Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Люминесцентный анализ механизмов вкусовой рецепции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Люминесцентный анализ механизмов вкусовой рецепции"

г б и«

з ЙНВ 1998

На правах рукописи НОВИКОВА Наталия Георгиевна

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ВКУСОВОЙ РЕЦЕПЦИИ

специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

На правах рукописи

НОВИКОВА Наталия Георгиевна

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ВКУСОВОЙ РЕЦЕПЦИИ

специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Техническом Университете и Военно-медицинской академии.

Научные руководители: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наУК.

профессор В.О.Самойлов,

доктор технических наук Г.И.Разоренов

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

БЕЗРУКОВА Александра Геннадиевна;

доктор технических наук БУБНОВ Владимир Павлович.

Ведущая организация: Институт аналитического приборостроения РАН

Защита диссертации состоится '¡/3" \ в /^часов на заседа-

нии Диссертационного совета Д 063.38.23 при Санкт-Петербургском Государственном Техническом Университете по адресу: Санкт-Петербург, ул. Политехническая, д. 29, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного Технического Университета.

Автореферат разослан "Л*

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат физико-математических наук /': /<- /

О.Л.ВЛАСОВА 0 7 J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время, несмотря на большое количество экспериментальных исследований, выполненных с помощью современных методик (см. обзоры: Avenet, Lindemann, 1989; Gilbertson, 1993; McLaughlin, Margolskee, 1994; Margolskee, 1993a,b; Schiffman, Gatlin, 1993; Schmale et al„ 1993 и др. ), не существует единой точки зрения на механизмы преобразования информации во вкусовых рецепторах. Относительно малоизученным остается вопрос о роли метаболических систем рецепторной клетки во вкусовой транедукции. Наряду с традиционным мнением, что роль метаболических систем сводится к энергетическому обеспечению деятельности рецепторных клеток, существуют данные о непосредственном участии этих систем в акте рецепции (Соловьев, 1978; Самойлов, 1980,1983).

Перспективным методом, позволяющим исследовать метаболические реакции рецепторных клеток in situ, является микроспектрофлуориметрический метод. В работах В.О.Самойлова и его сотрудников (Самойлов, 1980,1983; Самойлов и соавт., 1980, 1981; Соловьев,1978; Дулатова, 1988) было впервые показано, что при действии на вкусовые сосочки языка лягушки адекватных химических стимулов возникают изменения флуоресценции компонентов дыхательной цепи - пири-диннуклеотидов и флавопротеидов, а также хлортетрациклина - флуоресцентного зонда на мембраносвязанный Са2+. На основании этого феномена В.О.Самойловым сформулирована гипотеза гетерогенности механизмов вкусовой рецепции. Согласно этой гипотезе, вещества, воспринимаемые человеком на вкус как горечи и кислоты, вызывают преходящие нарушения метаболизма вкусовой клетки, что служит одним из начальных звеньев хемосенсорного акта. Однако включение метаболических реакций раздражителями этих типов, по мнению автора, осуществляется по-разному: кислоты, вероятно, изменяют внутриклеточный pH (возможно, с участием фермента карбоангидразы) и непосредственно влияют на метаболизм; горечи же могут изменять метаболизм клетки посредством активации системы цАМФ, причем существенную роль в этих процессах играют ионы Са2+.

Вместе с тем в вышеуказанных исследованиях не было проведено сопоставления динамики развития люминесцентных реакций вкусовых сосочков с временными характеристиками электрофизиологических реакций во вкусовых нервах, а также не была установлена последовательность метаболических реакций во вкусовых клетках. Нам неизвестны также работы авторов из других научных школ, содержащие попытки количественной многофакторной оценки метаболических реакций вкусовых рецепторов и построения математических моделей этих реакций. Следует заметить, что при большом количестве информации о механизмах рецепции различных вкусовых стимулов наименее определенными являются представления о механизмах действия кислот. В частности, до сих пор не были показаны изменения in situ внутриклеточного pH при действии на вкусовые со-

сочки кислот, хотя принципиальная возможность этого широко обсуждается в литературе.

Изучение механизмов хеморецепции было предусмотрено Государственными программами "Мозг", "Гомеостаз", "Феромон", в рамках которых и началось выполнение данной работы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в изучении посредством люминесцентного анализа закономерностей метаболических реакций рецепторного эпителия языка лягушки на комбинированное действие химических стимулов и уточнении роли этих реакций в акте вкусовой, трансдукции.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Провести сравнительный анализ динамики изменений собственной флуоресценции компонентов дыхательной цепи митохондрий - пиридиннуклеотидов и флавопротеидов, а также свечения флуоресцентных зондов (хлортетрациклина и флуоресцеиндиацетата) при действии на вкусовые сосочки языка лягушки химических стимулов, представляющих три "вкусовые качества" - кислое, горькое и соленое.

2. При помощи флуоресцеиндиацетата - флуоресцентного зонда на внутриклеточный рН - уточнить представления о механизмах рецепции кислот вкусовыми клетками.

3. С использованием методов математической теории эксперимента провести математический анализ динамики люминесцентных реакций при комбинированном действии трех вкусовых стимулов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Благодаря сравнительному анализу динамики собственной флуоресценции компонентов дыхательной цепи митохондрий и люминесценции флуоресцентных зондов во вкусовых почках языка лягушки под действием химических стимулов, представляющих три "вкусовых качества" - кислое, горькое и соленое, установлены выраженные различия в характере и временных характеристиках метаболических реакций рецепторного эпителия языка при действии раздражителей различных вкусовых модальностей, что подтверждает гипотезу гетерогенности вкусовой рецепции (Самойлов, 1980, 1983).

Впервые обнаружены изменения люминесценции флуоресцеиндиацетата (ФДА), свидетельствующие о снижении внутриклеточного рН в рецепторном эпителии языка при действии на него кислот. Установлено отчетливое влияние анионного компонента кислот на степень снижения рН вкусовых клеток, а также резкое усиление люминесцентных реакций ФДА при действии растворов кислот на бикарбонатном буфере. Угнетение этих реакций ацетазоламидом свидетельствует об участии карбоангидразы в рецепции кислот вкусовыми клетками.

