Особенности внутриклеточного транспорта малых неструктурных белков вирусов растений, определяющих вирулентность и взаимодействие с хозяином

Гущин, Владимир Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности внутриклеточного транспорта малых неструктурных белков вирусов растений, определяющих вирулентность и взаимодействие с хозяином
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности внутриклеточного транспорта малых неструктурных белков вирусов растений, определяющих вирулентность и взаимодействие с хозяином"

На правах рукописи

ГУЩИН Владимир Алексеевич

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА МАЛЫХ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ВИРУЛЕНТНОСТЬ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ХОЗЯИНОМ

005049560

03.01.03 - Молекулярная биология

1 4 ФЕВ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005049560

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета и в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты:

Завриев Сергей Кириакович, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАСХН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), заведующий лабораторией.

Лазаревич Наталия Леонидовна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский

онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «28» февраля 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан » января 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Изучение вирусных белков, определяющих патогенность и взаимодействие с хозяином, является важной задачей современной молекулярной вирусологии. Согласно данным последнего десятилетия, полученным с применением высокопроизводительных методов секвенирования нуклеиновых кислот, выделенных из материала различных образцов окружающей среды, разнообразие вирусов гораздо шире, чем предполагалось ранее (Roossinck et al., 2010; Roossinck, 2011a, с, d; Culley, 2011; Mokili et al., 2012). Значительная часть обнаруженных таким путем вирусов при инфекции не вызывает симптомов болезней или ухудшения состояния организма хозяина, а порой придает дополнительные свойства. Таким образом, восприятие вируса как объекта, приносящего исключительно вред, трансформируется, а вопрос изучения факторов, приводящих к появлению и усилению патогенности, становится еще актуальнее. Всестороннее изучение феномена «патогенности» создает потенциал, который можно будет использовать для предотвращения или уменьшения последствия вирусного заражения, повышая, таким образом, качество жизни человека, экологию, а также улучшая рентабельность сельскохозяйственных производств. Одним из основных направлений, несомненно, является изучение патогенности вирусов на молекулярном уровне.

Известно, что вирусы, помимо факторов, необходимых для репликации и сборки вириона, кодируют белки, которые для них не являются жизненно необходимыми. Между тем, данные белки могут значительно влиять на патогенность вируса (Yelina et al., 2005; Lukhovitskaya at al., 2005a, b; Lukhovitskaya at al., 2009). Известно, что некоторые из этих белков являются супрессорами посттранскрипционного умолкания генов (ПТУГ), тогда как функция других на сегодняшний день не вполне понятна. Одним из таких является белок ОРТ6 (открытая рамка трансляции 6) вируса табачной мозаики (ВТМ), рассматриваемый в настоящей работе. Ген этого белка перекрывается с открытыми рамками трансляции транспортного белка (ТБ) и белка оболочки (БО) и, предположительно, кодирует полипептид массой 4-5 кДа (Morozov et al., 1993). Похожие по размеру и последовательности ОРТ6 можно обнаружить у всех представителей субгруппы тобамовирусов la (Ikeda et al., 1993; Morozov et al., 1993). Ранее в нашей лаборатории было показано, что ОРТ6 вируса томатной мозаики (ВТоМ) штамма L (L-ОРТ6) способен к образованию стабильного комплекса с фактором элонгации трансляции eEFIA in vitro (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Кроме того известно, что мутация гена ОРТ6 ВТМ штамма U1 (U1-OPT6) ведет к уменьшению патогенности ВТМ,

тогда как его экспрессия в составе геномов вируса погремковости табака (ВПТ) и X -вируса картофеля (ХВК) усиливает патогенез этих вирусов (Canto et al., 2004). Несмотря на то, что L-OPT6 и U1-OPT6 занимают похожие позиции в геномах родственных вирусов, а также имеют умеренно сходные аминокислотные последовательности (Morozov et al., 1993), на сегодняшний день неясно, насколько сходные свойства они проявляют in vivo и каковы их функции. Цель и задачи исследования:

Целью данной работы является сравнительный анализ малых неструктурных белков L-OPT6 и U1-OPT6. Для достижения поставленной цели решались следующие основные научные задачи:

1. Изучение способности данных белков определять характер вирусной инфекции. Создание конструкций на основе инфекционных копий ВТоМ и ВПТ, экспрессирующих различные варианты ОРТ6. Изучение симптомов, вызываемых созданными вариантами вирусов на различных растениях-хозяевах.

2. Картирование детерминанты патогенности в составе последовательности L- и U1-OPT6 с использованием точечного мутагенеза и гибридных последовательностей, содержащих N-и С-конец от разных ОРТ6.

3. Изучение внутриклеточной локализации белков L- и U1-OPT6 в клетках эпидермиса листа N. benthamiana с использованием метода временной экспрессии ОРТ6 в одной рамке трансляции с GFP.

4. Поиск последовательностей, ответственных за внутриклеточную локализацию L- и U1-ОРТ6, с использованием точечного мутагенеза и гибридных последовательностей, содержащих N- и С-конец от разных ОРТ6.

5. Исследование взаимодействия между L-OPT6 и eEFl A in vitro.

6. Изучение способности связывания нуклеиновых кислот белком L-OPT6 in vitro. Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые проведена сравнительная характеристика белков L- и U1-OPT6. Во-первых, показано, что белок L-OPT6, в отличие от белка U1-OPT6, не усиливает патогенез ВТоМ. Во-вторых, L-OPT6, экспрессированый в составе вируса погремковости табака (ВПТ), лишь слегка усиливает патогенность вируса, тогда как U1-OPT6 вызывает некроз стебля и гибель растения. С использованием точечных мутантов, а также гибридных вариантов последовательности ОРТ6 с N-и С-концами от L- или U1-OPT6, определены детерминанты патогенности обоих белков в С-концевом районе. В-третьих, изучена субклеточная локализация белков, которая, как оказалось, также является различной. Белок U1-OPT6 первоначально обнаруживается в ядрышке и ядре, но в

дальнейшем перемещается в митохондрии, тогда как L-OPT6 находится в ассоциации с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) все время наблюдения. В работе проведено картирование последовательностей, ответственных за различия во внутриклеточной локализации этих белков.

В работе впервые представлены эксперименты по связыванию белком L-OPT6 нуклеиновых кислот. Показано, что мутация Ile>ll>Thr в составе аминокислотной последовательности L-OPT6, блокирующая образование комплекса с фактором элонгации трансляции eEFlA, нарушает также кооперативность связывания белка с нуклеиновыми кислотами.

Результаты данной работы могут быть использованы в практике научных исследований в области вирусологии и молекулярной биологии, а также при чтении курсов лекций по вирусологии на биологических факультетах. Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты работы были доложены на семинарах кафедры вирусологии, на международных конференциях: «Информационные технологии в медицине, биологии и экологии» 2010, 2011, 2012 гг. (г. Ялта, Украина), а также на ежегодной конференции для аспирантов института Джеймса Хаттона 2011 г. (г. Данди, Шотландия). Публикации

По материалам диссертации опубликованы 6 печатных работ. Из них статьей в реферируемых журналах - 2, материалов международных конференций - 4. Структура работы

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».

Диссертация изложена на | страницах, содержит рисунок и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы»

Цитируемая работа).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Мутация инициаторного кодона ОРТ6 не влияет на патогенность ВТоМ

Ранее было показано, что мутация стартового кодона ОРТ6 ВТМ в составе

инфекционной копии ведет к снижению патогенности вируса (Canto et al., 2004). В

настоящей работе в инфекционную копию ВТоМ (Kubota at al., 2003) была внесена

аналогичная мутация AUG > ACG, разрушающая стартовый кодон, но оставляющая без изменения аминокислотную последовательность ТБ, находящуюся в другой рамке трансляции. Кэпированные транскрипты полученной конструкции ВТоМ[-ОРТ6], а также дикого типа ВТоМ инокулировали в два нижних листа растений N. benthamiana различного возраста (2-10 недель). В обоих случаях инокулированные растения погибали через 7-10 дней после инфекции (д.п.и.) (Рис. 1А,В). Для проверки наличия мутации в нужном положении тотальная РНК из верхних листьев растений, зараженных обоими вариантами, подвергалась обратной транскрипции с вирус-специфичным праймером. После чего интересующая область, содержащая мутацию, амплифицировалась с соответствующими праймерами и секвенировалась. При этом не было обнаружено реверсий мутации к дикому типу. Также не было обнаружено мутаций в других положениях секвенированного фрагмента. Таким образом, влияния ОРТ6 на патогенность ВТоМ на N. benthamiana установлено не было. Этот результат был перепроверен на других растениях-хозяевах. Симптомы, вызываемые вирусом дикого типа и мутанта в системных листьях, были сходными и развивались с одинаковой скоростью на растениях N. clevelandii (изменение формы листовой пластинки) (Рис. 1С), N. íabacum cv. Samsun nn (мозаика) и томата (изменение формы листа и мозаика) (данные не показаны). В дополнение к визуальной оценке и контролю с помощью ПЦР и секвенирования, образцы РНК из N. benthamiana и N. clevelandii зараженных растений были использованы для Нозерн-блот анализа с использованием ВТоМ-специфичной пробы (Рис. 1D). Образцы отбирались со всех листьев с интервалом 2-3 дня в течение 3-х недель или до гибели растения (в случае с N. benthamiana). В результате этих экспериментов было показано отсутствие разницы в накоплении вирус-специфичной РНК в растениях, зараженных ВТоМ и ВТоМ[-ОРТ6], что сочетается с результатами, полученными на ВТМ (Canto at al., 2004). Кроме того, для определения возможного влияния мутации ОРТ6 на межклеточный транспорт ВТоМ проводилась оценка размера некрозов, вызываемых ВТоМ и ВТоМ[-ОРТ6] на соседних половинах одного и того же листа некротических хозяев N. tabacum cv. Xanthi NN и N. tabacum cv. Samsun NN. Статистически достоверной разницы в размерах некрозов, нормированных на лист, обнаружено не было (данные не показаны). Таким образом, ОРТ6 не проявлял видимого влияния на патогенность ВТоМ, распространение вируса и накопление вирусной РНК на всех протестированных растениях-хозяевах.

Рис. 1. Анализ симптоматики и накопления вируса в растениях, зараженных ВТоМ и ВТоМ[-ОР Г6|.

Растения N. Ьеп1Иат1апа на 6й и 12й д.п.и. (А и В, соответственно) и растения N. с1еуе1апсШ на 10 д.п.и. (С). Левое растение на каждой картинке было заражено ВТоМ и правое ВТоМ[-ОРТ6]. (Э) Нозерн-блот анализ образцов тотальной РНК N. ЬешИат1апа, меченных ВТоМ-специфичной пробой. С - контроль (РНК образец из незараженного растения). Числа сверху обозначают позицию листа выше инокулированного. В качестве контроля нанесения использовано окрашивание тотальной РНК бромистым этидием и приведено под каждой панелью.

Влияние белков L- и U1-OPT6 и их гибридов на патогенез ВПТ

Ранее было показано, что U1-OPT6 усиливает патогенность неродственных

вирусов, таких как ХВК и ВПТ (Canto et al., 2004). Для того чтобы изучить способность L-ОРТ6 усиливать патогенез ВПТ, а также сравнить с эффектом U1-OPT6 (Canto et al., 2004), был сконструирован вектор ВПТ[Ь-ОРТ6], экспрессирующий L-OPT6 в составе РНК 2 ВПТ. Растения N. benthamiana инокулировались соответствующим кэпированным транскриптом РНК 2 и немодифицированным кэпированным транскриптом РНК1 ВПТ. В качестве контроля использовался вариант РНК 2, несущей ген GFP вместо ОРТ6, что приводило к слабым симптомам, выражающимся в небольшом изменении формы верхних листьев, зараженных системно (Рис. 2А,В). Кроме того, экспрессию GFP этого контроля наблюдали под ультрафиолетовой лампой со 2-го д.п.и. в инокулированных листьях и после 4-го д.п.и. в системно зараженных листьях (данные не показаны). На растениях, зараженных ВПТ[Ь-ОРТ6] и ВПТ[Ш-ОРТ6], кроме деформации системных листьев, наблюдался некроз (Рис. 2C,D), который был слабее в случае ВПТ[Ь-ОРТ6]. Кроме того, на растениях зараженных ВПТ[1Л-ОРТ6] проявлялся сильный некроз стебля, который приводил к отмиранию апикальной части растения через 6 д.п.и. В случае с ВПТ[Ь-ОРТ6] такого эффекта не наблюдалось и на более поздних стадиях. Таким образом, оба варианта ОРТ6 были способны усиливать патогенность ВПТ, хотя в разной степени.

Сравнение аминокислотных последовательностей L-OPT6 и U1-OPT6 показывает умеренный уровень сходства в N-концевой и центральной областях (Рис. 3), тогда как в С-концевой части обнаруживаются наибольшие различия. С-концевая часть U1-OPT6 на 6 аминокислот длиннее, и в то же время, является менее гидрофобной (Kyte & Doolittle 1982). Чтобы проверить связаны ли различия в аминокислотной последовательности С-концевой части ОРТ6 ВТоМ и ВТМ с их биологическим эффектом были сконструированы рекомбинантные варианты ОРТ6, у которых N- и С-концевые части происходили от разных ОРТ6 (Рис. 3). Полученные рекомбинантные ОРТ6 были клонированы в составе РНК 2 ВПТ, как и дикие типы. Таким образом, ВПТ[Ш::Ь-ОРТ6] включал в своем составе N-концевую часть от U1-OPT6 и С-концевую от L-OPT6, тогда как ВПТ[Ь::Ш- ОРТ6], наоборот, N-концевой район от L-OPT6 и С-концевую область от U1-OPT6. Инокуляция растений транскриптами этих конструкций с РНК 1 ВПТ показала, что ВПТ[Ш ::L-OPT6] вызывал симптомы, сходные с ВПТ[ЮРТ6] (Рис. 2F), тогда как растения, зараженные ВПТ[Ь::Ш-ОРТ6], имели симптомы, сходные с ВПТ[Ш-ОРТ6] и выражающиеся в отмирании апикальной части растения (Рис. 2Е).

Рис. 2. Влияние Ь- и Ш-ОРТ6 белков и их гибридов на патогенез ВПТ на растениях N. ЬеШкат'шпа.

(А) - Незараженные растения, (В) - растения, зараженные ВПТ[СРР], (С) - ВПТ[Ь-ОРТ6], (Э) - ВПТ[Ш-ОРТ6], (Е) - ВПТ[Ь::1Л-ОРТ6], (Р) - ВПТ[Ш::Ь-ОРТ6], (в) - ВПТ[Ь-ОРТ6-НУОЯ] и (Н) - ВГЩШ-ОРТ6-ЯК]. Все фотографии сделаны на 6 д.п.и.

Таким образом, присутствие С-концевой части от 1Л-ОРТ6 было сопряжено с более суровыми симптомами, такими как скручивание листьев и некроз стебля, сопровождающееся отмиранием апикальной части зараженного растения, тогда как С-концевая часть от ЮРТ6 коррелировала с более мягкими симптомами. Для оценки накопления вирусной РНК был проведен Нозерн-блот анализ с РНК2 ВПТ-специфичной пробой. Связи между степенью проявления симптомов и количеством вирусной РНК не обнаружилось (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о том, что патогенность Ш-ОРТ6 ассоциирована с С-концевой частью белка, которая длиннее и менее гидрофобная, чем соответствующая часть у Ь-ОРТ6.

(а) РЗРП

Small replicase subunit

(b)

L::U1-OPT6 U1::L-OPTe

L-OPT6-HYDR

L-OPT6-RK

L-OPTS-HYDR-RK

L-OPT6-HYDR-FR1 L-OPT6-HYDR-FR2 L-OPT6-HYDR-FR3 L-OPT6-HYDR-FR4

U1-OPT6-RK

mkprrrsrilirikyvllnhfsiaicvfvicmg ■* * * **■ * + ** + + * * + + +

mmirrllspirirfkyvlqyhysisvrvlvisvgrpnrvn

mkprrrsrilirikyvllnhfsiairvlvisvgrpnrvn mmirrllspnrirfkyvlqyhysisvcvfvicmg

MKPRRRSRILIRIKYVLLNHFSIAI^^^^2

Íilirikyvllmhfsiaicvfvicmg

ilirikyvllnhfsiai^^Hg

§ ^R Я

1ИI

mkprrrsril

milirikyvll

mlnhfsiaic

mmihllspirirfkyvlqyhysisvrvlvisvgrpnrvn

Рис. 3. Схема генома тобамовирусов и варианты ОРТ6, используемые в работе. (А) Отмечено положение открытых рамок трансляции РНК-зависимой РНК-полимеразы (РЗРП), транспортного белка (МР), белка оболочки (СР), а также ОРТ6 (ОЯРб). (В) Выравнивание последовательностей Ь- и Ш-ОРТ6. Идентичные аминокислоты отмечены звездочками, тогда как похожие - знаком плюс. Приведены гибридные последовательности ОРТ6, а также мутантные последовательности, используемые в работе.

Для дальнейшей характеристики детерминант патогенности в аминокислотной

последовательности ОРТ6 были сделаны конструкции ВПТ[Ь-ОРТ6-НУОК], с заменами

гидрофобных остатков Ь-ОРТб в С-концевой части на менее гидрофобные и ВПТ[Ш-

ОРТ6-11К], в которой положительно заряженные остатки аргинина в ]М-концевой части

Щ-ОРТ6 были мутированы на нейтральные (Рис. 3). Не было обнаружено влияния

мутации положительно заряженных остатков в И-концевой части 1Л-ОРТ6, что

согласуется с данными о значении именно С-концевой части белка как детерминанты

патогенности (Рис. 2Н). ВПТ[Ь-ОРТ6-НУОК] вызывал мягкие симптомы, схожие с

ВПТ[ОРР] (Рис. 2С), что свидетельствует о том, что не повышенная гидрофильность Ш-

0РТ6 сама по себе определяет патогенные свойства, но специфические аминокислотные остатки в этой области играют роль в определении этого фенотипа, а также то, что детерминанта патогенности L-OPT6 также находится в С-концевом районе белка. Субклеточная локализация L- и U1-OPT6 и их гибридов.

Для анализа субклеточной локализации гены L- и U1-OPT6 были слиты в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора. Данные конструкции, в дальнейшем, использовались для экспрессии белков посредством агробактериальной трансформации клеток эпидермиса листа N. benthamiana. Наблюдения проводили с использованием сканирующего конфокального микроскопа. Для визуализации субклеточных структур использовались трансгенные растения, экспрессирующие красный или зеленый флуоресцентные белки (mRFP или GFP), слитые в одной рамке трансляции с белками маркерами различных компартментов: ядерный маркер H2B-mRFP, гистон Н2В (Martin et al., 2009), маркер ядрышка AtFib2-mRFP, фибрилларин (Goodin et al., 2007), маркер аппарата Гольджи ST-mRFP, N-концевая последовательность фермента сиалилтрансферазы крысы, маркер плазмодесм (ПД) MP-GFP, ТБ ВТМ, и маркер ЭПР ER-GFP, где GFP находится в одной рамке с ЭПР-направляющим сигналом на N-конце и ЭПР-удерживающим сигналом на С-конце (HDEL). Кроме того, в качестве контроля использовался свободный YFP, который локализовался в цитоплазме и ядре, но не в ядрышке (Рис. 4). Было обнаружено, что U1-OPT6-YFP, на 1-2 д.п.и., локализуется преимущественно в ядрышке, концентрируясь на его периферии (Рис. 4А). Позднее, на 3-4 д.п.и., сигнал наблюдался в основном в цитоплазматических тельцах 0,8-1 мкм неизвестной природы (Рис. 4В).

Небольшая часть цитоплазматических телец начинала появляться на 1-2 д.п.и., в то время как большая часть сигнала концентрировалась в ядрышке. Позднее, увеличение количества популяции цитоплазматических телец было сопряжено с уменьшением сигнала в ядре и ядрышке, вплоть до его полного исчезновения. Цитоплазматические тела не ко-локализовались с маркером аппарата Гольджи (данные не показаны). Для того чтобы понять природу цитоплазматических телец аминокислотная последовательность U1-OPT6 была проанализирована с использованием программ TargetP и WOLF PSort. Обе программы предсказывали локализацию U1-OPT6-YFP в митохондриях с высокой вероятностью. Чтобы подтвердить эти данные, конструкция U1-OPT6-YFP была экспрессирована в клетках эпидермиса листа с последующей их обработкой прижизненным красителем митохондрий MitoTracker Red перед просмотром. Как и ожидалось, наблюдалась полная ко-локализация U1-OPT6-YFP с маркером митохондрий (Рис. 4С).

(а)

(с)

(d)

(f)

Рис. 4. Субклеточная локализация белков U1- и L-OPT6 и их гибридов, слитых в одной рамке трансляции с YFP в клетках эпидермиса листа трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих маркер ядрышка фибрилларин (AtFib2), слитый с mRFP (A,D,F), или ядерный маркер Н2В, слитый с mRFP (B,E,G). (А) -Локализация Ш-ОРТ6 на 1-2 д.п.и., (В) - U1-OPT6 на 3-4 д.п.и., (С) - U1-OPT6 ко-инфильтрированный с маркером митохондрий MitoTracker Red на 3 д.п.и., (D) - свободный YFP на 1-4 д.п.и., (Е) - L-OPT6 на 1-4 д.п.и., (F) - L::Ul-OPT6 на 1-4 д.п.и. и (G) - Ul::L-OPT6 на 1-4 д.п.и.. Кроме микрофотографий, показывающих клетку целиком (слева), приведены микрофотографии одиночных оптических срезов тонких структур ядра (справа). Голубые тельца - автофлуоресцирующие хлоропласты. Масштабная линейка соответствует, 20 мкм (на микрофотографиях, показывающих клетку целиком); 5 мкм (на одиночных оптических срезах).

U1 - YFP+AtFib2-mRFP 1-2 д.п.и. Ul-YFP+H2B-mRFP 3-4 д.п.и.

Ul-YFP

•4 Single section

' у ** " г s

1 <Г. \ * »

* i t v t

U1 -YFP+MP-GFP

, ■■ U1>YFP

1- ; '.V

Merged

"гП

Рис. 5. Субклеточная локализация Ш-ОРТ6, слитого в одной рамке трансляции с УРР, в растениях N. Ьешкатгапам на 3 д.п.и. (А,С) - нетрансгенных и (В,Б) - трансгенных растениях N. Ьеп1Иат1апа, экспрессирующих маркер плазмодесм МР-вРР. Плазмолиз был индуцирован инфильтрацией листа 0,75М раствором сорбитола для отделения плазматической мембраны (РМ) от клеточной стенки (С\У) (С,О). Все микрофотографии, показывающие часть клетки, являются единичным оптическим срезом кроме (А) слева. Голубые тельца - автофлуоресцирующие хлоропласты. Масштабная линейка соответствует 20 мкм (на микрофотографиях, показывающих клетку целиком); 5 мкм (на одиночных оптических срезах, показывающих периферию).

В предыдущем исследовании было показано, что U1-OPT6-YFP локализуется в точках на периферии и что эти точки ко-локализуются с плазмодесмами (Canto et al., 2004). В настоящем исследовании эти данные были опровергнуты. Используя технику сканирования по Z, с последующим наложением слоев, было показано, что U1-OPT6-YFP локализуется по всей периферии клетки (Рис. 5А, слева), тогда как одиночные оптические срезы действительно давали похожую на ПД-подобную локализацию (Рис. 5А, справа), как у Canto et al. (2004). Для получения дополнительного подтверждения отсутствия ко-локализации с ПД были использованы два подхода. В первом подходе использовались трансгенные растения, экспрессирующие маркер плазмодесм MP-GFP (Рис. 5В), Во втором подходе использовалась техника плазмолиза клеток эпидермиса листа с помощью 0.75 М сорбитола, с целью отделения плазмалеммы от клеточной стенки (Рис. 5С). Также была применена техника, объединяющая оба подхода (Phc.5D). Эти эксперименты показали, что U1-OPT6-YFP ассоциируется с цитоплазматической фракцией, отходящей вместе с плазмапеммой, но не клеточной стенкой (Рис. 5C,D). Таким образом, можно заключить, что U1-OPT6-YFP локализуется в митохондриях, а не плазмодесмах.

В отличие, от U1-OPT6, L-OPT6 локализовался в цитоплазме в ассоциации с полигональной сетью ЭПР и ядерной оболочкой (Рис. 4Е), так как наблюдалась ко-локализация с маркером ЭПР (Рис. 6). Стоит также отметить, что эта локализация не менялась в течение всего времени наблюдения (на 1-4 д.п.и.).

L-YFP+ER-GFP

Рис. 6. Субклеточная локализация Ь-ОРТ6, слитого в одной рамке трансляции с УНР. в трансгенных растениях N. ЬешИат/апа, экспрессирующих маркер ЭПР (Т.К-ОКР). Представлен одиночный оптический срез. Масштабная линейка соответствует 5 мкм.

Так как было показано, что С-концевая часть ОРТ6 определяет патогенные свойства, то в ходе дальнейшего исследования была проанализирована субклеточная локализация гибридных рекомбинантных молекул 1Л :.Ь-ОРТ6 и Ь::Ш-ОРТ6, описанных

выше. Также как и варианты молекул дикого типа, гены гибридных молекул были слиты в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора, и в дальнейшем, использовались в экспериментах по агроинфильтрации на трансгенных растениях, экспрессирующих маркер ядра mRFP-H2B или ядрышка AtFib2-mRFP. Было обнаружено, что L::Ul-OPT6-YFP локализуется преимущественно в ядрышке, а также диффузно в нуклеоплазме и цитоплазме, в то время как никаких признаков локализации в митохондриях обнаружено не было (Рис. 4F). Такая локализация наблюдалась в течение всего времени эксперимента (1-4 д.п.и.). Напротив, Ul::L-OPT6 гибрид ассоциировался с мембранами ЭПР, но не ядром или ядрышком (Рис. 4G). Такое распределение также наблюдалось на протяжении 1-4 д.п.и. Таким образом, для митохондриальной локализации нужна либо полная последовательность U1-OPT6 (N-концевая и С-концевая), либо, в случае с Ul::L-OPT6, N-концевой сигнал митохондриальной локализации подавляется активностью ЭПР-направляющего сигнала в С-концевой части L-OPT6.

Детерминанты субклеточной локализации L- и Ш-ОРТ6

Как уже отмечалось ранее, анализ аминокислотной последовательности L-OPT6 показал, что С-концевая область является более гидрофобной, чем у U1-OPT6 (Рис. 3). Кроме того, присутствие С-конца L-OPT6 в составе гибрида Ul::L-OPT6 давало локализацию идентичную локализации L-OPT6, в ассоциации с ЭПР и не менялась со временем наблюдения. Для проверки гипотезы о том, что С-концевая часть L-OPT6 ответственна за локализацию белка в ЭПР, была использована конструкция L-OPT6-HYDR с заменами в С-конце (Рис. 3), уже использованная ранее в экспериментах по заражению ВПТ, но в данном случае слитая в одной рамке трансляции с N-конца YFP в составе бинарного вектора. Конструкция была экспрессирована посредством агроинфильтрации в клетках эпидермиса листа N. benthamiana, после чего наблюдения проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. На 1-2 д.п.и. L-OPT6-HYDR локализовался преимущественно на периферии ядрышка (Рис. 7А), напоминая дикий тип U1-OPT6-YFP (Рис. 4А). На 3-4 д.п.и. появлялась флуоресценция других структур ядра, в частности в виде различимых точек в ядрышке, сложенных в кольцо. Такая локализация напоминает расположение плотного фибриллярного компонента ядрышек растений, который содержит структуры, известные в литературе как "Christmas tree" (Chen et.al., 2002; Raska, 2003) (Рис. 7B). Также, в течение всего времени наблюдения, часть сигнала наблюдалась в цитоплазме клетки. Таким образом, С-концевая часть L-OPT6 влияет на способность белка ассоциироваться с ЭПР. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что U1- и L-OPT6 содержат сигналы ядерной/ядрышковой

локализации (МЦ5/МоЬ5), которые, как правило, представляют собой кластеры положительно заряженных аминокислот, направляющих белок в ядро или ядрышко (Мившоуа Й а1., 2011). Однако в случае с Ь-ОРТб, С-концевой гидрофобный сегмент, по-видимому, перенаправляет транспорт из ядра/ядрышка в ЭПР (в случае если Ь-ОРТ6 курсирует между ядром и ЭПР), или плотно фиксирует белок в ассоциации с ЭПР сразу после трансляции. Тем не менее, вне зависимости от конкретного механизма, мутация гидрофобной части ведет к локализации в ядре/ядрышке, вместо ассоциации с ЭПР.

Для поиска ЫоЬБ в составе Ь-ОРТ6 были использованы два подхода. В первом был проведен мутагенез ЮРТб-НУОЯ. Так как сигналы ядерной/ядрышковой локализации представлены в основном положительно заряженными аминокислотами (РПэсох, 2007; ТаНашку й а1., 2010), был сконструирован мутант Ь-ОРТб-НУБЯ-ЯК, несущий в дополнение к мутации в гидрофобном С-концевом районе мутацию в кластере из пяти положительно заряженных аминокислот в Ы-концевой области, потенциально вовлеченной в транспорт в ядро/ядрышко (Рис. 3). В качестве контроля мутация ЯК была также включена в последовательность дикого типа ЮРТ6 в составе конструкции Ь-ОРТб-ЯК (Рис. 3). Локализация этих мутантов была изучена в системе транзиентной экспрессии с помощью агротрансформации растений, несущих маркер ядра тЯБР-ШВ. Как и предполагалось, двойной мутант Ь-ОРТб-НУБЯ-ЯК терял ядерную/ядрышковую локализацию и локализовался диффузно в цитоплазме (Рис. 7С). Контрольный мутант Ь-ОРТ6-ЯК локализовался в цитоплазме в ассоциации с ЭПР (Рис. 70), как и дикий тип Ь-ОРТ6. Эти результаты показывают, что М-концевая часть, содержащая кластер положительно заряженных аминокислот, необходима для локализации в ядре/ядрышке, но, тем не менее, не обязательна для локализации ЮРТ6 в составе ЭПР.

Во втором подходе Ь-ОРТб-НУТЖ, локализующийся в ядрышке, был использован для получения четырех фрагментов (РЯ), слитых в одной рамке трансляции с УРР в составе бинарного вектора (Рис. 3). Эти фрагменты содержали: РЯ1 - десять М-концевых аминокислот, включающих кластер положительно заряженных аминокислот; БЯ2 -следующие за 1Ч-концом 10 аминокислот, включая мотив, ответственный за связывание ЕР1А (Могогоу е1 а1., 1993); БЯЗ - состоящий из десяти центральных аминокислот, между мотивом связывания ЕР1А и С-концом; а также РЯ4, представляющий собой С-концевые девять аминокислот, содержащих мутированный гидрофобный кластер (Рис. 3).

L-HYDR-YFP+AtFib2-mRFP L-HYDR-YFP+AtFib2-mRFP

l.-RK-IIYDR

+H2B-mRFl>

U1 -RK-YFP+AtFib2-mRFP

L-RK-HYDR-YFP+H2B-mRFP L-RK-YFP+H2B-mRFP

Рис. 7. Связь ядрышковой локализации L- и U1-OPT6 с кластером положительно заряженных аминокислот в N-конце. Слитые в одной рамке трансляции с YFP различные варианты ОРТ6 были экспрессированы посредством агроинфильтрации в растениях N. benthamiana, экспрессирующих маркеры ядрышка AtFib2-mRFP (А, В, Е) или маркер ядра H2B-mRFP (С, D). Используемые варианты ОРТ6: (А) - L-OPT6-HYDR на 1-2 д.п.и., (В) - L-OPT6-HYDR на 3-4 д.п.и., (С) - L-OPT6-HYDR-RK, (D) - L-OPT6-RK, (Е) -U1-RK. Все микрофотографии, показывающие часть клетки, являются единичным оптическим срезом. Голубые тельца - автофлуоресцирующие хлоропласты. Масштабная линейка, 20 мкм (на микрофотографиях, показывающих клетку целиком); 5 мкм (на одиночных оптических срезах).

В качестве контроля использовался свободный УРР. Локализация изучалась на трансгенных растениях, экспрессирующих маркер ядра (ШВ-тШТ) и ядрышка (А1РЛ2-тКРР) (Рис. 8). Только фрагмент, содержащий И-концевые 10 аминокислот, был способен направлять УРР в область ядрышка (Рис. 8А,В). Тогда как все остальные фрагменты локализовались подобно свободному УТР (контроль) (Рис. 8С,0,Е,Р). Таким образом, Ы-концевой фрагмент МКРДДКБШЬ содержит сигнал ядрышковой локализации. Стоит отметить, что интенсивность сигнала в ядрышке у М-концевого фрагмента, слитого с УРР, была гораздо слабее, чем у Ь-ОРТб-НУЭЯ (7А) или Ш-ОРТ6 (Рис. 4А). Этот эффект может объясняться тем, что МКРМШЭШЬ содержит неполный 1ЧоЬ8. Другим объяснением могло бы быть то, что полноразмерные ОРТ6 (в составе Ь-ОРТб-НУОИ или Ш-ОРТ6) содержат дополнительные последовательности, стабилизирующие ядрышковую локализацию через взаимодействия с другими компонентами ядрышка или дополнительно способствующие импорту в ядрышко.

МКРЯКН^ШЬ-УРР +А1Р1Ь-тЮ;Р МКРЮСКвМЬ-УРР +Н2В-тЯРР

МИЛЫКУУЬЬ-УРР МиЧНР51А1С-УРР

М^АБАТЯТО-УРР УРР

|||2В-тКГР КУ +Н2В-тКРР

Рис.8. Поиск сигнала ядрышковой локализации в составе последовательности белка Ь-ОРТ6. Четыре фрагмента [.-ОРТ6-1 [УПК, слитых с Ы-концом УРР, наблюдали на 2 д.п.и.. Ы-концевой фрагмент РИ! МКРККГ<8РП был ко-экспрессирован с ядрышковым маркером фибрилларином, слитым с тКРР (А) и ядерным маркером Н2В, слитым с тЯРР (В). Внутренние фрагменты РК2 МПЛШКУУЬЬ (С) и РКЗ МЬЫНР31А1С (О), С-концевой фрагмент РЯ4 МШАВАТЯТС (Е), а также свободный УРР (Р) были ко-экспрессированы с ядерным маркером Н2В, слитым с тЯРР. Микрофотографии представляют собой одиночные оптические срезы. Масштабная линейка соответствует 5 мкм.

Для того чтобы проанализировать наличие подобного сигнала ядрышковой локализации в составе N-конца U1-OPT6, был получен мутант, содержащий соответствующие замены U1-OPT6-RK (Рис. 3), слитый в одной рамке трансляции с YFP в составе бинарного вектора. Экспрессия этого мутанта в клетках эпидермиса листа посредством агроинфильтрации показала, что мутант не способен проникать в область ядрышка (Рис. 7Е) и локализуется в ядре подобно свободному YFP. Таким образом, L-ОРТ6 и U1-OPT6 содержат NoLS в N-концевой области. С помощью программных предсказаний было показано, что митохондриальная локализация у мутанта U1-OPT6-RK сохраняется, что также было видно по наличию телец в цитоплазме соответствующих по фенотипу тельцам, образуемым U1-OPT6. (Рис. 4В). Изучение взаимодействия между L-OPT6 и eEFIA in vitro

Фактор элонгации трансляции eEFIA играет существенную роль в жизненном цикле ВТМ (Yamaji et al., 2010). EEFIA взаимодействует с тРНК-подобной структурой (Litvak et al., 1973; Mans et al., 1991) и двумя псевдоузлами в 3' нетранслируемой области (З'-НТО) РНК ВТМ (Zeenko et al., 2002), а также взаимодействует с метилтрансферазным доменом РНК-зависимой РНК-полимеразы (Yamaji et al., 2006) и белком ОРТ6 (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Для изучения взаимодействия между eEFIA и L-OPT6 в данной работе использовалась описанная ранее экспериментальная система (Morozov et al., 1993) с некоторыми модификациями. Полученные in vitro некэпированные транскрипты гена ОРТ6 и его мутантов транслировали in vitro в лизате ретикулоцитов кролика (ЛРК) в присутствии лейцина, меченного [14С]. Поскольку ранее было показано, что N- и С-концевые районы ОРТ6 не влияют на образование комплекса с eEFIA (Morozov et al., 1993), с целью выравнивания количества остатков лейцина ген ОРТ6 был слит с искусственной последовательностью, добавляющей к N-концу всех использованных в данной работе вариантов ОРТ6 пептид MALSRLLDLLGSTSRS. содержащий пять дополнительных остатков лейцина. После разделения продуктов трансляции в ДСН-ПААГ комплекс, образованный меченым белком, кодируемым ОРТ6, и эндогенным eEFIA, присутствующим в ЛРК, детектировался в геле как полоса с молекулярной массой около 54 кДа, тогда как несвязанный продукт трансляции ОРТ6 двигался в геле как полоса с молекулярной массой 4 кДа, как и в оригинальных работах (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Изображения гелей анализировались с помощью программы Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics). Доля белка ОРТ6, находящегося в составе комплекса, от общего количества ОРТ6 рассчитывалась на основе интенсивности полос в геле с учетом эффективности трансляции каждой пробы. Статистическая обработка проводилась по данным дважды повторенных экспериментов.

0PT6-L MKPRRRSRILIRIKYVLLNHFSIñICVFVICMG*

0PT6-L-SICIE ---------S-C-E-------------------*

0PT6-L-I11T ----------T----------------------*

Рис. 9. Последовательности Ь-ОРТ6, а также мутантов, использованные в работе. Дефисы обозначают аминокислотные остатки, идентичные Ь-ОРТ6.

1_-\«Т Ь-в1С1Е ПИТ

•117 100

•85 ? 80 Ф

r.j ■50 i 60 a в

3 40

•10 к в ° 20 0

Рис. 10. Образование комплекса eEFlA/ОРТб в системе трансляции in vitro. Полученные in vitro некэпированные транскрипты (0,1 мкг), кодирующие белок ОРТ6 или его мутанты, транслировали в лизате ретикулоцитов кролика. Продукты реакции разделяли в 8-20% градиентном ДСН-ПААГ. Радиоавтограф ПААГ с продуктами трансляции OPT6-L, OPT6-L-SICIE и OPT6-L-111Т показан слева. Положение в геле комплекса eEFlA/ОРТб показано белой стрелкой; положение несвязанного ОРТ6 - черной стрелкой. Справа показано положение в геле маркеров молекулярной массы, указанной в кДа. Статистический анализ результатов связывания различных вариантов ОРТ6 и eEFIA приведен справа. Показан процент продукта трансляции ОРТ6, находящегося в составе комплекса с eEFIA.

Сравнение эффективности образования комплекса с eEFIA, проведенное для белка

дикого типа L-OPT6 и мутанта L-OPT6-SICIE (Рис. 9), для которого ранее было показано существенное снижение эффективности связывания eEFIA (Morozov et al., 1993), выявило, что последовательность, богатая лейцином, находящаяся на N-конце белка ОРТ6 и его мутантов, использованных в настоящей работе, не оказывает существенного влияния на способность к взаимодействию с eEFIA (Рис. 10). Также был проанализирован мутант L-OPT6-I11T (Рис. 10). Было обнаружено, что мутанты SICIE и I11T имеют достоверно сниженную способность к образованию комплекса по сравнению с белком дикого типа L-ОРТ6 (Рис. 10). Эти данные согласуются с ранее опубликованными результатами (Morozov et al., 1993). Важно, что точечная мутация II1Т, для которой на основании сравнения эффектов нескольких множественных мутантов было сделано предсказание о том, что она может быть достаточна для нарушения взаимодействия с eEF 1A (Morozov et al., 1993) действительно эффективно блокирует образование комплекса (Рис. 10). Аминокислотная замена II1Т в L-OPT6 препятствует образованию комплекса с eEFIA и кооперативному связыванию нуклеиновых кислот.

Способность связывать РНК свойственна многим белкам РНК-содержащих вирусов растений, принимающих участие в репликации, инкапсидации и транспорте

вирусного генома, а также в супрессии РНК-интерференции. Поскольку N-концевая область L-OPT6 включает кластер положительно заряженных остатков, которые потенциально могли бы определять взаимодействие белка с нуклеиновыми кислотами, были проведены эксперименты по выявлению такого рода взаимодействий. Белок L-OPT6 дикого типа и его мутант L-OPT6-IT, слитые с последовательностью из шести гистидиловых остатков, были экспрессированы в E.coli и очищены на Ni-NTA-агарозе (Рис. 11). Анализ способности L-OPT6 и L-OPT6-I11T взаимодействовать с различными типами нуклеиновых кислот проводили методом сдвига в геле. В соответствии с описанной ранее методикой (Rakitina et al., 2011). Рекомбинантные белки инкубировали с РНК или ДНК в буфере для связывания (20 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 1 мМ DTT, 3 мМ MgC12, 50 мМ NaCl), а затем пробы разделяли в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Изображения гелей, полученные в ультрафиолетовом свете, анализировали с помощью программы Gel-Pro Analyzer.

A L-WT L-I11T к

ОРТ6 ^^ . ..............

В _L-WT__L-I11T_

1:0 1:1 1:2 1:10 1:0 1:1 1:2 1:10

Рис. 11. Сравнительный анализ способности рекомбинантных белков ОРТ6-Ь и ОРТ6-Ь-111Т связывать тРНК и З'-НТО ВТМ. А. - Белки ОРТб-Ь и ОРТ6-1_-П1Т. выделенные на М-ИТА-агарозе. После разделения в 20% ДСН-ПААГ белки окрашивали Составе С250. В. - Анализ РНК-связывания методом сдвига в агарозном геле. Каждая проба содержала тРНК и транскрипт, соответствующий З'-НТО ВТМ, к которым добавляли увеличивающиеся количества 01М6-1, и ОРТб-Ь-ШТ. Над дорожками геля указано молярное соотношение РНК:белок в каждой пробе. Положение в геле несвязанных тРНК и транскрипта З'-НТО ВТМ показаны черной и белой стрелками, соответственно. Серая стрелка указывает положение комплекса, не способного мигрировать в геле и находящегося в лунках.

Данные, полученные в экспериментах по сдвигу в геле, проведенные с различными типами нуклеиновых кислот, показывают, что белок Ь-ОРТ6 дикого типа способен связывать одноцепочечные РНК, а также двуцепочечные РНК и ДНК (Рис. 11 и данные не показаны). Образование комплексов, не способных мигрировать в геле, наблюдаемое в этих экспериментах (Рис. 11), является характерным признаком кооперативного взаимодействия белков и нуклеиновых кислот (Яакйта е1: а1., 2011). Эти данные указывают на возможность гомотопических взаимодействий молекул белка Ь-ОРТ6. При

этом в опытах по конкурентному связыванию было обнаружено, что наблюдается предпочтение в связывании белком L-OPT6 З'-НТО РНК ВТМ по отношению к тРНК (Рис. 3), что указывает на возможность прямого взаимодействия белка L-OPT6 с той областью геномной РНК ВТМ, для которой ранее было выявлено взаимодействие с eEFl A (Litvak et al., 1973; Mans et al., 1991; Zeenko et al., 2002). Интересно, что мутант L-OPT6-I11T связывает РНК примерно с той же эффективностью, что и белок дикого типа, но не образует комплексов, неспособных мигрировать в геле (Рис. 11), что говорит об утере кооперативности связывания РНК. Таким образом, можно заключить, что мутация II 1Т расположена в области белка L-OPT6, которая участвует в образовании комплекса с eEFl А и влияет на кооперативность связывания нуклеиновых кислот. Заключение

Данные, представленные в этой работе, свидетельствуют о том, что, не взирая на факт наличия схожих последовательностей и подобных позиций в геномах близкородственных вирусов, белки L- и U1-OPT6, имеют немало отличительных черт. Например, разные свойства наблюдаются в способности влиять на патогенность вируса в составе генома тобамовируса и ВПТ. В целом, в изученных экспериментальных системах L-OPT6 проявляет себя как более слабый фактор патогенности, несмотря на то, что, по-видимому, у обоих белков детерминантой патогенности является С-конец. При изучении локализации также выясняется, что эти белки оккупируют разные субклеточные компартменты. Белок U1-OPT6 имеет динамичную локализацию, перемещаясь из ядрышка в митохондрии, тогда как L-OPT6 стабильно ассоциируется с мембранами ЭПР. При этом оба белка содержат функциональный сигнал ядрышковой локализации (NoLS) в составе N-конца, который, по всей видимости, в случае с L-OPT6 и Ul::L-OPT6 перенаправляется С-концом, в мембраны ЭПР. В настоящей работе все варианты ОРТ6, приводящие к некрозу стебля в системе ВПТ, локализовались в ядре/ядрышке. На сегодняшний день немало известно о функциях ядра и ядерных компонентов, в том числе ядрышка растений в микроРНК/киРНК регуляции экспрессии генов или «сайленсинга» (Taliansky et al., 2010; Shaw and Brown, 2012). Для вирусов эта система является одним из барьеров, для преодоления которого вирусы кодируют разнообразные белки супрессоры сайленсинга (Csorba et al., 2009). Для ряда супрессоров сайленсинга показана ядерная/ядрышковая локализация. Так для белка потивируса VPg было показано взаимодействие с компонентом ядрышка фибрилларином и необходимость ядерной/ядрышковой локализации для супрессии сайленсинга (Rajamaki and Valkonen, 2009). В свою очередь, хорошо изученный супрессор сайленсинга вируса мозаики огурца 2Ь в ядрышке взаимодействует с AGOl, являющимся коровым компонентом комплекса

RISC. В системе in vitro было показано, что связывание AGOl белком 2Ь достаточно для ингибирования его функции (Gonza'lez et al., 2010; Duan et al., 2012). Стоит отметить, что высокий уровень экспрессии белка 2Ь в составе генома неродственного вируса также приводил к некрозу стебля, вызывающему гибель растения (Brigneti et al., 1998).

В экспериментах Canto at al. (2004) не было обнаружено способности супрессировать сайленсинг белком U1-ORT6. Подобные результаты были получены на L-ОРТ6 (Н. И. Луховицкая, неопубликованные данные). Тем не менее, не исключено, что специфические взаимодействия с системой супрессии сайленсинга в будущем будут обнаружены, например, на специфических растениях хозяевах. Так, например, известно, что некоторые клостеровирусы имеют три различных гена, кодирующих супрессоры, работающие при инфекции различных растений, позволяя вирусу расширять круг хозяев (Tatineni et al., 2011). Если ОРТб действительно вовлечен во взаимодействия с системой супрессии сайленсинга, то способность связывать нуклеиновые кислоты может быть необходима для взаимодействия с предшественниками коротких РНК или самими короткими РНК для их последующей изоляции и предотвращения взаимодействия с другими белками.

Также, возможно, что ОРТ6 не влияет на систему сайленсинга, а его способность взаимодействовать с eEFIA и с З'-НТО РНК ВТМ, проявляется в модулировании функциональной активности eEFIA при его взаимодействии с З'-НТО РНК ВТМ, роль которого для инфекции ВТМ на сегодняшний день также мало изучена. Показано, что взаимодействие между eEFIA и элементом вторичной структуры в З'-концевой области геномной РНК вируса Западного Нила способствует синтезу цепей вирусной РНК отрицательной полярности, что определяет эффективность репликации вирусного генома (Davis at al., 2007). Достаточно хорошо изучена роль eEFIA в репликации вируса карликовой кустистости томатов. Показано, что eEFIA напрямую взаимодействует с белком рЗЗ и вирусной РНК, способствуя сборке репликативного комплекса, компонентом которого является рЗЗ, и привлечению геномных РНК в репликативный комплекс, что стимулирует инициацию репликации и приводит к повышению уровня синтеза вирусной РНК отрицательной полярности (Li at al., 2010; Sasvari at al., 2011). He исключено, что функция OPT6 может быть связана с влиянием на другие клеточные процессы и системы. Более того, учитывая данные полученные в этой работе, не исключено, что L- и U1-OPT6 имеют совершенно разные функции. Дальнейшие исследования необходимы для установления функции ОРТ6 в жизненном цикле тобамовирусов, а также необходимости ядерной/ядрышковой, митохондриальной

локализации и ассоциации с мембранами ЭПР, а также связывания нуклеиновых кислот и

взаимодействия с фактором элонгации трансляции еЕР1А.

Выводы

1. Показано, что белок 1Л-ОРТ6 вируса табачной мозаики, но не белок Ь-ОРТб вируса томатной мозаики, значительно усиливает патогенность рекомбинантного вируса погремковости табака в растениях №сойапа ЬепЛатгапа.

2. С-концевой район Ш-ОРТ6 и ЮРТб определяет влияние белка на патогенность вируса.

3. Белок Ш-ОРТ6 на ранних этапах экспрессии в клетке локализуется в ядрышке, а затем перемещается в митохондрии, тогда как белок Ь-ОРТ6 обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме, не меняя субклеточной локализации.

4. Белки Ш-ОРТ6 и Ь-ОРТ6 несут сигнал ядрышковой локализации в И-концевом районе. С-концевой район Ь-ОРТ6 необходим для взаимодействия белка с мембранами эндоплазматического ретикулума.

5. Показано, что единичная замена в составе аминокислотной последовательности белка Ь-ОРТ6, блокирующая образование комплекса с фактором элонгации трансляции еЕР1А, нарушает также кооперативность связывания белка с нуклеиновыми кислотами.

Публикации

Gushchin V.A., Lukhovitskaya N.I., Andreev D.E., Wright K.M., Taliansky M.E., Solovyev A.G., Morozov S.Y. and MacFarlane S.A. Dynamic localization of two tobamovirus ORF6 proteins involves distinct organellar compartments.// J. Gen. Virol. 2013. V.94. P. 230-240.

Гущин B.A., Андреев Д.Е., Тальянекий М.Э. МакФарлэйн С.Э., Соловьев А.Г. и Морозов С.Ю. Аминокислотная замена в белке ОРТ6 вируса табачной мозаики препятствует образованию комплекса с eEFIA и кооперативному связыванию нуклеиновых кислот in vitro. // Доклады Академии Наук. 2013. Т.448. № 1. С. 1-5.

Gushchin V.A., Solovyev A.G. and Morozov S.Y. Plant virus modulator of host defence.// XX International conference New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology. Ukraine. Jalta. 2012. P. 114-116.

Gushchin V.A., Kaplan I.B., Solovyev A.G. and Morozov S.Y. Interactions of tobacco mosaic virus protein encoded by ORF6 with plant cell components.// XIX International conference New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology. Ukraine. Jalta. 2011. P. 234-235.

Gushchin V.A. Functional studies of tobacco mosaic virus ORF6-encoded protein.// The James Hutton Institute - Dundee site postgraduate student competition. Scotland. Dundee. Invergowrie. 2011. P. 20

Morozov S.Y., Solovyev A.G. and Gushchin V.A. Intracellular transport of small cystein-rich proteins, modulators of plant virus virulence.// XVIII International conference New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology. Ukraine. Jalta. 2010. P. 117-118.

Заказ №441-1/01/2013 Подписано в печать 25.01.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гущин, Владимир Алексеевич

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Ядерно-цитоплазматический транспорт.

Общая характеристика ядра и ядерных структур.

Процесс транспорта через ядерную пору.

Сигналы ядерной локализации.

Сигналы ядерного экспорта.

Сигналы ядрышковой локализации.

Взаимодействие белков РНК- вирусов растений и вироидов с ядерными белками и структурами.

РНК вирусы с геномом положительной полярности.

Вироиды.

Тобамовирусы.

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III РЕЗУЛЬТАТЫ.

Мутация инициаторного кодона ОРТ6 не влияет на патогенность ВТоМ.

Влияние белков L- и U1-OPT6 и их гибридов на патогенез ВПТ.

Субклеточная локализация L- и U1-OPT6 и их гибридов.

Детерминанты субклеточной локализации L- и U1-OPT6.

Изучение взаимодействия между L-OPT6 и eEFIA in vitro.

Аминокислотная замена I11T в L-OPT6 препятствует образованию комплекса с eEFIA и кооперативному связыванию нуклеиновых кислот.

IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

V ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гущин, Владимир Алексеевич

V выводы

1. Показано, что белок 1Л-ОРТ6 вируса табачной мозаики, но не белок Ь-ОРТ6 вируса томатной мозаики, значительно усиливает патогенность рекомбинантного вируса погремковости табака в растениях МсоНапа ЬеШкттапа.

2. С-концевой район 1Л-ОРТ6 и Ь-ОРТ6 определяет влияние белка на патогенность вируса.

3. Белок Ш-ОРТ6 на ранних этапах экспрессии в клетке локализуется в ядрышке, а затем перемещается в митохондрии, тогда как белок Ь-ОРТб обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме, не меняя субклеточной локализации.

4. Белки Ш-ОРТ6 и Ь-ОРТ6 несут сигнал ядрышковой локализации в М-концевом районе. С-концевой район Ь-ОРТ6 необходим для взаимодействия белка с мембранами эндоплазматического ретикулума.

5. Показано, что единичная замена в составе аминокислотной последовательности белка Ь-ОРТ6, блокирующая образование комплекса с фактором элонгации трансляции еЕР1 А, нарушает также кооперативность связывания белка с нуклеиновыми кислотами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гущин, Владимир Алексеевич, Москва

1. Abraitiene A., Zhao Y., Hammond R. Nuclear targeting by fragmentation of the potato spindle tuber viroid genome// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, v. 368, p. 470475.

2. Ahmad Y., Boisvert F.M., Gregor P., Cobley A., Lamond A.I. NOPdb: Nucleolar Proteome Database—2008 update//Nucleic Acids Res. 2009, v. 37 p. 181-184.

3. Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K.L., Ong S.E., Lyon C.E., Lamond A.I., Mann M. Nucleolar proteome dynamics//Nature. 2005, v. 433, p. 77-83.

4. Andersen J.S., Lyon C.E., Fox A.H., Leung A.K.L., Lam Y.W., Steen H., Mann M., Lamond A.I. Directed proteomic analysis of the human nucleolus// Curr Biol. 2002, v. 12, p. 1-11.

5. Angell S.M., Davies C., Baulcombe D.C. Cell-to-ccll movement of potato virus X is associated with a change in the size exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana Cleveland»// Virology. 1996, v. 215, p. 197-201.

6. Anindya R., Chittori S., Savithri H.S. Tyrosine 66 of Pepper vein banding virus genome-linked protein is uridylylated by RNA-dependent RNA polymerase// Virology. 2005, v. 336, p. 154-162.

7. Anindya R., Savithri H.S. Potyviral NIa proteinase, a proteinase with novel deoxyribonuclease activity//J. Biol. Chem. 2004, v. 279, p. 32159-32169.

8. Apel E.D., Lewis R.M., Grady R.M., Sanes J.R. Syne-1: a dystrophin- and Klarsicht-related protein associated with synaptic nuclei at the neuromuscular junction// J. Biol. Chem. 2000, v. 275, p. 31986-31995.

9. Aris J.P., Blobel G. cDNA cloning and sequencing of human fibrillarin, a conserved nucleolar protein recognized by autoimmuneantisera// Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991, v. 88, p. 931-935.

10. Atabekov J., Nikitin N., Arkhipenko M., Chirkov S., Karpova O. Thermal transition of native tobacco mosaic virus and RNAfree viral proteins into spherical nanoparticles// J Gen Virol. 2011, v. 92, p. 453-456.

11. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000// Nucleic Acids Res. 2000, v. 28, p. 45^8.

12. Barneche F., Steinmetz F., Echeverrya M. Fibrillarin genes encode both a conserved nucleolar protein and a novel small nucleolar RNA involved in ribosomal RNA methylation in Arabidopsis thaliana// J. Biol. Chem. 2000, v. 275, p. 27212-27220.

13. Bayne E.H., Rakitina D.V., Morozov S.Y., Baulcombe D.C. Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing// Plant J. 2005, v. 44, p. 471-482.

14. Beachy R.N., Zaitlin M. Characterization and in vitro translation of the RNAs from less-than-full-length, virus-related, nucleoprotein rods present in tobacco mosaic virus preparations//Virology. 1977, v. 81, p. 160-169.

15. Beauchemin C., Laliberte' J.-F. The poly(A) binding protein is internalized in virus-induced vesicles or redistributed to the nucleolus during Turnip mosaic virus infection// J. Virol. 2007, v. 81, p. 10905- 10913.

16. Beijerinck M.W. Ueber ein contagium vivum fuidum als Ursache der Fleckenkrankheit der Tabaksblatter// Verh. Kon. Akad.Wetensch. 1898, v. 5, p. 3-21.

17. Benitez-Alfonso Y., Faulkner C., Ritzenthaler C., Maule A. Plasmodesmata: gateways to local and systemic virus infection// Mol. Plant Microbe Interact. 2010, v. 23, p. 14031412.

18. Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascues J., Lamond A.I. The multifunctional nucleolus// Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, v. 8, p. 574-585.

19. Bortolamiol D., Pazhouhandeh M., Marrocco K., Genschik P., Ziegler-Graff V. The Polerovirus F box protein P0 targets ARGONAUTE1 to suppress RNA silencing// Curr. Biol. 2007, v. 17, p. 1615-1621.

20. Boulon S., Verheggen C., Jady B.E., Girard C„ Pescia C., Paul C., Ospina J.K., Kiss T., Matera A.G., Bordonne R., Bertrand E. PHAX and CRM1 are required sequentially to transport U3 snoRNA to nucleoli// Mol. Cell. 2004, v. 16, p. 777-787.

21. Boulon S., Westman B.J., Hutten S., Boisvert F-M., Lamond A.I. The nucleolus under stress//Mol Cell. 2010, v. 40, p. 216-227.

22. Brigneti G, Voinnet O, Li WX, Ding SW, Baulcombe DC. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana// EMBO J. 1998, v. 17, p. 6739-6746.

23. Brigneti G., Voinnet O., Li W.X., Ji L.H., Ding S.W., Baulcombe D.C. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana// EMBO J. 1998, v. 17, p. 6739-6746.

24. Brown J.W., Shaw P.J. Small nucleolar RNAs and pre-rRNA processing in plants// Plant Cell. 1998, v. 10(5), p. 649-657.

25. Butler P.J. Self-assembly of tobacco mosaic virus: the role of an intermediate aggregate in generating both specificity and speed// Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1999, v. 354(1383), p. 537-50.

26. Butler P. J., Klug A. The assembly of a virus// Sci Am. 1978, v. 239(5), p. 62-9.

27. Canetta E., Kim S.H., Kalinina N.O., Shaw J., Adya A.K., Gillespie T., Brown J.W., Taliansky M. A plant virus movement protein forms ringlike complexes with the major nucleolar protein, fibrillarin, in vitro// J Mol Biol. 2008, v. 376 (4), p. 932-937.

28. Canto T., MacFarlane S. A., Palukaitis P. ORF6 of Tobacco mosaic virus is a determinant of viral pathogenicity in Nicotiana benthamiana//J Gen Virol. 2004, v. 85, p. 3123-3133.

29. Carmo-Fonseca M., Ferreira J., Lamond A.I. Assembly of snRNP-containing coiled bodies is regulated in interphase and mitosis—evidence that the coiled body is a kinetic nuclear structure// J. Cell Biol. 1993, v. 120, p. 841-852.

30. Carrington J.C., Dougherty W.G. Small nuclear inclusion protein encoded by a plant potyvirus genome is a protease// J. Virol. 1987, v. 61, p. 2540-2548.

31. Carrington J.C., Freed D.D., Leinicke A.J. Bipartite signal sequence mediates nuclear translocation of the plant potyviral NIa protein// Plant Cell. 1991, v. 3, p. 953-962.

32. Carrington J.C., Haldeman R., Dolja V.V., Restrepo-Hartwig M.A. Internal cleavage and trans-proteolytic activities of the VPg-proteinase (NIa) of tobacco etch potyvirus in vivo// J. Virol. 1993, v. 67, p. 6995-7000.

33. Catimel B., Teh T., Fontes M.R., Jennings I.G., Jans D.A., Ilowlett G.J., Nice E.C., Kobe B. Biophysical characterization of interactions involving importin-alpha during nuclear import// J Biol Chem. 2001, v. 276(36), p. 34189-341.

34. Chaplin J.F., Mann T.J. Evaluation of tobacco mosaic resistance factor transferred from burley to flue-cured tobacco// Journal of Heredity. 1978, v. 69, p. 175-178.

35. Chapman E., Prokhnevsky A., Gopinath K., Dolja V., Carrington J. Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate step// Genes & Dev. 2004, v. 18, p. 1179-1186.

36. Cherian S., Muniyapppa V. ELISA based survey and host range of tomato mosaic tobamovirus// Indian J. Virol. 1998, v. 14, p. 65-69.

37. Chitra T.R., Prakash H.S., Albrechtsen S.E., Shetty H.S., Mathur S.B. Indexing of leaf and seed samples of tomato and bell pepper for tobamoviruses// Indian Phytopathol. 2002, v. 55, p. 84-86.

38. Chiu M.H., Chen I.H., Baulcombe D.C., Tsai C.H. The silencing suppressor P25 of Potato virus X interacts with Argonautel and mediates its degradation through the proteasome pathway// Mol.PlantPathol. 2010, v. 11, p. 641-649.

39. Cioce M., Lamond A.I. Cajal bodies: a long history of discovery// Annu Rev Cell Dev Biol. 2005, v. 21, p. 105-31.

40. Citovsky V., Knorr D., Schuster G., Zambryski P. The P30 movement protein of Tobacco mosaic virus is asingle-stranded nucleic acid binding protein// Cell. 1990, v. 60, p. 637647.

41. Cokol M., Nair R., Rost, B. Finding nuclear localization signals// EMBO Rep. 2000, v. 1, p. 411-415.

42. Cole C.N., Scarcelli J.J. Transport of messenger RNA from the nucleus to the cytoplasm// Curr Opin Cell Biol. 2006, v. 18, p. 299-306.

43. Collier S., Pendle A., Boudonck K., van Rij T., Dolan L., Shaw P. A distant coilin homologue is required for the formation of cajal bodies in Arabidopsis// Mol Biol Cell. 2006, v. 17 (7), p. 2942-2951.

44. Conti E., Kuriyan, J. Crystallographic analysis of the specific yet versatile recognition of distinct nuclear localization signals by karyopherin alpha// Structure. 2000, v. 8, p. 329338.

45. Conti E., Uy M., Leighton L., Blobel G., Kuriyan J. Crystallographic analysis of the recognition of a nuclear localization signal by the nuclear import factor karyopherin alpha//Cell. 1998, v. 94, p. 193-204.

46. Csorba T., Bovi A., Dalmay T., Burgyan J. The pi22 subunit of Tobacco mosaic virus replicase is a potent silencing suppressor and compromises both small interfering RNA-and microRNA-mediated pathways// J Virol. 2007, v. 81, p. 11768-11780.

47. Culley A.I. Virophages to viromes: a report from the frontier of viral oceanography// Curr Opin Virol. 2011, v. 1, p. 52-57.

48. Dang C.V., Lee W.M. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal// Mol Cell Biol. 1988, v. 8 (10), p. 4048-4054.

49. D'Angelo M.A., Hetzer M.W. The role of the nuclear envelope in cellular organization// Cell Mol Life Sei. 2006, v. 63(3), p. 316-332.

50. Dauer W.T., Worman H.J. The nuclear envelope as a signaling node in development and disease// Dev Cell. 2009, v. 17, p. 626-638.

51. Davis W.G., Blackwell J.L., Shi P.Y., Brinton M.A. Interaction between the cellular protein eEFIA and the 3'-terminal stem-loop of West Nile virus genomic RNA facilitates viral minus-strand RNA synthesis//J. Virol. 2007, v. 81. p. 10172-10187.

52. Deom C.M., Oliver M.J., Beachy R.N. The 30-kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus movement// Science. 1987, v. 237, p. 389-394.

53. Ding B. The biology of viroid-host interactions// Annu Rev Phytopathol. 2009, v. 47, p. 105-131.

54. Ding B. Viroids: self-replicating, mobile, and fast-evolving noncoding regulatory RNAs// Wiley Interdiscip Rev RNA. 2010, v. 1(3), p. 362-75.

55. Ding B., Kwon M.O., Hammond R., Owens R. Cell-tocell movement of potato spindle tuber viroid// Plant J. 1997, v. 12, p. 931-936.

56. Ding X.S., Bao Y., Carter S.A., Nelson R.S. Host factors involved in virus replication and cell-to-cell movement// In 1997 Annual Report of the Samuel Rorberts Noble. 1998.

57. Dingwall C., Laskey, R.A. Nuclear targeting sequences a consensus// Trends Biochem. Sei. 1991, v. 16, p. 478-481.

58. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Novikov V.K., Agranovsky A.A., Morozov S.Yu., Efimov V.A., Casper R., Atabekov J.G. Comlete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants// FEBS Lett. 1994, v. 350, p. 5 8.

59. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Novikov V.K., Efimov V.A., Atabekov J.G. Cruciferous tobamovirus: nucleotide sequences of coat protein gene and 3' untranslated region// Dokl. Russian Acad. Sci. 1993, v. 332, p. 518-522.

60. Dreher T.W., Uhlenbeck O.C., Browning K. S. Quantitative assessment of EF-1 GTP binding to aminoacyl-tRNAs, aminoacyl-viral RNA, and tRNA shows close correspondence to the RNA binding properties of EF-Tu// J. Biol. Chem. 1999, v. 274, p. 666-672.

61. Dunoyer P., Pfeffer S., Fritsch C., Hemmer O., Voinnet O., Richards K.E. Identification, subcellular localization and some properties of a cysteinc-rich suppressor of gene silencing encoded by peanut clump virus// Plant J. 2002a, v. 29, p. 555-567.

62. Emmott E., Dove B.K., Howell G., Chappell L.A., Reed M.L., Boyne J.R., You J.H., Brooks G., Whitehouse A., Hiscox J.A. Viral nucleolar localisation signals determine dynamic trafficking within the nucleolus// Virology. 2008, v. 380, p. 191-202.

63. Ender C., Krek A., Friedlander M.R., Beitzinger M., Weinmann L., Chen W., Pfeffer S., Rajewsky N., Meister G. A human snoRNA with microRNA-like functions// Mol Cell. 2008, v. 32, p. 519-528.

64. Fahrenkrog B., Koser J., Aebi U. The nuclear pore complex: a jack of all trades// Trends Biochem Sci. 2004, v. 29, p. 175-182.

65. Fang Y., Spector D.L. Identification of nuclear dicing bodies containing proteins for microRNA biogenesis in living Arabidopsis plants// Curr Biol. 2007, v. 17, p. 818-823.

66. Fatica A., Tollervey D. Making ribosomes// Curr Opin Cell Biol. 2002, v. 14(3), p. 313321.

67. Felden B., Florentz C., Giege R., Westhof E. A central pseudoknotted three-way junction imposes tRNA-like mimicry and the orientation of three 5' upstream pseudoknots in the 3' terminus of tobacco mosaic virus RNA// RNA. 1996, v. 2, p. 201-212.

68. Fels A., Hu K., Riesner D. Transcription of potato spindle tuber viroid by RNA polymerase II starts predominantly at two specific sites// Nucl Acids Res. 2001, v. 29, p. 4589-4597.

69. Fink A.L. Natively unfolded proteins// Curr. Opin. Struct. Biol. 15. 2005, v. 35 p.e.41.

70. Fischer J.A., Acosta S., Kenny A., Cater C., Robinson C., Hook J. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye// Genetics. 2004, v. 168, p. 1385-1393.

71. Flores R, Serra P, Minoia S, Di Serio F, Navarro B. Viroids: from genotype to phenotype just relying on RNA sequence and structural motifs// Front Microbiol. 2012, v. 3, p. 217.

72. Flores R., Gas M.E., Molina-Serrano, D., Nohales M.A., Carbonell A., Gago S., Pena D.M., Daros J.A.Viroidrepli-cation:rolling-circles,enzymesand ribozymes// Viruses. 2009, v. 1, p. 317-334.

73. Flores R., Semancik J.S. Properties of a cell-free system for synthesis of citrus exocortis viroid// Proc Natl Acad Sci USA. 1982, v. 79, p. 6285-6288.

74. Fontes M.R., Teh T., Jans D., Brinkworth R.I., Kobe B. Structural basis for the specificity of bipartite nuclear localization sequence binding by importin-alpha// J Biol Chem. 2003, v. 278(30), p. 27981-27987.

75. Forster R.L., Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Van Dolleweerd C.J., Andersen M.T. The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants//Virology. 1992, v. 191 (1), p. 480-484.

76. Franke W.W., Scheer U., Krohne G., Jarasch E.D. The nuclear envelope and the architecture of the nuclear periphery//J. Cell Biol. 1981, v. 91, p. 39-50.

77. Fukuda M., Meshi T., Okada Y., Otsuki Y., Takebe I. Correlation between particle multiplicity and location on virion RNA of the assembly initiation site for viruses of the tobacco mosaic virus group//Proc Natl Acad Sci USA. 1981, v. 78, p. 4231^1235.

78. Gallie D.R. The 5-leader of tobacco mosaic virus promotes translation through enhanced recruitment of eIF4F// Nucleic Acids Res. 2002, v. 30(15), p. 3401-3411.

79. Gas M.E., Hernández C., Flores R., Daros J.A. Processing of nuclear viroids in vivo:an interplay between RNAconformations// PLoS Pathog. 2007, v. 3, e. 182.

80. Gerace L., Burke B. Functional organization of the nuclear envelope// Annu. Rev. Cell. Biol. 1988, v. 4, p. 335-374.

81. Gibbs A. Evolution and origins of tobamoviruses// Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1999, v. 354, p. 593-602.

82. Gibbs A. How ancient are the tobamoviruses// Intervirology. 1980, v. 14, p. 101-108.

83. Giesecke A., Stewart M. Novel binding of the mitotic regulator TPX2 (target protein for Xenopus kinesin-like protein 2) to importin-alpha// J Biol Chem. 2010, v. 285(23), p. 17628-17635.

84. Gómez G., Pallas V. Studies on subcellular compartmentalization of plant pathogenic noncoding RNAs give new insights into the intracellular RNA-traffic mechanisms// Plant Physiol. 2012, v. 159(2), p. 558-564.

85. Goodin M.M., Chakrabarty R., Banerjce R., Yelton S., Debolt S. New gateways to discovery//J Plant Physiol. 2007, v. 145, p. 1100-1109.

86. Gooding G. V. Control of tobacco mosaic virus on flue-cured tobacco by crop protection// Tobacco Science. 1981, v. 40, p. 30-31.

87. Gorbalenya A.E., Koonin E.V., Donchenko A.P., Blinov V.M. A conserved NTP-motif in putative helicases// Nature. 1988, v. 333, p. 22.

88. Goto K, Kobori T, Kosaka Y, Natsuaki T, Masuta C. Characterisation of silencing suppressor 2b of Cucumber mosaic virus based on examination of its small RNA-binding abilities// Plant Cell Physiol. 2007, v. 48, p. 1050-1060.

89. Greco A. Involvement of the nucleolus in replication of human viruses// Rev. Med. Virol. 2009, v. 19, p. 201-214.

90. Gultyaev A.P., van Batenburg E., Pleij C.W. Similarities between the secondary structure of satellite tobacco mosaic virus and tobamovirus RNAs// J. Gen. Virol. 1994, v. 75, p. 2851-2856.

91. Haas G., Azevedo J., Moissiard G., Geldreich A., Himber C., Bureau M., Fukuhara T., Keller M., Voinnet O. Nuclear import of CaMV P6 is required for infection and suppression of the RNA silencing factor DRB4// EMBO J. 2008, v. 27, p. 2102-2112.

92. Hamera S., Song X., Su L., Chen X., Fang R. Cucumber mosaic virus suppressor 2b binds to AG04-related small RNAs and impairs AG04 activities// Plant J. 2012, v. 69, p. 104-115.

93. Harrison B.D., Wilson T.M. Milestones in the research on tobacco mosaic virus// Philos Trans R Soc Lond В Biol Sei. 1999, v. 354(1383), p. 521-529.1.lO.Heinlein M„ Padgett H.S., Gens J.S., Pickard B.G., Casper S.J., Epel B.L., Beachy R.N.

94. Hiscox J.A. Brief review: The nucleolus a gateway to viral infection// Arch. Virol. 2002, v. 147, p. 1077-1089.

95. Hiscox J.A. RNA viruses: Hijacking the dynamic nucleolus//Nat. Rev. Microbiol. 2007, v. 5, p. 119-127.

96. Hodgman T.C. A new superfamily of replicative proteins// Nature. 1988, v. 333, p. 2223.

97. Hu Q., Hollunder J., Niehl A., Korner C.J., Gereige D., Windeis D., Arnold A., Kuiper M., Vazquez F., Pooggin M., Heinlein M. Specific impact of tobamovirus infection on the Arabidopsis small RNA profile// PLoS One. 2011, v. 6(5), e. 19549.

98. Hunter T.R., Hunt Т., Knowland J., Zimmern D. Messenger RNA for the coat protein of tobacco mosaic virus// Nature. 1976, v. 260, p. 759-764.

99. Hutten S., Prescott A., James J., Riesenberg S., Boulon S., Lam Y.W., Lamond A.I. An intranucleolar body associated with rDNA// Chromosoma. 2011, v. 120, p. 481-499.

100. Ivanov P.A., Karpova O.V., Skulachev M.V., Tomashevskaya O.L., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro// Virology. 1997, v. 232 (1), p. 32-43.

101. Ivanowski D. Ueber die Mosaikkrankheit der Tabakspfanze// St Petersb. Acad. Imp. Sci. Bull. 1892, v. 35, p. 65-70.

102. Jackson A.O., Lim H.S., Bragg J., Ganesan U., Lee M.Y. Hordeivirus replication, movement, and pathogenesis// Annu Rev Phytopathol. 2009, v. 47, p. 385-422.

103. Jacobi V., Bachand G.D., Hamelin R.C., Castello J.D. Development of a multiplex immunocapture RT-PCR assay for detection and differentiation of tomato and tobacco mosaic tobamoviruses// J. Virol. Methods. 1998, v. 74, p. 167-178.

104. Jacquemond M. Cucumber mosaic virus//Adv Virus Res. 2012, v. 84, p. 439-504.

105. Jady B.E., Darzacq X., Tucker K.E., Matera A.G., Bertrand E., Kiss T. Modification of Sm small nuclcar RNAs occurs in the nucleoplasmic Cajal body following import from the cytoplasm// EMBO J. 2003 v. 22, p. 1878-1888.

106. Jaubert M., Bhattacharjee S., Mello A.F.S., Perry K.L., Moffett P. ARGONAUTE2 mediates RNA-silencing antiviral defenses against Potato virus in Arabidopsis// Plant Physiol. 2011, v. 156, p. 1556-1564.

107. Kalab P., Wcis K., Heald R. Visualization of a Ran-GTP gradient in interphase and mitotic Xenopus egg extracts// Science. 2002, v. 295 (5564), p. 2452-2456.

108. Kalantidis K., Denti M.A., Tzortzakaki S., Marinou E., Tabler M., Tsagris M. Virpl is a host protein with a major role in Potato spindle tuber viroid infection in Nicotiana plants// J Virol. 2007, v. 81, p. 12872-12880.

109. Kalderon D., Richardson W.D., Markham A.F., Smith A.E. Sequence requirements for nuclear location of simian virus 40 large-T antigen// Nature. 1984, v. 311, p. 33-38.

110. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro// Virology. 1997, v. 230, p. 11-21.

111. Kawakami S., Watanabe Y., Beachy R.N. Tobacco mosaicvirus infection spreads cell to cell as intact replication complexes// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2004, v. 101, p. 62916296.

112. Keese P., Symons R.H. Domains in viroids: evidence of intermolecular RNA rearrangements and their contribution to viroid evolution// Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 1985, v. 82, p. 4582-4586.

113. Khurts S. Masutomi K., Delgermaa L., Arai K., Oishi N., Mizuno H., Hayashi N., Hahn W.C., Murakami S. Nucleolin interacts with telomerase// J. Biol. Chem. 2004, v. 279, p. 51508-51515.

114. Kim S.H., Ryabov E.V., Kalinina N.O., Rakitina D.V., Gillespie T., MacFarlane S., Haupt S., Brown J.W., Taliansky M. Cajal bodies and the nucleolus are required for a plant virus systemic infection// EMBO J. 2007b, v. 26 (8), p. 2169-2179.

115. Kim S.H., Spensley M., Choi S.K., Calixto C.P.G., Pendle A.F, Koroleva O., Shaw P.J., Brown J.W.S. Plant U13 orthologues and orphan snoRNAs identified by RNomics of RNA from Arabidopsis nucleoli//Nucleic Acids Res. 2010, v. 38 p. 3054—3067.

116. Klug A. The tobacco mosaic virus particle: structure and assembly// Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1999, v. 354(1383), p. 531-5.

117. Knowland J., Hunter T., Hunt T., Zimmern D. Translation of tobacco mosaic virus RNA and isolation for the messenger for TMV coat protein// INSERM Colloq. 1975, v. 47, p. 211-216.

118. Kolonko N., Bannach O., Aschermann K., IIu K.H., Moors M., Schmitz M., Steger G., Riesner D. Transcription of potato spindle tuber viroid by RNA polymerase II starts in the left terminal loop// Virology. 2006, v. 347, p. 392-404.

119. Kosugi S., Hasebe M., Matsumura N., Takashima H., Miyamoto-Sato E., Tomita M., Yanagawa H. Six classes of nuclear localization signals specific to different binding grooves of importin alpha//J Biol Chem. 2009, v. 284 (1), p. 478-85.

120. Kubota K., Tsuda S., Tamai A., Meshi T. Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing// J Virol. 2003, v. 77, p. 11016-11026.

121. Kuersten S., Ohno M., Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport: Ran, beta and beyond// Trends Cell Biol. 2001, v. 11, p. 497-503.

122. Kyte J., Doolittle R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein//J Mol Biol. 1982, v. 157, p. 105-32.

123. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970, v. 227(5259), p. 680-685.

124. Lam Y.W., Lamond A.I., Mann M., Andersen J.S. Analysis of nucleolar protein dynamics reveals the nuclear degradation of ribosomal proteins// Curr Biol. 2007, v. 17, p. 749-760.

125. Lamond A.I., Spector D.L. Nuclear speckles: A model for nuclear organelles// Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, v. 4, p. 605-612.

126. Lanctot C., Cheutin T., Cremer M., Cavalli G., Cremer T. Dynamic genome architecture in the nuclear space: regulation of gene expression in three dimensions// Nat Rev Genet. 2007, v. 8, p. 104-115.

127. Lange A., Mills R.E., Lange C.J., Stewart M., Devine S.E., Corbett A.H. Classical nuclear localization signals: definition, function, and interaction with importin alpha// J Biol Chem. 2007, v. 282 (8), p. 5101 -5105.

128. Lartey R.T., Voss T.C., Melcher U. Tobamovirus evolution: gene overlaps, recombination, and taxonomic implications// Mol Biol Evol. 1996, v. 13(10), p. 13271338.

129. Lechertier T., Sirri V., Hernandez-Verdun D., Roussel P. A B23-interacting sequence as a tool to visualize protein interactions in a cellular context// J Cell Sci. 2007, v. 120, p. 265275.

130. Lee J.-Y., Taoka K.-I., Yoo B.-C., Ben-Nissan G., Kim D.-J., Lucas D. J. Plasmodesmal-associated protein kinase in tobacco and Arabidopsis recognizes a subset of non-cell-autonomous proteins// Plant Cell. 2005, v. 17, p. 2817-2831

131. Leonard S., Plante D., Wittmann S., Daigneault N., Fortin M.G., Laliberte' J.-F. Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity// J. Virol. 2000, v. 74, p. 7730-7737.

132. Lewandowski D.J. Dawson W.O. Deletion of internal sequences results in tobacco mosaic virus defective RNAs that accumulate to high levels without interfering with replication of the helper virus// Virology. 1998, v. 251, p. 427-437.

133. Lewandowski D.J., Dawson W.O. Functions of the 126- and 183-kDa proteins of tobacco mosaic virus//Virology. 2000, v. 271, p. 90-98.

134. Li L., Kim B.G., Cheong Y.H., Pandey G.K., Luan S., A Ca(2)+ signaling pathway regulates a K(+) channel for low-K response in Arabidopsis// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, v. 103, p. 12625-12630.

135. Li Y.P., Busch R.K., Valdez B.C., Busch H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein// Euro J Biochem. 1996, v. 237, p. 153-158.

136. Li Z., Pogany J., Tupman S., Esposito A.M., Kinzy T.G., Nagy P.D. Translation Elongation Factor 1A Facilitates the Assembly of the Tombusvirus Replicase and Stimulates Minus-Strand Synthesis//PLoS. Pathogens, 2010, v. 6, p. 10011751-10011714.

137. Lim H.S., Bragg J.N., Ganesan U., Lawrence D.M., Yu J., Isogai M., Hammond J., Jackson A.O. Triple gene block protein interactions involved in movement of Barley stripe mosaic virus// J Virol. 2008, v. 82 (10), p. 4991-5006.

138. Litvak S., Tarrago A., Tarrago-Litvak L., Allende J.E. Elongation factor-viral genome interaction dependent on the aminoacylation of TYMV and TMV RNAs// Nature. 1973, v. 385. p. 245-260.

139. Liu C., Nelson R.S. The cell biology of Tobacco mosaic virus replication and movement// Front. Plant Sci. 2013, v. 4 e. 12.

140. Liu Q., Dreyfuss G. In vivo and in vitro arginine methylation of RNA-binding proteins// Mol. Cell Biol. 1995, v. 15, p. 2800-2808.

141. Liu Y., Schiff M., Marathe R., Dinesh-Kumar S.P. Tobacco Rarl, EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus// Plant J. 2002, v. 30, p. 415-429.

142. Lott K., Bhardwaj A., Sims P.J., Cingolani G. A minimal nuclear localization signal (NLS) in human phospholipid scramblase 4 that binds only the minor NLS-binding site of importin alpha 1// J Biol Chem. 2011, v. 286(32), p. 28160-28169.

143. Lucy A.P., Guo H-S., Li W-X., Ding S-W. Suppression of posttranscriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus// EMBO J. 2000, v. 19, p. 1672— 1680.

144. Lukhovitskaya N., Solovyev A., Koshkina T., Zavriev S., Morozov S. Interaction of the carlavirus cysteine-rich protein with the plant defense system// Mol Biol (Mosk). 2005b, v. 39, p. 785-791.

145. Macara I.G. Transport into and out of the nucleus// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001, v. 65, p. 570-594.

146. MacFarlane S.A., Popovich A.H. Efficient expression of foreign proteins in roots from tobravirus vectors// Virology. 2000, v. 267, p. 29-35.

147. Malone C.J., Misner L., Le Bot N., Tsai M.C., Campbell J.M., Ahringer J. et al. The C. elegans hook protein, ZYG-12: mediates the essential attachment between the centrosome and nucleus// Cell. 2003, v. 115, p. 825-836.

148. Mangus D.A., Evans M.C., Jacobson A. Poly(A)-binding proteins: multifunctional scaffolds for the post-transcriptional control of gene expression// Genome Biol. 2003, v. 4 (223).

149. Mans M.W.R., Pleij W.A.C., Bosch L. t RN A-like structures Structure, function and evolutionary significance // Eur. J. Biochem. 1991, v. 324, p. 303-324.

150. Mans R.-M.W., Pleij C.-W.A., Bosch L. tRNA-like structures. Function and evolutionary significance// Eur. J. Biochem. 1991, v. 201, p. 303-324.

151. Maroon C.J.M., Zavriev S. PCR-based tests for the detection of tobamoviruses and carlaviruses// Acta Horticulturae. 2002, v. 598, p. 117-122.

152. Martynez de Alba A.E., Sagesser R., Tabler M., Tsagris M. A bromodomaincontaining protein from tomato specifically binds potato spindle tuber viroid RNA in vitro and in vivo// J. Virol. 2003, v. 77, p. 9685-9694.

153. Matera A.G., Izaguire-Sierra M., Praveen K., Rajendra T.K. Nuclear bodies: random aggregates of sticky proteins or crucibles of macromolecular assembly// Dev. Cell. 2009, v. 17 p. 639-647.

154. Matera A.G., Ward D.C. Nucleoplasm^ organization of small nuclear ribonucleoproteins in cultured human cells// J. Cell Biol. 1993 v. 121, p. 715-727.

155. Matsuda D., Yoshinari S., Dreher T.W. eEFIA binding to aminoacylated viral RNA represses minus strand synthesis by TYMV RNA-dependent RNA polymerase// Virology. 2004, v. 321, p. 47-56.

156. Mayers C.N., Palukaitis P., Carr J.P. Subcellular distribution analysis of the cucumber mosaic virus 2b protein// J Gen Virol. 2000, v. 81, p. 219-226.

157. McGavin W.J., Mitchell C., Cock P.J.A., Wright K.M., MacFarlane S.A. Raspberry leaf blotch virus, a putative new member of the genus Emaravirus, encodes a novel genomic RNA// J Gen Virol. 2012 v. 93, p. 430-437.

158. Michael W.M., Dreyfuss G. Distinct domains in ribosomal protein L5 mediate 5 S rRNA binding and nucleolar localization// J. Biol. Chem. 1996, v. 271, p. 11571-11574.

159. Mitchell J.R., Wood E., Collins K. A telomerase component is defective in the human disease dyskeratosis congenita//Nature. 1999, v. 402, p. 551-555.

160. Mochizuki T. Ohki S.T. Cucumber mosaic virus: viral genes as virulence determinants// Mol Plant Pathol. 2012, v. 13(3), p. 217-225.

161. Mokili J.L., Rohwer F., Dutilh B.E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery// Curr Opin Virol. 2012, v. 2, p. 63-77.

162. Mongelard F., Bouvet P. Nucleolin: a multiFACeTed protein// Trends Cell Biol. 2007, v. 17, p. 80-86.

163. Morozov S.Y., Solovyev A.G. Did silencing suppression counter-defensive strategy contribute to origin and evolution of the triple gene block coding for plant virus movement proteins//Front.PlantSci. 2012, v. 3(136).

164. Morozov S.Y., Solovyev A.G. Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement//J. Gen.Virol. 2003, v. 84, p. 1351-1366.

165. Mueller A.M., Mooney A.L., MacFarlane S.A. Replication of in vitro tobravirus recombinants shows that the specificity of template recognition is determined by 59 non-coding but not 39 noncoding sequences// J Gen Virol. 1997, v. 78, p. 2085-2088.

166. Muhlbach H.P., Sanger H.L. Viroid replication is inhibited by alpha-amanitin// Nature. 1979, v. 278, p. 185-188.

167. Murphy J.F., Klein P.G., Hunt A.G., Shaw J.G. Replacement of the tyrosine residue that links a potyviral VPg to the viral RNA is lethal// Virology. 1996, v. 220, p. 535-538.

168. Neville M., Rosbash M. The NES-Crmlp export pathway is not a major mRNA export route in Saccharomyces cerevisiae// EMBO J. 1999, v. 18, p. 3746-3756.

169. Newport J.W., Forbes D.J. The nucleus: structure, function, and dynamics// Annu. Rev. Biochem. 1987, v. 56, p. 535-565.

170. Olson M.O. Sensing cellular stress: another new function for the nucleolus// Sci STKE. 2004, v. 224 p.e.10.

171. Paine P., Moore L., Horowitz S. Nuclear envelope permeability// Nature. 1975, v. 254, p. 109-114.

172. Palukaitis P., Garcia-Arenal F. Cucumoviruses// Adv Virus Res. 2003, v. 62, p. 241-323.

173. Pederson T. The plurifunctional nucleolus// Nucleic Acids Res. 1998, v. 26, p. 38713876.

174. Pelham H.R.B. Leaky UAG termination codon in tobacco mosaic virus RNA// Nature. 1978. v. 272, p. 469-471.

175. Peña E.J., Heinlein M. RNA transport during TMV cell-to-cell movement// Front Plant Sei. 2012, v. 3 p. 193.

176. Pendle A.F., Clark G.P., Boon R., Lewandowska D., Lam Y.W., Andersen J., Mann M., Lamond A.I., Brown J.W.S., Shaw P.J. Proteomic analysis of the Arabidopsis nucleolus suggests novel nucleolar functions// Mol Biol Cell. 2005, v. 16, p. 260-269.

177. Pillai R.S./Will C.L., Luhrmann R., Schumperli D., Muller B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain LsmlO, a new 14 kDa Sm Dl-like protein// EMBO J. 2001, v. 20, p. 5470-5479.

178. Poliseno L., Salmena L., Zhang J., Carver B., Haveman W.J., Pandolfi P.P. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology// Nature. 2010, v. 465 (7301), p. 1033-1038.

179. Pölitz J.C., Polena I., Trask I., Bazett-Jones D.P., Pederson T. Anonribosomal landscape in the nucleolus revealed by the stem cell protein nucleostemin// Mol Biol Cell. 2005, v. 16, p. 3401-3410.

180. Pölitz J.C.R., Hogan E.M, Pederson T. MicroRNAs with a nucleolar location// RNA. 2009, v. 15, p. 1705-1715.

181. Pontes 0., Li C.F., Nunes P.C., Haag J., Ream T., Vitins A., Jacobsen S.E., Pikaard C.S. The Arabidopsis chromatin-modifying nuclear siRNA pathway involves a nucleolar RNA processing center// Cell. 2006, v. 126, p. 79-92.

182. Pontes O., Pikaard C.S. siRNA and miRNA processing: new functions for Cajal bodies// Curr Opin Genet Dev. 2008, v. 18, p. 197-203.

183. Puustinen P., Makinen K. Uridylylation of the potyvirus VPg by viral replicase Nib correlates with the nucleotide binding capacity of VPg// J. Biol. Chem. 2004, v. 279, p. 38103-38110.

184. QÍ Y., Ding B. Differential subnuclear localization of RNA strands of opposite polarity derived from an autonomously replicating viroid// Plant Cell. 2003b, v. 15(11), p. 256677.

185. QÍ Y., Ding B. Inhibition of cell growth and shoot development by a specific nucleotide sequence in a noncoding viroid RNA// Plant Cell. 2003a, v. 15, p. 1360-1374.

186. Qi Y., He X., Wang X.J., Kohany O., Jurka J., Hannon G.J. Distinct catalytic and non-catalytic roles of ARGONAUTE4 in RNA-directed DNA methylation// Nature. 2006, v. 443, p. 1008-1012.

187. Qi Y., Pelissier T., Itaya A., Hunt E., Wassenegger M., Ding B. Direct role of a viroid RNA motif in mediating directional RNA trafficking across a specific cellular boundary// Plant Cell. 2004, v. 16, p. 1741-1752.

188. Rackwitz H.R., Rohde W., Sanger H.L. DNA-dependent RNA polymerase II of plant origin transcribes viroid RNA into full-length copies//Nature. 1981, v. 291, p. 297-301.

189. Rajamaki M.-L., Maki-Valkama T., Makinen K.5 Valkonen J.P.T. Infection with potyviruses// In Plant-Pathogen Interactions. N. Talbot, ed (Oxford, UK: Blackwell Publishing). 2004, pp. 68-91.

190. Rajamaki M.-L., Valkonen J.P.T. Control of nuclear and nucleolar localization of nuclear inclusion protein a of picorna-like Potato virus A in Nicotiana species// Plant Cell. 2009, v. 21, p. 2485-2502.

191. Rajamaki M.-L., Valkonen J.P.T. The 6K2 protein and the VPg of potato virus A are determinants of systemic infection in Nicandra physaloides// Mol. Plant Microbe Interact. 1999, v. 12, p. 1074-1081.

192. Rajamaki M.-L., Valkonen J.P.T. Viral genome-linked protein (VPg) controls accumulation and phloem-loading of a potyvirus in inoculated potato leaves// Mol. Plant Microbe Interact. 2002, v. 15, p. 138-149.

193. Rajamaki M.-L., Valkonen, J.P.T. Localization of a potyvirus and the viral genome-linked protein in wild potato leaves at an early stage of systemic infection// Mol. Plant Microbe Interact. 2003, v. 16, p. 25-34.

194. Rakitina D.V., Taliansky M., Brown J.W., KalininaN.O. Two RNA-binding sites in plant fibrillarin provide interactions with various RNA substrates// Nucleic Acids Res. 2011, v. 39 (20), p. 8869-8880.

195. Rashid U.J., Hoffman J., Brutschy B., Piehler J., Chen J.C-H. Multiple targets for suppression of RNA interference by Tomato aspermy virus protein 2b// Biochemistry. 2008, v. 48, p. 12655-12657.

196. Raska I., Koberna K., Malinsky J., Fidlerovâ H., Masata M. The nucleolus and transcription of ribosomal genes// Biol Cell. 2004, v. 96(8), p. 579-594.

197. Raska T., Shaw P.J., Cmarko D. New insights into nucleolar architecture and activity// Int Rev Cytol. 2006, v. 255, p. 177-235.

198. Reichow S.L., Hamma T., Ferre'-D Amare' A.R., Varani G. The structure and function of small nucleolar ribonucleoproteins//Nucleic Acids Res. 2007, v. 35, p. 1452-1464.

199. Restrepo M.A., Freed D.D., Carrington J.C. Nuclear transport of plant potyviral proteins// Plant Cell. 1990, v. 2, p. 987-998.

200. Rietveld K., Van Poelgeest R., Pleij C.W., van Boom J.H., Bosch L. The tRNA-like structure at the 3D terminus of turnip yellow mosaic virus RNA. Differences and similarities with canonical tRNA//Nucleic Acids Res. 1982, v. 10, p. 1929-1946.

201. Rippe K. Dynamic organisation of the cell nucleus// Curr. Opin. Genet. Dev. 2007, v. 17, p. 373-380.

202. Ritzenthaler C. Parallels and distinctions in the direct cell-to-cell spread of the plant and animal viruses// Curr. Opin. Virol. 2011, v. 1, p. 403-409.

203. Rivera-Bustamante R.F., Semancik J.S. Properties of a viroid-replicating complex soluilized from nuclei// J Gen Virol. 1989, v. 70, p. 2707-2716.

204. Robbins J., Dilworth S. M., Laskey R. A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: Identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence// Cell. 1991, v. 64, p. 615-623.

205. Roossinck M.J. Changes in population dynamics in mutualistic versus pathogenic viruses// Viruses. 201 lc, v. 3, p. 12-19.

206. Roossinck M.J. Environmental viruses from biodiversity to ecology// Curr Opin Virol. 201 Id, v. l,p. 50-51.

207. Roossinck M.J. The big unknown: plant virus biodiversity// Curr Opin Virol. 201 lb, v. 1, p. 63-67.

208. Roossinck M.J. The good viruses: viral mutualistic symbioses// Nat Rev Microbiol. 2011a, v. 9, p. 99-108.

209. Roossinck M.J., Sabanadzovic S., Okada R., Valverde, R. The remarkable evolutionary history of endornaviruses// J Gen Virol. 2011, v. 92, p. 2674-2678.

210. Roossinck M.J., Saha P., Wiley G.B., Quan J., White J.D., Lai H„ Chavarria F„ Shen G., Roe B. Ecogenomics: using massively parallel pyrosequencing to understand virus ecology// Molecular ecology. 2010, v. 1, p. 81-88.

211. Rose J.K., Whitt M.A. Rhabdoviridae: the virus and their replication// In D. M. Knipe and P. M. Howely (ed.), Fields virology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. 2001,p. 1221-1244.

212. Rozanov M.N., Koonin E.V., Gorbalenya A.E. Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark of the 'Sindbis-like' supergroup of positive-strand RNA viruses//J Gen Virol. 1992, v. 73, p. 2129-2134.

213. Rubbi C.P., Milner J. Disruption of the nucleolus mediates stabilization of p53 in response to DNA damage and other stresses// EMBO J. 2003, v. 22, p. 6068-6077.

214. Russo G., Ricciardelli G., Pietropaolo C. Different domains cooperate to target the human ribosomal L7a protein to the nucleus and to the nucleoli// J. Biol. Chem. 1997, v. 272, p. 5229-5235.

215. Ryabov E. V., Robinson D. J., Taliansky M.E. A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA// Proc Natl Acad Sci USA. 1999b, v. 96, p. 1212-1217.

216. Ryabov E.V., Kim S.H., Taliansky M. Identification of a nuclear localization signal and nuclear export signal of the umbraviral long-distance RNA movement protein// J Gen Virol. 2004, v. 85 (5), p. 1329-1333.

217. Ryabov E.V., Oparka K.J., Santa Cruz S., Robinson D.J., Taliansky M.E. Intracellular location of two groundnut rosette umbravirus proteins delivered by PVX and TMV vectors// Virology. 1998, v. 242 (2), p. 303-313.

218. Ryabov E.V., Roberts I.M., Palukaitis P., Taliansky M. Host-specific cell-to-cell and long-distance movements of cucumber mosaic virus are facilitated by the movement protein of groundnut rosette virus// Virology. 1999a, v. 260, p. 98-108.

219. Sambade A., Brandner K., Hofmann C., Seemanpillai M., Mutterer J., Heinlein M. Transport of TMV movement protein particles associated with the targeting of RNA to plasmodesmata// Traffic. 2008, v. 9, p. 2073-2088.

220. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

221. Samuels T.D., Ju H.J., Ye C.M., Motes C.M., Blancaflor E.B., Verchot-Lubicz J. Subcellular targeting and interactions among the Potato virus X TGB proteins// Virology. 2007, v. 367, p. 375-389.

222. Sano T., Candresse T., Hammond R.W., Diener T.O., Owens R.A. Identification of multiple structural domains regulating viroid pathogenicity// Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1992. v. 89, p. 10104-10108.

223. Santoro R., Grummt I. Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription// Mol. Cell. 2001, v. 8, p. 719-725.

224. Saraiya A.A., Wang C.C. snoRNA, a novel precursor of microRNA in Giardia lamblia// PLoS Pathog. 2008, v. 4, p.e. 1000224

225. Sasvari Z., Izotova L., Kinzy T.G., Nagy P. Synergistic Roles of Eukaryotic Translation Elongation Factors IB gamma and 1A in Stimulation of Tombusvirus Minus- Strand Synthesis// PLoS. Pathogens. 2011, v. 7, p. 1002438-1002415.

226. Schaad M.C., Lellis A.D., Carrington J.C. VPg of tobacco etch potyvirus is a host genotype-specific determinant for long-distance movement// J. Virol. 1997, v. 71, p. 8624-8631.

227. Scherl A., Coûte' Y., De'on C., Calle' A., Kindbeiter K., Sanchez J.C., Greco A., Hochstrasser D., Diaz J.J. Functional proteomic analysis of human nucleolus// Mol Biol Cell. 2002, v. 13, p. 4100^109.

228. Schindler I.M., Muhlbach H.P. Involvement of nuclear DNA-dependent RNA polymerases in potato spindle tuber viroid replication: a réévaluation// Plant Sci. 1992, v. 84, p. 221-229.

229. Schneider R., Grosschedl R. Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression// Genes Dev. 2007, v. 21(23), p. 3027-3043.

230. Schoelz J.E., Harries P. A., Nelson R.S. Intracellular transport of plant viruses: finding the door out of the cell// Mol. Plant. 2011, v. 4, p. 813-831.

231. Schwarzacher H.G., Wachtler F. The nucleolus// Anat Embryol. 1993, v. 188(6), p. 515536.

232. Scott M.S., Avolio F., Ono M., Lamond A.I., Barton G.J. Human miRNA precursors with box H/ACA snoRNA features// PLoS Comput Biol. 2009, v. 5, p.e. 1000507

233. Scott M.S., Boisvert F.M., McDowall M.D., Lamond A.I., Barton G.J. Characterization and prediction of protein nucleolar localization sequences// Nucleic Acids Res. 2010, v. 38(21), p. 7388-7399.

234. Scott M.S., Troshin P.V., Barton G.J. NoD: a Nucleolar localization sequence detector for eukaryotic and viral proteins// BMC Bioinformatics. 2011, v. 12 (317), p. 1-7.

235. Semancik J.S., Harper K.L. Optimal conditions for ccllfree synthesis of citrus exocortis viroid and the question of specificity of RNA polymerase activity// Proc Natl Acad Sci USA. 1984, v. 81, p. 4429-4433.

236. Semashko M.A., Rakitina D.V., González I., Canto T., Kalinina N.O., Taliansky M.E. Movement protein of hordeivirus interacts in vitro and in vivo with coilin, amajors tructural protein of Cajal bodies// Dokl. Biochem. Biophys. 2012b, v. 442, p. 57-60.

237. Sharma P., Ikegami M. Characterization of signals that dictate nuclear/nucleolar and cytoplasmic shuttling of the capsid protein of tomato leaf curl Java virus associated with DNAb satellite// Virus Res. 2009, v. 144, p. 145-153.

238. Shaw P. J., Jordan E. G. The nucleolus// Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1995, v. 11, p. 93121.

239. Shaw P., Brown J. Nucleoli: composition, function, and dynamics// Plant Physiol. 2012, v. 158, p. 44-51.

240. Shemyakina E.A., Solovyev A.G., Leonova O.G., Popenko V.I., Schiemann J., Morozov S.Y. The Role of Microtubule Association in Plasmodesmal Targeting of Potato mop-top virus Movement Protein TGBpl// Open Virol J. 201 la, v. 5, p. 1-11.

241. Sidebottom E., Harris I I. The role of the nucleolus in the transfer of RNA from nucleus to cytoplasm//J. Cell Sci. 1969, v. 5, p. 351-364.

242. Siegel A., Zaitlin M., Duda C.T. Replication of tobacco mosaic virus. IV. Further characterization of viral related RNAs//Virology. 1973, v. 53, p. 75-83.

243. Sleeman J.E., Ajuh P., Lamond A.I. snRNP protein expression enhances the formation of Cajal bodies containing p80-coilin and SMN// J. Cell Sci. 2001, v. 114, p. 4407-4419.

244. Smith N.A., Eamens A.L., Wang M.-B. Viral small interfering RNAs target host genes to mediate disease symptoms in plants// PLoS Pathog. 2011, v. 7, e. 1002022.

245. Snaar S., Wiesmeijer K., Jochemsen A.G., Tanke H.J., Dirks R.W. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells//J. Cell Biol. 2000, v. 151, p. 653-662.

246. Song L., Han M.H., Lesicka J., Fedoroff N. Arabidopsis primary microRNA processing proteins HYL1 and DCL1 define a nuclear body distinct from the Cajal body// Proc Natl Acad Sci USA. 2007, v. 104, p. 5437-5442.

247. Sorokin A.V., Kim E.R., Ovchinnikov L.P. Nucleocytoplasmic transport of proteins// Biochemistry (Mosc). 2007, v. 72(13), p. 1439-1457.

248. Starr D.A., Han M. Role of ANC-1 in tethering nuclei to the actin cytoskeleton// Science. 2002, v. 298, p. 406-409.

249. Stobbe A.H., Melcher U., Palmer M.W., Roossinck M.J., Shen G. Co-divergence and host-switching in the evolution of Tobamoviruses// J Gen Virol. 2011, v. 93(2), p. 408418.

250. Strudwick S., Borden K.L.B. The emerging roles of translation factor eIF4E in the nucleus// Differentiation. 2002, v.70, p. 10 22.

251. Sulzinski M. A., Gabard K. A., Palukaitis P., Zaitlin M. Replication of tobacco mosaic virus. VIII. Characterization of a third subgenomic TMV RNA// Virology. 1985, v. 145, p. 132-140.

252. Swedlow J.R., Lamond A.I. Nuclear dynamics: where genes are and how they got there// Genome Biol. 2001, v. 2, p. 3.

253. Tabler M., Tsagris M. Viroids: petite RNA pathogens with distinguished talents// Trends Plant Sci. 2004, v. 9, p. 339 348.

254. Taft R.J., Glazov E.A., Lassmann T., Hayashizaki Y., Carninci P., Mattick J.S. Small RNAs derived from snoRNAs// RNA. 2009, v. 15, p. 1233-1240.

255. Taliansky M.E., Brown J.W.S., Rajamaki M.L., Valkonen J.P.T., Kalinina N.O. Involvement of the plant nucleolus in vims and viroid infections: parallels with animal pathosystems// Adv Virus Res. 2010, v. 77, p. 119-158.

256. Taliansky M.E., Robinson D. Molecular biology of umbraviruses: phantom warriors. J Gen Virol. 2003, v. 84 (8), p. 1951-1960.

257. Tatineni S., Robertson C.J., Garnsey S.M., Dawson W.O. A plant virus evolved by acquiring multiple nonconserved genes to extend its host range// Proc Natl Acad Sei U S A. 2011, v. 108, p. 17366-17371.

258. Thiry M., Lamaye F., Lafontaine D.L. The nucleolus: when 2 became 3// Nucleus. 2011 v. 2, p. 289-293.

259. Thompson S.R., Sarnow P. Regulation of host cell translation by viruses and effects on cell function// Curr. Opin. Microbiol. 2000, v. 3, p. 366-370.

260. Tillemans V., Leponcc I., Rausin G., Dispa L., Motte P. Insights into nuclear organization in plants as revealed by the dynamic distribution of Arabidopsis SR splicing factors// Plant Cell. 2006, v. 18 p. 3218-3234.

261. Tompa P., Szasz C., Buday L. Structural disorder throws new light on moonlighting// Trends Biochem. Sei. 30. 2005, v. 484, p.e. 489.

262. Torrance L., Wright K.M., Crutzen F., Cowan G.H., Lukhovitskaya N. I., Bragard C., et al. Unusual features of pomoviral RNA movement// Front. Microbiol. 2011, v. 2 (259), p. 1-7.

263. Tran E.J., Wente S.R. Dynamic nuclear pore complexes: life on the edge// Cell. 2006, v. 125, p. 1041-1053.

264. Trinkle-Mulcahy L., Lamond A.I. Nuclear functions in space and time: gene expression in a dynamic, constrained environment// FEBS Lett. 2008, v. 582 (14), p. 1960-1970.

265. Tsai C.W., Redinbaugh M.G., Willie K.J., Reed S., Goodin M„ Hogenhout S.A. Complete genome sequence and in planta subcellular localization of maize fine streak virus proteins//J. Virol. 2005, v. 79, p. 5304-5314.

266. Tsai R.Y., McKay R.D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells// Genes Dev. 2002, v. 16, p. 2991-3003.

267. Tucker K.E., Berciano M.T., Jacobs E.Y., LePage D.F., Shpargel K.B., et al. Residual Cajal bodies in coilin knockout mice fail to recruit Sm snRNPs and SMN, the spinal muscular atrophy gene product// J. Cell Biol. 2001, v. 154, p. 293-307.

268. Venema J., Tollervey D. Ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae// Annu Rev. Genet. 1999, v. 33, p. 261-311.

269. Verchot-Lubicz J. A new cell-to-cell transport model for Potexviruses// Mol Plant Microbe Interact. 2005, v. 18 (4), p. 283-290.

270. Verwoerd T.C., Dekker B.M., Hoekema A. A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs//Nucleic Acids Res. 1989, v. 17, p. 2362.

271. Vinayarani G., Madhusudhan K.N., Deepak S.A., Niranjana S.R. and Prakash U.S. Detection of Mixed Infection of Tobamoviruses in Tomato and Bell Pepper by using RT-PCR and Duplex RT-PCR// International Journal of Plant Pathology. 2011, v. 2, p. 89-95.

272. Voinnet O., Lederer C., Baulcombe D.C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana// Cell. 2000, v. 103, p. 157-167.

273. Wang H., Boisvert D., Kim K.K., Kim R., Kim, S.H. Crystal structure of a fibrillarin homologue from Methanococcus jannaschii, a hypcrthermophile, at 1.6 A resolution// EMBO J. 2000a, v. 19, p. 317-323.

274. Wang X., Goregaoker S.P., Culver J.N. Interaction of the Tobacco mosaic virus replicase protein with a NAC domain transcription factor is associated with the suppression of systemic host defenses// J Virol. 2009, v. 83(19), p. 9720-30.

275. Wang Y., Tzfira T., Gaba V., Citovsky V., Palukaitis P., Gal-On A. Functional analysis of the Cucumber mosaic virus 2b protein: Pathogenicity and nuclear localization// J Gen Virol. 2004, v. 85, p. 3135-3147.

276. Warrilow D., Symons R.H. Citrus exocortis viroid RNA is associated with the largest subunit of RNA polymerase II in tomato in vivo// Arch. Virol. 1999, v. 144, p. 23672375.

277. Watson M.L. The nuclear envelope; its structure and relation to cytoplasmic embranes// J Biophys Biochem Cytol. 1955, v. 1, p. 257-270.

278. Weis K. Nucleocytoplasmic transport: cargo trafficking across the border// Curr Opin Cell Biol. 2002, v. 14, p. 328-335.

279. White R.G., Barton D.A. The cytoskeleton in plasmodesmata: a role in intercellular transport// J. Exp. Bot. 2011, v. 62, p. 5249-5266.

280. Wong J.M., Kusdra L., Collins K. Subnuclear shuttling of human telomerase induced by transformation and DNA damage//Nature Cell Biol. 2002, v. 4, p. 731-736.

281. Woo Y.-M., Itaya A., Owens R.A., Tang L., Hammond R.W., Chou H.-C., Lai M.M.C., Ding B. Characterization of nuclear import of potato spindle tuber viroid RNA in permeabilized protoplasts//Plant J. 1999, v. 17, p. 627-635.

282. Yamaji Y., Kobayashi T., Hamada K. Sakurai K., Yoshii A., Suzuki M., Namba S., Hibi T. In vivo interaction between Tobacco mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase and host translation elongation factor 1 A//Virology. 2006, v. 347. p. 100-108.

283. Yamaji Y., Sakurai K., Hamada K., Komatsu K., Ozeki J., Yoshida A., Yoshii A., Shimizu T., Namba S., Hibi Y. Significance of eukaryotic translation elongation factor 1A in tobacco mosaic virus infection// Arch. Virol. 2010, v. 155, p. 263-268.

284. Yoshikawa N., Takahashi T. Inhibition of hop stunt viroid replication by a-amanitin// Z Pflanzenkr Pflanzenschutz. 1986, v. 93, p. 62-71.

285. Young N.D., Forney J., Zaitlin M. Tobacco mosaic virus replicase and replicative structures// J Cell Sci. 1987, v. 7, p. 277-285.

286. Zeyenko V.V., Ryabova L.A., Gallie D.R., Spirin A.S. Enhancing effect of the 3'-untranslated region of tobacco mosaic virus RNA on protein synthesis in vitro// FEBS Lett. 1994, v. 354(3), p. 271-273.

287. Zhang X., Yuan Y-R., Pei Y., Lin S-S., Tuschl T., Patel D.J., Chua N-H. Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonautel cleavage activity to counter plant defense// Genes Dev. 2006, v. 20, p. 3255-3268.

288. Zhong X., Tao X., Stombaugh J., Leontis N., Ding B. Tertiary structure and function of an RNA motif required for plant vascular entry to initiate systemic trafficking// EMBO J. 2007, v. 26, p. 3836-3846.

Информация о работе

Гущин, Владимир Алексеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Особенности внутриклеточного транспорта малых неструктурных белков вирусов растений, определяющих вирулентность и взаимодействие с хозяином - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы