Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта

Челнокова, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта"

На правах рукописи

Челнокова Ольга Викторовна

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТОКСИНОВ В ХОДЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА.

03.00.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2002

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, проф. Тоневицкий А.Г.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, проф. Говорун В.М. Доктор биологических наук, проф. Долгих Д.А.

Ведущая организация:

ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится «_»

2002 г. в

мин на

заседании диссертационного совета Д.001.010.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Автореферат разослан «_»

2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Былинкина В. С.

Актуальность темы. Вискумин и рицин (молекулярная масса ~ 62 кДа) -белковые токсины растительного происхождения, которые относятся к группе рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБ II). Они состоят из двух субъединиц: А-субъединица (active) обеспечивает цитотоксический эффект, а В-субъединица (binding) - связывание токсинов с рецепторами на поверхности клеток. Механизм действия РИБ II заключается в избирательном выщеплении остатка аденина из 28Б-рРНК эукариот, результатом чего является остановка белкового синтеза. Токсины обладают высокой цитотоксической активностью для клеток млекопитающих -попадания одной молекулы в цитозоль достаточно, чтобы вызвать гибель клетки.

Процесс проникновения в клетку начинается со взаимодействия связывающей В-субъединицы с галактозосодержащими рецепторами, после чего происходит интернализация токсина внутрь клетки путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Затем токсин в составе везикул проходит эндосомальные компартменты клетки, аппарат Гольджи и достигает эндоплазматического ретикулума, где происходит его диссоциация на отдельные субъединицы. Конечной стадией транспорта является трансмембранный переход каталитической А-субъединицы токсина в цитозоль.

Высокое цитотоксическое действие РИБ II позволяет создавать на их основе цитостатики направленного действия для терапии, например, аутоиммунных и онкологических заболеваний. Повысить эффективность действия таких конъюгатов можно с помощью препаратов, изменяющих их внутриклеточный транспорт. При конструировании рекомбинантных иммунотоксинов необходимо учитывать данные о конформационных изменениях токсинов, в частности, во время трансмембранного перехода в цитозоль. Для А-субъединицы рицина было показано существование состояния «расплавленная глобула», которое предшествует транслокации токсина через мембрану внутриклеточных везикул [Argent et al., 2000]. Это состояние характеризуется частичным разворачиванием белка с последующим восстановлением нативной структуры в присутствии эукариотических рибосом in vitro.

Способность каталитических субъединиц токсинов к трансмембранному переходу позволяет использовать их при создании противовирусных вакцин

нового поколения в качестве вектора для доставки в цитоплазму различных пептидов. В результате необходимый пептид презентируется на поверхности клеток с помощью молекул главного комплекса гистосовместимости I класса. Это позволяет специфически активировать клеточный иммунный ответ организма. Активированные цитотоксические Т-клетки способны взаимодействовать с любой клеткой, зараженной вирусом, и убивать ее.

Таким образом, изучение конформационных изменений каталитической субъединицы перед трансмембранным переносом представляется важным аспектом изучения механизма действия токсинов на клетки.

Цели и задачи работы. Целью данной работы является изучение конформационных изменений вискумина и рицина в ходе внутриклеточного транспорта в клетках гибридом, продуцирующих антитела против этих токсинов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить гибридомы, продуцирующие монАт против А-субъединицы рицина. Охарактеризовать специфичность полученных антител. Изучить особенности внутриклеточного транспорта рицина и вискумина на стадии внутриклеточной диссоциации.

2. Получить гибридомы, синтезирующие монАт против связывающей В-субъединицы вискумина. Изучить устойчивость данных гибридом к цитотоксическому действию вискумина.

3. Охарактеризовать конформационные изменения МЬЛ в ходе внутриклеточной транслокации с помощью монАт против ненативной А-субъединицы вискумина (ТА7 и ТА71). С помощью синтетических фрагментов МЬЛ картировать эпитопы, узнаваемые данными антителами.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получена и охарактеризована серия новых гибридом, продуцирующих монАт против растительных токсинов - рицина и вискумина.

Картированы эпитопы для монАт, узнающих ненативную А-субъединицу вискумина.

Показано, что вискумин претерпевает изменения в структуре в ходе внутриклеточного транспорта. Установлено, что восстановление дисульфидной связи и диссоциация А- и В-субъединиц рицина, как и

вискумина, происходит до транслокации токсина в цитозоль. Показано, что перед трансмембранным переходом у каталитической субъединицы вискумина появляется новый антигенный эпитоп.

Полученные гибридомы и моноклональные антитела могут быть использованы для дальнейшего более подробного изучения транспорта РИБ II в клетке.

Апробация результатов и публикации. Результаты данной работы были доложены на VI Международной конференции аспирантов и студентов по фундаментальным наукам «Ломоносов-99» (Москва, Россия, 1999), на III конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99» (Санкт-Петербург, Россия, 1999), на 55-ой международной конференции «Dynamics of membrane traffic» (Ambleside, UK, 2002), а также на межлабораторном семинаре Центра «Биоинженерия» РАН. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выделение рицина, вискумина и их изолированных субъединиц. Рицин (R60) экстрагировали из семян клещевины Ricinus communis. Вискумин (Mistletoe lectin I или MLI) получали из листьев омелы белой (Viscum album). Токсины выделяли по методике, опубликованной ранее [Tonevitsky et al., 1990]. Изолированные А- и В-субъединицы токсинов выделяли по оригинальной методике путем элюции А-субъединицы 2% раствором меркаптоэтанола в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с колонки лактозил-сефароза 4B и последующей очисткой В-субъединиц с помощью ионообменной (для рицина) или аффинной (для вискумина) хроматографией. Чистоту полученных препаратов токсинов и их субъединиц оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия и твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) с использованием моноклональных антител к изолированным субъединицам токсинов.

Получение гибридом, очистка монАТ. Для получения гибридом, синтезирующих антитела против токсинов, использовали мышей линии Balb/C (пит. Столбовая).

Гибридомы против А-цепи рицина были получены при иммунизации мышей изолированной RTA. Первые две инъекции были проведены с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) - по 1,5 мкг RTA на мышь; последующие три инъекции - по 5 мкг RTA на мышь в отсутствии ПАФ. Для получения гибридом mlb-5,-6,-7,-9 мышей иммунизировали изолированной В-цепью вискумина (MLB). Первые две инъекции были проведены с ПАФ, по 20 мкг на мышь, последующие четыре - в отсутствии адъюванта, по 50 мкг на мышь.

Гибридома Mbchl была получена при иммунизации мышей нативным вискумином (MLI). Для снижения токсического эффекта MLI вводили в комплексе с монАт MNA9, взаимодействующими с А-субъединицей MLI. Молярное соотношение антиген: антитело в составе иммунного комплекса было 1:1. Первые две инъекции мыши получили с ПАФ, по 5 мкг токсина на мышь, последующие четыре - в отсутствии адъюванта и также по 5 мкг токсина на мышь.

Слияние иммунных селезеночных лимфоцитов и миеломы sp2/0 проводили на 3 день после последней иммунизации в полиэтиленгликоле (ПЭГ4000). Клетки миеломы и гибридом культивировали при 370С, 5% СО2 на среде RPMI-1640 с добавлением 10% ЭТС. Скрининг гибридом проводили с помощью ТИФА в двух системах: когда антиген был сорбирован на плате и когда находился в растворе. МонАт выделяли из асцитной жидкости мышей методом аффинной хроматографии на белок А-сефарозе. Чистоту препаратов контролировали с помощью электрофореза в ПААГ. Биотинилирование антител проводили с использованием N-оксисукцинимидного эфира биотинамидокапроата (Sigma, США) согласно рекомендациям производителей.

Твердофазный иммуноферментный анализ. Изучение взаимодействия антител с антигеном (рицином, вискумином или их изолированными цепями) проводили в различных системах ТИФА, отличающихся конформационным состоянием антигена. 1) В первой системе антиген сорбировали на плату, а затем наносили образцы, содержащие моноклональные антитела (монАт) в

различных концентрациях. Взаимодействие антител с антигеном оценивали с помощью меченных пероксидазой вторых антител против иммуноглобулинов мыши. 2) Во второй системе на плату сорбировали антитела, а затем вносили биотинилированный антиген. Уровень реакции оценивали с помощью конъюгата стрептавидин-пероксидаза. 3) В третьей системе на плату также сорбировали антитела, а затем добавляли подвергнутый тепловой денатурации в течение 3 минут при 1000С биотинилированный антиген. Реакцию проявляли с помощью комплекса стрептавидин-пероксидаза.

Для оценки эпитопной направленности монАт использовали конкурентный ТИФА. На иммунологическую плату сорбировали антиген (вискумин или его изолированные А- и В-цепи). Затем в лунки вносили образцы немеченых монАт в различных концентрациях. После инкубации и без отмывки добавляли известное количество меченных биотином монАт. Подавление связывания оценивали по ферментативной реакции, используя комплекс стрептавидин-пероксидаза.