С помощью методов математической теории эксперимента (МТЭ) впервые построены математические модели, описывающие развитие метаболических реакций вкусовых почек во времени, что позволило количественно оценить роль каждого из вкусовых раздражителей в сенсорном акте по отдельности и во взаимодействии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные факты и модели расширяют современные знания о первичных механизмах рецепции веществ, пред-

ставляющих различные вкусовые модальности, и включены в курсы лекций и практических занятий по биофизике органов чувств для студентов Санкт-Петербургских медицинского и электротехнического университетов. Результаты работы могут быть использованы при создании новых датчиков и сенсорных устройств в робототехнике. Существенные усовершенствования, внесенные автором в традиционную методику регистрации и анализа люминесцентных сигналов, в полной мере пригодны для изучения люминесценции других биообъектов. Метод активного многофакторного эксперимента, проводимого по оптимальным планам МТЭ, примененный для построения и оценки качества моделей исследуемых процессов и позволивший получить новые достоверные научные факты, рекомендован для изучения других сенсорных систем.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.Выраженные различия в характере и временных характеристиках метаболических реакций вкусового эпителия языка лягушки на химические стимулы, представляющие различные вкусовые "качества", подтверждают гипотезу гетерогенности вкусовой рецепции (Самойлов, 1980, 1983).

2. Под действием кислот снижается рН в цитоплазме вкусовой клетки. Усиление реакций на кислоту при наличиии бикарбоната в ротовой полости связано с образованием там С02, его быстрой диффузией через плазмолемму вкусовой клетки с последующим превращением в угольную кислоту при помощи цитоплаз-матической карбоангидразы.

3. Математические модели метаболических реакций вкусового эпителия на химические стимулы разных вкусовых модальностей, полученные в многофакторном исследовании с использованием микроспектрального анализа и методов математической теории эксперимента, позволяют количественно оценить роль исследуемых факторов и их взаимодействий, что способствует углублению представлений о механизмах трансдукции во вкусовых клетках.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII Симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Москва, Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, февраль 1992 г.), на семинарах кафедр биологической и медицинской физики, челюстно-лицевой хирургии Военно-медицинской академии, лаборатории биофизики Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. И.П. Павлова, отдела автоматизированных информационных систем Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова, а также кафедры биофизики Санкт-Петербургского технического университета.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает 73 работы отечественных и 255 работ иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы, поставлены цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая ценность полученных результатов, сформулированы положения, выносимые на

защиту, приведены сведения об апробации работы и основных публикациях по теме диссертации.

Глава 1 является обзором литературы и отображает современные представления о молекулярных механизмах реагирования вкусовых рецепторов на химические стимулы. В обзоре проведен сравнительный анализ основных теорий вкусовой транедукции: ферментативной гипотезы А.Баради и Г.Бурна (Baradi, Bourne, 1951 a,b, 1953, 1959а,b), адсорбционной теории Л.Бейдлера (Beidler, 1954, 1961, 1975) и теории гетерогенности первичных механизмов вкусовой рецепции В.О.Самойлова (Самойлов, 1980,1983). С позиций последней теории рассмотрены литературные данные относительно молекулярных механизмов рецепции веществ, вызывающих у человека ощущение сладкого вкуса, горечей, кислот и солей. Особое внимание уделено роли метаболических реакций в акте вкусовой транедукции.

В результате анализа литературных источников сделан вывод, что в настоящее время не существует единой точки зрения относительно последовательности процессов в акте рецепции веществ, обладающих различными вкусовыми качествами. Изменения мембранных потенциалов, долгое время признававшиеся центральным звеном рецепторного акта, многие авторы считают вторичными явлениями, не имеющими непосредственного отношения к транедукции. Вместе с тем первичными этапами вкусовой транедукции могут быть изменения метаболизма рецеп-торных клеток, в частности, при восприятии горечей и кислот (Самойлов, 1980, 1983; Avenet, Lindemann, 1989). Очевидна необходимость дальнейших исследований динамики метаболических реакций (особенно их быстрых изменений), которые позволят установить последовательность и взаимосвязь этих реакций и полностью описать процессы, происходящие во ВК при действии на них разнообразных вкусовых веществ, а также выяснить роль метаболических реакций в передаче информации об интенсивности и качестве химических стимулов. Обоснованы также стратегия работы и выбор методов.

Глава 2 посвящена материалам и методам исследования. Опыты проведены на самцах травяной лягушки Rana temporaria массой 30-40 г в осенне-зимний период. Для стимуляции вкусовых рецепторов грибовидных сосочков языка лягушки использовали растворы трех вкусовых модальностей, вызывающие у человека ощущение кислого, горького и соленого вкуса: уксусной кислоты (УК), кофеина и поваренной соли. Существенной особенностью настоящей работы являлось исследование сочетанного действия трех стимулов, концентрации которых варьировались в достаточно широких пределах: NaCl - от 0 до 1 моль/л; УК от 0 до 15.7 ммоль/л (рН 6,5-3.3); кофеина - от 0 до 100 ммоль/л. Порядок сочетания факторов определялся планом эксперимента. Все растворы вкусовых агентов приготавливали на физиологическом растворе для холоднокровных и подавали на язык после предварительной 3-5 минутной адаптации вкусового сосочка к этому же раствору.

Вкусовые раздражители подавали на язык в объеме 500 мкл из микропипетки F 500. Для исследования быстрых изменений люминесценции необходимо было точно регистрировать момент подачи раздражителя и обеспечить крутой передний фронт поступления стимула на вкусовой сосочек. Этого удалось достичь благодаря системе автоматической подачи стимула [5], специально разработанной в ходе выполнения диссертации.

Второй важной особенностью работы явилось создание автоматизированной микроспектрофлуориметрической установки на базе ПЭВМ и люминесцентного микроскопа МЛ-4 (со спектрофотометрической насадкой СФН-10 и фотоэлектронным умножителем ФЭУ-79). Нами разработана программа, обеспечивающая точное дозирование стимулов, регистрацию и усреднение флуоресцентных реакций, распечатку результатов обработки данных и построение графиков.

Возбуждение и регистрацию флуоресценции восстановленных пиридиннукле-отидов и окисленных флавопротеидов, а также хлортетрациклина (ХТЦ) мы проводили по описанным ранее методикам (Caswell, Hutchison, 1971; Соловьев, 1978; Дулатова, 1988; Самойлов, 1980, 1983) (см. табл.1).

Зонд на внутриклеточный рН - флуоресцеиндиацетат (ФДА) - имеет близко расположенные длины волн возбуждающего излучения (>.=490 нм) и флуоресценции (1=520 нм) (Добрецов, 1989 ), причем при снижении рН интенсивность люминесценции падает.

