Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности временной организации биологических свойств изолятов Candida species

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности временной организации биологических свойств изолятов Candida species"

На правах рукоппся

005060385

Николенко Марпна Викторовна

ОСОБЕННОСТИ ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPECIES

03.02.03 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

3 О МАЯ 2013

Оренбург - 2013

005060385

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

Доктор биологических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России

Доктор биологических наук, доцент, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН

Доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Тюменская государственна медицинская академия»

Минздрава России Жданова Екатерина Васильевна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « июня 2013 г. £>9. З-*3 часов на заседании дис-

сертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: orgma dsl@esso.ru. официальный сайт: http//orgma.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА.

Автореферат разослан « Н » 2013 г., автореферат и текст

объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки РФ в сети интернет «Л-Z » ^CCtl^mg 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д. м. н., профессор i-L: аг.к-V— Немцева Наталия Вячеславовна

Тимохина Татьяна Харитоновна

Чайникова Ирина Николаевна

Яценко - Степанова Татьяна Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Грибы рода Candida уникальные микроорганизмы, обладающие колоссальным адаптивным потенциалом и широко распространены в природе (Масюкова С.А. соавт., 2004; Короткова Т.Н., 2006). В организме человека Candida sp. входят в состав различных микросимбиоценозов и часто инициируют развитие оппортунистических инфекций, особенно у пациентов с иммунодефицитными состояниями. Колонизация слизистых оболочек организма человека микромицетами является результатом сим-биотических отношений с макроорганизмом и микросимбионтами в условиях ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В., 2007). Включение в этот симбиоз Candida sp. возможно благодаря различным адаптивным механизмам, проявляющим пластичность физиологических функций в различных условиях окружающей среды.

В настоящее время изучение механизмов адаптации является проблемой современной биологии и медицины, тесно связанной с вопросами биоритмологии, так как ритмы охватывают все проявления живого - от деятельности субклеточных структур и отдельных клеток до сложных форм поведения организма и экологической системы, символизируя саму жизнь (Арушанян Э.Б., 2000). Автономный самоподцерживающий процесс периодического чередования состояний клетки и колебаний интенсивности физиологических процессов с одной стороны, достаточно ста. icli

билен и по возможности независим от многочисленных случайных воздействий, за счет своей внутренней синхронизации, с другой, лабилен и постоянно подстраивается к новой среде обитания (Шмальгаузен И.И., 1983; ГубинД.Г., 2000).

Сведения о факторах адгезии и инвазии С. albicans не дают полной информации о биологии грибов рода Candida. Противоречивы данные о патогенном потенциале и его реализации у С. non-albicans (Васильева Н.В. с соавт., 2002; Карпунина Т.Н. с соавт., 2006; Горбасенко Н.В., 2006). Поэтому использование хронобиологического метода, как мето-

3

дического приема, на наш взгляд, открывает новые перспективы при изучении физиологии Candida sp.

В источниках литературы отсутствуют сведения о суточной динамике ростовых и патогенных свойствах грибов рода Candida, не сформировано представление об их временной организации. Открытым остается вопрос регуляции биологических свойств микромицетов. Не изучена временная организация микросимбионтов при формировании бактериально - грибковых микросимбиоценозов.

Поэтому, комплексный подход с позиции микробиологии и хронобиологии позволяет оценивать резерв саморегуляции микроорганизма и открывает возможности управлять их жизнеспособностью и прогнозировать устойчивость к используемым средствам.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучить особенности временной организации биологических свойств грибов рода Candida и их регуляцию под действием факторов различной природы.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Сформировать представление о временной организации биологической активности эталонных штаммов и клинических изолятов грибов рода Candida, выделенных из различных биотопов здоровых и больных кандвдозом людей.

2. Изучить влияние абиотических и биотических факторов на формирование хроноинфраструктуры физиологической активности Candida sp. в исследованиях in vitro и выявить условия, приводящие к десинхронозу биологической активности грибов.

3. Охарактеризовать роль бактерий, представителей доминантной и ассоциативной микробиоты, в регуляции временной организации биологических свойств клинических изолятов Candida sp. в бактериально грибковых ассоциациях.

4. Выявить ритмометрические критерии, позволяющие оценивать феномен микробного распознавания «свой - чужой» при формировании микросимбиоценозов.

Новизна исследования Впервые проведены фундаментальные многофакторные исследования и представлен комплексный анализ хроноинфраструктуры биологических свойств (пролиферативной, адгезивной, морфологической, фосфо-липазной, протеазной, катал аз ной активности) у эталонных штаммов и клинических изолятов Candida sp.

Доказано, что временные ряды изучаемых свойств у эталонных штаммов - объективная индивидуальная характеристика вида (патент РФ на изобретение № 2319747 от 20.03.2008 года «Способ выявления Candida albicans по биоритмам»).

Экспериментально установлено, что временная организация физиологической активности клинических изолятов Candida sp., полученных из кишечника, зева и влагалища, не зависит от вида гриба и биотопа. Выявлены универсальные ритмометрические характеристики (вклад ритма и амплитудно - фазовая стабильность), различающие штаммы, полученные от здоровых людей от изолятов, выделенных от больных пациентов.

Впервые выявлены факторы, формирующие последовательность и согласованность проявления биологических свойств клинических изолятов грибов рода Candida во времени. Под действием температуры 37 °Сили метаболитов дисбиотической кишечной микрофлоры эталонные штаммы Candida sp. приобрели временную организацию физиологических функций характерную для изолятов, выделенных от здоровых людей. Соче-танное воздействие субфунгиостатических концентраций флуконазола и метаболитов представителей нормофлоры биотопа приводило к формированию хроноинфраструктуры биологической активности Candida sp., характерной для культур, высеваемых при кандидозе.

Выявлена однотипная реакция С. albicans на воздействие регулятор-ных факторов (микросимбионты, флуконазол и их сочетание), проявляющаяся в виде десинхроноза биоритмов физиологических функций, как

5

свидетельство истощения адаптивных возможностей микромицетов к изменяющимся условиям среды.

При изучении in vitro механизмов формирования микросимбиоценоза установлено, что временная организация биологических свойств Candida sp., выделенных из биотопов здоровых людей стабильна и независима от воздействия метаболитов бактерий. Лабильность биоритмов физиологической активности выявлена у грибов, полученных из клинического материала больных людей.

Хронобиологический подход позволил дифференцировать in vitro «свои» и «чужие» микросимбионты при формировании бактериально -грибковых ассоциаций на модели микросимбиоценоза дистального отдела толстого кишечника Амплитудно - фазовая характеристика и среднесуточные значения биологической активности являлись маркерами оппо-зитных (усиление/подавление) взаимодействий в условиях микросимбиоценоза.

Научно-практическая значимость

Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению биологических свойств грибов рода Candida. Совокупность полученных данных о суточной динамике ростовых и патогенных характеристик микромицетов позволяют сформировать представление об их временной организации. Изученные ритмичные процессы, их лабильность под влиянием факторов различной природы, последовательность и согласованность проявления в течение суток расширяют теоретические представления о биологии патогенных дрожжей и их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.

Результаты работы можно использовать для решения фундаментальных вопросов современной микробиологии - изучения механизмов биорегуляции в микросимбиоценозах организма человека. Хронобиологический подход раскрывает механизмы формирования микробиоценозов на основе феномена распознавания «свой - чужой» в бактериально - грибковых ассоциациях.

Практическое значение исследований определяется разработкой ново-

6

го подхода к изучению биологических свойств Candida sp., в том числе С. поп - albicans, позволяющего выявлять периоды высокой экспрессии физиологических свойств в течение суток. Предложенный метод может быть использован в работе научно-исследовательских и практических лабораторий, а также в учебно-педагогическом процессе кафедры микробиологии (акты внедрения результатов диссертационной работы № 03/05 от 12.12.2012; № 01/04 от 07.02.2013 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Хроноинфраструктура, отражающая распределение биологических свойств клинических изолятов Candida sp. в течение суток, имеет отличия по вкладу ритма у грибов, выделенных от здоровых (циркадианный) и больных (ультрадианный) и изменяется, приобретая ритм, отражающий видовую специфичность грибов при культивировании их вне организма.

2. Временная организация биологических свойств Candida sp. формируется под действием факторов биотической и абиотической природы, являясь информативным и универсальным критерием физиологической адаптации грибов.

3. Хронобиологический подход является «инструментом» для изучения механизма микробного распознавания «свой - чужой», основанного на изменении амплитудно-фазовой характеристики физиологической активности микросимбионтов в паре «доминант - ассоциант» в бактериально - грибковых ассоциациях.

Апробация работы 7

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V; VII Всероссийских конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006; 2012); Всероссийских научно-практических конференциях «Оппортунистические микозы. Кандидозы» (Тюмень, 2006; 2011); V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва; 2007); научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН «Медицинская академическая наука - здоровью населения Урала» (Челябинск; 2008); I Междисциплинарном микологическом форуме

7

(Москва; 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009; XVIII Международной научной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь; 2010); Всероссийских научно-практических конференции с международным участием по медицинской микологии (Санкт-Петербург, 2008; 2009; 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 43 научные работы, из них 16 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент на изобретение, опубликовано 1 учебное пособие.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 309 отечественных и 174 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 96 таблицами и 94 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для исследования ритмичности биологических свойств были использованы 18 свежевыделенных клинических изолятов Candida sp. из зева, кишечника и влагалища здоровых и больных кандидозом людей. Контролем служили эталонные штаммы Candida sp. АТСС: С. albicans (24433), С. tropicalis (750) и С. krusei (6258). Выделение и идентификацию грибов проводили по комплексу признаков: внешний вид колоний, хламвдоспорообразование, тест на образование ростовых трубок, чув-• ствительность к антифунгальным препаратам диско - диффузионным методом, ассимиляционная способность (Блинов Н.П. с соавт., 2010).

Биологические свойства Candida sp.: активность адгезии (Брилис В.И. с соавт., 1986), пролиферации (Кашуба Э.А. с соавт., 2006), морфогенеза (Блинов Н.П. с соавт., 2010), фосфолипазы (Тужилин С.А. с соавт., 1975 в модификации Суплотова С.Н. с соавт., 2009), протеазы (Нетрусов А.И.,

8

2005) и каталазы (Бухарин О.В. с соавт., 2000) изучали в течение двух суток с 4-х часовьм интервалом, в зимнее время года, IV фаза Луны.

Влияние температуры на ритмичность физиологических свойств определяли на эталонных штаммах, выращенных на бульоне Сабуро в термостате при 28 °С и 37 °С в течение 24, 36, 48 и 72 часов, с последующим определением общего микробного числа и количества ростовых трубок.