Для оценки способности антител ингибировать связывание MLB с асиалофетуином (ASF) также использовали конкурентный ТИФА. На плату сорбировали асиалофетуин. Затем в лунки вносили MLB, предварительно преинкубированную с биотинилированными антителами. Молярное соотношение В-цепи и антител было 1:100. Способность комплекса MLB-антитело связываться с ASF выявляли с помощью конъюгата стрептавидин-пероксидаза.

Для изучения диссоциации субъединиц рицина и вискумина на плату сорбировали асиалофетуин или монАт против А-субъединиц токсинов. Затем в лунки добавляли предварительно проинкубированные с 5 мМ дитиотреитолом (ДТТ) токсины. А потом вносили вторые биотинилированные антитела против токсинов. Реакцию выявляли с помощью коньюгата стрептавидин-пероксидаза.

Чтобы оценить доступность антигена, связанного с рецептором, для антител внутри клетки использовали клеточный ИФА. После забивки 96-луночной платы 2%-ым раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ в лунки вносили мышиные фибробласты линии 3Т3 (10000 в лунку). Клетки добавляли и инкубировали в среде DMEM, содержащей 10% ЭТС.

После того, как клетки распластывались, в лунки вносили вискумин или его изолированную В-субъединицу. К образовавшемуся комплексу добавляли биотинилированные антитела против MLB. Уровень реакции оценивали с помощью конъюгата стрептавидин-пероксидаза.

В качестве хромогенного маркера пероксидазной реакции во всех схемах ТИФА использовали о-фенилендиамин (Sigma, США). Калориметрические измерения проводили на на мультискане фирмы Labsуstems (Финляндия) при 492 нм.

Определение цитотоксической активности токсинов. Цитотоксическое действие рицина и вискумина определяли по выживаемости клеток гибридом в присутствии токсинов с помощью раствора МТТ (2-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) (Sigma, США) [Agapov, Tonevitsky et al., 1999]. Измерения оптической плотности проводили на мультискане фирмы Labsystems (Финляндия) при 540 нм. Согласно методике, величина оптической плотности прямо пропорциональна числу живых клеток. Для сравнения активности токсинов использовали величину ЛД50 (доза токсина, вызывающая гибель 50% клеток). В качестве 100% принимали интенсивность окрашивания клеток, которые культивировали в отсутствии цитотоксических агентов. Бесклеточная система синтеза белка. Определяли ингибирование синтеза гемоглобина в бесклеточной системе синтеза белка лизата ретикулоцитов кролика. Уровень синтеза белка оценивали по включению Н-меченого лейцина после 1 часа инкубации в присутствии различных концентраций А-субъединицы рицина. Для осаждения белка по окончании инкубации к пробе (10 мкл) добавляли 10% раствор ТХУ. ТХУ-нерастворимый белок переносили на стеклянный фильтр. Фильтр помещали в раствор сцинтиллята и просчитывали радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика Delta 300 Spectra Analytic.

Для изучения влияния монАт на ферментативную активность, А-цепь рицина предварительно инкубировали в присутствии 100-кратного молярного избытка антител, затем смесь добавляли к бесклеточной системе синтеза белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение механизма действия рицина и вискумина на стадии внутриклеточной диссоциации.

Устойчивость гибридом, продуцирующих монАт против РИБ II типа, к действию токсинов определяется способностью антител ингибировать трансмембранный перенос каталитических субъединиц в цитоплазму [Kornfeld et al., 1991]. В отношении вискумина было показано, что существуют гибридомы, которые синтезируют антитела против MLA, не узнающие нативный токсин. Эпитоп для этих антител находится на каталитической субъединице вискумина в зоне контакта с В-субъединицей [Малюченко и др., 1997]. При этом клетки, продуцирующие данные антитела, устойчивы к действию вискумина. Устойчивость гибридом указывает на доступность эпитопа для антител внутри клеток (рис.1). Таким образом, перед транслокацией происходит диссоциация токсина, в результате чего экспонируются гидрофобные области, скрытые в зоне контакта субъединиц. Это может быть важным для выхода токсина из внутриклеточных компартментов в цитоплазму. С одной стороны, токсин может использовать ретротранслокационную систему клетки, которая экспортирует из эндоплазматического ретикулума в цитозоль белки с неправильной укладкой полипептидных цепей. С другой стороны, предполагают, что после разделения цепей в водную фазу экспонируются гидрофобные участки, что, в свою очередь, может запускать перестройки в структуре А-субъединицы. Гидрофобные участки встраиваются в мембрану, инициируя процесс транслокации.

Для изучения механизма действия и пути внутриклеточного транспорта рицина нами были получены гибридомы, продуцирующие монАт против различных эпитопов А-субъединицы рицина (RTA). Были выделены три типа монАт: Rch1, Rch2 и Rch5. Полученные антитела по-разному реагировали с RTA и цельным рицином (R60) в двух системах ТИФА (рис.2). МонАт Rch^ Rch2 взаимодействовали с нативными и сорбированными на плату RTA и рицином. В отличие от этих антител монАт Rch5 активно связывались с изолированной А-цепью в растворе, но не взаимодействовали с рицином. Эпитоп для этих антител расположен в области RTA, которая в целом токсине экранирована В-цепью и становится

1 Рецепторы • А-субъединица токсина

Клеточная У Антитела я В-субъединица токсина

З О Т

И Ц

мембрана

-II I Ф Ф I X

Эндосома

^ Транс-Гольджи

' Ъ».

Цис-Гольджи

Рибосомы

ГТ*

иэ^^р Ср—Со

Эндоплазматический ретикулум

Рисунок 1. Внутриклеточный транспорт токсина в гибридомной клетке.

Токсин в составе эндосом достигает комплекса Гольджи и ретроградно попадает в просвет эндоплазматического ретикулума. Синтезируемые клеткой антитела накапливаются также в просвете ЭР. Затем антитела внутри везикул доставляются антероградно через комплекс Гольджи к поверхности и секретируются. Антероградный и ретроградный транспорт осуществляются последовательным и непрерывным слиянием мембранных везикул. Пути движения токсина и антител могут пересекаться. При этом происходит образование комплексов токсин-антитело, которое приводит к

ингибированию переноса каталитической субъединицы в цитозоль.

доступной только при диссоциации цепей. Важно, что при сорбции ЯТЛ на иммунологическую плату эпитоп исчезает. Свойства полученных антирициновых антител аналогичны свойствам ранее описанных антител против МЬЛ [Малюченко и др., 1997].

1,5 1

1 "

0,5 -

стсм

Р60 в РТА в Р60 на РТА на растворе растворе плате плате

Рисунок 2. Взаимодействие анти-ЯТЛ моноклональных антител с рицином и его изолированной А-цепью в растворе и сорбированными на плату.

Клетки гибридом ЯеЫ и КеИ5 отличались устойчивостью по отношению к рицину (рис.3). Концентрация Я60, вызывающая гибель 50% клеток (ЛД50)

на контрольных гибридомных клетках составила 5х10 М. ЛД50 для рицина

ф ц

ф 3

к ц

0 с^ н

н о

100

80 -

60 -

20 -

13 12 11 10 9 концентрация рицина, -1д М

■РсМ

-А-МЫА5

Рисунок 3. Цитотоксическое действие рицина на клетки гибридом ЯеЫ. ЯеЬ5 и МЫЛ5.

на клетках Rchl и Rch5 отличалась от ЛД50 контрольных клеток более чем в 100 раз и составляла 2х10-10 и 5х10-11 М соответственно. При этом чувствительность клеток Rch1 и Rch5 к действию вискумина не отличалась от чувствительности контрольных клеток. Подобные результаты получены ранее для гибридом против MLA [Малюченко и др., 1997].

Интересно, что монАт Rch1 и Rch5 (рис.4), как и монАт MNA9 и MNA5 против MLA, не оказывали влияния на ингибирование токсинами белкового синтеза в бесклеточных белок-синтезирующих системах. Ферментативная активность RTA и MLA была практически одинаковой. Активность цельного токсина была почти в 1000 раз ниже, чем изолированной А-цепи. Следовательно, В-цепи рицина или вискумина стерически экранируют не только эпитопы MNA5 и Rch5, но также ферментативно-активные центры А-цепи. Размер межцепочечных доменов MLA и RTA (около 800 А) больше, чем размер эпитопов MNA5 и Rch5 [Sweeney E.C. et al., 1998]. Таким образом, В-цепь в цельном токсине ингибирует каталитическую активность А-цепи, но монАт не оказывают такого эффекта.

