Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация

Козлов, Владимир Егорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация"

На правах рукописи

ии^иЬ83?Э

КОЗЛОВ ВЛАДИМИР ЕГОРОВИЧ

0 3 МАЙ 2007

АЛЛЕРГЕНЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА: СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ

03 00 23 — биотехнология 16 00 03 —ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

003058373

Работа выполнена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных препаратов против хронических болезней животных ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») и на ФГУП «Курская биофабрика»

Научные консультанты доктор биологических наук, профессор

Безгин Вячеслав Михайлович

доктор биологических наук, доцент Букова Наталия Константин овна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Еремец Владимир Иванович (ГНУ ВНИиТИБП РАСХН)

доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович (МГАВМиБ им К И Скрябина)

доктор ветеринарных наук, профессор

Овдиенко Николай Павлович

(ГНУ ВНИИЭВ им ЯР Коваленко РАСХН)

Ведущая организация ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» СО РАСХН, г Омск

Защита диссертации состоится 24 мая 2007 г в 10 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д 220 011 01 при ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)

Апрес Россия, 123022, г Москва, Звенигородское шоссе, д 5, ФГУ «ВГНКИ»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ»

Автореферат разослан 20 апреля

Ученый секретарь диссертационного кандидат ветеринарных наук, до цент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

2007 г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Среди зоонозпых заболевании туберкулез по своему социальному и экономическому значению занимает особое место, нанося значительный ущерб сельскому хозяйству в связи с большой чувстви-тетьпостыо к нему животных, особенно, крупного рогатого скота (КРС), свиней и кур (Краснов В А , 1998, Кресс В М , 2000, Непоклонов Е А , 2003, Смо-лянинов Ю И , 2005)

Документы МЭБ характеризуют туберкулез КРС как хроническое бактериальное заболевание животных и человека, распространенное по всему миру, что является одной из проблем здоровья общества В связи с этим Федеральный Закон № 77 от 18 06 2001 г «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации», наряду с мероприятиями в системе здравоохранения, предусматривает необходимость своевременного выявления больных туберкулезом сельскохозяйственных животных

Эффективность борьбы с туберкулезом в значительной мере определяется степенью совершенства методов его диагностики Основным прижизненным методом массовой диагностики туберкулеза в РФ является туберкулиновая проба (Наиманов АХ , 2002) Документы МЭБ и ЕС в качестве основного метода, используемого для выявления зараженных животных, предусматривают тест на наличие гиперчувствителыюсти замедленного типа (ГЗТ) В нашей стране для этой цели изготавливаются туберкулины (ППД) для млекопитающих и для птиц, а также комплексный аллерген из атипичных микобактерий (KAM)

Широкий импорт — экспорт животных и продукции животноводства требует унификации методов и средств диагностики туберкулеза для получения равноценных результатов исследования в различных регионах мира

Интенсивность проявления аллергической реакции зависит от многих факторов, однако активность и специфичность аллергена должны быть стандартизованными величинами

Микобактериальные аллергены представляют собой многокомпонентную систему, основным действующим и наиболее специфичным веществом которой являются белки (Seibert F , 1934) Уровень содержания балластных веществ, снижающих уровень специфичности препарата, обусловлен технологией его изготовления (Безгин В М , 1999) Совершенствование технологии изготовления диагностикумов туберкулеза может быть эффективным только в комплексе с использованием международных стандартов и применением национальных нормативных документов РФ, гармонизированных с рекомендациями и требованиями МЭБ и ВОЗ

Принимая во внимание вступление в силу Федерального закона «О техническом регулировании», необходимость скорейшего выполнения мероприятии по гармонизации национальных и международных технических требовании стала очевидной (TAC1S, 2003)

Цель работы Целью исследований являлась разработка комплекса методов мембранного фракционирования туберкулина (ППД) для млекопитающих, позволяющих обеспечить промышленный выпуск аллергена, характеризующегося высокой диагностической эффективностью, стандартизация тубсркулинов в соответствии с международными требованиями, научное обоснование принципов стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной диагностике туберкулеза

Основные задачи исследований

1 Разработать комплекс методов мембранного фракционирования для промышленного производства туберкулина (ППД) для млекопитающих, обеспечивающий выпуск аллергена с более высокими диагностическими характеристиками

2 Изучить иммунобиологические свойства белковых фракции различной молекулярной массы и определить фракцию туберкулина, обладающую наибольшей диагностической эффективностью

3 Провести исследования, позволяющие гармонизировать требования к качеству тубсркулинов (ППД) с рекомендациями нормативных документов МЭБ и ВОЗ

4 Определить оптимальны» вариант сенсибилизирующего агента для определения активности туберкулина (ППД) для млекопитающих при стандартизации препарата

5 Изучить возможность применения штамма М bovis AN5 для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих

6 Определить активность отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine, разработать эталонный образец (национальный стандарт) туберкулина (ППД) для млекопитающих

7 Определить активность отечественного туберкулина (ППД) для птиц относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium, разработать эталонный образец (национальный стандарт) туберкулина (ППД) для птиц

8 Научно обосновать методику стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза (на примере KAM)

9 Провести сравнительную оценку активности и специфичности тубер-кулинов (ППД) для млекопитающих, производимых в разных странах

Научная новизна. Впервые разработан технологический комплекс методов промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих, соответствующего международным требованиям

Впервые установлено, что туберкулин, изготовленный с применением методов мембранного фракционирования и имеющий молекулярную массу от 3 до 300 кДа, обладает наибольшей специфической активностью С учетом этого подобраны технологические параметры, позволяющие снизить содержание балластных антигенов и реактогенность туберкулина с одновременным повышением выхода конечного продукта

Впервые с использованием методов, предусмотренных международной нормативной документацией, разработан отечественный эталонный образец туберкулина (ППД) для млекопитающих, стандартизованный относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine

Впервые с использованием методов, предусмотренных международной нормативной документацией, разработан отечественный эталонный образец туберкулина (ППД) для птиц, стандартизованный относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium

Впервые установлено, что вариант штамма М bovis AN5 депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ», по своим иммунобиологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к производственным штаммам и, наряду со штаммом М bovis № 8, может быть использован для производства отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих

Впервые разработаны принципы стандартизации микобактериальных аллергенов для дифференциальной диагностики туберкулеза, позволяющие проводить оценку препарата в соответствии с требованиями международных нормативных документов

Приоритетность научно-технических решении подтверждена патентами РФ № 2031656 с приоритетом от 28 04 1992 «Способ получения туберкулина», № 2045959 с приоритетом от 25 12 92 «Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения», № 2035914 с приоритетом от 18 01 93 «Способ получения туберкулина», № 2113233 с приоритетом от 04 07 97 «Способ получения туберкулина»

- оптимизирован процесс УФ-концентрирования очищенного культу-рального фильтрата,

- внедрен метод диафильтрации концентрата белков туберкулина для очистки от низкомолекулярных соединений,

- предложены параметры мембранного фракционирования туберкулина для эффективного удаления балластных антигенов,

- снижено количество выбросов экологически вредных реагентов Данная технология позволяет стандартизовать туберкулин (ППД) для

млекопитающих по молекулярной м<6ссе (3 — 300 кДа), повысить выход продукта и специфичность препарата, обеспечить выпуск производственных серии аллергена, соответствующих требованиям международных нормативных документов МЭБ и ЕФ

С применением предложенной технологии за период с 2002 по 2006 гг изготовлено более 220 млн доз туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих

Разработана и утверждена нормативная документация на туберкулин (ППД) для млекопитающих и туберкулин (ППД) для птиц, гармонизированная с международными требованиями

Производственные серии отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих, контролируемые в соответствии с новой нормативной документацией, характеризуются значительно меньшим допустимым разбросом активности и количественно нормируемым показателем специфичности

Штамм М bovis AN5, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ», принят в качестве производственного штамма при изготовлении туберкулина (ППД) для млекопитающих наряду со штаммом М bovis № 8

Установлено, что применяемая в РФ доза туберкулина (ППД) для млекопитающих (10000 ТЕ в 0,2 см3) соответствует дозе, рекомендуемой МЭБ для проведения т^беркулинизации КРС как в благополучных, так и в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах (2000 ME PFD bovine в 0,2 см3), при равнозначной эффективности способа введения — шприцем или инъ-ектором

IIa защиту выносятся следующие положения-

1 Технологический комплекс методов для промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих, который позволяет выпускать активный и специфичный диагностикум, соответствующий международным требованиям

2 Эталонные образцы (национальные стандарты) туберкулинов (ППД) для млекопитающих и для птиц, стандартизированные с применением методов, гармонизированных с требованиями международных нормативных документов

3 Принципы стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной диагностике туберкулеза

Апробация работы Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на

- Научно-практической конференции «Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири» — г Новосибирск, 12-13 июля 1995 г

- V Всероссиискои конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов» — г Щелково, 14-17 мая 1996 г

- Научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России — г Курск, 27-30 августа 1996 г

- Научной сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки» — Москва, 16-17 июня 1998 г

- Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета Казанской государственной академии ветеринарной медицины им Н Э Баумана — г Казань, 30-31 мая 2000 г

ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов»

- Москва, 14-15 февраля 2001 г

- Заседании рабочей группы по туберкулезу при Департаменте ветеринарии Минссльхоза России — Москва, 24 апреля 2003 г

- Международной научно-практической конференции «Актуалып иро-блеми ветеринарно1 медишши в умовах сучасного ведения твариниицтва» — г Феодосия, 26 мая — 2 июня 2003 г

- Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» - Москва, 7-8 октября 2003 г

- Расширенном заседании научно-проблемных методических комиссии по контролю и стандартизации биологических лекарственных средств для животных, применяемых при бактери&пыилх, грибковых и вирусных болезнях ФГУ «ВГНКИ» - г Москва, 22 июня 2004 г

- Международной на>чно-практическои конференции в рамках выставки «Агро-2004» — г Киев, 24-27 июня 2004 г

- Координационном совещании «Основные итоги выполнения научных исследований за 2004 г и задачи на 2005 г по разработке методов диагностики и средств профилактики, терапии и борьбы с массовыми инфекционными и протозоиными болезнями животных, рыб и пчел» — Москва, 19 апреля 2005 г

- Заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН — г Москва, 25 апреля 2006 г

- Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промыш-ченности России — г Курск, 21-22 сентября 2006 г

- Научно-техническом совете ФГУП «Курская биофабрика» 12 февраля 2007 г

Публикации результатов работы. Основные положения и выводы отражены в 40 научных статьях и 4 патентах на изобретение

Объем и структура диссертации Работа изложена на 287 страницах компьютерного текста Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследовании, результаты собственных исследовании, обсуждение результатов, заключение, выводы, приложения Список использованной литературы включает 418 источников, из них 203 отечественных и 215 иностранных Работа иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками

Автор выражает искреннюю признательность В М Безгину, Н К Буковой, АН Шарову, Н С Шевыреву,ЛД Ничвеевой,ЮМ Мясоедову, К В Шумилову, АХ Найманову, В С Дубинину, Н В Филиппову, В А Алехину, А И Никитинои, НН Быковой, Н В Безгиной, ЕН Солодову, НТ Гречкиной, В П Суханову, А А Конареву, Л К Семиной, Ю А Воеводиной за оказанную практическую и консультативную помощь в выполнении диссертационной работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена по рабочим программам НИР ФГУ «ВГНКИ» в 1986

- 2006 гг согласно Заданию 02 06 ГЗ МСХ РФ «Селекционировать производственные штаммы возбудителей туберкулеза, псевдо- и паратуберкулеза, сапа, а также атипичных микобактерии, разработать и усовершенствовать методы контроля и стандартизации препаратов против туберкулеза, псевдо- и пара-туберкулеза, сапа» раздел 02 06 07 «Провести испытания туберкулина, изготовленного с применением мембранной технологии, разработать НТД» (1992

— 1994 гг ), раздел 06 13 «Усовершенствовать методы и средства диагностики туберкулеза животных» (2001 — 2003 гг ), а также согласно плановым рабочим программам научно-исследовательских и внедренческих работ ФГУП «Курская биофабрика» Исследования на КРС выполнялись в благополучных и длительно неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Волгоградской, Вологодской, Курской, Саратовской и Смоленской областей

В работе использовали лиофилизированные производственные и музейные штаммы М avium № 2282, М intracellulars (штамм 13-N), М scrofulaceum (штамм 12-S), М bovis № 8, AN5, Vallee, BCG-1 (НПО «Аллерген», г Ставрополь) разных пассажей и разных дат лиофилизации Применяли питательные среды мясо-пептоиный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Левенштейна-Йенсена, среду ФАСТ-ЗЛ, картофельную среду Павловского, синтетическую среду Курской биофабрики (модифицированную среду Сотона)

Для исследовании были использованы коммерческие серии туберкулина (ППД) для млекопитающих, туберкулина (ППД) для птиц, аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (KAM), изготовленные ФГУП «Курская биофабрика», международные стандартные образцы туберкулина (PPD) bovine и туберкулина (PPD) avium предоставленные Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBS, Вейбридж, Великобритания), серии туберкулинов, изготовленных зарубежными производителями «ID-Lelystad», Нидерланды, «Bioveta», Чехия

Для отработки промышленной технологии изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих были использованы мембраны, кассетные и половолоконные мембранные модули отечественного и зарубежного производства с различной номинально отсекаемой молекулярной массой (НОММ)

При изучении серологической активности и специфичности антигенов М bovis, М avium и туберкулинов, полученных разными методами, применяли иммуноферментный анализ (ИФА) Молекулярную массу (м м ) анализируемых антигенов оценивали методом колоночной гель-хроматографии Концентрацию белка на технологических этапах процесса изготовления туберкулина определяли фотометрическим методом, основанным на измерении оптической плотности растворов после перевода белка в нерастворимое состояние добавлением трихлоруксусной кислоты (ТХУ)

Для определения биохимического состава туберкулиновых препаратов проводили следующие исследования концентрацию белка в туберкулино-

вых препаратах определяли по методу Кьсльдаля (ГОСТ 16739-88), полисахариды определяли методом Хагедорна-Иенсена (Шамахмудов Ш Ш , 1966), количественное содержание липидов определяли согласно методике Aronson (Модель JI M , 1958), определение сухого остатка, органических и неорганических соединении проводили весовым методом (Колесов С Г , 1970)

Исследования выполняли с использованием следующих экспериментальных моделей

- морские свинки-альбиносы или с белым окрасом на боках весом не менее 400 г — 1240 голов, распределенные в группы по принципу аналогов (условия содержания, стандартный кормовой рацион, возраст, вес — разброс в группах по исходной массе не превышал ± 10 %),

- КРС из благополучных (632 головы) и неблагополучных (361 голова) по туберкулезу хозяйств

Биологические показатели туберкулинов определяли в соответствии с методами, изложенными в ГОСТ 16739—88 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих», ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц», ТУ 10-19-518-87 «Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микробактерии (КАМ)», а также в соответствии с рекомендациями по оценке туберкулинов Руководства МЭБ (OÏE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004) и Европейской фармакопеи (European Pharmacopoeia, 2002)

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов (Ашмарин И П , 1962, Лакин Г Ф , 1990, Материалы Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов, 1988, Пло-хинскииНА, 1980)

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Разработка технологии изготовления туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих с применением методов мембранного фракционирования биомолекул

Туберкулины очищенные (ППД) представляют собой обогащенную белками фракцию культуралыюй жидкости (КЖ) микобактерий В составе исходной КЖ содержание белков составляет не более 20% от содержания органических веществ, поэтому основной стадией процесса промышленного производства туберкулинов (ППД) является очистка белков КЖ микобактерий от небелковых компонентов Стандартная технология изготовления очищенных туберкулинов (ППД) включает переосаждение белков ТХУ и сульфатом аммония, обессоливание концентрата белка и стерилизующую фильтрацию Такой способ очистки белков сопровождается потерей целевого продукта и характеризуется большой длительностью процесса, высокой материалоемкостью Выход конечного продукта не превышает 25%

Учитывая, что основные потери белка связаны с процессом переосаждения КЖ микобактерий, на первом этапе исследований были проведены

работы по предварительному ее концентрированию снижение объемов осаждаемого раствора, как правило, приводит к увеличению выхода белка Опыты проводили по схеме, представленной на рисунке 1

УФ-концентрирование Концентрат

УПВ-6 (ВПУ-15) УФ-20М (ПА-10)

Рисунок 1 — Схема опытов по разработке метода предварительного концентрирования' белков культуральной жидкости при изготовлении

туберкулина

Первоначально опыты по концентрированию белков микобактерий проводили на установке УПВ-6 с рабочей поверхностью мембран 6 м2 (ОКБ ТБМ, г Кириши) В экспериментах использовали разделительные аппараты АР-2 с полыми волокнами ВПУ-15, имеющими номинально отсекаемую молекулярную массу (НОММ) 15 кДа Выход готового препарата составил около 30 %, что для лабораторных способов можно оценивать как низкий показатель В связи с этим по указанной схеме были проведены эксперименты по концентрированию белков туберкулина на плоскорамной установке УФ-20М (НИИ физико-органической химии, г Минск) с рабочей поверхностью 20 м2 В предварительных опытах была подобрана оптимальная по производительности и задерживающей способности отечественная ультрафильтрационная мембрана из ароматического полиамида ПА-10 с НОММ 10 кДа Установка позволяла проводить концентрирование белков туберкулина с высокой производительностью при рабочем давлении 0,4 МПа выход фильтрата составлял 800—900 дм3 в час, таким образом предусмотренный технологическим процессом объем культуральной жидкости — 3—5 м3 мог быть сконцентрирован в течение рабочей смены В таблице 1 представлены результаты трех экспериментов по изготовлению туберкулина с применением установки УФ-20М в сравнении с контролем (традиционная технология без применения мембран)

Из данных таблицы 1 видно, что ни в одном из трех опытов выход белка не превысил уровня контроля Более того, в процессе экептуатации установки обнаружено увеличение суммарного количества белка в фильтрате Это позволяет сделать заключение о том, что в период проведения экспериментов (6 мес) произошло изменение селективности мембран

Эффективность концентрирования культуральной жидкости на основе использования мембранных методов удалось существенно повысить за счет

Таблица 1 — Оценка выхода белка в экспериментах с использованием установки УФ-20М

Номер опыта Культуральный фильтрат Получено Получено белка после диализа Выход белка в %от контроля

Объем, дч3 Концентрация белка, г/дм3 Общий бсчок, г концентрата, дм3 фильтрата дм3 Объем, дм3 Концентрация белка, г/дм3 Общий белок, г

1 3000 0,37 1100 320 54 15,0 810 91

2680 6 9,7 58,2 6,5

2 2900 0,35 1015 400 51 12,9 656 80

2500 12 14,3 171 20

3 4070 0,22 895 370 48 11,2 538 75

3700 15 11,8 177 25

Контроль 1800 0,37 666 42 12,8 537 100

аппаратурного объединения процессов проточной микрофильтрации «кросс-флоу» и ультрафильтрационного концентрирования Параллельно был разработан способ обессоливания концентрата белка аллергена методом диа-фильтрации на ультрафильтрационной мембранной установке, применяемой при концентрировании белка

Для реализации данной технологической схемы нами была разработана и внедрена в производство комплектная фильтрационная установка Схема установки представлена на рисунке 2

Предложено аппаратурное обеспечение процесса, состоящее из трех блоков блока микрофильтрации, блока ультрафильтрации-диафильтрации и реакторного блока, который включает емкости для обрабатываемого продукта и безразборной мойки установки

Микрофильтрацию КЖ осуществляли на трех последовательно соединенных половолоконных модулях «Микроза» с размером пор 0,1 мкм и общей поверхностью мембран 18 м2 КЖ, поступающая после грубой фильтрации в емкость Е1, насосным агрегатом Н1 подавалась на половолоконные мембранные модули М1

При давлении 0,2-0,25 МПа производительность микрофильтрационной установки по фильтрату составляла 300—600 дм3/час Пермеат (очищенная КЖ, прошедшая через микрофильтрационные мембраны) поступал в емкость Е4 После накопления в этой емкости 150—200 дм3 пермеата раствор подавали на ультрафильтрационные кассетные модули М2 и МЗ с мембранами НОММ 3 кДа для концентрирования Общая площадь мембран каждого модуля составляла 10 м2 Производительность одного модуля по фильтрату составляла 100—200 дм3/час при перепаде давления 0,2-0,25 МПа

Фильтрат, получаемый на кассетных модулях М2 и МЗ, контролировали на наличие белка и в случае отрицательной реакции подавали в систему утилизации

Рисунок 2 — Схема комплектной фильтрационной установки

Проведенные технологические исследования позволили установить исходные параметры процесса предполагаемый разовый объем исходной КЖ — 3,0 м3, объем концентрата, подаваемого на осаждение — 0,4— 0,5 м3, объем диализуемого концентрата белка — до 0,1 м1, время микро- и ультрафильтрации — 5—6 часов, время диафильтрацин — 2 часа, периодичность процесса - 1 раз в неделю Параметры мембранных процессов фильтрации были подобраны таким образом, чтобы процессы мпк-рофильтрации и ультрафильтрации происходили одновременно За рабочую смену на установке можно проводить осветление и концентрирование 3000 дм3 КЖ микобактерии Полученный концентрат белков подвергали дальнейшей очистке переосаждением ТХУ и сульфатом аммония

Разработанная технология позволила

- исключить используемые в традиционной технологии при осветлении КЖ асбестоцеллюлозные шихтные фильтры марки «Ф», и тем самым снизить потери продукции на этапе предварительной фильтрации,

- снизить за счет предварительною концентрирования КЖ расход ТХУ более чем на 80

- применить экономичный и экологически чнегыи мембранный метод обсссоливания белка,

- стандартизировать белки туберкучина по нижней границе молекулярной массы

Высокомолекулярная фракция туберкулина в значительной степени ответственна за развитие нсспецифнческих иммунных реакции, что обуславливает необходимость се удаления из препарата Гель-хромато! -рафпческии анализ фракций туберкулинов показал значительное отличие по молекулярной массе высокомолекулярных антигенов, соответствующих первому пику хроматограммы, от антигенов второго пика, содержащего основную массу белков туберкулина Это обстоятельство позволило предложить для удаления иммупногеннои и неспецпфичной высокомолекулярной фракции туберкулина метод мембранного фракционирования

Для очистки обессоленного методом диафильтрации раствора концентрата туберкулина от высокомолекулярной фракции был разработан процесс ультрафильтрациопного фракционирования белков концентрата туберкулина

С этой целью было проведено сравнение ультрафильтрационных мембран с различной НОММ 100 кДа, 300 кДа и 1000 кДа Контроль эффективности фракционирования концентрата осуществляли методом гель-фильтрации на колонке с ультрагелем АсА34 Полученные результаты представлены на рисунке 3

Установлено, что в случае применения мембраны 1000 кДа в пер-меате концентрата обнаруживалось незначительное количество высокомолекулярных белков (рисунок 3-Б) Поэтому для проведения дальнейших исследовании были использованы мембраны с НОММ 100 кДа и 300 кДа

А Б

Объем элюирования (см3) Рисунок 3 — Хроматограмма туберкулиновых препаратов, фракционированных на ультрафильтрационных мембранах с различной НОММ А — исходная кулыпуральная жидкость, Б — пермеат после фракционирования концентрата на мембране с НОММ 1000 кДа, В — пермеат после фракционирования концентрата на мембране с НОММ 100 кДа, Г — пермеат после фракционирования концентрата на мембране с НОММ 300 кДа

Наиболее важным технологическим параметром мембранных процессов является проницаемость мембран для разделяемых биомолекул При оценке этого параметра в диапазоне используемых давлений 0,05 — 0,35 МПа не установлено значительных различий сравниваемых мембран проницаемость составляла около 40 дм3/м2 час (рисунок 4)

Эти результаты позволили предложить для масштабирования процесса оба варианта мембран Однако при оценке зависимости проницаемости от объема полученного пермеата выявлены преимущества мембран с НОММ 300 кДа (рисунок 5) Процесс ультрафильтрационного фракционирования проводили в режиме прямого концентрирования при постоянном отводе пермеата

Как видно из рисунка 5, мембрана с НОММ 300 кДа на завершающих этапах фракционирования была предпочтительнее по показателю проницаемости, что обеспечило возможность сокращения временных затрат, необходимых для осуществления процесса ультрафильтрации Применение мембранного фракционирования позволило стандартизировать белки туберкулина по верхней границе молекулярной массы

£ 40

n5 35 Ч

§30

g. 25 s

I20

П.

005 010 015 020 025 030 0 35 Давление МПа

Рисунок 4 — Проницаемость мембран с НОММ 100 и 300 кДа в зависимости от давления

—В—НОММ 300 кДа —Л— НОММ 100 кДа

Объем пермеата, дм3

Рисунок 5 — Зависимость проницаемости мембран с НОММ 100 и 300 кДа от объема полученного пермеата

В традиционной технологии конечную стерилизующую фильтрацию препарата осуществляли на асбестоцеллюлозных фильтрах «СФ», что сопровождалось значительными потерями белка Предварительное ультрафильтрационное фракционирование белков позволило внедрить в технологию изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих метод стерилизующей мембранной микрофильтрации в тупиковом режиме, исключив невали-дируемый процесс фильтрации на глубинных фильтрах

При анализе биохимического состава и иммунобиологических свойств различных вариантов туберкулиновых фракций (таблица 2) установлено, что туберкулины, полученные после удаления высокомолекулярных соединений, характеризовались достоверно большим удельным содержанием белка, что повышало их диагностические свойства Корреляционный анализ показал, что имеется прямая зависимость между активностью туберкулинов в гетерологичной системе (специфичностью) и содержанием полисахаридов Не обнаружено различий в качестве туберкулинов, полученных при использовании мембран с НОММ 100 и 300 кДа

Таблица 2 - Сравнительный анализ биохимических и биологических характеристик туберкулиновых фракций, полученных промышленным способом с применением метода мембранного фракционирования

Номер Наименование препарата Содержание (% к сухому веществу) Биологические показатели

Белки Полисахариды Липиды Активность, МЕ/мг Специфичность, %

1 Концентрат белка, изготовленный по традиционной технологии, - контроль (I вариант) п = 7 74,0 4,9 6,0 10000 ±750 9,5 ±1,9

2 Концентрат белка с м м 3100 кДа (II вариант) п = 7 86,0 2,5 3,0 12500 ±520 3,5 ±0,7

3 Концентрат белка с м м 3300 кДа (III вариант) п = 7 84,5 2,5 3,0 12800 ±424 4,0 ±0,8

4 Концентрат белка с м м 31000 кДа (IV вариант) п = 8 81,0 3,0 3,5 13200 ±590 6,0 ±0,6

5 Высокомолекулярная фракция с м м >100 кДа ( V вариант) п = 7 69,5 9,0 9,5 14680 ±552 14,0 ±3,5

6 Высокомолекулярная фракция с м м > 300 кДа (VI вариант) п = 7 69,0 9,0 9,0 14900 ±612 13,5 ±3,5

7 Высокомолекулярная фракция с м м > 1000 кДа (М|вариант) п = 8 66,9 8,0 10,0 15870 ±670 12,0 ±2,5

Серологическая активность туберкул и нов и фракций, выделенных в процессе производства туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, была исследована в ИФА с использованием сывороток крови морских свинок, сенсибилизированных М. bovis или М. avium. Результаты экспериментов представлены на рисунке 6.

КЖ М .bovis

Иысикомолску.-.ярнвя

фрикция м м. > 300 кДэ

Туберкулин - ППД

JLi]R МЛйкОЛКтагищкХ

(получен 6-.Ч

l[p НМСШЯШЯ МСМОрЛНИОЙ

тездалотк)

ТуЙ^рКу?]»!! ■ МИД IUГЛ MJTCKOHKTÄIOHU«

(П'.т. i I с

гтримскенвсм чембрлнне if «ХИОЛОГИВ1

■ Сыворотка морских спилок, сенсибилизированныхМ. bovis ® Сыворотка морских свинок, сснсибил тирован пых М. avium

■ Сыворочка интакгных морских свинок

Рисунок 6 — Серологическая активность туберкулином и фракций, полученных в процессе производства туберкулина (ППД) для Млекопитающих

Как видно из представленных данных, высокая перекрестная активность; антисывороток и туберкул и нов для млекопитающих и для птиц, в большой степени определяется наличием высокомолекулярных фракций. Эти антигены обладали значительно более высокой антител ос называющей активностью по сравнению с низкомолекулярными фракциями. Применение мембранных методов при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих позволило снизить уровень серологической активности аллергена.

Проведенные исследования по разработке промышленного мембранного концентрирования белков КЖ микобактсрий и их ультрафильтрационного фракционирования, позволили предложить принципиально новую технологическую схему изготовления туберкулина (рисунок 7), включающую следующие этапы:

- очистка КЖ проточной микрофильтрацией «кросс-флоу» с использованием микрофильтрационных мембран с размером пор 0,1 мкм;

- концентрирование очищенной КЖ (фильтрата) на улырафильтра-ционных модулях с мембранами НОММ 3 кДа;

Рисунок 7 - Технологическая схема изготовления туберкулина (ППД)

для млекопитающих

- переосаждение концентрата ТХУ и сульфатом аммония,

- обессоливание концентрата методом диафильтрации с использованием ультрафильтрационных мембран с НОММ 3 кДа,

- ультрафильтрационное фракционирование концентрата белка па мембранах с НОММ 300 кДа

- стерилизующая мембранная фильтрация обессоленного белка Использование предложенной технологии позволило не только исключить из туберкулина неспецифическую высокомолекулярную фракцию, но и повысить выход конечного продукта

В таблице 3 представлены выход по белку и по дозам (суммарной активности) препарата при изготовлении промышленных серий туберкулина (ППД) для млекопитающих пяти серий — с применением мембранных методов и пяти серий — по ранее применявшейся (традиционной) технологии

Как видно из данных таблицы 3, средний выход конечного продукта по белку при использовании мембранной технологии повысился на 28%, в то время как увеличение выхода по количеству доз составило 44% Более высокий выход доз (суммарной активности) по сравнению с повышением выхода по белку указывает на эффективное удаление из препарата балластных антигенов

Одним из основных методов контроля качества туберкутинов является определение их реактогенности оценка диаметра ответной реакции, развивающейся у интактпых морских свинок на введение высокой дозы туберкулина На рисунке 8 представлены результаты контроля реактогенности туберку-линов, изготовленных двумя сравниваемыми способами

Здоровым морским свинкам внутрикожно вводили 500 MC туберкулина (дозу туберкулина, соответствующую 25% величины дозы для КРС) При введении животным туберкулинов, полученных с применением мембранной технологии, выраженность ответных реакций была достоверно ниже (2,6 ± 0,8 мм) уровня реакций, развивавшихся на введение туберкулинов, изготовленных по традиционной технологии (7,1+2,Змм)

Таким образом, разработана и внедрена в производство промышленная технология очистки туберкулина (ППД) для млекопитающих с применением мембранных методов Предложенная технология позволяет, за счет снижения содержания в диагностикуме балластных антигенов, повысить его специфичность и уменьшить реактогенность аллергена с одновременным повышением выхода конечного продукта

Использование в производстве закрытой технологической системы микро- и ультрафильтраиии является эффективным не только в аспекте повышения качества диагностикума, но также решает проблему экологической безопасности производства Предварительное концентрирование КЖ М bovis позволило снизить в 6—8 раз расход ТХУ и соответственно уменьшить суммарный выброс этого экологически вредного химического реагента Внедрение метода диафильтрации дало возможность значительно сократить потребление воды на этапе обессоливания концентрата белка по сравнению с традиционной технологией За счет применения методов мембранного фрак-

Таблица 3 — Оценка выхода туберкулина (ППД) для млекопитающих при использовании традиционной технологии и с применением мембранного фракционирования

оо

Технология изготовления препарата Номер серии Исходная КЖ Концентрат белка Выход по белку, % Выход доз из 1 дм3 посева в готовом препарате

Объем, ДмЗ Концентрация бечка, г/дмЗ Общий белок, г Объем, дмЗ Концентрация белка, г/дмЗ Общий белок, г

Традиционная 18 2975 0,35 1041 60 5,2 312 30 407

21 4000 0,27 1080 75 7,2 540 50 629

22 3056 0,27 825 60 7,7 462 56 630

24 1814 0,49 889 60 6,9 414 46 797

25 2400 0,54 1296 75 5,9 422 32 678

Среднее значение 0,38 ±0,11 6,6 ±0,8 42,8±9,0 628,2±88,5

С применением мембранных методов 26 2400 0,525 1260 60 9 542 44 878

27 2650 0,32 848 60 9,3 552 65 869

28 2600 0,34 884 60 8,1 486 55 946

29 2000 0,43 860 60 8,2 492 57 932

30 2600 0,34 884 60 8,4 504 57 907

Среднее значение 0,39 ±0,07 8,6 ±0,4 55,6±4,9 906,4±26,3

Серии туберкулинов

- туберкулин, изготовленный по традиционной технологии

- туберкулин, изготовленный с применением мембранного фракционировании

Рисунок 8 - Показатели реактогеннОсти туберкулинов, изготовленных по различным технологиям

ционирования полностью исключен из технологии материалоёмкий и сложный в экологическом плане процесс глубинной фильтраций белковых растворов на асбестоцеллюлозных фильтрах. Удаление высокомолекулярных небелковых примесных антигенов на ультрафилы рационных мембранных установках позволяет исключить этап переосаждения белков сульфатом аммония и соответственно снизить выброс данного вещества.

2 Стандартизация туберкулинов 2.1 Стандартизации туберкулина (НПД) для млекопитающих

Необходимым условием выпуска качественных аллергенов для диагностики туберкулеза является их соответствие действующим международным стандартам. В 1986 г. для контроля туберкулина (ППД) для КРС ВОЗ был представлен Первый международный стандарт PPD bovine. В связи с тем, что в некоторых странах данный стандарт еще не внедрен, при оценке активности туберкулина (ППД) для млекопитающих возникают значительные проблемы в выражении действующих единиц активности препарата.

По определению ВОЗ, целью проведения калибровки является определение количества эталонного препарата, который обладает специфическим биологическим эффектом, эквивалентным эффекту данного количества международного стандарта, при определенном сочетании условий испытания. Учитывая значительные различия нормативной документации МЭБ (ВОЗ) и ГОСТ16739-88 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих», предварительно были проведены опыты по отработке условий основного эксперимента по стандартизации туберкулина.

В связи с тем, что международный стандарт изготовлен из urra.ivia М bovis AN5, а оцениваемый туберкулин — из штамма М bovis № 8, было проведено сравнительное изучение влияния способа сенсибилизации морских свинок на степень выраженности реакций, развивающихся в ответ на введение туберкулина

Для сенсибилизации пяти групп морских свинок использовали штаммы М bovis—BCG-1, AN5 и №8 Микобактерии вводили следующими способами первой группе - штамм BCG-1 внутрикожно в объеме 0,1 см3, второй группе — инактивированные микобактерии штамма № 8 внутримышечно в объеме 1см3, третьей группе — инактивированные микобактерии штамма № 8 внутрикожно в объеме 0,1 см3, четвертой группе — инактивированные микобактерии штамма AN5 внутримышечно в объеме 1 см3, пятой группе — инактивированные микобактерии штамма AN5 внутрикожно в объеме 0,1 см3 Инактивированные микобактерии вводили в виде суспензии в жидком парафине Результаты исследований представлены в таблице 4

Таблица 4 — Уровень гиперчувствительности замедленного типа в кожном тесте у морских свинок, сенсибилизированных различными способами

Показатели Группы морских свинок

1 2 1 3 4 1 5

Штамм М bovis BCG-1 № 8 (инактивированный) AN5 (инактивированный)

Способ введения микобакте-рий Внутрикожно Внутримышеч но Внутрикожно Внутримышеч но Внутрикожно

Доза туберкулина (МЕ) 100 10 100 10 100 10 100 10 100 10

Среднее значение диаметра эритемы (мм) 24,5 ±4,3 17,1 ±3,2 22,6 ±2,6 14,0 ±5,0 19,9 ±1,0 16,1 ± 1,6 24,3 ±2,2 17,4 ± 1,8 21,0 ± 1,6 15,6 ±2,4

В данном эксперименте оцениваемым показателем являлась степень выраженности ответных реакций ГЗТ, развивающихся у сенсибилизированных морских свинок на введение туберкулина, а исследуемыми факторами были штамм М bovis, применяемый для сенсибилизации, и способ введения микобактерии Так как оба исследуемых фактора являются качественными показателями, для статистической обработки полученных данных применили двух-факторный дисперсионный анализ с повторными опытами

Значение статистики Фишера для исследуемого фактора (штамм М bovis) Fjian составило 0,01, что меньше табличного значения, и соответственно используемые для сенсибилизации термоинактивированные культуры штаммов AN5 и № 8 М bovis значимо не влияют на степень выраженности

реакции ГЗТ Значение статистики Фишера для способа введения (внутримышечно и внутрикожно) инактивированных микобактерии, полученное в эксперименте, F3Kcn, составило 8,58, что выше табличного значения (F б1 = 4,75) и соответственно степень выраженности ответных реакций на ППД-туберкулины значимо отличается при разных вариантах введения сенсибилизирующих микобактерий При оценке чувствительности методов сенсибилизации установлено, что наиболее предпочтительны внутримышечный способ сенсибилизации «»активированными микобактериями и сенсибилизация BCG

С целыо оце»ки возможного влияния состава растворителя на активность туберкулина при их стандартизации было проведено определение сравнительной активности туберкулина (ППД) для млекопитающих с применением двух вариантов растворителя — зарубежного (фосфатный буферный раствор + твин-80) и отечественного (0,85 М NaCl + глицерин) Расчет активности испытуемой серии, проведенный в соответствии с международными требованиями, не выявил различий в уровне активности туберкулина при использовании данных растворителей

Для проведения экспериментов по стандартизации туберкулина (ППД) для млекопитающих в предварительных опытах па морских свинках и на больном туберкулезом КРС в соответствии с требованиями ГОСТ 16739-88 был осуществлен выбор эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих

В соответствии с приказом Департамента ветеринарии МСХ РФ № 33 от 11 12 2002 г на ФГУП «Курская биофабрика» совместно с научными сотрудниками ФГУ «ВГНКИ» и ГНУ «ВНИИЭВ» было проведено комиссионное испытание активности эталонной серии туберкулина по отношению к активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine

На рисунке 9 представлены прямые титрации эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих и Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine, построенные по результатам экспериментов, проведенных исходя из предположения равенства единиц активности отечественного туберкулина, предусмотренных ГОСТ 16739-88, и единиц активности, установленных Первым международным стандартом туберкулина (PPD) bovine

Прямые зависимости «логарифм дозы» — «диаметр реакции» для международного стандарта и образца эталонной серии параллельны, что указывает на сходство иммунологических свойств сравниваемых препаратов Однако значительный интервал между прямыми (AlgD) позволяет сделать вывод о том, что единицы активности, предусматриваемые ГОСТ 16739, отличаются от единиц активности, установленных Первым международным стандартом туберкулина (PPD) bovine, приблизительно в 5 раз (antilg 0,7 = 5)

С учетом полученных данных для уточнения величины относительной активности эталонной серии R был проведен эксперимент, основанный на предположении, что в одном флаконе эталонной серии содержится 240000 МЕ Первого международного стандарта туберкулина PPD bovine Резутьта-ты эксперимента представлены в таблице 5 и на рисунке 10

Первый международный

Рисунок 9 — Зависимость диаметров ответных реакций от логарифмов доз введения Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine и туберкулина (ППД) для млекопитающих эталонной серии (при условии равнозначности единиц активности препаратов)

Таблица 5 — Результаты определения активности эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine

Группа животных Наименование препарата Среднее значение диаметра эритемы, мм Относительная активность R и доверительный интервал (р = 0,95)

Доза введения, МЕ

20 10 5 2,5

Сенсибилизация штаммом BCG (п = 9) ППД, эталонная серия 21,75± 1,70 18,00± 1,60 15,67± 1,14 13,17± 1,12 0,88 81-122%

Международный стандарт 22,33* 0,38 18,33* 1,61 16,92± 0,93 13,25± 1,47

Сенсибилизация штаммом AN5 (п = 9) ППД, эталонная серия 21,56± 0,66 18,17± 0,56 14,39± 0,66 10,78± 0,79 1,02 82-121 %

Между11 арод! 1ый с гандарт 20,39± 0,51 17,61± 0,47 14,06± 0,62 12,56± 0,65

Сенсибилизация штаммом № 8 (п-10) ППД, эталонная серия 22,35± 0,71 16,25± 0,64 13,15± 0,89 9,55± 0,26 0,89 82-120%

Международный стандарт 19,70± 0,86 17,20t 0,79 15,05± 0,71 11,85± 0,64

Эталонная серия туберкулина (ППД) для млекопитающих

Первый международный стандарт туберкулина (PPD) bovine

R=0,93

0,4

0,7

1,0

1,3 IgD

Рисунок 10 — Зависимость диаметров ответных реакций от логарифмов доз введения Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine и туберкулина (ППД) для млекопитающих эталонной серии (при условии, что 1000000 единиц ГОСТ 16739 соответствуют 240000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine)

Как видно из данных таблицы 5, интенсивность реакций на сопоставимые дозы Первого международного стандарта и туберкулина эталонной серии при сделанном предположении оказались практически равными Средняя величина относительной активности туберкулина эталонной серии R составила 0,927 при доверительных границах эксперимента 66 — 150 % (р = 0,95) То есть эксперимент соответствовал требованиям к опытам по проведению стандартизации Уточненное содержание единиц активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine в одном флаконе национального стандарта составило 240000 ME х 0,927 = 220000 ME Представленные на рисунке 10 прямые титрации эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих и Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine параллельны и практически совпали, что указывает на соответствие активности испытуемого образца и активности международного стандарта

В условиях длительно неблагополучного по туберкулезу хозяйства — СПК «Верхне-Черенский» Волгоградской области на КРС было проведено сравнение активности туберкулина эталонной серии и Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine Учитывая ограниченное количество образца международного стандарта, предварительно была проведена оценка

количества реагирующих на туберкулин животных Из 105 голов КРС испытуемой группы на введение 2000 ME туберкулина (ППД) для млекопитающих реагировало 90 % животных При постановке основного эксперимента животным вводили по две дозы туберкулина (ППД) для млекопитающих эталонной серии туберкулина и Первого международного стандарта туберкулина PPD bovine — 3250 и 650 ME Не установлена разница в выявлении больных туберкулезом животных при использовании соответствующих доз Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine и эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих При оценке интенсивности кожных реакции у КРС не выявлено достоверных различий средних величии ответных реакций на каждую из сравниваемых доз введения национального и международного стандартов, что подтверждает результаты, полученные в испытаниях, выполненных на морских свинках

Таким образом, активность эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих, установленная по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) bovine, составляет 220000 ME в одном флаконе лиофилизированного препарата, что эквивалентно принятому ГОСТ 16739-88 ранее используемому значению активности 1000000 туберкулиновых единиц в одном флаконе Производственные серии туберкулина (ППД) для млекопитающих, активность которых установлена по национальному стандарту туберкулина, содержат в среднем 200000 ME во флаконе, а доза введения туберкулина (ППД) для млекопитающих крупному рогатому скоту будет составлять в объеме 0,2 см3 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine, что соответствует рекомендациям Руководства МЭБ

2 2 Стандартизация туберкулина (ППД) для птиц

Определение биологической активности эталонной серии сухого очищенного туберкулина (ППД) для птиц по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) avium было проведено в соответствии с методами, предусмотренными руководством МЭБ, материалами Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов и наставлением NIBSC по применению международного стандарта Опыты проводили на трех группах морских свинок, сенсибилизированных микобактери-ями птичьего вида штамма № 2282, исходя из предположения равенства единиц активности туберкулина ППД для птиц, предусмотренных ГОСТ 23881, и единиц активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium Результаты экспериментов представлены в таблице 6 и на рисунке 11

Величина R во всех опытах соответствовала международным нормативам, лимитирующим этот показатель при исследованиях по стандартизации Rx = RCT „ х (1,0 ± 0,2) Доверительные границы проведенных экспериментов также соответствовали требованиям ВОЗ — 64—156% (р = 0,95) Прямые титрации аллергенов незначительно отличаются только в крайних точках, что позволяет сделать вывод о равном содержании туберкулиновых единиц

Таблица 6 — Определение активности эталонной серии туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) avium

Группа животных Среднее значение диаметра эритемы (мм) на введение различных доз туберкулинов Относительная активность R и доверительный интервал (р = 0,95)

ППД для птиц, эталонная серия Международный стандарт PPD avium

90 ME 30 ME ЮМЕ 90 ME 30 ME ЮМЕ

1 (п = 9) 19,9± 0,66 16,3± 0,75 12,8± 0,62 18,6± 0,61 16,1± 0,44 14,2± 0,80 1,01 68-146%

2(п= 12) 22,8± 0,78 16,5± 0,55 10,5± 0,45 21,5± 0,9 17,4± 0,85 12,9± 0,56 0,81 73- 138%

3 (п= 12) 23,0± 0,58 17,9± 0,59 14,3± 0,66 22,2± 0,73 17,8± 0,66 13,5± 0,25 1,20 70- 150%

Эталонная серия туберкулина

100 1 48 1 95 igD

Рисунок 11 — Зависимость диаметров ответных реакций от логарифмов доз введения Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium и эталонной серии туберкулина (ППД) для птиц (при условии равнозначности единиц активности препаратов)

активности во флаконе эталонной серии туберкулина (ППД) для птиц и в ампуле образца Международного стандарта — 500000 ME активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium

Таким образом, единицы активности туберкулина (ППД) для птиц, предусмотренные ГОСТ 23881-79, и единицы активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium эквивалентны

2.3 Разработка принципов стандартизации микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза

В Российской Федерации при постановке симультанной пробы применяются туберкулин (ППД) для млекопитающих и комплексный аллерген из атипичных микобактерий (KAM)

Так как KAM — отечественная разработка, не имеющая аналогов за рубежом, то в международных нормативных документах нет исходных требований к показателям качества такого диагностикума, и в этой связи наиболее сложным вопросом при стандартизации KAM является отсутствие международного эталонного образца для оценки активности препарата

Учитывая, что при постановке симультанной аллергической пробы KAM используют, как и туберкулин (ППД) для птиц, в качестве препарата сравнения, при разработке подходов к стандартизации сенситинов мы исходили из следующих положений

- при введении животным, сенсибилизированным М avium, KAM должен иметь активность не ниже активности туберкулина (ППД) для птиц, а при введении животным, сенсибилизированным атипичными микобактери-ями, KAM должен иметь более высокую активность по сравнению с туберкулином (ППД) для птиц,

- в соответствии с рекомендациями МЭБ доза введения KAM для КРС по массе органических веществ не должна превышать 0,2 мг,

- так как KAM вводится животным одновременно с туберкулином (ППД) для млекопитающих, специфичность и активность обоих препаратов следует оценивать на двух группах животных — одной группе животных, сенсибилизированных микобактериями М bovis, и другой группе, сенсибилизированной атипичными микобактериями,

- согласно методу определения специфичности аллергенов, предусмотренному в Руководстве МЭБ и ЕФ, специфичность KAM, оцениваемая на морских свинках, сенсибилизированных М bovis, относительно туберкулина (ППД) для млекопитающих, а также специфичность туберкулина (ППД) для млекопитающих, оцениваемая на морских свинках, сенсибилизированных атипичными микобактериями, относительно KAM, не должна превышать 10%

При определении активности KAM по отношению к активности туберкулина (ППД) для птиц на группах морских свинок, сенсибилизированных М avium и атипичными микобактериями, установлено, что активность комплексного аллергена при расчете по единицам действия для (единицам активности) значительно превышала активность туберкулина (ППД) птиц при сенсибилизации морских свинок М avium — в 2,5 раза, при сенсибилизации культурой штамма М intracellulare 13-N в 14 раз, культурой штамма М scrofulaceum 12-S — в 30 раз, при сенсибилизации смесью культур штаммов М intracellulare 13-N и М scrofulaceum 12-S — в 10 раз

Столь высокое отличие активности сравниваемых препаратов в значительной степени объясняется разным содержанием органического вещества в дозах введения

Учитывая, с одной стороны, высокую активность аллергена KAM на морских свинках, сенсибилизированных М avium и атипичными микобакте-риями, а с другой стороны, рекомендации МЭБ по содержанию количества туберкулиновых аллергенов в стандартном растворе (не более 1 мг/см3), представляется целесообразным снизить содержание органических веществ в дозе введения KAM до уровня содержания органических веществ в дозе введения туберкулина (ППД) для млекопитающих КРС - 0,2 мг При таком разведении препарата активность дозы KAM для крупного рогатого скота составит 840 ЕД,^, а концентрация органических веществ в растворе KAM не превысит 1 мг/см3, что будет соответствовать требованиям Руководства МЭБ

С учетом результатов определения активности KAM, приведенных выше, при снижении дозы введения аллергена до 800 ЕД, активность сенситина будет соответствовать активности 2000 ME туберкулина (ППД) для птиц при сравнении аллергенов на животных, сенсибилизированных М avium и будет превышать активность этой дозы туберкулина (ППД) для птиц в 3-10 раз в случае сенсибилизации животных атипичными микобактериями

Наряду с активностью важнейшим качественным показателем аллергенов является специфичность В соответствии с рекомендациями Руководства МЭБ и Европейской фармакопеи специфичность туберкулинов (ППД) для птиц и млекопитающих оценивают, определяя активность испытуемых препаратов на морских свинках, сенсибилизированных гетерологичными микобактериями

Для определения оптимального соотношения доз KAM и туберкулина (ППД) для млекопитающих при постановке симультанной пробы мы провели сравнение активности этих аллергенов в двух системах сенсибилизации — на группе морских свинок, сенсибилизированных БЦЖ, и на группе морских свинок, сенсибилизированных смесью атипичных микобактерий Предварительно были подобраны дозы введения препаратов, вызывающие у опытных животных сравнимые по величине ответные реакции ГЗТ

На рисунке 12 представлены прямые титрации KAM и туберкулина (ППД) для млекопитающих, рассчитанные по дозам аллергенов, выраженных в единицах активности (единицах действия) При таком методе сравнения активность гомологичных аллергенов превышала активность гетероло-гичных аллергенов в разной степени в 42,6 раза на группе морских свинок, сенсибилизированных смесью атипичных микобактерий, и в 6,45 раза на группе морских свинок, сенсибилизированных BCG

Оптимальными дозами для постановки симультанной пробы являются дозы препаратов, превышающие в гомологичных системах сенсибилизации уровень активности гетерологичных аллергенов, в равной степени При графическом отображении данного условия интервалы между прямыми титрации сравниваемых сенситинов (AlgD) в двух системах сенсибилизации должны быть равны Учитывая полученные результаты для определения оптимальных доз и уравнивания относительной активности препаратов (R) в двух системах сенсибилизации необходимо снизить относительную активность

d,AUI

ППДм i

Сенсибилизация ßCG

d,MM

lgD

Сенсибилизация смесью культур штаммов 13-N н 12-S

"Г

lgD

Рисунок 12 — Сравнение туберкулина (ППД) для млекопитающих и KAM по дозам, выраженным в единицах действия (активности), на морских свинках, сенсибилизированных BCG и смесью культур штаммов М intracellulare 13-N и М scrofulaceum 12-S KAM (ККЛМ/ппд«л = 42,6) или увеличить относительную активность туберкулина (ППД) для млекопитающих (ЛППДмл/КЛМ = 6,45) Установив для расчета коэффициент К, получаем равенство

42,6 / К = 6,45 х К, соответственно К= ^42,6/6,45 = 2,57

Таким образом, для проведения симультанной кожной пробы с применением KAM и туберкулина (ППД) для млекопитающих оптимальным является соотношение единиц действия KAM и единиц активности туберкулина (ППД) для млекопитающих 1 2,57 Поскольку Руководством МЭБ установлена доза введения туберкулина (ППД) для млекопитающих КРС — 2000 МЕ, обоснованным будет изменить дозу KAM не регламентируемую международными нормативными документами

В соответствии с проведенными расчетами эквивалентной дозой для постановки симультанной пробы по отношению к дозе туберкулина (ППД) для млекопитающих, равной 2000 МЕ, будет доза KAM 2000 EJ\KAM/ 2,57 = 780 ЕДКЛМ, что соответствует дозе KAM, рассчитанной согласно рекомендациям МЭБ при оценке активности препарата в сравнении с активностью туберкулина (ППД) для птиц

При оценке специфичности KAM и туберкулина (ППД) для млекопитающих с использованием метода сравнения активности препаратов по содержанию органического вещества в дозах введения, установлено, что показатели относительной активности гомологичных аллергенов в обеих сис-

темах сенсибилизации превышали показатели активности гетерологичных аллергенов в равной степени ЯППДм1/клм = 17,0 и Яклм/Г1ПДм1= 16,6 (рисунок 13) Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что сравнение КАМ и туберкулина (ППД) для млекопитающих по содержанию в дозах введения препаратов органического вещества оказалось результативным для определения эквивалентных доз аллергенов

d, ки

d,Mu

ППДч |

Сенсибилизация BCG

~Г

Сенсибилизация смесью культур uiTaM»ioul3-N и 12-S

2 5 3 5 4 5 'б" 2 5 3 0 3.5 40 4 5 'й"

Рисунок 13 — Сравнение туберкулина (ППД) для млекопитающих и КАМ по дозам, пропорциональным содержанию органического вещества, на морских свинках, сенсибилизированных ВСО и смесью культур штаммов М 1п1гасе11и1аге 13-14 и М зсгоМасеит 12-Б

Таким образом, результаты, полученные как при расчетах активности KAM, так и при оценке специфичности, позволяют сделать вывод о том, что по отношению к дозе туберкулина (ППД) для млекопитающих, содержащей 0,2 мг органических веществ и активностью 2000 МЕ, эквивалентной будет доза KAM, также содержащая 0,2 мг органических веществ и имеющая активность 800 ЕД

Сравнение специфичности равных по содержанию органического вещества доз туберкулина (ППД) для птиц и KAM было проведено в хозяйстве, длительно неблагополучном по туберкулезу на 42 головах КРС Положительная реакция на введение туберкулина (ППД) для млекопитающих установлена у 39 (92,9 %) животных, положительные реакции на KAM наблюдались у 8 (19,0 %) голов, при этом у всех животных, реагировавших на KAM, выявлены более выраженные реакции на туберкулин (ППД) для млекопитающих На введение туберкулина (ППД) для птиц в дозе 10000 МЕ положительно реагировало 18 (42,9 %) голов, что более чем в два раза превышало количество животных, реагировавших на введение KAM Животных, реагировавших только на KAM или только на туберкулин (ППД) для птиц,

не выявтено То есть при сравнении туберкулина (ППД) для птиц и KAM на КРС в дозах, содержащих равное количество органического вещества, выявлена большая специфичность KAM

Таким образом, применение методических подходов, используемых при стандартизации туберкулинов в международной практике, в решении вопроса стандартизации KAM позволило предложить принципы определения эквивалентных доз и оценки специфичности препаратов для дифференциальной аллергической диагностики туберкулеза Показано, что для целей стандартизации KAM эффективным является сравнение аллергена с туберкулином (ППД) для млекопитающих по содержанию органического вещества в дозах введения Для препаратов отличающихся от туберкулина (ППД) для млекопитающих по содержанию органического вещества в дозах введения (например, туберкулин (ППД) для птиц), расчет эквивалентных доз для симультанной пробы следует проводить, сравнивая разницу активности аллергенов в гомологичной и гетерологичпой системах сенсибилизации

3 Гармонизация требований к качеству туберкулиновых препаратов с международными нормативными документами

Гармонизация требовании к качеству туберкулиновых препаратов предполагает, во-первых, применение общепринятых международной практикой стандартных образцов при оценке показателен препарата (единиц активности), во-вторых, использование в производстве определенных штаммов и, наконец, применение унифицированных методов контроля качественных показателей

Исследования по стандартизации туберкулинов, проведенные в соответствии с требованиями МЭБ и ВОЗ, поставили вопрос о необходимости пересмотра устаревших методов контроля, предусмотренных действующей нормативной документацией В целях выпуска туберкулинов, соответствующих международным требованиям, ira ФГУП «Курская биофабрика» были разработаны нормативные документы Стандарт организации (СТО 004829090001-2004) - Технические условия на туберкулин очищенный ППД для млекопитающих и Стандарт организации (СТО 00482909-0011-2006) - Технические условия на туберкулин очищенный ППД для птиц, определяющие требования к качественным характеристикам туберкулинов согласно международным нормативным документам — Руководства МЭБ и Европейской фармакопеи

В таблице 7 приведены показатели туберкулина, указанные в ГОСТ 1673988 и в разработанном СТО 00482909-0001-2004 Изменения затрагивают семь основных качественных показателей препарата сенсибилизирующие свойства, реактогенность, стерильность, активность, специфичность, токсичность, специфическую безвредность

В методе оценки сенсибилизирующих свойств и при контроле реакто-генности туберкулина согласно СТО 00482909-0001-2004 применяется доза туберкулина 500 ME, что эквивалентно активности 2500 ТЕ, предусмотрен-

ных ГОСТ 16739-88 Следует подчеркнуть, что такая высокая доза туберкулина, инъецируемая интактным морским свинкам (25% дозы, вводимой КРС), позволяет лучше охарактеризовать качество аллергена по сравнению с более низкой дозой — 500 ТЕ, предусмотренной ГОСТ 16739-88 и эквивалентной 100 МЕ Первого международного стандарта туберкулина (РРО) Ьоушс Применение повышенной дозы туберкулина (ППД) для млекопитающих часто вызывает развитие кожных реакций у интактных морских свинок, тогда как доза введения 100 МЕ ареактогепна для интактных морских свинок и в связи с этим не информативна Так, например, туберкулины, содержащие высокомолекулярную фракцию, характеризуются повышенной реактогеп-ностыо (с1 > 5 мм) Внедрение мембранных методов фракционирования в технологию изготовления туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих обеспечивает уровень реактогенности препарата, соответствующий требованиям нового норматива (рисунок 8)

В СТО 00482909-0001-2004 изменен метод контроля стерильности В соответствии с международными требованиями при оценке стерильности применяется мембранный метод, который позволяет анализировать на наличие бактериальных загрязнений большие объемы туберкулина и исключить ошибки высева, опосредованные наличием в препарате бактериостатика — фенола Наиболее важные изменения внесены в раздел документа, регламенти-рующии метод определения активности туберкулина В Стандарте организации используются международные единицы активности Первого международного стандарта туберкулина (РРО) Ьоушс Главное изменение касается метода расчета активности препарата — предусмотрен принятый в международной практике метод, основанный на полулогарифмической зависимости диаметра реакции ГЗТ от введенной дозы туберкулина, тогда как в ГОСТ 16739-88 для расчета активности туберкулина по отношению к контрольному образцу применяется формула прямой зависимости диаметра реакции ГЗТ от дозы туберкулина

Несмотря на тот факт, что в международных документах и СТО допустимый разброс активности туберкулина (ППД) для млекопитающих составляет -33% - +50%, а в ГОСТ 16739-88 - ±20%, использование в расчетах полулогарифмической зависимости позволило снизить реальный разброс значений активности препарата более чем в 3 раза На рисунке 14 представлен допустимый разброс активности туберкулина, предусмотренный сравниваемыми нормативными документами

Зависимость «логарифм дозы туберкулина» - «диаметр реакции» более точно отражает соотношение данных показателей, поэтому ее применение значительно повышает чувствительность метода расчета Так, интервалу активности, предусмотренному документами МЭБ, соответствуют только те значения активности, которые при использовании метода расчета с применением прямой зависимости, указанного в ГОСТ 16379-88, отличаются от контроля ие более чем на 6% Таким образом, разработанный СТО 00482909-00012004 позволяет выпускать более стандартный диагностикум и снизить разброс допустимой активности препарата более чем в три раза

Таблица 7 — Качественные характеристики туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих согласно ГОСТ 16739-88 и СТО 00482909-0001-2004

Показатели ГОСТ 16739-88 СТО 00482909-0001-2004

Внешний вид Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета без механических примесей Прозрачная жидкость светло-бежевого цвета без осадка

Концентрация водородных ионов, рН 7,0 ± 0,5 7,0 ±0,5

Содержание белка, мг/мл 0,8 ± 0,2 0,8 ± 0,2

Массовая доля хлорида натрия, % 0,85 ± 0,05 0,85 ±0,05

Массовая доля фенола, % 0,3 ± 0,1 не более 0,5

Массовая доля глицерина, % 10,0 ± 1,0 не более 10

Реак 01^ьн'>сть ** Не должен вызывать изменений в месте внутрикожного введения здоровым животным, допускается покраснение диаметром не более 5 мм Не должен вызывать изменений в месте внутрикожного введения здоровым животным, допускается покраснение диаметром не более 5 мм

Сенсибилизирующие свойства ** Многократное внутрикожное введение не должно вызывать у животных повышенной чувствительности замедленного типа Многократное внутрикожное введение не должно вызывать у животных повышенной чувствительности замедленного типа

Стерильность * Должен быть стерильным Должен быть стерильным

Активность, МЕ/см3 *+ 50000 ± 10000 от 6600 до 15000

Специфичность *** - Не более 10 % активности в гетерологичной системе

Токсичность *** - Препарат должен быть нетоксичным

Специфическая безвредность *** - Живые микобактерии должны отсутствовать

* Изменен метод контроля (ГФ XI)

** Применены единицы активности Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine, отличающиеся от единиц активности, предусмотренных ГОСТ 16739-88

*** Дополнительно введенный параметр оценки качества туберкулина

2 о

иЗ 2

с;

о.

г?

Границы МЭБ Расчет МЭБ

Границы ГОСТ Расчет ГОСТ

Границы МЭБ Расчет ГОСТ

±6%

Допустимые границы активности туберкулина, предусмотренные и рассчитанные по методике ГОСТ 16739-88

Допустимые границы активности туберкулина, рассчитанные по методике ГОСТ 16739-88, соответствующие границам СТО 00482909-0001-2004 (Руководство МЭБ, 2004)

Допустимые границы активности туберкулина, предусмотренные н рассчитанные по методике СТО 00482909-0001 -2004 (Руководство МЭБ, 2004)

Рисунок 14 - Предусмотренные ГОСТ 16739-88 и СТО 00482909-0001-2004 допустимые границы активности туберкулина (ППД) для млекопитающих, рассчитанные по методикам ГОСТ 16739-88 и Руководства МЭБ, 2004

В новом нормативном документе при определении активности аллергена предусмотрен дополнительный статистический показатель контроля, характеризующий состояние лабораторных животных, уровень их сенсибилизации, точность введения туберкулина и способа оценки размеров реакции ГЗТ — нормированные фидуциальные пределы эксперимента от 50% до 200% при р < 0,05 (± 2а)

Кроме вышеуказанных изменений, в Стандарт организации внесены дополнительные показатели качества туберкулина, отсутствовавшие в ГОСТ 16739-88 специфичность, токсичность и специфическая безвредность

Специфичность препарата является одной из основных качественных характеристик туберкулинов В соответствии с международными документами этот параметр определяется как активность туберкулина на морских свинках, сенсибилизированных гетерологичиым видом микобактсрий, и не должен превышать 10% активности равной дозы гомологичного туберкулина Применение числового выражения уровня специфичности туберкулина наряду со статистической оценкой выполненного на лабораторных животных эксперимента позволяет повысить этот качественный показатель днагностн-кума

Международные требования, установленные к методам контроля аллергенов, были аналогично использованы при разработке СТО 00482909-00112006 «Технические условия на туберкулин очищенный ППД для птиц»

В целях стандартизации качества туберкулинов, изготавливаемых ФГУП «Курская биофабрика», на предприятии в соответствии с требованиями международных нормативных документов и ФЗ № 184 «О техническом регулировании» от 27 12 2002 г разработаны Стандарты организации на эталонные образцы туберкулинов, используемых при оценке коммерческих серии препаратов — СТО 00482909-0012-2006 «Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (эталонный образец) Технические условия» и СТО 00482909-0014-2006 «Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия»

Гармонизация требовании к ветеринарным препаратам предусматривает применение в производстве штаммов, принятых в международной практике Многие страны мира используют при изготовлении туберкулинов штамм микобактерии бычьего вида AN5 На основе этого штамма изготовлен действующий в настоящее время Первый международный стандарт PPD bovine В Российской Федерации туберкулин (ППД) для млекопитающих изготавливается из штамма М bovis № 8

Нами было проведено изучение штамма М bovis AN5, полученного из коллекции ФГУ «ВГНКИ», по всем необходимым параметрам, в особенности как продуцента белков туберкулина, и определена активность изготовленного диагностикума по сравнению с эталонной серией туберкулина (ППД) для млекопитающих

Штамм AN5 быт адаптирован к синтетической питательной среде Курской бнофабрикн По таким показателям, как выход доз и средняя активность микросернн туберкулина, изготовленного на основе штамма AN5, полностью соответствовали туберкулину, полученному с применением штамма № 8

С использованием штамма AN5 была изготовлена опытная серия тубер-к^ппна (ППД) для млекопитающих Активность туберкулина (ППД) для млекопитающих, изготовленного из штамма AN5, установленная на морских свинках, сенсибилизированных BCG, соответствовала активности контрольной серии туберкулина, изготовленной из штамма М bovis № 8 Не выявлено различии в активности опытной серии туберкулина при оценке на лабораторных животных, сенсибилизированных микобактериями штаммов М bovis BCG и AN5

Специфичность туберкулина (ППД) для млекопитающих, изготовленного из штамма AN5, установленная на морских свинках, сенсибилизированных М avium, составила 4,7%, что соответствует требованиям Руководства МЭБ и СТО 00482909-0001-2004

Полученные результаты позволили рекомендовать штамм М bovis AN5 в качестве производственного штамма для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих

На основании проведенных исследований в ТУ 9387-061-0494185-95 «Штаммы микобактерии туберкулеза бычьего вида № 8 и Vallee ВГНКИ,

производственные» внесено изменение (Извещение № 1 от 06 04 04 г , утвержденное Департаментом ветеринарии МСХ РФ)

Таким образом, подготовлена нормативная база для осуществления выпуска туберкулина (ППД) для млекопитающих и туберкулина (ППД) для птиц, гармонизированная с требованиями международных нормативных документов, включающая стандарты организации (технические условия), определяющие требования к туберкулинам и к методам контроля, а также характеристики эталонных образцов аллергенов В перечень штаммов-продуцентов туберкулина, используемых при изготовлении отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих, внесен штамм AN5, применяемый в международной практике

4 Сравнительная оценка активности н специфичности коммерческих серий туберкулшюв (ППД) для млекопитающих

Проведенные работы по стандартизации туберкулина (ППД) для млекопитающих и гармонизации нормативных документов позволили провести эксперименты по сравнительной оценке коммерческих серии туберкулина (ППД) для млекопитающих, изготовленных ФГУП «Курская биофабрика», и туберкулинов, применяемых в странах ЕС Большинство туберкулинов выпускается с расчетом дозы введения для КРС, равной 2000-2800 МЕ при объеме впутрикожпой инъекции 0,1 или 0,2 см3 В таблице 8 представлены заявленные и установленные в эксперименте показатели активности туберкулинов

При оценке активности туберкулинов с применением полулогарифмической зависимости установлено, что отечественный туберкулин и туберкулин производства «ID-Lelystad» (Нидерланды) обеспечивают дозу введения в инъецируемых объемах 2000 МЕ, что соответствует требованиям МЭБ

На рисунке 15 представлены результаты опытов по определению специфичности туберкулинов производства «ID-Lelystad» (Нидерланды) и ФГУП «Курская биофабрика» (РФ) Согласно методике определения специфичности, предусмотренной Руководством МЭБ, морским свинкам, сенсибилизированным М avium, вводили дозы испытуемых туберкулинов, превышающие в 10 раз дозы туберкулина (ППД) для птиц Как видно из рисунка 15, туберкулин производства ФГУП «Курская биофабрика», изготовленный с применением мембранной технологии, показал стабильно низкий уровень активности в гетерологичной системе — 3-5 %, как и туберкулин производства ««ID-Lelystad» (Нидерланды)

Специфичность сравниваемых туберкулинов была исследована в благополучном по туберкулезу хозяйстве Вологодской области на поголовье, сенсибилизированном атипичными микобактериями При введении препаратов 79 головам КРС не установлено различий по уровню интенсивности реакций и количеству животных, реагирующих на туберкулин (ППД) для млеко-пи тющих производства ФГУП «Курская биофабрика» и туберкулин производства «ID-Lelystad» (Нидерланды) При постановке симультанной пробы,

Таблица 8 - Показатели туберкулинов ППД для млекопитающих, выпускаемых различными производителями, и результаты контроля активности образцов

Прот&йдщслъ туберкулина Наименовал не препарата Заянлен-|[ая активность образ цов (МК/ см') Объем ■ведения согласно нд (см1) Лета введения на 1 111ПьСК1ПНО К14 согласно нд (МЕ) Результаты контроля а ^гг не н ости образцов (Мг-:/см!) Фактическая дтаа введения исследуемых образцов для КРС (МЮ

«Ю! с1; Нидерланды Туберкулин Bovine 2000 20 000 0,1 2000 22000 2200

Туберкулин Bovine 5000 50 000 0,1 5000 46000 4600

сИди с'г ь. Чехля BDvitubal 14000 14 000 0,2 2S00 4000 800

Bovilubal 28 000 28 000 0,1 2800 10000 1000

Курская б н «фабрика, Россия Туберкулин ППД для кяеколлшйщш 10 000 0,2 2000 10500 21О0

Нидерланды («|[Ы,с1у5(ас1») РФ (Курская Оиофабрнка)

^ Чмтпе 2000 в -серия Дй и -серий Л10 серии 03ВСИ2414

Ш -серия >"8 щн -ссрин Х°26 --------™

серия 02В012415

Серии туберкулинов

Рисунок 15 — Оценка специфичности {уровня активности в гетсрологичпой системе сенсибилизации) коммерческих серий туберкулинов ППД для млекопитающих

реакции на введение KAM у животных данного стада были выше уровня реакции, развивающихся на введение туберкулина (ППД) для млекопитающих

С целью оценки реактогснпости увеличенной дозы туберкулина (ППД) для млекопитающих производства ФГУП «Курская биофабрика» в бпагопо-лучных по туберкулезу хозяйствах на 361 животном было проведено испытание туберкулина, изготовленного с применением методов мембранного фракционирования Животным вводили по две дозы препарата — 2000 МЕ (доза, рекомендуемая для КРС Руководством МЭБ и ЕФ) и 4000 МЕ (удвоенная доза) Ни у одного опытного животного не выявлено неспецифических воспалительных кожных реакций на введение исследуемых доз туберкулина (ППД) для млекопитающих Полученные результаты свидетельствуют о высоком качестве туберкулина, отсутствии реактогенностн и возможности применения в некоторых случаях увеличенной дозы аллергена, что предусмотрено документами МЭБ

Таким образом, проведенные исследования по совершенствованию технологии производства туберкулина (ППД) для млекопитающих, изготавливаемого ФГУП «Курская биофабрика», его стандартизации, применению при контроле препарата методов, гармонизированных с документами МЭБ и ВОЗ, обеспечили выпуск отечественного туберкулина, соответствующего международным требованиям по дозам введения, специфичности, активности

ВЫВОДЫ

1 Разработан и внедрен технологический комплекс методов промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих с молекулярной массой 3-300 кДа, обеспечивающий выпуск диагностического препарата, соответствующего международным требованиям

2 Применение комплекса методов мембранного фракционирования белков позволяет, за счет снижения содержания в туберкулине (ППД) для млекопитающих балластных антигенов, повысить специфичность и уменьшить реактогенность аллергена с одновременным повышением выхода конечного продукта

3 Разработан эталонный образец туберкулина (ППД) для млекопитающих, активность которого по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) bovine составляет 220000 МЕ в одном флаконе лиофилизированного препарата, что эквивалентно принятому ГОСТ 1673988 значению активности 1000000 ТЕ

4 При использовании равнозначных доз эталонного образца туберкулина (ППД) для млекопитающих и Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine в опытах на КРС неблагополучного по туберкулезу хозяйства не установлено различий в выявлении количества животных, реагирующих на введение аллергенов

5 Активность производственных серий туберкулина (ППД) для млекопитающих, установленная по эталонному образцу туберкулина (ППД) для

млекопитающих, должна составлять в среднем 200000 ME во флаконе, содержащем 20 cmj стандартного раствора туберкулина, при этом доза введения препарата КРС в объеме 0,2 см3 будет соответствовать дозе введения, рекомендованной МЭБ, — 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine

6 Туберкулин (ППД) для млекопитающих в дозе 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine (ранее - 10000 ТЕ) позволяет эффективно выявлять животных, больных туберкулезом и ареактогенен для здорового поголовья КРС

7 Вариант штамма М bovis AN5, депонированный в РФ, по культураль-иым, морфологическим, тинкториальным, ферментативным, вирулентным, сенсибилизирующим и туберкулиногенным свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к производственным штаммам М bovis, и может быть использован для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих

8 Сенсибилизация морских свинок термоинактивированными культурами М bovis из штаммов AN5 или № 8 статистически достоверно не влияет па степень выраженности ответных реакций на туберкулин (ППД) для млекопитающих

9. Разработан эталонный образец туберкулина (ППД) для птиц, активность которого по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) М avium составляет 500000 ME в одном флаконе лиофили-зированного препарата и соответствует принятому ГОСТ 23881-79 значению активности 500000 ТЕ

10 Разработана и утверждена нормативная документация, гармонизированная с нормативными документами МЭБ и ВОЗ, обеспечивающая проведение контроля туберкулина (ППД) для млекопитающих и туберкулина (ППД) для птиц в соответствии с международными требованиями

11 В соответствии с международными требованиями предложены принципы стандартизации микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза, определена доза KAM — 800 ЕД, являющаяся оптимальной для проведения сравнительной симультанной пробы по отношению к дозе туберкулина (ППД) для млекопитающих- 2000 ME

12 Внедрение мембранных методов в технологию изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих позволило повысить экологическую безопасность производства

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработан ряд нормативных документов, позволяющих обеспечить выпуск производственных серий туберкулинов (ППД) для млекопитающих и для птиц, соответствующих требованиям МЭБ и ЕФ

1 Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0001-2004 Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 08 08 2006 г ,

2 Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0011-2006 Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Технические условия, согласованный директором ФГУ «ВГНКИ» 05 06 2006 г , находится на рассмотрении в Россельхознадзоре,

3 Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0012-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (эталонный образец) Технические условия, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» и согласованный с ФГУ ВГНКИ 05 06 2006 г ,

4 Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0014-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» и согласованный с ФГУ ВГНКИ 05 06 2006 г ,

5 Инструкция по применению стандартного раствора туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03 04 2006 г , per номер ПВР-1-3 0/00424,

6 Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для млекопитающих (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 08 08 2006r , per номер ПВР-1-3 5/01619,

7 Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БРЮК»), утвержденная Россельхознадзором 03 04 2006 г , per номер ПВР-1 3 0/00425,

8 Инструкция по применению туберкулина очищенного (ППД) для птиц, стандартный раствор (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БИОК»), находится на утверждении в Россельхознадзоре per номер ПВР-1-2 5/01620,

9 Промышленный регламент на производство туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих ПР 00482909-055-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21 12 2005 г ,

10 Промышленный регламент на производство туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц ПР 00482909-059-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21 12 2005 г ,

11 Промышленный регламент на производство аллергена сухого очищенною комплексного из атипичных микобактерий (KAM) ПР 00482909072-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21 12 2005 г,

12 Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные 10 12 1990 г ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам

13 Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные 13 10 1997 г директором Курской биофабрики

14 Извещение № 1 об изменении ТУ 9387-061-0494185-95 «Штаммы ми-кобактерии туберкулеза бычьего вида № 8 и Vallee ВГНКИ, производственные», утвержденное 06 04 2004 г Департаментом ветеринарии МСХ РФ (о возможности использования штамма M bovis AN5, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») при изготовлении туберкулина (ППД) для млекопитающих)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Безгии, В M Применение аспарагина отечественного производства при изготовлении очищенного туберкулина // Безгии В M , Козлов В Е , Солодов Е H и др //Труды ВГНКИ «Контроль и стандартизация средств специфической профилактики и диагностики туберкулеза, бруцеллеза, вирусных болезней животных» — M — 1988 - С 42-48

2 Безгии, В M Изучение иммунобиологических свойств ППД-туберкулина для млекопитающих, изготовленного различными способами / Безгии В M , Козлов В.Е Ал( \ин В А и др //Труды ВИЭВ «Иммунитет сельскохозяйственных животных» - VI - 1989 - Т 67 - С 125-132

"5 Копарев, А А Способ получения туберкулина / Конарев А А , Помогаева JI С , Безгии В M , Козлов В Е и др // Патент РФ № 2031656 с приоритетом от 28 04 1992 г

4 Шевырев, H С Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения / Шевырев H С , Безгии В M , Козлов В Е и др // Патент РФ № 2045959 с приоритетом от 25 12 1992 г

5 Шевырев, H С Способ получения туберкулина / Шевырев H С , Безгин В M , Ничвеева Л Д, Козлов В Е и др // Патент РФ № 2035914 с приоритетом от 18 01 1993 г

6 Шаров, А H Провести испытание туберкулина, изготовленного с применением мембранной технологии, разработать НТД (депонированный отчет) / Шаров А H , Бчкова H К , Безгин В M , Козлов В Е и др // Заключительный отчет по НИР УДК 619 616 98 579 873 21Т-07 , № гос регистрации 01930006128 - M - 1994 - 51 с

7 Шаров, А H Свойства туберкулина, полученного методом ультрафильтрации / Шаров А H , Букова H К , Безгин В M , Козлов В.Е и др // Труды ВГНКИ - M Изд ВГНКИ - 1995 - Т 57 - С 88-99

8 Шаров, А H Содержание белка с различной молекулярной, массой в культу-ралыюм фильтрате возбудителя туберкулеза / Шаров А H , Букова H К , Безгин В M , Кохюв В Е. и др // Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятии по ликвидации болезней в регионе Сибири /Тезисы докладов конференции 12-13 июля 1995 г - Новосибирск - 1995 - С 69-70

9 Безгин, В M Применение процесса ультрафильтрации для получения туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих / Безгин В M , Шевырев H С , Коз-

лов В Е , Ничвеева Л Д // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов Тезисы докладов V Всероссийской конференции, 1417 мая 1996 г - Щелково - 1996 - С 205

10 Конарсв, А А Использование электродиализа при промышленном получении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих / Конарсв АА, Козлов В Е , Солодов Е Н и др // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов Тезисы докладов V Всероссийской конференции, 1417 мая 1996 г - Щелково - 1996 - С 248

11 Безгин, В М Сравнительная оценка селективности и производительности ультрафильтрациомных мембран при различных параметрах ультрафильтрации / Безгин В М , Козюв В Е , Ничвеева Л Д и др // Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики 27-30 августа 1996 г - Курск - 1996 - С 44-45

12 Карпов, И Н Ультрафильтрация в производстве туберкулина / Карпов И Н , Конарсв А А , Безгин В М , Козлов В Е и др // Тезисы докладов научно-производ-ственнои конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрнкн, 27-30 августа 1996 г - Курск - 1996 - С 138

13 Козюв, В Е Влияние фенола на процессы осаждения белков туберкулина / Козлов В Е , Ничвеева Л Д , Шевырев Н С , Безгин В М // Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики, 2730 августа 1996 г - Курск - 1996 - С 148

14 Козлов, В Е Влияние солевого состава очищенного (ППД) туберкулина для чз ^питающих на растворимость белков после сублимации / Козлов В Е , Безгин В М Шевырси Н С , Ничвеева Л Д // Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики, 27-30 августа 1996 г -Курск - 1996 - С 149 -150

15 Конарсв, А А Масштабирование процесса олекгроднализного обессочивания растворов туберкулина и освоение его в промышленности / Конарев А А , Шевырев Н С , Безгин В М , Козлов В Е и др // Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики, 27-30 августа 1996 г — Курск - 1996 - С 159

16 Маслов, Е В Иммуногенная активность различных фракции туберкулина (ППД) для млекопитающих / Маслов Е В , Козлов В Е , Безгин В М // Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики, 27-30 августа 1996 г - Курск - 1996 - С 198 - 199

17 Ничвеева, Л Д Экспресс-метод определения концентрации белков туберкулина в разбавленных растворах / Ничвеева Л Д , Козлов В Е , Безгин В М , Шевырев НС// Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики, 27-30 августа 1996 г — Курск — 1996 — С 226 - 227

18 Солодов, Е Н Применение электрохимической мембранной технологии для очистки туберкулинов / Солодов Е Н , Конарев А А , Безгин В М , Козлов В Е и др // Тезисы докладов научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики, 27-30 августа 1996 г — Курск — 1996 — С 307 — 308

19 Безгин, В М Курская биофабрика К 100-летию биологической промышленности Часть 1 Исторический очерк, посвященный 100-летию Курской биофабрики / Безгин В М , Гольцов В И , Демидов Л Н , Козлов В Е и др , Под ред И А Бакулова, Н С Шевырева - Курск ГУИПП «Курск», 1996 - С 3- 282

20 Козлов, В Е Способ получения туберкулина / Козлов В Е , Ничвеева Л Д , Гречкина Н Т и др // Патент РФ № 2113233 с приоритетом от 04 07 1997 г

21 Конарсв, А А Элсктродиализная очистка растворов туберкулииов от сульфата аммония / Конарсв А А., Бсзгин В М , Колов В Е и др // Электрохимия — 1998 — Т 34 11 -С 1365 - 1369

22 Шевырсв, Н С Биотехнология производства препаратов для диагностики инфекционных болезнен животных / Шевырев Н С , Безгин В М , Козлов В Е // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарнои науки Сборник материалов научной сессии РАСХН - 1999 - Т 1 - С 268 -271

23 Конарсв, А А Использование электродиализа в производстве туберкулииов / Конарсв А А , Безгин В М , Шевырев Н С , Козлов В Е. и др // Журнал прикладной химии - 1999 - Т 72 - Выпуск 7 - С 1119-1124

24 Букова, Н К Биохимический состав аллергенов, применяющихся для диагностики некоторых хронических болезней (туберкулины) / Букова Н К Безгин В М , Козлов В.Е., и др // Незаразные болезни животных Материалы Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета Казанском государственной академии ветеринарной медицины им Н Э Баумана 30— 31 мая 2000 г - Казань - 2000 - С 14-16

25 Козлов, В Е. Сравнительный анализ методов обсчета активности туберкулиновых препаратов с использованием коммерческих образцов туберкулииов различных фнрм-пронзводитслеи / Козлов В Е , Ничвеева Л Д , Шевырев НС и др // «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» Тезисы докладов Всероссийской научной конференции Департамент ветеринарии МСХ РФ, ВГНКИ ветпрепаратов 14-15 февраля 2001 г - М — 2001 -С 84 - 85

26 Лысенко, А П Получение вялоактивного и специфичного аллергена для массовой диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с помощью ультрафильтрации / Лысенко А П , Безгин В М , Козлов В Е , Притыченко АН// «Ветеринарная медицина Беларуси» Научно-практическим журнал № 4 2001, № 1 2002 — С 12—14

27 Букова, Н К Усовершенствовать методы и средства диагностики туберкулеза жчротных (депонированный отчет) / Букова Н К , Козлов В Е , Сверчков AB и др /

Ьоючитсльныи отчет по НИР УДК 619 616 98 579 873 21Т-07 , № гос регистрации 01200 112106 -М - 2003 - 50 с

28 Козлов, В Е. Новые технологии производства диагностических препаратов для ветеринарной медицины / Козлов В Е , Безгин В М // «Ветеринарна медицина» М(жв1домчии тематичпии науковии збфник — Випуск 81 — Харгав — 2003 — С 41 — 45

29 Кохтов, В Е. Изучение активности и специфичности антигенов М bovis и М avium в иммуноферментном анализе / Козлов В Е , Безгин В М , Быкова Н Н , Ничвеева J> Д // «Ветеринарна медицина» М1жв1домчий тематичпии науковии збфник

- Вшп.к82 -Харкш -2003 - С 285 - 289

30 Мясоедов, Ю М Изучение различных способов сенсибилизации морских свинок, используемых при определении биологической активности ППД туберкулииов для млекопитающих / Мясоедов IO М , Козлов В Е , Ничвеева Л Д и др // «Ветеринарна медицина» Мажвщомчии тематичпии науковии збфник — Випуск 82 -Харив -2003 -С 417-420

31 Кохтов, В.Е Выбор эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих для контроля и стандартизации производственных серии препарата / Козлов В Е , Букова Н К , Безгин В М и др // Ветеринарная патология - 2004 — № 1-2 (9)

- С 80-82

32 Козлов, В.Е. Оценка активности национального стандарта туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно 1-го международного стандарта туберкулина (PPD) bovine / Кохтов В Е , Безгин В М , Шумилов К В и др // Ветеринарная патология -2004 — № 1-2 (9) - С 85-89

33 Кохтов, В.Е Определение активности эталонной серии туберкулина (ППД) для птиц относительно первого международного стандарта туберкулина (PPD) М

avium / Козлов В Е , Безгин В М , Шумилов KB и др // Ветеринарная патология — 2004 - № 1-2 (9) - С 89-92

34 Козлов, В Е Оценка активности и специфичности коммерческих серии туберкулина (ПГ1Д) для млекопитающих отечественного и зарубежного производства / Козлов В Е, Букова Н К, Наиманов АХ// Ветеринарная патология — 2004 — № 12 (9) - С 82 - 85

35 Мясоедов, Ю М Сравнительный анализ фракции туберкулина, полученных лабораторным и производственным способами / Мясоедов Ю М , Козлов В Е., Безгин В М // «Ветеринарная биотехнология настоящее и будущее» Материалы международной научно-практическои конференции, посвященной 80-летию ФГУП «Щез-ковскии биокомбинат» 20-23 сентября 2004 г — Щелково — 2004 — С 164 - 167

36 Козлов, В Е Стандартизация туберкулинов / Козлов BE// Ветеринария — 2004 - № 10 - С 6 - 8

37 Козтов, В Е Оценка эффективности различных доз и методов введения туберкулина / Козлов В Е , Мясоедов 10 М , Безгин ОМ// Ветеринария — 2004 — N° 11 -С 5-8

38 Безгин, В М Как это было К 110-летию Российской агробиологической промышленности и Курской биофабрики факты, события, воспоминания Учебное пособие / Безгин В М , Козлов В Е , Рахманин П П и др , Под ред П П Рахманина и В М Безгина - Курск Изд-во КГСХА, 2006 - 688 с

39 Козлов, В Е Гармонизация требовании к туберкулиновым препаратам с международными нормативными документами / Козлов В Е , Безгин В М // Материалы международной юбилейной научно-практическои конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, 21 — 22 сентября 2006 г - Курск -2006 - С 14-17

40 Безгина, Н В Оценка стабильности туберкулина ППД для птиц в стандартном разведении / Безгина Н В , Ничвеева Л Д , Мясоедов Ю М , Козлов В Е. // Материалы международной юбилейной научно-практическои конференции, посвященной 110-к. iino Курской биофабрики и агробиологической промышленности России 21-22 сентября 2006 г - Курск - 2006 - С 93-98

41 Безгина, Н В Изготовление туберкулина ППД для птиц в стандартном разведении с применением методов мембранной технологии / Безгина Н В , Ничвеева J] Д , Суханов В П , Козлов BE // Материалы международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской бнофабрикн и агро-биотогическои промышленности России, 21—22 сентября 2006 г — Курск — 2006 — С 98-99

42 Козчов, В Е Сравнительная оценка использования растворителей различного химического состава при определении биологической активности туберкулина / Козлов В Е , Мясоедов Ю М , Ничвеева JI Д , Безгин В М // Материалы международной юбитсинои научно-практическои конференции, посвященной 110-летию Курской бнофабрикн и агробиологической промышленности России, 21 — 22 сентября 2006 г - Курск - 2006 - С 133-137

43 Козлов, В Е Гармонизация методов контроля туберкулиновых препаратов / Козлов BE// Ветеринария - 2007 - № 3 - С 20-22

44 Козлов, В Е Стандартизация аллергенов для дифференциальной диагностики туберкулеза / Козлов BE // Ветеринария — 2007 — №5 —С 6 — 8

Формат 60x84'/16 Бумага офсетная Печать офсетная Уел пл 2,0 Тираж 120 экз Заказ 1859

Отпечатано в МУЛ «Курская городская типография», 305004, г Курск, ул Ленина, 77

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Козлов, Владимир Егорович

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Аллергены для диагностики туберкулеза животных -история открытия и изготовления

1.1.1 Иммунные механизмы туберкулиновой реакции

1.1.2 Туберкулиновые препараты и их изготовление

1.2 Туберкулиновые фракции и методы их получения

1.2.1 Антигены туберкулина

1.2.2 Применение мембранных методов при промышленной очистке и фракционировании белков

1.3 Стандартизация аллергенов для диагностики туберкулеза

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 60 2.1 Материалы, экспериментальные модели и условия экспериментов

2.2. Методы исследований

2.3. Статистическая обработка результатов исследования

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 71 3.1 Разработка технологии получения туберкулина с применением методов мембранного фракционирования биомолекул

3.1.1 Разработка промышленной установки для концентрирования и диафильтрации белков туберкулина

3.1.2 Мембранное фракционирование белков туберкулина

3.1.3 Оценка биохимических и иммунобиологических свойств фракций туберкулина, полученных в процессе промышленного 88 мембранного фракционирования

3.1.4 Совершенствование технологии изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих

3.2 Стандартизация туберкулинов

3.2.1 Стандартизация туберкулина (ППД) для млекопитающих

3.2.1.1 Отработка условий опытов по стандартизации на морских свинках

3.2.1.2 Отработка условий опытов по стандартизации на крупном рогатом скоте

3.2.1.3 Выбор эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих

3.2.1.4 Определение активности эталонной серии туберкулина

ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine

3.2.2 Стандартизация туберкулина (ППД) для птиц

3.2.3 Стандартизация микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической 128 диагностике туберкулеза

3.2.3.1 Разработка принципов стандартизации аллергенов для дифференциальной аллергической диагностики туберкулеза на 128 примере КАМ

3.2.3.2 Применение принципов стандартизации микобактериальных антигенов для оценки оптимальных доз туберкулина (ППД) для птиц и туберкулина (ППД) для млекопитающих при постановке симультанной пробы 3.3. Гармонизация нормативных требований к туберкулиновым препаратам с международными нормативными документами 3.4 Практическое применение и сравнительная оценка стандартизированных аллергенов

3.4.1 Исследование коммерческих серий зарубежных и отечественных туберкулинов (ППД)

3.4.2 Оценка эффективности применения разных доз туберкулина (ППД) для млекопитающих

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация"

Актуальность темы. Среди зоонозных заболеваний туберкулез по своему социальному и экономическому значению занимает особое место, нанося значительный ущерб сельскому хозяйству в связи с большой ^ восприимчивостью к нему животных, особенно, крупного рогатого скота, свиней и кур [1, 75, 76, 114, 196]. Туберкулезные микобактерии не только поражают человека и животных разных видов, но и способны длительно сохраняться в продуктах животноводства и объектах внешней среды, что обуславливает необходимость дополнительных затрат, связанных с проведением на неблагополучных фермах комплекса организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий [4, 8, 40, 78, 159, 197]. Туберкулез обычно протекает хронически, нередко в латентной форме с отсутствием характерных клинических признаков заболевания, что затрудняет его своевременное выявление [77, 99]. В последнее время установлено увеличение количества патологий, вызванных инфицированием человека и животных нетуберкулезными микобактериями [39, 112, 119].

Результативность противоэпизоотических и профилактических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота в значительной степени зависит от своевременной и надёжной постановки диагноза и удаления больных животных из оздоравливаемых стад [130, 143, 341].

Документы МЭБ [356] характеризуют туберкулез крупного рогатого скота как хроническое бактериальное заболевание животных и человека, распространенное по всему миру. Во многих странах это заболевание до сих пор является основным инфекционным заболеванием крупного рогатого скота и передача этого заболевания человеку - одна из проблем здоровья общества.

В связи с этим Федеральный Закон № 77 «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации» наряду с мероприятиями в системе здравоохранения предусматривает необходимость своевременного выявления больных туберкулезом сельскохозяйственных животных.

Основным прижизненным методом массовой диагностики туберкулеза в РФ является туберкулиновая проба [112]. Нормативные документы МЭБ и ЕС в качестве основного метода, используемого для выявления животных, больных туберкулезом, также предусматривают тест на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при внутрикожном введении туберкулина. Сравнительная внутрикожная туберкулиновая проба с одновременным введением равных доз туберкулинов для млекопитающих и для птиц используется при дифференциальной диагностике туберкулеза для определения сенсибилизации животных непатогенными для крупного рогатого скота микобактериями [356]. Туберкулиновая проба обладает высокой чувствительностью, кроме того, для ее проведения не требуется наличия дорогостоящей аппаратуры и специальных условий.

Тесты, предложенные Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ) для прижизненной диагностики туберкулеза в качестве альтернативных - тест пролиферации лимфоцитов, тест определения гамма-интерферона, ИФА на основе моноклональных антител и другие пока не востребованы для широкого использования в ветеринарной практике нашей страны, в частности, из-за сложности постановки и дороговизны [6, 136, 157, 172,234,253,268, 272,409, 413].

В последнее время усилился интерес к разработке других методов прижизненной диагностики туберкулеза: ПЦР [126, 140, 170], спектрофотометрии гемолизатов крови, хемилюминесценции иммунокомпетентных клеток крови [7, 44, 144, 135], однако результаты исследований также пока не приняты для широкого использования.

В настоящее время туберкулиновые тесты применяются для диагностики туберкулеза во многих странах мира, как в ветеринарной, так и в медицинской практике [265,404].

Важными факторами эффективности диагностики являются специфичность и активность применяемого препарата. Одним из путей повышения качества туберкулинов может быть фракционирование антигенов микобактерий. На сегодня для достижения этой цели наиболее перспективны методы промышленной мембранной технологии, что обусловлено снижением энергозатрат, материалоемкости, экологически вредных выбросов, минимизацией воздействия на обрабатываемый объект и соответственно повышением выхода конечного продукта.

В силу того, что аллергены, изготавливаемые в разных странах, являются оригинальными препаратами, крайне важное значение должно уделяться их стандартизации.

Одной из определяющих характеристик современного мирового рынка лекарственных средств, в группу которых входят и ветеринарные препараты, является развитие интеграционных процессов. Наиболее значимыми примерами интеграции, направленной на устранение технических барьеров в сфере международного обращения лекарственных средств, могут служить:

- создание единой законодательной и нормативной базы стран-членов Европейского союза;

- соглашение о взаимном признании регуляторных документов ЕС и США;

- гармонизация Европейской Фармакопеи и Фармакопеи США. С

В связи предстоящим вступлением России в ВТО актуальность работ по приведению нормативной базы в сфере производства и контроля лекарственных средств в соответствие с международными требованиями возрастает. В отношении диагностических препаратов и вакцин для ветеринарии, следует предусматривать, что рекомендации и правила МЭБ, согласованные с требованиями Европейской Фармакопеи, будут носить обязательный характер.

В сфере производства биопрепаратов в соответствии с международными стандартами качества ИСО и GMP стандартизации подлежат не только характеристики конечного продукта, но и технологический процесс, условия производства, методы и средства контроля качества в процессе производства, санитарная и экологическая безопасность, документация по контролю качества. В связи с чем стандартизация, являясь одним из основных способов повышения качества биологических препаратов, в современном понимании этого процесса должна затрагивать все этапы производства и контроля продукции [31, 152].

Одним из вопросов стандартизации требований в области обеспечения качества ветеринарных препаратов является соответствие их характеристик требованиям руководящих документов МЭБ и Европейской Фармакопеи. В настоящее время многие национальные нормативные документы РФ, содержащие технические требования, отличаются от аналогичных документов, принятых ЕС и международными организациями. В значительной мере это относится и к нормативным документам на ветеринарные биопрепараты, в частности к ГОСТу 16739-88 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» и ГОСТу 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц».

Принимая во внимание вступление в силу Федерального закона «О техническом регулировании», необходимость скорейшего выполнения мероприятий по гармонизации технических требований стала очевидной [115, 171].

Цель работы. Целью исследований являлась разработка комплекса методов мембранного фракционирования туберкулина (ППД) для млекопитающих, позволяющих обеспечить промышленный выпуск аллергена, характеризующегося высокой диагностической эффективностью, стандартизация туберкулинов в соответствии с международными требованиями, научное обоснование принципов стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной диагностике туберкулёза.

Основные задачи исследований.

1. Разработать комплекс методов мембранного фракционирования для промышленного производства туберкулина (ППД) для млекопитающих, обеспечивающий выпуск аллергена с более высокими диагностическими характеристиками.

2. Изучить иммунобиологические свойства белковых фракций различной молекулярной массы и определить фракцию туберкулина, обладающую наибольшей диагностической эффективностью.

3. Провести исследования, позволяющие гармонизировать требования к качеству туберкулинов (ППД) с рекомендациями нормативных документов МЭБ и ВОЗ.

4. Определить оптимальный вариант сенсибилизирующего агента для определения активности туберкулина (ППД) для млекопитающих при стандартизации препарата.

5. Изучить возможность применения штамма М. bovis AN5 для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих.

6. Определить активность отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine, разработать эталонный образец (национальный стандарт) туберкулина (ППД) для млекопитающих.

7. Определить активность отечественного туберкулина (ППД) для птиц относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) avium, разработать эталонный образец (национальный стандарт) туберкулина (ППД) для птиц.

8. Научно обосновать методику стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза (на примере КАМ).

9. Провести сравнительную оценку активности и специфичности туберкулинов (ППД) для млекопитающих, производимых в разных странах.

Впервые установлено, что туберкулин, изготовленный с применением методов мембранного фракционирования и имеющий молекулярную массу от 3 до 300 кДа, обладает наибольшей специфической активностью. С учетом этого подобраны технологические параметры, позволяющие снизить содержание балластных антигенов и реактогенность туберкулина с одновременным повышением выхода конечного продукта.

Впервые установлено, что вариант штамма М. bovis AN5; депонированный в коллекции ФГУ «ВГНКИ», по своим иммунобиологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к производственным штаммам и, наряду со штамммом М. bovis № 8, может быть использован для производства отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих.

Приоритетность научно-технических решений подтверждена патентами РФ: № 2031656 с приоритетом от 28.04.1992 «Способ получения туберкулина»; № 2045959 с приоритетом от 25.12.92 «Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения»; № 2035914 с приоритетом от 18.01.93 «Способ получения туберкулина»; № 2113233 с приоритетом от 04.07.97 «Способ получения туберкулина».

Практическая значимость. Разработана промышленная технология получения туберкулина (ППД) для млекопитающих с применением методов мембранного фракционирования биомолекул: оптимизирован процесс УФ-концентрирования очищенного культурального фильтрата;

- внедрен метод диафильтрации концентрата белков туберкулина для очистки от низкомолекулярных соединений;

- предложены параметры мембранного фракционирования туберкулина для эффективного удаления балластных антигенов;

- снижено количество выбросов экологически вредных реагентов.

Данная технология позволяет стандартизовать туберкулин (ППД) для млекопитающих по молекулярной массе (3 - 300 к Да), повысить выход продукта и специфичность препарата, обеспечить выпуск производственных серий аллергена, соответствующих требованиям международных нормативных документов МЭБ и ЕФ.

С применением предложенной технологии за период с 2002 по 2006 гг. изготовлено более 220 млн. доз туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

Разработана и утверждена нормативная документация на туберкулин (ППД) для млекопитающих и туберкулин (ППД) для птиц, гармонизированная с международными требованиями.

Штамм М. bovis AN5, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ», принят в качестве производственного штамма при изготовлении туберкулина (ППД) для млекопитающих наряду со штаммом М. bovis № 8.

Установлено, что применяемая в РФ доза туберкулина (ППД) для млекопитающих (10000 ТЕ в 0,2 см3) соответствует дозе, рекомендуемой МЭБ для проведения туберкулинизации КРС как в благополучных, так и в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах (2000 ME PPD bovine в 0,2 см3), при равнозначной эффективности способа введения - шприцем или инъектором.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Технологический комплекс методов для промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих, который позволяет выпускать активный и специфичный диагностикум, соответствующий международным требованиям.

2. Эталонные образцы (национальные стандарты) туберкулинов (ППД) для млекопитающих и для птиц, стандартизированные с применением методов, гармонизированных с требованиями международных нормативных документов.

3. Принципы стандартизации аллергенов, применяемых при дифференциальной диагностике туберкулеза.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:

- Научно-практической конференции «Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири»-г. Новосибирск, 12-13 июля 1995 г.

- V Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов» - г. Щелково, 1417 мая 1996 г.

- Научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России - г. Курск, 27-30 августа 1996 г.

- Научной сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки» - Москва, 16-17 июня 1998 г.

- Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана - г. Казань, 30-31 мая 2000 г.

- Всероссийской научной конференции, посвященной 70-летию Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов -Центра качества ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» - Москва, 14-15 февраля 2001 г.

- Заседании рабочей группы по туберкулёзу при Департаменте ветеринарии Минсельхоза России - Москва, 24 апреля 2003 г.

- Международной научно-практической конференции «Актуальш проблеми ветеринарно1 медицини в умовах сучасного ведения твариниицтва» - г. Феодосия, 26 мая - 2 июня 2003 г.

- Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» - Москва, 78 октября 2003 г.

- Расширенном заседании научно-проблемных методических комиссий по контролю и стандартизации биологических лекарственных средств для животных, применяемых при бактериальных, грибковых и вирусных болезнях ФГУ «ВГНКИ» - г. Москва, 22 июня 2004 г.

Международной научно-практической конференции в рамках выставки «Агро-2004» - г. Киев, 24-27 июня 2004 г.

- Координационном совещании «Основные итоги выполнения научных исследований за 2004 г. и задачи на 2005 г. по разработке методов диагностики и средств профилактики, терапии и борьбы с массовыми инфекционными и протозойными болезнями животных, рыб и пчел» -Москва, 19 апреля 2005 г.

- Заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН - г. Москва, 25 апреля 2006 г.

- Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России - г. Курск, 21-22 сентября 2006 г.

- Научно-техническом совете ФГУП «Курская биофабрика» 12 февраля 2007 г.

Публикации результатов работы. Основные положения и выводы отражены в 40 научных статьях и 4 патентах на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 287 страницах компьютерного текста. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, приложения. Список использованной литературы включает 418 источников, из них 203 отечественных и 215 иностранных. Работа иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Козлов, Владимир Егорович

выводы

1. Разработан и внедрен технологический комплекс методов промышленного изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих с молекулярной массой 3-300 кДа, обеспечивающий выпуск диагностического препарата, соответствующего международным требованиям.

2. Применение комплекса методов мембранного фракционирования белков позволяет, за счет снижения содержания в туберкулине (ППД) для млекопитающих балластных антигенов, повысить специфичность и уменьшить реактогенность аллергена с одновременным повышением выхода конечного продукта.

3. Разработан эталонный образец туберкулина (ППД) для млекопитающих, активность которого по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) bovine составляет 220000 ME в одном флаконе лиофилизированного препарата, что эквивалентно принятому ГОСТ 16739-88 значению активности 1000000 ТЕ.

4. При использовании равнозначных доз эталонного образца туберкулина (ППД) для млекопитающих и Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine в опытах на КРС неблагополучного по туберкулезу хозяйства не установлено различий в выявлении количества животных, реагирующих на введение аллергенов.

5. Активность производственных серий туберкулина (ППД) для млекопитающих, установленная по эталонному образцу туберкулина (ППД) для млекопитающих, должна составлять в среднем 200000 ME во флаконе,

-1 содержащем 20 см стандартного раствора туберкулина, при этом доза введения препарата КРС в объеме 0,2 см3 будет соответствовать дозе введения, рекомендованной МЭБ, - 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine.

6. Туберкулин (ППД) для млекопитающих в дозе 2000 ME Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine (ранее - 10000 ТЕ) позволяет эффективно выявлять животных, больных туберкулезом и ареактогенен для здорового поголовья КРС.

7. Вариант штамма М. bovis AN5, депонированный в РФ, по культуральным, морфологическим, тинкториальным, ферментативным, вирулентным, сенсибилизирующим и туберкулиногенным свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к производственным штаммам М. bovis, и может быть использован для изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих.

8. Сенсибилизация морских свинок термоинактивированными культурами М. bovis из штаммов AN5 или № 8 статистически достоверно не влияет на степень выраженности ответных реакций на туберкулин (ППД) для млекопитающих.

9. Разработан эталонный образец туберкулина (ППД) для птиц, активность которого по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) М. avium составляет 500000 ME в одном флаконе лиофилизированного препарата и соответствует принятому ГОСТ 23881-79 значению активности 500000 ТЕ.

10. Разработана и утверждена нормативная документация, гармонизированная с нормативными документами МЭБ и ВОЗ, обеспечивающая проведение контроля туберкулина (ППД) для млекопитающих и туберкулина (ППД) для птиц в соответствии с международными требованиями.

11. В соответствии с международными требованиями предложены принципы стандартизации микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза, определена доза КАМ - 800 ЕД, являющаяся оптимальной для проведения сравнительной симультанной пробы по отношению к дозе туберкулина (ППД) для млекопитающих - 2000 ME.

12. Внедрение мембранных методов в технологию изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих позволило повысить экологическую безопасность производства.

1. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0001-2004 Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 08.08.2006 г.;

2. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0011-2006 Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 03.04.2007 г;

3. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0012-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (эталонный образец) Технические условия, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» и согласованный с ФГУ ВГНКИ 05.06.2006 г.;

4. Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0014-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» и согласованный с ФГУ ВГНКИ 05.06.2006 г.;

5. Инструкция по применению стандартного раствора туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03.04.2006 г., per. номер ПВР-1-3.0/00424;

6. Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для млекопитающих (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 08.08.2006г., per. номер ПВР-1-3.5/01619;

7. Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03.04.2006 г., per. номер ПВР-1-3.0/00425;

8. Инструкция по применению туберкулина очищенного (ППД) для птиц, стандартный раствор (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК»), утвержденный Россельхознадзором 03.04.2007 г., per. номер ПВР-1-2.5/01620;

9. Промышленный регламент на производство туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих ПР 00482909-055-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21.12.2005 г.;

10. Промышленный регламент на производство туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц ПР 00482909-059-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21.12.2005 г.;

11. Промышленный регламент на производство аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (КАМ) ПР 00482909-072-2005, утвержденный генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 21.12.2005 г.;

12. Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные 10.12.1990 г. ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам.

13. Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные 13.10.1997 г. директором Курской биофабрики.

14. Извещение № 1 об изменении ТУ 9387-061-0494185-95 «Штаммы микобактерий туберкулеза бычьего вида № 8 и Vallee ВГНКИ, производственные», утвержденное 06.04.2004 г. Департаментом ветеринарии МСХ РФ (о возможности использования штамма М. bovis AN5, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») при изготовлении туберкулина (ППД) для млекопитающих).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа направлена на совершенствование системы диагностики туберкулеза у животных, а именно: внедрение в ветеринарную практику эффективных аллергенов, соответствующих требованиям международных нормативных документов. На основании проведенных исследований предложена современная технология изготовления туберкулина (ППД) для млекопитающих. Разработаны отечественные нормативные документы и эталонные образцы туберкулинов для оценки качества аллергенов методами, гармонизированными с документами ВОЗ и Руководством МЭБ. Научно обоснованы принципы стандартизации микобактериальных аллергенов, применяемых при дифференциальной аллергической диагностике туберкулеза.

С использованием международных стандартных образцов установлена активность эталонных серий (национальных стандартов) туберкулина (ППД) для млекопитающих и туберкулина (ППД) для птиц. Контроль показателей отечественного туберкулина (ППД) для млекопитающих, осуществляемый в соответствии с международными требованиями в комплексе с применением усовершенствованной технологии обеспечили повышение качества препарата и его конкурентоспособность по сравнению с туберкулинами, выпускаемыми за рубежом.

В результате проведенной работы в производство туберкулина (ППД) для млекопитающих внедрена экономически эффективная промышленная технология, позволившая повысить экологическую безопасность производства. С применением предложенной технологии с 2002 по 2006 годы изготовлено более 220 млн. доз туберкулина (ППД) для млекопитающих.

Базируясь на методических подходах, применяемых при стандартизации туберкулинов в международной практике, предложены методы определения эквивалентных доз аллергенов, используемых в симультанной пробе, позволяющие оптимизировать соотношение доз введения препаратов с учетом их специфичности.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Козлов, Владимир Егорович, Москва

1. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние по туберкулезу в РСФСР и методы борьбы с болезнью / Авилов В.М., Пылинин В.Ф. // Ветеринария. 1992. - № 1. - С. 3-9.

2. Агеев Е.П. Мембранные процессы разделения. / Агеев Е.П. // Крит, технол. Мембраны. 2001. -№ 9. - С. 42-56.

3. Аллахвердиев, И.И. Природные резервуары туберкулеза / Аллахвердиев И.И. // Вестник ветеринарии. 1997. - № 5. - С. 60-62.

4. Аллергическая диагностика туберкулеза / Урбан В.П., Широкобокова М.М., Данко Ю.Ю. и др. // Профилактика и ликвидация заразных болезней с.-х. животных. Сб. науч. трудов ЛВИ. JI. - 1985. - С. 80-85.

5. Андросова, М.В. Иммуноферментный анализ для идентификации микобактерий бычьего вида с помощью моноклональных антител / Андросова М.В., Владимирский М.А., Ходун JI.M. // Пробл. туберкулеза. 1996. - № 1. - С. 40-43.

6. Аникин, В.А. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза / Аникин В.А., Дитятков А.Е., Белоброва С.И. и др // Ветеринарная патология. М. - 2004. - № 1-2 (9). - С. 30-32.

7. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. JL: Медгиз, 1962. -180 с.

8. Бабич, М.А. Новые питательные среды для выращивания туберкулезных производственных штаммов / Бабич М.А., Плотникова

9. В.А. // Биопрепараты, вирусы, микробы. М.,1955. - С. 173-180.

10. Бактериологическая диагностика туберкулеза животных / Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Смолянинов Ю.И. и др. // Ветеринария. 2006. -№ 12.-С. 3-5.

11. Безгин, В.М. Промышленная технология изготовления комплексного ППД-туберкулина ВИЭВ для крупного рогатого скота / Безгин В.М., Устинова Г.И. // Инф. листок № 228-89 Курского МТЦНТиП. 1989.

12. Биосинтез протеина микобактерий туберкулеза птиц в зависимости от сроков инкубирования культуры / Иванов М.М., Гринев А.А., Шаров А.Н., Лукина Е.А. // Труды ГНКИ вет. препаратов. 1974. - Т. 20. - С. 112-117.

13. Биотехнология / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. СПб:ГИОРД, 2005. - 792 с.

14. Боганец, Н.С. Видовой состав микобактерий в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией / Боганец Н.С., Хайкин Б.Я., Панкратов А.Д. // Паразиты и вызываемые ими болезни в Сибири. Новосибирск. -1997.-С. 17-19.

15. Буран, А.В. Некоторые особенности законодательства РФ о лекарственных средствах / Буран А.В. // Технол. чистоты. 2005. - № 4.-С. 9-12.

16. Бусол, В.А. Применение разных доз туберкулина при исследовании крупного рогатого скота на туберкулез / Бусол В.А., Кочмарский А.Ф., Ткаченко А.А. //Ветеринария. 1991.- № 11. - С. 21-23.

17. Василенко, К.Ф. Сравнительная оценка альттуберкулина и туберкулопротеина при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Василенко К.Ф., Пылинин В.Ф. //Сб. науч. работ. Омск, 1974. -Вып. XXI.-С. 77-81.

18. Васильченко, Г.А. Аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / Васильченко Г.А. // Научно-техн. бюлл. -Новосибирск. 1982. - Вып. 11. - С. 9-10.

19. Воробьева, З.Г. Получение и характеристика биологической активности26

Информация о работе

Козлов, Владимир Егорович
доктора биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Аллергены для диагностики туберкулеза: совершенствование производства и стандартизация - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы