Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биохимических и биологических свойств ППД туберкулина для млекопитающих и его стандартизация

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение биохимических и биологических свойств ППД туберкулина для млекопитающих и его стандартизация"

На правах рукописи

Мясоедов Юрий Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ППД ТУБЕРКУЛИНА ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЕГО СТАНДАРТИЗАЦИЯ

03.00.04 - биохимия 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Курск - 2006

Работа выполнена в ФГУП "Курская биофабрика фирма - «БИОК»

Научные руководители: заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор биологических наук, профессор Безгин Вячеслав Михайлович

кандидат биологических наук, доцент Козлов Владимир Егорович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Еременко Виктор Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Евглевский Алексей Алексеевич

Ведущая организация: ФГУ Всероссийский государственный

научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов

Защита состоится «о¥-3 » 2006 г. в «/^'^Гчасов

на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова (305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова.

Автореферат разослан « № » 2006 г

Ученый секретарь

диссертационного совета --Г.Ф. Рыжкова

200 Gf\

33 Gi

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время туберкулез является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний животных (Sternberg S. et al. 2002) и наносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству (GonZalez Llamazares O.R., 1999; Непоклонов Е.А., 2003). Эффективность профилактических и противоэпизооти-ческих мероприятий при туберкулезной инфекции в значительной степени зависят от своевременной постановки и точности диагностических тестов. Существует несколько методов диагностики туберкулеза, которые используются в ветеринарной практике при проведении противотуберкулезных мероприятий: патологоанатомический, аллергический, бактериологический, ПЦР, ИФА (OIE. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. 2004). Эффективность данных методов различна (Коротяев А.И., 1998). Наиболее широко применяемым массовым, прижизненным методом исследования на тубе .сулез является аллергический метод (Найманов А.Х., 2002). Это связано с тем, что туберкулиновая проба обладает высокой чувствительностью, кроме того, для нее не требуется наличия дорогостоящей аппаратуры и особых условий постановки теста (Грузевский А.А. 1999; М. Amadori et al., 2002). В то же время эффективность туберкулинового теста зависит от ряда факторов. Из них основными являются активность и специфичность диагностику-ма. Данные параметры определяют оптимальную дозу туберкулина, используемую при диагностике туберкулеза, и в свою очередь, зависят от технологии изготовления и его биохимического состава.

На Курской биофабрике с 2001 года в процессе изготовления ППД туберкулина для млекопитающих используется метод мембранного фракционирования микобактериальных белков культуральной жидкости (Патент РФ №2113233,1997). Внедрение этой технологии привело к изменениям биохимических свойств аллергена. В связи с этим актуальным является сравнительное изучение биохимического состава ППД туберкулина для млекопитающих, а также оценка эффективности технологических процессов при изготовлении высокоактивных диагности-кумов.

В течение нескольких десятилетий в Российской Федерации использовали туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, биологическая активность которого была определена относительно Международного стандарта туберкулина - PPD-S. В 1986 году ВОЗ был представлен Первый Международный стандарт ППД туберкулина -PPD-bovine (European Pharmacopoeia 4 th Edition, 2002). Согласно этому стандарту в настоящее время для оценки биологических свойств коммерческих серий туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих основополагающим является применение эталонов, соответствующих общепринятым международным стандартам, и использование регламентированных методов оценки их качества (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines., 2004). В связи с этим, актуальным является стандартизация туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного стандарт

Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение биохимических и биологических свойств туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, а также сравнительное изучение методов контроля качества туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и его стандартизация.

Исходя из поставленной цели, для ее решения были определены следующие задачи:

1. Провести изучение биохимического состава и иммунобиологических характеристик фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных по промышленной технологии, с использованием метода мембранного фракционирования и без применения мембранной технологии.

2. Изучить эффективность различных методов сенсибилизации морских свинок живыми и инактивированными микобактериями туберкулеза бычьего вида и определить способ сенсибилизации морских свинок термоинактивированными микобактериями для достижения оптимального уровня кожной реакции ГЗТ при определении биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.

3. Провести сравнительные исследования по подбору эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и установить эквивалент ее биологической активности относительно Первого Международного стандарта PPD-bovine (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004).

4. Оценить эффективность использования различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ на лабораторных животных и больном туберкулезом крупном рогатом скоте при определении биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

Научная новизна работы. В сравнительном аспекте изучен биохимический состав и иммунобиологические свойства вариантов фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных при использовании мембран с разной номинальной отсекаемой молекулярной массой. Впервые проведен сравнительный анализ чувствительности разных методов сенсибилизации морских свинок при определении биологической активности ППД туберкулина (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004). Впервые выявлена статистическая закономерность увеличения вариации кожной реакции ГЗТ при снижении дозы туберкулина как у крупного рогатого скота, больного туберкулезом (доза 3250 ME PPD-bovine - 32%; 650 ME PPD-bovine -42,69%), так и у морских свинок, сенсибилизированных микобактериями туберкулеза бычьего вида (доза 20 ME PPD-bovine - 12,66 %; 2 ME PPD-bovine-21,55%).

Практическая значимость работы и пути ее реализации. По результатам исследования для проведения контроля биологической активности производственных серий утверждена эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих -ЗА (письмо ВГНКИ №444/1.3 от 13.03.02). В соответствии с международными требованиями проведено определение биологической активности эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно

Первого Международного стандарта PPD-bovine. Результаты исследований включены в нормативно-техническую документацию по контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих - СТО 00482909-0001-2004.

Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

1. Результаты изучения биохимических и иммунобиологических характеристик фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных с использованием мембранной технологии.

2. Результаты сравнительных исследований эффективности различных методов сенсибилизации морских свинок микобактериями туберкулеза при определении величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.

3. Результаты исследования по подбору эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и стандартизация эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного эталона PPD- bovine.

4. Результаты оценки эффективности применения различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ при определении величины биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

Апробация результатов работы. Основные положения диссертации доложены на заседании кафедры биотехнологии, фармакологии и ветеринарно-санитарной экспертизы КГСХА им. профессора И.И.Иванова 15.02.2001; конференции молодых ученых КГСХА им. профессора И.И.Иванова: 10.05.2003, 20.11.2004; на международной научно-практической конференции: «Актуальна проблеми ветеринарноТ медицини в умовах сучасного ведения тваринництва» 28.05.2003, Феодосия; международной научно-практической конференции: «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее» 23.09.2004, Щелково.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 7 рисунками. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения. Список использованной литературы включает 210 источников, из них 118 отечественных и 92 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования были выполнены согласно плану научных исследований на ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК», в период 20002005 гг. по схеме, представленной на рисунке 1.

Рис 1. Общая схема исследования

В опытах использовали лабораторных животных - морских свинок, альбиносов массой 400 - 600 г. Предварительно перед использованием в опытах всех морских свинок исследовали на туберкулез путем внут-рикожного введения туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих в дозе 25 ME (PPD-S) (согласно: Инструкции по изготовлению и контролю сухого очищенного туберкулина (ППД) для млекопитающих, утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 10.12.1970). Всего в работе было использовано 540 морских свинок.

Исследования туберкулинов на крупном рогатом скоте, больном туберкулезом, проводили в изоляторах Саратовской области - Петровского района (согласно приказу Департамента ветеринарии МСХ РФ №13-3a-09/142 от 28.01.2002), Волгоградской области - станица Клет-ская (согласно приказу Департамента ветеринарии МСХ РФ №33 от 11.12.2002). Туберкулез в хозяйствах был установлен бактериологическими методами с идентификацией возбудителя - М. bovis. Всего в работе было использовано 235 животных, больных туберкулезом.

Реактогенность туберкулинов проверяли на здоровом поголовье крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах Курской области. Всего в работе было использовано 361 животное.

В работе использовали туберкулиновые фракции и туберкулины, полученные по технологии с использованием метода мембранного фракционирования при использовании мембран с разной номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ), а также туберкулины и фракции туберкулина, полученные без применения методов мембранной технологии.

Суспензию термоинактивированных микобактерий AN-5 и 8-88 изготавливали из расчета содержания 1 миллиграмм микобактерий в 1 миллилитре вазелинового масла. Суспензию микобактерий штамма BCG-1 изготавливали на стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (рН=7,0) из расчета содержания 2 миллиграмма микобактерий в 1 миллилитре раствора.

Содержание полисахаридов в исследуемых туберкулиновых препаратах определяли методом Хагедорна-Иенсена (Шамахмудов Ш.Ш., 1966).

Определение нуклеиновых кислот проводили по методу М.А. Гу-берниева И. Г. Ковырева (Асатиани В. С., 1956).

Количественное содержание липидов в образцах определяли согласно методике Aronson (Модель JI.M.,1958).

Определение сухого остатка, органических и не органических соединений проводили весовым методом (Физико-химические методы контроля ингредиентов питательных сред и биопрепаратов, 1970).

Определение концентрации туберкулопротеина проводили по методу Кьельдаля (ГОСТ 16739-88).

Гель - хроматографию туберкулинов проводили с использованием колонки размером 1,05 х 40 см, заполненной ультрагелем АсА 44 (фирма LKB) или сефадексом G-150 (фирма Pharmacia), (Остерман JT.A.,1985).

Аминокислоты в образцах определяли на аминокислотном анализаторе HITACHI KLA-3B по методике, предложенной фирмой - изготовителем.

Биологическую активность туберкулинов определяли на морских свинках, сенсибилизированных M. bovis, специфичность - на морских свинках, сенсибилизированных M. avium.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым статистическим методам (Лакин Г.Ф.,1990). Статистические критерии постановки экспериментов по определению биологических показателей туберкулинов оценивали по методике OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение биохимических и иммунобиологических свойств ППД туберкулина для млекопитающих

Одним из возможных путей повышения активности и специфичности туберкулиновых препаратов является фракционирование белков культуральной жидкости M. bovis по молекулярной массе и определение фракций, характеризующихся наилучшими иммунобиологическими свойствами.