Рисунок 4. Рибосом-инактивирующее действие А-субъединицы рицина в бесклеточной системе синтеза белка (А) и влияние монАт на ЛД50 ЯТЛ (Б). В качестве контроля брали пробу, куда не добавлялась ЯТЛ.

мембрана

ЭР

цитозоль

Рисунок 5. Ингибирование трансмембранного переноса каталитической субъединицы в клетках гибридом, устойчивых к действию токсина. Обозначения субъединиц, рецепторов и антител как в рисунке 1.

Повышенная устойчивость гибридом к действию рицина обусловлена нарушением транслокации токсина в цитозоль. Устойчивость гибридомы КеИ5 подтверждает, что экспонирование эпитопа КеИ5 и, следовательно, диссоциация рицина на А- и В-цепи происходит до трансмембранного переноса токсина в цитозоль (рисунок 5).

Известно, что вискумин обладает более низкой цитотоксической активностью по сравнению с рицином. Т.к. В-цепи токсинов стерически экранируют ферментативно активные центры А-цепей, логично предположить, что разница в цитотоксической активности рицина и вискумина связана с характером и силой взаимодействия А- и В-субъединиц токсинов между собой.

Дитиотреитол (ДТТ) вызывает восстановление дисульфидной связи между А- и В-цепями токсинов, что должно приводить к диссоциации субъединиц рицина и вискумина. Однако кроме ковалентной дисульфидной связи субъединицы удерживаются вместе за счет нековалентных гидрофобных

взаимодействий. Для сравнения эффективности межсубъединичных взаимодействий в молекулах рицина и вискумина к сорбированным на плату асиалофетуину (ASF) или монАт против А-субъединиц токсинов добавляли предварительно проинкубированные с ДТТ токсины, после чего в лунки вносили вторые биотинилированные анти-токсиновые антитела. ASF -гликопротеин с концевой галактозой - может служить моделью рецептора для растительных РИБ II, т.к. взаимодействует с галактозо-связывающими центрами В-субъединиц токсинов. С помощью данной системы оценивали количество диссоциировавших молекул токсинов.

Из рисунка 6 видно, что нековалентные взаимодействия между субъединицами у вискумина сильнее, чем у рицина. Это согласуется с данными рентгеноструктурного анализа - показано, что межцепочечная область в вискумине как минимум на 20% больше, чем в рицине, у которого она равна 1600 А, и содержит больше гидрофобных аминокислот [Sweeney E.C. et al., 1998]. Более сильные межсубъединичные взаимодействия у вискумина могут объяснить снижение цитотоксической активности этого токсина по сравнению с рицином.

1,6 п

, Т f 1,2 Н

т.

3 0,8 Н

0,4

R60

R60+DTT

MLI

MLI+DTT

Рисунок 6. Диссоциация субъединиц рицина и вискумина под действием ДТТ, детектируемая монАт ЯеЫ и МЫА9.

По-видимому, диссоциация субъединиц является необходимой для транслокации каталитической субъединицы в цитозоль. Этапы восстановления дисульфидной связи и последующая диссоциация субъединиц являются универсальной стадией для цитотоксического действия РИБ II. Однако, место и механизм этого процесса пока неясен.

Ингибирующее действие вискумина на гибридомы, синтезирующие антитела против его связывающей субъединицы (MLB).

Получена серия гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против связывающей субъединицы вискумина.

Для получения гибридом применялись две схемы иммунизации. В одной схеме в качестве антигена использовали изолированную MLB. В другой -цельный вискумин. При этом для наиболее вероятного получения гибридом, синтезирующих антитела против MLB, токсин вводили в смеси с монАт MNA9, узнающими А-субъединицу вискумина. В таком комплексе антитела снижают иммуногенность А-цепи.

В результате слияния иммунных селезеночных лимфоцитов мыши, иммунизированной MLB, с миеломой были получены 374 ГАТ-устойчивых клона. Из этих клонов были отобраны четыре гибридомы (mlb-5, -6, -7 и -9), антитела которых в различной степени реагировали с нативной и сорбированной на плате формами MLI и MLB.

Из 533 ГАТ-устойчивых гибридом, полученных при слиянии лимфоцитов мыши, иммунизированной смесью MLI+MNA9, с миеломой две продуцировали антитела против В-субъединицы и одна против А-субъединицы. Оказалось, что антитела против В-цепи направлены к одному эпитопу. Поэтому для дальнейшего изучения нами была выбрана одна из гибридом (Mbch-1).

Таким образом, в ходе иммунизаций, дальнейшего получения и изучения свойств антител нами были отобраны пять клонов, продуцирующих моноклональные антитела против связывающей субъединицы вискумина: mlb-5, mlb-6, mlb-7, mlb-9 и Mbch-1.

С помощью конкурентного анализа антител между собой, было показано, что эпитопы для них частично перекрываются (рисунок 7).

Была изучена устойчивость гибридом, синтезирующих антитела против MLB, к цитотоксическому действию вискумина. Контрольными клетками в этих экспериментах служила миелома sp2/0, не продуцирующая антител против MLI, а также клетки описанной ранее гибридомы ТВ12 [Tonevitsky et al., 1995], устойчивой к действию вискумина. В отличие от гибридомы ТВ12

(ЛД50 = 5х10-11 М), полученные гибридомы были неустойчивы к действию

токсина. ЛД50 составляла -10" М, что сравнимо с ЛД50 контрольной линии

sp2/0. На рисунке 8 показано цитотоксическое действие вискумина на клетки Mbch-1.

Mbch-1

mlb-9

Рисунок 7. Предполагаемая схема расположения эпитопов на MLB, узнаваемых антителами серии mlb и Mbch-1.

14 13 12 11 10 9 8 концентрация вискумина, - 1д М

Рисунок 8. Цитотоксическое действие вискумина на клетки гибридомы МЬеЫ.

Известно, что устойчивость гибридом к цитотоксическому действию РИБ определена внутриклеточным взаимодействием токсинов и антител [Agapov ^ а1., 1999]. Отсутствие протективного эффекта полученных антител может

♦-Mbch-1

■■— TB12

-Ь— sp2/0

быть связано с тем, что участки В-цепи, взаимодействующие с антителами, не влияют как на взаимодействие MLB с рецепторами, так и на транслокацию А-цепи.

МонАт были протестированы на способность ингибировать связывание MLB с асиалофетуином. В конкурентном иммуноферментном анализе на сорбированный на плату ASF наносили вискумин, предварительно проинкубированный с биотинилированными антителами. Соотношение токсина и антител было 1:100. Как видно из рисунка 9 монАт Mbch-1 не препятствовали связыванию асиалофетуина с MLI. Следовательно, эпитоп на MLB, узнаваемый монАт Mbch-1, расположен таким образом, что данные антитела не создают стерических препятствий для связывания токсина с рецептором. Сходные данные получены и для гибридом mlb-5, -6, -7 и -9.

0,6-,

0,4-

о ^

О 0,2

без антител MNA9 Mbch-1

моноклональные антитела

Рисунок 9. Влияние антител на взаимодействие MLB c асиалофетуином.

Возможно, что эпитопы, распознаваемые данными антителами, становятся недоступным в образовавшемся комплексе токсин-рецептор.

Была оценена доступность вискумина или его изолированной В-субъединицы, находящихся в комплексе с рецептором, для антител. Антигены связывались с сорбированными на пластике клетками 3Т3 или асиалофетуином и к такому комплексу добавлялись биотинилированные

антитела. Как видно из рисунка 10, доступность эпитопа, узнаваемого антителами МЬсИ-1, практически не отличается для комплексов рецептор-токсин и асиалофетуин-токсин. Аналогичные результаты получены и для других антител. Полученные данные указывают на доступность В-субъединицы, находящейся в комплексе с рецептором, для антител.

А Б

см

СП ■t

с: О

1,8 -I 1,8 Л

1,5 - 1,5 -

1,2 - 1,2 -

Ж Л X

/ / см

0,9 - / / СП / / 0,9 -

/ _/

0,6 - /г 0 0,6 -

0,3 0,3

0 1 0 1

1 3 10 30 100 300 1000 концентрация Mbch1-bi, нг/мл

-■-клетки 3Т3 -A-ASF

1 3 10 30 100 300 1000 концентрация Mbch1-bi, нг/мл -■- клетки 3Т3 —A— ASF

Рисунок 10. Доступность вискумина (А) или его изолированной В-цепи (Б), находящихся в комплексе с рецептором, для антител Mbch-1.

Необходимо отметить, что описаны гибридомы (например, ТВ 12), синтезирующие антитела против MLB, устойчивые к действию вискумина. По-видимому, устойчивость гибридомных клеток определяется вытеснением токсина из комплекса с рецептором [Tonevitsky et al., 1995].

Неустойчивость гибридом к цитотоксическому действию вискумина говорит о том, что В-субъединица является вектором для доставки А-субъединицы в компартмент, из которого происходит ее транслокация, но, по-видимому, не участвует в ее трансмембранном переносе.

Конформационные изменения А-субъединицы вискумина при внутриклеточной транслокации.

Для изучения конформационных изменений МЬЛ перед транслокацией были использованы гибридомы, продуцирующие антитела против денатурированной формы вискумина. Конкурентный анализ семи монАт между собой позволил разделить антитела на две группы, обладающие различной специфичностью. В первую группу вошли шесть монАт, во вторую - одно монАт ТА7. В дальнейших экспериментах использовали по одному монАт из каждой группы - ТА7 и ТА71. Важно, что оба антитела взаимодействовали с МЬЛ и МЫ, сорбированными на плате, и с денатурированными антигенами, но не реагировали с нативными белками (рис.11).

2,5 -, 2

0,5 Н 0

□ MLA

□ денат. MLA ■ MLA на плате

ТА71

ТА7

Рисунок 11. Взаимодействие антител ТА7 и ТА71 с сорбированной на плате, денатурированной и нативной МЬЛ.

Интересно, что гибридома ТА71, синтезирующая соответствующие монАт, была неустойчива к действию токсинов. ЛД50 данной гибридомы к вискумину

12 13

составляла 1,5х10 М токсина (рис.12), ЛД50 к рицину - 2,5х10 М токсина, что в обоих случаях сравнимо с ЛД50 контрольной линии Бр2/0. Рицин использовался в качестве контроля на неспецифическую устойчивость гибридом к действию токсинов. Таким образом, в эндоплазматическом ретикулуме изучаемый эпитоп недоступен для взаимодействия с антителами.

В отличие от гибридомы ТА71 гибридома ТА7 была в 15 раз более устойчива к цитотоксическому действию вискумина (ЛД50 = 3х10-11) по

сравнению с контрольной линией (рис.12), но также не обладала

устойчивостью к действию рицина (ЛД50 = 4х10 ). Устойчивость гибридомы ТА7 к вискумину может определяться специфичностью продуцируемых антител.

I-

Ф Ц

Ф S

к ц

0 с^ н

н о

100

80 -

60 -

20 -

13 12 11 10 9 концентрация вискумина, - lg M

MNA9 sp2/0

-A-TA71

-X—TA7

Рисунок 12. Устойчивость гибридом ТА71, ТА7, MNA9 и миеломы sp2/0 к цитотоксическому действию MLI.

Однако, отсутствие сильного протективного эффекта ТА7 антител может объясняться, например, недолговременным существованием промежуточных конформационных состояний вискумина, в которых эпитоп для ТА7 становится доступен.

Наличие или отсутствие углеводов в составе эпитопов оценивали по взаимодействию монАт с негликозилированными формами антигена. Наряду с вискумином в листьях Омелы белой содержатся два родственных токсина, обозначаемые как Mistletoe lectin II (MLII) и Mistletoe lectin III (MLIII). Характерной особенностью ML3 является отсутствие углеводов в составе его каталитической субъединицы [Soler M.H. et al., 1997]. Как видно из рисунка 13, монАт взаимодействуют с ML3, а также с рекомбинантной MLA (r-MLA), полученной из E. coli, и, следовательно, негликозилированной. Таким образом, углеводы не входят в состав изучаемых эпитопов, поскольку эти эпитопы представлены на дегликозилированных молекулах -

рекомбинантной MLA и на изоформе вискумина ML3.

■ r-MLA

□ MLA

□ ML3

ТА71

ТА7

MNA9

моноклональные антитела

Рисунок 13. Взаимодействие монАт с рекомбинантной MLA и ML3.

Интересно отметить, что монАт ТА71 (но не ТА7), узнавали рицин и его А-субъединицу, сорбированные на плате. Взаимодействие антител ТА71 с R60 и RTA объясняется частичной гомологией рицина и вискумина (41%) и сходством их третичных структур [Sweeney et al., 1993].

Обработка токсинов гуанидингидрохлоридом приводит к появлению эпитопа ТА71. Сравнивали условия экспонирования эпитопа на RTA и MLA. На плату сорбировали монАт. Затем в лунки вносили предварительно проинкубированные с денатурирующим агентом биотинилированные антигены. Чтобы избежать разрушения антиген-связывающих центров антител под действием гуанидингидрохлорида, перед нанесением раствор разводили в 200 раз. Из рисунка 14 видно, что экспонирование эпитопа на молекулах RTA и MLA вызывается разной концентрацией денатурирующего агента: эпитоп на MLA появляется при концентрации гуанидингидрохлорида 3 М, а на RTA - при концентрации 2М. Это может быть связано с разной скоростью ренатурации у RTA и MLA. Поскольку при прохождении через клеточную мембрану необходимо разворачивание субъединиц [Argent R.H. et al., 1994], их способность возвращаться к исходной конфигурации может быть важной для восстанавливания ферментативной активности. Различия в

скорости ренатурации могут влиять на цитотоксическое действие этих двух токсинов, а также иммунотоксинов на их основе.

1,4 1 1,2 -1

концентрация гуанидингидрохлорида, М

Рисунок 14. Взаимодействие монАт ТА71 с биотинилированными МЬЛ и ЯТЛ после инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствии гуанидингидрохлорида.

Чтобы установить аминокислотные последовательности эпитопов, исследовали взаимодействие монАт ТА7 и ТА71 с синтетическими фрагментами МЬЛ. Панель пептидов была любезно предоставлена сотрудницей ГУ БМХ им. В.Н. Ореховича РАМН Е.И. Колесановой. Пептиды соответствовали наиболее иммуногенным линейным участкам МЬЛ (31% последовательности белка). В качестве положительного контроля использовали сыворотку иммунной мыши, спленоциты которой использовались для гибридизации. Было показано, что антитела ТА71 взаимодействуют с участком 93-103 (эпитоп ЛЕТНЬ) на МЬЛ. Антитела ТА7 с высокой эффективностью взаимодействовали с участком 98-108 (эпитоп РТотт) на МЬЛ. Данные по пептидному анализу согласуются с данными конкурентного ТИФА, в котором наблюдались частичные перекресты между эпитопами, узнаваемыми монАт ТА7 и ТА71. Согласно результатам рентгено-структурного анализа аминокислотные последовательности

эпитопов для данных антител скрыты в нативной молекуле вискумина [КгашрепИааг й а1., 2002].

Итак, с помощью монАт, узнающих ненативную МЬЛ, было получено свидетельство о разворачивании вискумина перед транслокацией. Представленные данные согласуются с ранее опубликованными данными о том, что при введении ковалентной дисульфидной связи в А-субъединицу рицина, то есть при жесткой фиксации конформации белка, способность токсина транслоцироваться резко понижается [Беаише11е е! а1., 1997].

Выводы:

1. Получены и охарактеризованы монАт, узнающие изолированную А-субъединицу рицина. Показано, что эпитоп для антител ЯсИ5 расположен в области контакта с В-субъединицей. Устойчивость гибридомы ЯсИ5 к цитотоксическому действию рицина указывает на то, что появление эпитопа, а следовательно, диссоциация токсина на субъединицы происходит до трансмембранного переноса каталитической субъединицы в цитоплазму.

2. Получена панель монАт против связывающей субъединицы вискумина. Антитела не ингибируют связывания токсина с рецептором. Гибридомные клетки не обладают устойчивостью к цитотоксическому действию вискумина. Это указывает на то, что связывающая субъединица токсина является только вектором для А-субъединицы и не участвует в ее трансмембранном переносе.

3. Показано, что монАт ТА7 узнают эпитоп, который отсутствует в нативном белке и появляется при денатурации вискумина. Гибридома ТА7 устойчива к цитотоксическому действию вискумина, что свидетельствует о взаимодействии антител и токсина до трансмембранного перехода каталитической субъединицы в цитозоль. Таким образом, устойчивость гибридомных клеток свидетельствует об изменении конформации А-субъединицы вискумина и появлении нового эпитопа в ходе внутриклеточного транспорта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Анализ свойств эпитопа, общего для А-субъединиц рицина и вискумина. М.М. Мойсенович, О.В. Челнокова, О.Н. Солопова, Н.В. Малюченко, С.Г. Егорова, И.И. Агапов, И.З. Зайцев, Е.И. Колесанова, А.Г. Тоневицкий.// Ж. Биотехнология, №3-4, стр. 31-37, 1999

2. Свойства общего для А-субъединиц рицина и вискумина эпитопа. О.В. Челнокова, М.М. Мойсенович, Н.В. Малюченко, Н.А. Торосян, С.Г. Егорова.// Медицинская иммунология, т. 1, стр. 111-112, 1999

3. Влияние схемы иммунизации на эпитопную направленность моноклональных антител, взаимодействующих со связывающей субъединицей вискумина. М.М. Мойсенович, С.Г. Егорова, О.В. Челнокова, И.А. Демина, Е.Р. Полосухина, Н.В. Козловская, Е.Н. Попова, Г.В. Фаттахова, О.Н. Солопова, И.И. Агапов.// Российский иммунологический журнал, т. 5, №4, стр. 375-384, 2000

4. Моноклональные антитела 763.74 и 225.28, направленные против высокомолекулярного меланомассоциированного антигена (HMW), как вектор для синтеза иммунотоксинов. К.Н. Новиков, О.В. Челнокова, Н.В. Малюченко, М.М. Мойсенович, И.С. Комолов, Т.Ю. Кондратьева, И.А. Демина, Г.В. Фаттахова, С. Ферроне, С.Г. Егорова// Биотехнология, №1, стр. 60-64, 2001

5. Внутриклеточные антитела не оказывают влияния на транспорт белковых токсинов. М.М. Мойсенович, И.И. Агапов, С.Г. Егорова, О.В. Челнокова, Н.В. Козловская, Г.В. Фаттахова, Ю. Бирайтер-Хан, А.Г. Тоневицкий// Доклады Академии Наук, серия Биохимия и Биофизика, т. 379, стр. 247-251, 2001

6. Рицин и вискумин связываются с разными участками клеточной мембраны. М.М. Мойсенович, И.А. Демина, И.И. Агапов, О.В. Челнокова, Н.В. Козловская, Ю. Бирайтер-Хан, А.Г. Тоневицкий, акад. РАН В.И. Шумаков// Доклады Академии Наук, т. 383, №6, стр. 175178, 2002

7. Comparison between the mechanisms of action of plant toxins ricin and viscumin on the stage of intracellular dissociation. A. Tonevitsky, I. Agapov, O. Chelnokova, M. Moisenovich, U. Marx// Drug Res, V. 52(6),

PP. 500-505, 2002

8. Binding, endocytosis, and intracellular sorting of ricin and viscumin. M.M. Moisenovich, O.V. Tchelnokova, I.I. Agapov, J. Bereiter-Hahn, A.G. Tonevitsky// Biochemical Society, PP. 24, 2002

Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований (№ 97-04-48796, № 97-04-48486, № 00-04-48349, № 00-0448828, № 693-1-26) и совместным Российско-Американским грантом СКОБ (№ £N1-403).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Челнокова, Ольга Викторовна

Список сокращений:.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Рицин и вискумин - представители растительных РИБ II типа.

1.1.1. Строение каталитических субъединиц рицина и вискумина.

1.1.2. Строение связывающих субъединиц рицина и вискумина.

1.1.3. Взаимодействие между субъединицами рицина и вискумина.

1.2. Внутриклеточный транспорт белковых токсинов.

1.2.1. Связывание с мембраной: рецепторы для рицина и вискумина.

1.2.2. Интернализация токсинов внутрь клетки.

1.2.3. Везикулярный транспорт белков в клетке.

1.2.4. Прохождение токсинов через эндосомальные компартменты клетки.

1.2.5. Транспорт токсинов в аппарат Гольджи.

1.2.6. Ретроградный транспорт токсинов в эндоплазматический ретикулум.

1.2.7. Транслокация токсинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта"

Белковые токсины растительного происхождения, относящиеся к группе рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБ II), состоят из двух субъединиц: каталитической (А) и лектиновой (В). А-субъединица (active) обеспечивает цитотоксический эффект, а В-субъединица (binding) - связывание токсинов с рецепторами на поверхности клеток. Механизм действия РИБ II заключается в избирательном выщеплении остатка аденина из 288-рРНК эукариот, результатом чего является остановка белкового синтеза. Токсины обладают высокой цитотоксической активностью для клеток млекопитающих - попадания одной молекулы в цитозоль достаточно, чтобы вызвать гибель клетки.

Интерес к токсинам вызван возможностью их практического применения. Высокое цитотоксическое действие РИБ II позволяет создавать на их основе цитостатики направленного действия для терапии, например, аутоиммунных и онкологических заболеваний. Повысить эффективность действия таких конъюгатов можно с помощью препаратов, изменяющих их внутриклеточный транспорт. При конструировании рекомбинантных иммунотоксинов необходимо учитывать данные о конформационных изменениях токсинов, в частности, во время трансмембранного перехода в цитозоль. Для А-субъединицы рицина было показано существование состояния «расплавленная глобула», которое предшествует транслокации токсина через мембрану внутриклеточных везикул [Argent et al., 2000]. Это состояние характеризуется частичным разворачиванием белка с последующим восстановлением нативной структуры в присутствии эукариотических рибосом in vitro. При разворачивании токсина экспонируются гидрофобные области, скрытые в нативной молекуле. Это может быть важным для выхода токсина из внутриклеточных компартментов в цитоплазму.

Способность каталитических субъединиц токсинов к трансмембранному переносу позволяет использовать их при создании противовирусных вакцин нового поколения в качестве вектора для доставки в цитоплазму различных пептидов. В результате необходимый пептид презентируется на поверхности клеток с помощью молекул главного комплекса гистосовместимости I класса. Это позволяет специфически активировать клеточный иммунный ответ организма, что важно для профилактики и лечения вирусных инфекций. Активированные цитотоксические Т-клетки способны взаимодействовать с любой клеткой, зараженной вирусом, и убивать ее.

Таким образом, изучение конформационных изменений каталитической субъединицы в ходе внутриклеточного транспорта и, в частности, перед трансмембранным переносом представляется важным аспектом изучения механизма действия токсинов на клетки.

Целью данной работы является изучение конформационных изменений вискумина и рицина в ходе внутриклеточного транспорта в клетках гибридом, продуцирующих антитела против этих токсинов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Челнокова, Ольга Викторовна

Выводы:

1. Получены и охарактеризованы монАт, узнающие изолированную А-субъединицу рицина. Показано, что эпитоп для антител КеЬ5 расположен в области контакта с В-субъединицей. Устойчивость гибридомы КеЬ5 к цитотоксическому действию рицина указывает на то, что появление эпитопа, а следовательно, диссоциация токсина на субъединицы происходит до трансмембранного переноса каталитической субъединицы в цитоплазму.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Челнокова, Ольга Викторовна, Москва

1. Агапов И.И., Тоневицкий А.Г., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Гусарова В.Ю. // Диссоциация каталитической и связывающей субъединиц вискумина при транслокации через мембрану. // ДАН, Т. 363(6), стр. 823-826, 1998

2. Вернослова Е.А., Конарева Н.В., Михайлов А.М. и др. // Пространственная структура молекулы Viscum album в кристаллическом состоянии. // Кристаллография, Т. 43, стр. 739-744, 1998

3. Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Егорова С.Г. Агапов И.И. Колесанова Е.Ф., Тоневицкий А.Г. // Разворачивание А-субъединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта токсина. // Молекулярная биология, T 34(1), 2000

4. Малюченко Н.В., Мойсенович M.M., Егорова С.Г., Гусарова В.Ю., Агапов И.И., Пфюллер У., Айфлер Р., Тоневицкий А.Г. // Получение моноклональных антител к различным детерминантам А-субъединицы Mistletoe lectin I. // Биотехнология, № 7-8, стр. 8-18, 1997

5. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Maluchenko N.V., Moisenovich M.M., Bulah Y.S., Kirpichnikov M.P. // Mistletoe lectin A-chain unfolds during the intracellular transport. // FEBS Lett, V. 464(1-2), PP. 63-6,1999

6. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Shamshiev A.T., Pohl E., Pohl P., Palmer R.A., Kirpichnikov M.P. // The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding. // FEBS Lett, V. 402, PP. 91-93, 1997

7. Argent R.H., Parrott A.M., Day P.J., Roberts L.M., Stockley P.G., Lord J.M., Radford S.E. // Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. // J Biol Chem, V. 275(13), PP. 9263-9, Mar 31,2000

8. Argent R.H., Roberts L.M., Wales R., et al // Introduction of a disulfide bond into ricin A-chain decreases the cytotoxicity of the ricin holotoxin. // J. Biol. Chem., V. 269, PP. 26705-26710, 1994

9. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. // Ribosome-inactivating proteins from plants. // Biochim. Biophys. Acta., V. 1154, pp. 237-282. 1993

10. Beaumelle B., Alami M., Hopkins C.R.// ATP-dependent translocation of ricin across the membrane of purified endosomes. // J. Biol. Chem., V. 268, PP 23661-23669, 1993

11. Bilge A., Howell-Clark J., Ramakrishman S., et al // Degradation of ricin A-chain by endosomal and lysosomal enzymes: the protective role of ricin B-chain. // Ther. Immunol., V. 1, PP. 197-204, 1994