Таблица 1. Особенности методик возбуждения и регистрации флуоресценции

Флуоресцирующее вещество Восстановленные пиридин-нуклеотиды Окисленные флаво-протеиды Хлортетра-циклин

Тип источника света ДРШ-250 ДРШ-250 ДРШ-250

Длина волны возбуждающего излучения (нм) 320-380 (шах 360) 380- 430 390

Длина волны, на которой производилась регистрация (нм) 455 530 530

Тип светофильтра для выделения возбуждающего излучения УФС 6-3 СС-15-2 +БС-8 СС-15-2+ ФС-1-6

Тип «запирающего» светофильтра ЖЭС-3+ БС-8 ЖС18-ЖЗС19 ЖС18-ЖЗС19

Тип светоделительной пластинки в насадке СФН-10 №2 №3 №3

Близость значений длин волн возбуждающего и излучаемого потоков света потребовала от нас существенного изменения осветительной части установки. Из излучения лампы накаливания КГМ мощностью 150 Вт выделяли световой поток с длиной волны 490 нм при помощи монохроматора от прибора "Spekol 11" (полуширина спектрального интервала 3 нм). Регистрацию люминесценции зонда производили на длине волны 520 нм с использованием "запирающего" светофильтра ЖС-19-ЖЗС-18 и светоделительной пластинки № 3 насадки СФН-10.

Для "прокрашивания" языка лягушки использовали хлортетрациклин фирмы "Sigma" (молекулярная масса 515.14). Раствор ХТЦ на физиологическом растворе (концентрация ХТЦ 25 мкмоль/л; рН 7.3-7.4) апплицировали на поверхность языка на 30 мин.

ФДА практически не растворим в воде. В связи с этим раствор ФДА (фирмы "Sigma", молекулярная масса 416,4) на ФР готовили следующим образом: вначале 5 мг ФДА растворяли в 1 мл концентрированного диметилсульфоксида, а затем добавляли ФР до объема 300 мл. При аппликации полученного раствора (с концентрацией ФДА 40 ммоль/л) на поверхность языка максимальное "прокрашивание" сосочка наступало через 15 мин.

Многофакторное исследование вкусового анализатора проводилось с использованием оптимальных планов математической теории эксперимента (МТЭ) (Налимов, Чернова; 1965; Разоренов, 1979).

Реакции (отклики) объекта на комбинированное действие факторов были аппроксимировали многомерными полиномами 2-го порядка:

где коэффициенты Ь„ Ь,„ Ьу имеют смысл коэффициентов чувствительности функции отклика У к вариациям факторов и их взаимодействий (произведений х,

В качестве откликов (У) рассматривались изменения интенсивности люминесценции (в процентах от фонового уровня люминесценции).

Эксперимент был проведен по квази-О-оптимальному плану второго порядка для 4-х факторов (Налимов, 1969). Этот план обеспечивает некоррелированность коэффициентов 6/ и Ьу и максимальную точность модели. Порядок опытов был рандомизирован. Каждый опыт проводился на нескольких (6 - 10) экспериментальных животных. Полученные данные усреднялись.

Факторами в данном исследовании являлись три вкусовых агента (кофеин, №С1 и УК) и время I.

Расчеты коэффициентов моделей (1), критериев адекватности моделей и значимости коэффициентов производились с помощью реализующей алгоритмы МТЭ программы Р1ап2, которая разработана Г.И.Разореновым.

Глава 3 посвящена исследованию динамики собственной и вторичной флуоресценции вкусового эпителия языка лягушки при раздельном (не комбинированном) действии исследуемых химических стимулов.

При исследовании собственной флуоресценции восстановленных пиридин-нуклеотидов показано, что кофеин вызывает резкое усиление флуоресценции НАДН, причем реакция развивается очень быстро и имеет крутой передний фронт. Длительность переднего фронта реакции составляла в среднем 400+60 мс; за это время флуоресценция возрастала на 32.3+11.5% (п=10; р=0.95) и оставалась на этом уровне до конца периода наблюдения (8.5 с), т.е. клетки вкусового сосочка переходили на новый уровень метаболизма.

к

к

к

(1)

Реакция на соль была слабой, развивалась во времени постепенно; при этом уровень флуоресценции в течение всего рассматриваемого периода времени (8.5 с) возрастал и достигал 5.8±1.5% (п=10; рЮ.95).

При действии на вкусовой сосочек УК после начального незначительного подъема уровень флуоресценции НАД Н снижался и в конце периода наблюдения составлял в среднем -3.3+2.0% (п=10; р=0.95).

Фоновый уровень флуоресценции окисленных флавопротеидов был в 2.5-3 раза ниже, чем у НАД Н. В связи с этим возрастала значимость шумовых колебаний сигнала. Достоверными оказались лишь изменения флуоресценции ФП при действии на вкусовой сосочек кофеина. При этом свечение быстро усиливалось (длительность переднего фронта реакции составила 230+70 мс при п=9 и р=0.95), а затем оставалось примерно на одинаковом уровне (7.4±2.2% при п=9 и р=0.95) в течение всего периода наблюдения. Изменения флуоресценции ФП при действии на вкусовой эпителий УК и NaCl оказались статистически недостоверными. Можно говорить лишь об определенной направленности реакций. Так, при действии на вкусовой сосочек NaCI флуоресценция ФП медленно нарастала в течение всего периода наблюдения, а при действии на вкусовой сосочек УК ее уровень несколько снижался.

При исследовании кальцийаккумулирующей способности мембран рецептор-ного эпителия языка лягушки с использованием ХТЦ - флуоресцентного зонда на мембраносвязанный кальций - показано, что 2% раствор кофеина вызывает слабое уменьшение флуоресценции зонда (в среднем, на -6.9+5.1% при п=5 и р=0.95), что свидетельствует о распаде комплекса «ХТЦ - Са2+- клеточная мембрана» и выходе Са2+ из клеточных мембран.

Гораздо сильнее изменялось свечение зонда при действии на вкусовой эпителий уксусной кислоты (рН 3.3) - уменьшение уровня флуоресценции за период наблюдения составило, в среднем, -14.4±5.0%при п=6 и р=0.95.

При действии на вкусовые сосочки 1 М NaCl уровень флуоресценции зонда увеличивался (в среднем, на 3.6±2.1% при п=5 и р=0.95), что свидетельствует об увеличении кальцийаккумулирующей способности мембран вкусовых клеток.

Уровень люминесценции ФДА (зонда на внутриклеточный рН) уменьшался при действии на вкусовые сосочки УК (рН 3.3). Это уменьшение происходило в течение всего периода наблюдения и к концу его составило в среднем 15.7+3.5% (при п=10 и р=0.95). Уменьшение люминесценции ФДА на длине волны 520 им указывает на снижение уровня внутриклеточного рН.

Изменения люминесценции ФДА при действии на вкусовые сосочки раствора УК, свидетельствовавшие о снижении внутриклеточного рН, были зарегистрированы нами впервые. Несмотря на то, что многие авторы высказывали предположения, что рН во вкусовых клетках должен уменьшаться под действием растворов кислот, эти изменения не были до сих пор показаны в опытах in situ. Неожиданным оказался факт, что при действии на вкусовой эпителий I М NaCI люминесценция ФДА также уменьшалась в течение всего периода наблюдения и к концу его уменьшение составило -12.5±2.4% (при л=10 и р=0.95). Поскольку рН 1 М раствора NaCl достоверно не отличался от рН адаптирующего (физиологического) раствора, мы предположили, что этот факт свидетельствует о

проникновении внутрь ВК ионов натрия. Повышение в цитоплазме ВК концентрации любых одновалентных ионов, вероятно, должно приводить к снижению люминесценции ФДА.

Кофеин (2% раствор) вызывал после незначительного начального снижения уровня люминесценции слабое повышение свечения зонда (в среднем, на 2.5+1.6% за период наблюдения при п=7 и р=0.95), т.е. слабое защелачивание внутриклеточной среды.

Таким образом, наши исследования динамики собственной флуоресценции вкусового эпителия языка лягушки и люминесценции флуоресцентных зондов выявили отчетливую гетерогенность метаболических реакций вкусовых сосочков на действие «горького» (кофеин), «кислого» (УК) и «соленого» (ЫаС1) агентов.

Разнообразие метаболических реакций на стимулы, представляющие три основных вкусовых качества, свидетельствует о том, что эти реакции связаны не только с энергетическим обеспечением рецепторного акта, но и непосредственно вовлечены в акт вкусовой трансдукции. Наши результаты подтверждают теорию гетерогенности молекулярных механизмов вкусовой рецепции (Самойлов, 1980, 1983).

Выявленные нами различия в характере и динамике изменений люминесценции при действии исследованных вкусовых стимулов потребовали установления общих закономерностей, описывающих развитие этих процессов во времени, и выполнения количественной оценки роли каждого из исследу-емых факторов и их взаимных влияний. Для построения математических моделей, представляющих эти закономерности в виде многомерных полиномов второго порядка (1), нами впервые была использована методология МТЭ.

В главе 4 представлены результаты исследования динамики люминесцентных реакций вкусового эпителия языка лягушки на комбинированное воздействие трех вкусовых стимулов по плану МТЭ.

В связи с определенными методическими трудностями метод был использован нами только при исследовании изменений собственной флуоресценции пири-динннуклеотидов и люминесценции ХТЦ - зонда на мембраносвязанный Са2+. Свечение флавопротеидов было относительно слабым, в связи с чем возрастала значимость шумовых изменений сигнала, Флуоресцеиндиацетат - зонд на внутриклеточный рН - достаточно быстро диффундировал из вкусовых клеток, и поэтому на одном вкусовом сосочке не удавалось выполнить полную схему многофакторного эксперимента.

В результате первичного анализа динамики флуоресценции пиридиннуклеоти-дов было установлено, что эти реакции наиболее интенсивны при действии на вкусовые сосочки кофеина, причем в реакции на кофеин четко видны две ярко выраженные фазы - "быстрая" (передний фронт реакции) и "медленная". Поэтому при изучении реакций на комбинированное действие стимулов мы использовали принцип кусочно-полиномиальной аппроксимации реакций сложной формы, в соответствии с которым период наблюдения разбивается на отдельные интервалы, для каждого из которых строится "индивидуальная" модель.

Первая математическая модель (для У;) была построена нами для временного интервала 0-450 мс. Именно в этом интервале происходят быстрые изменения флуоресценции пиридиннуклеотидов при действии на вкусовые сосочки кофеина,

а также максимальна частота афферентной импульсации по вкусовых нервах (Шмаров, Самойлов, 1979; Самойлов и соавт., 1992).

Эта модель в кодированных переменных (когда минимальному значению фактора соответствует безразмерное значение «-1», а максимальному - «+1») имеет вид:

Y, = 11.091 + 5.9581 + 7.938 х2 - 0.273х3- 1.009х4 + + 5.520 tx2 - 0.069 tx3 - 0.648 tx4 - 0.16! х2х3 - 1.307лЛ - 0.127 Х)Х4 -

- 3.285 t2+ 2.047х2 -0.414х32 - 1.510 х/. (2)

Модель (2) статистически адекватна, так как справедливо неравенство Fa_ <)<Гм= 1.19 < FmaBJp=0.90, 9, 216) = 1.63, где Fmo6,- табличное значение F-критерия Фишера для вероятности р и числа степеней свободы п,, п2. Это дает нам право использовать данную модель в качестве "полномочного представителя" экспериментальных данных для графоаналитического исследования и оценки "силы" и "направленности" действия исследованных факторов и их взаимодействий.

Модель (2) позволила получить также частные модели для каждого стимула в отдельности и любых парных сочетаний стимулов путем подстановки в нее кодированных значений (х,= -1) для отсутствующих стимулов и приведения подобных членов. После округления и исключения незначимых коэффициентов (р<0.90) модель (2) принимает вид:

Y,a = 11.09 + 5.961 + 7.94 х2-1.01 х4 + 5.52 tx2- 0.65 t х,- 1.31 х2х4- 3.29 t2 + 2.05х/. (3)

Модель (3) статистически не адекватна, так как справедливо неравенство Fa. дем= 1-90 > Егабл (р=0.90, 15, 216) = 1.49. Тем не менее, эта модель дает нам отчетливое представление о сравнительном "вкладе" наиболее сильно влияющих факторов и их взаимодействий в величину отклика, так как из модели исключены слабые влияния.

Анализ моделей (2,3) показывает, что в избранных диапазонах варьирования наиболее сильное положительное влияние на величину функции отклика оказывает фактор х2 - кофеин (Ъ2 - 7.94); отрицательное действие фактора х4 (уксусная кислота) слабее почти в 8 раз (Ь4 - -1.01). Влияние кофеина и УК возрастает с течением времени, на что указывают достоверные коэффициенты Ь12 = 5.52 и Ь14 = -0.65. Выявлено значимое отрицательное взаимодействие кофеина и УК (Ь24 - -1.31), что свидетельствует о наличии "общих точек" в механизмах реагирования ВК на УК и кофеин. Поваренная соль в исследованном интервале времени достоверно не влияет на флуоресценцию пиридиннуклеотидов и не взаимодействует с другими факторами. Важное значение имеет фактор x/=t (время). В модели присутствуют как коэффициенты 6, и Ьц, так и коэффициенты Ьп и Ь14, отображающие характер развития реакций на кофеин и УК во времени.

Для второй ("медленной") фазы реакции нами была построена модель У2 в кодированных переменных, охватывающая весь промежуток времени от 450 до 8550 мс:

У2 = 18.586 + 1.2361 + 14.911х2 + 0.778 х3 - 2.076х, + f 1.3641X2+ 1.092 (х3-0.584 1х4 + 0.100х2х3 - 1.567х2 х4 + 0.079х3х4-

- 2.426х/ + 0.021 х22 + 1.008 х32 - 1.706х/. (4)

Модель (4) статистически адекватна, так как справедливо неравенство: Рада„= 0.43 < Ртабл (р=0.90, 9, 216) = 1.63.

После округления и исключения статистически незначимых коэффициентов (р=0.90) модель приобретает вид:

У2а = 18.59+ 1.241 + 14.91 х2 - 2.08 х4 + 1.361 х2 + 1.091х3 - 1.57 х2х4.

(5)

Модель (5) статистически не адекватна, так как Радекв= 2.27 > Рта6л (р=0.90, 15, 216) = 1.49, и использована нами, как и (3), только для анализа роли исследуемых факторов. Модель (5) существенно отличается от модели (3). В модели (5) отсутствуют квадратичные члены, что обусловлено медленным изменением люминесценции в этот период. Наиболее «влиятельным» фактором по-прежнему является кофеин (Ь2- 14.91); второй по значимости фактор - УК -2.08). В течение всего периода наблюдения проявляется отрицательный эффект взаимодействия кофеина и УК (Ь24= -1.57). Следует отметить, что в этой модели выявился статистически значимый эффект взаимодействия фактора х3 (№С1) и фактора х, (время) (¿>/5= 1.09), т.е. в "медленную" фазу поваренная соль влияет на развитие люминесцентных реакций.

Изменения люминесценции ХТЦ при действии на вкусовой эпителий языка лягушки вкусовых агентов развивались во времени относительно медленно. Поэтому нами была построена модель У3, охватывающая весь период наблюдения (08550 мс).

У3 = -2.822 - 2.361 1 + 0.387х2 + 2.526х3 - 2.720х4 + + 0.301 (х2 + 2.451 ¡х3 - 2.618 ¡х4 + 0.499х2 х3 - 0.078 х2х4 - 0.0698 х3х4 + + 0.7469 х/ - 0.0531 х/ + 0.5469 х32- 0.7531 х42. (6)

Модель (6) статистически адекватна, так как справедливо

Радеют 119 < Ртаб., (р=0.90, 9, 120) = 1.68. После округления и исключения статистически незначимых коэффициентов (р=0.90) модель приобретает следующий вид:

Уз,, = -2.82 - 2.36 < + 2.53 х3 - 2.72 х4 + 2.45 1х3 - 2.62 ¡х4 (7)

Модель (7) также статистически адекватна, так как выполняется неравенство 1.31 < Ртабз (р=0.90, 18, 120)=1.51.

Анализ модели (7) показывает, что на люминесценцию ХТЦ оказывают влияние два фактора: х3 (ЫаС1) и х4 (УК). Влияние этих факторов противоположно (коэффициент Ь3 положителен (Ь3 = 2.53), а коэффициент Ь4 отрицателен -2.72). Эти факторы влияют на функцию У3а практически одинаково (абсолютные величины коэффициентов Ь3 и Ь4 примерно равны). Факторы х3 и х4 не взаимодей-

ствуют между собой в течение всего периода наблюдения (коэффицент статистически не значим). Отсутствие взаимодействия между этими факторами, по-видимому, свидетельствует о различных механизмах изменения содержания мем-браносвязанного кальция при действии на ВК УК и NaCl.

Таким образом, с использованием методов математической теории эксперимента (МТЭ) нами впервые построены математические модели, описывающие изменения флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов и ХТЦ. Эти модели позволили установить силу и направленность действия исследованных факторов и их взаимодействий, а также ранжировать эти факторы по силе влияния. Полученные модели позволяют прогнозировать реакции объекта при комбинациях факторов, не исследованных в эксперименте. Использование методов МТЭ позволило повысить достоверность оценок данных, уменьшить влияние разбросов результатов отдельных опытов. Выявленные взаимодействия факторов (например, отрицательное взаимодействие кофеина и УК в математических моделях, описывающих динамику люминесценции пиридиннуклеотидов) позволяют предположить наличие "общих точек" в молекулярных механизмах рецепции этих веществ вкусовыми клетками, в то время как отсутствие взаимодействий между факторами (например, между наиболее эффективно влияющими на люминесценцию ХТЦ УК и NaCl) свидетельствует о принципиальной разнородности этих механизмов.

Глава 5 посвящена исследованию некоторых сторон механизма действия кислот на вкусовые рецепторы при помощи ФДА - зонда на внутриклеточный рН. Как уже указано выше, в ходе предварительных экспериментов, описанных в главе 3, было показано, что люминесценция этого зонда на длине волны 520 нм достоверно снижается при действии двух вкусовых агентов - УК и NaCl. Напомним, что увеличение люминесценции зонда на длине волны 520 нм должно свидетельствовать об увеличении внутриклеточного рН, а снижение уровня люминесценции зонда - о снижении внутриклеточного рН. Неожиданным оказалось достоверное снижение люминесценции ФДА при действии на вкусовой сосочек не только УК, но и NaCl. Мы предположили, что этот эффект обусловлен проникновением внутрь ВК как ионов водорода, так и ионов Na+.

Что касается механизмов проникновения ионов водорода и натрия внутрь ВК, то, исходя из литературных данных, наиболее вероятна диффузия этих ионов через катионные каналы (у лягушки, возможно, через неспецифический катионный канал) (Avenet, Lindemann, 1987, 1989; Tonosaki, 1990; Fujiyama et al„ 1993). Мы предположили, что при этом должна проявиться конкуренция между водородными и натриевыми ионами. Поэтому в следующей серии экспериментов мы аппли-цировали на вкусовые сосочки не только растворы УК и NaCl по отдельности, но также и раствор NaCl, подкисленный УК до того же значения рН, равного в наших опытах 3.3.

Реакция на 1 М раствор NaCl, подкисленный УК до рН 3.3, всегда была меньше, чем сумма реакций на растворы УК и NaCl по отдельности. Снижение реакции составляло, в среднем, 82.0±14.4%. Различия между сериями достоверны с р=95% как по t-критерию Стьюдента, так и по непараметрическому критерию знаков (Лакин, 1980). Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения о том, что ионы водорода и натрия могут иметь общие механизмы проникновения в клетку.

Далее мы решили проанализировать, как зависят изменения внутриклеточного рН от анионного компонента кислот. Для исследования нами были выбраны три кислоты: соляная (НС1), уксусная и масляная (МК). Растворы всех кислот имели одинаковый рН, равный 3.3. Тем не менее, изменения люминесценции ФДА при действии на вкусовые сосочки этих растворов, различны. Раствор соляной кислоты не вызывал достоверных изменений люминесценции ФДА, причем при использовании более концентрированных растворов НС1 с рН 3.1 и 2.9 нам также не удалось обнаружить достоверных изменений люминесценции ФДА.

