Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности внутриклеточного транспорта каталитических субъединиц растительных токсинов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности внутриклеточного транспорта каталитических субъединиц растительных токсинов"

МИНИСТЕРСТВО ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Сарма Тулика

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА КАТАЛИТИЧЕСКИХ СУБЪЕДИНИЦ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТОКСИНОВ

03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стелен« кандидата биологических наук

Москва —1994

Работа выполнена ц Научно-исследэоательском институте экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН и в Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель доктор биологических наук

ТОНЕВИЦКИЙ А. Г.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

КОМОЛОВ И. С.

кандидат биологических наук КАТРУХА С. П.

Ведущая организация Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится _ 19Э4 года в часов

на заседании Специализированного Ученого совета Д QQ9.-l2.0-i, при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " " 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ЩЕРБАКОВА В. И.

Актуальность проблемы. Изучение механизма дейстгйй растительных и бактериальных токсинов, ингибируоаих синтез бедка а клетках эукариот - одно из перспективных направлений кал молекулярной биологии, так и биотехнологии. Токсины является удобный инструментом для изучения взаимодействия белков с клетками, внутриклеточного транспорта белков и особенностей Функционирования белок-синтезирувдего аппарата клеток эукариот.

Вискунин из листьев омелы базой Viscun albun и рицин из сенях клеаевины Ricinus connunis являится представителями рибосом-икактивирувиих белков II пласса. Токсины состоят из двух субьедиииц (примерно 30 кЛа) и связаны.мвхду собой дисульфидяой связьо. Каталитическая еубьедииица - A (active) - является специфичной Н-гликозидазой. Она высокоизбирательхо . модифицирует РНК рибосом зукариот, выаепляя адения в положении 4324 28S рРНК, что приводит к остановке синтеза бздка на уровне трансляции. В-субъедикицы рицина и вискумиха ингют два центра связывания , галактозы и взаимодействуют с клеточными рецепторами, содергаиими терминальную галактозу.

Особое внимание к этим белкам связано с тем, что токешш и их субъединицы используется для получения цитотоксических препаратов направленного действия. Инмунотоксины (ИТ) состоят иэ токсина и ковалентно связанного с ним мококлокалького антитела (монАТ) против специфической антигенной детерминанты на поверхности клетки-кишени. ИТ являотся перспективными фармакологическими препаратами при терапии различим*

аутоиммунных, онкологических и других заболеваний. Успел применения ИТ обеспечивается их высокой избиратвльностьп и

Эффективностью действия.

Данная работа посэяяека кзученио отдельных этапов механизма действия растительных 'токсинов путем сравнения активностей кокьогатоз, содержащих различные каталитические субъедикииы. Использование изолированных каталитических субъединиц токсиноз в качество компонентов ИТ избавляет от необходимости блокировать связываваие субьединиии. Однако, это приводит к существенному снижение иитотоксичсского действия этих препаратов по сравнение с натизкинн токсинами. Лля повышения эффективности действия ИТ необходимо детальное изучение неханизнов действия токсикоз, и в частности А-субъедикииы; особенностей взаимодействия с менбрахьки внутриклеточных компартментов; способов усиления активности кокъегатов.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было: Сравнительное изучение особенностей внутриклеточного транспорта каталитических субъединиц токсинаь как я е. клетках гибридом, продуцирующих /актителг. против А-субъеликиии зискумина, так и опухолевых клетках-ниаекях. Получение высокоэффективных ИТ направленного действия на основе растительных токсинов и сравнительное изучения активности этих кокьвгатов.

Лля достижения этой иели ставились следующие задачи:

1. Получение гибридомы. продуцирующей нонАТ протиз каталитической А-субъединииы вискумина, изучение цитотоксических свойств нативкых токсинов и химерного коньогата, содергаиего 8-цепъ рицина и А-субь-дикичу вискумин». ка различных клетках-нивенях. Изучение гетерогенности в секеиствг лектинов из омелы с помоиьв кон&Т.

