Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Безгин, Вячеслав Михайлович, Москва



/1Л П / *> / / А

С*/ п /• / Д ««г— / /

' ' / 1Л . с^'

Государственная Курская биофабрика'

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко у

у /¿? ■ ^ : Щ/У^

1 ' На правах рукописи

/^^ИЕигзгин Вячеслав Михайлович

, / ^

Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота

03.00.04 - биохимия

03.00.23 - биотехнология

Диссертация.. в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук.

Москва -1999

Работа выполнена на Государственной Курской биофабрике, во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко

Официальные оппоненты:

- доктор биологически наук, профессор Кармолиев Р.Х. (МГАВМиБ им К.И. Скрябина)

- доктор ветеринарных наук

Гулюкин М.И. (ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко)

- доктор ветеринарных наук

Белоусов В.И. (Департамент ветеринарии МСХ иП РФ)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Защита диссертации состоится «¿8» 1999 г. часов

на заседании диссертационного совета Д020.28.1Й при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ)

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко

Диссертация в виде научного доклада разослана »««.,„.

ГОСУдарственная » млр>/У>01999г. БИБЛИОТЕКА

а 1

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ^

40 0 0 Н

¡<(\/ /V О" '

Г. А. Трондина

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. В структуре инфекционных болезней животных туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота по своему социальному и экономическому значению занимают особое место. Значительный ущерб эти заболевания наносят скотоводству в связи с большой чувствительностью животных к этим болезням и длительностью эксплуатации.

Эффективность противоэпизоотических и профилактических мероприятий при туберкулезе и лейкозе крупного рогатого скота в значительной степени зависит от своевременной постановки диагноза и удаления больных животных из оздоравливаемых стад, так как они являются основным источником возбудителей болезней (В.Е. Щуревский, 1980; Н.П. Овдиенко, В.А. Шаров« Э.С. Плотников, 1982; В.А. Бусол, М.И. Гулюкин, 1988; П.Н. Смирнов и др., 1998).

Во всех странах, где регистрируют туберкулез, эффективность диагностики обеспечивается применением аллергического метода с использованием специфического биопрепарата - туберкулина. В диагностике лейкоза крупного рогатого скота широко применяют реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (РИД), которая принята в качестве основного диагностического теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными животными, спермой, эмбрионами, а также при проведении оздоровительных мероприятий (М. Шваних, 1996; А.Н. Шаров, B.C. Тырина, JI.A. Ерощенко, Й.С. Шевырев и др., 1996; В.П. Шишков, Л.Г. Бурба, А.Ф. Валихов, 1988,1996).

Одним из ведущих биопредприятий, производящих препараты диагно--—-"кого профиля, является Государственная Курская биофабрика, производ-\ч мощности которой позволяют ежегодно выпускать около 400 млн. доз 'атов для диагностики лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота. , ,ует отметить, что на изготовителе диагностикумов туберкулеза и лейкоза -их огромная ответственность за их качество, так как по данным Департа-:;та ветеринарии Минсельхозпрода РФ туберкулез и лейкоз крупного рогато-~ ешта последние годы занимают ведущее место в структуре инфекционной

патологии животных (В.М. Авилов, В.М. Нахмансон, 1995; В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин, Н.П. Овдиенко, В.А. Ведерников, 1997).

Сложность биологическйх систем, применяемых в биотехнологических производствах, заключается в многостадийности технологий, а также необходимости оптимизации и строгой организации производственных процессов.

Поэтому совершенствование промышленной технологии изготовления препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также решение проблемы охраны окружающей среды при их производстве остаются актуальными (В.П. Шишков, Г.Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба, 1991; В.И. Литвинов, A.M. Моррз, В.Я. Гергерт, 1996).

Цель работы.- Целью наших исследований было разработать научные и практические основы промышленного производства новых и усовершенствования существующих технологий получения препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота*

Основные задачи исследований.

1. Разработать типовую промышленную технологию изготовления туберкулина ППД (protein purified derivative) для млекопитающих в стандартном разведении.

2. Разработать научно обоснованный способ производства качественно нового,, стандартизированного ло молекулярной.массе, туберкулиНас использованием ультрафильтрации.

3. Изучить зависимость качества туберкулина ПГ1Д для млекопитающих от производственных штаммов, используемых в его получении.

4. Оптимизировать условия культивирования микобактерий туберкулеза бычьего вида при промышленном производстве туберкулинов.

5. Изучить процесс электродиализного обессоливания растворов туберкулина и внедрить в производство промышленную технологию.....

6. Разработать промышленную технологию приготовления сублимированной питательной среды для ускоренного выделения микобактерий туберку^ леза из биоматериала животных.

7. Разработать технологию промышленного изготовления сублимированного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) для РИД.

8. Разработать промышленную технологию культивирования клеток почки эмбриона овцы (ПЭО), хронически инфицированных вирусом лейкоза, в промышленных ферментерах и выделения антигена вируса лейкоза с использованием процессов ультрафильтрации.

9. Разработать нормативную документацию на изготовление туберкули-нов ППД для млекопитающих и наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

10. Представить экологическую характеристику разработанных технологий производства диагностикумов.

Научная новизна. Впервые разработана промышленная технология производства:

- туберкулина ППД в стандартном разведении (патент № 2031656 «Способ получения туберкулина», 1992 г.);

- туберкулина ППД для млекопитающих с использованием методов ультрафильтрации (патент № 2045959 «Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения», 1992 г. и патент № 2035914 «Способ получения туберкулина», 1993 г.);

- наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии (патент № 2020960 « Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота», 1992 г.);

- питательной среды для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из биоматериала животных (ФАСТ-ЗЛ).

Впервые изучен процесс электродиализного обессоливания растворов туберкулина и разработана его промышленная технология (патент №2031656 «Способ получения туберкулина», 1992 г.), позволяющая существенно интенсифицировать процесс изготовления диагностикума.

Изучены иммунобиологические свойства ППД туберкулинов для млекопитающих в едином разведении и разработана технология стабилизации растворов туберкулина.

Разработана методика концентрирования и стандартизации туберкуло-протеина по молекулярной массе и дана иммунобиологическая характеристика препарата.

Изучено влияние производственных штаммов М. bovis и М. tubereulosis на качественные характеристики туберкулина ППД для млекопитающих. Показана высокая специфичность и активность моноштаммного препарата.

и гг Ангмтыл I „

Разработана технология выделения и концентрирования вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы определена действующими Нормативно-техническими документами (НТД) на технологию изготовления (технологические инструкции) и контроль (технические условия, государственный стандарт), рассмотренными и утвержденными в установленном порядке.

Результаты исследований включены в:

«Инструкцию по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденную Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 30.12.85 г;

- «Временную инструкцию по изготовлению и контролю набора для серологической диагностики лейкоза КРС в РИД», утвержденную Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 25.05.87 г;

- ГОСТ 16739-88 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих»;

- Технические условия 10-19-442-87 «Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота»;

- Технические условия 46-21-902-85 «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих»;

- «Инструкцию по изготовлению аллергена сухого очищенного комплексного из атипичных микобактерий (KAM)», утвержденную директором ВГНКИ ветпрепаратов 02.10.93 г.;

- Дополнения и изменения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 02.10.87 г.;

- Изменения и дополнения к «Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного ППД для млекопитающих», утвержденные ГУВ при Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию 04.04.90 г. и 10.12.90 г.;

- «Инструкцию по изготовлению среды питательной ФАСТ-ЗЛ», утвержденную директором Государственной Курской биофабрики и директором ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных 12.04.96 г. и 16.04.96.;

- Технические условия 9385-106-00494185-96 «Среда питательная ФАСТ-ЗЛ».

Освоено серийное промышленное производство диагностикумов и питательной среды на Государственной Курской биофабрике. По разработанным технологиям произведено 3591 млн. доз туберкулина, 223,3 млн. доз наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, 70,8 тыс. доз питательной среды ФАСТ-ЗЛ для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из биоматериала от животных.

Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:

- секции «Эпизоотология и профилактика инфекционных болезней животных», Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ, 1987 г., г. Курск;

- заседании Ученого Совета ВИЭВ, 1990 г.;

- заседании рабочей группы по вопросам туберкулеза и бруцеллеза Отделения ветеринарной медицины ВАСХНИЛ, 1991, г. Москва;

- Международном экологическом форуме «Современные экологические проблемы провинции», 1995 г., г. Курск;

- 5-й Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», 1996 г., г. Москва;

- Всероссийской научно-производственной конференции «К 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России», 1996 г., г. Курск;

- Всероссийской 'научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозом сельскохозяйственных животных и птиц» 1997 г., г. Москва;

- заседаниях Научно-технического Совета Государственной Курской биофабрики, 1990-1998 гг.;

- научной сессии Российской Академии сельскохозяйственных наук «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России», 1998 г., г. Москва.

Публикации результатов исследований. Основные положения и выводы отражены в восьми нормативно-технических документах* утвержденных ГУ В МСХ СССР (Госагропрома СССР, Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию), а также в 31 научной статье и сообщениях, пяти патентах на изобретения и 12 рационализаторских предложениях.

Основные положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся:

- материалы разработки промышленной технологии изготовления ту-беркулинов;

- результаты усовершенствования существующей технологии промышленного изготовления и разработки экологически безопасной технологии изготовления ППД туберкулина;

- оптимальные условия электродиализа растворов туберкулина;

- основные материалы разработки промышленной технологии изготовления наборов для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии;

- технология получения питательной среды для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала.