В первой серии экспериментов были изучены биохимические и иммунобиологические свойства туберкулиновых фракций, полученных как с использованием метода мембранного фракционирования при использовании мембран с разной НОММ (номинальная отсекаемая молекулярная масса), так и без применения методов мембранной технологии. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Установлено, что варианты II и III концентрата белка (с молекулярной массой от 15 до 100 КДА и от 15 до 1000 КДА) характеризовались достоверно более высокой специфичностью по сравнению с вариантом I концентрата белка, изготовленного без использования метода мембранного фракционирования. Варианты высокомолекулярной фракции IV и V (с молекулярной массой более 100 КДА и более 1000 КДА соответственно) имели достоверно более высокую активность по сравнению с контролем (вариант I), но не отличались от него по специфичности. Следует отметить, что согласно требованиям нормативной документации МЭБ микобактериальные аллергены, имеющие показатель специфичности, равный более 10%, характеризуются как низко специфичные. То есть высокомолекулярные фракции (вариант IV и V) не соответствуют требованиям международных нормативных документов. Поэтому при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, с применением мембранной технологии, высокомолекулярная фракция удаляется.

Сравнительный анализ биохимических и биологических характеристик туберкулиновых фракций, полученных промышленным способом с использованием разных технологий

№ п/п Наименование препарата Молекулярная масса КДА Количество полученных фракций, при использовании хроматографиче-ской матрицы Биологические показатели

АсА 44 G-150 Активность, МЕ/мг Специфичность, %

1 Концентрат белка, контроль (I вариант) п=7 2 2 10000±678 12±1,9

2 Концентрат белка (И вариант) п=7 15-100 1 1 13400±459 3,9±0,9*

3 Концентрат белка (III вариант) п=7 15-1000 2 2 12600±300 6,5±0,56*

4 Высокомолекулярная фракция (IV вариант) п=7 >100 1 1 14680±552* 14±3,5

5 Высокомолекулярная фракция (V вариант) п=7 >1000 1 1 15870±670* 12±2,5

Примечание:* разница достоверна при р<0,05 (значимые результаты выделены черным шрифтом)

Биохимический состав туберкулиновых фракций, полученных разными способами

Варианты туберкулиновых фракций Сухой остаток Органические вещества 1 (еоргани- ческие вещества Белки Полисахариды Липиды Нуклеиновые кислоты

мг % мг % мг % мг % мг % мг % мг %

I. (п=7) контроль 7,5± 0,92 100 7,1± 0,88 94,67 0,40± 0,18 5,33 5,85± 2,1 78,0 0,33± 0.09 4,40 0,45± 0,03 6,0 0,18± 0,02 2,40

И. (п=7) 14,53± 0,22 100 13,53± 0,11 93,12 1,0± 0,3 6,88 12,4± 2,5 85,7* 0,29± 0,01 2,0* 0,44± 0,09 3,0* 0,29± 0,14 2,0

III. (п=7) 10,03± 0,41 100 9,26± 0,15 92,3 0,77± 0,1 7,68 8,27± 0,11 82,5* 0,25± 0,02 2,45* 0,32± 0,05 3,23* 0,23± 0,10 2,30

IV. (п=7) 8,2± 0,45 100 7,54± 0,25 92,0 0,66± 0,03 8,0 5,7± 1.02 694* 0,74± 0,20 9,0* 0,78± 0,16 9,5* 0,10± 0,01 1,22*

V. (п=7) 7,5± 0,11 100 6,75± 0,2 90,0 0,75± 0,01 10 5,02± 1,33 66,9* 0,6± 0,25 8,0* 0,75± 0,2 10,0* 0,15± 0,05 2,0

Примечание : * разница достоверна при р<0,05. контроль вариант I, с которым сравнивали остальные фракции (значения выделены черным шрифтом)

Обозначения

1. Концентрат белка, полученный по технологии без использования мембранного фракционирования, контроль (молекулярная масса менее 15 и более 100 К ДА) 111 Концентрат белка, полученный по технологии с использованием мембранного фракционирования (молекулярная масса от 15 до 1000 КДА) V. Высокомолекулярная фракция (молекулярная масса более 1000 КДА)

II Концентрат белка, полученный по технологии с использованием мембранного фракционирования (молекулярная масса от 15 до 100 КДА) IV Высокомолекулярная фракция (молекулярная масса более 100 КДА)

В состав туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученного методом мембранного фракционирования, могут входить компоненты с молекулярной массой от 15 до 100 КДА и от 15 до 1000 КДА (фракции II и III).

Отсутствие достоверного отличия иммунобиологических свойств вариантов II и III концентрата белка с разной молекулярной массой имеет большое значение в технологическом плане, так как производство туберкулина очищенного ППД для млекопитающих, содержащего ми-кобактериальные белки до 15-1000 КДА, позволяет снизить потери активных компонентов в процессе производства с одновременным сохранением специфичности препарата.

Следующим этапом исследования было изучение биохимического состава туберкулиновых фракций. Оценивали содержание белка, полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот, также определяли сухой остаток. Результаты исследования представлены в таблице 2. Установлено, что значимые различия между фракциями регистрировались по содержанию белка, полисахаридов, липидов.

Таким образом, использование метода мембранного фракционирования достоверно влияло на биохимический состав фракций. Так, варианты (II и III) концентрата белка, полученные по технологии с использованием метода мембранного фракционирования, характеризовались пониженным содержанием липидов и полисахаридов с одновременным увеличением содержания белка. Вместе с тем, варианты (IV и V) высокомолекулярной фракции характеризовались повышенным содержанием липидов, полисахаридов и соответственно снижением содержания белка. С учетом результатов исследования иммунобиологических показателей фракций можно сделать вывод, что с повышением степени очистки белка и снижением содержания липидов и полисахаридов достоверно повышается специфичность туберкулиновых препаратов.

Проведенные эксперименты показывают высокую эффективность метода мембранного фракционирования в процессе производства туберкулина и возможность получения с помощью этого метода высокоактивного диагностикума.

3.2. Сравнительное изучение способов сенсибилизации морских свинок микобактериями для определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих

При промышленном изготовлении туберкулинов контроль биологической активности проводится двукратно: на этапе изготовления (цеховой контроль) и при выпуске готового препарата (контроль отдела биологического и технологического контроля). Согласно требованиям ГОСТ 16739, биологическая активность ППД туберкулина определяется на морских свинках, сенсибилизированных живыми микобактериями штамма ВСО-1. В то же время для стандартизации туберкулина по содержанию Международных единиц международной нормативной доку-

ментацией предусмотрены и другие способы сенсибилизации, а именно сенсибилизация живыми или инактивированными патогенными штаммами М. bovis. Использование морских свинок, сенсибилизированных живыми патогенными микобактериями, связано с определенными сложностями в поддержании соответствующего санитарного режима вивария, поэтому предпочтительным для сенсибилизации животных является использование инактивированных патогенных микобактерий. Учитывая вышеизложенное, для проведения дальнейших работ по стандартизации туберкулина, было проведено сравнительное изучение методов сенсибилизации морских свинок аттенуированными (штамм BCG-1) и инактивированными патогенными микобактериями (штаммы: AN-5 и 8-88) бычьего вида. Инактивированные микобактерии морским свинкам вводили двумя способами - внутрикожно и внутримышечно, а живые аттенуированные микобактерии только внутрикожно. Исследовали влияние дозы туберкулина на диаметр эритемы кожной реакции ГЗТ. Результаты исследования представлены на рисунке 2.

24

22 20 181614 ■

12'

- -

-BCG

---№8в/м

......№8в/к

----AN-5B/M

----AN-5B/K

0,3 (2 МЕ) 1,3 (20 МЕ)

логарифм дозы введения туберкулина

Рис 2. Зависимость среднего диаметра кожной реакции ГЗТ от дозы введения туберкулина

Прямые, представленные на рисунке 2, характеризуют чувствительность кожной реакции ГЗТ при использовании разных методов сенсибилизации морских свинок. Чувствительность кожных реакций определяется разностью величины кожных реакций ГЗТ на низкие и высокие дозы туберкулина. Для выражения чувствительности используют показатель тангенса угла наклона прямой зависимости логарифма дозы от диаметра кож-

ной реакции ГЗТ. Как видно из рисунка 2, наибольшей чувствительностью обладают методы с использованием внутримышечного способа введения инактивированных микобактерий штамма АМ-5 или 8-88 и внутрикожного способа введения с использованием микобактерий штамма ВСС-1. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Таблица 3

Чувствительность методов сенсибилизации (тангенс угла наклона)

в зависимости от штамма и способа введения микобактерий

Штаммы микобактерий

ВСС-1 8-88 АМ-5

контроль испытуемые группы

способ введения микобактерий

внутри-кожно (п=10) внутримышечно (п=10) внутри-кожно (п=10) внутримышечно (п=10) внутри-кожно (п=10)

10,4±1,1 12,34±1,9 5,37±0,46 9,84±0,34 7,69±2,4

Сравнительный анализ методов сенсибилизации проводили при помощи дисперсионного анализа. Исследовали взаимодействие двух факторов: способа введения микобактерий (внутримышечно и внутри-кожно) и штамма вводимых микобактерий. По результатам проведенных исследований выявили, что на величину кожной реакции достоверно оказывал влияние способ введения микобактерий, при этом штамм используемых для сенсибилизации микобактерий не влиял на величину кожной реакции ГЗТ.

Таким образом, наряду с применением в соответствии ГОСТ 16739 внутрикожного метода сенсибилизации морских свинок микобак-териями штамма ВСО-1, при определении величины биологической активности туберкулина может быть использован внутримышечный метод сенсибилизации инактивированными микобактериями штаммов АЫ-5 и 8-88 согласно требованиям международных нормативных документов.

3.3. Подбор эталонной серии и стандартизация 1111Д туберкулина для млекопитающих

Для проведения экспериментов по стандартизации туберкулинов первоначально проводили подбор эталонной серии. Было проведено испытание четырех сублимированных серий туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих №№ 4, 25А, ЗА, 7А, изготовленных в 20002001 году. В соответствии с требованиями ГОСТ 16739 оценивали следующие показатели качества препаратов: внешний вид, растворимость, рН, массовая доля белка, реактогенность, отсутствие сенсибилизирующих свойств и биологическую активность. Результаты иссле-

дований представлены в таблице 4. Сравнительные исследования вариантов туберкулина на больном туберкулезом крупном рогатом скоте не выявили различий между исследованными и контрольной серией. На основании данных, полученных в опытах на сенсибилизированных морских свинках и больном туберкулезом крупном рогатом скоте, для дальнейших исследований по стандартизации была использована серия 3 А.

Таблица 4

Физико-химические и биологические показатели сублимированных серий туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих

Номер серии, № Наименование показателя качества (ГОСТ 16739-88)

Внешний вид Растворимость, мин. pH Массовая доля белка, % Реакто-ген-ность Сенсибилизирующие свойства Биологическая активность, МЕ/мл (PPD-S)

4 Сухая пористая масса светло-коричневого цвета с серым оттенком 1' 7,4 77,0 ареак-тогенны не обладают сенсибилизирующими свойствами 46500

25А 1' 7,32 82,4 50000

ЗА I1 7,36 82,7 50500

7А I1 6,65 60,0 45000

Величину биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих серии №ЗА относительно Первого Международного стандарта PPD- bovine определяли на трех группах морских свинок, сенсибилизированных инактивированными (штаммы: AN-5 и 888) и авирулентными микобактериями (штамм BCG-1) бычьего вида. Результаты исследований представлены в таблице 5.

По трем группам сенсибилизированных морских свинок показатель биологической активности эталонной серии №ЗА, выраженный в Международных единицах Первого Международного стандарта PPD-bovine, в среднем составил 9300 МЕ/ мл. С учетом разведения во флаконе содержится 220 ООО ME PPD-bovine. При растворении содержимого флакона в 20 миллилитрах растворителя, 1 миллилитр стандартного раствора содержит 11000 ME/мл (PPD bovine).

При проведении сравнительного анализа результатов биологической активности, полученных на трех группах морских свинок, сенсибилизированных различными штаммами микобактерий, не обнаружено достоверных различий. Разброс величины биологической активности (R) по отношению к Международному стандартному образцу во всех группах не превышал 20%, а значения доверительного интервала

Определение биологической активности Эталонной серии ЗА туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного стандарта РРО-Ьоуте на морских свинках сенсибилизированных

Показатели Варианты сенсибилизации морских свинок микобактериями

BCG-1 AN-5 8-88

п=10 л= 9 п=10

М±т Эталонной серии и Международного стандарта

Доза туберкулина (РРО-Ьоипе) Эт. серия ЗА Межд. ст-т Эт. серия ЗА Межд. ст-т Эт. серия ЗА Межд. ст-т

20 МЕ 2!,75±1,2 22,33±0,38 21,56±0,67 20,39±0.51 22,5±0,71 19,7±0,86

ЮМЕ 18,0*1,56 18,33±0,91 18,17±0,56 17,61 ±0,61 16,25±0,68 17,2±0,79

5 МЕ 15,67±1,14 16,92±0,93 14,39±0,66 14,06±0,65 13,15±0,89 15,05±0,71

2.5 МЕ 13,17±1,15 13,25±1,48 10,78±0,79 12.56±0,67 9,55±0,26 11,85±0,64

Доверительный интервал при р= 0,05 (%) 81-122 82-121 82-120

Относительная активность национального стандарта (Я) 0,88 1.02 0,89

Биологическая активность МЕ/мл (РРЕ>-Ьоуте) 10550 12200 10730

входили в установленные нормативно-технической документацией МЭБ границы от 50% до 200%. Таким образом, подобрана эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и определена ее биологическая активность относительно Первого Международного стандарта PPD- bovine.

3.4. Оценка эффективности использования различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ при определении биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих

В исследованиях, выполненных на крупном рогатом скоте, больном туберкулезом, проводили сравнение разных способов и доз введения туберкулина. Также проведено сравнение между собой результатов вариабельности туберкулиновых реакций, полученных как на больном туберкулезом крупном рогатом скоте, так и на морских свинках, сенсибилизированных микобактериями штамма ВСО-1. В работе, выполненной на крупном рогатом скоте, больном туберкулезом, использовали две дозы туберкулина, которые регламентированы нормативной доку-

ментацией МЭБ для сравнительных исследований туберкулинов по биологической активности. Максимальная доза соответствовала 3250МЕ (РРЭ-Ьоуте), минимальная 650 МЕ (РРО-Ьоуше). Туберкулин вводили шприцем и инъектором. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

Таблица 6

Показатели кожной реакции ГЗТ у КРС при использовании ___различных методов введения туберкулина_

Пока- Введение Введение Введение Введение

затели туберкулина туберкулина туберкулина туберкулина

шприцем инъектором шприцем инъектором

1 группа п=20 2 группа п= 18

доза МЕ

(РРБ-Ьоуте) 3250 650 3250 650 3250 650 3250 650

М±т 10,55 ± 6,35 ± 9,5 ± 5,5 ± 7,78 ± 4,39 ± 8,28 ± 4,89 ±

(мм) 0,64 0,51 0,68 0,44 0,55 0,51 0,75 0,58

У<%) 27,5 36,2 31.3 36,4 30,72 48,06 38,65 50,1

На основании статистических расчетов с использованием критерия Стьюдента не установлено достоверных различий между оцениваемыми методами введения туберкулина шприцем и инъектором. Из представленных данных видно, что вариация кожных значений реакций ГЗТ во всех случаях превышает 25% и является значительной. При этом была обнаружена достоверная закономерность: увеличение вариации кожной реакции ГЗТ при снижении дозы введения туберкулина.

Следующим этапом исследования было изучение варьирования результатов реакций в зависимости от дозы туберкулина на морских свинках, сенсибилизированных авирулентными микобактериями штамма ВСС-1. Работу проводили на трех группах морских свинок, которым вводили две дозы ППД туберкулина для млекопитающих: 20 и 2 МЕ (РРБ-Ьоуте). Результаты исследований представлены в таблице 7. Из данных таблицы видно, что во всех трех опытах значения коэффициентов вариации величины кожной реакции ГЗТ для равных доз туберкулина практически одинаковы. При этом наблюдалось достоверное увеличение коэффициента вариации туберкулиновых реакций при снижении дозы аллергена, как в опытах, проведенных на крупном рогатом скоте, больном туберкулезом. В среднем для дозы 20 МЕ коэффициент вариации составил 12,66±0,6, а для дозы 2 МЕ -21,55±0,62. Из данных таблицы также видно, что варьирование результатов туберкулиновых реакций у морских свинок является средним и не превышает 25%. Сравнительный анализ результатов определения коэффициентов вариации, полученных в опытах на сенсибилизированных морских свинках и на больном туберкулезом крупном рогатом скоте, свидетельствует о более высокой точности определения величины

Таблица 7

Показатели величины кожных реакций морских свинок,

сенсибилизированных М. Bovis (штамм BCG-1)_

Показатели Туберкулин серия 1 Туберкулин серия 2 Туберкулин серия 3

п= 9 9 И

доза МЕ (PPD-bovine) 20 2 20 2 20 2

M±m (мм) 16,61± 0,54 12,11± 0,85 17,22± 0,73 13,22± 1.0 17,13± 0,8 12,64± 0,7

V (%) 11.62 21,06 12,66 22,8 13,7 20,8

биологической активности туберкулинов на морских свинках, в сравнении с испытанием на крупном рогатом скоте.

Таким образом, при определении величины биологической активности туберкулина, использование морских свинок, сенсибилизированных микобактериями туберкулеза бычьего вида наиболее целесообразно в сравнении с крупным рогатым скотом, больным туберкулезом.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что применение методов мембранной технологии при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих позволяет повысить его специфичность, при этом в препарате достоверно увеличивается доля белковых соединений и снижается содержание липидов и полисахаридов.

2. Показано достоверное различие биохимического состава туберкулиновых препаратов, полученных с использованием мембранного фракционирования по сравнению с туберкулином, изготовленным без применения мембранной технологии. Использование мембран с НОММ от 15 до 1000 КДА наиболее эффективно, по сравнению с применением мембран с НОММ от 15 до 100 КДА.

3. Определено, что чувствительность внутримышечных методов сенсибилизации морских свинок инактивированными микобактериями достоверно выше (штамм АЫ-5- 9,84±0,34; штамм 8-88- 12,34±1,9), чем внутрикожных (штамм АЫ-5- 7,69±2,4; штамм 8-88- 5,37±0,46).

4. Установлено, что варианты внутримышечной сенсибилизации инактивированными микобактериями (штамм АЫ-5 и 8-88) и внутри-кожной живыми авирулентными микобактериями (штамм ВСО-1) позволяют получать стабильные результаты величины биологической активности туберкулина (11=1±0,2)

5. Предложена эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих стандартизированная относительно Первого Международного стандарта РРБ-Ьоуше в соответствии с требованиями МЭБ.

6. Показано, что уровень вариации кожных реакций ГЗТ у крупного рогатого скота, больного туберкулезом, и морских свинок, сенсибилизированных М. bovis, при использовании низких доз туберкулина имеет более высокие значения по сравнению с уровнем вариации реакций на высокие дозы.

7. Установлена более низкая вариация туберкулиновых реакций на сенсибилизированных М. bovis морских свинках в сравнении с больным туберкулезом крупным рогатым скотом, что определяет предпочтительность использования морских свинок при определении величины биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

8. Не установлено достоверных различий в выявляемости больных туберкулезом животных при введении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, как шприцем, так и инъектором в условиях туберкулезного изолятора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработана и утверждена для проведения контроля эталонная серия ППД туберкулина для млекопитающих (письмо ВГНКИ №444/1.3 от 13.03.02). Определена биологическая активность эталонной серии ППД туберкулина для млекопитающих на морских свинках относительно Международного эталона PPD Bovine. Результаты исследований включены в нормативно техническую документацию по контролю ППД туберкулина для млекопитающих - СТО 00482909-0001-2004.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Мясоедов Ю.М. Изучение различных способов сенсибилизации морских свинок, используемых при определении биологической активности ППД туберкулинов для млекопитающих / Ю.М. Мясоедов, В.Е. Козлов, Л.Д. Ничвеева, В.М. Безгин, A.A. Маслак // Ветеринарна медицина. Мшвщомчий тематичний науковий зб!рник, №82. - Харкт,-

2003.- С. 285-288.