2. Получение и сравнительное изучение ингибируоаих свойств кокьогатов А-цапи растительного токсина вискумика с иоиАТ против Т-лим«оцитов человека и сравнение с другими коньогатани. Изучение влияния хлорида аммония на активность токсинов и конызгатоа.

Иоучаал новизаа работы. ' Впервые получены кокАТ к А-

субъе'динице вискунина. С лоношьо гибридом, продуцнрусиих антитела к токсину, изучены особенности иеханизма транспорта А-субьединтш вискуинна как токсической части коаызгата.

Получены ИТ на основе А-субгединицы вискумниа. рицина и СЛ25 антигена Т-лимфоцитов человека, обладавшие высокой эовгктизностъ» и избирательностьо действия. Изучено действие анти-СД5 и анти-СЯ25 ИТ с А-субгединиией рицина и вискунина на клетхи-киаенн.

Практическая ценность работы. Получен кокьюгат А-субъединицы растительного токсина вискумина с нокАТ против СД25 антигена Т-лии^оиитов человека. Данный иммунотоксин позволяет распирнть спектр пгепаратов для направленной элиминации Т-лимфоцитов человека. Показано, что каталитическая субъединица гискумииа является перспективным агенток для создании ИТ.

Получеиние моиАТ к А-субъедикице вискумина могно использовать при разработке тест-системы для определения вискумина в экстрактах омелы, которые используотся при терапии онкологических заболеваний.

Апробация результатов и иуСаихациу.. .Результаты ' настояаеА работы докладывались на 5 Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущиио, 19Э2). на международном конференции но трансплантологии (Швейцария, 1933), на межлабораторном семинаре ВНИИ генетики.

Основные материал»! диссертации опубликованы в 4 печатных работах.

МАТЕРИАЛ!! И НЕТОЛЫ Токсины и их субъедкккцы. Рицин экстрагировали из семян клевевихы Ricinus cocounis выделяли согласно методике [Hicolson and Blaustein. 1972]. Изолированные А- и В-субъедииииы рицина разделяли по методу [Fulton et al.. 1986]. Токсины из оиелы белой (Viscun albus) HL1. HLZ и HL3 и А-субъедикица KL1 были лвбезко дрэдоставлекы «рое. Пооллерок. Химерный токсин

из А-субъедихици HL1 и В-субъедимиии рициха бил получек с поновьо реакции тиолдисульфидного обмена.

Получение гибридом и конокдовальных алтител. Для получения гибридных клеток были использованы клетки селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных изолированной А-субъедихиией вискуниха. Очистку антител из асцитной сидкости проводили с поиовью хроматографии на колонке с DEAE-Tyopear1-6S0H. Степень иммунологического перекреста ионАТ с токсинами определяли методой иммухоферменткото анализа (ИСА). Константы связывания изосорн HL-токсинов с мохАТ ТА5 к. вискунину били определены с поноеьо радиолигакдного метода. Кечекие токсинов проводили с покоаью подогена. 7дельхая активность составляла <2.2-4,7>х104 инп/иих~* на 1 мкг белка.

Получение иммунотоксияов. Антитела анти-СД25 (IgGl) обрабатывали бифункциональным реагентом Н-сукцихимидил-3(2-пиридилдитно) пропионатон. К модифицированным акти'. 4лан добавляли

дреобработахные дитиотреитолом А-субъедикицы вискуниха л инкубировали 30 мин яри комнатной температуре. Коньогат отделяли

от непрореагироваваих молекул антител и А-су5ъедимиии вискуммка с noMOCbD гельфильтраиии на ееоарозе CL-6B.

Энектрофорез и «миуиоблоттинг бйлкоэ. Белки аь'лидировали с помоиью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-На> согласно Ленмли [Laennli. 1970]. Икмуноблоттииг проводили по стандартной методике, описанной [Toubin et al., 1332].