Объем и структура доклада. Научный доклад изложен на 51 странице машинописи, содержит 11 таблиц и рисунков включает следующие разделы: общая характеристика работы; материалы и методы исследований; результаты собственных, исследований; выводы и практические предложения; список опубликованных работ, в которых отражены основные материалы научного доклада.

Материалы и методыиссл«дования

Работа выполнена в 1981-1998 гг. в научно-производственных подразделениях Государственной Курской биофабрики и в лаборатории молекулярной биологии и биохимий ВИЭВ в соответствии с тематическими планами:

-ВИЭВ, по Государственной научно-технической программе 0.69.05 «Разработать и внедрить систему государственных мероприятий по эффективной профилактике, лечению и снижению заболеваемости депрессиями кроветворения и лейкозами человека и сельскохозяйственных животных и птиц», заявкой МСХ СССР от 15 июня 1984 года на разработку и освоение продукции «Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота»,

- ВГНКИ ветпрепаратов, по заданию 02.06.07 М «Провести испытания туберкулина, изготовленного с применением мембранной технологии, разработать НТД» (1991 г.) и согласно постановления ГКНТ №179 от 03.05.79 г. «Отобрать и стандартизировать эффективные штаммы для производства жидких очищенных туберкулинов. Разработать количественные методы контроля этих препаратов»;

- ежегодными планами НИР и ОКР Государственной Курской биофабрики.

В работе использовали следующие штаммы микобактерий и клеточные культуры: 1 ■

- штамм Mycobacterium bovis «Valle»; штамм Mycobacterium bovis «8»; штамм Mycobacterium bovis «14»; штамм Mycobacterium tuberculosis «192»; штамм Mycobacterium tuberculosis «ДТ/СТ»;

- перевиваемую линию клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированных вирусом лейкоза КРС.

За основу при изготовлении опытных серий туберкулинов ППД были взяты: «Инструкция по изготовлению и контролю сухого очищенного туберкулина (ППД) для млекопитающих», утвержденная Главветупром МСХ СССР 10.12.1970 г., «Инструкция по изготовлению и контролю сухого очищенного (ППД) туберкулина для млекопитающих», утвержденная Главветупром МСХ СССР 30.12.85 г.

Контроль опытных, опытно-промышленных и производственных серий туберкулинов па соответствие требованиям действующей нормативной документации проводили на базе отдела биологического контроля Государственной Курской биофабрики. Контроль биологической активности туберкулинов. осуществляли на здоровом и больном туберкулезом, крупном рогатом скоте в хозяйствах Ставропольского края, Саратовской и Курской областей, рекомендованных Главным управлением ветеринарии МСХ СССР и МСХ России. В качестве контрольных серий при определении биологической активности и специфичности препаратов использовали утвержденные ВГНКИ ветпрепаратов контрольные серии сухого очищенного ППД туберкулина для млекопитающих №№ 43, 29, 28, 14, 9 изготовленные Государственной, Курской биофабрикой соответственно 02.06.77 г., 13.10.83 г., 25.09.86 г., 01.03.90 г., 15.02.96 г. При оценке реактогенности, биологической активности, видовой специфичности опытных, опытно-промышленных и производственных серий туберкулинов, изготовленных различными способами, в опытах использовано 1300 морских свинок, 1084 здорового и 1146 больного туберкулезом крупного рогатого скота.

Биохимические исследования культуралыюй жидкости и туберкул,илов проводили в Центральной исследовательской лаборатории Курской биофабрики и в лаборатории молекулярной биологии и биохимииВИЭВ. Для выращивания микобактерий использовали синтетическую питательную среду Курской биофабрики. Для культивирования перевиваемой линии клеток ПЭО, хронически инфицированных вирусом лейкоза КРС, применяли среды Игла, 199, гидролизат лактальбумина, ферментативный гидролизат мышечных белков (ФГМС), стерильную сыворотку крови северных оленей и лошадей. При изучении химического состава и физико-химических свойств полученных препаратов были использованы следующие методы: определение общего белка макрометодом Къельдаля, определение содержания нуклеиновых кислот по фосфору (Ф.М. Орлову 1973), весовой метод определения сухого остатка и золы, колориметрический метод определения полисахаридов (О.Д. Кушманова, Г.М. Ивченко, 1974), концентрацию липидов определяли после экстрагирования их эфир-но-этанольной смесью (Ю.Б. Филиппович, Т.А. Егорова, Г.А. Севастьянова, 1982), протеолитическую активность ферментов оценивали по расщеплению казеина (Негру-Водэ, 1973), гель-фильтрацию проводили на колонке 1,6 х 49 см с сефадексами и акриламид-агарозными гелями (Л.А. Зильбер, 1968), используя систему для жидкостной хроматографии фирмы «ЛКБ» (Швеция), ультрафильтрацию осуществляли на кассетной системе «Пелликон» фи