Максимальное изменение люминесценции при действии УК составило в среднем -13.1±6.2% (при п=7 и р=0.95), а при действии на вкусовой сосочек МК оно было равным -26.2±4,0% (при п=7 и р=0.95).

Специфическая роль анионного компонента в рецепции кислот подтверждается и результатами серии опытов, в которой в качестве раздражителей вкусовых сосочков использовались растворы УК и НС1 с рН 3.3 и смесь этих растворов в соотношении 1:1 с тем же значением рН. Смесь растворов УК и НС1 вызывала меньшие изменения внутриклеточного рН. Если максимальное изменение люминесценции в ответ на раствор УК составило в среднем -13.1±6.2% (при п=7 и р=0.95), то изменение люминесценции при действии на вкусовой сосочек смеси растворов УК и НС1 с тем же рН составило в среднем -5.7+2.4% (при том же числе измерений и уровне доверительной вероятности). Реакция уменьшилась примерно в 2 раза, что соответствует уменьшению концентрации УК в растворе.

Каким же образом анионный компонент кислот может влиять на изменение внутриклеточного рН? Во-первых, анионы могут изменять проницаемость мембраны для катионов. Во-вторых, кислоты могут проникать через мембрану в не-диссоциированной форме (через фосфолипидный бислой) с последующей диссоциацией внутри клетки. В этом случае изменения внутриклеточного рН должны быть обратно пропорциональны концентрации недиссоциированных молекул кислоты.

Чтобы проверить последнюю гипотезу, мы произвели расчет равновесных концентраций катионов водорода, анионов и недиссоциированных молекул исследованных нами кислот при выбранном значении рН, равном 3.3. В расчетах мы использовали известные значения констант диссоциации кислот и исходили из закона действующих масс.

Результаты расчетов (табл. 2) показывают, что двукратное превышение реакции ФДА на МК над реакцией на УК не может быть объяснено увеличением концентрации недиссоциированных молекул, так как в растворе МК при рН 3.3 концентрация недиссоциированных молекул всего в 1.16 раза больше, чем в растворе УК при том же значении рН.

По-видимому, величина реакций все же связана с влиянием органических анионов (не способных проникать через мембрану и парацеллюлярные пространства) на проницаемость ионных каналов.

Таблица 2. Концентрации ионов водорода, анионов и недиссоциированных молекул в растворах соляной, уксусной и масляной кислот при рН 3.3

Кислота_| НС1 | УК | МК

Константа диссоциации 2.81.10'2 1.75.105 1.51.10"5

Концентрация катионов и анионов (ммоль/л) 0.53 0.51 0.51

Концентрация недиссоциированных молекул (ммоль/л) 0.01 15.18 17.61

Суммарная концентрация кислоты (ммоль/л) 0.54 15.69 18.12

Хорошо известно, что вкусовые рецепторы весьма чувствительны к углекислому газу, и что пороги восприятия кислот снижаются при наличии бикарбоната в ротовой полости. Поэтому следующим этапом нашей работы стало исследование влияния на уровень внутриклеточного рН растворов кислот, содержащих бикарбонат натрия.

Раствор бикарбоната натрия на физиологическом растворе (концентрация бикарбоната 1.2 ммоль/л, рН раствора 7.8), не вызывал достоверных изменений люминесценции зонда, а значит, и изменений внутриклеточного рН. Зато добавление бикарбоната к растворам кислот приводило к резкому увеличению люминесцентных реакций. Так, если при действии на вкусовой сосочек раствора УК с рН 3.3 изменение люминесценции составило в среднем -12.2±4.0% (при п=7 и р=0.95), то при действии раствора бикарбоната (1.2 ммоль/л), подкисленного УК до того же значения рН, среднее изменение люминесценции составило уже -25.4±6.5% (при том же числе измерений и уровне доверительной вероятности), т.е. реакция увеличилась в 2.1 раза. Аналогичный эффект был обнаружен и при добавлении бикарбоната к растворам МК.

Увеличение люминесцентных реакций на растворы кислот в присутствии бикарбоната может быть обусловлено: а) взаимодействием бикарбонатного иона с анионными рецепторными центрами мембраны ВК, приводящим к изменению проницаемости мембраны для катионов водорода (например, за счет активации катионных каналов); б) повышенным содержанием анионов и недиссоциирован-ных молекул соответствующих кислот в растворах, содержащих бикарбонат и обладающих определенной буферной емкостью, по сравнению с растворами "чистых" кислот при тех же значениях рН; в) появлением в растворах, содержащих бикарбонат свободной углекислоты, то есть с позиций карбоангидразной гипотезы (Самойлов, 1980, 1983).

С целью проверки гипотезы о возможном участии карбоангидразы в рецепции кислот мы исследовали влияние ингибитора карбоангидразы ацетазоламида (диакарба) на изменения люминесценции ФДА при действии на вкусовые сосочки языка лягушки растворов кислот, содержащих бикарбнат.

В опытах мы использовали очищенный ацетазоламид (АцА), выделенный из таблеток. АцА вводили непосредственно в клетки слизистой языка лягушки путем ионофореза. Ионофорез проводили в течение 10 мин при значении постоянного тока 10 мА от отрицательного электрода к положительному. В контрольных опытах ионофорез физиологического раствора не приводил к достоверным изменениям реакций на УК

После ионофореза АцА реакция на "чистую" УК не только не подавлялась, но в среднем даже несколько увеличивалась. Среднее изменение уровня люминесценции ФДА составляло в этих опытах -18.5±8.4%. Зато реакция на раствор УК, содержащий бикарбонат натрия, значительно уменьшалась. Среднее изменение уровня люминесценции ФДА составило -22.7± 11.1%, т.е. различия в реакциях на "чистую" кислоту и раствор кислоты с бикарбонатом статистически недостоверны.

Несмотря на то, что результаты последней серии опытов, на наш взгляд, достаточно убедительно свидетельствуют в пользу представления об участии карбо-ангидразы во вкусовой рецепции кислот, мы все же решили провести контрольную серию опытов с целью проверки возможности увеличения люминесцентных реакций ФДА при действии на вкусовые сосочки растворов кислот, содержащих бикарбонат натрия, за счет повышенного содержания в этих растворах анионов и нсдиссоциированных молекул кислот, по сравнению с растворами "чистых" кислот при тех же значениях рН.

В этих опытах раствор NaOH на физиологическом растворе, имевший первоначальное значение рН 8.5, подкисляли УК до рН 3.3. При аппликации этого раствора на вкусовые сосочки языка лягушки мы не обнаружили увеличения люминесцентных реакций ФДА по сравнению с раствором УК на физиологическом растворе при том же значении рН. На основании результатов этих и вышеприведенных экспериментов мы полагаем, что карбоангидраза участвует в акте вкусовой транедукции кислотного стимула в присутствии бикарбоната в ротовой полости.

Глава 6 представляет собой общее обсуждение результатов работы. Особое внимание в ней уделено месту полученных данных в системе современных представлений о механизмах вкусовой транедукции.

Нами показано, что кофеин (вещество, относящееся к мембранопроникающим горечам) вызывает резкое и быстрое усиление собственной флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеидов. Известно, что кофеин оказывает прямое влияние на уровень окислительно-восстановительных процессов в митохондриях (Димитров, 1968; Ураков, Баранов, 1979; Ураков, 1980), в частности, увеличивает скорость окисления сукцината; при этом свободный путь электронов по дыхательной цепи от ФП облегчается и степень окислсн-ности ФП увеличивается (Ураков, 1980). С другой стороны, одновременно усиливается окисление янтарной кислоты и возрастает степень восстановленности НАД Н (Ураков, 1980). Эти данные хорошо согласуются с нашими результатами.

Кофеин является ингибитором фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов. Влияние кофеина и ряда других горечей на активность ФДЭ, выделенной из тканей языка крысы, показано в опытах in vitro (Kurihara, 1972; Дулатова, 1988). Существуют также данные о повышении уровня цАМФ во вкусовой рецепторном эпителии при действии горечей (в том числе, кофеина) (Самойлов и соавт., 1978; Самойлов, 1980, 1983; Соловьев, 1978). При этом клеточное дыхание усиливается за счет влияния циклических нуклеотидов на активность ферментов, контролирующих уровень содержания в клетке метаболитов, окисляемых в цикле Кребса (Албертс и др., 1994).

Кроме того, кофеин влияет на процессы выхода ионов кальция из внутриклеточных депо. Известно, что он ингибирует Са2+-АТФазу и усиливает выброс Са2+ из терминальных цистерн саркоплазматического ретикулума (Успанова и др., 1984; Беневоленский и др., 1985; Есьгрев и др., 1985; Дядюша, 1985; Ритов, 1985; Ритов, Мурзахметова, 1985). Повышение же внутриклеточной концентрации цАМФ под действием кофеина стимулирует выход кальция из митохондрий (Borle, 1974).

Показанное в наших экспериментах с ХТЦ - зондом на мембраносвязаниый кальций - некоторое снижение кальцийаккумулирующей способности мембран под действием кофеина вполне согласуется с этими литературными данными. Отметим, что уменьшение митохондриальных запасов Са2+ всего на 0.5% приводит к 10-кратному увеличению концентрации Са2+ в цитозоле (Федоров, 1979; Rasmussen, 1970; Rasmussen et al., 1975), поэтому при относительно небольшом изменении люминесценции ХТЦ влияние ионов Са2+, освобожденных из клеточных мембран, на метаболические процессы может быть очень значительным.

Таким образом, кофеин, вероятно, может иметь несколько точек приложения во вкусовой РК. Тем не менее, все процессы, которые могут инициироваться в клетке под влиянием кофеина, имеют одинаковую направленность на изменение общего уровня метаболической активности клетки и интенсификацию клеточного дыхания, что подтверждается результатами наших опытов. Высокая скорость развития изменений люминесценции компонентов дыхательной цепи митохондрий при действии кофеина на вкусовые сосочки подтверждает идею об их возможной информационной роли в акте рецепции (Самойлов, 1980, 1983). Общеизвестно, что многие вещества, воспринимаемые на вкус как горечи, являются алкалоидами, в том числе и кофеин. Вероятно, действие этих иитотоксичных веществ вызывает в клетке выраженные нарушения метаболических процессов. Распространение "метаболической волны" по клетке приводит, в частности, к сбросу ионов кальция с внутриклеточных мембран и выходу их в цитозоль, что может инициировать синаптическую передачу информации со вкусовой клетки на нервное волокно без участия в этом процессе рецепторных потенциалов и активации Са2^-потенциалзависимых каналов. В пользу этого предположения свидетельствует то, что время наступления максимума люминесцентных реакций компонентов дыхательной цепи не превышает времени развития максимальной частоты им-пульсации во вкусовых нервах (Шмаров, 1979; Шмаров, Самойлов, 1979; Самойлов и соавт., 1992).

Уксусная кислота (вещество, обладающее кислым вкусом) также оказывает влияние на состояние окислительно-восстановительных процессов в митохондриях. Результаты наших опытов свидетельствуют об активации клеточного дыхания под влиянием УК. Причиной же активации клеточного дыхания может быть увеличение концентрации ионов Н+ в цитозоле, впервые показанное нами с использованием ФДА - зонда на внутриклеточный рН.

При снижении рН в цитозоле увеличивается электрохимический протонный градиент на внутренней мембране митохондрий, энергия которого используется для синтеза АТФ и транспорта метаболитов и неорганических ионов в митохонд-риальный матрикс (Албертс и др., 1994). Увеличение концентрации метаболи-

тов цикла Кребса в матриксе митохондрий, в свою очередь, приводит к активации их окисления.

Отметим, что метаболические реакции под влиянием УК изменяются достаточно быстро. Достоверные изменения люминесценции восстановленных пири-диннуклеотидов выявлены методом математического моделирования уже в первые 450 мс после воздействия.

При анализе математических моделей, описывающих изменения люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов, нами было выявлено антагонистическое взаимодействие кофеина и УК. Амплитуда реакций при одновременном действии кофеина и УК достоверно меньше, чем сумма реакций на эти факторы по отдельности. Антагонистическое взаимодействие этих факторов проявилось также в полиномиальных моделях, описывающих параметры афферентной импуль-сации во вкусовых нервах лягушки (Самойлов, Соловьев, Гурченок, 1991). В психофизиологических опытах на людях также было показано ослабление ощущения горького вкуса при снижении рН стимулирующих растворов (Бронштейн, 1950). Результаты наших опытов свидетельствуют, что конкурентное взаимодействие кофеина и УК может начинаться на уровне метаболических систем клетки. Результатом снижения внутриклеточного рН во вкусовых клетках при стимуляции их кислотами может изменяться активность ферментов, вовлеченных в акт вкусовой трансдукции для горечи. Природа этих ферментов требует дальнейшего исследования.

При помощи ХТЦ - зонда на мембраносвязанный Са2+ - нами показано, что УК вызывает сброс ионов Са2+ с внутриклеточных мембран, что должно сопровождаться увеличением концентрации ионов Са2+ в цитозоле и может приводить к инициации синаптической передачи. Таким образом, рецепция кислот также может осуществляться по принципу "метаболической" волны, однако, изменения метаболизма при этом качественно иные, нежели при действии кофеина (горечи).

Изменения внутриклеточного рН, зарегистрированные в наших опытах, наиболее вероятно связаны с транспортом ионов водорода через катионные каналы (Avenet, Lindemann, 1987, 1989; Tonosaki,1990; Fujiyama ct al., 1993). Вместе с тем наши результаты свидетельствуют о том, что существует и дополнительный механизм изменения внутриклеточного рН. Очевидно, что при взаимодействии растворов кислот с бикарбонатами слюны образуется СОг, которая легко проникает через мембрану клеток. Далее при помощи карбоангидразы она превращается в угольную кислоту, диссоциация которой усиливает снижение внутриклеточного рН. Эта идея, высказанная В.О.Самойловым (1980,1983) на основании гистохимических данных о высоком содержании карбоангидразы во вкусовых клетках, впервые подтверждена нами в ходе экспериментов in situ.

Что же касается механизмов рецепции NaCl - вещества, обладающего соленым вкусом, то наши данные свидетельствуют в пользу идеи о транспорте ионов Na+ внутрь ВК как центральном этапе рецепторного акта для этого вещества. Деполяризация мембраны ВК, обусловленная входом Na+ (так называемый рецепторный потенциал), вероятно, распространяется по мембране вплоть до области синапса, приводит к открытию кальциевых потенциалзависимых ионных каналов, входу Са2+ внутрь РК и началу выброса медиатора. Нами показано, что при действии NaCl на вкусовые сосочки люминесценция компонентов дыхательной цепи изме-

няется слабо, т.е. метаболические реакции ВК вряд ли играют информационную роль в акте рецепции КаС1. Увеличение люминесценции комплекса "ХТЦ - Са2+ -клеточная мембрана", выявленное нами, может являться следствием восстановительных процессов, направленных на нормализацию уровня внутриклеточного Са2\ предварительно повышенного за счет входа кальция из межклеточной среды. Отсутствие взаимодействия наиболее значимо влияющих на люминесценцию ХТЦ факторов - УК и №С1, выявленное при анализе математических моделей, свидетельствует о различии внутриклеточных механизмов, вызывающих эти изменения.

выводы

1. При действии на вкусовой эпителий языка лягушки адекватных раздражителей, ответственных за разные первичные вкусы (вкусовые модальности), характер и временные характеристики люминесцентных реакций существенно различаются, что подтверждает теорию гетерогенности вкусовой рецепции (Самойлов, 1980, 1983).

2. Впервые построенные с использованием методов математической теории эксперимента математические модели, имеющие вид полиномов второго порядка, которые описывают изменения флуоресценции восстановленных пиридиннуклео-тидов и хлортетрациклина, позволили установить силу и направленность действия исследованных факторов, их взаимодействия, ранжировать эти факторы по силе влияния. Полученные модели дают возможность прогнозировать числовые значения реакций объекта на комбинации значений факторов, не исследованные в эксперименте, и способствуют расширению представлений о механизмах вкусовой рецепции.

3. Кофеин и уксусная кислота оказывают влияние на собственную флуоресценцию восстановленных пиридиннуклеотидов, причем коэффициент влияния этих стимулов в соответствующей модели для кофеина оказался в 8 раз больше, чем для уксусной кислоты. Антагонистическое взаимодействие этих факторов между собой в ходе всего периода наблюдения свидетельствует о наличии общих механизмов влияния кофеина и уксусной кислоты на метаболизм вкусовых клеток. Раннее, уже в первые 450 мс после начала действия стимула, развитие люминесцентных реакций подтверждает возможность информационной роли изменений клеточного дыхания в акте вкусовой трансдукции при рецепции горечей и кислот.

4. Способность мембран вкусового эпителия аккумулировать кальций наиболее эффективно изменяют уксусная кислота и NaCl. Согласно математическим моделям влияния этих стимулов имеют противоположную направленность и приблизительно одинаковую силу, а достоверные взаимодействия между ними отсутствуют.

5. Органические кислоты достоверно снижают внутриклеточный рН в рецеп-торном эпителии языка лягушки in situ, причем уровень этого снижения зависит от структуры аниона.

6. Растворы кислот, содержащие бикарбонат, вызывают достоверно большее снижение внутриклеточного рН, чем растворы "чистых" кислот. Эффект блокируется ацетазоламидом - ингибитором карбоангидразы, что свидетельствует об участии этого фермента в акте вкусовой трансдукции кислотного стимула.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О значении метаболических реакций вкусовых рецепторов в восприятии химических стимулов I/ Сенсорные системы. Обоняние и вкус. - Л., 1980. - С. 107-119 (в соавт. с Самойловым В.О., Соловьевым В.Н., Гурченком A.C. и др.).

2. Исследование механизмов реагирования вкусовых рецепторов на химические раздражители // Механизмы реагирования нейрона на раздражающие воздействия. - Л., 1981. - С. 42-75 (в соавт. с Самойловым В.О., Соловьевым В.Н., Гурченком A.C. и др.).

3. Анализ изменений люминесценции и электрофизиологических реакций при адекватных воздействиях на живую клетку. Отчет по теме N 210-89-вт. - Л., 1989. - 33 с (в соавт. с Гурченком A.C., Плотниковой С.Д., Соловьевым В.Н.)

4. Анализ кинетики люминесцентных ответов вкусовых почек при химической стимуляции // Сенсорные системы. - 1991. - Т. 5, N 2. - С. 5-8 (в соавт. с Самойловым В.О., Соловьевым В.Н.).

5. Устройство для автоматизированной подачи вкусовых стимулов // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. Сб. изобретений и рац. предложений. Вып. 23. - С.-Пб., 1992. - С. 40.

6. Установка для автоматизированного исследования быстрых изменений люминесценции // Там же. - С. 53 (в соавт. с В.Н. Соловьевым).

7. Анализ флуоресценции НАД Н вкусового рецепторного эпителия в многофакторном планируемом эксперименте // Сенсорные системы. - 1992. - Т. 6, N 3. -С. 109-111.

НГ. Новикова

ЛЮМИНИСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ВКУСОВОЙ РЕЦЕПЦИИ

формат 60X84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Dutch. Печать офсетная. Усл. печ. листов 1,4 Тираж 100 экз. Заказ 173. Отпечатано с оригинала-макета заказчика.

Государственное предприятие "Издательство деловых бумаг "Формиздат" 191011, Санкт-Петербург, канал Грибоедова, 20 Лицензия сер. ЛР № 040098 от 27.09.96.