Определение иитотохсической активности токсинов и иинунотокскзоа. Цитотоксическое действие токсинов определяли по выхив&емости клеток' согласно методике [Hossaan Т.. 1383] или по ингибировахио вклочения С^Н]тимияина на лимфоцитах периферической крови человека. Лимфоциты предварительно активировали

Фитогемагглвтинином (5хкг/кл) и ©орболнеристатацетатом (2 нг/ил) в течение 2 дней, а затем культивировали с ИЛ-2 <40 вд./ил). После инкубации с [^Н]-тимидином клетки переносили на стеклянные Фильтры и измеряли радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. Препарат ИТ тестировали при различных концентрациях, которые определяли по концентрации А-цепи рицина.

Ингибировахие белкового синтеза в бесклеточной системе. Ингибирование синтеза белка токсинами оценивали по вклвчекио [*4С]-лейцина в бесклеточкой системе из ретикулоцитоа кролика. Оценка гиярофобности топсшов по соязывато с АНС. Спектры Флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре "Aainco" (США), оборудованном термостатированным коветодергателен в стандартной кварцевой ковете (IckxIch). Связывание АНС о белками оценивали согласно методике [Cardanone and Purl, 1992].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. КоЕСкгокалыше антитела протиа токсина HL1.

Гибридомная клеточная линия TAS. продуиируопая

моноклон&льхие антитела против А-субъединицы вискумина (ВТА) была получена путей гибридизации клеток селезенки иммунизированных мыасй и мывиной ниедони SP2/0. Нетодон ИФА и иммуу.облоттинга показано, что моноклональние антитела ТА5 (монАТ ТА5. IeGl) выявляет ВТА.

Вискумин - Kistletoe lectin 1 (ML1). наиболее изученный представитель семейства токсических лектинов из онелы белой. В это семейство входят также HL2 и HL3. Оки представляют большой интерес как цитотоксические агенты для получения иммунотоксинов. Кроне того, эти токсины является основными белками в экстрактах онелы бело!-, которые применяется при терапии онкологических заболеваний. Структура и механизм иитотоксического действия этих токсинов мало изучены. С поиоаьо полученных кокАТ ТА5 определяли степень иммунологического перекреста мехду иэофорнами токсинов KL1. KL2 и HL3. На рис. 1 представлены результаты ИФА. На платы накосили антитела TAS, затем токсины, меченные биотипом. Обнаружили. что токсины ML2 и ML3 обладают перекрестной иммунореактивностью с вискумином. Для HL2 перекрест, выразенная в процентах, составляет 252, для KL3 - 1,52 (рис. П. Рицин, в аминокислотной последовательности А-субьединииы которого каблвдаетоя гомология до 202 с А-субъединицей вискумиха, не ьааимодействовал с TAS антителами.

0 2 4 6

Рис. I. Связывание токсинов HL1. HL2 и HL3 с монАТ ТА5 методом иммуноферкентного анализа. Кривые 1 - -о-о- - HL1; 2 -- HL2; 3 - - KL3.

На рис. Z.А показано, что А-субъединииы токсинов KL1, ML2 и

ML3 незначительно отличаются по молекулярном/ весу.

Иммуноблогтинг показал, что монАТ ТА5 взаимодействует со всеми

токсинами этого семейства (рис. 2. В). Аффинность подученных

мокАТ оценивали с помооью радиолигандиого метода. На рис. 3

показан профиль разделения комплексов монАТТА5-[*^1]токсин от

несвязанного токсина на колонке G3000SV (0.8x30см). Первый пик

соответствует связанному токсину - конплексу TAS-C^Sj]токсии.

Контрольные антитела не соязываотся с токсинами. Данные

связывания HL-токсинов с монАТ TAS были предсталены 8 координатах Скэтчарда и вычислены константы связывания. Константа связывания ТА5 антител с вискукнном составляла 4,3х107 Н"1. Для HL2 и HL3 кзооори токсинов кскстанты связывания равны 1.2х107 М"1 и 0.3x10^ Н"*. соответственно.

Рис. 2. Эдектрофоретическое разделение в присутствии НДС На в ПААГ (7-22Х) и икиуноблоттикг Hl-токсинов (А-В). 1-3 - ML1. HL2, HL3 6es * неркаптоэтанола. Нитроцеллюлозу обрабатывали ионоклональкиии антителами TAS к А-субъединиие вискумина (ML1), затем конъогаток анти-мыоиных антител с пероксидазой.

НСМЕ? ФРАКЦИИ

Рис. 3. Прооиль разделения комплексов "[моаАГ tA5]-[^5i.TOKelíH] от сэободиого токсина с помоаь» гельсильтраиии. 1 - -о-о- - HL1; 2 - -7-V- - HL2; 3 - -т-т- - HL3; 4 - -»-е- - HL1 в смеси о контрольными антителами.

Из полученных данных видно, что ноиАТ ТА5 характеризуется высокой аффккностыэ при взаимодействии с изофоркаки HL. Результаты ИФА при определении иммунологического перекреста токси'Аов (рис. 1), подтверхдаются данными, полученными яри изучении связывания токсинов с антителами радиолигакдным методой.

Пока отсутствуют данные о полкой аминокислотной последовательности токсинов семейства HL. Наличие перекрестной инкунореактизности говорит о гомологии в аминокислотной последовательности А-субъедпнии токсинов KL1, HL2 и HL3 и согласуются данными о первичной структуре токсинов этого семейства полученными [Dietrich et al., 1992]. Н-кокцы (30 аниногчслог) А-субьединиц HL1. HL2 и HL3 идентичны к еж ну собой и. имеет гомологи» с 8-гонцами рибосом-инактивирующих СЭлков II типа (рицин, абрих и др.). Предполагают, что три белка кодируется

одни« геном, и различия связаны липь с количественным к качественным составом углеводов. Однако, до результатам J.Crsbb (персональное сообвение) имеются 2 замени в К-ксние нехду НИ н HL2. Наблюдаемое сходство нехду HL изоформами подобно ранее описанному нехду рицином и агглютинином из клевгвины. которые такхе имеют значительное сходство в первичной структуре (из 689 а.к. отличаются 59). Нави данные, видимо, подтверждает вторую гипотезу.

С помовьв бесг.деточной белоксинтезируюаей системы ю ретикулоцито» кролика было изучено влияния монАТ TAS на Ферментативную активность ВТА. Для этого нокАТ инкубировали с ВТА 40 кинут при 37^С в молярном соотношении 3:1, при этом более S9X А-субьединицы находятся в комплексе с антителами. Затем оценивали ферментативную активность ВТА Срис. 4). Как видно, монАТ ТА5 хе ихгибируют активность ВТА. В то se время, уиеньсекие концентрации А-субьединицы в 10 раз приводит к укекьоению ингибируюцей активности в бесклеточкой системе на 422. Таким образом, антитела TAS связываютоя с ВТА, но не влияют на каталитическую активность. Это указывает ка то, что антигенный эпитоп для TAS антител и активный центр А-субъедикицы яе перекрывается в пространстве.

О 10 20 30

Время, мин

4. Включение лейцина в белки, синтезируемые бесклеточкой системе из ретикулоцитсэ кролика. 1 -о-о- - контроль; 2 - - А-субьеяикица НЬ1 (1.3х10"~ Н); 3 --- А-субьединииа НЬ1 (1.3х10"6 ) + монАТ ТА5 (Зх10"в Н).