12. Bilge A., Warner C., Press O. //Translocation of ricin A-chain into proteoliposomes reconstituted from Goli and endoplasmic reticulum. // J. Biol. Chem., V. 270, PP. 23720-23725, 1995

13. Bliek V.D., Redelmeier T.E., Damke H. et al // Mutations in human dynamin block an intermediate stage in coated vesicle formation. // J.Cell Biol., V. 122, PP. 553-565, 1993

14. Bradley D., Piatak M., Lane J.A., McGuire P.M. // Site-directed mutagenesis at amino terminus of recombinant ricin A chain. // Int. J. Peptide protein Res., V. 34(1), PP. 2-5, 1989

15. Brodsky J.L., McCracken A.A.//Er-associated and proteasome-mediated protein degradation: how two topologically restricted events came together. // Trends Cell Biol., V. 7, PP. 151-156, 1997

16. Brunger A.T. // Structural insights into the molecular mechanism of calcium-dependent vesicle-membrane fusion. // Current Opinion in Structural Biology, V.11, PP. 163-173, 2001

17. Chaudhary V.K., Jinno Y., FitzGerald D., Pastan I. // Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxyterminus that is required for citotoxicity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 87, PP. 308-312, 1990

18. Collwan J.F., Stangel M., Kuhn L.A., et al. // Trasferrin Receptor internalization sequence YXRF implicates a tight turh at the structrural recognition motif for endocytosis. // Cell, V. 63, PP 1061-1072, 1990

19. Cosson P., Letourneur F. // Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs. // Science, V. 263, PP. 16291631, 1994

20. Cosson P., Letourneur F. // Coatomer (COP I)-coated vesicles: role in intracellular transport and protein sorting. // Curr.Opin.Cell Biol., V. 9, PP. 484-487, 1997

21. Damke H., Baba T., van der Bliek A.M., Schmid S.L. // Clathrin-independent pinocytosis is induced in cells overexpressing a temperature-sensitive mutant of dynamin. // J. Cell Biol., V. 131, PP. 69-80, 1995

22. Davidson R.L, Gerald P.S.// Induction of mammalian somatic cell hybridization by polyethyleneglycol. // Methods Cell Biol., V. 15, P.325, 1977

23. Davis A.F., Bai J., Fasshauer J.L., Wolowick M.J., Lewis J.L., Chapman E.R. // Kinetics of synaptotagmin responses to Ca2+ and assembly with the core SNARE complex onto membranes. // Neuron, V. 24, PP. 363-376, 1999

24. Day, P.J., Owens, S.R., Wesche, J., Olsnes, S., Roberts, L.M., Lord, J.M. // An interaction between ricin and calreticulin that may have implications for toxin trafficking. // J. Biol. Chem. 276, 7202-7208, 2001

25. Donaldson J.G., Finazzi D., Klausner R.D. et al // Brefeldin A inhibits Golgi membrany-catalysed exchange of guanine nucleotide onto ARF protein. // Nature, V. 360, PP. 350-352, 1992

26. Duzgunes N. and Wilschut J. // Fusion assay monitoring intermixing of aqueous contents. // Methods in Enzymology, V. 220, PP. 3-14, 1993

27. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. // The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotiic ribosomes. The RNA N-glycosidase activity of the protein. // FEBS Letters, V.231, PP. 378-380. 1988

28. Eschenburg S., Krauspenhaar R., Mikhailov A., Stoeva S., Betzel C., Voelter W. // Primary structure and molecular modeling of mistletoe lectin I from Viscum Album. // Biochem and Biophys Res. Commun., v. 247, pp. 367-372, 1998

29. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. //Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-sepharose. // Immunochemistry, V. 15, PP. 429-436, 1978

30. Franz H. // Mistletoe lectins and their A and B chains. // Oncology, V. 43, PP. 23-34, 1986

31. Fujimoto T., Kogo H., Nomura R., Une T. // Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. // J. of Cell Science, V. 113, PP. 3509-3517, 2000

32. Gagescu R. // SNARE hypothsis 2000. // Nature Reviews Molecular Cell Biology, V. 1, PP. 5, 2000

33. Garred O., Deurs B.V., Sandvig K. // Furin-induced cleavage and activation of Shiga toxin. // J.Biol.Chem., V.270, PP. 10817-10821, 1995

34. Gerona R.R., Larsen E.C., Kowalchyk J.A., Martin T.F. // The C terminus of SNAP-25 is essential for Ca(2+)-dependent binding of synaptotagmin to SNARE complexes. // J Biol Chem, V. 275, PP. 63286336, 2000

35. Gluck A., Endo Y., Wool I. // The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. // Nucleic Acids Res., V. 22, pp. 321-324. 1994

36. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson G.W. et al. //Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor systems. // Ann.Rev.Cell.Biol., V.1, PP.1-39, 1985

37. Gorlich D., Hartmann E., Prehn S., et al // A protein of endoplasmic reticulum involved early in polypeptide translocation. // Nature, V. 357, PP. 47-52, 1992

38. Green S.A., Setiadi H., McEver R.P. // The cytoplasmic domain of P-selectin contains a sorting determinant that madiates rapid degradation in lysosomes. // J Cell Biol., V. 124, PP. 435-448, 1994

39. Gronenborn A.M. and Clore G.M. // Modeling the three-dimensional structure of the monocyte chemo-attractant and activating protein MCAF/MCP-1 on the basis of the solution structure of interleukin-8. // Protein Eng., V. 4(3), PP. 263-9, Feb 1991

40. Haft C. R., Klausner R.D., Tayolor S.I. // Involvement of dileucine motifs in the internalization and degradation of the insulin receptor. // J.Biol. Chem., V. 269, PP. 26286-26294, 1994

41. Hatakeyama T., Yamasaki N., Funatsu G. // Identification of the tryptophan residue located at the low-affinity sacharide binding site of ricin D. // J. Biochem., V. 100, PP. 781-788, 1986

42. Hazes B. // The (QxW)3 domain: a flexible lectin scaffold. // Protein Science, V. 5, PP. 1490-1501, 1996

43. Hazes B., Read R.J. // Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. // Biochem., V. 36, PP. 1105111054, 1997

44. Henley J.R., Krueger E.W.A., Oswald B.J., NcNiven M.A. // Dynamin-mediated internalization of caveolae. // J. Cell Biol., V. 141, PP. 85-99, 1998

45. Herskovits J.S., Shpetner H.S., Burgess C.C., Vallee R.B. // Microtubules and Src homology 3 domains stimulate the dynamin GTPase via its C terminal domain. // Proc Natl Acad Sci USA, V. 90, PP. 11468-11472, 1993

46. High S. // Protein translocation at the membrane of the endoplasmic reticulum. // Prog.Biophys.molec.Biol., V. 63, PP. 233-250, 1995

47. Humphrey J.S., Peters P.J., Yuan L.C et al // Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine containing sequence. // J. Cell Biol., V. 120, PP. 1123-1135, 1993

48. Hwang C., Sinskey A.J. and Lodish H.F.// Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. // Science, V. 257, PP. 14961502. 1992

49. Itin C., Foguet M., Kappeler F., Klumperman J., Hauri H.P. // Recycling of the endoplasmic reticulum/Golgi intermediate compartmentprotein ERGIC-53 in the secretory pathway. // Biochem. Soc. Trans., V. 23, PP. 541-544, 1995

50. Johannes L. and Goud B. // Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum? // Trends Cell Biol., V. 8, PP. 158-162, 1998

51. Johannes L., Tenza D., Antony C. // Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga-toxin. // J.Biol.Chem., V. 272, PP 19554-10561, 1997

52. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. // Structure of ricin A-chain at 2.5 Â. // Proteins: Structure, function, and genetics, V. 10, PP. 251-259, 1991

53. Kornfeld S.B., Leonard J.E., Mullen M.D., and Taetle R. // Assessment of ligand effects in intracellular trafficking of ricin A chain using anti-ricin hybridomas. // Cancer Res; V. 51, PP. 1689-1693, 1991

54. Laemmli U.K. // Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, V. 227, PP. 680-685, 1970

55. Lamaze C. and Schmid S.L. // The emergence of clathrin-independent pinocytic pathways. // Curr. Opin. Cell Biol., V. 7, PP. 573580, 1995

56. Le Borgne R., Hoflak B. Mannose-6-phospate receptors regulate the formation of clathrin-coated vesicles in the TGN. // J.Cell Biol., V. 137, PP. 335-345, 1997

57. Lee R.T., Gabius H.J., Lee Y.C. // Ligand binding characteristics of the major mistletoe lectin. // J. Biol. Chem., V. 267, PP. 23722-23727, 1992

58. Lee S.Z.Y. and Anderson W.F. // Receptor-mediated Moloney murine leukemia virus entry can occur independently of the clathrin-coated-pit-mediated endocytic pathway. // J. Virol., V. 73, PP. 59946005, 1999

59. Letourneur F., Gaynor E.C., Hennecke S. // Coatomer is essential for retrieval of dilysine-tagged proteins to the endoplasmic reticulum. // Cell, V. 79, PP. 1199-1207, 1994

60. Llorente A., Rapak A., Schmid S., et al // Expression of mutant dynamin inhibits toxicity and transport of endocytosed ricin to the Golgi apparatus. // J.Cell Biol., V. 140, PP. 553-563, 1998

61. London E. //How bactreial protein toxins enter cells: the role of partial infolding in membrane translocation// Mol. Microbiol., V. 6, PP. 3277-3282, 1992

62. Lord J.M., Roberts L.M. // The intracellular transport of ricin: why mammalian cells are killed and how Ricinus cells servive. // Plant Physiol Biochem., V. 34 (2), PP. 253-261, 1996

63. Lord J.M., Roberts L.M. // Retrograde transport: going against the flow. // Curr. Biol., V. 8, PP R56-R58, 1998

64. Lord J.M., Roberts L.M. // Toxin entry: retrograde transport through the secretory pathway. // J. of Cell Biology, V. 140(4), PP. 733736, 1998b

65. Majoul I. V., Ferrari D., Solling H.D. //Reduction of protein disulfide bonds in an oxidizing enviroment. The disulfide bridge of cholera toxin A subunit is reduced in the endoplasmic reticulum. // FEBS Lett., V. 401, PP. 104-108, 1997

66. Majoul I.V., Bastianes P.I., Solling H.D. // Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. // J.Cell Biol., V. 133, PP. 777-789, 1996

67. Mallard F., Antony C., Tenza D., Salamero J., Goud B., Johannes L. // Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. // J. Cell Biol., V. 143, PP. 973-990, 1998

68. Mekalanos J.J., Swarth D.J., Pearson G.D.N., Harford N., Groyne F. // Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development. // Nature, V. 306, PP. 551-557, 1983

69. Melby E.L., Prydz K., Olsnes S., Sandvig K. // Effect of monensin on ricin and fluid phase transport in polarized MDCK cells. // J. Cell. Biochem., V. 47, PP. 1-10, 1991

70. Mellman I. //Endocytosis and molecular sorting. // Ann. Rev. Cell. Dev. Biol., V.12, PP. 575-625, 1996

71. Miettinen H.M., Matter W., hunziker J.K. et al // Fc receptor endocytosis is controlled by a cytoplasmic domain determinant that actively prevents coated pit localization. // J. Cell. Biol., V. 116, PP. 875888, 1992

72. Montesano R., Roth J., Robert A. et al // Non-coated membrane invaginations are involved in binding and internalization of cholera and tetanus toxin. // Nature, V. 296, PP. 548-559, 1982

73. Montfort W., Villifranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S., Katzin B., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. //The three-dimensional structure of ricin at 2,8 A. // J. Biol. Chem., V.262, PP. 5398-5403, 1987

74. Morris R.E., Gerstein A.S., Bonventure P.F., et al // Recptor-mediated entry of diphtheria toxin into monkey kidney (Vero) cells: electron microscopical evaluation. // Infect. Immun., V. 50, PP 721-727, 1985

75. Mossman T. // Rapid colometric assay for cellular growth and survive: application to proliferation cytotoxity assays. // J. Immunol. Methods, V. 65, PP. 55-63, 1983

76. Moya M., Dautry-Varsat A., Goud B. // Inhibition of coated pit formation in Hep2 cells blocks the cytotoxicity of diphtheria toxin but not that of ricin toxin. // J.Cell Biol., V. 101, PP. 548-559, 1985

77. Mukherjee S., Ghosh R.N., Maxfield F. // Endocytosis // Physiol. Reviews, V. 77, PP. 759-803, 1997

78. Murzin A., Lesk A., Chothia C. // Beta-trefoil fold. // J.Mol.Biol., V. 223, PP.531-543, 1992

79. Newton D.L., Wales R., Richardson P.T., et al // Cell surface and intracellular functions for ricin galactose binding. // J.Biol. Chem., V. 267, PP.11917-11922, 1992

80. Nicolson G.L., Blaunstein J. // The interaction of Ricinus communis agglutinin with normal and tumor cell surfaces. // Biochem. Biophys. Acta., V. 266, PP. 543-547, 1972

81. Nie X, Basu S, and Cerny J // Immunization with immune complex alters the repertoire of antigen-reactive B-cells in the germinal centers. // Eur J Immunol, V. 27(12), PP. 3517-3525, 1997

82. Nilsson T., Hoe M.H., Shsarewicz P. et al // Kin recognition between medial Golgi enzymes in Hela cells. // EMBO J., V. 13, PP. 562574, 1994

83. Odorizzi G., Cowles C.R., Emr S.D. // The AP-3 complex: a coat of many colors. // Trends Cell Biol., V. 8, PP. 282-288, 1998

84. Oh P., Melntosh D.P., Schnitzer J E. // Dynamin at the neck of caveolae mediates their budding to form transport vesicles by GTP-driven fission from the plasma membrane of endothelium. // J. Cell Biol., V. 141, PP. 101-104, 1998

85. Ohno H., Stewart J., Fournier M.C. et al. // Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins. // Science, V. 269, PP. 1872-1875, 1995

86. Opresko L.K., Chang C.P., Will B.H. et al // Endocytosis and lysosomal targeting of epidermal growth factor receptors are mediated by distinct sequence independent of the tyrosine kinase domain. // J. Biol. Chem., V. 270, PP. 4325-4333, 1995

87. Pals-Rylaarsdam R., Gurevich V.V., Lee K.B., Ptasienski J.A., Benovic J.L., Hosey M.M. // Internalization of the m2 muscarinic acetylcholine receptor. Arrestin-independent and -dependent pathways. // J. Biol. Chem., V. 272, PP. 23682-23689, 1997

88. Pelham H.R., Munro S. // Sorting of membrane proteins in the secretory pathway. // Cell, V. 75. PP. 603-605, 1993

89. Pelham H.R.B. // SNAREs and the specificity of membrane fusion. // Cell Biology, V. 11(3), PP. 99-101, 2001

90. Plemper R.K., Wolf D.H. Retrograde protein translocation: ERADication of secretory proteins in health and disease.// Trends Biochem. Sci., V. 24 (7), PP. 266-270, 1999

91. Rapak A., Falnes P., Olsnes S. //Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94, PP. 3783-3788, 1997

92. Rapoport T., Rolls M., Jungnickel B. Approaching the mechanism of protein transport across the ER membrane. // Curr.Opin.Cell Biol., V. 8, PP. 499-504, 1996

93. Riederer M.A., Soldati T., Shapiro J., Lin J., Pfeffer S R. // Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. // J. Cell Biol., V. 125, PP. 573582, 1994

94. Riezman H. // The ins and out of protein translocation// Science, V. 278, PP. 1728-1729, 1997

95. Rizo, J., Suedhof T.C. // Mechanisms of membrane fusion. // Nature Struct.Biol., V. 5, PP. 839-842, 1998

96. Roberts L.M. and Lord J.M. //Cytotoxic proteins. // Current Opin Biotech, V. 3, PP. 422-429, 1991

97. Robinson M.S. et al // Cloning and expression of y-adaptin, a component of clatrin-coated vesicles associated with Golgi apparatus. // J.Cell.Biol, V. 111, PP. 2319-2326, 1990

98. Rodal S.K., Skretting G., Garred O., Vilhardt F., van Deurs B., Sandvig K. // Extraction of cholesterol with methyl-ß-cyclodextrinperturbs formation of clathrin-coated endocytic vesicles. // Mol. Biol. Cell, V. 10, PP. 961-974, 1999

99. Rohrer J., Schweizer A., Johnson K.F. et al // A determinant in the cytoplasmic tail of cation-dependent mannose 6-phosphate receptors prevents trafficking to lysosomes. // J. Cell Biol., V. 130, PP. 1297-1306, 1995

100. Romisch K. // Trends Cell Biol., V. 4, PP. 311-314, 1994

101. Rothberg K.G., Heuser J.E., Donzell W.C., Ying Y.-S., Glenney J.R., Anderson R.G.W. // Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. // Cell., Feb 21; V. 68(4), PP. 673-82, 1992

102. Rothberg K G., Ying Y.S., Kamen B.A., Anderson R.G. // Cholesterol controls the clustering of glycosphingolipid-anchred membrane receptor for 5-methyltetrahydrofolat. // J. Cell Biol., V. 111, PP. 2931-2938, 1990

103. Rothman J.E. // Mechanisms of intracellular transport. // Nature, V. 372, PP. 55-63, 1992

104. Rothman J.E., Schmid S.L. // Enzymatic recycling of clathrin from coated vesicles. // Cell, V. 46, PP. 5-9, 1986

105. Rutenber E., Ready M., Robertus J.D. // Structure and evolution of ricin B-chain. // Nature, V. 326, PP. 624-626, 1987

