Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оценка методов дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Оценка методов дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота"



На правах рукописи

СЛЕПЧЕНКО Андрей Дмитриевич

ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД-ТУБЕРКУЛИН У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

11 АПР 2013

005051647

На правах рукописи

СЛЕПЧЕНКО Андрей Дмитриевич

ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД-ТУБЕ РКУЛИН У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в государственном научном учреждении "Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных" Российской академии сельскохозяйственных наук

Ощепков Владимир Григорьевич

заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Аржаков Виктор Николаевич доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заведующий кафедрой экономики, организации сельскохозяйственного производства и ветеринарного дела ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А.Столыпина

Шкиль Николай Алексеевич

заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор, заместитель директора по науке ГНУ ИЭВСиДВ

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана"

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Защита состоится "26" апреля 2013 года, в 10:00 часов, на заседании диссертационного совета Д 220.050.03 при ФГБОУ ВПО "Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина", г. Омск, 644008, Институтская площадь, 2,тел. (3812)24-15-35, факс. (3812) 24-39-63, E-mail: lescheva@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО "Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина".

Автореферат разослан марта 2013 Ученый секретарь диссертационного совета.

кандидат ветеринарных наук, доцент .-¡у Ул1 ,, ЛещёваН.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Туберкулёз сельскохозяйственных животных продолжает оставаться одной из наиболее распространённых инфекционных болезней, представляющей серьёзную угрозу здоровью людей и препятствующая развитию животноводства, хотя следует заметить, что в борьбе с ней в последние годы достигнуты неплохие результаты.

Наметившаяся тенденция, к улучшению эпизоотической ситуации по туберкулёзу в целом по России, указывает на создание в нашей стране довольно эффективной научно -обоснованной системы, позволяющей в большинстве краёв и областей РФ успешно осуществлять оздоровительные и профилактические мероприятия. Однако эта система ещё далека от совершенства.

При туберкулёзе крупного рогатого скота, как ни при какой другой болезни, успех её ликвидации, сохранности поголовья и предупреждения распространения возбудителя во

многом зависит от того, насколько своевременно ставится диагноз.

Степень разработанности темы.

К середине девяностых годов прошлого века, благодаря усилиям учёных многих отечественных НИИ и вузов (М.К. Юсковец, И.В. Поддубский, В.Е. Щуревский, В.П. Урбан, В.И. Рогов, Н.С. Щепилов, H.A. Александров, А.И. Кузин, М.А. Сафин, A.C. Донченю, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, P.A. Нуратинов, В.И. Ротов, H.A. Налетов, О.В. Мартма, Д.Д. Новак, Г.А. Юдин, А.Н. Шаров, Б.Я. Хайкин, Н.М. Колычев, A.C. Жумаш, Ю.И. Смоляни-нов, H.A. Шкиль, В.И. Околелов, H.A. Донченко, Ю. А. Макаров, В.Г. Луницын, В.Н. Кислен-ко, В.В. Разумовская, М.А. Бажин и другие) была усовершенствована методика комплексной диагностики туберкулёза у этого вида животных и включена в обязательные санитарные и ветеринарные Правила, действующие на всей территории РФ. Но и эта уже усовершенствованная методика ещё очень сложна и требует затрат времени на окончательную постановку диагноза до 3 и более месяцев (В.Г. Ощепков 2001,2003 и др.).

Кроме того, в последние годы во многих благополучных регионах стала более очевидной проблема пара- и псевдоаллергических реакций, обусловленных циркуляцией в стадах крупного рогатого скота так называемых атипичных микобаиерий и других патогенов, которые вызывают аллергические реакции на ППД туберкулин. Эти реакции зачастую носят массовый характер и вынуждают в большинстве случаев проводить преждевременный убой здорового, продуктивного скота, нанося значительный материальный ущерб, который зачастую превышает в десятки раз ущерб от туберкулёза.

Цель и задачи исследований.

С учётом актуальности дифференциальной диагностики туберкулёза нами была поставлена цель - дать сравнительную оценку существующим и новым экспресс - методам дифференциальной диагностики аллергических реакций у крупного рогатого скота, вызываемых патогенными мйкобактериями (М. bovis, М. tuberculosis) и другими факторами бактериальной и не бактериальной природы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- провести анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота, сложившейся в Российской Федерации в последние два десятилетия и значимости неспецифических реакций на ППД-туберкулин в диагностике этой инфекции;

- разработать эффективный способ определения аллергизируюших свойств у атипичных микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин;

- дать сравнительную оценку специфичности аллергического метода диагностики туберкулёза и микобактериозов с применением ППД-туберкулина во внутрикожной и паль-пебральной пробах;

- усовершенствовать хемилюминесцентный метод дифференциации туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, содержащегося в благополучных по туберкулёзу фермах;

- провести научно-производственное испытание диагност ического иммунохроматографического теста Во vidTB START-PAK, предложенного фирмой Chembio Diagnostic Systems, Гпс. (США);

- изучить диагностическое значение КАД-теста с новым рекомбинантным аллергеном в условиях благополучных и неблагополучных по туберкулёзу хозяйств;

- разработать комплексную систему дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин с применением традиционных и новых экспресс-методов.

Научная новизна исследований.

Впервые дана комплексная сравнительная оценка аллергического, хемилюминесцентного и иммунохроматографического методов диагностики туберкулёза, а также их значимости в дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин. ^

Экспериментально обоснована комплексная схема прижизненной и послеубойной (посмертной) дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота, включающая модифицированную пальпеб-ральную пробу, внутрикожные пробы с ППД-туберкулином и новым рекомбинантным аллергеном, хемилюминесцентный и культуралыю - генетический методы.

Теоретическая и практическая значимость работы.

На основании результатов сравнительных исследований диагностическим лабораториям, занимающимся проблемами туберкулёза, предложены наиболее надёжные тесты и методики их применения для дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин, проявляющихся в скотоводческих фермах, благополучных по туберкулёзу.

Материалы исследований, приведённых в диссертации и её автореферате, MOiyr быть использованы в учебных программах ветеринарных академий, институтов и колледжей.

Материалы и методы исследований.

Работа по теме выполнялась в период с 2007 по 2012 г. в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулёзом Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллёза и туберкулеза животных. В производственных условиях исследования проводились в животноводческих хозяйствах Омской, Новосибирской и Тюменской областей РФ.

При анализе эпизоотического состояния различных регионов Российской Федерации, в том числе и Омской области, использованы доступные для изучения статистические данные Департамента ветеринарии МСХ, ФГУ "Центр ветеринарии", материалы Главного управления ветеринарии Омской области, областной и районных ветеринарных лабораторий.

Объектом экспериментальных исследований служили: крупный рогатый скот и лабораторные животные (морские свинки). Всего было исследовано 21615 коров и 188 лабораторных животных.

В работе были использованы эпизоотологический, клинический, аллергический, хемилюминесцентный, иммунохроматографический, патологоанатомический, бактериологический, молекулярно - генетический (ПЦР) и культурально - генетический методы исследований. Эпизоотологические, клинические, патологоанатомические и бактериологические исследования выполнены по общепринятым методикам.

При аллергических исследованиях использовали ППД-туберкулин для млекопитающих,

ППД-чуберкулин для птиц и KAM (комплексный аллерген из атипичных миюбакгерии) производства Курской биофабрики. Для внутрикожного, введения тубсркулинов использовали

безигольные иньекторы БИ-7.

Все традиционные диагностические исследования в производственных условиях проводили с участием представителей районных ветеринарных служб и специалистов хозяйств. Работа проводилась в соответствии с Санитарными правилами СП 3.1.093-96 и Ветеринарными правйлами ВП 13.3.1325-96, п. 10 "Туберкулез", утвержденными Госкомсанэпиднадзором и Минсельхозпродом России (1996), а также "Наставлением по диагностике туберкулеза животных" (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации 18.11.2002). Отдельные фрагменты аллергических исследований (пальпебральная проба, КАД-тест) проводили в собственной модификации.

Усовершенствование хемшпоминесцентного метода диагностики, осуществлялось с позиций повышения безопасности его использования и увеличения срока хранения и транспортировки проб крови с жизнеспособными лейкоцитами и их пригодности для диагностических

исследований (до 6 - 7 суток).

Диагностическая ценность усовершенствованного ХЛ-анализа испытана в опытах на 40 морских свинках и на 1249 коровах из благополучных и неблагополучных по туберкулёзу стад.

Иммунохроматографический тест (ИХТ), испытан с учётом рекомендаций сотрудников фирмы-разработчика "Chembio Diagnostic Systems, Inc." (США) и собственных предварительных данных (2007г.).

Антиген, используемый в этом тесте, готовится по генно-инженерной технологии, включающую секвенцию ДНК патогенных мшюбактерий и встраивание генов, кодирующих специфическую структуру их антигенов, в ДНК кишечных бактерий E.coÍi, синтезирующих эти антигены в

нужных количествах. : . "

Такие рекомбинантные антигены обычно отличаются высокой специфичностью и взаимодействуют, как считают авторы этой технологии (Les S., Stuzman et al.), только с антигенами к патогенным микобактериям (М. tuberculosis, М. bovis и др.).

До использования диагностический комплект теста (хроматографические пластинки с антигеном, буферный раствор, сыворотки крови), хранили в оригинальной упаковке фирмы-изготовителя при температуре плюс 2-8°С с обязательным учетом сроков его изготовления.