2. Получение и оценка цитотоксической активности имнунотоссияоэ. Поиск высокоэффективных коньпгатов на основе монАТ представляет значительный интерес для избирательной элиминации Т-лиифоцитсв человека. Для получения иммунотоксиков хами были использованы монАТ <акти-СД25) к рецептору иитерлейкина-2 (ИЛ-2). которые представлены на поверхности как опухолевых, так и нормальных клеток. Различает гисокоаффинные и иизкоаффикние репепторц к ИЛ-2. Высокоаффинний рецептор имеет дополнительную субъеяиницу -

белок с молекулярной кассой около 70 кДа. Применение анти-СД25 ИТ возможно при терапии Т-лейкекиЯ и пересадках костного мозга для подавления реакции "трансплантант против хозяина", когда необходима элииимнеция популяции Т-лимооиитов, хесуоих высокоаффншшй рецептор.

Для получения имкухотоксиков <ИТ) антитела аити-СД25 обработали бифункциональным реагентом СПДП. На одну молекулу антитела было введено 3-4 киридилдисульфмдхых групп. После добавления ВГА или А-субьедихишд рицина (РТА), которые предварительно были обработаны дитиотрейтолом, в ' результате реакции тиоядисульфкдиого обиена яёразовалась ковалентиая дисульфидхая связь иехду антителом и А-субъедихиией токсина. Очистку кокъвгата от свободных антител и А-субъодикицы проводили с лоновь» гельфильтрации. Электрофорез в присутствии ДЛС-На показал, что очи&екный ИТ представлен тремя полосами (с молекулярным весом 160 кЛа. 210 кДа и 240 кДа). которые о присутствии 2-иеркаптозтакола расщепляются на А-субъединицу токсина'(30 кДа). тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина (23 и 55 кДа). Таким образом, получены ИТ анти-СД25/ВТА и анти-СД25/РТА. которые содержат в среднем 2 молекулы А-субьедихицы.

Анализ цитотоксических свойств ИТ проводили in vitro на активированных Т-линфоцитэх человека, экспрессируыаие на поверхности СД25 антигена. Для увеличения числа высокоаф^инкых рецепторов ИЛ-2 лняфоиити периферической крови человека предварительно обрабатывали с^тог емагглстиннном и

Форбодмеристатаиетатон.

к

с

и»

я «

и

д о

V X X 4)

V о

»«4

С а т

Рис. 5.

иммунотоксинов 4кти-СЯ25/СТА и ахти-СД25/РТА на клетки-кивеки.

Эффективность цитотоксического действия в культуре клеток оценивали по ихгибировакив включения С'Н]тинидина в клетки-нишехи. На рис. 5 предстаьлсны результаты ингибировакия ИТ включения С^Н]тимидииа клетками-мишснямн. Изолированные А-субьча^ници токсинов не ок1зиааг/г влияния на включения натки, тогда как полученные ИТ аятм-СД25/ВТА и ахти-С225/РТА полностью подавляет пролиферацию клеток при концентрации 10~® Н. Таким

образом, получеиниа ИТ обладают иитотокснческой активностью.

3. Сравнительный анализ иитотоксяческой активности ИТ.

Основной характеристикой активности токсинов и ИТ является

Концентрация ИТ, (М)

Зависимость токсического действия от концентрации

лоза. визываюаая ¿OS ингибирование ьключения метки - •

Величина ÎUI5Q ИТ сктн-СД25/БТА составляла 2,Сх10~1СМ <рис. 5). HCcq ИТ анти-СД25/РТА составляла 4,0x10"^ Н. Нейбходимо отметить, что активность ИТ с ВТА в 20 pas превивает активности ИТ с РТА.

Ранее хани выли получены ИТ ЛТ1/РТА и ЛТ1/ВТА (ЛТ1 -моноклональние антитела против поверхностных CS5 антигенов Т-линфоцитов), которые Эффективно подавляли пролиферацию кл<ток-мивенеЯ линии Jurkat. Как и в случае ИТ анти-СД25/ВТА. коныэгат ЛТ1/ВТА обладал более высокой активностью (ИД^д 2.1x10"I1 Н>, чем кокьюгат-ЛТ1/РТА (ИД50 1.6х10'9 Н). Таким образом, анализ иитотоксических свойств полученных ИТ против СД5 и СД25 антигенов Т-лимфоцитов человека показывает, что ИТ, содерхааие А-субьедиккц/ вискумина более активны по сравнению с ИТ, содерхапими А-субъединицу рицина. Более высокая активность ИТ, возможно, связана со структурными особенностями ВТА. например, с его высокой гидрофобностью.

Как известно, а при белок-белковых и белок-липидних взаимодействиях основную роль играет гидрофобные силы. Для оценки тидрофобности белков использовали метод с применением флуоресцентного зонда АНС (1-анилинонафталин-в-сульфонат). Метод основан на значительное увеличение квантового выхода АНС при связывании с гидрофобными участками белка. При добавлении АНС к раствору рицина, вискумина и их субьединиц наблюдали увеличение флуоресценция зохда АНС а 3 раза и коротковолновый сдвиг максимума спектров флуоресценции на 50-55 хм. Для определения количественных параметров связывания АНС с белком проводили анализ кривых титрования двух типов: 1- титрование зонда (3-5

мкН) белкой (от 0,1 до 10 мкМ); 2 - титрование белка (2-5 мкН) зондом ( от 1 до 50 икМ). Анализируя изменения

интенсивности флуоресценции можно рассчитать константу

ассоциации (Ка) АНС с белком и количество мест связывания

(Н) для АНС. В таблице 2 приведены значения этих параметров связывания для токсинов и их субьедикиц.

Таблица 2. Параметры связывания флуоресцентного зонда АНС вискуником и его А- и В- субьединицами в РЗЭ рН 7.4 яри температуре 25°С. (С - концентрация белка. &а - константа ассоциации, Н - число мест связывания}. Длина волны возбуждения 380 нм. длина волна регистрации 430 км.

Белок [С]. Н*6 [Ха], И"1 Ш/моль

Рицин 1.6 4.0x10' 0.9

Вискумин 2.2 2.0x10,1 2.6

ВТА 1.0 3,0x104 6.8

РТА 10.0 6.0x10^ 6.8

ВТВ 5.6 2.7x10° 0.5

РТВ 3.0 2.0x10° 0.7

Как видно из таблицы, константы связывания и количество мест связывания АНС для А-субгединиц токсинов значительно выве. чем для В-субьедикки. Это указывает на то, что структура РТА и ВТА отличается высокой гидрофовностъс. Эти гидрофобные участки Л-субъединиц токсинов расположены в области контакта между субъеднклиани. и по-випиному, обеспечивают Эффективное взаимодействие с гидрофобной мембраной при транслокаиии черва мембрану в цитоплазму клетки. Однако, не удалось выявить значительных различий при связывании АНС с РТА и ВТА.

4. Изучение внутриклеточного транспорта вискукияа.

В процессе цитотоксического действия токсины проходят четыре этапа: 1) связывание с рецептором; 2) рецептор-опосредованный экдоиитоз; 3) транспорт it месту траксмембранного перекоса (предполагают в области комплекса Гольдхи) и транслокаиия А-субъедикииы в цитоплазму; 4) инактивация рибосом. Синтез, внутриклеточный транспорт и секреция иммуноглобулинов осуществляется в обратном направлении. В связи с этим, клетки, продуцирувжие антитела против токсина являются удобным обьектом для изучения внутриклеточного процессинга токсина.

Цитотокснческое действие вискумина и химерного токсина на клетки гибридомы TAS оценивали по вихиваекости клеток. Определяли дозу токсина, вызываскую гибель SOS клеток. В качестве контроля использовали гибридопную линию, которая синтезирует кеспецифическне антитела IgGl. ЛДэд вискумина. определенная на клетках гибридоны ТА5. составляла 3.5х10"*®М. тогда как для контрольной гибридокы ЗЕ4 ока была ЗкЮ"12Н (рис. 6).