106. Rutenber E., Robertus J.D.// Structure of Ricin B-chain at 2.5 A Resolution. // Proteins, V. 10, PP. 260-269, 1991

107. Sacchettini J.C., Baum L.G., Brewer C.F. // Multivalent protein-carbohydrate interactions. A new paradigm for supermolecular assemblyand signal transduction. // Biochemistry, V. 40(10), PP. 3009-3015, Mar 13, 2001

108. Sandvig K., Bo van Deurs // Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of shiga toxin and ricin. // Phys. Reviews, V. 76, PP. 949-966, 1996

109. Sandvig K.,.Ryd M., Garred O., et al.//Retrograde transport from the Golgi complex to the ER of both Shiga toxin and nontoxic shiga B-fragment is regulated by butyric acid and cAMP// J. Cell Biol., V. 126, PP. 53-64, 1994

110. Sandvig K., Dubinina E., Garred O. et al // Endocytosis and intracellular transport of protein toxins. // Biochem. Soc. Trans., V. 21, PP. 707-710, 1993

111. Sandvig K., Olsnes S., Petersen O.W. et al // Endocytosis from coated pits of Shiga toxin: a glycolipid-binding protein from Shigella dysentereriae// J. Cell Biol., V. 108, PP. 1331-1343, 1989

112. Sandvig K., van Deurs B. // Endocytosis and intracellular transport of ricin: recent discoveries. // FEBS Let., V. 452, PP. 67-70, 1999

113. Schapiro F.B., Lingwood C., Furuya W., Grinstein S. // pH-independent retrograde targeting of glycolipids to the Golgi complex. // Am. J. Physiol., V. 274, PP. 319-332, 1998

114. Schapiro F.B. and Grinstein S. // Determinants of the pH of the Golgi complex. // J. of Biological Chemistry, V. 275, PP. 21025-21032, 2000

115. Schekman R. and Orci L. // Coat proteins and vesicle budding. // Science, V. 271, PP. 1526-1533, 1996

116. Scherer P.E., Okamoto T., Chun M., Nishimoto I., Lodish H.F., Lisanti M.P. // Identification, sequence, and expression of caveolin-2 defines a caveolin gene family. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 93, PP. 131-135, 1996

117. Schlegel A. and Lisanti M.P. // Caveolae and their coat proteins, the caveolins: from electron microscopic novelty to biological launching pad. // J Cell Physiol. Mar, V. 186(3), PP. 329-37, 2001

118. Schmid S.L., Carter L.L. // ATP is required for receptor-mediated endocytosis in intact cells. // J. Cell Biol, V. 111, PP. 2307-2318, 1990

119. Seetharam S., Chaudhary VK, FitzGerald D, Pastan I // Increased cytotoxic activity of Pseudomonas exotoxin and two chimeric toxins ending in KDEL. //J. Biol. Chem., V. 266, PP. 17376-17381, 1991

120. Sharon N. // Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals: an atomic view. // TIBS, V. 18, PP. 221-226, 1993

121. Simmons B.M., Stahl P.D., Russel I.H. Mannose receptor-mediated uptake of ricin toxin and ricin A-chain by macrophages.

122. Multiple intracellular pathways for A chain translocation. // J.Biol.Chem., V. 261, PP. 7912-7920, 1986

123. Simpson J.C., Dascher C., Roberts L.M. et al //Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. // J. Biol. Chem., V. 270, PP. 20078-20083, 1995a

124. Simpson J.C., Lord J.M., Roberts L.M. // Point mutation in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays key role in the membrane translocation. // Eur. J. Biochem., V. 232, PP. 458-463, 1995b

125. Simpson J.C., Roberts L.M., Lord J.M. // Free ricin A-chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol. // Exp. Cell Res., V. 229, PP. 447-451, 1996

126. Soler M.H., Stoeva S, Voelter W // Complete amino acid sequence of the B chain of mistletoe lectin I. // Biochem Biophys Res Commun V. 246(3), PP. 596-601, 1998

127. Soler M.H., Stoeva S., Schwamborn C., Wilhelm S., Stifel T, Voelter W. Complete aminoacid sequence of the A-chain of mistletoe lectin I. // FEBS letters, V. 399, PP.153-157, 1996

128. Spicer E.K. and Noble J.A. // Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Nucleotide sequence of the A subunit gene. // J. Biol. Chem., V. 257, PP. 5716-5721, 1982

129. Stamnes M.A., Craighead M.W., Hoe M.H. et al //An integral membrane component of coatomer-coated transport vesicles defines afamily of proteins involved in budding. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 92, PP. 8011-8015, 1995

130. Stamnes M.A., Rothman J.E. // The binding of AP-1 clathrin adaptor particles to Golgi membrane requires ADP-ribosylation factor, a small GTP-binding protein. // Cell, V. 73, PP. 999-1005, 1993

131. Subtil A., Gaidarov I., Kobylarz K., Lampson M.A., Keen J.H., McGraw T.E. // Acute cholesterol depletion inhibits clathrin-coated pit budding. // Proc. Natl Acad. Sci. USA, V. 96, PP. 6775-6780, 1999

132. Sweeney E.C., Palmer R.A., Pfuller U. // Crystallization of the ribosome-inactivating protein MLI from Viscum album (Mistletoe) complexed with ß-D-galactose. // J. Mol. Biol., V. 234, PP. 1279-1281, 1993

133. Sweeney E.C., Rex A.P., Pfuller U. et al // Dimerisation of mistletoe lectin I occurs by non-covalent association of two molecules. // COST 98, V. 5, PP. 69-75, 1998

134. Teasdale R.D., Jackson M.R. // Signal-mediated sorting of membrane proteins between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. // Ann.Rev.Cell Dev.Biol., V. 12, PP. 27-54, 1996

135. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. // Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 76, PP. 4350-4354, 1979

136. Van Deurs B. // Ricin transport into cells: studies of endocytosis and intracellular transport. // Int. J. Med. Microbiol, V. 290, PP. 415-420, 2000

137. Van Deurs B., Sandvig K., Petersen O.W. et al // The ways of endocytosis. // Int. Rev. Cytol, V. 117, PP. 131-177, 1989

138. Van Deurs B., Sandvig K., Petersen O.W. et all // Estimation the amount of internalizated ricin that reaches the trans-Golgi network. // J.Cell Biol., V.106, PP. 253-267, 1988

139. Van Deurs B., Tonnessen T.I., Petersen O.W., Sandvig K., Olsnes S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. // J.Cell Biol., V. 102, PP. 37-47, 1986

140. Vickery R.G. and Zastrow M. // Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic compartments. // J. Cell Biol., V. 144, PP. 31-43, 1999

141. Villafranca J.E., Robertus J.D. // Ricin B chain is a product of gene duplication. // J.Biol.Chem., V. 256, PP. 554-556, 1981

142. Villifranca J.E // The crystal structure of ricin at low resolution. // Ph.D. dissertation. University of Texas at Austin, 1980

143. Voorhees P., Deignan E., van Donselaar et al // An acidic sequence within the cytoplasmic domain of furin functions as a determinant of trans-Golgi network localization and internalization from cell surface. // EMBO J., V. 14, PP. 4961-4975, 1995

144. Wales R., Richardson P.T., Roberts L.M. et al // Mutational analysis of the galactose binding ability of recombinant ricin B chain. // J. Biol. Chem., V. 266, PP. 19172-19179, 1991

145. Weston S., Tucker A., Thatcher D., Derbyshire D., Pauptit R. // X-ray structure of recombinant ricin A-chain at 1,8 A resolution. // J Mol Biol, V. 244, PP. 410-22, 1994

146. Yamasaki N., Hatakeyama T., Funatsu G. // Ricin D-sacharide interaction as studied by ultraviolet difference spectroscopy. // J. Biochem., V. 98, PP. 1555-1560, 1985

147. Youle R.J. and Colombatti M. // Hybridoma cells containing intracellular anti-ricin antibodies show ricin meets secretory antibody before entering the cytosol. // J Biol Chem; V. 262, PP. 4676-4682, 1987

148. Zhan J., Stayton P., Press O. // Modificatication of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences enhances its cytotoxicity and traslocation. // Cancer Immunol., Immunother., V. 46, PP. 55-60, 1998

149. Zhang J., Ferguson S.S.G., Barak L.S., Menard L., Caron M.G. // Dynamin and P-arrestin reveal distinct mechanisms for G proein-coupled receptor internalization. // J. Biol. Chem., V. 271, PP. 18302-18305, 19961. Благодарности.

Информация о работе

Челнокова, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2002
ВАК 03.00.04

Диссертация

Конформационные изменения растительных токсинов в ходе внутриклеточного транспорта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы