Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оценка функционального состояния ооцитов коров при культивировании IN VITRO

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Оценка функционального состояния ооцитов коров при культивировании IN VITRO"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАЗВЕДЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ДЖАББУР Зохир Ибрагим

ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО состояния ООЦИТОВ КОРОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO

Специальность: 06.02.01 — Разведение, селекция и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

ЛЕНИНГРАД 1990

Работа выполнена в лаборатории культивирования эмбрионов Всесоюзного научно-исследовательского института разведення и генетики сельскохозяйственных животных.

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Б. П. Завертяев; кандидат биологических наук Т. И. Кузьмина.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Р Р. Тейнберг; кандидат биологических наук Л. Г. Мороз.

Ведущее учреждение: Ленинградский ветеринарный институт.

Защита диссертации состоится « 'Ш^^/Ято г. в И час. на заседании Специализированного совета Д 020.CT7.0i по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном научно-исследовательском институте разведения и генетики сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Ленинград—Пушкин, Московское шоссе, дом 55-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИРГЖ-

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных

наук, профессор Б. П. Завертяев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУаЛНОСТЬ темьь Биотехнология как перспективное и приориг ?тное направлении в животноводстве развивается ускоренными темами. Новые методы биотехнологии должны привести к коренному избиению воспроизводства и селекции сельскохозяйственных животных

Важным разделом биологии Клеток, который служит Фундамем- , «льноП Вазой новых направления в биотехнологии животных, жэнана клеточная инженерия. Под клеточной С геномноЯЗ инженери-1 понимается направление биотехнологии, в основе которого »кит культивирование клеток In vitro и манипуляция с ними.

В новых направлениях клеточной инженерии еельскохоэяпствен-jx животных используются половые клетки, зиготы и ранние эмбри-!Ы. Одним иэ таких направлении, позволяющим резко интенсифи-«ровать процессы воспроизводства генетически ценных короз, >ляется экстракорпоральное оплодотворение созревших In vitro эцнтов.

У короз рост ооцитов заканчивается на стадии ранних «тральных Фолликулов. Культивирование ооцитов, извлеченных иэ »ких Фолликулов, с последующим экстракорпоральным оплодотвори-«ем, является эффективным методом'получения ранних эмбрионов.

Благодаря достигнутому прогрессу в раскрытии механизма южных биологических процессов, связанных с к у льтивированием эцитов млекопитающих, существенно усовершенствованы методы эзревания и оплодотворения ооцитор in vitro. Наиболее •тенсивные исследования по обсуждаемой теме' проводятся на >упном рогатом скоте. Однако, • несмотря на Вольи/ой опыт ■льтивирования ооцитов коров, данные литературы об >Фективности метода противоречивы. Это связано с тем, что ютехнологня включает такие сложные этапы, как культивирование эцитов до метаФазы II меЯют нческого созревания, капацитзция герматоэоидов, экстракорпоральное оплодотворение? ооцитов и льтивирование ранних эмбрионов in vitro.

Как показывает анализ литературы, отсутствуют надежные юсобы оценки жизнеспособности ооцитов. зигот н эмбрионов, ?обходимые на каждом этапе биотехнологии экстракорпорального 1лодотворения созревших in vitro ооцитов.

Так, популяция ооцитов, извлеченных иэ антральных Фоллику-

л os весьма гетерогенна по ряду морфологических, цитологических других признаков. Это обусловливает разную компетенцию ооцитов созреванию и оплодотворению. Такая изменчивость позволяет проводить предварительный отбор ооцитов с целью повышены эффективности их культивирования.

Исходя из сказанного можно заключить, что исследования п совершенствованию существующих и разработке нозых методов оценк Функционального состояния ооцитов при культивировании in vi tr являются актуальными.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилос совершенствование оценки Функционального состояния ооцито коров, позволяющей повысить эффективность их отбора дл культивирования in vitro.

Для выполнения поставленной цели необходимо было реыит следующие основные задачи:

— разработать метод оценки Функционального состояния ооцитс коров при культивировании in vitro;

- оценить влияние некоторых Факторов на процесс созревани ооцитов при культивнровании;

- провести оценку Функционального состояния ооцитов н разных стадиях созревания. \

Научная новизна работы- в работе показано влияние факторо - температуры, ультрафиолетовых лучей. и сезона года н созревание ооцитов in vitro. Изучено Функциональное состояние ооцитов коров на разных стадиях созревания. Разработан ието прижизненной оценки функционального состояния ооцитов позволяющий Солее Эффективно проводить отбор яйцеклеток дл культивирования. В ходе, исследований после культивирован» ооцитов обнаружена их способность к спрятанному партеногенезу.

ЩШЭЕИЗЭШШЯ значимость работы, предложены уточненные уело вия культивирования ооцитов in vitro. Ьетод оцеп к Функционального состояния ооцитов, основанный на Флуоресценци внутриклеточных пиридиннуклеотидов и флавопротеидов, может быт использован в биотехнологии экстракорпорального оплодотворен» созревших in vitro яйцеклеток. . '

Апробация работы. По результатам исследования опубликован четырга печатные работы, отражающий основные научные результат:

»чссертлции. Материалы диссертации обсуждались на заседаниях гченого совета и аспирантских сессиях ВНИИРГЖ С198Я, 19В9, 1990) .

Стрэтггура дкссерташш И Объем работы- Диссертация состоит

1Э введения* ofoopa литературы» материала и методов (сследопаний, результатов исследований, обсуждения, выводов и 1редложениЯ производству. Работа изложена на стр. ,

♦ашиногшеного текста ♦ содержит 1в таблиц и £ рисунков. Список штера^уры включает «190 наименований.

S. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили на ооцитах, выделенных из аитральных юллнкулов яичников коров, убитых на мясокомбинате. Материал ¡оставляли с Ленинградского мясокомбината в течение 1,5-2 ч. ¡ичники со следами свенгей овуляции, геморрогические, с Фоллику-ярными кистами, с резко уменьшенным числом видимых Фолликулов тбраковывали нэ конвейере. Транспортировка яичников

существлялась в термосе при температуре 20-В5°С в среде ТС-199.

Ооциты извлекали из яичников путем надреза Фолликулов иаметром Й—6 мм. Надрез производили устройством для рассечения олликулов, разработанным в • лаборатории культивирования мОрионов ВНИИРГЖ, или лезвиями, фиксированными зажимом.

Яйцеклетки промывали раствором Хэнкса или стандартной редой ТС-199 на растворе Эрла с 100 ЕД/мл пениииллина О мкг/мл стрептомицина или гентомицина в концентрации 10 Д^мл, рН раствора 7,1.

Выделенные нэ яичников ооциты использовали для чефолликулярного культивирования и оплодотворения 1л vitro, груктурно-логическая схема эксперимента представлена на рис.1.

Для определения жизнеспособности яйцеклеток нами впервые лл применен метод оценки качества ооцитов, заключающийся в »учении. метаболизма некоторых групп ко^ерментов, принимающих цветне в окислительно-восстанооительных процессах при клеточном ахании, обладающих характерными споктрами поглощения ; в 1ьтраФИолетовой оГласти С НАДН, фАД>. Н^тод основан на линейной .енсммостн мнт'?"смрмссти t/iyop'.vcueummh от kt-4.tini'?ctj:>'> окисленных 1 гл?с про твидов С ■)[,П> и Г'С'СС > an^n/jciiiiii гл пи|?л.-и1ннукл<>отидсг» С ПЮ .

Рис. 1. Структурно-логическая схема эксперимента

(висимости интенсивности Флуоресценции от количества окисленных гсавопротеидов СфП) и восстановленных пиридиннуклеотидов С ПН).

Перед проведение»! люминесцентного анализа проводили цито-эрФО логическую оценку. в основе которой лежала характеристика lk самого ооцнта, так и окружающих ого клеток кумулюса. В экс->рименте исследовали Функциональное состояние двух групп ооцит- , 'ну люсных комплексов, характеризующихся следующими признаками: группа Синтактные) - ооциты с тонкозернистой ■ гомогенной ооп-

лазмой, окруженные многослойным компактным кумулюсом;

группа С с признаками дегенерации) - ооциты с нарушенной вител-линовой мембраной, вакуолизнрованной сюплазмоя, с отслоением кумулюса.

Д-

Для проведения люминесцентного анализа испольэовли чуориметрию. Параметры проведения анализа Выли следующие: «аметр зонда соответствовал диаметру ооцита.

Длины волн для НАДН - 365 нм, для фАД - 43© им, температура 32-S5°C. Экспозиция тестирования - 1S-20 сек.

Для более углубленного исследования окисЛительно-восстано-ггельных процессов в клетках нами Выло использовано воздействие

-7

чтимицина С в концентрации 5-7 х 10 нЮ • ингибитора IX участка лхательной цепи и щавелевоуксусной кислоты С в концентрации 5 ■О ■ После получения данных о содержании НАДН и фАД в ооцитах с подвергали цитогенетическому анализу.

Цитогенетически исследовались Фолликулярные- ооциты коров ^посредственно после их выделения из антральных фолликулов,, а. 1кже в различные сроки культивирования.

Препараты мейотических хромосом готовили по методу крковского С Tarkovski, 1966). Исследования хромосом проводили >д микроскопом Olimpus при увеличении ЭООх. Для оценки стадий ?йоэа учитывали классификацию, предложенную Мах-Гаухвей СМс lUchey, Polge, 19763.

Культивирование ооцитов проводили в закрытых сосудах флаконах) или в чашках Петри. Среда для культивнрования >стояла из сле?дугоших компонентов: среда ТО-1 ПО - 60%, сыворотка 'рпного рогатого скота п/ir фетальная -80?;, 10 ЕД/нл гентомицина ш S0 нкгУг 1 л стрептомицина - 10 ЕД/м л пенициллина ; рН среды - 7,2

S

уравкйьеилшается ЯЯ СО„, температура - 38°С. С цмыо получения полноценных яйцеклеток, компетентных к оплодотворению, в исходную культуральную среду вводили комплекс гормонов в следующем составе: остраднол - 50 мкг/ил, ЛГ - 1-Ю ЕД/ил, фСГ -Ю мкг^мл, инсулин - 4 ЕДУ мл.

Для оплодотворения использовали сперму Быков из свежелолу-ченного или замороженного аякуля-.ов. Экстракорпоральное оплодотворение проводили в среде TC-1S9 с 10% детальной сыворотю и антибиотиками методом "swim-up" CParrish, 19863.

На определенном £»тапе кул ьтивиррвания часть ооцитов исследовали для контроля полноценности их созревания, когда около 30% ооцитов достигали стадии метаФазы-11, проводили оплодотворение яйцеклеток коров предварительно капацитированны! i сперматозоидами Сыка в концентрации 1 ~1, В илн/мл. Экслоошшя оплодотворения от 3 до 6 ч» в зависимости от качества слормы.

После инкубации ооцитов со сперматозоидами оплодотворенные яйцеклетки помещали для культивирования в питательную среду ТС-189 с 20>i детальной сыворотки и антибиотиками НО ЕДу мл гентомицина или ЮО ЕД.'мл пенициллина й SO мкгхмл стрептомицина}. Первый просмотр клеток .после оплодотворения проводили через 24 ч. При благоприятном ходе эксперимента среди клеток присутствовали ооциты с признаками ■ оплодотворения — наличием второго полярного тельца, Сюрозды дробления, мужского и женского пронуклеусов.

Документировались резу льтаты исследований мнкрсх^отогр&Фияни.

Статистическую ойраСс^гку результатов оштсй) проводил» по Стьюденту и при помощи критерия Пирсона "Хи-квадрат" СЛакин, 108О>.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Влияние различных факторов на мепоз ооцитов коров

Сезонные изменения опдодотворяемости ооштгов коров при щ уультивкровании ЙШ организма- Одним из самых вв'кмых условие,

определяющих успешное проведение эксперимента, является качество исходного материала. • . 1

В наших исследованиях установлено, что на созревание ооцитов in vitro и их окстракорпоральное оплодотворение сущест-

а

ванное влияние оказывает сезон. Т»?к, наиеысшил выход созревших ооцмтов lia телофазе-метафазе-ll наблюдается о месяце

С и наименьший - в июле-сентябре С 554). Наибольшая оплодот-

воряемость созреших in vitro ооцигов приходится на апрель-май месяцы С37,1 -37, и наименьшая - на июль месяц С13,£?0.

Таким образом, мани внйвлряы сезонные изменения экстракорпоральной оплодотворяемости In vitro созревших oouhtob.

Известно, что у коров, созревание ооцитов in vivo происходит в конце фолликулярной Фазы эстралыюго цикла в условиях подъема концентрации стероидных гормонов, в осноеном,эстрогенов. Мы предполагаем, что сезонная изменчивость концентрации стероидных гормонов обусловливает основную вариабельность созревания ооЦитов in vitro и их компетентность к оплодотворению.

Влияние, ультрафиолетовых лучей на МЭКОй ШШТРВ щэод La

yit.ro. Известны способы определения жизнеспособности яйцеклеток и зародышей с использованием прижизненных красителей. Однако большинство этих методов имеют ряд недостатков. Один из них заключается п том, что при тестировании полноценности яйцеклеток и зародышей красители проник а jot э оонит. Непрон икающие внутрь красители позволяют*: с большим успехом оценить их кизнеспоеоБ-ность. Использованный в наших исследованиях люминесцентный метод оценки функционального состояния ооцитов коров позволил доста-таточно быстро тестировать качество ооцитов, не требуя введения в них красителей. В связи с тем, что для определения флуоресценции клеток их необходимо подв&ргнуть облучению Уф-лучами длиной волны 34-0-36S нм. нами были проведены эксперименты по изучению характера влияния ультрафиолетовых лучей на созревание ооцитов. .

• В литературе имеются данные .об отрицательном действии ультрафиолетовых лучей на соматические клетки млекопитающих.

Ультрафиолетовые лучи вызывают нарушения жизненно важных клеточных функций и увеличивают количество клеток с хромосомными аберрациями. В наших исследованиях показано» что характер действия ультрафиолетовых лучей на ооциты коров зависит от экспозиции облучения. При длительном воздействии Уф-луч^й С ЭОО-365 имЭ - до 9 мин и более, ндол.одается отрицательный Эффект Срост количества клеток с хромосомными нарушениями?.

Кратковременное облучение ооцитов Уф-лучлми С до 2,5--3 мин>

оказало положительное влияние на внефолликулярное созреван*

яйцеклеток, при этом увеличивается выход ооцитов на. стадии МЛ,

количество клеток с кариологическимм аномалиями снижается.

Полученные результаты согласуются с данными о влиянии Уф-

лучей с длиной волны 3653 ни на жизнеспособность сперматозоидов

е

млекопитающих. Так как время для проведения люминисцентны анализа ооцитов укладывается в диапазоне 15-20 сек, то понятые

Таблица

Влияние Уф-лучей С 365 нм> на созревание ооцитов коров in vi tri

Время ооцитов на стадиях мейоза:

воз-

действия , мин. Группы опыта Число клеток Дп Дк Ш Ан Тел Ш1 MII+T

Всего гьь а, з 8,3 ЗВ, 7 5,3 11,3 гв. г 42, 3

О Норма 20Э О, Ö 8, Э 34 .5 S, 4 Ю,8 31 ,5 4г, ,э

0 Деген^р. • 63 е,э а, з эг.- .4 4,8 12,7 17,5

Всего 110 13,3 6,4 14. S 4,5 12,7 48,а

г', В Норма Э6 13,3 6,2 ia, ,5 4.2 51 ,0 63,

Деген^р. 14 14.3 7,1 20, ,2 7.1 14,3 гв.е

Всего НО 3,6 7,3 31.. О г,7 11,8 42.7

3,0 Норма 93 4,3 e,s г.: ,7 г. г 12. Э 49,3 еа ,4

• Дегенер.. 17 - 11.8 70, ,6 В.9 5,0 5,0

Всего 1S4 12.г 11,о 34, 1 3.7 e,s 20,3

0,0 Норма 100 17,0 13,0 30, .О 3,0 в,о 29.0 37, ,о

Дегенер. 64 4,7 7,0 40 .в 4,7 9.4 зг.в

Лрим&чание. Дл-диллотена, Дк—диакинеэ, М1-ме-таФаза 1, Ан-анафаза, Т^л-телоФаза, М11 - метафаза II.

что возможность- появления хромосомных нарушений, обусловл&ннъ действием Уф-лучей, сводится к минимуму. При оплодотворен» ооцитов, предварительно подвергшихся люминеецегт к>му анализу, были получены эмбрионы. Из них 30% при пролангировамном культивировании достигли стадии нору лы.

3. 2. Оценка Функционального состояния ооцитов коров при культивировании вне организма

Влияние хранения ооцуггов ш ШМДШНШЕШйё. состояние

Использование цитоморфологических характеристик при оценке селэкции ооцитов в экспериментах не является окончательны . критерием . их полноценности и не позволяет судить

Функциональном состс лшш- клетки. В клетках с признаками морфологической дегенера"ии нередко Выли установлены изменения характера метаболизма Ь н&ш^х исследованиях а ооцитах, оцененных цито-морфо логически сак интактные, интенсивнс :ть Флуоресценции НАДИ СНАДФ1Р и фАД выше, чом ь ооцитах с признаками дегенерации и не меняет на разных стадиях мейоза СДп, МХ и 1Д1Э. Аналогичный Эффект 1 аРлк дается в ооцитах, хранившихся в яичниках при температуре в теченне 3 6 ч С табл. 23. В то же время в ооцитах с признаками цитоморфолс гической дегенерации наблюдалось прогрессивное снижение НАЛН С НАДфШ и фАД при тех же условиях хранения ооцитоэ. При этом наблюдалось наибольшее снижение флуоресценции фАД, т.е. увеличение восстановленности Флавопрот^идов. При культивировании таких сюцитов происходило резкое возрастами* Флуоресценции НАДН СНАДфЮ и фАД.

Таблица 2

Влияние хранения исходной популяции ооцлтов на нх Функциональное состояние

Морфологиче-

ская харак- Интенсивность

Время теристика Стадия Флуоресценции

хране- сюцит-куму- п меКоэа НАДН-фАД

ния люсного

комплекса ИАДН фАД

Контроль Интактный 5в Дп 0.4Э± 0,31+ 1,4±0,01в

ССез 0,0477 О.-Э55

хранения)

С признаками 61 Дп 0,'33+ 0.17+ 2,1+0,0124

дегенерации

16-20 ч Интактный Дп О, 48+ о.озве О, 33+ О.027© 1,4±0,01в

С . признаками 33 Дп 0,1в+ о.оюг** - 0,07 + О.ООв2КХ. г.в+о,1б2

дегенерации

Изучение «муоресценпии НАШ! а ФМ ооюттов коров при

ДЭЙСТВКИ аптиншииа. Известно, что амтимицин А ингибирует .перенос электронов между цитохромами в и с^ н, как следствие, происходит значительное возрастание восстановленных форм переносчиков электронов на начальном участке , дыхательной цепи. При "нарушениях в дыхательнрй цели вышеуказанные процессы замедляются или же полностью отсутстйуют. В наших исследованиях

после в ведения антимицина в исследуемые клетки в Большинстве цитсморфологически интактных ооиитов наблюдалось значительное возрастание НАДН С тайл. 3) .

Таблица о

Интенсивность Флуоресценции НАДН и фАД

Морфологическая Интенсивность Флуоресценции НАДН при

характеристика добавлении ингибитора антимицина А

ооцит-кумулюснс- п _;__;___:__

го комплекса • усл. ед. усл. ед. Я

Йнтактныя 27 0,38+0,022 0,60+0,035 79

С признакамк

дегенерации 25 0,5510,019 0.62+0,034' 13

Введение антимицина в ооциты повысило интенсивность Флуоресценции НАДН на 79JÍ. В ооцитах же с признаками дегенерации уровень НАД увеличился лиш1, на 13%.

Ктаяние шавелэвоуксусноя кислоты ÍMK1 на окислшэльно-рос-становнпгедьные процессы в оошггах коров на стадии диплотвны.

Изменение . метаболизма и Функционального состояния клеток сопровождается также изменением реакции клеток н уровня восстановительных эквивалентов на действие щавеле^оуксусной кислоты Стабл. 4). Оксалацетат, к.*к известно, может выполнять различные Функции: с одной стороны, активировать цитратсинтетазную реакцию и цикл трикареоновых кислот, а, с другой - тормозить цикл КреОса в результате конкурентного ингибирования сукцинат-дэгидрогеназы. В результате сравнительного изучения влияния ЩУК на ред оке-реакции пиридин и Флавиннуклеотидов в клетках животных и растительных тканей показано, что в клетках малоповреж денных объектов ЩУК окисляет Флавопротеиды и пиридинкуклеотиды; при большом повреждении и пи в условиях анаяробиоза ЩУК окисляет Флавопротеиды и восстанавливает пиридиннуклеотиды.

В наших исследованиях получен неоднозначный эффект на введение ЩУК в ооциты, оцененные, как имтакгны©. Часть ооцитов- отвечала снижением Флуоресценции НАДН и увеличение^ Флуоресценции фАД, что характерно для неповрежденных клеток. Вторая часть отвечала одновременным возрастанием Флуоресценции НАДН и фАД.

Мочшо предположить, что, во-первых: не fice оодиты, цитомор-(Фолсгически оцененные как интактные, являются функционально

Ю

Т&Слица 4

Влияние {:;:• велевоуксуснс-й кислоты на окислительно-ВОССТАМСВНТе/ процессы ооциТОЬ коров при хранении яичников

Морфологи-Вр*?мя ч >ская чакра - } стерис- Стеснения тика оо- лия

ц.' иу — п ней-Л1.. ного оза

комплекса

физиологический раствор;

ШУИ

'физиологический раствор

ПАЛИ фАД

НАЛ»

фАД НАЛН ФАД

Сразу Интактный 25 . Дп О, ,55+ о, ■ 41 + 0,67*4 о. 52+ 0,54 + С, ,44+

ПОСЛ& 0 ,057 0 ,020 0,021 0,016 0,024 0 ,015

полу- С призна-

чения ками деге- ■ге>' Дп о. 67 + 0. 33 + 0,50+ 0, ЗЭ + 0,43 + 0, 29 +

нерации 0 ,043 О, 04В 0,049 о ,041 0.044 ,041

16-20 Инталтный ге Дп о , 40 + О ,32± о,зах+ о ,за+ 0, 47± 0 ,зо±

час. о, , 031 0, ,022 0,021 0, 019 0,006 0, ,017

хра- С призна-

нен. ками деге- -31 Дп 0, 74 + 0, , 43 + 0,55+ о, ,37+ 0, 4В + 0, ,33+

при нерлинч 0, 031 о. 027 О, 031 0, 01 э 0,029 0, 022

4-3 С

С|1 азу

после* Интактный 11 Дп 0,51± 0,36+ С»47± 0,30± 0.46± 0,37± полу- 0*0163 0,0164 0,014?. 0,014(3 0,0141 0,0107

чсния

полноценными; во-вторых» поскольку перед определением интенсивности флуоресценции ооциты предварительно освобождали от клеток куму л юс а С механически— пипеткой, или с помощью препаровальной иглы>» возрастание флуоресценции НАЛН и ФАД второй части ооцитов Сем. выше}на действие ЩУК является результатом стрессового воздейстьия меха-—нического удаления клеток ку мулюса. В пользу последнего предположения свидетельству ет Быстрое взсста -новление исходного уровня флуоресценции НАЛ И и фАД в яйцеклетках после их отмыва от ЩУК.

При действии ЩУК на ооциты, имеющие? признаки цитоморфологи-ческой дегенерации, наблюдается снижение флу оресценции НАДИ и .фАД. Эффект не исчезает и после отмывки ооцитов от ЩУК.

Функциональное - постоянно ооцитов щ завершающих стадиях

МвЙОЗа. Имеются. многочисленные литературные данные о мейотичес-ких преобразованиях :;ромосом .созревающего ооцита. Значительно меньше исследований посвящено изучению характера . гзнергетических процессов & • динамикч? созревания ооцитов. В наших исследованиях

1 1

предпринята попытка охарактеризовать Функциональное состояние? ооцитов крупного рогатого скота в ходе? их внеФолликулярного созреваний. Результаты исследования, представленные в. табл. 5, свидетельствуют об однонаправленности окислительно-восстнови-тельных процессов в клетках, подвергшихся 24 ч культивированию. Так, данные по интенсивности Флуоресценции НАДН^фАД на различных стадиях мейоэа: Дп, MI, Mil не имеют достоверных различия, а соотношение НАДН. iAJX однозначно - 1,4 на всех исследуемых стадиях.

Таблица S

функциональное состояние осцитов на завершающих стадиях мейоза Цитоморфологи- Вре-

ческая харак- мя Ста- Интенсивность

теристика куль- дня Флуоресценции НАДН^фАД

ооцит-кумулюс- тиви- нейо- п__'

ного комплекса рова- за M.tm M+m

ния

Интактный О Дп 61 0,45±0,0477 О, Э1±0,0255 1,4

Интактный IS Ml 43 0,50+0,0078 0,35+0,0054 1,4

Интактный 24 Mil 44 0,47+0,0072 0.34+0,0031 1,4

Анализ результатов исследований многочисленных авторов и полученные нами данные позволяют утверждать, что прижизненная оценка ооцит-кумулюсных комплексов по цитоморфологическим признакам не обеспечивает достаточно высоких результатов экспериментов. Одним из дополнительных критериев оценки качества может служить предложенный нами тест оценки Функционалного состояния яйцеклеток перед их оплодотворением. Со этом свидетельствуют полученные нами результаты по изучению интенсивности Флуоресценции во внефолликулярно созревших ооцитах С табл. 6?. Так, при оплодотворении цитоморфологически ; интактных ооцитов, предварительно оцененных по функциональному состоянию, компетент! ¡ныли к оплодотворению и дальнейшему развитию . в эмбрионы оказались лишь те ооциты, интенсивность Флуоресценции которых находилась в следующих пределах: НАДН - 0,55-0,00 и ФАД соответственно — 0,40-6. 42.

Ооциты с признаками цитоморфологической дегенерации и высокой степенью Флуоресценци>> С НАДН - 0,В4-0,7Б и фАД - 0,44 -

О» 55) не огмсдотсорилксь. Отрицательный результат полу чц-н и при оплодотворении ..»оцитоэ, оцененных, как, интактные, по цитоморфологич« ;ким признакам, но с интенсивностью Флуоресценции НАДН мвнеч 0,3 и фАД - ниже О, 40.

ТаБлица 6

Интенсивность флуоресценции ооцито» после их 24-ч^соеого культивирования

цитоморфологи- иитогенетиче<_кий

Номер ческая оценка НАДН фАД анализ после оп-

п^л осцит-кумулюсно- лодотворени* го комплекса

1. Интактный , 40 О, ,ге Дегенерация

г. Интактный 0, ,33 о, ,40 Морула

3. С признаками дегечарации 0 ,73 0 ,33 Дегенерация

4. Интактный с, ,33 О, ,40 2-клеточный амбрион

3. Интактный ' о, ,43 о, ,га Дегенерация

в. Интактный о, ,42 0, .¿а Дегенерация

7. С признаками дегенерации о. 64 0, 44 Отсутствие хромосом

в. Интактный 0, ,32 о, ,37 _ •• _

9. С признаками дегечерацни о ,73 0 ,ВЗ Дегенерация

10. Интактный о. 60 о. 42 ,2-клеточмый эмбрион

Таким оБраэом» данные наСлюдений позволяют утверждать, что цитоморфологи чески интактиые ооииты с соотношением интенсивности Флуоресценции пиридиннуклеотидов и флавопротеидоь IНАДН/фАД^ в следующих пределах: 0,40 - О, бО/О,'42 могут Оыть оценки как Функционально мнтактные и пригодны х далън&йш&пу их использовании* с целью экстракорпорального оплодотворения.

3. Э. Спонтанное плртеногенетическое развитие ооцит'о» коров при их вмефолликулярном культивировании Одной из причин гиЬе/зи ранни« зародышей, полученных из ооцитов. прокультивированных и оплодотьоренных вне организма, может Оыть спонтаннь^й. партеногенез яйцеклеток. Известно, что ооциты млекопитающих обладают потенцией к партеногенетическому развитию» которое мож<?т Оыть индуцировано некоторыми химическими и физическими факторами. Для выяснения причин

ггартеногенетического развития oou.it тов в процессе созревания нами была исследована возможность появления дробящихся эчВрионов при культивировании ооцитов в зависимости от временного интервала. Средой для культивирования служила ТС-199 с 1054 Феталъной сыворотки с гормональными доОавками СфСГ, эотрадиолЭ и Оез ник.

Таолица У

Спонтанный партеногенез ооцитов крупного рогатого скота л ри внефолликулярном культивировании

Количество

Число просящихся клеток

оидихио и 'груше ^ 2-клеточный 4-клеточный В-клеточны Р. Я

40 ' 1 - 2, ,3

33 1 1 - 3, 7

40 2 - - 3, ,о

40 3 - 3, ,7

35 1 .1 - 5. 7

. за - 1 1 6, ,3

Е 222 В 3 1 5, ,4

Примечание. Концентрация клеток: 7 С1 мл среды ТС-19ё+20?< сыворотки в среде}

Нами обнаружены клетки при культивировании ооцитов в

вышеуказанных средах через 48-30 ч экспозиции. Процент дроОления

составлял от 2,5 до 12,3; количество Влэютокеров достигало 6

СтаВл.7Э. Не Выло отмечено достоверных различий по выходу

эмбрионов в исследуемых группах. Отмечена тенденция к повышению

выхода партеногенетических зародышей при увеличении концентрации

ооцитов на мм. среды. При цитологическом анализе таких гмБрионов

с их Оластомерах обнаружены ядра Ста5л.8>.

• Таблицы 9

Партеногенетическое развитие при культивировании ооцитов |:оров на 48-50 ч

Количество ООЦИТОВ В 1 груипо ДроОление Я

2-клеточный 4-клеточный

33 32 30 40 1 4 1 4 2 2 8,0 12,5 10,0 10,0

3 37 Ю 4 10,2

Примечв1:по. концентрация клеток: 14 С1 мл ТС-199 +■ 5'А в среде).

14 '

сыворотки

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что при культивировании or,. \итоо &ие организма среди получаемых эмбрионов возможно нали не партодогенетических зародышей, что следует учитывать при разработке технологии по.-учения эмбрионов вне орган*«» а,

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод оценки Функционального состояний ооцитов корсв» основанный на Флуоресценции внутриклеточных гшридиннуклеотидок» С НЛДЬО и Флавопротеидов С фАД) .

2. При кратковременном действии ультрафиолетовых лучей С 365 нм> на ооциты происходят активация ядерного созревания

и повышение жизнеспособности яйцеклеток, выражающаяся в увеличении выхода ооцитов на продвинутых стадиях мейоэа и уменьшении дегенерации хромосом.

3. Выявлена сиязь между жизнеспоооОностыо ооцитоз и содержанием НАДН и фАД.

Л. Установлена корреляция цьтоморфолсгической гетерогенному

сти ооцитов с Функциональным состоянием, * ,

. 5. Интенсивность Флуоресценции НАДН и ФАД в ооцитах, находящихся на разных ст.здиях мейотического созревания, не имеет статистически достоверных различий.

6. Соотношение НАДИ и фАД в цнтоморфологически интактныи ооцитах^составляет 1.4, а в ооцитах с признаками дегенерации выше. >

7. Выявлена сезонная изменчивость в аплодо гворяе мости яйцеклеток при культие4*ро*ании in vitro.

в. Показана возможность использования щавелевоухсусной кислоты в "качестве дополнительного теста на степень

повреждения ооцитор.;' •

9. Удлиннение времени экспозиции культивирования ооцитов до 4В-50 ч приводит к спонтанному партеногенезу яйцеклеток. Отмечена тенденция к повышению выхода п&ртеногенов С до 12,5?0 при увеличении числа ооцитов на мл среды.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПГОИЗРОДСЧЧУ

1. Для оЦенки Функционального состояния ооцитов коров при культигированин in vitro рекомендуется метод, основанный на интенсивности Флуоресценции внутриклеточных пнридиннукл^отидов и Флавоиротеидов.

2. Полученные результаты могут быть использованы в сельскохозяйственных и зоов-отернмарных ВУЗах . в учебны:: курсам биотехнологии и .воспроизводства животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Джаббур 3-Й. , Кузьмина Т. И. , Завертяев Б. П. Оценка и отВор по жизнеспособности ооцитов . крупного рогатого скота при их культивировании вне организма У/ Бюлл. ВИИИРГЖ. - 1089. - МЮ97 -С. 34-38.

2. Кузьмина Т. И. , Завертяев В. П. , Джаббур 3. И. Сезонные изменения оплодотвсряемости ооцитов коров при их культивировании вне организма ^v Бюлл. ВНИИРГЖ. - 1989. - N11S. - С. 25-26.

3. Джаббур 3. И. , Кузьмина Т. И. , Шапиев И. Спонтанное лартеногенетическое развитие ооцитов крупного рогатого скота при их внефолликулярном культивировании // Бюлл. ВНИИРГЖ. - 1990. -N119. - С. 29-31.

4. Кузьмина Т. И. , Гойло Т. А. , Джаббур 3. И. Протеолитичесиая активность ■ фолликулярной жидкости .-V Бюлл. ВНИИРГЖ. - 1S90. N119. - С. 19-31.

Подписано и печать 31.10.90 г. Формат бумаги 60х 84'Vlô, -Печ.л. I Тираж 100 экз. Заказ 1094. Бесплатно

РТО. Тип. ВИР, г.Павловск

Бесплатно

i

\