Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности взаимодействия мелитина с модельными и природными мембранами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия мелитина с модельными и природными мембранами"

рїБ Ой

1 7 ;

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. Палладіна

ТАРАСЕНКО Алла Сергіївна

УДК 577.352.332

ОСОБЛИВОСТІ ВЗАЄМОДІЇ МЕЛІТИНУ З МОДЕЛЬНИМИ ТА ПРИРОДНИМИ МЕМБРАНАМИ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у віоділі біофізики Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна Національної академії наук України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук

МАЛИШЕВА Маргарита Костянтинівна,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольца НАН України завідуюча відділом нейрохімії; кандидат біологічних наук КОЛЕСНІКОВА Ірина Миколаївна,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, старший науковий співробітник.

Провідна організація - Кримський медичний інститут ім С.О.Георгієвського (лабороторія біотехнології) МОЗ України, м. Сімферополь.

о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01. 84. 01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України за адресою:

252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії НАН України за адресою: 252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий "26 " вересня __________1997 р.

Вчений секретар

ДЕМЧЕНКО Олександр Петрович,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Захист відбудеться "27 " жовтня

1997 р.

спеціалізованої вченої ради

КІРСЕНКО О.В.

Актуальність проблеми. Не виникає сумніву, що білок-ліпідні взаємодії контролю. функціонування біологічних мембран і тому їх дослідження протягом вже довгого часу шаються актуальними. Велике значення в цих роботах надається вибору коректної елі дослідження. Мелітин-ліпідні взаємодії привертають увагу вчених головним чином ики відносній, добре охарактеризованій різними методами структурній простоті тиду та широкому спектру його біологічної дії. Мелітин - це літичний мембрано-ївииіі пептид бджолиної отрут, який здатний спонтанно вбудовуватись в природні та чні мембрани і в мікромояярнш концентраціях впливати на стан фосфоліпідного бі-у /Dempsey С. 1990/. Проте, навіть для такої простої моделі, як мелітин-фосфоліпідна брана, на більшість поставлених питань, зокрема, питань про механізм вбудовування гиду в мембрану, конформацію та орієнтацію його по відношенню до бішару, немає иначної відповіді. Відкритим залишається і питання про ступінь аїрегації мембрано-заного мелітину. На цей час пропонуються як протилежні моделі організації пептиду в тстурі сформованої ним пори (мономер або тетрамер) /Altenbach C. et al., 1988; Vogel H.

1986/, так і проміжні, які допускають різну ступінь його олігомеризації. Не ясною є і ціна високої імуногенності мелітину, який викликає різноманітні алергічні реакції, міння цього питання, можливо, дозволить пояснити природу біологічної дії пептиду.

Враховуючи високу мембранну активність мелітину, цікавим є не тільки теоретичне ідження пептиду, але і можливість практичного його застосування. Так, на базі гину вже створені гібридні молекули, які мають поліпшені антибактеріальні та ¡мікробні властивості і водночас не є цитолітиками /Femandez І. et al., 1994; Juwadi Р. її., 1996/. Зараз відкривається також перспектива використання пептиду як сціональної частани біфункціональних молекул цілеспрямованої дії. Такі молекули, що гь, з одного боку, літичну активність мелітину, а, з другого - вибірковість по эшенню до певних типів клітин, можуть бути використані в терапії ряду тяжких зрювань, до числа яких належать аутоімунні, онкологічні та СНІД.

Ступінь дослідженності тематики. Білок-ліпідні взаємодії, зокрема, мелітин-¡ранні комплекси, досліджуються дуже активно /Benachii T. et al., 1995; Ohki S. et al., f. Проте, незважаючи на високий сучасний рівень експериментальної науки, для пості поставлених питань існують неоднозначні, а часом і протилежні висновки. Це ізано як з недоліками та обмеженістю методичних підходів, так і з використанням арату мелітину, що має залишкову фосфоліпазну активність. Останнє особливо нво враховувати при дослідженні взаємодії мелітину з мембраною, так як фосфоліпаза клітин проявляють синергічну дію. Слід також враховувати, що фізико-хімічні ■ивості пептиду, а також його структура тісно пов’язані як із станом та складом го ліпідного бішару, так і з умовами експерименту.

Мета роботи та завдання дослідження. Метою цієї роботи стало подальи поглиблення теоретичних знань про природу та характер взаємодії мелітину фосфоліпідним бішаром, а також вивчення можливості практичного застосування пепги, шляхом створення на йото основі біфункціональних молекул цілеспрямованої дії. Д: вирішення цих питань були поставлені такі завдання:

- отримати високоочищений препарат мелітину, позбавлений залишків фосфоліпа ної активності, шляхом створення високоспецифічного імуносорбенту на основі моноклі нальних антитіл проти пептиду;

- за допомогою полі- та моноклональних антитіл виявити локалізацію основи антигенної детермінанти мелітину, вбудованого в модельну мембрану;

- вивчити вплив первинного конформаційного стану мелітину та його синтетичні похідних на ступінь агрегації пептидів в структурі пори;

- дослідити вплив моноклональних антитіл на індуковану мелітинс потенціалзалежну проникливість бішарової ліпідної мембрани;

- вивчити можливість створення на основі мелітину лікарської форми біфункції нальних переадресованих токсинів, здатних завдяки селективній пептид-рецепторк: взаємодії вибірково діяти на тимуезалежні лімфоцити та викликати їх специфічі руйнування.

Наукова новизна. Внаслідок проведених досліджень вперше отримані прямі дока: того, що мелітин, взаємодіючи з мембраною, розташовується на її поверхні таким чиної що основна його антигенна детермінанта експонована в оточуюче середовище та доступі дії антитіл. Де пояснює природу високої імуногенності мелітину: зв’язування з мембрано перетворюс пептид з розчинного антигену в клітинний, здатний довгий час циркулювати крові. Показано, що зв’язування антигенної детермінанти пептиду з антитілом ст; суттєвою перешкодою для вбудовування мелітину в фосфоліпідний бішар та формувант ним каналолодібних структур.

Встановлена залежність між первинним конформаційним станом мелітину (та йоі синтетичних похідних) у розчині та ступенем їх агрегації в структурі пори, сформованої мембрані. Показана можливість існування двох форм (димер та тетрамер) мембране зв’язаного пептиду.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати поглиблюю; уявлення про характер взаємодії мелітину з модельними та природними мембранам] пояснюють природ)’ його біологічної дії, а також дозволяють ставити нові проблем фундаментальної біохімії мембран. Практичне значення цієї роботи полягає в можливіс використання мелітину для пошуку та створення гібридних біфункціональних молек) цілеспрямованої дії як фармакологічних агентів в терапії ряду тяжких патологічних стан організму.

з

Аппобаиія роботи. Дисертаційні матеріали було викладено та обговорено на 20th seting of the Federation of European Biochemical Societies (Budapest, 1990); 16th International ingress of Biochemistry and Molecular Biology (New Delhi, 1994); 1-му Українському >фізичному з’їзді (Київ, 1994); W.Mejbaum-katzenellenbogen’s Seminars in Molecular >logy (Wroclaw, 1996) та на наукових конференціях Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна іНУ. '

Публікаиії. За матеріалами дисертації було надруковано 3 статті та 6 тез.

Структура та об'єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 123 сторінках гкарського тексту та складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів :лідження, результатів та їх обговорення, заключної частини, висновків, списку основної гратури, що містить 155 посилань на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Робота ^ілюстрована 20 рисунками та 1 таблицею.

Конкретний особистий внесок дисертанта. Експериментальна частина роботи, бір та аналіз літературного огляду виконані дисертантом особисто. Обговорення ультатів проведено спільно з науковим керівником та співробітниками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі дисертаційної роботи подано літературний огляд сучасних уявлень то структури, фізико-хімічних властивостей та механізму дії основного мембрано-ивного пептиду бджолиної отрути - мелітину. Обговорено основні протиріччя, які :уються головним чином конформації мембранозв”язаного пептиду, ступені його :гації та орієнтації відносно фосфоліпідного бішару.

У другому розділі висвітлюються останні літературні дані щодо біфункціональних •адресованих токсинів, які знайшли своє застосування у розвитку нетрадиційної терапії Y тяжких захворювань. Розглядається можливість практичного використання мелітину у іді таких гібридних молекул.

Третій розділ описує матеріали та основні метода дослідження, а у четвертому -ведені основні результати та їх обговорення.

МАТЕРАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Отримання високоочвшеного rwenanamv мелітину ms його ósaziaenmie. Грубу <лію мелітину отримували з отрути медоносної бджоли шляхом гель-фільїрації та тообмінної хроматографії /Maulet Y. et al., 1980/. Заключну очистку мелітину юдили за допомогою високоспецифічного імуносорбенту, що містив моноклональні тіла проти пептиду. Фрагменти мелітину отримували шляхом розділення в системі С продуктів протеолізу пептиду-

Отримання F¿ та ^-фрагментів моноклональных антитіл проти мелітиі Моноклональні антитіла (мАт) проти пептиду виділяли шляхом афінної хроматографії асцитної рідини мишей, імунізованих мелітином. Джерелом мАт, які належали до кла lgGj, була гібридома, стримана Єфстовим К А. в лабораторії біотехнології Кримсько медичного інституту. Fab та Fc-фрагменги антитіл отримували шляхом папаїново гідролізу, згідно /Брок 1., 1979/. Активність антитіл та їх фрагментів, а також виявден епїгопів мелітину оцінювали в постановці ELISA за стандартною методикою.

Еяектвонно-міквосхапічні дослідження. Взаємодію між антитілом та пептидом, вб дованим в модельну мембрану, досліджували методом негативного контрастування допомогою антитіл, мічених колоїдним золотом /Голобородько В.Н. и др. 1986/. Як ко троль, використовувались неспецифічні імуноглобуліни та антитіла проти фосфоліпази А;

Отримання фосйатидилхоліну та л'тосом. Фосфатидилхолін екстрагували з яєчк жовтків за методом /Bligh, Dyer, 1959/. Чистоту фосфоліпіду контролювали за допомого двохмірної тонкошарової хроматографії /Латиигев, 1980/. Моноламелярні ліпосоми діаметром 80-100 нм отримували ультразвуковим дезінтегруванням суспензії ліпіл протягом 10 хвилин при 22 000 Гц на диспергаторі MSE-150 WT (Англія). В експеримент з флуоресцентним барвником кальцеїном дезінтегрування проводили в його присугнос Концентрацію ліпіду в ліпосомах визначали за загальним вмістом фосфору, згідно /Chi P., 1956/. Фракційно-дисперсний аналіз везикул за розміром проводили на інформаційні обчислювальному комплексі Malvern Zetasizes 3 за допомогою методу спектроског оптичного змішування /Лебедев та інші, 1987/.

Вивчення літтної та гемолітичної активності мелітину та його синтетичні похідних. Синтетичні гібридні пептиди були отримані твердофазним методом Кауров;: ОА. (ін-т ОЧБП, м. Санкт-Петербург) та люб’язно надані Наволоцькою О.В. (ін імунології, Любучани, Росія). Літичну активність пептидів вивчали методо концентраційного гасіння флуоресценції калькеїну. Гемолітичну активність оцінювали вимірюючи на спектрофотометрі СФ-26 оптичну густину гемоглобіну (Хпога=540 нм вивільненого з еритроцитів після їх інкубації (37°С, 30 хвилин) з пептидами.

мелітином та мАт. БЛМ формували з загальних ліпідів мозку бика (4% розчин ліпідів н-октані) за методом Мюллсра /Mueller, 1962/. Струм крізь мембрану реєстрували в режю фіхсації потенціалу при кімнатній температурі.

Радіореиепторний аналіз 125І-мічеиих пептидів. Специфічне зв’язування 125І-мічени пептидів із <Х2-інтерферону та інтерлейкіяу-2 з тимоцитами мишей оцінювали згідн /Зайцев C.B., 1985/. Для визначення параметрів специфічного зв’язування міченії пептидів (kj-константи дисоціації комплексу мічений ліганд-рецептор та кі - констант інгібування) проводили аналіз графіку Скетчарда в модифікації Берсона та Ялоу /Ткачу В .А., 1983/.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Огримаияя иирпкпочитеного препарату мелгпщу. Проблема отримання високоочище-

о препарату мелітину полягає в тому, що виділений за стандартною методикою пептид жди має залишки фосфоліпази А2, яка теж входить до складу бджолиної отрути та 'являє з мелітином синергічну дію на мембрану. Тому нами був синтезований високо-цифічний сорбент, в якому моноклональні антитіла проти пептиду були імобілізовані гідразидну похідну сефакрілу Б-ІООО ОАА через активовану карбоксигідратну шоненту Рс-фрагменту антитіл. Треба відзначити, що відбір клонів при отриманні мАт водився за допомогою синтетичного мелітину і це виключало можливі перехрестні кції антитіл з фосфоліпазою А2. В результаті проведених експериментів був виділений парат мелітину, який не містив залишків фосфоліпази, і саме він був застосований для альших дослідженнь взаємодії мелітину з природішми та штучними мембранами.

Локаліладія аятетеиинх аететмінант мелітият. вбудованого в модельну мембрану. эмо, що індукована бджолиним укусом реакція вивільнення гістаміну з тучних клітин ’язана, поряд з іншими факторами, з цитотоксичними та алергічними властивостми ітину /Гущін І.С., 1990/. Високу імуногенність пептиду можна пояснити, виходячи як труктури самого мелітину, так і з особливостей його взаємодії з клітиною. Можливо, при зв’язуванні з фосфолілідним бішаром, наприклад, з ліпосомою, яку ми вибрали як ель природної мембрани, пептид орієнтується в ній таким чином, що його антигенні ;рмінанти експоновані в оточуюче середовище та доступні дії антитіл. Тоді, завдяки {валентності антитіл, ліпосоми збільшаться за розміром, внаслідок взаємодії антитіл з екулами антигенів, розташованих на різних везикулах, як це представлено на схемі:

Цей процес можна реєструвати як прямим методом електронної мікроскопії, так і эямим - спектроскопії оптичного змішування, який дозволяє вимірювати розміри инок. На рисунку 1 приведена гістограма розподілу за розмірами мелтга-ліпосомаль-комплексів в залежності від концентрації в суміші мАт проти пептиду. И, - молярне відношення ліпід-пептид. Добре видно, що як при низькій (А), так і лри високій (Б) йй силі, тобто, при різному первинному конформаційному стані мелітину (мономер чи амер), спостерігається загальна тенденція до збільшення розмірів частинок. Так, якщо дній діаметр вихідних ліпосом складав 103.3 км (низька йонна сила), а в присутності тину №=100) він досягав 147.7 нм, то додавання мАт (молярне співвідношення

антиген-антитіло 1:1) приводило до значного збільшення діаметру везикул - 420 нм. Ме: тин, попередньо інкубований з надлишком чи еквімолярною кількісно антитіл при 37 протягом 15 хвилин, не чинив суттєвого впливу на гідродинамічні параметри ліпосом, і вказувало на нездатність пептиду в складі імунного комплексу вбудовуватись в фосфо. підний бішар. Враховуючи, що основна антигенна детермінанта мелітину локалізована його С-кінцсвій частині (постановка ELISA з фрагментами пептиду), можна припуспп що її зв’язування з молекулою антитіла стає перешкодою для первинного процесу заяк рення мелітину в мембрану, яке обумовлене електростатичною взаємодією позитивно зар дженкх аміногруп пептиду з негативно зарядженими фосфатними голівками фосфоліпідй

Рис. 1 Гістограма розподілу за розмірами ліпосої. фосфатидияхоліну (ФХ) під впливом мелітад мономеру (А), тетрамеру (Б) та мАт проти пептид;

1. Ліпосоми (ФХ);

2. ФХ + мелітин (М) (Ri=10Q)

3. ФХ + мАт;

4. (ФХ+М (Ri—100)) +мАт (1:0.25);

5. (ФХ + М (Ri=100)) + мАт (1:1);

6. ФХ + (М + мАт (1:0.25), інкубація 15 хвилин, 37°С).

Отримані дані були підтверджені прямими електронно-мікроскопічними дослідах нями, в яких комплекси антиг-ен-антитіло безпосередньо виявляли за допомогою антиті мічених колоїдним золотом. На рис. 2 приведені фотографії, які відображають стан ліп сом з димиристоїлфосфатадилхоліну після обробки їх мелітином (R¡=100), а потім мічек ми поліклональними антитілами проти тпрамерної форми пептиду. Дослідження провод лось при Rj—100, тобто, при умовах, коди, як було показано раніше, практично весь меі тин зв’язаний з мембраною та впливає на її структуру та властивості. Як видно з рисунк вже саме додавання мелітину приводить до збільшення розмірів вихідних ліпосом (2а), рахунок злиття їх мембран (26). В присутності ж антитіл спостерігається подальше збіл шення розмірів везикул та їх агрегація. При негативному котрастуванні на поверх ліпосом виявляється значна кількість частинок колоїдного золота, причому, мічені антит ла, як правило, розташовуються уздовж кордону поверхні частинок (2в, локалізація золо вказана стрілками). Це можна пояснити лише, виходячи з міркувань про специфічну вза модію антитіл з молекулами антигенів, розташованих на різних везикулах. Саме по со додавання мічених антитіл до вихідної суспензії ліпосом не впливає на їх стан (2г).

Таким чином, застосування двох незалежних методів дозволило нам вперії отримати прямі докази того, що мелітин, взаємодіючи з мембраною, орієнтується в н так, що основна антигенна детермінанта пептиду експонована в оточуюче середовиш

Рис. 2 Взаємодія іюліклональних антитіл, мічених колоїдним золотом, з мелітином, вбудовані™ в ДМФХ-ліпосоми:

а) - суспензія вихідних везикул (зб. х 48 250);

б) - фузогекіїий ефект мслітину (зб. х 93 150);

в) - агрегація лілосом в результаті утворення комплексу

мелітин- антитіло (зб. х 173 600);

г) - вихідні ліпосоми, інкубовані з міченими антитілами

проти пептиду (зб. х 48 250).

та доступна дії антитіл. Цс пояснює природу високої імуногенноеті мелітину: зв'язування а мембраною перетворює пептид з розчинного антигену в клітинний, здатний довгий час циркулювати в крові та індукувати синтез антитіл.

Вплив мелітину та його синтетичних дохідних на проникливість модельної _тя поиролно? мрмйряии. До цього часу відкритим залишається питання про ступінь аїрегздії пептиду в структурі пори, утвореної ним в мембрані. В літературі обговорюються як протилежні моделі (мономер або тетрамер), так і проміжні, які допускають різну ступінь його олігомеркзації. Вирішуючи це питання, ми вивчали вплив первинного конформацій-ного стану мелітину на процеси його вбудовування в ліпосому. Був використаний метод концентраційного гасіння флуоресцентного барвника кальцеїну, який дозволяє по вивільненню барвника, що знаходиться у внутрішньому об’ємі везикул, судити про зміни в проникливості фосфоліпідного бішару. На рис. З приведена кінетика вивільнення кальцеїну з ФХ ліпосом при низькій (1, 2, 3) та високій (Г, 2’, 3 ) йонній силі. Як видно з рисунку, швидкість та максимальний % вивільнення кальцеїну залежать як від конформації мелітину в розчині, з якої відбувалось вбудовування, так і від молярного співвідношення

Рис.З Кінетика вивільнення кальцеїну з ФХ-ліпосом під впливом мелітину в умовах низької (1;2;3) та високої йонної сили (1;2’;3).

Молярне співвідношення ліпід-пептид складало:

200(1, 1’); 100 (2, 2’);

50 (З, З').

Якщо допустити, що лімітуючою стадією процесу вбудовування мелітину в фосфо-ліпідний бішар являється формування олігомерного каналу, то доцільно проаналізувати залежність величиїві граничного звільнення барвника із везикул від концентрації пептиду (рис. 4а). Добре видно, що отримані криві мають З-подібну форму і одним із можливих шляхів аналізу таких залежностей “дсза-ефект” є їх лінеаризація в координатах Хілла, де тангенс кугу нахилу прямих (коефіцієнт Хілла) в ідеальному випадку вкаже на кількість молекул мелітину, які приймають участь в створенні кінцевого продукту - водної пори. Використовуючи такий підхід, ми встановили (рис. 46), що уявне значення коефіцієнта Хілла для мелітину, вбудованного в мембрану в умовах низької (1) та високої (2) йонної сили, відрізнялось майже в 2 рази та складало приблизно 2 та 4 відповідно. Це означає, що первинний конформаційтш стан пептиду визначає ступінь його олігомеризації, достатню для формування водної пори. Іншими словами, мелітин, який знаходиться у розчині у

гляді мономеру, повинен асоціювати на мембрані до димеру, в той час як тетрамер вже л по собі являється самостійною провідною структурою.

Рис. 4 Вплив рі'зккх концентрацій мелітину на величину граничного вивільнення каль-цеїну в умовах низької (1) та високої (2) йонної сили - а) та його представлення в координатах Хілла - 6)

Звідси стає зрозумілою різна швидкість вивільнення хальцеїну з ліпосом при різній пай силі, але при однаковій концентрації пептиду, наприклад, при 11;= 100 (рис. 5). Як дао з рисунку, швидкість вивільнення барвника вища при умовах високої йонної сили, їу що за одиницю часу крізь пору, створену 4 молекулами мелітину, вийде більша кіль-гь кальцеїну, ніж через пору, створену димером. В той же час, максимальне вивільнення івника (в % відношенні) буде вище при низькій йонній силі, бо при однакових іцентраціях мелітин-мономер, вбудовуючись в мембрану, створить теоретично в 2 рази ьще пор, ніж тетрамер, що і приведе до охоплення більшої кількості ліпосом.

Рис. 5. Залежність відношення інтенсивностей флуоресценції від часу для мелітину-мономеру (1) та тетрамеру (2).

І - інтенсивність в даний момент часу; Ітах - інтенсивність при насиченні. Яі = 100

Підтвердженням цьому служить проведений нами порівняльний аналіз літичної «ності синтетичних похідних мелітину, синтезованих твердофазним методом, ліджувались похідні мелітину, в яких гідрофільна С-кінцева частика пептиду була івдена функціонально активними фрагментами імуномодуяяторів - оу-інтерферону та рлейкіну-2 :

-8 0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5

- СМ]. мелітин /1-26/ - інгерлейкін-2 /27-35/

[ М/1-26/ 1

КН}+-01Пі-..-Ьу52і+-АгВ22+-Ьу523+-Аг524+'01П25-01П2б -Пе-01у-Азп-/Ьп-Туг-Ьузз2+-А$п-Рп)-1у5з5,-ОН [ ІЛ2 /27-35/ ]

- СМ2 : мелітин /1-21/ - іятерлейкін-2 /27-35/ .

Ш3+-01пі-...-Ьу57+ -...-Ьу52і+ - Пе-ау-^п-Ат-Туг-Ьу.^-Ахп-Рго-Ьухзо^—ОН

І М /1-21/ ] [ ІЛ2 /27-35/ ]

- М-ІТ* : мелітин /1-21/- інтерферон /131-138/

КНз+-01гц-...-Ьу57+ -...-Ьу52і+ - Ьги-Ьув23+-С1и-Ьу525+-1уэ2б+-Туг-5ег-Рго-ОН

[ М /1-21/ ] [ ІТ-8 /131-138/ ]

Як видно, спільною для усіх цих пептидів залишилась незмінна гідрофобна частин мелітину, модифікація торкнулась тільки С-кінцевої частини, причому, в першу черг величини позитивного заряду та його густини. Виходячи з структурних особливостей мелі тину, можна припустити, що ці дві величини будуть мати суттєве значення для прояв літичної дії таких гібридних молекул. Дійсно, як свідчать дані, приведені на рисунку 6г найбільша активність спостерігалась у нативної молекули мелітину, яка мала локальний (+)-заряджсний кластер, на відміну від, наприклад, СМ-2 та М-ІТ8, які містили аб менший заряд, або локально розподілений. Гібридна молекула СМ-1, незважаючи н сумарний заряд 6(+), була менш активна, ніж мелітин, певно, тому, що заряд розподіленні на більшій відстані та його локальна густина нижча. Оскільки експеримент проводився умовах низької йонної сили, при якій пептиди знаходились в мономерному стані, загаль ним показником для усіх гібридів стало значення коефіцієнта Хілла, що дорівнювало 2. Ц вказувало на димерну організацію пептидів в структурі пори (рис. 66).

Рис 6. Порівняльний аналіз кривих “доза-ефект” нативного мелітину та його синтетичних похідних: СМ-1, СМ-2 та МЕ-ІТв - а), а також його представлення в

координатах Хілла - б)

Адекватність використання ліпосом, як моделі природної мембрани, підтвердив проведений нами порівняльний аналіз гемолітичної активності мелітину та його синтетичних гібридних молекул (рис, 7а). В умовах, які наближені до фізіологічних (140 мМ ИаО, 10 мМ тріс-НСІ, 1 мМ ЕДТА, pH 7.4), усі пептиди переважно знаходяться у мономерній формі, про що свідчать максимуми їх власної тритофанової флуоресценції (Хфл*350нм). Найбільш яскраво гемолітична активність виражена у натжвної молекули мелітину, тоді як дія химер проявляється при більш високих концентраціях. Загальним показником для усіх використаних пептидів стало значення коефіцієнта Хілла, яке, як і в попередніх дослідах, становило 2. Останнє вказувало на те, що структурною одиницею гібридів, зв’язаних з еритроцитарною мембраною, є димер (рис. 76).

Рис. 7 Гемолітична активність мелітину, СМ-1 та СМ-2 - а) та її представлення в координатах Хілла - б)

Таким чином, дослідження літичної та гемолітичної активності мелітину та його синтетичних похідних дозволило сформулювати гіпотезу про вплив первинного конформаційно-го стану пептидів на ступінь їх агрегації в структурі пори, створеної в мембрані. Такий підхід, по-перше, дозволяє врахувати тісний взаємозв’язок між; умовами експерименту та структурними властивостями мембранозв’язаного мелітину. По-друге, він пояснює ті численні суперечності, які виникають у дослідників, що використовують різні методичні підходи.

Як відомо, /Dawson, 1978/, первинним етапом взаємодії мелітину з мембраною шляється його “заякорення” в фосфоліпідний бішар завдяки позитивно зарядженій С-сінпевій частині молекули. Можливо, що зв’язування цієї частики, наприклад, з молеку-юю антитіла, може стати критичним моментом у подальшому функціонуванні мелітину як ситотоксичного агенту. Так, реєстрація кінетики вивільнення кальцеїну із ліпосом в [рисутності мелітину та моноклональних антитіл проти нього виявила нездатність пепти-у, зв’язаного з антитілами, змінювати проникливість фосфоліпідного бішару. При цьому утгєвим є як час предінкубації мелітину з антитілами, так і молярне співвідношення нтиген/ангитіло. Цікаво відмітити (рис. 8), що імунний комплекс, створений при 2-х 'ратному надмірі антигену {молярне співвідношення мелітин/антитіло = 1/0.25 чи 1/0.5 у

випадку Раь-фрагментів; (К;=100)], чинив такий хе ефект, як і вільний пептид при 1^=200. Тобто, 50% молекул мелітину, які приймають участь в створенні комплексу, втрачають здатність зв’язуватись з мембраною і формувати каналоподібні структури. Це підтверджується експериментами, де було використано еквімолярне співвідношення мелітин/ антитіло чи надлишок антитіл. В цьому випадку фосфоліпідний бішар не пошкоджувався та вивільнення кальцеїну не реєструвалось.

Рис. 8 Кінетика вивільнення кальцеїну із ФХ-ліпосом під впливом:

1. Мелітину (Ri= 100);

2. —//-- та Fab-фрагментів (1/0.5);

3. //— та мАт (1/0.25);

4. Мелітину (R, = 200);

За 100% прийнято вивільнення барвника під впливом тритону Х-100.

Таким чином, взаємодія між мелігином та антитілом, яка відбулася до вбудовування пептиду в мембрану, стає суттєвою перешкодою для цитолітичної активності пептиду. Проте залишалось невідомо, як присутність антитіл впливає на властивості пори, створеної пептидом, який вже вбудувався в фосфоліпідний бішар.

Вплив моноклоиальакх антитіл на індуковану мелітином провідність бішачової ліпідної мембрани (БЛМ). Згідно літературні« даних Дойезоп М. ег аі., 1981; Ра\УІак М. й аі., 1991/, мелітин змінює основні параметри БЛМ, зокрема, провідність, селективність та вольт-амперну характеристику (ВАХ). Оскільки антитіла проти пептиду можуть зв’язуватись з мелітином, вбудованним у ліпідний матрикс, важливо було з’ясувати, чи змінюються в присутності мАт властивості іоипровідних структур, створених мелітином в мембрані. Так, внесення антитіл з боку аплікації мелітину приводило до зупинки росту трансмембранного струму, індукованого пептидом, але при цьому його значення не зменшувалось, а залишалось постійним (рис. 9, А). Це вказує на те, що мАт впливають тільки на вільний, ще не зв’язаний з мембраною пептид, та не змінюють властивостей пор, створених вже вбудованим мелітином. У випадку попередньої інкубації пептиду з надлишком антитіл зміни у трансмембранному струмі ке спостерігалися взагалі. Це ще раз підтверджує факт про нездатність мелітину у складі імунного комплексу вбудовуватись в мембрану та формувати іокпровідкі структури.

Для характеристики властивостей мелітин-індукованої іонпровідної структуру в БЛМ була знята її вольт-амперна характеристика. На рисунку 9, Б (1.) приведена найбільш типова її форма, яка являється нелінійною та асиметричною. Така поведінка ВАХ, у випадку БЛМ з нейтральних ліпідів, головним чином витікає із структури самого пептиду,

який має локальний (+)-заряджений кластер на С-ківдевій частині молекули. Оскільки антигенна детермінанта мелітину знаходиться на її С-кінцевій частині, то логічно було припустити, що її зв’язування з антитілом може привести до зміни ВАХ. Всупереч очікуваному, додавання мАт до мсмбранозв’язаиого пептиду практично не змінювало ВАХ (2.). Це означає, що взаємодія антитіл з мелітином, вбудованим у фосфоліпідний бішар, не приводить до екранування поля позитивних зарядів амінокислотних залишків Lys та Arg і властивості іонпровідних структур не змінюються.

І. au

А Б

Рис. 9 Кінетика росту провідності БЛМ (А) та її вольт-амперна характеристика (Б) під впливом мелітину (М) та моноклональних антитіл (АТ) проти нього. Стрілками позначені моменти внесення пептиду та антитіл в цис-відсік ячейки.

Таким чином, наші дані, отримані на іншій модельній системі, плоских ліпідних бішарах, по-перше, ще раз підтвердили факт нездатності мелітину, зв’язаного із своїми специфічними антитілами, вбудовуватись в мембрану та створювати каналоподібні структури. По-друге, вони показали, що іонпровідні властивості пори, створеної пептидом, не змінюються в присутності антитіл.

Дослідження властивостей біфупкшоиальних переадресованих токсинів на основі мелітину та імтвомодтляторів. Завдяки своїй унікальній структурі, характерними рисами

[кої є амфіфіяьна а-епіраль та (+)-заряджена С-кінцєва частина, мелітин має неспецифіч-іу активність, тобто, руйнує мембрани будь-яких типів клітин. Проте, якщо цю частину юлекули пептида замінити на який-небудь білковий ліганд, наприклад, фрагмент імуно-юдулятору, то це може забезпечити вибіркове зв’язування такої гібридної молекули тільки відповідним рецептором. Така химерна молекула представляє практичний інтерес, бо мо-:е стати основою для створення так званих біфункціональних переадресованих токсинів, їатних, завдяки селективній пептид-рецепторній дії, цілеспрямовано діяти на клітини-ішені та викликати їх руйнування. Вони можуть бути використані з метою знищення чітии, які за якимись обставинами стали чужимим дія організму та являються причиною

гч

виникнення ряду тяжких захворювань, до числа яких належать онкологічні, аутоімунні та

СНІД.

Природно, що такі химерні молекули повинні мати як літичну дію мелітину, який є функціональною частиною гібриду, так і рецепторні властивості імуномодуляторів, що виступають як адресні мітки та забезпечують доставку молекули до клітини-мішені.

Проте, перш ніж створювати біфункціональні агенти на основі мелітину, необхідно було з’ясувати доцільність його застосування як функціональної частини. Тому першим етапом роботи в цьому напрямку стало вивчення впливу мелітину на рецепторні властивості двох синтетичних пептидів - фрагментів з аг-інтерферону та інтерлейкіну-2.

Аналіз специфічного зв’язування міченого пептиду 125І-ІТ-8, який відтворює властивості цільної молекули інтерферону, з тимоцитами миші показав наявність на поверхні цих клітин одного класу рецепторів до пептиду з дуже високою спорідненістю -ка = 4.2х10'12М (рис. 10а) /Ісаев 1. та ін., 1990/. Попередня інкубація чи одночасне додавання до суспензії тимоцитів міченого ІТ-8 та мелітину приводило до зниження к<і комплексу мічений ІТ-8-рецептор - 9х10'9М (рис. 106). Однак, як видно, ця спорідненість залишалась досить високою, що і дозволило припустити доцільність створення на основі мелітину та фрагментів імуномодуляторів гібридних молекул.

Рис. 10 Аналіз в координатах Скетчарда специфічного зв’язування Ш1-ІТ8 з тимоцитами миші - а) та в присутності 3.3 мкМ мелітину - б).

По осі абсцис - молярна концентрація 125І-ІТ8,

зв'язаного з тимоцитами; по осі ординат - відношення концентрацій зв'язаного та вільного П5І-ІТ8.

Такі молекули були синтезовані, і їх літичні властивості вже були розглянуті. Що стосується рецепторних властивостей, то ІТ-8, наприклад, у складі такого гібриду зберігав свої рецепторні властивості з ка = 1хЮ"10М, тобто, мав досить високу' спорідненість до свого рецептору, а фрагмент з інтерлейкіну зв’язувався дещо слабкіше.

Висока афіннісгь досліджуваних молекул до рецепторів на тимоцитах і відсутність такої у нативного мелітину дозволили припустити, що цитотоксичність гібридів проявиться при значно менших концентраціях, ніж у мелітину. Проте, токсичність химер по тесту з трипановим синім виявилась не тільки не вища, але навіть суттєво нижча. Так,

і£>50> яка відповідає концентрації пептидів, при якій спостерігається 50% загибель тимоцитів, для нативної молекули мелітину складала 5х10'7М, а для химер близько 4х10‘ 6М. Але така концентрація виявляється літичною не тільки для тимоцитів, але і для будь-якого типу клітин, тобто мова йде про неспецифічний лізис. На перший погляд, в даному випадку не реалізується одна з головних вимог до біфункціональних переадресованих токсинів - їх висока токсичність до певного типу клітин-мішеней. Проте, такі результати можна було очікувати і далі пояснити, виходячи з запропонованої нами гіпотези про ступінь олігомеризації мелітину, яка необхідна для створення каналоподібної структури. Як було показано, пептид, який знаходиться у розчині в стані мономеру (а в даних умовах, наближених до фізіологічних, він є мономер), для проявлення своєї літичної дії повинен асоціювати як найменш до димеру. Низька ж концентрація химерних молекул забезпечує їх зв’язування з рецептором, але не дає змоги асоціювати на поверхні мембрани.

Можливо, подальший пошук експериментальних умов, які визначають димерну чи тетрамерну структуру мелітину, або синтез нових молекул з поліпшеними властивостями дозволять у майбутньому використовувати пептиди на основі мелітину як терапевтичні агенти. Адже, як свідчать отримані нами результати, синтетичні гібридні молекули СМ-2 та М-Щ зберігають як літичну активність мелітину, так і високу афіннісгь до своїх рецепторів з боку фрагментів імуномодуляторів.

ВИСНОВКИ

1. Досягнута висока ступінь очистки мелітину, позбавленого залишкової фосфоліпазної активності, завдяки використанню високоспецифічного імуносорбенту, створеного на основі моноклональних антитіл проти пептиду.

2. Вперше отримані прямі експериментальні докази того, що мелітин, взаємодіючи з модельною мембраною, розташовується в ній таким чином, що його основна антигенна детермінанта експонована в оточуюче середовише та може взаємодіяти з антитілами. Це пояснює високу імуногенність пептиду.

3. Показано, що зв’язування антигенної детермінанти мелітину з молекулою антитіла стає суттєвою перешкодою для вбудовування пептиду в мембрану та наступних процесів створення каналоподібних структур, злиття та фрагментації фосфоліпідного бішару.

4. Запропонована та обгрунтована гіпотеза про вплив первинного конформаційного пану пептиду на ступінь його агрегації в структурі пори, створеної в ліпідному бішарі ■іембран. Показана можливість існування двох форм (димер та тетрамер) мембрано-ів’язаного мелітину.

5. Проведено порівняльний аналіз літичної (по відношенню до ліпосом) та емолітичної активності синтетичних похідних мелітину, що дозволяє досліджувати

взаємозв’язок між їх структурою та функцією. Показано, що величина та густина позитивного заряду на гідрофільній С-кінцевій частині молекули пептиду визначає ефективність взаємодії мелітину з мембраною.

6. Встановлено, що химерні біфункціональні молекули на основі мелітину та імуномодуляторів зберігають як літичну активність мелітину, так і високу афінність до свого рецептора з боку імуномодуляторів. Це робить можливим пошук та створення на їх основі терапевтичних агентів.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Костржевская Е.Г., Тарасенко А.С., Веклич Ю.И., Щербацкая Н.В. Определение антигенных детерминант мелиттина в модельной мембране // Укр. биохим. журн,- 1992.64, №1,- С. 22-29.

2. Тарасенко АС., Костржевская Е.Г., Щербацкая Н.В. Взаимодействие мелиттина с

модельной мембраною в присутствии антител //Укр. биохим. журн.- 1992.- 64, №4.- С. 2933. ’

3. Костржевська О.Г., Тарасенко А.С., Курлянд Д.І., Щербацька Н.В., Петрина ІД., акад. Терновий К.С. Вплив антитіл проти мелітину на його взаємодію з мембраною // ДАН України.- 1992- 6.- С. 135-138.

4. Kostizevska E.G., Veklich Yu.I., Shcherbatska N.V., Moskalenko A.S. (Tarasenko AS.) Localization of antigenic determinants of melittin in model membrane // 20th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies: Abstr.- Budapest (Hungary).- 1990.- P. 287.

5. Tarasenko A, Kostrzhevska E., Navolotska E. Investigation of melittin-hybrides: binding with receptors of a-interferon and interleukin-2 of murine thymocytes // 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology: Abstr.- New Delhi (India).- 1994.- P. 216.

6. Petrina I., Tarasenko A. Analysis of interaction between melittin and model membranes by means of antibodies // 16th Intemat. Congress of Biochem. & Molec. Biology': Abstr.- New Delhi (India).- 1994,- P. 422.

7. Тарасенко A.C., Костржевська О.Г., Петрина І.Д. Структурна організація мелітину в модельній мембрані// 1-й З’їзд Укр. біофіз. тов. -Тези.- Київ (Україна).- 1994,- С. 228-229.

8. Petrina I., Tarasenko A., Kostrzhevska Е. The use liposomes for analysis of melittin properties in model membranes // W.Mejbaum-katzenellenbogen’s Seminars in Molecular Biology. Abstr.- Wroclaw (Poland).- 1996.- P. 13.

9. Tarasenko A., Petrina I., Kostrzhevska E. Investigation of the aggregation state of melittin bound to phospholipid bilayer // W.Mejbaum-katzenellenbogen’s Seminars in Molecular Biology: Abstr.- Wroclaw (Poland).- 1996.- P. 20.

Тарасенко АС. Особливості взаємодії мелітину з модельними та природними мембранами.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія.- Інститут біохімії ім О.В.Палладіна НАН України, Київ, 1997.

Дисертацію присвячено дослідженню взаємодії літичного мембраноактивного пептиду мелітину з модельними та природними мембранами. Використання полі- та моноклональних антитіл проти мелітину дозволило вперше отримати прямі експериментальні докази, які пояснюють природу високої імуногекності цього пептиду: зв”язування з мембраною перетворює мелітин з розчинного антигену в клітинний з експонованою в водну фазу та здатну взаємодіяти з антитілами основною антигенною детермінантою. Встановлена залежність ступеня агрегації мембранозв”язаного мелітину та його синтетичних похідних від їх первинного конформаційного стану' у розчині. Показана можливість існування двох форм пептиду (димер та тетрамер), зв”язанйго з фосфоліпідним бішаром. Досліджені властивості гібридних молекул на основі мелітину та фрагментів імуномодуляторів - інтерлейкіну-2 та аг-інтерферону. Показана перспектива пошуку і створення на їх основі фармакологічних агентів цілеспрямованої дії, які мають як літичну активність мелітину, так і високу специфічність по відношенню до клітин-мішеней.

Ключові слова: пептид-ліпідні взаємодії, мелітин, ліпосома, біфункціональні переадресовані токсини.

Тарасенко АС. Особенности взаимодействия мелитгина с модельными и природными мембранами.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия.- Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 1997.

Диссертация посвящена изучению взаимодействия литического мембраноактивного пептида мелитгина с модельными и природными мембранами. Использование поли- и моноклональных антител против мелиттина позволило впервые получить прямые жспериментальные доказательства, объясняющие природу высокой иммуногенности этого іептида: связывание с мембраной превращает мелитгин из растворимого антигена в легочный с экспонированной в водную фазу и способной взаимодействовать с нтителами основной антигенной детерминантой. Установлена зависимость степени грегации мембраносвязанного мелиттина и его синтетических производных от их ервоначального конформационного состояния в растворе. Показана возможность ^шествования двух форм пептида (димер и тэтрамер), связанного с фосфолипидным тслоем. Исследованы свойства гибридных молекул на основе мелитгина и фрагментов імуномодуляторов - интерлейкина-2 и аг-интерферона. Показана перспектива поиска и

создания на их основе фармакологических агентов целенаправленного действия, обладающих как литической активностью мелигшна, так и высокой специфичностью по отношению к клеткам-мишеням.

Ключевые слова: пептид-липидные взаимодействия, мелитгин, липосома,

бифункциональные переадрессованные токсины.

Tarasenko A. S. Peculiarities of the interaction of melittin with model and natural membranes.- Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of sciences by speciality 03.00.04 - biochemistry.-A.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1997.

The dissertation is devoted to the investigation of interaction of lytic membrane-active peptide melittin with model and natural membranes. Using poly- and monoclonal antibodies against melittin, the first direct experimental data explaining the nature of high immunogenecity of this small peptide were obtained. It was shown that the binding with membrane transforms melittin from soluble antigen to cellular one with main antigenic determinants exposed into aqueous phase and available to action of antibodies. The dependence of the aggregation state of melittin (and its synthetic derivatives) embedded into phospholipid bilayer on its primary conformational state in solution has been established. It was shown that membrane-bound peptide may exist in two different forms, which are dymer and tetramer. A special study focused on the possibility of the practical application of hybrid molecules based on melittin and fragment of immimomodulyators (a2-interferon and interleukin-2) has been done. On the basis of obtained data, it was suggested that such molecules have prospects in developing the pharmacological agents possessing high specificity with respect to binding with specifical target as well as cell lytic activity.

Key words: peptide-lipid interactions, melittin, liposome, bifunctional readdressed toxins.