Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ИХ ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ПРИ НЕХИРУРГИЧЕСКОЙ ПЕРЕСАДКЕ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ИХ ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ПРИ НЕХИРУРГИЧЕСКОЙ ПЕРЕСАДКЕ"

А-0993-/

вскхжэиый ордша тртаоваго красного ашвнв ничво-всскиоаииьсиВ шнягшт

животноводства '

злк 632í64s»02

сцешл КАЧВСТВА эиериэноб крупваго рогатого енот h их при£ив1яаюсть при нехирургичвскоя dbpscabb

03;00ЛЗ - «жзжадогжа человека ж

АВТОРЕФЕРАТ двосертшшх ал содошняе y^feaoft степени

ау»

>

Ду0{ЮБЖП8« Московской oäneoni Х99Х rf

Ра do та вшюявева во Всесоюзно» орцеш Трудового Краевого научно-исследовательском институте дивотвоводства с 1987 no 1990 гг.

Ваучвнв руководитель - доктор биологических даун, профессор ШИ;Свргеев;

qjüij ^|ffvhifhjft дпттр у

■ догтор а*шюгячесхйх ваук, врофессор Шихоэ ИЛг

жавдняат сельскохозяйственных варе Будевжч И.Ит

Ведущее учраадеяне: Научно-иоследоэатаяьсЕий институт животноводства Лосостепн в Полесья, 5ССР;

ЗЬщята диссертации состоится "/%» .. (м^^СХ/ jssi г;' в . / (Р чае. на заседание «педализированного Совега Д;020И6.02 щ* Всесовэною ордена Трудового Краевого Знамени научно-исследовательском жвегжтуге животноводства;

Адрес института: J420I2» Московская ойл., Подольский р-он, вое» Дубровждр;

С диссертацией ыохво ознакомиться в биСкхотеке института; Автореферат разослан ' г;

Ученый секретарь специализированного Совете кандидат биологических шук

ЩИ.1Имнгин

: I, Сбаая характеристик* раости ■"'■/■ .'. \ - -

. ' : . Лроодеми, - связанные с раериоеткой м»тода тре.испл&нт&к;й зародазей са»скохоз*£стмнкнх жйвотнкх, едрско я»увд?тея 2 раэ-дичншс странах». Лрв атом.осеФоурнвмагт» уяеяяется «¿сдедскшв; ^■разработке техника,-оявикн жмкеспосойновтв, куяктнвйроь&цкя " в краохоксерьацак вародавей.ч . • - ■

Кетод травсалмт^к широко ис долг, зеваться■»практическом жгвотноводстве» что ускоряет хазмвожвиге васокопрсдухтгвншс яавоткнх, . . ' '. « Актуальность тем«.' В расперяжекгг исследователей в дрсктвт.-. . ков свльского хоэ^ет^^;

' определения ;кг8нвеяосо0ности »ародыией нлекопигвшвх перед ех

■ траноалавтаиивй решдиеитЬи. Отсутствие солее оСмктиексгр . способа контроля. при вода т не : только ксшикению »{фбктггкосгк

; самого, метода траисилавтадии. ко и к вогадяностя доявлекад нездорового'потсаствв^ Поэтому разработка »ф$ектя£вдго; метода ■ оценки кяэнеспосоОности гародывей на »еех вталах гх долучеда:/ низкотемпературной. вонсервадаи' я. особенно перед трансхкантажей

■ являете«, ■ ключе ши этапом практического ■ прдкекеняя метода- салантацив в животноводстве. " • ч/ •

разработка иетодо» опеякв:качества гмбраовс»л изымаю;? яо»а белее эФФ&ктйрнъ» хриодротехторов,.. состава сред,, утоп б-' ,.шя. способе»; аамораетвююя; в оттаиваяяя даст возможность энада-теипао пошеить эффективность трвнегшитацки.'■ ■ : «

; . Цель в задачи исследований. Основиея цель исследовгккп ■■зашаталась в усогершекствовании методов оцевки кдчесгвг, гал-рааавандя а оттаивании ^^рндноаг^Евпази^ванрем ггтальшяс

красителей а кряодротек*0£я гдяаарива^ктжтетфви с дро^адге-

И..И».

док-1,2 в различных концентрациях,„ изучении влияния в векото- / рых других факторов на жизнеспособность а праживдаемость. эмбрионов щш .вехврурггческой лересадае.--V'-'..-, .-'■ Исходя; дз. этого • в ■ задачи- исследований, входило : --. ^ определить''влияние типа гонадотродинов на качество эмбрионов, а' также их • приживднемость' дри вехирургической пересадке;:;

. — изучить возможность оценки жизнеспособности свекедолучен-шх а заморожённо-оттаянных эмбрионов о поыодыэ витальных краен-гелей; . •'" ."/'■'.■."-'■'-.■'■

- определить влияние некоторых факторов на\ приживляемость замороженно-отхаянных.эмбрионов дри нехирургичесхоЗ пересадке (среда., рекам охладтаёыая И'отогрева,, коЙЦентрашя криодротек- . тора). ' '..."' ' ' '".■'. ■ "'.'."/:.'■ . - ,.' .

Научная новизна работы; заключается." в изучении зависимости. качества г нрияавднеиости эмбрионов о? .типа гонадотродинов. • ■„ шхалЬЕЫХХраситекеа,;.видаи концентрад!Ш криопротектора, раз-' личных режимов замораживания и оттаиванпя. -

Практическая значимость работа заключается в разработке экспрвсс-методов ошнки 'жизвеспособносги зм(5рЕонов с помопв» < _ .< штадьныхкрасителвй,'примэвенилв-качествекриоаротектора глицерина в сочетания с прошадиалом-1,2 при ускоренном режиме замораживания. что дает возиояиость сократить время криоков-сервирования, поансить лшзнеспособность и пршшвдяешсть аыбрио-ноь» . ,'Л "-"/:." ' • / Л ' " ■ .

; задал результатов* исследований: "■■.■;■ Результаты ^рследованаЁ: вшэдрзш'е лаборитории воспроиз— зодства о-х -животных и биотехнологии ТНИЙ нивотноводства и

используется в центре травсалантацзи с-х-гхвотщп ЖГЙа-

Апробаош работы.,Результата всыедаюеий докяаяквалясь _ •на еаегодгсп производственно: совезаклях лаборатории воспрогэ-водетва с.-х. гавотньэ: в баотехнолотзи я на Всесоюзном научно- : " техначеском совегоида в ЦуСроалл, 1990. гад).-

Объен работа. ДЕСсерташя вздсгена "ва ■ стралзцах чь- . аанопиокого 'текста, ядятетрзровада; 20 таблдшмд а 7 $асуикаьй!.: . Состоят гз введения,.обзора литературы, иатерлала и'ыетодов^.. результатов собственных исследован^» ькводсв в практических v., предлсйВ1Е£. Сдасок использованной дстературы: вютает ■ fО О.

ИСТОЧНИКОВ, В ТОМ ЧИОЛв, /0& ИЕйСТрвНШВС.

2. Уатергал к методы исследоваилЯ ■ - ••* ' '■■"■■

X Исследования по оценке' качества энбраонов с пшодьо вгуа-Г тальныхкрас::твлей,' кулътдвиротакт. зааораЕгвакап а оттадватак . эмбрионов крупного рогатого скота проведены элабораторид техка-:кз'трааошавтаэзи и"«расконсервирования аыбраонов сельскохозяйственных зевотные КШа в:перзод о1987"ао19Э0 гг.,а'гЗраоны получали от,суперовудироЕгвщЕХ вамок крупного рогатого.скота вехирургстескки методам о использованием '¿ос;агно-солевого раствора Даяьбехко' (2БС),. ' ;

- 'Оценку тазнесдособноста проводили по 5-бальной скале, раз-рабоганной в'ВСЕе. Кроив'морфологической оценка, использовала "... метол витального окрашивания энфаонов красатедямз нейтральным красным и трззановш синим. Нейтральный красный в гавойклетке ■ способен абсорбироваться на аузлекноЕкх клетках к взаи«оде2стБывать сдрухдаи ко1шовентаиз клеток, вчаствостд, о хроматгнеи -дадяткхся клеток. Трйсшювнй сгнгй, в отяатае от-нейтрального красного, окрашивает мертвые клетки в интенсивно сзнай цвет»

экспозиция гд^имятиг "г'пл'каяяепга • ъ-х.иуптуг ; которед, дозводдлау"' ■ дифференцировать мертвые л жизнеспособные; &мбрионы.> ■ '

■". Растворы готовюш. следу11ш1:образом:. навеску 0,001 г ней- - . трального красного растворят-: в ^ 10 : мл ; среды .Дшьбекко(с добав- : -чта^га ,ттатггртттаип . ^атя.тгу.'дяст- ^ирпргургд тй.тйттая.)яятяц - , " .

браш 0,1 .ил 0,42» раствора тршавовото -.сап^ и доб^ среды- Дииьбшскб;-- Эмбрионы, гомаавиа ;на~дредаегвое стаяло, с 'двумя . . да штанга-- красителя ■ в:;ищубировали.вгвтение :2-5 .минут; .Доел© .. окрашвавая - оценивала •жизнеспособность1. эмбрионов:под. бивокудяр---.ной лудой. .Вое зародыша доела • окрашивания^ бала - поставлена на .. нультиварованае - {до'ЛЭ •часов) :в ^зиолшзгееског среде „Даяьбек-ко о ■ добавлена е^-1 30? феталъной - сыворотки. т еленка, в-термостате -ари +37°С.\^Часовое,;сте1Ш1.с:дуттуральвовГс^ эмбрионами,: ставида^в-чашку,. Петри - с увлажненной .-фильтровальной:; : ■ бумагоЗ;дляпредотвращена» - дспареная.среды> -. У - - - ■\

Яаигуяттраяа е ЭМбрВОНОВ; ПрОВОДОШ : на . ПрОГраМИНОЙ ; ЗЭМОраЗИ- :' "V \ '■' вателв-в в газообразном-азоте/ ' : : . - . '

■ .. Вконтродьной. группе в • качестве - дриопрот эктора. и спольэова^' V ■ ■ ' ; ■■ лиглацерин 1,^;'концентрашд.,Васш№ше;крвопротекторои:11рово- --.

: днлг'.в 4 атгип::0*35;<<0,7; 1,05 Я. 1*4 Ц-с выде^шеов.в казфзы по • ■. ■ 5 минут: _ Заморадлвание, ароводала ; на : программном. заыоражавателе, - . . ' по- традиционной- схеме.-' Охлахдение- от-+20°С до: -7°С со скоростью -

^ ТОр/ция. При ■ ТТ^то. атпту» о«тпрв»ядарпч» . •

продолжала- со-скорость»- 0,3°С/мен,, до —Э6°С, :а:затем эмбраоны : переносила ъ хядгаз азот;' " -''.' • • • ■.■/-"■'У

• ; ГНтят* ^ тгад ^¿¿пАрилипр - тгрпрлдт« ^ - р агцг<п»пй ттр^ - ' р

течение нескольким сещад*,-Удаление дриоаротшяора: после - бттаа- ■ , ааяая йсуабй1Еляда-В'Обратной;последовательности'в растворах; "

той яе концентрадаи и видерека. -.'

В опьтншс группах зсзольэоЕала в качестве кргопротектора ' глицерина в сочетании с црошшщолом-1,2 Б разных концентрадлх с использованием иетода вятргфакаагв. . V ;

* В первой группе использовала. 25%.раствор глицерина в сочетании с 25£ раствором пропандзола-1,2. КасшеЕве "эмбрионов .крао-протектороы провещала в 2 этапа: 10% раствор, глацеринав сочетаний с .раствором пропандаола-'1,2; 25% раствор глицерина: в сочетании с 25$ раствор пропандяола-1,2 с вздержкой в лалдои., по 10 шяут. *..:'" -

Зо'второй группе использовали: 40$ раствор глицерина .в сочетании с 5С£ раствором пропандз ола-1,2.: Насвдеяи е - дроводауа — танке в 2 этапа: Х0% раствор глицерина и 20% раствор продандаэ-ла-1,2; 4. ОЙ раствор т лидера на и 50£ раствор пропандаола-1,2."" ~ Экскозкщя в кадцом растворе по 10 минут. После выдержка во;, втором "растворе краопротектораэмбрионы.помечала в паатты и.,. располагали в негавко«ерном,темдературвом поде 4-54 -60°") в--газообразном азоте, на 3 минуты-,В таких условиях среда с V"-кряопротектором приобретает стекловидное'состояние (вторая; группа) и амор$ное (1-я груши). После охлаздензя (метод вит" ряфзваща) эмбБйокы переносили в кидхий .азот. ■ ■ ■.>■'.'■.'/■.-■..■■. -

Оттаивание эмбрионов било быстрое путел погружения лаетт с эмбргонаыа в водяную баню при: температуре +39°С. Удаление ' ■ крЕОцротектора проводила в два этапа, помедая ах в Ш, раствор 4 сахарозы на 6 минут в 0(5М раствор сахароэы на 3 минута После , оценка качества.эмбрионов их помещала в паеггу в.пересежнвалл. рецашгевтои. ', ,: 1 ' ■

Полученные цифровые данные подвергали статистической О05&~. ботке по Е.К.Меркурьевой, 1970 г.

Схема'исследований

Изучаемый вопроса ■ . Объем исследований:

Морфологическая оценка качества . аайрийов. я определение1 стадии их ■ развития ■; ' ; . 1123

Притязавшая оценка качества эмбрлб-^■"■ нов с помощь» витальных красителей. ■'125".

Изучение влияния культироваяия на жизнеспособность о«браонов . ' - 136 ■

Зшдорадвваддв эмбрионовс исегльзо-ванием различных, рвюшов а конйензсра- . ■ ций криоцротекто!» ютцерина и его ■ ■ , * ; сочетаний с дро1*»ад2олсм-1.г - 856 ■ '

Оттаивание и оценка качества.эмбрионов 420

Паресадаа све&ешиученши - и заморо-' ■ женно-оттаянвш амбраонов 614

3. Результаты исследований.'. .

3.1. Опенка качества эмбрионов. Исследования по морфологической оценке качества свежетолученншс эмбрионов доказали» что яз обцвго.^сла11^3 зародышей 856 0ыла нор.1альнЕе (76,2?), 123 (П,0{!) -дегенерированные.й 144 {12,8%) ~ неошгодотворен-ны^лгдаюштки. ... .* '. -.. ■

Установлено, чтопра гормональном вызывании суперовуляции эмбрионов отличного качества.на разных стадиях развития можно, получить лзш> незначительное.количество (30,5^). Цоныле всего ах на стадии- поздней ыорулы .17,5^. Процент их заметно'■ уэеличм-

вается на стадза ранней;(39,35)е поздней бластодастк -

' (табл.. I). " '

* ■ 'Таолида I -'.-.■■'*

.Качество а стадия развития а'-'ЗрЕонов крупного, рогатого " " -скота С %) '. .'V; : ■ ■ ч

Качество ■ .■■': Стадая развитая Всего ••

эмбрао- . ■ ■■..............................— I. -

. нов ;- мпбруны властошсты . ■■

позднае -■■■ ■ ■ —- — ■ " — ■ -■■-■■ ■.

ранние ; ■ позднае

... ъ , - , . ^ ■ . ■ г -.-■.., ■■ '■...'■ г *

Исследовано '•• ■ . ', ■ ■

эмбрионов^; 400 . 420 _ 36 ■ --•"656"

Отхгчнке 70-17.5 165-39,3 26^72,2" "' 261-30,5

Хороше 203-50,6 ■ " 233-55,5 10-27,8 ' 446-52Д

■ Удовлет- ■..". "-.V" .■

воштель— .'.'■" ■>"■■■■

• пае 127-31,8 . 22-5,2 " • 149-17,5

Стадия-ранней.бластодасты от - доз дней морула отличалась . . Оачьшш процентом эибрионов отлячного и хорошего качества в " . шньшм числом удовлвтвсряталъквх^ В обшей'числе поздних Оластоцаст . наблвддлось наличие высокого: цроаентаэмбрионов отличного кача- ",".' ства (72,2й) и более. назкдй яроцент хороаего качества . (27,655)..' ^ ' ■

3.2. Прижизненная оценка качества эмбрионов • с помощью ' " '.'" . "■' витальных красителей , ; .:.

■ г. Для определения жизнеспособности использовали ыатод окраши-. . ванпя штальнши красителяш, который основан на различной сте-деня пронинаеыости красителей через прозрачную ободочку живых ! и погибших эмбрионов, . "■ ■ ■ ,

В качестве краситедеЕ .использовали нейтральный красшй н

, . -Ю ' •

тркпановы! скнпйв Еондентрзиип 0,01£(нз2традьны2 красный) в 0,С4£ (градаповыЯ сенп2). Экстазщия окрашивания составляла 2-6 ьсшут, кота рая позволяла дш^феревцгровать кертвне с гжзне-спосщЗше эийргэшт

.. Вшо окрашено 123 гкбриошв. Из 126 зародшег, 78 быет -вогшальтих в остальные (38,1^) датенерирозаннщст.

Результаты морфйиогЕчбСЕо5 г прижизненной сделки с паколью ьи-тальнкх краситзлэг всегда совпадали ыеэду собой..

Дападнатедьвкм;гесток определения влзяшы: красителей за . хпзкесяосойность эиЗрнонзв я^тяется та культЕзироваяле. Паи: . бако прокузыЕвгроваво 72 све^ело-туче^^ вибрионов кэр$слогЕ-ческд полноценны!, с откдзвенЕЯИг структуре с дегенерировая-ш (тайл.2).

' - • „ Тайгжа 2

Резухматы кулыгвгрования све&шо^учешшх зародпзеЙ , после оарадираадя витальныии красит аджи

Красители

Показатель

нейтральный красный

тргпанэвый синсг

кэрфэлЕО-.с шрфо- деге-гичесЕЕ' логичес- дери-подшь- квзд от- рован-ценнне клонена- ше яш ■

кэсфояо- с юрфо- деге- 1 гически логичес- дериро-пално— ядаи от— ванше ценше клонени-' ями .

Исследовано экСрпоаов

Качество

рэзеиешлсся гиОряонов

Дрсцгдг1 от'. чдсда культе-вирогаяянх

10 17 в,- Ш 60,0 58,8

К

7 6

12 30 5

85,7 41,7

. .. Морфологически-полноцешшо эмвриокк яри культивировании имеош.высокую наэноспособкость.-. Развитие их после окрашивания -.нейтральны:.! красным а тркпановыи синим каблвдалос^ в'80,О в ' 85^7^ случаев, а при культивировании.эмбрионов с морфологическими отклонениями дробление отмечалось у 58,8' и 41,Ни один из окрашенное, неполноценных эмбрионов не-раз вился.'.

При оценке качества замороженно-оттаянгшх эмбрионов с помощью красителей,'также использовала. кратковременное культивирование в течение 1-2 часов. Было поставлено на кратковременное,-кулътавирование ¡54. замороженно-оттаянных эмбриона разного качест-"ва, "после" витального-окраования. ¡1 .в этом случае' также/наблюдалась". высокая степень развития морфологически полноценных-эмбрионов

(табл. зК ..... -'■■'.:

' ' • *'' ' Таблйца З" .'" .

Развитие замороненно-оттаянкых аародыией при'йультаЕИрованЕа после окрашивания витальнша красителями 1

Показатель ■ , . ■ Красители

■ нейтрально,красный. -> трисаловый -синий:

морфологи- с морфоло- морфоло-'- ■ о' иорфоло-

чески пол- гвческимз гачески, ," гическима

неценные. .отклоне- солноцен- стклоне-

" _ ниямц ные ■_. нижа

Исследовано эыбрао-

нов ' ■ 3 24 2 25 Количество развив-- ' ■-■■'•■'■■■

гахся эмбрионов " а . ( т .21 '- . • 2\ ■ " - " 22 *

"Процент от числа' ^

культивированных .100,0 .. 67,5 100,0 92,0

Результаты табжцщ 3: показывают что при кратковременном культивировании окрашенных морфологических "прт пт,ннг ?ямгцу>^н-

-к-;. .

во-оттаянныг эмбрионов развития ах наглодалось в 100£ случаев , насколько низке у эмбрионов с морфологическими отклонениями. (87,53)., . . '

' Наш. также изучено влияние витальных красптедеЗ на' пршжаяяо-! ыость свезеполученных' к задорохенно-оттаявпхх эмбрионов, в зависимости от их качества.-Было пересажено 18 свеяеподученЕых.. зарог дышей (табл. 4). ' - -х■

■ '. . • • Таблица 4

Прикивляемость свежаполученных зароджлеЗ в зависимости от ех качества после'витального окрашивания

Показатель ■

Качест» эмбрионов

отличные и хороше удовлетворит.

Пересажало эмбрионов " . Л- 12 б '

Число реципиентов 12 • 6

Стельных ревдлиентов & ... '2

Процент стельности 1 '■'■.*■.'■ 50,0 ■ 33,3 ■

■ От: пересадки эмбрионов отличного и хорошего качества, окрашенных ватажными, красителями стельности составила 50^ , удовлетворительного 'качества 33,3/4. Общий показатель стельности составил 44,45.,

...." . При аэучишш влияния красителей на жизнеспособность эмбрло-нов до замораова;-:кя:а после оттаивания установлено, что эизрзо-вы ^расенпке до згысра^вания в оцененные по морфологическим ¿ризиагаа, как хоропио и отличные в^болышшстве своем носле от-тпдванкйг была дрпуодшдла для пересадки (табл. 5 и 6).

'Габлаца 5

2авякзе нейтрального к^асксгона срлкивляеность ■ заыороженно-оттаяшшх змбряоаоьв .зашсамссти-от их качества: \ - ;

Доказатедв: -

Окразешдо заморатазваная

Качество; эмбрионов

отлачниз - хорозпе

удовлетворн-■ тельные ■

Перэсааено эмбрлонов' Стельно; ревдппенгов Процент стельности

13. 7

63,9

II I

9,0

Табливд 6

Вдзянне тр^закового синего на - пралдвляемость заглорогешю-оттошггш; эмбрионов в эашсашстз о? их качества .

Показатель'

Пересажено эмбрионов Стельных реципиентов Процент стельности

Окрашены после оттаивания

Качество эмбрзонов

. отдэтнне — хорошее

ТТ.

удовлетворительные

149

■ 64,3

■10 - I 10,0

- Отмечено заметное различие в приаивляемости скраденных-' эмбрионов при нехирургической.пересадке в зааасаыостп от их качества, У зародышей лучшего качества до заморазагаккя в после

оттаивания наблюдалась более высокая прпяавляемосхь.

При пересадке эмбрионов отличного в хорошего качества;. ■ ■■

окрашены® нейтральным краснш и трипановым синим, стельность

составила 53,9 в 64,& соответственно. Отмечено заметное скаже-нив стельности в 6 раз после пересадки .удовлетворительных эмбрионов. - •

Было изучено . также ■ влияние витальных красителей на нржяв-ляемоСть замороженно-оттаянных зародышей. После: замораживался и оттаивания половину эмбрионов-хаадой грушш окрашивала двумя: красителями. Вторая половина неокрашенныг. эмбрионов- служила -контродам., После окрашивания и оценки; качества. эмбрионы бьш пересаженытелкам-рецитаентам(та0л.7).

Таблица 7

Влияние витальных красителей на дриживляемость - эааороженно-оттаяннах эмбрионе»

Группы '

контроль- красители

.. ная-- ---

• - ■ нейтральный трипановый си-красный (ок- ний (окрашены раиены до после оттаива-... заыорагава- вия)

ния) _ : ■

Оттаяно эибргснов ■ ;■ ' 27 27 ' ' ' 27

Пригодных к пересадке 23 24 . 24 Процент от числа оттаян--

кых 85,2 63,9 ее,9

Число реципиент,ов .15 24 .2X ■

Стельных рецякиевтов 10 ■ 8 ' ' 10

Процент стельности; .... 52,6,..-,. "33,3 : -.....47,6

■ Э грузде окрашенных эмбрионов наблюдалась хорошая приживляемое ту и составила у зародышей окрашенных' 0,04Й трапанового

синего - 47,в% т 0,01% нейтрального' красного' - 33,иди - на -14,3% меньас. ОсиаЗ показатель стельности окрашенных-эмбрио-

Показатель

■ . . . - 13 - ■ - V - •••

нов состава л 4СЙ против 52, в контроле,'' . ■■ -ч::"."':

' Пслтченкыо результата свидетельствуют, чт оС,01£г раствор нейтрального.красного я 0,042 трэяанового синего не оказывала заметного отрицательного ажяния на гкзнеспособность эибриоиов, тс качество к прткиэдгаеггость аосле дересадкп.

3.4. Длзян:;е крзопротектора гдпцэрана в его сочетаний .. с прсландаодш-1,2 на казнеспособность эмбрионов

Вал о протектора а его кссшентрацая ане от для ■ выжпЕаеиости эмбрионов особое значен::в. ^ехакдзм залетного действия-крволро-тектора сводится к эффекту растворенья солей, внутргклеточноцу заглораягвакж а стао^жгаца:: клеточных мембран. Основным требована ем к кряопротектораа является отсутствие токсичности пра .высоких концентрациях в легкая длс^узая в клетке» • ■

Прдмеаензе в качестве крд опротектора глгцергыа- в. сочетании с лролаЕДЕОлсу-1,2 аре за:лсразз:ванг:2 методом ватри^акасгл .дает возмолаость существенно упростить технологии криоконсерварованзя.

Исходя кз этого, кшлл было определено вдлянзе пацерзна с его сочетаний с пропандаолом-Х £ на качество а газнеспособность - эмбрионов после заиэразаваная з отталвашя (табл. 8).

Таблаш 8

¿¿^неспособность эмбрионов, замороженных в разных резамзх п концентрациях краопротектора

Показатель . _Режимы охлаждения_

стандартна метод метод.витрафакадкп*

Заморожено и оттаяно

эмбрионов 34 30

Количество развившихся

эмбрионов. 29 - .•- 26

Процент жизнеспособных ...

эмбрионов- ' 65,3 ■ 86,7

' Сравнительные испытания различных способов замораживания , *■ доказала, что после оттаивания бшго примерно равное. количество -"■'. жизнеспособных эмбрионов* йз' числа зародатейзаж) решенных по . стандартному. методу до -35°С "после оттаивавия оказалась - вазне-способйыш 29 из 34 (85,350,' 5 (14,7?) эмбрионов оказались де—' генерированнымиОри ;замораживания" методойвдтрафпкавди яазнеспо-; СОбЯОСТЬ ЭМБРИОНОВ была:ДОЧТИ одинаково! {86 ,7$К ■

■\> Из приведенного следует»; что криоконсервироваыие ■ эмбрионов - ■ 'методсц1витрификащи мояет, 0ыть -с - успеха, использо- ;;

вала в практической криобиология, •'••

При - сравнительном ;ьслыхаиии замораживания : эмбрионов- ыето- ; дом витри^кадиио-использованием криопро^гекторов различной концентрации получены удовлетвори тельшерезультаты' (табл.. 9)

; V'. ;'■;■.- •/'\ '.'■':..■ ■ Тоблида. 9 г £изнеспособность эмбрионов замороженных методом

••• ; ..■• . - Цетод замораживания. . ■

стандартна " : . ' нитрификации

Показатель- ■'.-■ .

■ , концентрация - криопрот екгора, %

.25/25 40/50 по 2-м

группам

Заморожено-я ¿гтая- .•' .'.- -.> : ■: ■ . .

ВО ' .. . 34 . 20 10 : 30

Число жизнестособ-_ • ^ . ■

внх « 29 Iе .8 • 26

Процент от' ,осла, ' - * •• ' .

оттаянных ' . - . 85,3 90,0 80,0 86,7

- 4 \ - ' лчвна тендвидая-улучшения - переживаемости £:£рионов ; ; (86,против 85,3?)' цра эамораяиванли эмбрионов в газообразном ■■"/

азоте а нераввоиершкд тваавратурном воле. Стельность .в контроль-' ной груше составила ^.гй.' в оаыткоа - ЗЗ.З^.- Сшжевяепригашля-к1с>стл:эглЗраонов пря исаользовакдз. метода' ватрафлкат^а.' вероятно, модно объяснить кесищма условзяиа охлагденяяа >«сов%ра№нствоы . самой технологий. \ .

■ ■ 3.5. йшянле качества-и стадии развития эмбрионов,и

кекоторгзс других *а?.торов иа ах газнеспособность ' и прагзвдяемость зри нехгруртич'есхоа пересадке. ;

; На казнеспособности z.прзжквляемость эибрдоноа влияет ряд .факторов, такзх как.стадая развития,,качество,, состоялае зона пеллзздада зыбриона. спосос! касвдешш и выведения краопротектора. В исследованиях установлено, что пригявдяемость эмбрионов при нехируртическоЗ пересадке,находится в прямой зава см о ста от зх , качества (табл. 10). . '

. Таблица Ю:

-'.'■ Привавляклость'свекеполученных эмбрионов в зависимости ', от стадий развития s их качества -

Стадия : развития икачество. ■ ...■ зародышей : Пересажено. заведшей Стельных рецапвевтов Продент стельноМЕ

Морулы 118 . 67 56,8

отлзчше ■■ 19 ■ -'14" ..'" ' ',73,7

хорошие .59. за: ■ 64,4

удовлетворительные. 40 ; ' IS ' ■'.:.-.'. : 37,5

ЕЛастоцисты 107 ■ - 63 ' 7 58,9 -

отличные '■■.■' .. 51 - 32 62,7.•

хорошие - 40 28 '' 7 58,3 -,

удовлетворительные " ' . . в '■■■ 3. ■ ; " 37,5 .

ВСЕГО. " 225 ' 130. 57,8

• Пра пересадка ' глорул и бластоцист отличного качества пралав-ляшость 0Х соотавала 73,7 и 62,что На36,2и25,2£ вкшв.

чем при пересадке морул и'бластоглст удовлетворательного качества./ г ■ ' V" ■ ;:. /;''. .' ■ В среднем от пересадки 225 свегеполучевннх морул и бласто-даст разного качества црахивляемость составила 57,8^.

Нами была изучена взаимосвязь качества эмбрионов до в после замораживания, к оттаивания с приаивляемостью их после нехирурга-ческой пересадки. "'

Бшю заморожено 219, поздних .морул, 267'раншх и 28 поздних бластоцаст (табл. II).

. '.' " Таблица II

. Зйгзвесдособность и дражавл^амость замороженно-отташпшх ' эмбрионов в зависимости от стадая^раэввтая

Показатели"" . - - ■ Стадия развитая "...

моруды бластошсты.

поздние ■ ' - 1 •

', ' '■■-... ранние ' поздние

Заморозе© эмбрионов ■ 219.-: • 237 28

оттаяно эмбрионов ■ ■■ 168 194 28 Пригодных к пересадке -

.после оттаивания. ..... - ' 138 , 159 • 26 .

Процент.от'числа оттаянных 82,4 81,9 92,7

Число редипиентов 133 "159 • 26

Стельных реципиентов - 61 - 76 . 16

Процэкт стельнорти 44,2 ■ 47,8 - 61,5

Данные табдацн П показывают, что самая высокая выживав-моссь (92,7%) получена при замораживании поздних бластоцаст. При' замораживании поздних морул жизнеспособность их снизалась на. 10,65. 03 сравнен^) о доэдыами бластошстамя. Хорошие результата были получены при криоконсервировании ранних бластощст (81,9?), но зыживаемость ах свигалась на 10,8$-по сравнение о поздника бдастоцзстамг. ■ ■ ■■

, .- ;Пра^а^орааааанаа. поздних - б.~л стодаст - суельность, доеле/ пере-^' • садки их составила 61.5? с .била лучсе2 со-сравнению с пересадксЗ -■' /поздних ыорул (44,25) а-'рагаах.6ласто1ь:ст;-Д47,82). д • : 'л-.-V, Отмечены.эа«етяыо различия-в.арзгавляеаости эмбрионов после вехврургаческой, пересадкав зависимости. :от ч1зХ;Качества..-?э^йрго-^:', ".нов лучлего:качества до заясрата^ная,а ;аосде...оттаавадая бид.бо-^./ лее .'высокий. уровезъ; притавляеиоста .после ^пересадка,, (табл. 12)^ . ,

Д- г-л ' '".'.■ , Таблща..12. .-..'•.

ь/ В-тпщгае. качества замэроаеиво-оттаянкнх,, эмбрионов',перед' ,

- . ..■■:' . .пересадкой на.ах-лриггвдяемость.. •'• •;.- 'г.

'-.'■ '• ■ ■■■ '■■':'■■'■'■' '-V - '.Качество.эмбрионов • •.

Показатель . * ■._..——-I . . ■ — .■..—,, . ._„..,,,

:.-:.■.':>. . отличные, хорошие " удовлетворительные-,,"

Пересажено эмбрионов, : . :;42 ". • 167. "123 ,; ..'''.

Число .реципиентов'! . • 42 /'"■;. '.1&7:/ ГП4*:' - .'. '

Стельных• реципиентовV. •' . * 25 :'■■■■ • 'Э5;' - '33

Процент.стельности " .59,5 . 56,9. .'• .■28,9,^';/

-.-■-/. . Стельность после пересадка вибрионов отдгчного качества'"* ,■;■'• . составила, 59,5^ . При ^,т1Ш1Сплаетапаал зародызе2 ,хброаег'о качества"..' ^ процент стельности несколько снижался-(5€,9£).• Прзяавяяеиость ■. эмбрионов. удовлетворит еигьного-; качества .была; ыеньпе, белее /чем в:

• 2 раза,в,:сосгаэзла 28,92. •: /•. : •':; ..'•; . ' - '

' ..V-* ''/-г'---/.''''-.*' / ;'' татапцч ' "'■''.■"■.'-'■','*' . ^V г..'.. у/'-'-С-/:/'.-'' -

.-Т. Эффективность пересадки, свеЕеполученвых и/замороабНво^^ ■ *

• оттаяншд /эмбрионов - находятся .в прямой зависимости- от'. их - качест- .

■ ва:и'стадии-.развитая.' Про пересадке"свежёподучеданх;зародышей от- .-;'. личного:качества можно получить е5,7? стельностей, хорошего—.

59,8$, удовлетворительного — 37,5?, от пересадки эомороженяо-' :

оттаянных.эмбрионов - 59,5$ 56.9 и.28,92 соответственно,.'' -'

.:•'■■■■■ ¿О'г'.- . . ■ ■..,

2. Зятальные,красителя нейтраль красннй в О,01? и трипа-нозаЗ сгвдЗ — 0,045 концектраща.пра'аккубшдш э^рионов в тече-: Кае 2-5 минут ве оаазывавт отрицательного "влияния на газвеспособ-' ность эмбрионов./■-л':./'- ■■ ■-,■..■'.'

. ■' 3, Применение краопротеатора глицерина 1, конкентрадаи и -: глицв^саа в сочетавия о 1,2-срошндаолом при, заморазавашш оОес-пб^ивает 'рашое усахрвнеаае ГЕЗнэоцособностЕ эмбрионов после от-: тааваная.; .у;/ :••• .Ц;■: ./■.'■'."' ■■■■' ■■■■■. '

V +4, - Нриоконсервирозанзе эмбрионов с глгцераноы; в сочетании с 1,2-пропандиадом методом ватрзфакацап не оказывает . отрицатель— ноге* атаяния на ах жизнеспособность, сокращает процесс, запора-живания. ' " '■".•■ г ? ,'.; ■;.■■.■

5. Удаленяе криосротектора с использованием1121 концентрацаа -сахароэв сокрашает время маыипуляцяа о эмбрлонаък после оттаива- -игя, . улучшает актавныЗ перенос ведестэ; внутри эмбраозаС.

драдтлчэсхае предлогения ■ •; -;■/-' ¡¡¿я более точной опенки качества свегеясоученнык л заао-; розсезно-оттаянныг- эмбрионов удовлетворительного а - сомнительного качества,", рекоиенцуется:црвменять вптальЕ1а краситель трапановнЗ Г-ЦУ^Ъ ? О.ПД^ тптг^дт-грятрд прт; п^ряпг^рятга^ от ?" до'.5

минут« . ••' ■ У1;/V,' • л,-:.'.■■."*■■■..' : '-.Ч

" 2., Дгя кргрдонсервирования эмбрионов методом аатри:$и кадки в качвстве краояротектора исподьзовать -4Сй глицераз в сочетании' , с 5СИ раствором 1,2-цроааадаода; . " ■ ■./.'■;.-_.;.,.

- Сдзсог охтбжкованшз работ I. Сергеев Н.Я.#.у1адьЛ2ва И.В.» Сукачева ЛЛ.» Ибрагимов Ю.Ю.

ЯрааенаЕзе ивтода траксшянтаяди эмбрионов в драктдяе живот- . ■ новодотаа // Оология воспроазведения а бЕотехнологдческие метода развадеазя-с.-г.. згестнах. - Москва, 1990. с. .64-91. -

■2.' Ефремова Ц.Н., Смыслова Н.И., Сукачева Л.П. ПркжвЕЛяемость змброонов в зависимости от/стадии развития з качества при . вехиигргзческоа пересадке // Трансплантация эмбрионов крутого рогатого скота. - Жодино, .1589,с. 22-24. З.СукачевеЛ.Ш, Ефремова Ц.Н, Оценка качества эмбрионов с. ," иомоцью витальных-красителей // Проблемы развития бвотехно-

.. логии в животноводстве. Дубровипи. - 1990, с, 53-54. , '4.'Маэепклн.С.А., 0ед1жкин А.6., Сукачева Л.П. - Заморанивание эмбрионов крупного рогатого скота // Проблемы развития Оио-„технологии в эавотноводстве. Дубровнда, 1930, с. 59-61.

ПСЕЖС1Д0 К flS4JLTX 7.05..I99Ir ЗАКАЗ 665.. SBFiS 100»я« ŒT-Bi 0,9ytj Л.ЛШ1 ЕИЫ,..