2. Мясоедов Ю.М. Выбор эталонной серии туберкулина (ППД) для млекопитающих для контроля и стандартизации производственных серий препарата / В.Е. Козлов, Н.К. Букова, В. М. Безгин, Ю.М. Мясоедов, Л.Д. Ничвеева, В.А. Гринев, H.A. Селезнев // Ветеринарная патология. -

2004,- Т. 9.-№ 1-2. С. 80-82.

3. Мясоедов Ю.М. Оценка активности национального стандарта туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно международного стандарта туберкулина (PPD) Bovine / D.E. Козлов, В.М. Безгин, К.В. Шумилов, Н.К. Букова, А.Х. Найманос, Ю.М. Мясоедов, Л.Д. Ничвеева, В.Н. Абрамов, B.C. Дубинин // Ветеринарная патология,- 2004. -Т. 9,-№ 1-2.-С. 85-89.

4. Мясоедов Ю.М. Оценка эффективности различных доз и методов введения туберкулина при диагностике туберкулеза КРС /

B.Е. Козлов, Ю.М. Мясоедов, В.М. Безгин // Ветеринария. - 2004,- №11.-

C. 5-8.

5. Мясоедов Ю.М. Сравнительный анализ фракций туберкулина, полученных лабораторным и производственным способами / Ю.М. Мясоедов, В.Е. Козлов, В.М. Безгин // Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию ФГУП «Щелковский биокомбинат» «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее», 20-23 сентября 2004 г., Щелково. - Щелково, 2004. - С. 164-167.

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Печать на копировальном аппарате КГСХА. Уел печ л. 1,0. Уч -изд.л. 1,0. Тираж 100 экз.

ZöoGh

P-396 1

( /

i

b

i

г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мясоедов, Юрий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика микобактсрий туберкулеза

1.2. Реакции иммунного ответа при туберкулезной инфекции

1.3. Биохимический состав туберкулина очищенного

ППД) для млекопитающих

1.4. Биологические свойства туберкулина очищенного

ППД) для млекопитающих и его стандартизация

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Экспериментальные животные

2.2. Туберкулиновые препараты

2.3. Приготовление микобактериальных антигенов. Схемы иммунизации морских свинок. Оценка интенсивности развития иммунного ответа

2.4. Биохимические исследования

2.5. Биологические исследования

2.6. Математическая обработка результатов эксперимента

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение биохимических и иммунобиологических свойств

ППД туберкулина для млекопитающих

3.2. Сравнительное изучение способов сенсибилизации морских свинок микобактериями для определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих

3.3. Подбор эталонной серии и стандартизация ППД туберкулина для млекопитающих

3.4. Оценка эффективности использования различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ при определении биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биохимических и биологических свойств ППД туберкулина для млекопитающих и его стандартизация"

Актуальность темы. В настоящее время туберкулез является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний животных (Краснов В.А., Мурашкина Г.С., 1998; Додонов М.М., 2002) и наносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству (Авилов В.М., 1992; GonZalez Llamazares O.R. 1999; Кресс В.М., 2000; Paziak-Domanska, В. 2002; Непоклонов Е.А., 2003). Эффективность профилактических и противоэпизоотических мероприятий при туберкулезной инфекции в значительной степени определяется своевременностью постановки и точностью используемых диагностических тестов. Существует несколько методов диагностики туберкулеза -прижизненных и послеубойных (Петров А. А. и др., 1993; OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines,2004), которые используются для борьбы и своевременной профилактики распространения заболевания: пато-логоанатомический, аллергический; бактериологический, включающий в себя микроскопию, культуральные исследования, биопробу; ПЦР, ИФА. Эффективность данных методов различна (Коротяев А. И., 1998; Осипова Е. П.,2004). Наиболее широко применяющимся, массовым, прижизненным методом исследования на туберкулез, согласно данным Найманова А.Х. (2002), является аллергический метод. Это связано с тем, что туберкулиновая проба обладает высокой чувствительностью, кроме того, для нее не требуется наличия дорогостоящей аппаратуры и особых условий постановки (Amadori M., 2002). В то же время эффективность туберкулинового теста зависит от ряда факторов. Из них основными являются активность и специфичность. Активность при этом определяет оптимальную дозу туберкулина, используемую при диагностике туберкулеза (Шаров А. Н., Ерошенко JL А., Косякин А. Н., 1996). В то же время показатель специфичности зависит от химического состава аллергена, который зависит от технологии изготовления препарата (Шаров А.Н.,1989).

На Курской биофабрике с 2001 года в процессе изготовления ППД туберкулина для млекопитающих используется метод мембранного фракционирования микобактериальных белков культуральной жидкости (согласно Патенту РФ №2113233,1997). Внедрение этой технологии привело к изменениям биохимических свойств аллергена. В связи с этим актуальным является сравнительное изучение биохимического состава туберкулина, а также оценка эффективности технологических процессов при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

В настоящее время среди исследователей нет окончательного мнения относительно оптимальной дозы туберкулина используемой при проведении аллергической диагностики туберкулеза. Это в определенной степени связано с большим количеством существовавших международных и европейских стандартов, которые в разное время были разработаны для тех или иных ту-беркулинов: стандарты для АТК (Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 15 докл., 1964; Фрадкин В.А.,1990), стандарт Зей-берт (Фрадкин В.А.,1990) и другие. В течение долгого периода времени (с 1970 года) в Российской Федерации использовали туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, биологическая активность которого была определена относительно международного стандарта туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих- PPD-S (Шевырев Н.С., 1971). В 1986 году ВОЗ был представлен Первый Международный стандарт ППД туберкулина -PPD-Bovine (European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002). Для оценки биологических свойств коммерческих серий туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих основополагающим является применение эталонов, соответствующих общепринятым международным стандартам, и использование регламентированных методов оценки качества туберкулиновых препаратов (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004). В связи с предстоящим вхождением России в ВТО и необходимостью гармонизации требований к ветеринарным препаратам с учетом международной нормативной документации, актуальным является проведение стандартизации туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного стандарта PPD-bovine.

Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение биохимических и биологических свойств туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, а также сравнительное изучение методов контроля качества туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и его стандартизация.

Исходя из поставленной цели, для ее решения были определены следующие задачи:

1. Провести изучение биохимического состава и иммунобиологических характеристик фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных по промышленной технологии, с использованием метода мембранного фракционирования и без применения мембранной технологии.

2. Изучить эффективность различных методов сенсибилизации морских свинок живыми и инактивированными микобактериями туберкулеза бычьего вида и определить способ сенсибилизации морских свинок термо-инактивированными микобактериями для достижения оптимального уровня кожной реакции ГЗТ при определении биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.

3. Провести сравнительные исследования по подбору эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и установить эквивалент ее биологической активности относительно Первого Международного стандарта PPD-bovine (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004).

4. Оценить эффективность использования различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ на лабораторных животных и больном туберкулезом крупном рогатом скоте при определении биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

Научная новизна работы. В сравнительном аспекте изучен биохимический состав и иммунобиологические свойства вариантов фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих полученных при использовании мембран с разной номинальной отсекаемой молекулярной массой. Впервые проведен сравнительный анализ чувствительности разных методов сенсибилизации морских свинок при определении биологической активности ППД туберкулина (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004). Впервые выявлена статистическая закономерность увеличения вариации кожной реакции ГЗТ при снижении дозы туберкулина как у крупного рогатого скота больного туберкулезом (доза 3250 ME PPD-bovine -32%; 650 ME PPD-bovine -42,69%) так и у морских свинок, сенсибилизированных мико-бактериями туберкулеза бычьего вида (доза 20 ME PPD-bovine - 12,66 %; 2 ME PPD-bovine- 21,55 %).

Практическая значимость работы и пути ее реализации. По результатам исследования для проведения контроля биологической активности производственных серий утверждена эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих -ЗА (письмо ВГНКИ №444/1.3 от 13.03.02). В соответствии с международными требованиями проведено определение биологической активности эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта PPD-bovine. Результаты исследований включены в нормативно-техническую документацию по контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих - СТО 00482909-0001-2004.

Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

1. Результаты изучения биохимических и иммунобиологических характеристик фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных с использованием мембранной технологии.

2. Результаты сравнительных исследований эффективности различных методов сенсибилизации морских свинок микобактериями туберкулеза при определении величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.

3. Результаты исследования по подбору эталонной серии туберкулина очищенного (1111Д) для млекопитающих и стандартизация эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного эталона PPD- bovine.

4. Результаты оценки эффективности применения различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ при определении величины биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.

Апробация результатов работы. Основные положения диссертации доложены на заседании кафедры биотехнологии, фармакологии и вете-ринарно-санитарной экспертизы КГСХА им. профессора И.И.Иванова 15.02.2001; конференции молодых ученых КГСХА им. профессора И.И.Иванова: 10.05.2003, 20.11.2004; на международной научно-практической конференции: «Актуальш проблеми ветеринарно! медицини в умовах сучасного ведения тваринництва» 28.05.2003, Феодосия; международной научно-практической конференции: «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее» 23.09.2004, Щелково.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мясоедов, Юрий Михайлович

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что применение методов мембранной технологии при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих позволяет повысить его специфичность, при этом в препарате достоверно увеличивается доля белковых соединений и снижается содержание липидов и полисахаридов.

2. Показано достоверное различие биохимического состава туберкулиновых препаратов, полученных с использованием мембранного фракционирования по сравнению с туберкулином, изготовленным без применения мембранной технологии. Использование мембран с НОММ от 15 до 1000 К ДА наиболее эффективно, по сравнению с применением мембран с НОММ от 15 до 100 КДА.