Первоначально была изучена специфичность и чувствительность в опытах на морских свинках (по 20 голов), а затем в производственных условиях на 249 коровах и нетелях из благополучных и неблагополучных по туберкулёзу ферм. •

Для лабораторных исследований был отобран биологический материал (лимфатические узлы, фрагменты паренхиматозных органов) от 23 5 голов убитого с диагностической целью

крупного рогатого скота.

Пробы отбирали в соответствии с "Методическими рекомендациями по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных", (М„ 1992). Отобранный материал обрабатывали методом Гона и А.П. Аликаевой. Материал использовали для микроскопии, посева на питательные среды (Фаст-ЗЛ, Левеншгейна-Йенсена) и биологического исследования на лабораторных животных (морских свинках).

Животных опытных групп содержали в соответствии с "Правилами работы с использованием экспериментальных животных" (Приложение к приказу министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 №755). Лабораторные животные находились в условиях вивария, кормление осуществляли согласно норм рациона для лабораторных животных (Г.Е. Батрак, A.M. Кудрин, 1979). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных.

5

Идентификацию выделенных культур проводили соответственно ГОСТ 26072-84 "Методы лабораторной диагностики туберкулеза" и ГОСТ 27318-87 - "Методы идентификации атипичных микобактерий". Куяьтурально-морфологические и биохимические свойства мию-бактерий изучали в соответствии с: методическими рекомендациями "Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий" (Оттен Т.Ф., 1994), приказом Минздрава СССР № 558 от 08.06.78 года "Об унификации микробиологических методов исследований-при туберкулезе" и приказом Минздрава РФ № 109 от 21 марта 2003 года "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации".

Бактериоскопические исследования проводили по методу Циля-Нильсена с оценкой результатов в визуализированной системе с фотодокументированием Axiostar plus Cari Zeiss. Результаты обработаны в программе Axiovision Rel 4.7.

Культуралыю-генетический метод исследования, основанный на сочетании культураль-ного посева на модифицированные питательные среды и полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием тест-системы "МТБ-КОМ" производства НИИ эпидемиологии и микробиологии, г. Москва.

Выявление ДНК Mycobacterium tuberculosis complex проводили методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. ПЦР- амплификацию проводили на приборе "AmpIi-4" производства "ДНК-Технология", Россия.

Кожно-аллергический дифференциальный тест (КАД-тест) использовался по методике аналогичной применению "Диаскинтеста" в медицинской практике. Аллерген (антигены-гаптены) для этого теста был изготовлен научно-производственными фармацевтическими фирмами "Лекко" и "Генериум" (Россия) с участием сотрудников ВНИИБТЖ (профессора В.Г. Ощепкова и старшего научного сотрудника Н.Н. Кощеева).

Опытные серии аллергена, условноназванного "НРА" (новый реюмбинаншый аллерген) были испытаны в опытах на 40 морских свинках и2460 норовах, негелях и тёлках скотоводческих ферм (хозяйств), из которых 4 были благополучными и 2 неблагополучными по туберкулёзу крупного рогатого скота.

Все цифровые данные экспериментов и научно-производственных опытов были обработаны методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2007 и с учётом рекомендаций Н.А. Плохинского (1969) и Г.Ф. Лакина (1990).

Отдельные фрагменты исследований выполнялись совместно с канд. ветеринар, наук, доцентом Таллер Л.А., канд. ветеринар, наук Дюсеновой Г.М., канд. ветеринар, наук Бор-дюгом В.Ф., канд. ветеринар, наук Кощеевым Н.Н., канд. ветеринар, наук Секиным Е.Ю., канд. ветеринар, наук Понкратовой А.Д., аспирантом Янченко Т.А. За оказанную методическую и практическую помощь всем им искренне благодарен.

Особую признательность за полезные советы и конструктивные замечания при выполнении и оформлении результатов диссертационной работы выражаю научному руководителю - профессору Владимиру Григорьевичу Ощепкову.

Апробация полученных результатов.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии (Омск, 2008-2012гг.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Института ветеринарной медицины ОмГАУ (Омск, 2009г., 2010г.), на межрегиональных научно-практических конференциях ВНИИБТЖ (Омск 20082012гг.), на международной научно-практической конференции посвященной 105-летию Каз-НИВИ (Алматы, 2010г.), на втором Сибирском ветеринарии конгрессе (Новосибирск, 2010г.),

обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (Омск, 2012г.).

Публикация результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, 4 статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ ("Достижения науки и техники АПК", "Ветеринария и кормление").

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 173 страницах компьютерного набора и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения полученных результатов, заключение, выводы, практические предложения и приложение. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 265 работ, в том числе 208 отечественных и 57 зарубежных авторов.

Основные положения, выноснмые на защиту.

1. Новые экспресс-методы: иммунохроматографический, хемштюминесцентпый, кожно-алдергический дифференциальный обладают более высокой специфичностью, чем традиционная внутрикожная проба с ППД-туберкулином и позволяют объективнее оценивать инфекционный (эпизоотический) статус крупного рогатого скота.

2. Комплексное применение традиционных (пальпебральная проба, патологоанатомиче-ское исследование) и новых экспресс-методов (ХЛ-метод, КАД-тест, КГ-метод) позволяет дать рекогносцировочный ответ: "истинные" или неспецифические реакции на ППД-тубер-кулин у крупного рогатого скота в очень короткие сроки: за 3-ое суток, в особо сложных ситуациях - за 10-12 суток (вместо часто требующихся для этого 1-3 мес.)

Степень достоверности результатов проведённых исследований

Все проведенные исследования соответствующим образом документированы и оформлены в рабочих журналах. Результаты отдельных экспериментов обработаны статистически. Выводы диссертации экспериментально обоснованны и соответствуют полученным результатам.

Проведена комиссионная проверка первичной документации. Первичная документация соответствует материалам исследования, представлена в полном объеме и признана достоверным материалом, который соответствует выполненной работе. Составлен акт проверки достоверности первичной документации № 2 от 09.10.2012 г.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота, сложившейся за последние два десятилетия в Российской Федерации, и значимости неспецифических реакций на ППД - туберкулин в диагностике этой инфекции

Анализ статистических данных ФГУ "Центр ветеринарии" и Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, а также имеющихся публикаций свидетельствует о том, что эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота за последние 15 лет в Российской Федерации неуклонно улучшается. Наблюдается стойкая тенденция снижения как числа неблагополучных по туберкулезу пунктов, так и заболевших животных. Так, если на 01.01.1996 года в РФ было зарегистрировано 814 неблагополучных пунктов, выявлено 36,3 тыс. больных туберкулёзом животных, а характерные для туберкулёза изменения обнаружены у 21,2 тыс. убитого крупного рогатого сиэта, то в 2005 году число неблагополучных пунктов снизилось до 113, а заболевшего сила до 7,9 тыс. голов, то есть их число соответственно сократилось более чем в 7 раз (Таблица 1).

За 12 месяцев 2011 года на территории Российской Федерации оздоровлено 9 из 21 не-

7

благополучных пунктов по туберкулезу крупного рогатого скота. К 2012 году в РФ осталось 12 неблагополучных пунктов.

Одной из основных проблем в диагностике туберкулёза крупного рогатого скота во многих регионах РФ в настоящее время являются неспецифические пара- и псевдоаллергические реакции, на ППД-туберкулин, проявляющиеся в большинстве случаев на благополучных по туберкулёзу фермах. В целом в РФ в 2007-2011 гг. в благополучных по туберкулёзу хозяйствах было выявлено реагирующих на ППД-туберкулин животных в 15 раз больше, чем в неблагополучных.

Эта проблема весьма актуальна и для Западной Сибири. Например, в Омской области неспецифические реакции, в период с 1996 по 2005 гг. были зарегистрированы более чем у 20 тыс. голов крупною рогатого скота, находившегося в благополучных по туберкулезу пунктах. Это почти в десять раз превышало количество больных туберкулезом, реагирующих на ППД-туберкулин и находящихся в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах (2748 гол.).

Выявление реагирующих на ППД-туберкулин наблюдалось фактически во всех 32 районах области с определёнными колебаниями в их абсолютном количестве.

При ретроспективном анализе динамики проявления неспецифических аллергических реакций, проведённом совместно с сотрудниками лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулёзом (Таллер Л.А., Дюсенова Г.М., Кощеев H.H.), было определено, что в хозяйствах, благополучие которых по туберкулёзу крупного рогатого скота подтверждено многолетними и многочисленными исследованиями, эти реакции проявлялись постоянно и у значительного количества животных (до 7,5-10,6% от числа исследованных).

Таблица 1 - Количество неблагополучных пунктов и выявленного больного туберкулёзом крупного рогатого сгота в Российской Федерации в 1996-2011гт.

Годы Неблагополучные пункты Движение больного скота в теч. года (голов)

наличие оздоровле выявлено наличие на заболело сдано на осталось на

на 01.01 но новых 01.01. убой конец года

А 1 2 3 4 5 6 7

1996 814 293 191 36252 53783 60183 27224

1997 712 272 153 29852 38926 47957 20821

1998 593 250 186 20821 31501 36163 16159

1999 529 225 141 16159 22184 24864 13479

2000 445 212 145 13393 21779 24836 10336

2001 377 222 _j 78 10268 9324 15267 8544

2002 234 108 71 8544 6595 9980 5159

2003 197 112 86 5159 12022 14745 2436

2004 171 . 108 50 2531 7674 8969 1216

2005 113 57 45 1234 7360 8285 309

2006 99 30 12 309 5330 5444 195

2007 81 43 18 195 4056 2503 47

2008 56 23 16 59 5014 3064 343

2009 49 34 10 316 2389 2085 12

2010 25 27 20 12 I860 1869 3

2011 13 9 8 3 879 875 4

Итого 4509 2018 1217 145039 265270 267089 79264

При этом мы отметили, что подавляющее большинство (77,9%) реагировавших коров при последующих систематических исследованиях не проявляет повторно реакцию на туберкулин в течение пятилетнего срока наблюдения. У 18,2% первично реагировавших животных реакции проявляются повторно, в основном двукратно, а у отдельных (1-3%) животных 3-; 4-; 5 - кратно.

Собственные аллергические исследования, проведённые в последние 5 лет (2008-2012 гг.), подтвердили ранее полученные в нашей лаборатории данные о том, что пара- и псевдоаллергические реакции на ППД-туберкулин могут проявляться у большого числа исследуемого крупного рогатого скота (до 2-7%), находящегося в благополучных по туберкулёзу стадах, и на протяжении нескольких лет (2-3 года и более). Их проявление нестабильно, и в течение 2,3, или 6 месяцев они у большинства коров исчезают. Однако у многих животных они могут сохраняться до 12 и более месяцев. Поэтому для дифференциации неспецифических реакций необходимы оперативные методы, позволяющие установить истинную природу этих реакций в течение 24-48 часов или же за 3-10 суток.

2.2 Разработка эффективного способа определения аллергизируюших свойств у атипичных микобактернй, выделяемых от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин

В ходе изучения сенсибилизирующих свойств атипичных микобакгерий (АМБ), нами разработана методика быстрого и надежного выявления этих свойств.

При разработке методики первоначально провели изучение аллергизирующих свойств у вида М. ясгоГЫассит.

Вначале определили оптимальную дозу введения культур атипичных микобакгерий, вызывающую аллергические реакции у морских свинок. Для этого вводили атипичные микобактерии в различных дозах.

Введение морским свинкам атипичных микобакгерий видаМ. всго&ксеит (2-ая группа по классификации Раньона) в дозе, регламентированной Наставлением по диагностике туберкулеза животных - 1 мг, не вызвало их аллергизирующего действия. В то же время более высокие экспериментально подобранные дозы (10 и 20 мг/гол) вызывали аллергические реакции у 33,3 - 66,6% подопытных животных.

Для изучения влияния кратности введения одной и той же увеличенной дозы атипичных микобакгерий на проявление аллергических реакций был поставлен второй эксперимент на 12 морских свинках, из которых сформировали четыре группы по 3 морских свинки в каждой (Таблица 2):

- животные 1 группы были заражены подкожно атипичными мигобактериями вида М. всгойЛасеит в дозе 1 мг/мл

- животные 2 группы были заражены также атипичными микобактериями вида М. 5сго(Ыасеит, но в дозе 10 мг/гол. подкожно, при этом общую заражающую дозу делили на 3 равные части и вводили культуру с интервалом в 24 часа;

- животные 3 группы были заражены этой же культурой в дозе 20 мг/гол. аналогично схеме заражения второй группы.

- 4 группа была контрольной (интактной).

Таблица 2 - Результаты аллергических исследований животных, зараженных М. этсгоййасеит по разным схемам

Груп па № Кол- во голов Доза и схема введения М. зсгоАіІасеит Оценка аллергических реакций

До заражения На 30 сутки после заражения

1 3 доза -1 мг/гол однократно №1 - отр №2 - отр №3 - отр №1 - отр №2 - отр №3 - отр

2 3 доза — 10 мг/гол трехкратно №1 - отр №2 - отр №3 - отр №1 - пол №2 - отр №3 - пол

3 3 доза - 20 мг/гол трехкратно №1 - отр №2 - отр №3 - отр №1 - пол №2 - пол №3 - пол

4 3 Контроль №1 - отр №2 - отр №3 - отр №1 - отр №2 - отр №3 - отр

Животные 1 группы (доза 1 мг/мл) на ППД туберкулин не реагировали. Почти все животные с заражающей дозой 10 мг/гол и 20 мг/гол (2,3 группа) реагировали положительно, контрольная группа - отрицательно. Таким образом, второй эксперимент показал, что использованная схема введения атипичной культуры в дозе 10 и 20 мг/гол. дробно (три равные части), с интервалом 24 часа более эффективна и вызывает сенсибилизацию у 66-100% морских свинок.

Эффективность разработанного способа была апробирована при изучении культур четырёх видов атипичных миюбакгерий (М. хепор!, М. Ш0~асе11и1аге, М. эсгоШасеит, М. япе^^паЙБ), выделенных от крупною рогатого скота, реагирующего на ГШД-туберкулин. В ходе апробации было подтверждено, что доза 20 мг/гол. вызвала проявление аллергических реакций у всех изучаемых культур микобактерий

На основании проведенных экспериментов мы пришли к заключению, что разработанный способ повышает достоверность определения сенсибилизирующих (аллергизирующих) свойств у атипичных миюбактерий, и, следовательно, объективность дифференциации парааллергичес-ких реакций у крупного рогатого скота и позволяет предотвратить преждевременный убой продуктивных животных, находящихся в благополучных хозяйствах и реагирующих на ППД-туберкулин по причине персистенции у них атипичных микобактерий, повышающих чувствительность к этому аллергену.

2.3 Изучение дифференциально-диагностической значимости модифицированной иальпебральной пробы с ППД-туберкулином в условиях Омской области

Первоначально провели аллергические исследования в 7 стадах (фермах), находящихся в разных административных районах и природно-климатических зонах Омской области с применением общепринятой внутрикожной пробы с ППД - туберкулином. Из семи ферм четыре считались благополучными (ЗАО "Азовское", ф. Привальное: КФХ "Люфт", ф. "Александ-ровка"; ЗАО "Дружба" ф. Александровка и ф. Петровка) и три неблагополучными (ОГК "Украинский" ф. Украинка; ООО АГХ "Восток" ф. Астыровка; ООО "Восточное" ф. Кулом-зино) по туберкулёзу крупного рогатого скота. Всего было исследовано на туберкулез 10642

голов крупного рогатого скота, в том числе в благополучных хозяйствах - 8811, неблагополучных по туберкулёзу -1831. Выявлено 43 8 животных, реагирующих на туберкулин, из них в благополучных хозяйствах -197, неблагополучных - 241.

При этом было установлено, что в благополучных хозяйствах количество животных, реагирующих на ППД-туберкулин, варьировало от 0,9 до 5,2% (Таблица 3), Для уточнения эпизоотического состояния ферм (хозяйств), дополнительно пальпебральной пробой исследовано 192 коровы, ранее давших реакцию навнутрикожное введение аллергена.

В результате было определено, что из этих 192 коров, находящихся в благополучных по туберкулезу хозяйствах, на пальпебральную пробу с ППД-туберкулином, среагировали 10 (5,2%), причём реагирующие распределились неравномерно: в ферме с. Привальное Азовского района таких было семь (14,3%), в ферме с. Алексеевка Марьяновского района -1 (1,3%), в с. Петровка этого же района - 2 (3,3%), а в ферме с. Александровка Азовского района реагирующих вообще не выявлено.

С диагностической целью животные, реагирующие на внутрикожную и пальпебральную пробу (всего 16 голов), были убиты. При ветеринарно-санитарной экспертизе во внутренних органах и лимфатических узлах тканях изменений, характерных для туберкулеза, нив одном случае не обнаружено. Лабораторными исследованиями, проведенными во ВНИИБТЖ, возбудитель туберкулеза бычьего вида не выделен. На основании этих данных было подтверждено благополучие всех четырёх ферм по туберкулёзу.

Нереагирующие на пальпебральную пробу коровы оставлены в стаде и продукцию от них продолжали использовать без ограничений.

При аллергических исследованиях на туберкулез в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, как уже указывалось, было выявлено 241 животное. Число животных, реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих, колебалось от 4,3 до 22,9% (Таблица 4).

Пальпебральной пробой исследовано 229 животных ранее давших реакцию на внутри-кожное введение аллергена. Положительная реакция на пальпебральную пробу из числа реагирующих на внутрикожную установлена у 171 животного (78,6%).

Показатели пальпебральной пробы в каждом из этих неблагополучных хозяйств зависели от напряженности эпизоотической ситуации по туберкулезу и составляли от 60,3% до 85,1% от числа животных, реагирующих на внутрикожную туберкулиновую пробу. Наибольшее число коров, реагирующих на пальпебральное введение туберкулина, отмечено в ф. Украинка (85,1%).

Все реагирующие на туберкулин животные в неблагополучных хозяйствах были сданы на мясокомбинат. При ветеринарно-санитарной экспертизе туш изменения туберкулезного характера обнаружены у 98 голов (42,8%). У животных, реагирующих на внутрикожную туберкулиновую и пальпебральную пробы, туберкулезные поражения отмечены в 91 случае (39,7%).

И

Таблица 3 - Результаты исследования крупного рогатого скота внутрикожной и пальпеб-ральной туберкулиновыми пробами в благополучных по туберкулезу хозяйствах

Реагировало Реагировало на Результаты исследования

§ * на ППД- пальпебральную пробу о х лимфоузлов и органов

§ 1' туберкулин для (из числа реагирующих 2 о 5 ё ° ^

млекопитающих на вкутрикожную ю £ ж

£ * (в/кожная проба) пробу) > § §

з: голов % . голов % Пат. анатомия |Бактериология"""

Азовский район. ЗАО "Азовское", ф. Привальное

5451 50* 0,9 7 14,3 Отр Отр.

Азовский район. КФХ "Люфт", ф. Ачександровка

563 6 1,1 - - не исслед. не исслед.

Марьяновский район. ЗАО "Дружба", ф Александрова

1503 78" 5,2 1 1,3 6 Отр. Отр.

Марьяновский район, ЗАО "Дружба", ф. Петровка

1294 63'" 4,9 . 2 3,1 5 Отр. Отр.

Всего

8811 197"" 2,2 10 5,2 16 Отр. Отр.

Примечание: * Исследовано пальпебрально 49 голов; * * Исследовано пальпебрально 76 голов; *** Исследовано пальпебрально 61 голов; ****Всего исследовано пальпебрапьно 192 головы; * ****Выделены только атипичные микобактерии Зи4 групп по классификации Раньона (у 7 голое).

Таблица 4 - Результаты исследования крупного рогатого скота внутриюжной и пальпебральной туберкулиновыми пробами в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах

Исследовано животных Реагировало на 1Д-туберкулин для млекопитающих в/кожная проба) Реагировало на іальпебральную :тробу (из числа іеагирующих на внутрикожную пробу) Убито (голов) Выявлены туберкулезные поражения у реагирующих животных

на внутрикожную туберкули новую пробу на внутрикожную туберкулиновую и льпебральную пробы

голов | % голов | % голов | % голов | %

Исилькулъский район. СПК "Украинский", ф. Украинка

573 | 131 * | 22,9 | 109 185,1 | 131 | 68 .52,7 | 56 1 43,8

Горьковский район. ООО АГХ "Восток", ф. Астыровка

634 21** 4,3 18 66,7 27 5 18,5 . 5 18,5

Оконешниковскийрайон. ООО "Восточное", ф. Куломзино

624 83*** ¡3,3 44 60,3 83 25 34,2 30 41,1

Всего

1831 241**** 13,2 171 78,6 241 98 42,8 91 39,7

Примечание: * Исследовано пальпебрально 129 голов; * * Исследовано пальпебрально 27 головы; ***Исследовано пальпебрально 73 головы; **** Всего исследовано пальпебрально 229 голов

Таким образом, результаты исследований показали, что для дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в благополучных и неблагопо-

12

лучных хозяйствах вполне оправдано применение пальпебральной туберкулиновой пробы через 72 или 96 часов после внутрикожной. В связи с тем, что ППД-туберкулин для млекопитающих в нашей модификации вводится только реагирующим животным, сокращается объём исследований и значительно расход аллергена.

2.4 Усовершенствование хемилюминесцентного метода, предназначенного для дифференциальной диагностики неспецифнческих реакций на ППД-туберкулин

В период 1995-2005 гг. был разработан базовый вариант ХЛ-метода, на который был получен патент (№ 2296334 от 27.03.2007г., авторы Г.М. Дюсенова, В.Г. Ощепков). Этот вариант постановки и учёта ХЛ-метода позволяет провести прижизненную экспресс-диагностику острой фазы туберкулёза сельскохозяйственных животных в течение 3-4 часов с момента взятия и доставки проб крови. В качестве неспецифического индукторахемилюминесценции используется люминал и опсонизированный зимозан, ав качестве дополнительного специфического индуктора применяется антиген, извлечённый из патогенных микобактерий.

Однако наращивание бактериальной массы - процесс трудоемкий и длительный (более 2030 суток), работа с живой культурой патогенных микобактерий представляет определенную опасность для исследователя. Поэтому в дальнейших исследованиях была поставлена задача по снижению трудоемкости способа, повышению безопасности и эффективности путем использования в качестве специфического индуктора поверхностный антигенный комплекс цельных инак-тивированиых микобактерий из вакцинного штамма БЦЖ.

Техника постановки и учёта хемилюминесцентного анализа была следующей: суспензию полученных отмытых лейкоцитов ресуспендировали в стабилизирующем растворе, доводили концентрацию лейкоцитов до 2 млн. клеток в 1 мл. Определяли жизнеспособность клеток 1%-ным трипановым синим в камере Горяева, добиваясь, чтобы число живых клеток составляло 90-95%.

Затем к лейкоцитам добавляли: раствор люминола; зимозан, опсонизированный пулом сывороток от здоровых животных, специфический антиген микобактерий - взвесь инактиви-рованных микобактерий в изотоническом растворе №01.

В результате проведения этих экспериментов, было установлено, что модифицированный вариант изготовления специфического антигена из микобактерий штамма БЦЖ снижает трудоемкость и сокращает процесс подготовки специфического индуктора хемилюминесценции до 2-х час, снижает материальные затраты в 10-15 раз. Кроме того, предлагаемый способ является более безопасным.

В дальнейшем (2010-2011 гг.) мы поставили следующую задачу - продлить срок пригодности для хемилюминесцентного исследования проб крови, взятых от животных, реагирующих на ППД-туберкулин. В базовом варианте ХЛ - метода этот срок составлял лишь 3-4 часа, потому для большинства хозяйств, в которых требовалось проводить дифференциальные исследования, доставить за это время пробы крови в нашу лабораторию было очень проблематично, особенно для тех которые находились за 300-500 км и более от г. Омска.

Для решения этой весьма важной задачи, мы и продолжили усовершенствование метода. Основное внимание было уделено изучению возможности увеличения срока сохранения жизнеспособных лейкоцитов, предназначенных для хемилюминесцентного исследования, до 5-7 суток (вместо 3-4 ч. в базовом варианте).

При взятии проб крови от исследуемых животных и транспортировке их из различных хозяйств и регионов РФ (Тюменская обл., Омская обл.) использовали 3 гемоконсерванта: "Фаглюцид" производства ОАО "Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий "Синтез"; растворы ЦФГ/САГМ и ЦФДА-1, ЗАО "Дельрус", Россия.

13

Результаты опытов показали, что гемоконсервант "Фаглюцид", обеспечивает сохранение морфофункциональной полноценности крови крупного рогатого скота в течение 5-7 суток за счет поддержан™ физиологического уровня АТФ в эритроцитах, реологических свойств крови и величины pH на физиологическом уровне.

Соотношение объёма гемоконсерванта Фаглюцид и крови крупного рогатого скота 1:6 обеспечивает необходимую для исследований концентрацию жизнеспособных лейкоцитов (90-95%) в течение 144-168 часов с момента взятия пробы крови (вместо 3-4 часов в базовом варианте XJT).

Апробация усовершенствованного ХЛ-метода в эксперименте на 40 морских свинках и в производственных условиях на крупном рогатом скоте благополучных по туберкулёзу хозяйств, показала, что первый его вариант (с антигеном из микобактерий штамма БЦЖ) может быть с успехом использован для изучения глубинных молекулярно-клеточных аспектов вакцинального и инфекционного процессов, вызываемых культурами БЦЖ и патогенными микобактериями, а второй вариант (молекулярный антиген патогенных микобактерий и "Фаглюцид") - для дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин.

2.5 Результаты испытания иммунохроматографического теста BovidTB START -РАК для дифференциальной диагностики туберкулеза и мнкобактериозов крупного рогатого скота

В настоящей диссертационной работе приводятся также данные, полученные при испытании иммунохроматографического (ИХГ) теста BovidTB, созданного американской фирмой "Chembio, Diagnostic Systems Inc." и предназначенного для выявления в сыворотке животных, больных туберкулезом, иммуноглобулинов, специфичных к антигенам патогенных микобактерий (М. bovis, М. tuberculosis и др.).

Ранее в России этот тест не применялся. Испытание BovidTB теста проводилось нами в хозяйствах Омской и Новосибирской областей. Было исследовано 249 проб сыворотки крови, из которых 127 были взяты от крупного рогатого скота, находящегося в благополучных и 122 в неблагополучных по туберкулезу фермах.

В набор теста входили: хроматографические пластинки с заранее внесенными на них специфическими антигенами патогенных микобактерий; пробирки для хранения сыворотки крови емкостью 0,5 мл; буферный раствор, содержащий протеино-латексный комплекс; микропипетки емкостью 30 мкл.

Антиген, используемый в этом тесте, готовится, как уже указывалось, по генно-инженерной технологии с использованием патогенных микобактерий и кишечной палочки Е. coli.

Перед началом работы хроматографические пластинки нумеровали и раскладывали по планшетам. Затем наносили на них по 30 мкл тестируемой сыворотки, полученной из проб цельной крови, взятой из яремной вены исследуемых животных. После этого на хроматографические пластинки наносили буферный раствор в объеме 30 или 90 мкл.

Если в исследуемой сыворотке присутствовали специфические антитела, то они вместе с буферным раствором мигрировали по хроматографической пластинке и взаимодействовали в зоне, обозначенной буквой "Т", с фиксированным антигеном и в результате образования иммунного комплекса антиген + антитело в этой зоне появлялась синяя (голубая) поперечная линия (полоска). При отсутствии специфических антител синяя линия не появлялась в зоне "Т", а испытуемая сыворотка с буферным раствором продолжала мигрировать по хроматографической пластинке до зоны, обозначенной буквой "С", в которой также появлялась поперечная синяя линия (контрольная), свидетельствующая о том, что все ре-

агенты теста работают правильно.

Учет результатов проводили через 15-20 минут. Тест считали положительным, если на хроматографичесшй пластинке появлялись две поперечные синие линии: в зоне "Т" и в зоне "С". Если появлялась только одна линия в зоне "С", то тест считали отрицательным.

Полученные при исследовании проб сыворотки показания ЕктсЛ В теста в необходимых случаях сопоставлялись с общепринятыми прижизненными и послеубойными методами диагностики: аллергическим (внутрикожная проба с ППД-туберкулином), пагологоанатомическим, микроскопическим, культуральным и биологическим (биопроба на морских свинках).

Такие сопоставления были проведены по 154 пробам сыворотки крови, в том числе в благополучных хозяйствах по 103 пробам и неблагополучных - по 51 пробе. Из данных, представленных в таблице 5, видно, что в условиях благополучных по туберкулёзу хозяйств диагностическая значимость иммунохроматографического теста в целом значительно выше, чем внутрикожной пробы с ППД-ту беркулином.

Таблица 5 - Диагностическая значимость Воу1(1ТВ теста в благополучных по туберкулезу хозяйствах

Хозяйство Исследовано голов в/к* пробой с под- туберкулином Реагировало положительно на в/к пробу Из них реагировало положительно в BovidTB Результаты патологоанатоми ческих и бактериологичес ких исследований

всего % всего %

№1 63 12 19,0 9 14,2 Отр.

№2 540 40 7,4 20 3,7 Отр.

Итого 603 52 8,6 29 4,8 Отр.

Примечание: * в/к проба - внутрикожная проба

Так, при исследовании 63 голов крупного рогатого скота, находящихся в благополучном хозяйстве (№1), ложноположительные аллергические реакции на ППД-туберкулин были установлены у 12 гол. (19,4%), а при исследовании BovidTB тестом положительные серореакции выявлены только у 9 гол (14,2%). Еще более контрастные результаты были получены во втором благополучном хозяйстве (№ 2), где при аллергическом исследовании 540 голов крупного рогатого скота положительно реагировали наППД-туберкулин 40 животных (7,4%). При иммунохро-магографическом исследовании этих 40 реагирующих на аллерген голов крупного рогатого енота, только 20 (50%) дали положительную реакцию. Всего по этим двум хозяйствам из 603 голов крупного рогатого скота 52 гол.(8,6%) положительно реагировали на ППД-туберкулин, из них реагировало положительно в BovidTB тесте лишь 29 гол. (4,8%).

Если оценивать диагностическую эффективность BovidTB теста в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, то можно определённо отметить, что иммунохроматографический тест и в этих условиях показал довольно хорошие результаты. В восьми хозяйствах при исследовании 860 гол.крупного рогатого скота с его помощью было выявлено 51 положительно реагирующих животных, имеющих характерные признаки туберкулеза. Очень важно отметить, что у 47 (92,1%) наличие туберкулеза было подтверждено другими (традиционными) методами.

При этом положительный результат испытуемого теста в 60,7% - совпал с положительным результатом микроскопических исследований и в 56,8% -выделением культур возбудителя туберкулеза (М. bovis) на питательных средах.

15

Таким образом, испытание диагностического теста BovidTB (США) в условиях благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств показало, что он обладает удовлетворительной специфичностью и достаточно высокой чувствительностью, и может быть использован как рекогносцировочный экспресс - тест для прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и выбора животных для контрольно-диагностического убоя.

2.6 Апробация кожно-аллергнческого дифференциального тсста (КАД-тест)

В 2009 году учёными НИИ молекулярной медицины и специалистами фармацевтической фирмы "Лекю" с участием научных сотрудников ГНУ ВНИИБТЖ (профессор В.Г. Ощепков, старший науч. сотрудник H.H. Кощеев) по специальной генно-инженерной технологии, включающую секвенцию ДНК патогенных микобактерий и встраивание генов, кодирующих специфическую структуру их антигенов, в ДНК кишечных бактерий E.coli, синтезирующих эти антигены в нужных количествах, был создан новый рекомбинантный аллерген.

Рекомбинантный аллерген, предназначен для дифференциации аллергических реакций, возникающих в результате персистенции у крупного рогатого скота микобактерий - возбудителей туберкулёза (М. bovis, М. tuberculosis) и атипичных микобактерий.

На первом этапе испытаний, в эксперименте на 40 морских свинках была произведена проверка специфичности и активности нового аллергена (НРА), в сравнении со стандартным диагностическим ППД-туберкулином, выпускаемым Курской биофабрикой.

Эксперимент показал, что.если животные заражены патогенными микобактериями, например М bovis, то у них. возникают аллергические реакции, которые можно выявить внутрикожной пробой как с ППД-туберкулином, так и с НРА. Если животные были заражены атипичными микобактериями, хотя и в большей дозе (40 мг), но однократно, то аллергические реакции к ППД-туберкулину и новому аллергену к 45 суткам у них не развиваются.

Производственное испытание дифференциальной значимости нового аллергена проведено в 6-ти стадах (фермах) Омской и Новосибирской областей, в четырёх благополучных (СПК "Сибэталон", ЗАО "Солнцево", СПК "Таволжан", С ПК "Сибиряк") и двух неблагополучных по туберкулёзу крупного рогатого скота (2 фермы ООО "Маяк" Чановского района Новосибирской области).

В обеих категориях стад изучение дифференциальной значимости НРА проводили в сравнении с традиционным ППД-туберкулином, выпускаемым Курской биофабрикой.

Всего в благополучных и неблагополучных стадах было исследовано 8543 коров, нетелей и тёлок старше одного года. На 2460 из них была проведена сравнительная оценка разных доз: 5 тыс. и 10 тыс. усл. ТЕ.

Каких-либо различий в активности и специфичности этих доз установлено не было. Поэтому, в дальнейшем мы использовали лишь одну дозу - 5 тыс. усл. ТЕ.

Результаты испытания нового решмбинантного аллергена, применённого в дозе 5 тыс. усл.

, ТЕ показали, что по чувствительности НРА в применённой дозе уступает ППД-туберкулину, зато по специфичности превосходит.

В четырёх благополучных по туберкулёзу стадах (фермах), находящихся в Омской и Тюменской областях (Таблица 6) НРА и ППД-туберкулином было исследовано 8105 голов коров и нетелей. Полученные результата резко контрастировали с результатами полученными в первой категории стад.

Если на ППД-туберкулин реакции наблюдались у 131 голов коров и нетелей (с колебаниями от 18 до 46 голов по ферме), то на НРА - ни одной, что полностью соответствовало

эпизоотическому статусу ферм в которых проводились исследования.

Таблица 6 - Результаты сравнительного испытания специфичности НРА и ППД-тубер-кулина в благополучных по туберкулёзу хозяйствах

Наименование ферм хозяйств Исследовано аллергическо й пробой голов Из них реагировали: Результаты патологоанатомических и бактериологии, иссле.

на НРА на ППД-туберкулин

abe % abe %

СПК «Сибиряк» 2937 - 45 1,5 отрицательно

ЗАО «Солнцево» 1670 - - 22 1,3 отрицательно

СПК «Таволжан» 1768 - - 46 2,6 отрицательно

СПК «Сибэталон» 1728 - - 18 1,0 отрицательно

Всего 8105 - - 131 1,6 Туберкулёз исключён

Следовательно, НРА безусловно является очень перспективным препаратом и после его усовершенствования с позиции повышения чувствительности, и он вполне пригоден для дифференциации неспецифических реакций, возникающих у крупного рогатого скота на благополучных по туберкулёзу фермах. Более того, внутрикожная проба с новым реком-бинантным аллергеном при соответствующей доработке (повышении чувствительности) в перспективе, видимо, вполне может заменить аналогичную пробу с ППД-туберкулином при массовой диагностике туберкулёза у крупного рогатого скота.

2.7 Комплексная дифференциация неспецнфическнх реакций на ППД-туберку-лин с применением традиционных и новых методов

В современных эпизоотических условиях по туберкулёзу надёжные результаты по дифференциации пара- и псевдоаллергических реакций, возникающих у крупного рогатого скота, находящихся в благополучных по этой инфекции фермах, пока могут быть получены только при использовании нескольких методов и средств.

Учитывая это обстоятельство, мы на основании полученных данных предлагаем осуществлять ускоренную дифференциацию с использованием традиционных и новых методов диагностических исследований.

Причём диагностический комплекс может выполняться в трёх вариантах.

Первый вариант ускоренной схемы дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота предусматривает исследование реагирующих на этот аллерген сразу тремя тестами: пальпебральной пробой с ППД-туберкулином, кожно-аллергическим дифференциальным (КАД) и хемилюминесцентным (ХЛ).

Время проведения первого теста составляет 72 часа, второго - 72 часа и третьего - 3-4 часа.

В случае получения по всем трём тестам отрицательного результата, аллергические реакции на традиционную внутрикожную пробу с ППД-туберкулином признаются неспецифическими, а стадо (ферма, хозяйство) благополучными по туберкулёзу.

Заключение о благополучии стада делается даже в том случае, когда при отрицательных результатах ХЛ-метода и КАД-теста, на пальпебральную пробу с ППД-туберкулином реагируют до 1-14% животных, так как наши исследования показали, что до 2-3% и даже до

14,2% могут реагировать на пальпебральную пробу и в длительно благополучных фермах.

Если во всех трёх тестах (пальпебральная проба, КАД-теса; ХЛ-метод) число реагирующих составит более 15-25% от числа реагирующих на традиционную внутрикожную "шейную" пробу с ППД-туберкулином, то стадо (ферма, хозяйство) признаётся неблагополучным по туберкулёзу и в нём начинают проводить соответствующие оздоровительные мероприятия.

Второй вариант комплексной схемы дифференциации аллергических реакций основан на применении традиционной пальпебральной пробы с ППД-туберкулином, патологоана-томических исследованиях и двух новых методов: хемилюминесцентном анализе (ХЛ-ана-лиз) и культурально-генетическом методе (КГ-метод), предусматривающим применение питательных сред со стимуляторами роста микобактерий и ПЦР.

На первом этапе реагирующим на внутрикожную пробу с ППД-туберкулином ставят пальпебральную пробу с этим же аллергеном и одновременно от них берут пробы крови для ХЛ-анализа. Если оба этих дифференциальных теста дадут отрицательный результат, то стадо продолжают считать благополучным. Если выявятся единичные животные (одна, две или три головы), реагирующие положительно в одном из этих тестов или одновременно в обоих, то проводят их диагностический убой с последующим проведением патологоанатоми-ческих и культурально-генетических исследований. Культурально-генетический метод исследований разработан во ВНИИБТЖ сотрудниками лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулёзом (Таллер Л.А., Вассимирская Т.А., Ощепков В.Г. и др.) в 2007-2009 гг. Сущность его сводится к посевам биоматериала (паренхиматозные органы, лимфатические узлы), взятого от исследуемых животных на питательные среды (ФАСТ-ЗЛ, СФД-1 или СФД-2), содержащие стимуляторы роста микобактерий и затем исследование через 3-5 суток "слепых" смывов, сделанных физиологическим раствором с поверхности питательных сред, в ПЦР с праймерами для патогенных микобактерий (М. bovis и М. tuberculosis). При наличии в органах или лимфатических узлах ДНК даже нескольких клеток возбудителя туберкулёза (М. bovis или М. tuberculosis), ПЦР в 100% случаев даёт положительный результат. Таким образом, через трое суток, а с учётом убоя и послеубойных патолого анатомических и культураль-но - генетических исследований (3-5 суток) окончательный диагностический результат может быть получен на 6-е, 8-е, в крайнем случае, на 10-е, 12-е сутки после начала дифференциальных исследований.

Если по техническим причинам нет возможности применить ХЛ-метод (отсутствие соответствующего оборудования), то дифференциальные исследования проводятся по третьему варианту. По этому варианту исследования осуществляются примерно по той же схеме, что и во втором варианте, с той лишь разницей, что вместо ХЛ-метода, используют кэжно-аллергический дифференциальный тест (КАД-тест) с новым рекомбинантным аллергеном (НРА).

Этот тест применяют для исследования реагирующих на ППД-туберкулин животных одновременно с внутрикожной пальпебральной пробой с ППД-туберкулином. И далее, при необходимости, на втором этапе используют патологоанатомический и культурально-гене-тический методы.

Окончательный диагностический результат также как и по второму варианту исследований может быть получен за 6 или за 10-12 суток, вместо часто требующихся для этого 13 мес., предусмотренных существующим "Наставлением по диагностике туберкулёза животных" (М., 2002г.)

3. выводы

1. Ретроспективным анализом установлено, что в последние два десятилетия на фоне значительного улучшешы в Российской Федерации эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота (число неблагополучных пунктов сократилось в 7 раз) во многих регионах стала более значимой проблема неспецифических реакций на ППД-тубер-кулин: в период с 2007г. по 2011 г. в благополучных по туберкулёзу хозяйствах было выявлено реагирующих на ППД-туберкулин животных в 15 раз больше, чем в неблагополучных. Последнее обстоятельство обязывает НИИ и практическую ветеринарную службу вести оперативный поиск, испытание и внедрение в практику новых эффективных экспресс - методов дифференциации пара- и псевдореакций на этот диагностический аллерген.

2. В Западной Сибири (Омская, Новосибирская области) неспецифические реакции на ППД-туберкулин могут наблюдаться у значительного числа исследуемого крупного рогатого скота (до 7-10% и более) и проявляться в одном и том же стаде (хозяйстве) длительнее 2-3 лет. У большинства коров (77,9%) неспецифические реакции проявляются однократно, но у некоторых (18,2%) проявляются два, три, четыре и даже пять раз с разным интервалом: в 3,6. 12 или 36 мес.

3. В случае выделения у крупного рогатого скота, находящегося в благополучной по туберкулёзу ферме и реагирующего на ППД-туберкулин, атипичных микобакгерий I-IV групп по Раньону и определения у них способности к индукции парааллергических реакций к этому аллергену, их культуры лучше вводить морским свинкам в дозах 10 мг или 20 мг (предпочтительнее 20 мг). При этом избранную дозу необходимо водить каждой морской свинке трёхкратно в равных объёмах (по 3-4 мг или 6-7мг) и с интервалом 24 часа, так как эта методика повышает достоверность исследований и позволяет получить объективный результат в 66-100% случаев.

4. Модифицированная схема постановки и учёта пальпебральной пробы, предложенной ВИЭВ, показала в условиях Сибири (Омская область) сравнительно высокую надёжность и возможность её использования в большинстве ферм (75%), где требуется дифференциация специфических и неспецифических аллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД-туберкулин.

5. Иммунохроматографический тест (Bovíd ТВ-тест, США) основанный на выявлении иммуноглобулинов в сыворотке крови животных, инфицированных различными видами микобакгерий, обладает более высокой специфичностью, чем внутрикожная проба с ППД-туберкулином и даёт при исследовании крупного рогатого скота на благополучных по туберкулёзу фермах на 40-45% меньше неспецифических реакций.

6. Усовершенствованный хемилюминесцентный метод (ХЛ-метод), предусматривает также как и базовый вариант, регистрацию разницы сверхслабого свечения иммунокомпе-тентных клеток крови (лимфоцитов, нейтрофилов и др.) у здоровых и заражённых патогенными микобактериями (М. bovis, М. tuberculosis) животных. Но при этом отличается от базового варианта, ранее разработанного во ВНИИБТЖ (2007г.), безопасностью приготовления специфического антигена-индуктора хемилюминесценции и пролонгированной пригодностью проб крови для ХЛ-анализа до 6-7 суток (вместо 3-4 часов).

Последний вариант ХЛ-анализа, обладая более высокой специфичностью, чем внутрикожная и пальпебральная пробы с ППД-туберкулином, может использоваться в комплексной дифференциальной диагностике, а в дальнейшем и самостоятельно для отличия неспецифических реакций на ППД-туберкулин.

7. Внутригожная проба с новым рекомбинантным аллергеном (НРА), изготовленным по генно-инженерной технологии, уступая традиционной пробе с ППД-туберкулином в чувствительности, показала 100%-ную специфичность при исследовании крупного рогатого скота, находящегося на благополучных по туберкулёзу фермах и реагирующего (от 18 до 46 голов) на ППД-туберкулин.

8. В современных эпизоотических условиях по туберкулёзу дифференциация неспецифических реакций должна проводиться комплексно с применением традиционных и новых (инновационных) методов, при этом сроки дифференциальных исследований не должны превышать 24-48ч. или же 3-12 суток. В качестве инновационных экспресс-методов для широкого производственного испытания могут быть приняты усовершенствованный ХЛ-метод и кожно-аллергический тест с новым рекомбинантным аллергеном, показавшие наиболее перспективные результаты при их предварительной апробации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В научных и производственных диагностических лабораториях при изучении аллер-гизирующих свойств у атипичных микобактерий 1-Г/ групп по Раньону и определения их этиологической роли в развитии парааллергических реакций у крупного рогатого скота лучше использовать трёхкратное введение их культур морским свинкам в дозе 20 мг, которую следует вводить каждой морской свинке трёхкратно, равными дозами (по 6-7 мг) с интервалом в 24 часа. Учёт их аллергизирукмцей способности проводить внутрикожной пробой с ППД-туберкулинсм через 30 суток после заражения животных.

2. В НИИ и научных лабораториях, занимающихся разработкой методов и средств дифференциальной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота, целесообразно включать в диагностический комплекс усовершенствованный хемилюминесцентньш метод и внут-рикожную пробу с новым рекомбинантным аллергеном.

3. Методические рекомендации "Система противоэпизоотических мероприятий по профилактике и ликвидации хронических болезней животных", утверждены секцией животноводства центра научного обеспечения АПК Омской области (при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области), прот. №9 от 15.11.2008 г.

4. Схемы ускоренной дифференциации аллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД-туберкулин с применением традиционных (пальпебральная проба, патолого-анатомические исследования) и инновационных (ХЛ-анализ, КАД-тест) методов. Три варианта. Срок исследований от 3-х до 10-12 суток.

5. Методические рекомендации "Модифицированный хемилюминесцентный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота", утвержденные подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, прот. №6 от 12.10.2010 г.

6. Материалы исследований приведённых в диссертации и её автореферате, могут быть использованы в учебных программах ветеринарных академий, институтов и колледжей.

СПИСОКРАБОТОПУБЛИКОВАШЛЫХПОТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ощепков В.Г. Культурно-генетический метод диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / В.Г. Ощепков, JI.A. Таллер, ЕЛО. Секии, Т.А. Вассимирская, А.Д. Слепченко // Достижения науки и техники АПК. - 2010. - N 5. - С. 64-65

2. Таллер Л .А. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота / Л.А. Таллер, В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секип, Т.А. Янченко, А.Д. Слепченко // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9- С 67-69.