Таким обк'ььон. гидридона TAS сказалась в 110 раз устойчивее к токсическому действию вискумина. Резистентность к цитотоксичесхбиу действию токсина не является ¿особенностью линии клеток TAS. ЛЛсд рицина us отличается для клеток двух гибридом. При замене РТА на ЕТА наблюдается резистентность клеток TAS.

125 ПГПТ|—| 111.КЦ—til HIH|-1 I МЧЩ-I I 1 -1 I MIIÜJ

С 100

а

J5

и

а г ш а а s к 3

а

10~12 Ю-11 ю-10 10~3

КОНЦЕНТРАЦИЯ БЕЛКА, [Н]

Fhí . 6. Цитотоксичгское действие ЭТА xa клетки гм£?>ио;< ТА5 ЗВ4 (-0-0-",. Ешиваелотсъ клеток, оценивали с гоновью

нтт.

На рис. 7 язкагано цитотохсическое дейстьие хииерного т<жсих&, который состоит из А-еубьеднкици вискумика и В-субьедикииы рицина, ка клетки дьух гибридон. ЛД50 химерного токсина на клетки гибридомы ТА5 составляло 8x10"^^Н, тогда как ка клетки контрольной гибридомы ЗВ4 равно 2,7х10~Ч (рис. 7). Гибридона TAS сказалась в 30 раз устойчивее к цитотоксмчеркому действие химерного токсина, чем контрольная гибридона. Таким образом, резистентность клеток ТА5 объясняется взаимодействием антител с ВТА.

125

S 100

v □

Jü tu □

с

Ш

s «

3 о

75

50

25

TT3j—i 11 |мц—i i nrrr¡—j i m;ii|—гшм!> гтттгга]

ТА5 "

Q 14.J ■ ■ I "iij i i m-iJ ■ ill mit_I I Чпф—.-Шнф—

10-14 10-13 10-12 10-11 l0-9

ХИМЕРНЫ^ ТОКСИН. £M3

Рис. 7. Цитотоксическое действие химерного токсин» на клетки гибридомы ТА5 (-«-»-) и ЗЕ4 (-о-о-). Выхлваеность клеток оценивали с помовьо МГТ.

Лля выяснения иеханизма резистентности изучали влияние монАТ ТА5 на кькдом этапе взаимолейстьия токсина с клеткани. С понотыэ радиолигандного нетола количественно определили

связывание вискуинка с клеткам* двух гибридом. Число мест сьязыьания va одной клетке гибс-идони TAS составляло ¿2x10® при Згтом константа связывания достигает Ка-0.22x10® И"* Лля контрольной гибридоми ЗВ4 число мест связывания на одной

клетке равно 32x10s о Ка-0.15x10® Н~1 В присутствии лактозы блокируется связывание вискунина с клетками и наблюдается значительное скизениз иитотоксического действия на клетки двух гибридом (рис 4 и 5). Зто означает, что зискумик сэязнзается с поверхностными галактозосодерхаиими рецепторами клеток, и антитела ТА5, которые экспрессируетса на поверхность клеток гибридомы ТА5. не влияют на эффективность связывания его с клетками. 3 цитоплазм« клетки антитела TAS Sís влияет xs фериентатиБНуп активность ВТА, что било показано вuse (рис. 4). Следовательно, резистентность клеток ТА5 можно объяснить взаимодействием антител с токсином до tpauc.ioKauHH А-субъединицы в цитоплазму клетки.

Местом встречи антител с токсином является, либо везикулы в области тргнс-Гольджи, где нейтральное значение рН, либо цистерны комплекса Гольджи. Такое предг.ологение согласуется с литературными данными. В клетках, синтеэируюаих антитела, имеет :;есто слияние эндоиитозинх везикул с секреторными везикулами в области комплекса Голъдхи [Otlosen, 1980]. Кроме того, по данным [Yoshida et al.. 1931], нейтрализация внутриклеточных везикул усиливает цитотоксическое действие вискунина. Это указывает на то, что траксмембраимш'1 перенос А-субъеаиницы вискумииа Эффективнее осуыествляется из нейтральных везикул комплекса Гольджи.

Процессы внутриклеточного транспорта ноано нарушить с помочью НН4С1. S присутствии 10 нН HH^Cl, который нейтрализует рН везикул и нарувает внутриклеточный транспорт, наблюдали 150 кратное увеличение активности нативного вискунина на контрольных

клетках. Однако для клеток гибридомы ТА5 эффект усиления составлял 13 и 11 pas для вискумина и химерного токсина, соответственно. По-видиноку, это указывает на то. что наиболее вероятным местом транслокации А-субъединицы является внутриклеточные везикулы в области транс-Гольдхи, в которых ионАТ ТА5 связываются с А-субьедикицей вискумика, в результате чего каруаается трансмембранный перенос А-субъединицы.

ВЫВОДЫ

1) Получены моноклональные антитела ТА5 (IgGl), выявляющие А-субъединицу растительного токсина вискумина. Показано, что лектины из омелы белой ULI. HL2 и HL3 обладают перекрестной иимунореактивностью, ко различаются по сродству к монАТ ТА5. Данные антитела не ингибируют ферментативную активность А-суб-ьединицы.

2> Впервые получены иммунотоксины против СД25 антигенов Т-лимооцитов человека, содержащие А-субьединицы вискумина, который обладает избирательной цитотоксичесой активностью in vitro. Данный коиьюгат обладает более высокой активностью по сравнению с подобным имкуктоксикон на основе А-субьединицы рицина, что указывает на перспективность использования А-цепи вискумина для создания цнтотоксических агентов направленного действия.

3) Показано, что более вероятным местом транслокаиии А-субьединицы вискумика в цитоплазму является внутриклеточные везикулы в йбласти транс-Гольджи.

СПИСОК РАБОТ, ОП7БДМХОЕШН1ЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Буауева Т.Л., Бупуев В.Н., Ниринанова Н.В. Сарна Т., Топтыгин А.В., Ершова Г.В., Агапов И.И., Тоневицкий А.Г. Особенности структуры термически обработанкоой саяэыэасией субьедимипы рицина и возможность использования ее в составе иммунотоксинов. Натериалц 5-й Всероссийской конференции 'Новые направления биотехнологии", Пуаико, 1992, с.11.

2. A.G.Tonevitsky, ' I.I.Agapov, G.V.Ershova. T.Saraa, A.Yu.Toptygin, E.B.Hechetner. Cytotoxic Effect of Ricin-A-Chain Conjugates Containing Honoclonal Antibodies Against Hunan Erythroid Cells. International Journal of Innunopharaacology, v.15, n.2, p.229-235. 1993.

3. A.G.Tonevitsky, l.I.Agapov, E.B.Hechetner, G.V.Ershova, A.Yu. Toptygin, T.Sarna, A.T.Shanshibv, U.PfulIer. Conparison of the cytotoxic activity of the innunotoxins uith different internalization rate. Biocheaistry and Holecular Biology International, v.31, n.S. p.1053-1059, 1993.

4. А.Г.ТонеЕицкий, Г.В.Ершова, И.И.Агапоэ, А.В.Топтыгин, Т.Сарма, 0.В.Ксрсткоза, 3.Г.Кадагидае, А.Ю.Барышников. "Сравнение цитотоксическнх свойств иммунотоксиноъ с А-цепьо рицина против ди^грекцировочних ахтигекоз Т-лимфоцитоь человека" Доклады Академии Каук. т.334, м.2. с.245-2-43, 1394.

Зак.601

21

внииимт

Тир. 100