Влияние флуконазола (производитель - Гедеон Рихтер А.О. Будапешт, Венгрия) и сочетанного воздействия флуконазола с метаболитами бактериальных микросимбионтов на биоритмы биологических свойств эталонного штамма и клинических изолятов С. albicans определяли по стандартной методике серийных разведений, используя Vi МПК препарата (Меньшиков В.В., 2003; Кириллов Д.А., 2004). В качестве антимикотика был выбран флуконазол, так как он широко используется в лечении поверхностного и глубокого кандидоза.

Исследование биологических свойств грибов под действием доминантных и ассоциативных бактерий проводили при добавлении стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов) в питательный бульон по методу Н. Н. Елагиной (2001); Н. Б. Перуновой (2003). Изучение межмикробных взаимодействий смотрели на модели дистального отдела толстого кишечника. В качестве доминантов использовали Bifidumbacterium bifldum № 791 («Бифидумбактерин»), ассоциан-тами являлись Lactobacillus acidophilus №1 («Лактобактерин»), Escherichia coli лактозопозитивная негемолитическая 301, Staphylococcus aureus № 104, Escherichia coli № 111 лактозонегативная, гемолитическая, изолированные от пациентов при обследовании на дисбиоз кишечника.

Распознавание «свой - чужой» в паре «доминант - ассоциант» определяли по методике Н.Б. Перуновой (2011).

Результаты исследований получены на основе анализа суточной динамики изучаемых биологических свойств Candida sp. в течение 7 лет. Статистическую обработку материалов и графическое изображение данных осуществляли с использованием программ: Primer of Biostatics Ver-

9

sion 4.03 by Stanton A. Glantz, 1998; Microsoft Office Excel 2010. Определяли M - среднее арифметическое, 5 - среднеквадратичное отклонение, m - средняя ошибка среднего арифметического, данные представляли по форме М±т или М±5. В случае соответствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по %2) использовали t - критерий Стьюдента.

При определении регулирующего влияния экзометаболитов микросимбионтов и антимикотика на биологические свойства грибов, а также результатов суточной динамики биологической активности эталонных и клинических изолятов Candida sp. достоверность различий сравниваемых выборок определяли непараметрическими методами статистической обработки: критерий Уилкоксона (W) применяли для связанных выборок, критерий Манна-Уитни (Т) - для несвязанных выборок. Анализируемые различия считали достоверными при р<0,05. Для установления связи между параметрами использовали метод ранговой корреляции (Гланц С., 1999).

Хронодизайн исследований подразумевал получение по каждой оцениваемой функции 6-ти измерений в сутки с 3-5-ти кратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор - анализ) при заданной значимости достоверности, р<0,05 (Nelson W. et. al., 1979). Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с периодами Т=12 и Т=24 часа: мезор (М) - среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (А) - расстояние от экстремума до мезора и акрофаза (ф) - момент времени ожидаемого экстремума функции.

Для выявления степени межиндивидуальной синхронизации ритмов использован популяционный косинор - анализ. Статистическая обработка проведена с использованием программ «Cosinor Ellipse» (Нопин C.B. с соавт., 2006) и «Косинор - анализ» (Тимохина Т.Х. с соавт., 2009).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Временная организация биологических свойств эталонных штаммов Candida sp.

На первом этапе исследований выявлена суточная динамика биологических показателей всех изучаемых свойств у эталонных штаммов Candida sp., которые длительно культивировались in vitro. При такой изоляции биоритмы могут переходить на собственную частоту, проявляя тем самым свой собственный период, закрепленный в геноме (Ашофф Ю.,1984). Судить о временных закономерностях данной частоты возможно, если периодичность изменений организма сохранялась при изоляции от внешних источников отсчета времени в течение двух циклов (периодов) и более (Дедов И.И. с соавт., 1992).

В ходе экспериментов у штамма С. albicans выявлены ультрадианные ритмы пролиферативной, адгезивной и морфологической активности (вклад ритма - 57,6 %; 44,8 %; 47,0 %; р<0,05 соответственно). Ведущим ритмом активности фосфолипазы и протеазы являлся циркадианный ритм (вклад 74,2 % и 73,4 %; р<0,05) с максимумом в утреннее время -04.35 - 07.20 часов. Для каталазной активности была характерна цирка-дианная ритмичность с 12-ти часовыми гармониками. Наличие цирка-дианных ритмов у микроорганизмов одновременно с ультрадианными гармониками указывало на усиление их адаптивных возможностей, что доказано на примере грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов (Тимохина Т.Х., 2011).

Выявленная временная организация биологических свойств была закономерна для каждого вида грибов. Хронологические ряды физиологической активности эталонного штамма С. albicans характеризовались утренним типом ритмичности (рис. 1) с идентичными значениями мезора, амплитуды и акрофазы в первые и вторые сутки исследований. Максимальная активность представителей данного вида регистрировалась во временном диапазоне с 03.00 до 12.00 часов: в ранние утренние часы -максимальная адгезивная способность, секреция ферментов патогенно-

сти (фосфолипазы, протеазы, каталазы) и формирование ростовых трубок; в дневное время - максимальная пролиферативная активность.

Небольшая площадь эллипсов и относительно узкие доверительные интервалы акрофаз активности адгезии, каталазы и фосфолипазы указывали на высокую стабильность основных параметров их ритмов.

Хронобиологическим методой выявлены физиологические особенности С. поп-а1Ысап8. Обнаружены циркадианные колебания всех изучаемых показателей. Активность каталазы регистрировалась, как и у С. а1Ы-

Рис. 1-3. Амплитудно-фазовая характеристика суточных ритмов биологических свойств С. albicans 24433 (рис. 1), С. tropicalis 750 (рис. 2), С. krusei 6258 (рис. 3); Т = 24.

Примечание: 1) пролиферация; 2) адгезия; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-за; 5) протеаза; 6) каталаза.

Местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства - амплитуд и фаз) отражают временную область проявления ритма по результатам популяционно-го косинор - анализа. По окружности - время суток, градусная мера суточного цикла, 24 часа = 360°. По радиусу от центра - единицы измерения амплитуды.

Для грибов С. non-albicans характерна синхронизация показателей активности адгезии и каталазы. Временные ряды биологических свойств С. tropicalis характеризовались дневным типом ритмичности, а С. krusei -вечерним и ночным типом. Определена последовательность проявления максимальной активности у С. tropicalis с 08.00-13.00 часов: ростовые

свойства, секреция ферментов патогенности и морфогенеза, с 15.00-18.00 часов - адгезия и синтез каталазы.

У С. krusei отмечены значительные временные интервалы (с 01.00 до 16.00) отсутствия или проявления минимальной активности физиологических свойств. Реализация биологического потенциала начиналась в 16.00 часов с пролиферации, с последующей максимальной способностью к адгезии, секреции ферментов агрессии и защиты - протеазы, каталазы и фосфолипазы и формированию ростовых трубок.

Для выявления согласованности исследуемых признаков Candida sp. проведен корреляционный анализ. У эталонных штаммов установлена обратная корреляция пролиферации с адгезией (г = - 0,45; р<0,05 у С. albicans; г = - 0,33; р<0,05 для С. krusei), морфогенезом (г = - 0,68; р<0,05 у С. albicans-, г = - 0,50; р<0,05 для С. krusei) и протеазой (г = -0,54; р<0,05 у С. albicans; г = -0,31; р<0,05 у С. krusei). У всех видов грибов выявлена прямая связь между факторами патогенности (адгезивной, морфологической, протеазной, каталазной активностью).

Идентичные результаты были получены в результате нескольких серий 2-х суточных исследований при одинаковых условиях проведения экспериментов.

Таким образом, сформировано представление о временной организации биологических свойств Candida sp. Доказано, что последовательность и согласованность физиологической активности грибов - объективная индивидуальная характеристика вида (патент № 2319747 от 20.03.2008). Периодичность этих изменений, по-видимому, наследственно закреплена естественным отбором. Хроноинфраструктура эталонных штаммов может служить временным нормативом при изучении механизмов адаптации Candida sp. в различных биотопах организма здорового и больного кандидозом человека.

Характеристика временной организации биологической активности клинических изолятов Candida sp., выделенных из биотопов здоровых и больных кандидозом людей

Проведенные исследования показали, что у изолятов С. albicans, выделенных от здоровых людей, вклад околосуточного ритма адгезивной активности варьировал от 56,8 % до 64,0 % (р<0,05). В период времени с 13.30 - 17.30 часов грибы всех исследуемых биотопов обладали высокой способностью к прикреплению, средний показатель адгезии составил 4,0±0,4 - 4,2±0,7. При оценке временных рядов адгезивной активности изолятов С. albicans, выделенных от больных кандидозом, выявлены достоверные ультрадианные ритмы (вклад - 63,9 % - 81,8 %) (р<0,05). Грибы, изолированные при острой стадии болезни, характеризовались высокой адгезивностью (4,9±0,1 - 5,9±0,2) с пиком активности в ранние утренние часы - 04.20 - 08.09 и в вечернее время с 16.00 - 20.00 часов. Полученные результаты согласуются с данным Н.И. Глушко с соавт. (2006); С.А. Лисовской с соавт. (2006); L.J. Douglas et al. (1983), которые установили, что процент адгезии грибов при носительстве меньше, чем в случае выраженного кандидоза.

В спектральном составе биоритмов пролиферативной активности С. albicans, выделенных от здоровых пациентов, доминировал 24-часовой ритм, вклад которого находился в диапазоне от 53,1 % до 78,7 % (р<0,05). Максимум роста регистрировался в вечернее и ночное время с 18.20 до 00.24 часов. Все исследуемые варианты имели схожий профиль ритма. Ритмометрический анализ активности ростовых качеств патогенных изолятов С. albicans, полученных из биотопов больного кандидозом человека, показал ультрадианную ритмичность. В доступном анализу спектре основными достоверными гармониками были ритмы с Т = 12 и Т = 8 часами, которые различались по своему удельному вкладу и основным параметрам - амплитудам и фазовому положению в суточном цикле.

Далее исследовали суточную динамику морфогенеза С. albicans, так как д иморфизм и полиморфизм патогенных грибов считается одним из главных факторов их патогенности, встречающийся только у больных инвазивным кандидозом, в то время как для состояния носительства характерно нахождение грибов на поверхности эпителия (Зеленова Е.Г. с соавт., 2002; Шевяков М.А., 2007). Активность морфогенеза у изолятов

14

C.'albicans, выделенных из биотопов здоровых людей, характеризовалась циркадианным ритмом со стабильными акрофазами в утреннее время 04.04 - 07.10 часов. Среднесуточный показатель находился в диапазоне от 4,6±0,6 % до 15,6±2,7 %. В спектральном составе биоритмов грибов, полученных из биотопов больных кандидозом пациентов, выявлен 12 -часовой вклад ритма (60,0 % - 66,9 %), значения мезора составили 34,4±3,4 % - 60,3±5,8 %, а амплитуда колебаний функции возросла в 2 раза (р<0,05).

Специфическая саморегуляция микробной клетки связана, прежде всего, с ферментативной активностью (Коротяев А.И., 2007), поэтому в данной работе изучали активность фосфолипазы, протеазы и каталазы грибов в течение суток. У изолятов С. albicans, полученных от здоровых людей, выявлен околосуточный ритм ферментативной активности с максимальными значениями в утреннее время с 03.30. до 09.11. часов. Мезор активности ферментов Candida sp., как стабильный ритмометрический параметр, не зависел от биотопа выделения, напротив, такая зависимость выявлена у амплитуды колебаний. Амплитуда фосфолипазной активности С. albicans из вагинального биотопа имела средние значения от 11,4±3,9 ммоль/л»час до 18,8±5,7 ммоль/л*час и превышала этот показатель у дрожжей, полученных из зева и кишечника (средние значения от 5,6±2,4 ммоль/л'час до 10,8±2,8 ммоль/л'час) (р<0,05). Достоверно высокие амплитудные значения протеазной активности проявляли штаммы С. albicans, изолированные из дистального отдела толстого кишечника (0,8 ±0,1 мг/мин-мл - 1,20±0,1 мг/мин-мл) (р<0,05). У микромицетов, выделенных из зева, регистрировалась высокая катал азная активность, амплитуда которой была выше в 2,7- 6,0 раз, чем у грибов, изолированных из кишечника и влагалища (р<0,05).

Биоритмы С. albicans, выделенные от больных острым кандидозом, характеризовались достоверными 12 - часовыми гармониками ферментативной активности с максимальными значениями показателей в дневное и ночное время (р<0,05). Мезор протеазной активности данных штаммов достоверно выше, чем у изолятов, выделенных из организма здорового

15

человека (р<0,05). В других работах также отмечено, что культуры, гпро-дуцирующие высокие концентрации протеазы, вызывали развитие острого кандидоза, а штаммы с низким уровнем продукции этого фермента участвовали в бессимптомной колонизации эпителия (Карпунина Т.И. с соавт., 2006; Ray T.L., 1984). Среднесуточные значения каталазной активности грибов, выделенных из всех биотопов здоровых людей, имели более высокие значения показателя, чем у культур при кандвдозе (р<0,05).

Исследование хроноинфраструктуры клинических изолятов С. поп-albicans вызывало особый интерес, так как по одним данным, биологическая активность присуща только С. albicans, по другим - она резко усилена у этого вида по сравнению с другими. Есть сведения, что грибы С. krusei не способны секретировать ферменты патогенности, либо обладают очень низкой ферментативной активностью (Карпунина Т.И. с соавт., 2006; Ozutsumi К. et. al., 1985), а варианты С. tropicalis могут формировать нити псевдомицелия только через 5-6 суток культивирования на сывороточном агаре (Себряков Е.В., 1966).

Используемый нами методический прием позволил не только выявить наличие активности в течение суток у клинических изолятов С. поп - albicans, но и обнаружить общие закономерности проявления свойств с С. albicans.

У видов С. tropicalis, С. krusei, выделенных от здоровых пациентов, выявлены циркадианные ритмы всех исследуемых показателей (р<0,05), тогда как у грибов, изолированных от больных кандидозом, отмечен ритм с периодом активности меньше 20 часов. Кроме того, у культур С. tropicalis и С. krusei, выделенных от больных людей, аналогично С. albicans, наблюдалось достоверное повышение среднесуточных значений морфогенеза и протеазной активности (р<0,05).

Таким образом, период ритма является универсальным показателем, который подчёркивает различия изолятов Candida sp. здоровых людей от культур, полученных из организма больных острой кандидозной инфекцией. Циркадианные ритмы биологической активности изолятов Candida

16

sp. .'^высокой амплитудой (особенно морфологических и метаболических показателей) и акрофазой в одно и тоже время свидетельствуют о стабильности изучаемых свойств. Чем больше амплитуда, тем труднее индуцировать сдвиг акрофазы (Катинас Г.С., 1989; Reynolds C.F., 1991; Czeisler С.А., 1992). Появление околосуточных ритмов у микроорганизмов, с одной стороны, может быть обусловлено влиянием макроорганизма, как основной среды обитания для Candida Бр.Сдля макроорганизма циркадианный ритм - ведущий и единственный генетически обусловленным в рассматриваемом нами спектральном диапазоне). С другой стороны, обсуждается вопрос о циркадианности в проявлении ряда физиологических функций грибов и формируется доказательная база, объясняющая наличие у них генетической регуляции биоритмов (Беккер З.Э., 1988; Загускин С.Л., 2000; Ноздрин Г.А., 2006).

У клинических изолятов Candida sp., полученных от больных пациентов, ведущим ритмом являлся ультрадианный. К характерным свойствам таких ритмов относятся: вариабельность периодов и способность к адаптивному ответу на периодические раздражители. Будучи нерегулярными, с внешне хаотически чередующимися периодами, ультрадианные ритмы устойчивы по набору своих колебаний (Сергеева Э.П., 1987; Нечаева Н.В. с соавт.,1989; Kippert F., 1987; Lloyd А. et al., 1993). Изучение изменений соотношения ультра- и циркадианных компонентов в спектральном составе, которое при различных воздействиях окружающей среды не является стационарным, дает возможность отличать патологические нарушения хроноинфраструктуры от приспособительных изменений (Губин Г.Д. с соавт., 2000; Тимохина Т.Х., 2011; Halberg F. et al., 1984). Следовательно, подход к инфекции с позиции хронобиологии расширяет представление о физиологии грибов рода Candida.

Анализ амплитудно-фазовой стабильности биологических показателей С. albicans выявил, что временные ряды факторов патогенности клинических изолятов, полученных от здоровых людей, соответствовали временным рядам эталонного штамма (рис. 4-6). Ферменты агрессии и показатели морфогенеза сохранили утренний тип суточной активности,

17

акрофазы регистрировались в 04.00 - 08.00 часов (р<0,05). Время проявления максимальной адгезивной способности клинических изолятов С. albicans совпадало с акрофазой эталонного штамма. Однако наблюдалось изменение ритмометрических параметров пролиферации. У всех изучаемых культур акрофазы регистрировались в ночное время (23.00 -24.00).

Рис. 4-6. Амплитудно-фазовая характеристика суточных ритмов биологических свойств С. albicans, выделенных из кишечника (рис. 4); зева (рис. 5); влагалища (рис. 6), Т = 24 ч.

Примечание: 1) пролиферация; 2) адгезия; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-за; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Проведенные исследования показали, что хронологические ряды изучаемых свойств С. tropicalis и С. krusei, выделенных из биотопов здоровых лиц, идентичны временным рядам изолятов С. albicans (рис. 7-8). Ферментативная активность у видов С. non-albicans регистрировалась в ранние утренние часы (04.00 - 07.30), время максимального проявления пролиферативной и морфологической активности фиксировалось в 20.00 - 24.00 часа. Отмечено отсутствие активности в утреннее и дневное время у С. tropicalis с учетом блуждания фазы с 08.30 - 15.00 часов, у С. krusei - с 06.10 - 15. 20 часов.

Рис. 7-8. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств клинических изолятов С. tropicalis (рис. 7) и С. knisei (рис. 8); Т=24. Примечание: 1) адгезия; 2) пролиферация; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-за; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Периоды физиологической активности Candida sp., выделенных от больных кандидозом людей, равномерно распределены в течение суток и имели два и более пика активности. Установлено, что факторы адгезии, пролиферации, морфогенеза и каталазы у грибов рода Candida характеризовались утренним и вечерним типом (рис. 9-13), активность протеазы и фосфолипазы - ночным и дневным типом ритмичности. У С. albicans наблюдалась синхронизация во времени факторов адгезии с факторами колонизации и факторов инвазии друг с другом независимо от биотопа выделения.

Рис. 9-11. Амплитудно-фазовая характеристика суточных ритмов биологических свойств С. albicans, выделенных из кишечника (рис. 9); зева (рис. 10); влагалища (рис. 11), Т = 12 ч.

Примечание: 1) пролиферация; 2) адгезия; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-за;5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Активность адгезии микромицетов характеризовалась постоянством, о чем свидетельствовала небольшая площадь эллипсов. Напротив, факторы инвазии и агрессии (морфогенез, протеазная, каталазная активность) имели высокую лабильность биоритмов, о чем можно сулить по

Рис. 12-13. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств С. tropicalis (рис. 12) и С. krusei (рис. 13); Т=12.

Примечание: 1) адгезия; 2) пролиферация; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-за; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Корреляционный анализ выявил обратную зависимость между ростовой способностью и активностью факторов патогенности у штаммов С. albicans, выделенных из биотопов клинически здоровых людей; у культур С. tropicalis, С. krusei - между адгезивной активностью и остальными показателями. У всех изучаемых видов дрожжей, выделенных из биото-

пов больных лиц, зафиксирована прямая корреляция изучаемых свойств в периоды их максимальной активности.

Таким образом, согласованность и последовательность проявления физиологических функций клинических изолятов, отражающих стратегию распределения биологических ресурсов грибов во времени, не зависела от вида гриба и биотопа, но зависела от формы инфекционного процесса.

Анализ фактического материала выявил, что отклонение биоритмов изучаемых параметров клинических изолятов Candida sp. от ритмов эталонных штаммов являлось результатом модификационной изменчиво-

большим площадям их доверительных эллипсов.

-Г НИИ!

•JCTffr Для подтверждения этого факта культуры С. albicans и С. krusei, выделенные из биотопов здоровых и больных кандидозом людей, длитель-'-' но культивировали вне организма. Изменчивость грибов оценивали по poctc{Bbi;j свойствам и по способности к морфологической трансформации, так как существенные различия при сравнительном анализе амплитудно-фазовых характеристик клинических изолятов и эталонных штаммов касались местоположения акрофаз именно этих показателей.

У Candida sp. выявлена реверсия ритмичных компонентов изучаемых свойств к эталонным штаммам при культивировании на питательной среде Сабуро в течение года. Установлена последовательность перестройки биоритмов: суточная динамика пролиферации грибов при кан-дидозе -►ритмы Candida sp., изолированных от здоровых людей-*' ритмы эталонных штаммов. Аналогичные результаты получены у культур С. albicans, С. krusei при изучении морфогенеза. У прокариот подобных изменений не обнаружено (Паромова Я.И., 2009; Тимохина Т.Х., 2011). Это обстоятельство навело на мысль, что в основе всех процессов лежит единый внутриклеточный таймер - «биологические часы» (Куприянович Л.И, 1976), механизмом которых у грибной клетки являются белки (факторы транскрипции), способные менять экспрессию генов (Young, М. W. et al., 2001). Высокочастотное фенотипическое переключение способно одновременно воздействовать на проявление многих потенциальных факторов вирулентности, служит генетическим механизмом, позволяющим различным формам грибов адаптироваться к изменению среды, а также помогает им преодолевать защитные механизмы хозяина (Зелено-ва Е.Г. с соавт., 2002).

Полученные данные позволили предположить, что временная организация физиологической активности Candida sp., выделяемых из организма человека, формируется под влиянием факторов ассоциативного симбиоза. Подобное заключение сделано Дробковой В.А. (2010) доказавшей, что метаболиты микросимбионтов вагинального биотопа могут модулировать биологическую активность С. albicans.

Механизмы формирования временной организации биолойкссг^гс свойств Candida sp. при ассоциативном симбиозе :/

Важное адаптивное свойство биоритмов заключается в возможности взаимодействия организма с внешней средой по принципу опережающего отражения действительности. Поэтому, учет биоритмов и поиск ловых факторов, играющих роль сигналов, информирующих организм и агггив-но участвующих в его приспособительных перестройках в связи с предстоящими изменениями параметров окружающей среды, актуальны дня понимания адаптивных возможностей биосистемы (Дмитрук А.И.^2007).

На микроорганизмы постоянно воздействуют внешние параметры: абиотические - ритм солнечной освещенности (чередование дня и ночи), колебания температуры, Лунный цикл и др. и биологические - ритмы организма человека и/или экзогенные продукты метаболизма микробов -ассоциантов, в связи с этим нами были изучены некоторые факторы, которые могли бы оказывать влияние на суточную динамику физиологической активности Candida sp.

Экспериментально установлено, что регуляторы ритмичных процессов можно разделить на факторы, формирующие временную организацию у грибов, обитающих в организме здорового человека и факторы, регулирующие временную организацию клинических изолятов при кан-дидозе(рис. 14).

Как показано на рис. 14 последовательность и согласованность биологических свойств во времени у грибов рода Candida, обитающих в организме здорового человека может формироваться под влиянием температурного фактора или под действием продуктов жизнедеятельности бактерий, представителей дисбиотической микробиоты, что отражает сим-биотические отношения патогенов в микросимбиоценозе.

В экспериментах in vitro эталонные штаммы Candida sp. инкубировали при температуре 28 °С в течение 24 часов и 37 °С в течение 72 часов. При 28 °С у музейных культур выявлена ультрадианная ритмичность пролиферативной активности (вклад ритма - 74,0 %; р<0,05) и морфоло-

гическайсфансформации (51,3 %; р<0,05) со стабильными акрофазами в утренние и вечерние часы.

Через 72 часа при 37 °С непрерывного температурного воздействия профиль ритма, мезор, амплитуда, акрофаза пролиферации и морфогенеза эталонных штаммов Candida sp. соответствовали ритмометрическим параметрам изолятов (р<0,05), полученных из биотопов здоровых людей.

ItSJ

fVOOC

Временная организация биологических свойств эталонных штаммов Candida sp.

Экзометаболиты бактерий, характерных для дисбиоза

Температурный фактор

Флуконазол

Экзометаболиты бактерий, характерных для эубиоза

Временная организация биологических свойств изолятов Candida sp., полученных от здоровых людей

V,

Временная организация биологических свойств изолятов Candida sp., выделенных от больных лиц

z>

Рис. 14. Факторы, регулирующие временную организацию биологических свойств Candida sp.

Культивирование клинических изолятов С. albicans и С. krusei, полученных от здоровых лиц, при непрерывном температурном режиме 28 °С в течение 72 часов возвращало биоритмы пролиферативной активности и морфологической трансформации к ритмам эталонных штаммов.

Учитывая, что на дрожжевые грибы помимо абиотических факторов, оказывали влияние метаболиты микросимбионтов, исследования по изучению бактериально - грибковых ассоциаций были проведены на модели дистального отдела толстого кишечника организма человека. Микробио-та желудочно-кишечного тракта по праву является уникальной моделью

для изучения межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе поскольку является динамической равновесной системой организма хозяина и населяющей его доминантной и ассоциативной мйкрофло-рой (Перунова Н.Б., 2011). В качестве доминантов выбраны Rbifidum, именно они являются важнейшими представителями облигатной микрофлоры кишечника (Гончарова Г.И., 1987; Roy D., 1992; Vasiljevic T. et. al., 2008). Одной из функции бифидофлоры является поддержание нормального микроэкологического статуса занимаемого биотопа (Шендеров Б.А., 1996, 1998). Микросимбионты S. aureus и Е. coli «lac-», характерны для дисбиоза кишечника, и обычно обнаруживаемые в большом количестве на фоне дефицита бифидофлоры (Перунова Н.Б., 2011), чаще высеваются с грибами рода Candida.

Установлено, что под действием супернатантов микросимбионтов дисбиотической микрофлоры эталонные штаммы Candida sp. перестраивали временную организацию изучаемых свойств в хроноинфраструкту-ру, характерную для грибов, изолированных от здоровых лиц (рис. 15-

18).

Рис. 15-18. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств

С. albicans АТСС до воздействия (рис.15); после воздействия экзомета-болитов S. aureus (рис. 16); после воздействия экзометаболитов Е. coli «/ас-» (рис. 17); клинического изолята С. albicans (рис. 18); Т=24 часа. Примечание: 1) адгезия; 2) пролиферация; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-за; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

IВ присутствии метаболитов S. aureus и Е. coli «lac-» у С. albicans выявлено смещение акрофазы пролиферативной активности с дневного времени на ночные часы, повышение значений мезора и амплитуды активности; адгезии (р<0,05). У С. krusei получены аналогичные результаты..; »VT •

х Корреляционный анализ биологических свойств С. albicans и С. krusei выявил согласованность физиологической активности грибов, свойственную культурам, полученным от здоровых лиц.

Для выявления регуляторов ритмичности, характерной для микро-мицетов при кандидозе, на эталонный штамм С. albicans воздействовали субфунгиостатическими концентрациями флуконазола. Данные концентрации антимикотика у С. albicans, проявляющего к нему чувствительность, нарушали исходную архитектонику ритмов: регистрировалось снижение мезора, резкое уменьшение амплитуды, асинхронность вплоть до противофазное™, наличие достоверных ультрадианных гармоник физиологической активности (р<0,05).

При сочетанном действии флуконазола и экзометаболитов бактерий В. bifldum, Е. coli «lac+», Е. coli «lac-», S. aureus метаболиты не влияли на спектральный состав биоритмов изучаемых свойств. Преобладала ультрадианная ритмичность биологической активности С. albicans (р<0,05). Следовательно, вклад ритма эталонного штамма изменился именно под действием флуконазола.

Супернатанты дисбиотической микрофлоры толстого кишечника-S.aureus и Е. coli «lac-» совместно с '/2 МПК препарата усиливали экспрессию патогенных свойств грибов. При этом выявлено повышение среднесуточных значений адгезивной активности от 2,9±0,3 (контроль) до 3,6±0,3 (опыт) (р<0,05), амплитуда возросла в 2 - 4 раза (р<0,05). Значения активности морфогенеза выросли с 3,8+1,0% до 6,8±1,7% (р<0,05). Ритмометрические показатели ростовых свойств, активности протеазы и каталазы (мезор и амплитуда) реверсировали к исходным контрольным значениям (р<0,05).

Сочетанное действие продуктов жизнедеятельности нормофлоры (В. bifidum, Е . coli «lac+») дистального отдела толстого кишечника с «уб-фунгиостатическими концентрациями антимикотика привело к изменению временной организации эталонного штамма в «хроном», характерный для грибов, изолированных от больных кандидозом (рис. 19 - 22).

Активность адгезии, пролиферации, морфогенеза и каталаз» характеризовались утренним и вечерним типом ритмичности, в то время как фосфолипаза и протеаза демонстрировали ночной и дневной тип. Экзо-метаболиты В. bifidum и Е . coli «lac+» оказывали модулирующее воздействие на показатели фосфолипазной и морфологической активности

Рис.19-22. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств С. albicans АТСС до воздействия (рис.19); при воздействии флуконазола сочетанно с метаболитами Е. coli «lac+» (рис. 20); с метаболитами В. bifidum (рис. 21); клинического изолята С. albicans (рис.22); Т=12 часов. Примечание: 1) адгезия; 2) пролиферация; 3) морфогенез; 4) фосфолипаза; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Корреляционный анализ выявил прямую зависимость между всеми изучаемыми показателями факторов патогенности эталонной культуры С. albicans под влиянием флуконазола в сочетании метаболитами В. bifidum или Е. coli «1ас+», что также характерно дня клинических изолятов

грибов при кандидозе.

Таким образом, одним из главных механизмов адаптации грибов роде Candida к факторам среды и компенсации нарушенных функций являете*

соответствующее изменение ритмов интенсивности физиологических процессов. Изменение исходной периодичности у эталонных штаммов дрожжевых грибов характеризовалось не только нарушением постоянства периода, но и увеличением амплитуды колебательного процесса вследствие активации расхода и восстановления энергетических и пластических ресурсов, т.е. активации обеих сторон обмена веществ - катаболизма и анаболизма. Одним из возможных механизмов увеличения амплитуды биоритмов является взаимная синхронизация ритмов отдельных функциональных структур (Дмитрук А.И., 2007). Сочетанное влияние флуконазола и бактериальных метаболитов на временную организацию биологических свойств клинических изолятов С. albicans При изучении уровня адаптивности клинических изолятов С. albicans в условиях внешней среды на следующем этапе работы оценивали изменения их хроноинфраструктуры при воздействии субингибигорных доз флуконазола сочетанно с метаболитами микросимбионтов.

Под влиянием Vi МПК флуконазола у грибов выявлено нивелирование биоритмов адгезивной, пролиферативной, морфологической и каталаз-ной активности, снижение мезора биологических свойств в 2 - 5 раз (р<0,05),^а амплитуды в 3 - 10 раз (р<0,05). Установлена синхронизация всех свойств С. albicans во временном интервале с 06.00 до 12.00 и с 18.00 до 24.00 часов. Сравнительный анализ выявил прямую корреляцию между всеми изучаемыми свойствами патогенов.

При сочетанном влиянии метаболиты нормобиоты биотопа усиливали действие препарата (рис. 23-25). Флуктуации (колебания) пролиферативной и морфологической активности грибов в присутствии флуконазола и супергигантов В. bifldum, Е. coli «1ас+» характеризовались циркадианной ритмичностью (вклад ритма пролиферации составил 67,1 % и 70,3 % морфогенеза 51,5 % и 66,3 % соответственно). Максимальная физиологическая активность регистрировалась в очень узком временном интервале, отмечены значительные периоды отсутствия проявления биологических показателей с 03.00 до 18.00 часов. Кроме того, в присутствии

27

метаболитов Е. coli «lac+» наблюдалось снижение среднесуточных значений и амплитуды фосфолипазной активности грибов в 3,2 раза (р<0,05). ___

Рис. 23-25. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств ) клинического изолята С. albicans после воздействия V4 МПК флуконазола (рис. 23); флуконазола и Е. coli «1ас+» (рис. 24); флуконазола и В bifldum

Примечание: 1) адгезия; 2) пролиферация; 3) морфогенез; 4) фосфолипа-, за; 5) протеаза; 6) каталаза. По окружности - время суток, часы.

Таким образом, сочетанное влияние препарата и метаболитов бактерий, представителей нормофлоры, привело к десинхронозу биологической активности клинического изолята С. albicans, что указывало на срыв компенсаторно-приспособительных реакций и, возможно, на необ-| ратимые изменения, в дальнейшем, приводящие культуру к гибели. Аналогичные результаты были получены при изучении влияние антибиоти-| ков на суточную динамику пролиферативной и антилизоцимной актива ности 5. aureus (Бухарин O.B. с соавт., 2008; Тимохина Т.Х., 2011). Влияние бактериальных метаболитов на хроноинфраструктуру клинических изолятов Candida sp.

С целью изучения механизмов регуляции межмикробных взаимоотношений при функционировании микросимбиоценоза, на следующем этапе работы оценивали изменения патогенного потенциала Candida sp. i смоделированных in vitro бактериально - грибковых ассоциациях в течение суток. Хроноинфраструктуру возбудителей оценивали по пролифе, ративной, морфологической и фосфолипазной активности.

28

Проведенные эксперименты показали, что экзометаболиты доминантных бактерий (В. bifldum) и ассоциантов (S. aureus и К coli «lac-») не изменяли вклад околосуточных ритмов биологических свойств Gandida sp., изолированных от здоровых лиц, сохраняя положения акрофаз, значения мезора и амплитуды.

Таким образом, полученные данные свидетельствовали, что временная организация изучаемых показателей Candida sp., выделенных го биотопов организма здоровых лиц, обладала стабильностью и, по возможности, независимостью от воздействия метаболитов бактерий.

Иная закономерность установлена при воздействии супернатангов микросимбионтов на ритмичные процессы физиологической активности клинических изолятов, полученных от больных пациентов. По - видимому, при снижении колонизационной резистентности макроорганизма, происходило ослабление регулирующего действия его на биоритмы грибов, и биорегуляторами физиологических функций Candida sp. выступали микросимбионты. Проведенные исследования показали, что метаболиты микроорганизмов, характерных для эубиоза кишечника, достоверно снижали у Candida sp. мезор в 3,1 - 4,9 раз (р<0,05), амплитуду активности в 3-4 раза (р<0,05) всех изучаемых свойств.

Супернатанты L. acidophilus, Е. coli «lac +» изменяли спектральный состав биоритмов морфогенеза и фосфолипазной активности грибов с ультрадианного на циркадианный (р<0,05).

В экспериментах in vitro установлено, что продукты жизнедеятельности доминангов не влияли на фазовую стабильность биологических свойств грибов всех изучаемых видов. Сохранялась последовательность и согласованность проявления максимальной активности физиологических процессов.

Представители ассоциативной нормобиоты L. acidophilus, Е. coli «lac +», напротив, вызывали изменения хроноинфраструктуры Candida sp. Установлена синхронизация физиологических показателей в очень узком временном периоде и отмечены значительные промежутки времени отсутствия активности. Метаболиты Е. coli «lac +» преобразовывали хро-

29

^инфраструктуру клинических изолятов С. albicans, С. tropicalis в «хроном», типичный для эталонных, непатогенных штаммов.

Таким образом, поддержание резистентности на фоне постоянно действующего раздражителя сопряжено с более высоким напряжением жизненных сил, чем в обычных условиях. Такая напряженность сопровождается уменьшением амплитуды исходных колебаний и трансформацией высокочастотных колебаний в колебания с меньшей частотой (Степанова, С.И.,1986). В этом проявляется одна из важнейших закономерностей адаптационного процесса. Чем продолжительнее периоды биоритмов, тем более эффективно осуществляются восстановительные процессы и тем устойчивее система к повреждениям (Кочетков А.Г. с соавт., 2005).

Под действием супернатангов микробиоты, характерной для дисбиоза (S. aureus и Е. coli «lac-»), у грибов рода Candida повышались среднесуточные значения активности пролиферации, морфогенеза и фосфолипазы в 1,7 раза (р<0,05), амплитуда возросла в 3 раза (р<0,05). Метаболита микробов - ассоциантов S. aureus и Е. coli «lac-» синхронизировали ак рофазы активности пролиферации и фосфолипазы у культур С. albicans С. tropicalis (г = 0,64; г = 0,57; р<0,05 и г = 0,69; г = 0,62; р<0,05 соответ ственно), у С. krusei - акрофазы морфогенеза и фосфолипазы (г - 0,59; г 0,46; р<0,05).

Полученные результаты согласуются с существующим принципо попеременной (асинхронной) работы структур организма (Комаров Ф.И. 1989) и отражают распределение патогенных ресурсов микробных кле ток во времени. Так изменения спектрального состава ритмов, изменени мезора, резкое уменьшением амплитуды, асинхронность ритмов вплот до противофазное™ характеризуют напряжение адаптации (Хетагуров Л.Г., 2008).

Таким образом, микробные метаболиты, оказывающие модулиру щее действие на биологические свойства грибов, играли важную роль регуляции межмикробных взаимоотношений, что, вероятно, можно и пользовать в практической медицине.

Хронобиологические критерии диагностики «свой», «чужой» в микросимбиоценозах ., , ,

Учитывая, что в условиях микросимбиоценоза экзометаболигы ассо-циангов способны не только изменять биологические свойства доминан-тов, но и ивдуцировать у них выработку вторичных экзометаболитов (Shank А.Е., Kolter R„ 2009; Перунова Н.Б., 2011), проведены исследования по соинкубированию аутохтонных и аллохтонных микросимбионтов с супернатантами грибов.

Механизм микробного распознавания «свой - чужой» в бактериально - грибковых ассоциациях изучали на примере клинических изолятов Candida sp„ свежевыделенных от больных лиц. Влияние экзометаболитов доминантной и ассоциативной микрофлоры на рост/размножение, морфологическую трансформацию и фосфолипазную активность грибов проводили после предварительного соинкубирования бактериальных микросимбионтов с супернатантами Candida sp. Ранее использование этого метода было применено для распознавания бифвдофлорой ассоци-антов «свой-чужой» в микросимбиоценозе дистального отдела толстого кишечника по изменению их основных физиологических функций - ростовых свойств, антилизоцимной активности, биопленкообразования (Перунова Н.Б., 2011).

В нашем исследовании выявлены ритмометрические параметры, позволяющие дифференцировать «свои» и «чужие» ввды микроорганизмов

в парах «доминант - ассоциант» в бактериально-грибковых ассоциациях (рис. 26).

Как показано на рис. 26 «своими» для грибов рода Candida являлись представители дисбиотической микрофлоры кишечника, так как метаболиты культур S. aureus и Е. coli «lac-» усиливали биологическую активность Candida sp. в течение суток. Оказалось, что более подвержены данному влиянию грибы С. non-albicam. Установлено, что из всех изучаемых показателей пролиферативная активность являлась более лабильным признаком, реагирующим быстрее на воздействие бактериальных супернатантов. Среднесуточные значения пролиферации увеличива-

31

лись у С. albicans в 1,7 раз (р<0,05), у С. tropicalis в 2,4 раза (р<0,05) и у ■ &<krusei в 2,5 раза (р<0,05) после соинкубирования с метаболитами бактерий, обработанных супернатангами тех же грибов. Амплитуда выросла в 3,0 - 7,5 раз (р<0,05).

, Продукты метаболизма S. aureus и Е. coli «lac-» сохраняли ультра-дианную ритмичность ростовых и патогенных свойств, периоды физиологической активности Candida sp. были равномерно распределены в те-

«свои»

Candida sp.

«чужой»

т

я

Е. coli «lac-» S. aureus

т

повышение значений мезора; повышение значений амплитуды;

сохранение спектрального состава ритмов; отсутствие синхронизации биологических свойств в узком временном интервале

усиление (сохранение) адаптивных возможностей

В. bifidum Е. coli «lac +» L. acidophilus

снижение значений мезора; снижение значений амплитуды;

изменение спектрального состава ритмов; синхронизация биологических свойств в узком временном интервале

десинхроноз, снижение адаптивных возможностей

Рис. 26. Ритмометрические критерии, позволяющие распознавать «свой чужой» в бактериально - грибковых ассоциациях.

32

Под влиянием метаболитов нормальной микробиоты кишечника (В. bifldum, L. acidophilus, Е. coli «lac+») установлено снижение среднесуточных значений пролиферативной активности у С. albicans в 5Д раза (р<0,05), морфогенеза в 17,1 раза (р<0,05), амплитуда уменьшалась в среднем в 7,3 раза (р<0,05). У грибов С. non-albicans мезор снижался в 5,6 раз (р<0,05), способность к морфологической трансформации снизилась в 20 - 26 раз (р<0,05), фосфолипазная активность была ниже контрольных значений в 6,3 раза (р<0,05). Экспериментально выявлено нивелирование ритмов изучаемых свойств дрожжевых патогенов.

Установлено, что метаболиты В. bifldum, L. acidophilus, Е. coli «lac +» преобразовывали ультрадианные колебания биологических свойств в циркадианные ритмы, что характерно для непатогенных эталонных культур и изолятов, выделенных от здоровых лиц. Бактериальные супер-натанты изменяли последовательность и согласованность проявления биологических свойств во времени. На воздействие метаболитов нормо-биоты у грибов наблюдалась четкая синхронизация пролиферативной, морфологической и фосфолипазной активности в определенном временном интервале. Максимальная активность регистрировалась в вечернее и ночное время или ранние утренние часы. В дневной период активность возбудителей кандидоза не фиксировалась, либо была минимальной. Данный факт подтвердил представление, что организму свойственна способность экономии материальных и энергетических ресурсов и максимальная концентрация их на главном участке развертывания приспособительной реакции в определенный временной период (Лукомская К.А., 1987; Комаров Ф.И., 2000).

Таким образом, ритмометрические показатели позволили выявить феномен микробного распознавания «свой - чужой» при формировании микросимбиоценозов. Так, повышение значений мезора, амплитуды, сохранение спектрального состава биоритмов изучаемых свойств, сохранение амплитудно - фазововой характеристики указывало на усиление или сохранение адаптивных возможностей Candida sp. Данные критерии характеризовали «своих» микросимбионгов. Напротив, снижение значений

33

мезора, амплитуды более чем на 50%, изменение спектрального состава tpHiMOB, синхронизация биологических свойств в узком временном интервале, приводящая к десинхронозу и снижению адаптивных возможностей указывало на «чужих» микросимбионгов для грибов рода Candida. Следовательно, амплитудно - фазовая характеристика физиологической активности Candida sp. являлась маркером огшозитного (усиление / ослабление) эффекта выживания микросимбионтов, дифференцирующая «свои» и «чужие» виды микроорганизмов в парах «доминант-ассоциант».

Для подтверждения оппозитного эффекта «своих» и «чужих» видов бактерий по отношению к грибам выявили изменения изучаемых физиологических функций ростовых и патогенных свойств (табл. 1).

Таблица 1 - Изменение экспрессии физиологических функций Candida sp. под действием микросимбионгов, предварительно ' соинкубированных с супернатантами данных грибов

uä

Й X о,

0J

С

физиологические функции

прушшш'^/* у ^ — -----«____

изменение физиологических функций грибов под влияние супернатантов бактерий, культивируемых с супернатантами этих же грибов; мезор (%)

SÜ.

1 |

рост

морфогенез

фосфолипаза

рост

морфогенез

В. bifidum

-66,7±4,3

-55,3*7,1

L.

acidophilus

-89,8*7,5

-94,2*7,3

«чужой» -71,7*4,2

-51,9*4,2

фосфолипаза

£

JJ_

рост

морфогенез

фосфолипаза

-66,0*8,5

«чужой»

-99,4*11,2

-95,7±3,1

-89,0±9,2

«чужой»

-59,5*5,2

-82,5*5,3

«чужои»

-43,0*9,1

-63,9*4,2

-61,1*6,2

Е. coli lac «+», гем «-»

-89,6*12,3

-69,5*3,5

Е. coli lac «-», гем «+»

S. aureus

+34,8*4,6

-91,6*6,2

«чужои»

-77,2*7,7

-79,0*6,4

-76,3*5,2

«чужои»

-98,4*5,3

-45,5*2,9

-67,0*8,3

«чужои»

«чужой»

-96,2*11,4

+14,4*6,4

+31,1*7,3

«свои»

+77,9*4,0

+38,2*5,3

+30,1*5,0

+32,2*4,5 +20,8*3,

+42,3*4,

«свои>

+38,7*1,

+21,2*0,

+24,6*0,

«свои»

+15,5*4,9

-85,4*9,0

-96,2*7,9

«чужой»

+35,2*8,4

+33,2*8,2

«свои»

«свои>

+4,0*0,2 +29,7*10

+11,8*4,

«свои>

Примечание: «+» - увеличение экспрессии свойств; «-» - снижение эк прессии свойств.

Приведенные в таблице данные, свидетельствовали, что супернатанты культур Е. coli «lac«-» и S. aureus, предварительно соинкубированные с супернатантами грибов рода Candida (с каждым в отдельности), увеличивали экспрессию пролиферации, морфогенеза и фосфолипазы (р<0,05), в связи с чем, данные бактерии можно отнести к «своим» ввдамликро-симбионтов.

• • ъТ

Предварительное соинкубирование В. bifidum, L. acidophilus; ' EL coli «lac +» с супернатантами Candida sp. (с каждым в отдельности), способствовало снижению экспрессии изучаемых физиологических свойств грибов, на основании чего они были отнесены к «чужим» видам микросимбионтов (р<0,05).

Используемый способ позволил оценить микробное распознавание в системе «свой - чужой» на межвидовом и внутривидовом уровне. Например, Е. coli «lac + » являлась антагонистом Candida sp., а Е. coli «lac -» - си-нергистом грибов рода Candida. Известно, что при антагонистическом типе взаимодействия микроорганизмов может происходить модификация антагонистической активности продуцента в связи с активным воздействием на него симбионта: модификация обмена веществ или морфологические и функциональные изменения микросимбионтов (Shank А. Е., Kolter R., 2009; Перунова Н.Б., 2011). Изучение этих вопросов важно для понимания механизмов формирования и функционирования микро-симбиоценозов при ассоциативном симбиозе человека.

ВЫВОДЫ:

1. Временная организация физиологической активности эталонных штаммов грибов является видовым признаком Candida sp.

2. Спектральный состав биоритмов клинических изолятов Candida sp., выделенных от здоровых лиц характеризуется только циркадианными ритмами всех биологических свойств, в то время как для возбудителей кандадоза установлены ультрадианные гармоники физиологической активности, что отражает адаптивные возможности микромицетов.

3. Трансформация временной организации биологических характери-vcrrac эталонных штаммов Candida sp. в хроноинфраструктуру, типичную доот клинических изолятов формируется под действием биотических и

абиотических факторов.

,43 Сочеганное действие флуконазола и экзометаболитов нормофлоры биотопа дистального отдела толстого кишечника человека приводит к дёсийхронозу биологических свойств клинических изолятов Candida sp., что свидетельствует о снижении компенсаторно - приспособительных реакций.

5. Под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов выявлен стабильность проявления биоритмов физиологической активности изо лятов грибов рода Candida, выделенных от здоровых лиц, тогда как клинических культур, выделенных от больных людей, патогенные свой ства микромицетов характеризовались лабильностью в течение суток.

6. Амгатитудно - фазовая характеристика и среднесуточные значен биологической активности Candida sp. являются критериями, позволяю щими выявить феномен микробного распознавания «свой - чужой» пр формировании бактериально - грибковых ассоциаций в микросимбиоце нозе.

7. Снижение ритмометрических показателей - мезора и амлитуды формирование десинхроноза являются маркерами чужеродности микро симбионтов, тогда как повышение мезора, сохранение амплитудою фазовой стабильности биологических свойств являются показателям «своих» микросимбионтов в бактериально-грибковых ассоциациях.

Список работ, опубликованных в научных журналах, рекомендованных ВАК:

1. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальнь штаммов микроорганизмов / Т.Х. Тимохина, H.A. Курлович, Я.И. Пар мова, В.В. Варницына, Э.А. Кашуба, Д.Г. Губин, М.В. Николенко Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2007,- № 4 С.3-5.

2. Характеристика временной организации штаммов Candida spp., выделенных из клинического материала / Н. Б. Перунова, М.В Ннколенко, В.В. Варницына, М.В. Янина, Т.Х. Тимохина // Медицинская наука и образование Урала.- 2008. - № 2/52. - С. 58-59.

3. Симбионты паразитов, их роль в патогенезе болезней / В Л Бычков, В.П. Сергиев, А.О. Плотников, Г.Г. Крылов, Ю.Г. Суховей, М.В. Ннколенко // Медицинская паразитология и паразитарные болезни - 2008:- № 2,- С. 3-8.

4. Влияние экзометаболитов ассоциативной микрофлоры на временную организацию музейных штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa I Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, В.В.Леонов, Н.Б. Перунова, В.В. Варницына, М. В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала,- 2008. - № 2/52,- С. 89-90.

5. Биоритмы биологических свойств Staphylococcus aureus как фактор адаптации при госпитальной инфекции / Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, H.A. Курлович, М.В. Николенко, Э.А. Кашуба // Медицинская наука и образование Урала. - 2009.- №2/62,- С. 100-101.

6. Биологические свойства доминирующих микроорганизмов в отделениях хирургического профиля / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, A.A. Барадулин // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 2/62. - С. 100-101.

7. Николенко М.В. Суточная динамика фосфолипазной активности Candida albicans / М.В. Николенко // Проблемы медицинской микологии- 2010,- том 12. - № 2. - С. 49-52.

8. Суточная динамика каталазной активности Candida albicans / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Леонов, В.В. Варницына // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 4/64. - С. 60-62.

9. Тимохина Т.Х. Суточная динамика темпа роста микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала.- 2010. - № 4/64. - С. 84-86.

10. Временная организация биологических свойств Candida albicans / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Н.Б. Перунова // Из-

37

вестия Оренбургского государственного аграрного университета.- 2011. -

№2 (30).-С. 226-228.

Л. Николепко М.В. Адаптивные возможности Candida albicans / М.В. Николенко // Вестник Тюменского государственного университета. кМеЙикотбиологические науки. - 2011. - № 6. - С.145-151.

12. Изменение функциональной активности Candida albicans под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты в течение суток / О.В. Бухарин, Т.Х. Тимохина, М.В Николенко, В.В. Варнищлна, Н.Б. Перунова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.

- 2011. - № 3. - С.67-70.

13. Николенко М.В. Хронобиологический метод изучения биологи ческих свойств Candida species / М.В. Николенко // Проблемы медицин ской микологии. - 2011.- том 13. - № 4. - С. 3-7.

14. Николенко М.В. Морфофункциональная активность Candida albi - .-cans в.течение суток / М.В. Николенко, Т.Х. Тимохина В.В. Варницына /

Медицинская наука и образование Урала. - № 4/68. - 2011. - С. 46-48.

15. Николенко М.В. Хронобиологические методы изучения биологи ческих свойств грибов Candida albicans, выделенных из вагинальног биотопа / М.В. Николенко, Т.Х. Тимохина В.В. Варницына // Вестн Ивановской медицинской академии. - 2012. - Т.17. - № 2. -С.12-15.

16. Николенко М.В. Новый подход к изучению биологической ак тивности Candida krusei / М.В. Николенко, Т.Х. Тимохина // Вестн Тюменского государственного университета. Медико-биологически науки. - 2012. - № 6,- С,164-170.

Публикации в других изданиях

1. Суточная динамика биохимической активности музейных и госх тальных штаммов микроорганизмов под действием пероксимеда / Я. Паромова, С.Л. Галян, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, М.В. Николен // Медицинская наука и образование Урала. - 2005. - № 5. - С. 86.

2. Адаптивный потенциал Staphylococcus aureus при госпитальнь инфекциях / Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Ку

лович, Э.А. Кашуба, М.В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала. - 2006. - № 2. - С. 94-103.

3. Суточная динамика биологических свойств грибов* рода Cäfidida / Т.Х Тимохина., H.A. Курлович, Н.Б. Перунова, М.В. Николенко и др. // Персистенция микроорганизмов: М-лы V Всероссийской научной ГкЬн-ференции. - Оренбург, 2006 - С. 45-48. , • ,

4. Пролиферативная активность и чувствительность к антимикробным препаратам Pseudomonas aeroginosa / Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, ЯМ. Паромова, H.A. Курлович, М.В. Николенко // Актуальные вопросы частной микробиологии: М - лы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва,2007. - том 2. - С. 242-243.

5. Хронобиологические особенности адаптивных свойств грибов рода Candida / Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, М.В. Николенко, H.A. Курлович, Н.Б. Перунова // Успехи медицинской микологии: М-лы пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - Москва, 2007. -том 9. - С.26-27.

6. Влияние препарата микосист на пролиферативную активность Candida spp. / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, О.П. Твер-скова // «Человек и лекарство. Урал - 2007»: Тез. докл. Российского национального конгресса. - Тюмень,2007. - С. 103-104.

7. Суточная динамика антилизоцимной активности грибов рода Candida /О.В. Бухарин, Т.Х. Тимохина , Н.Б. Перунова, В.В. Варницына, М.В. Николенко и др. // Успехи медицинской микологии: М-лы пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии,- Москва, 2007. -том 10. - С.48-49.

8. Особенности биологии грибов рода CANDIDA / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Н.Б. Перунова, В.В. Варницына // Современная микология в России: Тез. докл. Второго съезда по микологии. - Москва, 2008. - том 2. - С.279-280.

9. Характеристика временной организации грибов рода CANDIDA в ассоциации с золотистым стафилококком / Т.Х. Тимохина, М.В. Нико-

39

ленко, Я:И, Паромова, Н.Б. Перунова-// Современная микология в Рос-¿1 бпенТез. докл. Второго съезда по микологии. - Москва, 2008. - том 2. -■ C.280-281S

10. Чувствительность CANDIDA ALBICANS, выделенных из различ-оньш/ йиотопов, к антимикотическим препаратам / Т.Х. Тимохина, .МД.Николенко, В.В. Варницына, М.В. Янина // Проблемы медицин-шскойшикологии: - 2008. - Том 2. - № 2. - С. 84.

11. Тимохина Т.Х. Хронобиологические особенности Candida albican v / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына // Проблемы меди

цинской микологии. -2008. - том 2 - № 2. - С. 83.

12. Николенко М.В. Способ выявления Candida aldicans по биориг мам / М.В. Николенко, Э.А. Кашуба и др. // Лучшие использованны технические решения, представленные на областные конкурсы: Тез

, докл. общества изобретателей и рационализаторов Тюменской области.

" -Тюмень, 2008. - С. 132.

13. Тимохина Т.Х. Суточная динамика пролиферативной активност как способ индикации Candida albicans / Т.Х. Тимохина, М.В. Николен ко, В.В. Варницына // Иммунопатология, аллергология и инфектолоп

Москва, 2009. - № 1.- С. 30-31.

14. Николенко М.В. Способ выявления Candida albicans по биор] мам / Николенко М.В., Э.А. Кашуба и др. // Современные наукоемки технологии: М - лы Общероссийской научной конференции «Инновш ■ онный потенциал отечественной науки», 17-19 февраля 2009. - Москв 2009. - С. 31.

15. Оценка способности формировать биопленку грибами рода С. dida, выделенными из разных источников / В.В.Леонов, В.В. Варницы Т.Х. Тимохина, Я.И Паромова, М.В. Николенко // Проблемы медищ ской микологии. - 2009. - том 11. - № 2. - С. 91.

16. Влияние экзометаболитов грамотрицательной микрофлоры формирование патогенного потенциала Candida albicans / Т.Х. Тимохин М.В. Николенко, В.В. Варницына, В.В. Леонов // Иммунопатолог аллергология и инфектология. - Москва, 2009. - № 1. - С. 31-32.

40

17. Влияние экзометаболитов на пролиферативную активность Candida albicans / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варшщынщ»В.В. Леонов // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - том 11. - №2. - С 116. '

18. Эффективность лекарственных средств в отношении Candidaalbi-cans / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, И.Д Нешта, В.В. ВарницьМа // Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов: М-лы Конгресса терапевтов «Урал-2009» к 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов. - Тюмень, 2009. - С. 85.

19. Изменение среднесуточной гемолитической и каталазной активности госпитальных штаммов ассоциативной микробиоты под действием экзометаболитов Candida albicans в эксперименте / В. В. Костерина, А. П. Рябинина, В. В. Леонов, В. В. Варницына, М. В. Николенко и др. // Вестник Югорского государственного университета, 2009. - Выпуск 3 (14). - С. 58-61.

20. Николенко М.В. Суточная динамика фосфолипазной активности Candida albicans / М.В. Николенко, Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2010 - том 12 - № 2. - С. 117-118.

21. Оценка способности формировать биопленку грибами рода Candida, выделенными из разных источников / В.В. Леонов, В.В. Варницына, Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, М.В. Николенко, В.В. Костерина, П.Ю. Рябнина // Проблемы медицинской микологии. - 2010. - том 12. - № 2. -С.91.

22. Тимохина Т.Х. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на фосфолипазную активность Candida albicans / Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына // Проблемы медицинской микологии. -2010. - том 12. - № 2. - С. 117.

23. Губин Д. Г. К вопросу о циркадианной и ультрадианной ритмичности у нефотосинтезирующих бактерий / Д.Г. Губин, Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко М.В. // М-лы XVIII международной конференции «Циклы природы и общества». - Ставрополь, 2010. - С. 106-108.

41

24. Николенко M.B. Влияние ■ флуконазола на суточную динамику -о.тфосфолипазной активности дрожжевых грибов / М.В. Николенко, Т.Х.

Тимохина, В.В. Варницына, Т.Д. Журавлева // «Человек и лекарство. Урал - 2010»: Тез. докл. Российского национального конгресса.- Тю

мень, 2010. - С. 117.

25. Николенко М.В. Суточная динамика фосфолипазной активност С. krusei / M.B. Николенко, Т.Х. Тимохина // Проблемы медицинско

микологии. - 2011. - том 13 - № 2. - С. 95.

26. Николенко М.В. Временная организация биологических свойств С. species /М.В. Николенко // Проблемы медицинской микологии. - 201

-том 13 -№ 2. -С. 95.

27. Николенко М.В. Влияние флуконазола на биоритмы пролифера тивной активности С. albicans в системе ассоциативного симбиоза. / М. Николенко, Н. А. Будкевич // Проблемы медицинской микологии. - 201

г -том14-№2.-С. 114.

Патенты, свидетельства, учебные пособия

1. Способ выявления Candida albicans по биоритмам: Патент РФ н изобретение №2319747 / Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, H.A. Курлов М.В. Николенко, В.В. Варницына, ЯМ. Паромова Л.Б. Козлов, Н.Б. П рунова, Д.Г. Губин, О.П. Тверскова // Заявка 2006127709/13, 31.07.200

Опубликовано: 20.03.2008 Бюл. № 8.

2. Патогенные и условно-патогенные макро- и микромицеты как об екты царства грибов (Fungi), их характеристика с учетом требова! международного кодекса ботанической номенклатуры. Вып I. Учебн пособие. Изд-во ООО "ИПК КОСТА" Санкт-Петербург, 2011 /Елин Н.П., Васильева Н.В., Маметьева A.A., Николенко М.В., Озерская С.М

Criucoz; сокращений:

АТСС - American Type Culture Collection (американскач еоллекцфг^яю-вых культур) .ч г, f.,.up

АЛА - антилизоцимная активность - . ■ •<-■

СПА - средний показатель адгезии Ji;..f

КОЕ - колониеобразующая единица

ОМЧ - общее микробное число о ^

МПК - минимальная подавляющая концентрация г - коэффициент ранговой корреляции Спирмена Т - критерий Манна-Уитни W - критерий Уилкоксона

.'от -

НИКОЛЕНКО МАРИНА ВИКТОРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPECKS

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2010 Подписано в печать 22. 03. 2013 г. Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Николенко, Марина Викторовна, Оренбург

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ТЮМЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

0520*1351165

Николенко Марина Викторовна

ОСОБЕННОСТИ ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPECIES

03.02.03 - «Микробиология»

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, заслуженный работник высшей школы Российской Федерации, доцент Тимохина Т.Х.

Тюмень - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Страница

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................6

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ CANDIDA SP. (обзор литературы) ..........................................................................................12

1.1. Хронобиологические особенности грибов..........................................12

1.2. Морфофункциональные, цито- и патогенетические особенности Candida sp................................................................................................24

1.3. Механизмы адаптации Candida sp. в системе ассоциативного симбиоза...............................................................................................38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................48

2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе.................48

2.2. Методы выделения и идентификации культур Candida sp...................49

2.3. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов..............54

2.4. Метод изучения влияния температуры на биологические свойства Candida sp..............................................................................................59

2.5. Метод изучения регулирующего влияния флуконазола на биологические свойства дрожжевых грибов.................................................................59

2.6. Методы изучения регулирующего влияния экзометаболитов микросимбионтов на биологические свойства Candida sp..........................................61

2.7. Метод определения «свой - чужой» на модели микросимбиоценоза кишечника человека..........................................................................63

2.8. Методы статистической обработки полученных результатов..............65

ГЛАВА 3. ХРОНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭТАЛОННЫХ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА CANDIDA...................................68

3.1. Хронобиологические особенности С. albicans 24433 ..............................69

3.2. Хронобиологические особенности С. non-albicans...........................73

3.3. Сравнительная характеристика амплитудно-фазовых показателей суточных ритмов биологических свойств Candida sp.......................................78

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SP., ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОТОПОВ ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ КАНДИДОЗОМ ЛЮДЕЙ........83

4.1. Адгезивная активность Candida sp. в течение суток...........................84

4.2. Пролиферативная активность Candida sp. в течение суток..................92

4.3. Морфологическая активность Candida sp. в течение суток.................100

4.4. Фосфолипазная активность Candida sp. в течение суток.......................108

4.5. Протеазная активность Candida sp. в течение суток.................................116

4.6. Каталазная активность Candida sp. в течение суток.........................124

4.7. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств изолятов Candida sp.........................................................................................131

4.8. Модификационная изменчивость Candida sp. в зависимости от условий

существования............................................................................136

ГЛАВА 5. МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ CANDIDA SP. В УСЛОВИЯХ АССОЦИАТИВНОГО СИМБИОЗА.............................................146

5.1. Факторы - регуляторы биоритмов физиологических функций Candida sp. при их адаптации к условиям организма здоровых людей.......................147

5.2. Факторы - регуляторы биоритмов физиологических функций Candida spp. при их адаптации к условиям больного кандидозом человека............161

5.3. Сочетанное влияние флуконазола и бактериальных метаболитов на временную организацию биологических свойств клинических изолятов С. albicans...........................................................................................169

ГЛАВА 6. РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ НА ХРОНОИНФРАСТРУКТУРУ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SP..................................................................177

6.1. Влияние бактериальных метаболитов на хронопоказатели биологической активности клинических изолятов Candida sp., выделенных из кишечника здоровых людей...........................................................................178

6.2.Влияние бактериальных метаболитов на хронопоказатели биологических свойств клинических изолятов Candida sp., выделенных из кишечника боль-

ных острым кандидозом.................................................................187

6.3. Хронобиологические критерии диагностики «свой - чужой» в микросим-

биоценозах.................................................................................197

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................217

ВЫВОДЫ.................................................................................233

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ...................................235

Список сокращений:

АТСС - American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур)

КОЕ - колониеобразующая единица

ОМЧ - общее микробное число

СПА - средний показатель адгезии

ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма

МПК - минимальная подавляющая концентрация

Т - критерий Манна-Уитни

W - критерий Уилкоксона

г - коэффициент ранговой корреляции Спирмена

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Грибы рода Candida - уникальные микроорганизмы, обладающие колоссальным адаптивным потенциалом, широко распространенны в природе и (Масюкова С.А. соавт., 2004; Короткова Т.Н., 2006). Они входят в состав различных микросимбиоценозов, в том числе и организма человека, и часто выступают этиологическим фактором оппортунистических инфекций у больных с иммунодефицитными состояниями. Колонизация слизистых оболочек организма человека микромицетами является результатом симбиотических отношений с макроорганизмом и микросимбионтами в условиях ассоциативного симбиоза (Бухарин О.В., 2007). Включение в этот симбиоз Candida sp. возможно благодаря различным адаптивным механизмам, проявляющим пластичность физиологических функций в различных условиях окружающей среды.

В настоящее время изучение механизмов адаптации является проблемой современной биологии и медицины, тесно связанной с вопросами биоритмологии, так как ритмы охватывают все проявления живого - от деятельности субклеточных структур и отдельных клеток до сложных форм поведения организма и экологической системы, символизируя саму жизнь (Арушанян Э.Б., 2000). Автономный самоподдерживающий процесс периодического чередования состояний клетки и колебаний интенсивности физиологических процессов с одной стороны, достаточно стабилен и по возможности независим от многочисленных случайных воздействий, за счет своей внутренней синхронизации, с другой, лабилен и постоянно подстраивается к новой среде обитания (Шмальгаузен И.И., 1983; Губин Д.Г., 2000).

Сведения о факторах адгезии и инвазии С. albicans не дают полной информации о биологии грибов рода Candida. Противоречивы данные о патогенном потенциале и его реализации у С. non-albicans (Васильева Н.В. с соавт., 2002; Карпунина Т.И. с соавт., 2006; Горбасенко Н.В., 2006). Поэтому использование хронобиологического метода, как мето-

4. Выявить ритмометрические критерии, позволяющие оценивать феномен микробного распознавания «свой - чужой» при формировании микросим-биоценозов.

Новизна исследования

Впервые проведены фундаментальные многофакторные исследования и представлен комплексный анализ хроноинфраструктуры биологических свойств (пролиферативной, адгезивной, морфологической, фосфолипазной, протеазной, каталазной активности) у эталонных штаммов и клинических изолятов Candida sp.

Доказано, что временные ряды изучаемых свойств у эталонных штаммов - объективная индивидуальная характеристика вида (патент РФ на изобретение № 2319747 от 20.03.2008 года «Способ выявления Candida albicans по биоритмам»).

Экспериментально установлено, что временная организация физиологической активности клинических изолятов Candida sp., полученных из кишечника, зева и влагалища, не зависит от вида гриба и биотопа. Выявлены универсальные ритмометрические характеристики (вклад ритма и амплитудно -фазовая стабильность), позволяющие дифференцировать культуры грибов, выделенные от здоровых и больных кандидозом людей.

Впервые выявлены факторы, формирующие последовательность и согласованность проявления биологических свойств клинических изолятов грибов рода Candida во времени. Под действием температуры 37 °С или метаболитов дисбиотической кишечной микрофлоры эталонные штаммы Candida sp. приобрели временную организацию физиологических функций характерную для изолятов, выделенных от здоровых людей. Сочетанное воздействие субфунгиостатических концентраций флуконазола и метаболитов представителей нормофлоры биотопа приводило к формированию хроноинфраструктуры биологической активности Candida sp., характерной для культур, высеваемых при кандидозе.

Таблица 75

Ритмометрические параметры биологической активности С. albicans под влиянием экзометаболитов бактерий

Функции С. albicans Ритмометрические показатели

Вклад ритма, % Мезор М±т Амплитуда Акрофаза, час

24-час. 12-час. 24-час. 12-час. 24-час. 12-час.

адгезия контроль 55,0* 19,2 16,5±1,6 9,9±2,3 8,2±3,2 00.06 23.10

S. aureus 60,8* 24,5 16,1±0,5 8,2±1,0 7,7±0,4 01.28 22.50

Е. coli «lac-» 53,3* 42,4* 18,0±2,7 9,6±3,1 9,0±5,2 01.56 21.44

В. bifldum 43,2* 53,3* 8,9±0,4* 4,2±1,3 4,8±0,7 00.06 01.50

пролиферация КОЕ/мл контроль 78,7* 12,2 165,4±23,4 137,1± 45,2 9,9±1,3 00.24 02.33

S. aureus 78,8* 9,4 137,1±6,2 119,7±34,2 8,4±1,6 23.30 16.10

Е. coli «lac-» 42,7* 20,3 155,1±13,3 132,8±9,3 8,4±1,5 02.00 19.20

В. bifidum 51,8* 21,0 192,3±26,4 126,6±24,3 8,5±6,2 03.26 13.20

морфогенез, % контроль 59,0* 30,7 5,0±0,5 17,4±4,2 3,4±0,9 07.10 20.10

S. aureus 63,2* 28,5 3,2±0,8 18,4±2,3 5,8±1,2 05.50 16.00

E. coli «lac-» 63,8* 22,7 4,5±2,2 17,0±3,1 5,3±1,9 05.25 16.20

B. bifidum 60,0* 32,3 5,9±1,2 17,8±2,1 4,3±0,4 06.30 20.58

фосфо-липаза, ммоль/л* час контроль 62,7* 22,0 12,3±2,8 9,5±1,3 5,3±1,9 06.12 08.46

S. aureus 64,2* 24,1 14,5±0,4 7,5±0,9 5,4±0,4 07.20 04.20

E. coli «lac-» 66,9* 12,4 11,4±0,5 8,7±2,1 4,2±0,7 06.20 22.45

B. bifidum 64,2* 26,1 9,8±0,4 8,5±1,3 5,2±0,8 02.10 00.56

протеаза мг/мин.м л контроль 60,9* 28,4 0,10±0,01 0,13±0,02 0,05±0,01 06.30 07.24

S. aureus 70,0* 15,3 0,14±0,02 0,10±0,02 0,03±0,01 05.08 08.00

E. coli «lac-» 60,0* 30,0 0,11±0,03 0,15±0,01 0,02±0,01 06.00 20.00

B. bifidum 69,6* 18,4 0,12±0,02 0,11±0,02 0,03±0,01 02.03 22.45

катал аза, мкмоль/ мин контроль 65,9* 23,2 0,22±0,02 0,11±0,03 0,02±0,01 06.40 06.52

S. aureus 85,8* 9,3 0,20±0,03 0,06±0,02 0,01±0,00 07.20 10.30

E. coli «lac-» 60,0* 24,1 0,18±0,03 0,07±0,02 0,02±0,01 07.50 13.10

B. bifidum 66,6* 23,1 0,22±0,01 0,06±0,02 0,03±0,01 03.35 11.30

Таблица 77

Ритмометрические параметры биологической активности С. кги8е1 под влиянием экзометаболитов бактерий

Функции С. albicans Ритмометрические показатели

Вклад ритма, % Мезор М±ш Амплитуда Акрофаза, час

24-час. 12-час. 24-час. 12-час. 24-час. 12-час.

адгезия контроль 67,8* 25,3 1,4±0,1 0,9±0,1 0,2±0,1 16.20 05.23

S. aureus 80,0* 10,3 1,5±0,2 1,2±0,1 0,3±0,1 15.20 04.20

Е. coli «lac-» 71,4* 12,4 1,6±0,1 1,0±0,2 0,4±0,1 15.34 03.54

В. bifidum 77,7* 21,8 1,3±0,1 0,7±0,2 0,2±0,1 18.10 05.56

пролиферация КОЕ/мл контроль 53,8* 34,2 220,4±49,7 238,6±34,7 109,5±26,9 23.10 08.00

S. aureus 69,6* 23,1 232,3±36,9 230,3±54,2 99,4±34,2 20.19 07.10

Е. coli «lac-» 69,2* 22,1 240,1±23,6 200,3±34,6 89,3±23,1 21.10 06.57

В. bifidum 67,5* 20,6 212,7±48,2 189,6±46,2 89,4±27,5 23.30 08.30

морфогенез, % контроль 58,3* 29,7 11,3±3,2 7,1±1,1 5,2±0,8 22.00 01.12

S. aureus 60,5* 29,4 10,9±5,6 8,6±1,0 5,7±1,2 21.00 00.20

E. coli «lac-» 55,1* 33,4 11,4±2,5 8,0±0,9 6,3±3,4 20.19 01.34

B. bifidum 58,2* 36,2 9,8±3,1 6,4±2,1 4,9±2,4 23.28 22.20

фосфо-липаза, ммоль/л* час контроль 75,0* 18,9 8,8±1,1 25,1±4,3 10,2±1,3 04.56 04.28

S. aureus 70,5* 10,3 9,7±1,3 24,7±3,5 11,2±2,3 04.20 05.39

E. coli «lac-» 77,3* 15,3 9,0±1,4 26,3±5,2 9,6±0,8 04.18 06.10

B. bifidum 73,5* 20,1 8,0±0,9 22,8±5,2 8,6±0,8 03.20 06.34

протеаза мг/мин.м л контроль 75,0* 12,3 0,11±0,01 0,18±0,03 0,06±0,01 04.32 00.10

S. aureus 84,6* 10,4 0,12±0,03 0,22±0,03 0,04±0,01 05.10 23.10

E. coli «lac-» 82,6* 9,6 0,14±0,01 0,19±0,02 0,05±0,02 04.39 22.56

B. bifidum 80,9* 11,5 0Д1±0,01 0,17±0,02 0,04±0,01 03.00 00.27

каталаза, мкмоль/ мин контроль 69,2* 20,1 0,22±0,02 0,09±0,02 0,04±0,01 04.31 09.23

S. aureus 73,3* 15,3 0,26±0,03 0,11±0,02 0,04±0,01 04.10 10.23

E. coli «lac-» 66,6* 12,9 0,25±0,04 0,12±0,01 0,06±0,01 04.00 11.09

B. bifidum 72,7* 10,5 0,20±0,01 0,08±0,01 0,03±0,01 03.10 08.50

С. albicans контроль

С. albicans после воздействия метаболитов бактерий, соинкубированных с метаболитами грибов:

ассоциантов Е. coli «lac-»

ассоциантов S. aureus

Рис. 90. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств клинического изолята С. albicans после воздействия экзометаболитами бактерий дисбиотической микрофлоры кишечника; Т=12

Примечание: 1) пролиферация; 2) морфогенез; 3) фосфолипаза. По окружности - время суток, часы.