3. Дюсенова Г.М. Значение пальпебральной и симультанной проб при дифференциальной диагностике туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах. / Г.М. Дюсенова, JI.A. Таллер, В.Ф. Бордюг, А.Д. Слепченко // Ветеринария и кормле-ние.-2009-№4-С. 14-16.

4. Ощепков В.Г. Резервуары атипичных микобактерий в дикой и синантропной фауне Прииртышья / В.Г. Ощепков; В.Ф. Бордюг; H.H. Кощеев; А.Д. Слепченко; А.Г. Гардер // ВЕТКОРМ - 2012 - №4 С. 24-27.

5. Патент РФ №2438700 Способ определения сенсибилизирующих свойств атипичпых микобактерий / H.H. Кощеев, В.Ф. Бордюг, В.Г. Ощепков, А.Д. Панкратова, А.Д. Слепченко, заяв, от 11.01.2010 опубл. 10.01.2012.

6. Патент РФ JV>2456595 Способ сохранения жизнеспособных клеток крови для хемилюминес-центных исследований У Г.М. Дюсенова, В.Г. Ощепков, А.Д. Слепченко, заяв, от 04.10.2010 опубл. 20.07.2012.

7. Бордюг В.Ф. Применение усовершенствованной методики постановки пальпебральной пробы для дифференциальной диагностики туберкулеза. / В.Ф. Бордюг, В.Г. Ощепков, Г.М Дюсенова., КН. Кощеев, А.Д. Слепченко // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций /Всерос. науч.-исслед, ин-т бруцеллеза и туберкулезаживотных.-Омск, 2009.-С. 108-112.-Библиогр.:С.111-112.

8. Дюсенова Г.М. Разработка и усовершенствование хемилюминесцентного метода для прижизненной диагностики туберкулеза / Г.М. Дюсенова, В.Г. Ощепков, А.Д. Слепченко // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций / Всерос. науч.-исслед. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных.-Омск, 2009.-С. 116-120.-Библиогр.: С.120.

9. Ощепков В.Г. Ускоренная диагностика туберкулеза животных / В.Г. Ощепков, Л.А. Таллер, Е.Ю. Секин, Т.А. Вассимирская, А.Д. Степченко // Межведомственный тематический сборник "Ветеринарная медицина". - Харьков, 2010. - С. 26-28.

10. Ощепков В.Г. О длительности и повгорности проявления неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота / В.Г. Ощепков, J1.A Таллер, Г.М. Дюсенова, Т.А. Вассимирская, АД. Слепченко // Актуальные проблемы инновационного развитая ветеринарной науки и практики: материалы Междунарси. науч.-практ. конф., посвяш. 105-летию КазНИВИ. - Алмагы, 2010. - С. 274-279.

11. Ощепков В.Г. Усовершенствование хемилюминесцентного метода для прижизненной диагностики туберкулеза/Ощепков В.Г., Таллер JI.A., Дюсенова Г.М, Слепченко А.Д. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины. Материалы 2-го Сибирского ветеринарного конгресса//Новосибирский Государственный Аграрный Университет-Новосибирск, 2010. С. 387

12. Система противоэпизоотических мероприятий по профилактике и ликвидации хронических болезней животных. Методические рекомендации. / Сост. Ошепкнв В.Г, Бажин М.А., Бордюг В.Ф., Таллер ДА, Кощеев H.H., Власенко B.C., Панкратова А.Д., Дюсенова ГМ., Слепченко АД. и др.; ГНУ ВНИИБТЖ РОССЕЛЬХО-ЗАКАДЕМИН Омск, 2008. 36 с.

13. Модифицированный хемилюминесцентный метод прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Методические рекомендации. / Сост. Ощепков В.Г., Дюсенова Г.М., Слепченко А.Д.; ГНУ ВНИИБТЖ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ. Омск, 2010. _

Компьютерная вёрстка А.И. Ушакова Подписано з печать 22.03.13 Гарнитура Times New Roman Syr. Формат 60 x 84 V„ Бумага офсетная Печать ризограф Тираж 100 экз. Заказ № 22t

Издательство «Амфора» 644001, Омск. ул. Лермонтова, а. 93. Тел (3S12) 56-31-28 e-mail amfora2002@inbox.rii

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Слепченко, Андрей Дмитриевич, Омск

Российская академия сельскохозяйственных наук ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

На правах рукопири

Слепченко Андрей Дмитриевич

ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ППД-ТУ Ь Е Р КУЛ ИЙГ^^ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

;

Специальность 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпиотология, микология с микотоксикологией и иммунология

XI Диссертация

ю

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ю „ ю 5 со 8

ю о

СМ Я

Научный руководитель:

Ч^1 ^ заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Ощепков В.Г.

Омск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................. 3

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................. 12

1.1. Современная классификация и свойства патогенных и условно-патогенных (атипичных) микобактерий............................................ 12

1.2. Особенности диагностики туберкулёза у крупного рогатого скота в новых условиях развития животноводства.......................................... 22

1.3. Этиология и методы дифференциации неспецифических реакций у

крупного рогатого скота на ППД-туберкулин..................................... 33

1.4 Заключение по обзору литературы.............................................. 40

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................... 44

2.1 Характеристика эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота, сложившейся за последние два десятилетия в Российской Федерации и значимости неспецифических реакций на ППД - туберкулин

в диагностике этой инфекции.......................................................... 44

2.2 Разработка эффективного способа определения аллергизирующих свойств у атипичных микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин....................................................... 61

2.3 Изучение дифференциально-диагностической значимости модифицированной пальпебральной пробы с ППД-туберкулином в условиях Омской области........................................................................................................ 67

2.4 Усовершенствование хемилюминесцентного метода, предназначенного для дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД-туберкулин................................................................................................. 72

2.5 Результаты испытания иммунохроматографического теста BovidTB START-PAK для дифференциальной диагностики туберкулеза и мико-бактериозов крупного рогатого скота............................................... 81

2.6 Апробация кожно-аллергического дифференциального теста (КАД-

теста)..................................................................................................................... 86

2.7. Комплексная дифференциация неспецифических реакций на ППД-туберкулин с применением традиционных и новых методов........................ 93

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ............................... 99

ВЫВОДЫ...................................................................................... 118

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................................... 120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.................... 122

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................... 123

ПРИЛОЖЕНИЕ....................................................................................................... 149

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

В новых условиях развития животноводства, производства мяса, молока и других пищевых продуктов необходимо обеспечить благополучие хозяйств по инфекционным болезням, в том числе и по туберкулёзу.

Туберкулёз сельскохозяйственных животных продолжает оставаться наиболее распространённой инфекционной болезнью, представляющей серьёзную угрозу здоровью людей и препятствующей развитию животноводства.

Наметившаяся тенденция к улучшению эпизоотической ситуации по туберкулёзу в целом по России, указывает на создание в нашей стране научно обоснованной системы, позволяющей в большинстве краёв и областей РФ успешно осуществлять оздоровительные и профилактические мероприятия. Однако эта система ещё далека от совершенства.

В общем комплексе мер борьбы с туберкулёзом сельскохозяйственных животных решающее значение имеет лабораторная диагностика. Её целью является подтверждение специфических слабовыраженных и отсутствующих изменений в органах специальным патоморфологическим их изучением и обнаружение возбудителя в патологическом материале убитых животных посредством микроскопии, бактериологических посевов или постановкой биологической пробы.

Степень разработанности темы

К середине девяностых годов прошлого века отечественными учёными, такими как М.К. Юсковец, И.В. Поддубский, В.Е. Щуревский, В.П. Урбан, В.И. Ро-тов, Н.С. Щепилов, H.A. Александров, А.И. Кузин, М.А. Сафин, A.C. Донченко, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, P.A. Нуратинов, H.A. Налетов, О.В. Мартма, Д.Д. Новак, Г.А. Юдин, А.Н. Шаров, Б.Я. Хайкин, Н.М. Колычев, A.C. Жумаш, Ю.И. Смолянинов, H.A. Шкиль, В.И. Околелов, H.A. Донченко, Ю.А. Макаров, В.Г. Луницын, В.Н. Кисленко, В.В. Разумовская, М.А. Бажин и другими, была усовершенствована методика комплексной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота и включена в обязательные санитарные и ветеринарные Правила, действующие на всей территории РФ. Но и эта уже усовершенствованная методика

ещё очень сложна и требует затрат времени на окончательную постановку диагноза до 3-х и более месяцев (В.Г. Ощепков и др. 2000).

Кроме того, в последние годы во многих благополучных хозяйствах острой стала проблема пара - и псевдоаллергических реакций, обусловленных циркуляцией в стадах крупного рогатого скота, так называемых атипичных микобактерий и других патогенов, которые вызывают аллергические реакции на Ш1Д-туберкулин. Эти реакции зачастую носят массовый характер и способствуют преждевременному убою здорового, продуктивного скота, нанося значительный материальный ущерб, который зачастую превышает в десятки раз ущерб от туберкулёза. Парааллергические реакции на туберкулин часто отмечали у сенсибилизированных атипичными микобактериями животных М.А. Журнакова и соавт., 1964; А.И. Тогунова, 1965; О.В. Мартма, 1967, 1971,1982; A.B. Акулов, B.C. Ты-рина, 1969; Г.А.Юдин, 1976, 1986; Д.Д. Новак, 1977; А.О. Бокун, 1977; В.И. Ротов и др., 1978; A.C. Донченко с соавт., 1980, 1987; Z. Corner, 1981; В.И. Пионтков-ский с соавт., 1987; В.А. Сысоев, 1982; A.M. Кадочкин, 1983; Ю.И. Смолянинов, JI.A. Кучина, 1984; В.Н. Кудяков, 1984; Н.М. Мандро и соавт, 1985; A.A. Ткачен-ко, 1985; Ю.Л. Кассич с соавт., 1985, 1990, 1991; P.A. Нуратинов, 1987; Ю.И. Смолянинов, 1994; М.А. Сафин 1992; Ю.Ю. Данко, 2000; А.Х. Найманов, 2002; J. Schneider, 1998; Н.М. Колычев 2004; А.И. Прокопьева, 2007; Ф.Р. Латыпов с соавт., 2009; И.М. Донник, В.П. Краснопёров с соавт., 2011; В.Г. Ощепков с соавт., 2001, 2010 и многие другие.

Цель и задачи исследований

Цель исследований - дать сравнительную оценку существующим и новым экспресс - методам дифференциальной диагностики аллергических реакций у крупного рогатого скота, вызываемых патогенными микобактериями (М. bovis, М. tuberculosis) и другими факторами бактериальной и небактериальной природы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• провести анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота сложившейся в Российской Федерации в последние два десятилетия и

значимости неспецифических реакций на ППД-туберкулин в диагностике этой инфекции;

• разработать эффективный способ определения аллергизирующих свойств у атипичных микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин;

• дать сравнительную оценку специфичности аллергического метода диагностики туберкулёза и микобактериозов с применением ППД-туберкулина во внут-рикожной и пальпебральной пробах;

• усовершенствовать хемилюминесцентный метод дифференциации туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, содержащегося в благополучных по туберкулёзу фермах;

• провести научно-производственное испытание диагностического иммунохро-матографического теста BovidTB START-PAK, предложенного фирмой Chembio Diagnostic Systems, Inc. (США);

• изучить диагностическое значение КАД-теста с новым рекомбинантным аллергеном в условиях благополучных и неблагополучных по туберкулёзу хозяйств;

• разработать комплексную систему дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин с применением традиционных и новых экспресс-методов.

Научная новизна исследований

Впервые дана комплексная сравнительная оценка аллергического, хемилю-минесцентного и иммунохроматографического методов диагностики туберкулёза, а также их значимости в дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин.

Экспериментально обоснована комплексная схема прижизненной и после-убойной (посмертной) дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота, включающая модифицированную пальпебральную пробу, внутрикожные пробы с ППД-туберкулином и новым рекомбинантным аллергеном, хемилюминесцентный и культурально - генетический методы.

Теоретическая и практическая значимость работы

На основании результатов сравнительных исследований диагностическим лабораториям, занимающимся проблемами туберкулёза, предложены наиболее надёжные тесты и методики их применения для дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин, проявляющихся в скотоводческих фермах благополучных по туберкулёзу.

Материалы исследований, приведённых в диссертации и её автореферате, могут быть использованы в учебных программах ветеринарных академий, институтов и колледжей.

Материалы и методы исследований

Работа по теме выполнялась в период с 2007 по 2012 г. в лаборатории биотехнологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллёза и туберкулеза животных Сибирского отделения Россельхозакадемии. В производственных условиях исследования проводились в скотоводческих хозяйствах Омской и Новосибирской и Тюменской областей Российской Федерации.

При анализе эпизоотического состояния различных регионов Российской Федерации, в том числе и Омской области, использованы доступные для изучения статистические данные Департамента ветеринарии МСХ, ФГУ Центр ветеринарии, материалы Главного управления ветеринарии Омской области, областной и районных ветеринарных лабораторий.

Объектом экспериментальных исследований являлись крупный рогатый скот и лабораторные животные (морские свинки). Всего было исследовано в опытах 21615 голов крупного рогатого скота и 188 лабораторных морских свинок.

В работе были использованы эпизоотологический, клинический, аллергический, хемилюминесцентный, иммунохроматографический, патологоанатомиче-ский, бактериологический, молекулярно-генетический (ПЦР) и культурально - генетический методы исследований. Эпизоотологические, клинические, патолого-анатомические и бактериологические исследования выполнены по общепринятым методикам.

При аллергических исследованиях использовали ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и KAM (комплексный аллерген из атипичных микобактерии) производства Курской биофабрики. Для внутрикожного введения туберкулинов использовали безыгольные инъекторы БИ-7.

Все традиционные диагностические исследования в производственных условиях проводили комиссионно, с участием представителей районных ветеринарных служб и специалистов хозяйств. Работа проводилась в соответствии с Санитарными правилами СП 3.1.093-96 и Ветеринарными правилами ВП 13.3.1325-96, п. 10 «Туберкулез», утвержденными Госкомсанэпиднадзором и Минсельхозпродом России (1996), а также «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации 18.11.2002). Отдельные фрагменты аллергических исследований (пальпебральная проба, КАД-тест) проводили в собственной модификации.

Усовершенствование хемилюминесцентного метода диагностики, осуществлялось с позиций повышения безопасности его использования и увеличения срока хранения и транспортировки проб крови с жизнеспособными лейкоцитами и их пригодности для диагностических исследований (до 6-7 суток).

Диагностическая ценность усовершенствованного XJl-метода испытана в опытах на 40 морских свинках и на 1249 коровах из благополучных и неблагополучных по туберкулёзу стад.

Иммунохроматографический тест (ИХТ) испытан с учётом рекомендаций сотрудников фирмы-разработчика «Chembio» (США).

Антиген, используемый в этом тесте, изготавливали по генно-инженерной технологии, включающую секвенцию ДНК патогенных микобактерий и встраивание генов, кодирующих специфическую структуру их антигенов, в ДНК кишечных бактерий E.coli, синтезирующих эти антигены в нужных количествах.

Такие рекомбинантные антигены отличаются высокой специфичностью и взаимодействуют только с антигенами к патогенным микобактериям М. tuberculosis, M.bovis и др.

До использования диагностический комплект теста (хроматографические пластинки с антигеном, буферный раствор, сыворотки крови), хранили в оригинальной упаковке фирмы - изготовителя при температуре плюс 2-8°С с обязательным учетом сроков его изготовления.

Первоначально была изучена специфичность и чувствительность теста в опытах на морских свинках (по 20 голов), а затем в производственных условиях на 249 коровах и нетелях из благополучных и неблагополучных по туберкулёзу ферм.

Для лабораторных исследований был отобран биологический материал (лимфатические узлы, фрагменты паренхиматозных органов) от 235 голов убитого с диагностической целью крупного рогатого скота.

Пробы биологического материала отбирали в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных», (М., 1992). Отобранный материал обрабатывали методом Гона и А.П. Аликаевой. Материал использовали для микроскопии, посева на питательные среды (Фаст-ЗЛ, Левенштейна-Иенсена) и биологического исследования на морских свинках.

Животных опытных групп содержали в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 №755). Лабораторные животные находились в условиях вивария, кормление осуществляли согласно норм рациона для лабораторных животных (Г.Е. Батрак, A.M. Кудрин, 1979). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыты отбирали только клинически здоровых животных.

Идентификацию выделенных культур проводили согласно ГОСТ 26072-84 «Методы лабораторной диагностики туберкулеза» и ГОСТ 27318-87 - «Методы идентификации атипичных микобактерий». Культурально-морфологические и биохимические свойства микобактерий изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Оттен Т.Ф., 1994), приказом Минздрава СССР № 558 от 08.06.78 года «Об

унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» и приказом Минздрава РФ № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

Бактериоскопические исследования проводили по методу Циля-Нильсена с оценкой результатов в визуализированной системе с фотодокументированием Axiostar plus Cari Zeiss. Результаты обработаны в программе Axiovision Rel 4.7.

Культурально-генетический метод исследования, основанный на сочетании культурального посева на модифицированные питательные среды и полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводили с использованием тест-системы «МТБ-КОМ» производства НИИ эпидемиологии и микробиологии, г. Москва.

Выявление ДНК Mycobacterium tuberculosis complex проводили методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. ПЦР-амплификацию проводили на приборе «Ampli-4».

Кожно-аллергический дифференциальный тест (КАД-тест) использовался по методике аналогичной применению «Диаскинтеста» в медицинской практике. Аллерген (антигены-гаптены) для этого теста был изготовлен научно-производственными фармацевтическими фирмами «Лекко» и «Генериум» (Россия) с участием сотрудников ВНИИБТЖ (профессора В.Г. Ощепкова и старшего научного сотрудника Н.Н. Кощеева).

Опытные серии аллергена, условно-названного «HPА» (новый рекомби-нантный аллерген) были испытаны в опытах на 40 морских свинках и 2460 коровах, нетелях и тёлках скотоводческих ферм (хозяйств), из которых 4 были благополучными и 2 неблагополучными по туберкулёзу крупного рогатого скота.

Все цифровые данные экспериментов и научно-производственных опытов были обработаны методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2007 и с учётом рекомендаций Н.А. Плохинского (1969) и Г.Ф. Лакина (1990).

Отдельные фрагменты исследований выполнялись совместно с канд. ветеринар. наук, доцентом Л.А. Таллер, канд. ветеринар, наук Г.М. Дюсеновой, канд.

ветеринар, наук В.Ф. Бордюгом, канд. ветеринар, наук H.H. Кощеевым, канд. ветеринар. наук Е.Ю. Секиным, канд. ветеринар, наук А.Д. Понкратовой, аспирантом Т.А. Янченко.

Особую признательность за полезные советы и конст