3. Определено, что чувствительность внутримышечных методов сенсибилизации морских свинок инактивированными микобактериями достоверно выше (штамм AN-5- 9,84±0,34; штамм 8-88- 12,34±1,9), чем внутри-кожных (штамм AN-5- 7,69±2,4; штамм 8-88- 5,37±0,46).

4. Установлено, что варианты внутримышечной сенсибилизации инактивированными микобактериями (штамм AN-5 и 8-88) и внутрикожной живыми авирулентными микобактериями (штамм BCG-1) позволяют получать стабильные результаты величины биологической активности туберкулина (R=l±0,2)

5. Предложена эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих стандартизированная относительно Первого Международного стандарта PPD-bovine в соответствии с требованиями МЭБ.

6. Показано, что уровень вариации кожных реакций ГЗТ у крупного рогатого скота, больного туберкулезом, и морских свинок, сенсибилизированных М. bovis, при использовании низких доз туберкулина имеет более высокие значения по сравнению с уровнем вариации реакций на высокие дозы.

7. Установлена более низкая вариация туберкулиновых реакций на сенсибилизированных М. bovis морских свинках в сравнении с больным туберкулезом крупным рогатым скотом, что определяет предпочтительность использования морских свинок при определении величины биологической активности туберкулина очищенного (11Г1Д) для млекопитающих.

8. Не установлено достоверных различий в выявляемости больных туберкулезом животных при введении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, как шприцем, так и инъектором в условиях туберкулезного изолятора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработана и утверждена для проведения контроля эталонная серия ППД туберкулина для млекопитающих (письмо ВГНКИ №444/1.3 от 13.03.02). Определена биологическая активность эталонной серии ППД туберкулина для млекопитающих на морских свинках относительно Международного эталона PPD Bovine. Результаты исследований включены в нормативно техническую документацию по контролю ППД туберкулина для млекопитающих (стандарта отрасли)- СТО 00482909-0001-2004.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мясоедов, Юрий Михайлович, Курск

1. Авдиенко, В.Г. Противотуберкулезные IgE- антитела (И часть). Исследование концентрации при формах туберкулеза/ В.Г. Авдиенко, Г.А. Косми-диади, A.B. Баенский// Проблемы туберкулеза.- 2002.-№3.-С.45-48.

2. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние по туберкулезу в РСФСР и меры борьбы с болезнью / В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин// Ветеринария .-1992.

3. Адамбеков, Д.А. Старение, противотуберкулезный иммунитет, иммуно-коррекция: Обзор литературы/ Д.А. Адамбеков, В.Ф. Салов, В.Н. Литвинов // Проблемы туберкулеза.-1993 .-№5 .-С.52-54.

4. Аллахвердиев, И.И. Природные резервуары туберкулеза/ И.И. Аллахвер-диев// Вестник ветеринарии.-1997.-№5.-С.60-62.

5. Андросова, М. В. Иммунологический метод идентификации М. TUBERCULOSIS И M.BOVIS (БЦЖ) на основе применения моноклональных антител/ М. В. Андросова, M.A.Bладимирский, Г.И. Алексеева// Проблемы туберкулеза." 1996,- №1.- С.- 43-46.

6. Архипов, В.В. Активность туберкулина, полученного с применением ионизирующих излучений через 7 лет/ В.В. Архипов, Л. А. Нечаева//Труды Государственного научно контрольного института ветеринарных препаратов. - М., 1972. -Т. XVIII. -С.214-215.

7. Асатиани, В. С. Методы биохимических исследований, В. С. Асатиани. М.: Медицина, 1956.- С. 211-212.

8. Безгин, В.М. Совершенствование промышленной технологии (ИНД) туберкулина и его биохимическая характеристика/ В.М. Безгин: Дисс. канд. биол. наук.- М., 1990.- 134 с.

9. Безгин, В.М. Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота: Дисс. в виде научн. докл. на соиск. уч . степени докт. биол. наук. / В.М. Безгин.-М., 1999.-51 с.

10. Безгин, В. М., Козлов В.Е. Новые технологии производства диагностических препаратов для ветеринарной медицины/ В. М. Безгин, В.Е. Козлов// Ве-теринарна медицина: М1жвщомчий тематичний науковий зб1рник. -XapKiB.2003.- №81.-С.41-45.

11. Бергхов, П. К. Домашние животные болезни и лечение / П.К. Бергхов.-М.: Аквариум, 2001. 95с.

12. Болезни собак.- 3-е изд. / Ф.И. Василевич, В.А. Голубева, Е.П. Данилов и др. М: Колос, 2001.-396 с.

13. Боль, Б.К. Патологоанатомическое вскрытие сельскохозяйственных животных.- 4-е изд./ Б.К. Боль М.: Гос. сельхозиздат, 1953.- 247 с.

14. Бусол, В.А. Применение разных доз туберкулина при исследовании крупного рогатого скота на туберкулез/ В.А. Бусол, А. Ф. Кочмарский, A.A. Ткаченко //Ветеринария. -1991.- №11.-С.21-23.

15. Василенко, К.Ф. Сравнительная оценка альттуберкулина и туберкуло-протеина при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / К.Ф. Василенко, В.Ф. Пылинин // Сборник научных работ. Омск, 1974. Вып.ХХГ -С.-77-81.

16. Вейсфеллер, Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии/ Ю.К. Вейсфеллер// Экспериментально- теоретические исследования.- Будапешт: Изд. Академии наук Венгрии, 1975. -С. 28-43.

17. Вишневский П.П.Туберкулез крупного рогатого скота. // М. - Сельхоз -изд., 1973.-С. 173.

18. Возианов, А.Ф. Цитокины биологические и противоопухолевые свойст-ва/А.Ф. Возианов, А.К. Бутенко, К.П. Зак// Цитокины и их биологическая роль в организме человека.-Киев,1998.-С.9-17.

19. Галактионов, В.Г. Иммунология/ В.Г. Галактионов. М.: РНЦ МДК,2000.-487 с.

20. Галкин, Н.И. Физико химические и биологические свойства туберку-лопротеинов, очищенных гель - фильтрацией: Автореф. дис. канд. биол. Наук/Н.И. Галкин.- М., 1978.- 14 с.

21. Гаскелл, P.M. Справочник по инфекционным болезням собак и кошек/ P.M. Гаскелл, М. Беннет. М.: Аквариум, 1999.- 163 с.

22. ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. М.: Изд.- во стандартов, 1988. - 21с.

23. Грузевский, A.A. Современные данные о роли фотохромогенных мико-бактерий в патологии человека: Обзор литературы/ A.A. Грузевский // Проблемы туберкулеза.- 1999.-№6.-С.58-60.

24. Гусейнов, Г.К. Типовая структура микобактерий туберкулеза и ее связь с эпидемическим процессом и эпизоотией в Дагестане/ Г.К. Гусейнов, A.M. Хома Лемишко, М.А. Муталимов // Проблемы туберкулеза.-2002.-№5.-С. 14-16.

25. Дегтяренко, В.И. Хроматографическое разделение и аллергенная активность пептидов, выделенных из микобактерий туберкулеза штамма Dt/St/ В.И. Дегтяренко, А. Я. Розанов // ЖМЭИ.- 1966.- №11.-С. 29.

26. Диагностика инфекционных болезней животных/ А. А. Петров, В. Е. Симбирцев, М.И. Гертман и др.- Новосибирск, 1993.- С. 38- 42.

27. Додонов, М.М. Экспертиза молока на содержание туберкулезных микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции/М.М. Додонов, Э.А. Федотов, Н.Х. Ягудина и др. // Гигиена и санитария.-2002.-№2.-С.76-77.

28. Досон, Р. Справочник биохимика/ Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир, 1991.- 543 с.

29. Драбкина, Р. Микробиология туберкулеза/ Р. Драбкина.- М.: Государственное изд-во мед. лит., 1963 .-255 с.

30. Евглевский, А. А. Сравнительная оценка синтетических питательных сред, применяемых для изготовления очищенных туберкулинов / A.A. Евг-левский//Труды Государственного научно контрольного института ветеринарных препаратов.- М., 1968,- Т. XV.-C.110-115.

31. Егоров, A.M. Некоторые проблемы химиотерапии туберкулеза с учетом новых данных о его возбудителе/ A.M. Егоров, Ю. О. Сазыкин // Антибиотики и химиотерапия. 2000. -№45.- С. 3-5.

32. Блинов, Н.П. Химия микробных полисахаридов/ Н.П. Блинов.- М.: Высш. Шк. 1984. -С.244.

33. Еремеев, B.B. Взаимодействие макрофаг микобактерия в процессе реакции микроорганизма на туберкулезную инфекцию/ В.В. Еремеев, К.Б.Майоров// Проблемы туберкулеза.-2002.- ЖЗ.-С.54.

34. Ерошенко, JI.A. Оптимизация метода определения активности туберкулина: Дис. канд. вет. наук./ JI.A. Ерошенко.- М., 1997.- С. 137.

35. Зайчик, А. Ш. Основы общей патологии / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов. -СПб.: Элби, 1999-420 с.

36. Иванов, М.М. , Шаров А.Н., Беляев A.C. и др. Стандартизация сухого очищенного туберкулина. / М.М Иванов, А.Н. Шаров, A.C. Беляев и др.-Труды ВГНКИ. 1972.-Т. 18.-С-20-28.

37. Извещение об изменении ТУ 9387-061-0494185-95. Штаммы микобакте-рий туберкулеза бычьего вида №8 и Valle ФГУ ВГНКИ, производственные, от 6.04.2004.

38. Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. Утверждена Главным управлением ветеринарии при Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 10.12.90.

39. Изменение и дополнение к « Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих» утвержденной. Утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 30.12.1995.

40. Изучение протеинового состава и антигенных свойств некоторых видов микобактерий/ П.З. Протченко, A.A. Грузевский, A.B. Филлиповский, Л.Н. Александрова// Реф. Сборник Туберкулез.- 2000. -№6.-С. 5-7.

41. Иммуногенетика инфекционных заболеваний/ М.М. Авербах, А. М. Мороз, A.C. Апт, Б.В. Никоненко.- М.: Медицина, 1985.- С.22-23.

42. Инструкция по изготовлению и контролю сухого очищенного туберкулина (ППД) для млекопитающих. Утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 10.12.1970.

43. Kapp, Я.Н. Макрофаги/Я.Н. Kapp. М.: Медицина, 1978. - 188 с.

44. Кассич, Ю. Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним/ Ю.Я Кас-сич.-Киев: Урожай, 1990.-С.63-65.

45. Козаренко Т.Д. Материалы научно-производственной конференции, тезисы докладов/ Т. Д. Козаренко, H.H. Пугачева, Н. С. Шевырев и др.// Новый метод выделения туберкулопротеина с помощью ионообменных смол.-1967.-С.56.

46. Козлов, В.Е. Оценка активности и специфичности коммерческих серий туберкулина (1111Д) для млекопитающих отечественного и зарубежного производства/ В.Е. Козлов, Н.К. Букова, А.Х. Найманов// Ветеринарная патоло-гия.-2004.- №1-2 (9).- С.-82-85.

47. Колычев, А.М.Туберкулез сельскохозяйственных животных/ А.М. Колычев, Ю.С. Кассич, О.В. Мартма.-М.,1991.-С. 17-18.

48. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов . 15 докл. Серия тех. докладов 254. ВОЗ.- Женева, 1964.

49. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов . 37 докл. Серия тех. докладов 760. ВОЗ.- Женева, 1990.

50. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36 докл. Серия тех. докладов 745. ВОЗ. Женева, 1988.- С. 29-47.

51. Коромыслов, Г.Ф. Биологические свойства ППД туберкулина ВИЭВ полученного из бактериальной массы туберкулезных культур/ Г.Ф. Коромыслов// Бюллетень ВИЭВ. -1977.- Вып. 28.- С. 69- 70.

52. Коротяев, А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология/ А. И. Коротяев, С. А. Бабичев.- СПб. Изд-во Спец. литература, 1998.- С. 438-441.

53. Краснов, В.А. Взаимосвязь эпидемиологии и эпизоотологии туберкулеза в Западной Сибири / В.А.Краснов, Г.С. Мурашкина //Проблемы туберкулеза.-1998.- №5.-С.8-11.

54. Кресс, В.М. Туберкулез в Российской Федерации проблема государственной значимости / В.М. Кресс//Вестник РАМН.-2000.-№12.-С. 19-20.

55. Лазовская, А.Л. Некоторые химические показатели препаратов СОТ, полученного различными методами/ А.Л. Лазовская// Биохимия микробов,-Горький, 1964,- С.349-360.

56. Лазовская, А.Л. Изменение аминокислотного состава синтетической среды при росте микобактерий туберкулеза: Автореф. дис. канд. биол. наук/ А.Л. Лазовская.- Горький, 1962.

57. Лазовская, А.Л. Быстрорастущие микобактерии, вызывающие микобак-териозы у людей/ А.Л. Лазовская, Л.С. Финкельштейн// Проблемы туберку-леза.-1989.- №12.- С. 46-50.

58. Лакин, Г.Ф. Биометрия /Г.Ф.Лакин.- М.: Высшая школа, 1990.-352 с.

59. Леви, Д. Т. Современные препараты туберкулина методы получения, контроля, стандартизации и применения. 03.00.07 Микробиология: Дисс. уч. степ. докт. мед. наук/ Д. Т.Леви.- М., 1987.-291 с.

60. Леви, Д.Т. Оптимизация метода туберкулинодиагностики при использовании препарата ППД- БЦЖ/ Д.Т. Леви, Т.Б. Яблокова, Л.Н. Жукова //Проблемы туберкулеза.-1987.- №12.-С. 5-8.

61. Линникова, М.А. Фракционирование ОСТ путем высаливания с характеристикой химических и биологических свойств его фракций/ М.А. Линникова, Б.А. Лянда-Геллер, О.И. Кичагова // Труды Ленинградского НИИ вакцин и сывороток. 1960. - Т.З. - С.243-261.

62. Литвинов, В.И. Антигены микобактерий туберкулеза/ В.И. Литвинов, Б.Ш. Гильбурд, Л.Н. Черноусова// Проблемы туберкулеза.- 1989.-№10.-С.68-72.

63. Луницын, В.Г. Туберкулез пятнистых оленей/ В.Г. Луницын// Ветеринария.- 1991.-№10.- С. 33-38.

64. Лысенко, А.П. Результаты испытания ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 5000 ТЕ/ А.П. Лысенко, М.М. Григорьев, Г.А. Объедков // Вет. наука производству.- 1988. -Вып. 33.- С.-47-50.

65. Лысенко, А. П. Иммунохимический анализ хроматографических фракций М. BOVIS и М. TUBERCULOSIS/ А. П. Лысенко//Ветеринария.- 1987. -№12.-С.- 32-36.

66. Лысенко, А.П. Антигенный состав ППД туберкулинов для млекопитающих / А.П. Лысенко //Ветеринария.- 1989.- №5.-С.-30-32.

67. Лысенко, А. П. Распространение микобактерий в благополучных по туберкулезу хозяйствах/ А. П. Лысенко, А.Э. Высоцкий, И.И. Румачик //Ветеринария.-2003.- №5.- С. 19-21.

68. Лянда Геллер, Б.А. Получение высокоактивной фракции очищенного сухого туберкулина и ее биохимическая характеристика/ Б.А. Лянда - Геллер// Проблемы туберкулеза.-1963.-С. 67- 72.

69. Лященко К.П. Иммунологическая характеристика моноклональных антител к Mycobacterium bovis и 4 аффинно очищенных микобактериальных антигенов/ К.П. Лященко, С.А. Бобровник, Е.В.Горбенко и др.// Проблемы туберкулеза.- 1993 .-№5.-С.41-44.

70. Малахов, А. Г. Биохимический полиморфизм туберкулопротеинов, полученных различными способами/ А. Г. Малахов, Г.И. Устинова// Важнейшие исследования по изучению заболеваний сельскохозяйственных животных// Сб. трудов MBA.- М., 1973.-С.8-9.

71. Маянский, А.Н. Туберкулез (микробиологические и иммунопатогенети-ческие аспекты) / А.Н. Маянский // Иммунология.- 2001.-№2.-С.53-63.

72. Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского, O.K. Поздее-ва.-М.: Гэотар Медицина, 1998.- С. 499-503.

73. Митинская, Л.А. Туберкулодиагностика/ J1.A. Митинская // Проблемы туберкулеза.- 1998.-№3.-С.76-77.

74. Модель, JI.M. Биология туберкулезных микобактерий и иммунология туберкулеза/ Л. М. Модель.- М.: Медицина, 1958. 191 с.

75. Наставление по диагностике туберкулеза животных/ Министерство сельского хозяйства Российской Федерации. Департамент ветеринарии. М., 2002.-63 с.

76. Найманов А.Х. Дифференциация аллергических реакций на туберкулин / А.Х. Найманов // Ветеринария ,-2002.-№3.-С.10-13.

77. Найманов, А.Х. Совершенствование аллергической диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. вет. наук / А.Х. Найманов.- М., 1981. -16с.

78. Найманов, А.Х. Определение у-интерферона для диагностики туберкулеза/ А.Х. Найманов, O.A. Верховский, О.А.Савицкая, Н.П. Овдиенко, Ю.Н.Федоров // Ветеринария.-2004-№6.-С. 19-22.

79. Непоклонов, Е.А. На рубеже реформ / Е.А. Непоклонов // Ветеринарная газета.-2003.-№9.-С.2.

80. Нечаева, Л.А. Испытание туберкулиновых препаратов, изготовленных с применением ионизирующих излучений: Автореф. дис. кан. биол. наук.- Казань, 1975. -21с.

81. Новак, Д.Д. Туберкулинизация крупного рогатого скота безыгольным инъектором/ Д.Д. Новак, Н.В. Душенин, Б. В. Смоляров, В. Т. Рогачев// Ветеринария.- 1974.-№5. С. 58- 60.

82. Нуратинов, P.A. Способность нокардий сенсибилизировать животных к туберкулину (экспериментальное заражение кроликов микобактериями и но-кардиями музейных штаммов)/ Р.А.Нуратинов, М.Н. Магомедов// Ветеринария.» 1996.-№5. С. 27-30.

83. Нуратинов, P.A. Изучение сенсибилизирующих к туберкулину свойств нокардий и родококков/ P.A. Нуратинов, М.О. Баратов, И.В. Эфендиева // Ветеринария. 2001.- №11.- С.23-27.

84. Нуратинов, P.A. Кислотоустойчивые микроорганизмы- микобактерии, нокардии, родококки: химический состав, биологические свойства, антигенная структура/ Р.А.Нуратинов, М.О. Ургуев, М.О Баратов// Проблемы туберкулеза. -2001.-№5.-С.54-57.

85. Осипова, Е. П. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации микобактерий и ее диагностическая значимость при туберкулезе крупного рогатого скота: Автореф. дисс. кан. вет. наук/ Е.П. Осипова -М., 2004.-21 с.

86. Остерман, JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот /Л.А.Остерман.- М.: Наука, 1985.- 535 с.

87. Очищенный туберкулин.//Европейская Фармакопея.-1971.-Т.2.-С. 406409.

88. Получение невыпаренного безбелкового туберкулина и его диагностические свойства/ Евглевский A.A., Беляев А. С., Алехин В. А. и др. Сб. науч. работ/ Сибирский научно- исслед. ветер, ин-т.- Омск, 1974.- Т. 21.- С. 82-85.

89. Романенко, В. Ф. Характеристика адаптированных к организму птицы М. Tuberculosis и М. Bovis/ В. Ф.Романенко, П. И. Вербицкий, A.M. Дяченко // Ветеринария. 2002. - №8.-С.24- 26.

90. Ротов, В.И. Туберкулез сельскохозяйственных животных/ В.И. Ротов, П.Н. Кокуричев, П.Е. Савченко,-Киев: Урожай, 1973.- 175 с.

91. Савицкая O.A. Диагностическое значение реакций клеточного иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота/ O.A. Савицкая. Автореф. дисс. канд. вет. наук.- Москва.-2004.- 24 с.

92. Сахно, В.М. Иммуногенез и выраженность аллергических реакций при туберкулезе/В.М. Сахно// Вестник ветеринарии.- 1988.-№8.-С.46-51.

93. Сахно, JI.B. Участие оксида азота в развитии туберкулиновой анергии у больных туберкулезом легких/ JI.B. Сахно, H.A. Хонина, О.В. Норкина// Проблемы туберкулеза.- 2001.- №8.-С.42- 46.

94. Свиридов, В.Д. Бактериемия и иммунологические реакции у животных инфицированных микобактериями птичьего вида/ В.Д. Свиридов // Ветеринария.- 1983.- № 4. -С. 26-27.

95. Серов, В.В. Заболевания, вызываемые палочками семейства Mycobacteri-асеае/ Под ред. В.В. Серова, B.C. Паукова// Воспаление: руководство для врачей.-М.: Медицина, 1995.-С.388-391.

96. Смолянинов, Ю.И. Экономический ущерб от туберкулеза крупного рогатого скота в России / Ю.И. Смолянинов, A.C. Донченко, С.Ю. Смолянинов, В.Ф. Бордюг, H.H. Кощеев // Ветеринарный консультант.- 2005.-№1. С.3-5.

97. Способ получения туберкулина. Патент РФ №2113233. 1997. / В.Е. Козлов, J1. Д. Ничвеева, Н.Т. Гречкина, Н.С. Шевырев, H.A. Азарова, А.Н. Шаров, В. М. Безгин, E.H. Солодов, Н.К. Букова.

98. Труфанов, В. А. Изучения химического строения и аллергенных свойств туберкулиноактивных пептидов/ В. А. Труфанов/ Автореферат канд. хим. наук. -М., 1971.-18 с.

99. Физико- химические методы контроля ингредиентов питательных сред и биопрепаратов.- М.: Медицина, 1970.- 140 с.

100. Фрадкин, В.А. Диагностические и лечебные аллергены/ В.А. Фрадкин// М.: Медицина, 1990.-С.-52-53.

101. Шамахмудов, Ш.Ш. Фотометрическое определение количества сахара в крови методом Хагедорна- Иенсена / Ш.Ш. Шамахмудов // Лабораторное дело.- 1966.- №1.-С.16-17.

102. Шаров, А.Н. Дифференциация специфических и неспецифических реакций на туберкулин/ А.Н. Шаров// Материалы научно производственной конференции: Тез. докл.- М., 1967.-С.52-53.

103. Ш.Шаров, А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение ее эффективности: Автореф. дисс. докт. вет. наук / А.Н. Шаров.- М., 1989.- 37с.

104. Шаров, А. Н. Параллергичекие реакции на туберкулин у крупного рогатого скота/ А.Н. Шаров, М.М. Иванов// Труды ГНКИ ветеринарных препаратов.-М, 1969.- Т. XVI.- С.159-166.

105. Шаров, А.Н. Сенсибилизирующие и аллергенные свойства атипичных кислотоустойчивых микобактерий/ А.Н. Шаров // Труды ГНКИ ветеринарных препаратов.- М.,196$.-Т XVI.-C.-153- 158.

106. Шевырев, Н.С. Введение в ветеринарную иммунологию/ Н.С. Шевырев.-Курск: КГСХА, 1999.- С. 139 140.

107. Шевырев, Н.С. Биологическая и химическая характеристика и стандартизация туберкулинов, изготовленных различными способами/ Н.С. Шевырев: Дисс. кан. вет. наук. Курск- Москва, 1971.- 126 с.

108. Шишков, В.П. Туберкулез сельскохозяйственных животных/ В.П. Шишков, В.П. Урбан.-М.: Агропромиздат, 1991.-С.-89-90.

109. Ярилин, А.А. Основы иммунологии/ А.А. Ярилин.- М: Медицина, 1999.-С. 495.1. Иностранная литература

110. Al-Attiyah, R. Synthetic peptides identify promiscuous human Thl cell epitopes of the secreted mycobacterial antigen МРВ70/ R. Al-Attiyah, F.A. Shaban, H.G. Wiker//Infect Immun. -2003 Apr.-71(4).- P.-1953-1960.

111. Amadori, M. Use of recombinant proteins in antibody tests for tuberculosis/ M. Amadori, K. P. Lyaschenko, M. L. Gennaro // Vet.Microbiol.-2002.-85.- S.-379-389.

112. Antas, P.R. kinetics of T cell-activation molecules in response to Mycobacterium tuberculosis antigens / Antas P.R., Oliveira E.B., Milagres A.S., Franken K.C., Ottenhoff T.H.// Men Inst Oswaldo Cruz.-2002 Dec.-vol- 97.-P-1097-1099.

113. Augier? J.Un. PPD Hautement purified le PPD JP71/ J. Augier, V. Lopault, C.Gliange // Ann. Immunol. Inst. Pasteur.-1974.- Vol.125.- P.675-685.

114. Barnes, P. Tuberculosis: Pathogenesis, Protection, and Control / P. Barnes, R.L. Modlin, J.J. Ellner // Ed. B. Bloom.- Washington.- 1994.- P.417-435.

115. Bentson, M.W. Standartization of new batch of purified tuberculin intended of international use/ M,W. Bentson, M.A. Bleiker, W.A. Griep// Bull. Wld.Hlth.Org.-1958. v. 19.-P. 845-951.

116. Biological Substances International Standards, Reference Preparations and Reference Reagents. WHO. Geneva, 1982. -S. - 36-39.

117. Campos-Neto, A. Evaluation of DPPD, a single recombinant Mycobacterium tuberculosis protein as an alternative antigen for the Mantoux test/ A. Campos-Neto, V. Rodrigues-Junior, D.B. Pedral-Sampaio //Tuberculosis (Edinb). -2001.81. (5-6).-P.353-358.

118. Chambers, M.A. Simple objective measurement of the cutaneous delayed-type hypersensitivity reaction to tuberculin using spectrophotometry / M.A. Chambers, K. Jahans, A. Whelan //Skin Res Technol. -2002. May- 8 (2). -S.89-93.

119. Clausen, J.E. Tuberculin-induced migration inhibition of human perepheral leucocytes in agarose medium / J.E. Clausen // Acta Allergol. 1971. - v. 26. - P. 56-80.

120. Clausen, J.E. The agarose migration inhibition technique for in vitro demonicstration of cell mediated immunity in man / J.E. Clausen // Danish. Med. Bull. -1975.-v. 22.-P. 181-194.

121. Daniel, T.M.// Amer. rev. resp. dis.- 1975.- vol.111.- P.787-794.

122. Daniel, T.M. Immunoelectrophoresis of Mycobacterium tuberculosis antigens. ^ Comparative analysis of cell extract and culture filtrate antigens/ T.M. Daniel,

123. R.C.Good, B. W. Janicki // Amer. rev. resp. diss.- 1975.- Vol. 112.-P.639- 644. 0 137. Daniel, T.M. Immunological analisis of a major antigen of Mycobacterium szulgai/ T.M. Daniel, R.W. Dc Muth // Infect. Dis.- 1977.-Vol.135.- P.778-786.

124. Daniel, T. M. Mycobacterial antigens: a review of their isolation, chemistry and immunological properties/ T. M. Daniel, B.W. Janicki // Microbiol. Rev. -1978.-Vol.42.-P.84-113.

125. Dreyer, G. Pricipitin method for the standartization of "old" tuberculin and the expression of resalt in standard unit/ G. Dreyer, R. A. Wollum// Lancet. - 1924.v. -P. 1003.

126. European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002. Council of Europe Strasbourg. -£ P.2088-2089.

127. Fang, F. C. Clin. Jnvest. 1997.- Vol 99, -№12. -P. 2818-2825.

128. Fortune, S. M. Mycobacterium tuberculosis macrophage responses to IFN- y through myeloid differentiation factor 88-dependent and-independent mechanisms/ Fortune S. M., Solache A., Jaeger A., et al. //J. Immunol.- 2004.-Vol.-172, №10. S.-6272-6280.

129. Gamier, T. The complete genome sequence of Mycobacterium bovis/ T. Garnier, K. Eiglmeier, J.C. Camus // Proc. Natl. Acad Sci U S A.-2003 Jun 24.-100# (13). P.-7877-7882.

130. Glenchur, H. Tuberculin activity of mycobacterial fractions obtained by chromatography/ H. Glenchur, R.E. Bürge, S.Fromas // Appl. Environ Microbiol.-1973.-Vol.25.-P. 5-10.

131. Gruner, J. Rinder der krankenheiten/ J. Gruner.-Stuttgart, 1992.- S.257-259.

132. Harboe, M. Antigens of PPD, old tuberculin, and autoclaved Mycobacterium bovis BCG studied by crossed Immunoelectrophoresis/ M. Harboe // Amer. Rev. resp. Dis.-1981 .-Vol. 124.-P.80-87.

133. Hattikudur S. Characterisation of target antigen of cell-mediated immunity in Mycobacterium tuberculosis H37Rv/ S. Hattikudur, R.S. Kamat // Med. Micro-biol.-1984.-Vol. 18. P. 17-25.

134. Holm J., Lind P. Standartization of tuberculin/ J. Holm, P. Lind// Publ. hlth. rep.- 1947.-v.62.-№6.-P. 188-201.

135. Hussain, R. Immune response profile in patients with active tuberculosis in a BCG vaccinated area/ R. Hussain, Z. Toossi, R. Hasan// Southeast Asian J. trop. med. public, health.- 1997.- Dec;28 (4). S.764-73.

136. Kaufmann, S.H. gamma/delta and other unconventional T lymphocytes: what do they see and what do they do?/ S.H. Kaufmann // Proc. natl. acad. sei. USA.-1996.-Vol.93.- P.2272-2279.

137. Kobayashi, K. Nucleotide sequence of MPB63 gene in Mycobacterium bovis BCG Tokyo/ K. Kobayashi, K. Kamiie, A.Kobayashi // Basic microbiol. -2003.-43 (3).- P.-249-254.

138. Koch, R. Weitere Mitteilung ueber das Tuberkulin/ R. Koch // Dtsch med. Wsch.-1891.- 17.- P. 1189-1192.

139. Kuwabara S. Amino acid sequence of tuberculin active protein from Mycobacterium tuberculosis/ S. Kuwabara // Biological chemistry.-1975.- Vol.250. -№7 -P.2563-2568.

140. Landi S. Physiochemical and biological studies on various preparation of tuberculin purified protein derivative/ S. Landi, H.R. Held// Appl. microbiol. -1965.-Vol.l3.-P.132-139.

141. Long, E. Standartization of tuberculin: assey on the basis of the spermocyte reaction/ E. Long // J. inf. dis. 1925. - v. 37. - P. 368 - 375.

142. Lowrie, D. How macrophages kill tubercle bacilli. / D, Lowrie // Med.Microb. 1983. -v. 16.-№1.-P. 1-12.

143. Manca C. Molecular cloning, purification, and serological characterization of MPT 63, a novel secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis/ C. Manca, Lyashchenco K., Wiker H.G., et al. //Infect. Immunol.-1997 (65). S.-16-23.

144. Mateos Colino, A. Tuberculous epididymitis caused by Mycobacterium bovis/ A. Mateos Colino, M.A. Sousa Escandon, R. Golpe Gomez //Arch Esp Urol.-2003.- Mar.-56 (2). P.-175-178.

145. Matsuyama, W. Purified protein derivative of tuberculin up regulates the expression of vascular endothelial growth factor in T lymphocytes in vitro/ W. Ma-tsuyama, R.Kubota, T. Hashiguchi // Immunology.- 2002 May.-106 (1). -S.96-101.

146. Mombaerts, P. Different roles of alpha beta and gamma delta T cells in immunity against an intracellular bacterial pathogen/ P. Mombaerts, J. Amoldi, F.Russ. // Nature. 1993.- Vol.365.- P.53-56.

147. Moulton, R.G. Isolation of spesific and nonspesific components from purified protein derivative / R.G. Moulton, T.M. Dletz, S. Marcus // Amer. Rev. resp. dis.-1972.- Vol.l06.-P.213-218.

148. Mufituoglu, A.U. Cytology of tuberculin reaction / A.U. Muftuoglu , N. Ak-man, I. Basar //Acta haematologica.- 1971. v. 42. - № 2. - P. 121-128.

149. Nagai, S. Tuberculin peptide from culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis/ S. Nagai, T. Nagasuga, J. Matsumoto //Amer. rev. resp. dis.- 1980.-Vol.l21.-P.551-557.

150. Office International des Epizooties (OIE) Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. -2004.- S. 359-369.

151. Pollock, J. M. Specific Delayed-Type Hypersensitivity Responses to ESAT-6 Identify Tuberculosis-Infected Cattle/ J. M. Pollock., J. McNair, H. Bassett// Clin Microbiol.- 2003. May.- 41 (5).- S.1856-1860.

152. Reich, M. Isolation and partial characterization of the most immunologically reactive antigen from Mycobacterium tuberculosis H37Ra culture filtrate/ M. Reich, L.F. Affronti, G.L. Wright // Tubercle. -1982 Jun.-63 (2).- P.99-106.

153. Riley, R.L. Aerial dissemination of pulmonary tuberculosis. A two-year study of contagion in a tuberculosis ward. 1959/ R.L.Riley, C.C.Mills, W. Nyka // Am. j. epidemiol.- 1995.-Vol.142.- P.3-14.

154. Romain, F. Preparation of tuberculin antigen L/ F.Romain, E. Versmisse, P. Pescher// Ann instPasteurmicrobiol.- 1985.- Sep-Oct; 136B (2).- S.235-248

155. Römer, P., Joseph K. Zur Verwertung der intrakutanen Reaktion auf tuberculin/ P. Römer, K. Joseph // Beitr. Klin. Tuberk. -1909. 14. - P. 1-35.

156. Sannders, B.M./ T cell-derived tumor necrosis factor is essential, but not sufficient, for protection against Mycobacterium tuberculosis infection// Sannders B.M., Briscoe H., Britton W.J.// Clin, and exp. jmmunol.-2004.- vol- 137. №2. S.-297-289.1. V

157. Savdra, J. Synthesis and Biological Assays of Peptides from a Tuberculin-Active Protein / J. Savdra // Infection and immunity, June. -1983.- Vol.40.- №3.-P.l 163-1169.

158. Seibert, F. B. The isolation of crystalline protein with tuberculin activity/ F. Seibert// Science.-1926.-v.63 .-P.619-620.

159. Seibert, F. B. Purified protein derivative/ F. Seibert, J.D. Aronson, J. Reichel// Amer.rev.tuberc.-1934.-v.30-P.705-712.

160. Seibert, F. Purified protein derivative, its isolation from old tuberculin and fractionation of residue/ F. Seibert, E. Du Four // Amer. rev. tuberc.-1940.-Vol.41,-P.57.

161. Seibert, F. B. History of the development of purified protein derivative tuberculin/ F. Seibert//Amer.rev.tuber.-1941.-№ l.-P. 1-8.

162. Seibert, F.B. Tuberculin purified protein derivtive: Preparation and analisis of a large quantity for standard/ F.B.Seibert, J. T.Glen// Amer. rev. tuberc.-1941.-Vol.44.-P.9-25.

163. Seibert, F.B. Progressin the chemistry of tuberculin/ F.B. Seibert// Schweizerische Zeitschrift fur Tuberculose. Supplement. (Bibliotheca Tuberculosea). -1950.- fasc 3. III. Forttschritte der tuberculoseforschung, S. -1-29.

164. Seibert, F.B. Constituents of mycobacteria/ F.B. Seibert// Annal. Review if microbiology. 1950. - v. 4. P.-35-52.

165. Schlesinger, L.S. Role of mononuclear phagocytes in M tuberculosis pathogenesis/L.S. Schlesinger // J. invest. Med.-1996.-Vol.44. P.312- 323.

166. Schleisinger, L. S. Entry of Mycobacterium tuberculosis into mononuclear phagocytes/ L.S. Schlesinger// Curr. top. mycrobiol. immunol.- 1996.-Vol. 215.-P.71-96.

167. Schleisinger, L. S., Hull S., Kaufman T.// Ibid.-1994.- Vol. 152.- P.4070-4079.

168. Singh, S.D. Tuberculin-induced lymphocyte proliferation in whole blood: an antigen specific method for assessing immunosuppressive agents/ S.D. Singh, C.G. Booth// Immunol methods.- 2002.-- Feb- 1;260 (1-2) P.-149-156.

169. Skinner, M. Cytotoxic T-cell responses to Mycobacterium bovis during experimental infection of cattle with bovine tuberculosis/ M.A. Skinner, N. Parlane, A. McCarthy // Immunology.-2003.- Oct.-l 10 (2).- P.234-241.

170. S0rensen, A. L. Purrification and characterization of a low molecular mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis/ A. L. S0rensen, S. Nagai, G. Houen.//Infect. Immun.- 1995. -63.-S. 1710-1717.

171. Southey, A. Detection of Mycobacterium bovis infection and production of interleukin-2 by in vitro stimulation of badger lymphocytes/ Southey, A, Costello E, Gormley, E// Vet immunol immunopathol.- 2002.- Aug.-87-(l-2) P.-73-78.

172. Stavri, D. Mycobacterium tuberculosis tuberculin devoid of BCG Common Antigens/ D.Stavri, H. Stavri, J. Claicin// Zbl. bakt. hyg. Abt.Orig. -1982. Vol. 251.- S.399-401.

173. Stottmeier K.D. Purified protoplasmic peptides of mycobacteria: chemical composition of a tuberculin- active glycopeptide/ K.D.Stottmeier, R. E. Beam, H.L. David //Bact.-1971.- Vol.105.- P.172-175.

174. Takatsu, K. The immunogenic peptide for Thl development/ K. Takatsu, A.Kariyonell Int immunopharmacol.-2003 Jun-3 (6). P.-783-800.

175. Takuhashi, J. The behaviour of three different kinds of antibodis in tuberculosis: antiprotein, antipolysaccharide and antiphosphatide / J.Takuhashi, G. Omod-era, K. Jamamoto // Jornal of experimental medicine.-1961.-№114,- P.-555-567.

176. The Merck Veterinary Manual. / Merck & co., Jnc. Rahway, N.J. Sixth edition U.S.A, 1986.-S.401.

177. Thole, J.E, Cloning of Mycobacterium bovis BCG DNA and expression of antigens in Escherichia coli/ J.E. Thole, H.G. Dauwerse, P.K Das //Infect, and immun.- 1985.- Vol. 50.- P.800-806.

178. Toida I. Lack of Tuberculin Activity of Synthetic Peptides/1. Toida, S. Ya-mamoto, S. Takuma et al. // Infection and immunity.- 1985 Dec.-№3. -Vol.50.-P.614-619.

179. Varela, E. Isolation of a 19-kDa mycobacterium, bovis-specific antigen, different from MPB70/80, by chromatofocusing/ Varela E, Masso F, Paez A// Prep biochem biotechnol. -2002 Nov-32 (4).-P.-329-340.

180. Waters, W.R. Expression of L-Selectin (CD62L), CD44, and CD25 on activated bovine T cells/ W.R. Waters, T.E. Rahner, M.V. Palmer // Infect immun. -2003.- Jan.-71 (1).- P.317-326.

181. Wilson, M. Bacterial perturbation of cytokine networks/ M. Wilson, R Seymour, B. Henderson// Infect, and Immun. -1998.-vol.66.-P.2401-2409.

182. World Health Organization.ECBS.16 report. // Technical report series № - S. 259.- 1963.

183. World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization. Thirty- second Report. Technical Report Series 673. World Health Organization, Geneva. 1982. - S. 22-23.