Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности влияния миллиметровых электромагнитных волн на регуляцию генной экспрессии на модели индукции профага в клетках ESCHERICHIA COLI

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности влияния миллиметровых электромагнитных волн на регуляцию генной экспрессии на модели индукции профага в клетках ESCHERICHIA COLI"

из 00

МЕЖЗТРАСтаОЙ^ХЧНО-ИНЖЕНЕРНШ ЦЕНТР ФИЗИКИ ЖИВОГО И ~ "мМ)ёОЛШШ РЕЗОНАНСНОЙ ТЕРАПИИ "ВИДГУК" ПРИ КАБИНЕТЕ МИНИСТРОВ УКРАИНЫ

На правах рукописи ЛУКАШЕВСКИЙ Константин Валерьевич

ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ МИЛЛИМЕТРОВЫХ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ВОЛН НА РЕГУЛЯЦИЮ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ НА МОДЕЛИ ИНДУКЦИИ ПРОФАГА X В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI

(03.00.02 - БИОФИЗИКА)

АВТОР-ЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1993

Работа выполнена в Межотраслевом научно-инженерном центре физики живого и микроволновой резонансной терапии "Видгук".

Научные руководители: кандидат биологически? наук

И. Я. Беляев, доктор физико-математических наук, профессор В. В. Самедов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ю. А. Кутлахмедов, доктор биологических наук,

профессор В. Л. Зима.

Еедущая организация: Объединенный институт ядерных

исследований С г. Дубна).

Защита состоится " " 1993 г.

в_час._мин. на заседании специализированного совета

Д 173.01.01 МНИЦ "Видгук" в Межотраслевом научно-инженерном центре физики живого и микроволновой резонансной терапии "Видгук" по адресу: г. Киев, ул. Владимирская, 61-Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МВД "Видгук".

Автореферат разослан " ^ уъС^р&Я 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, у ,

кандидат физико-математических наук, доцент Г. С.Литвинов.

- з -

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы во всем мире растет интерес к изучению биологических эффектов низкоинтенсивных микроволн, что связано как с расширением их использования в технике и медицине, так и с возникновением теоретических представлений, связывающих устойчивость живых систрм с передачей информации в миллиметровом диапазоне электромагнитных излучений (ЭМЮ CSitko el al.,

1988). Данная работа, посвященная исследование регуляции генной экспрессии клеток под влиянием миллметровых волн (ММВ) является частью исследований, ведущихся в рамках концепции физики живого (Ситько,

1989).

В настоящее время наиболее актуальным является вопрос о механизме действия ММВ на биообъекты различных уровней организации, приводящего к заметным эпигенетическим эффектам, то есть эффектам происходящим на уровне взаимодействия генов и их продуктов, но не связанных с изменением нуклеотидной последовательности ДНК (Toman, 1985). Имеется ряд данных, свидетельствующих о возможности экстраполяции явлений, происходящих при переключении генов в клетках бактерий на более высокие уровни организации живого (Ptashne М., 1986). Высокая чувствительность и хорошая изученность бактериальных индуци-бельных систем, широкие возможности манипулирования экспериментальным материалом делают их наиболее подходящими объектами для изучения механизмов регуляции генной экспрессии. На двух наиболее исследованных системах бактерии Escherichia coli, индукции синтеза колицина (Смолянская и Виленская, 1973) и индукции прсфага X (Webb, 1979) были получены острорезонансные эффекты действия низкоинтенсивных миллиметровых волн.

Отсутствие в настоящее время полной ясности в понимании механизма биоэффектов низкоинтенсивных ММВ придает большое значение исследованию микроволновой регуляции генной экспрессии, изменяющейся при различных заболеваниях и действии внешних физических и химических агентов (Ghering, 1989). Практически важно связать параметры сигнала, приводящего к включению и выключению различных групп генов, с параметрами биологической системы способной переводить клетку из

одного состояния в другое. Это возможно только при ясно« понимании того, каким образом происходит выбор того или иного пути развития. На первых же этапах, направление исследований может подсказать изучение закономерностей влияния ЭМИ на поведение хорошо изученных систем, таких как две вышеназванные.

Поскольку для разрыва ковалентной связи в молекуле ДНК требуется энергия 2...5 эВ, прямое действие миллиметрового излучения с энергией кванта 10 "^...10 ~"эБ не может быть ДНК-яовреадающш, что подтверждают и имевшиеся литературные данные. В таком случае, механизмы переключения генной активности под действием ДНК- повреждающих факторов и миллиметровых волн должны принципиально отличаться.

Наличие экспериментальных данных о резонансном поглощении микроволн молекулами ДНК in vivo (Webb and Booth, 1979) и in vitro (Swicord M. et al.,1983) и теоретических моделей, описывающих существование собственых колебаний белковых глобул в диапазоне частот Ю10...10П Гц (Fröhlich, 1980) позволяют предположить взаимодействие ММВ с белок-нуклеиновыми комплексами, участвующими в регуляции генной экспрессии.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы является экспериментальное исследование закономерностей индукции бактериофага X в клетках E.coli под влиянием миллиметровых волн и анализ происходящих при этом процессов регуляции экопрессии гёнов профага .

В соответствии с данной целью были поставлены следующие конкретные задачи исследования: исследовать влияние миллиметровых волн на индукцию профага X в лизогенных клетках E.coli К12 дикого типа на разных стадиях роста бактериальной культуры; исследовать индукцию профага X под действием миллиметровых волн в клетках E.coli с мутациями в системе SOS-репарации (гес/1 мутанты); провести сравнительный анализ действия микроволн и ультрафиолета на лизогенную индукцию в исследуемых штаммах; изучить частотные и мощностные зависимости действия ММВ на индукцию X профага; оценить возможность теплового характера обнаруженных эффектов, для чего изучить зависимость лизогенной индукции от температуры; исследовать индукцию профага X под влиянием низких концентраций бромистого этидия, как модельнуЬ систему для

оценки индуцибельного действия конформационных изменений ДНК.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые обнаружено резонансное действие ЭМИ в области 70.40 ГГц на индукции профага X в клетках E.coli N99rec/j(XJ, с блокированной SOS-системой. Таким образом, показано отсутствие роли индуцибельной системы SOS-репарации в индукции профага X под действием ММВ, что подтверждает гипотезу о влиянии данного фактора на динамический комплекс ДНК - X репрессор, а также данные о немутагенном, ДНК- неповреждащем действии низкоинтенсивных миллиметровых волн. Впервые зарегистрировано динамическое увеличение и уменьшение спонтанного уровня индукции профага X в стационарных клетках N99ÍX) после облучения их на частоте 51.74 ГГц в условиях эффективнго воздействия ММВ на конформационное состояние генома E.coli. Обнаружено изменение лизогенной индукции в клетках КЭ9гес/1(Х) под влиянием низких концентраций бромистого этидия, что свидетельствует о принципиальной возможности контроля переключения генов профага с помощью изменения конформации макромолекулярных комплексов.

Практическое значение работы. Выводы о закономерностях биологического действия ММВ, сделанные на основе экспериментальных данных, полученных на простейших, можно использовать как в медицинской практике, так и в экологии для нормирования воздействия ММВ на производстве и в быту.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на I Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты использования миллиметровых излучений в медицине" СКиев, 1989), I Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Механизмы действия магнитных и электромагнитных полей на биосистемы различных уровней организации" (Ростов-на-Дону, 1989), X Международном биофизическом конгрессе (Ванкувер, Канада, 1990), VIII Балканских биохимических и биофизическихх днях (Клуш-Напока, Румыния, 1990), XIX Ассамблее URSI (Прага, ЧСФР. 1990), I Биофизическом и биотехнологическом конгрессе GAP (Диарбакир, Турция, 1991), I Конгрессе ЕВЕА (Брюссель, Бельгия, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 17

тезисов научных докладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы включавшего 102 наименования. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и содержит 19 таблиц. Полный объем диссертации - 80 страниц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среды. Для выращивания бактерий в'работе использовали богатые и минимальные среды. В качестве богатой среды использовали бульон или авизированную среду Хоттингера (Тимаков, Гольдфарб, 1958). В качестве минимальной среды использовали жидкую или агаризованную среду Адамса с соответствующими добавками (Миллер, 1976). Для инкубации клеток перед облучением использовали обогащенную среду BHIB (Brain Heart Infusion Broth, Difco).

Для выращивания фагов использовали бульон или агаризованную среду Лурия (L-бульон или L-среда) (на 1 л дистиллированной воды /г/: пептон •• 15 , дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, MgSO^HgP - 4; для L-среды агар -15).

Разведения препаратов бактерий и бактериофагов проводили в физрастворе (8.5г NaCl на 1л дистиллированной воды).

Бактериальные штаммы. Использованные в работе штаммы Escherichia coli К-12: С600, U99(F~galKgalTstrr) (индикаторные) и SS447 = N99metBpurDsrl::Tn10recA получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (BKIM). Штаммы N99(X) и НЖгесЛШ были получены в ходе работы.

Штаммы бактериофагов. Умеренный бактериофаг X, необходимый для лизогенизации штаммов, и бактериофаги X biolO и Xvir для

проверки бактерий на наличие гесА мутации и лизогенность предоставлены ВКПМ.

Культивирование бактерий. Для большинства опытов клетки ез ночной культуры разводили в необходимое количество раз и растили до середины логарифмической фазы в L-бульоне на качалке при температуре 37°С.

Концентрацию клеток в суспензии бактерий перед высевом опреде-

ляли умножением числа выросших на чашке Петри с агаризованной средой колоний (18 ч, 37°С) на значение разведения суспензии перед высевом.

Титр фага определяли на чашках с L-средой стандартным двуслойным методом Грация (Тимаков, Гольдфарб, 1958). В качестве верхнего слоя использовали жидкий агар (7 г агара на 1 л дистиллированной воды) который перед заливкой на чашки поддерживали при температуре 45°С. На чашку Петри заливали 3 мл верхнего агара вместе с 0.1 мл индикаторного штамма и 0.1 мл суспензии фага после соответствующего разведения. Концентрацию фаговых частиц получали умножением подсчитанного числа негативных колоний (НЮ (стерильных бляшек) на чашке на разведение фагов перед высевом.

Коэффициент индукции (К^) профага определяли как отношение наблюдаемых НК при титровании свободного фага из облученной и необлученной культур бактерий через 16-18 часов инкубации при 37°С.

Техника облучения. Источником ММВ являлся генератор Г4-142. Образцы облучались рупорной пирамидальной антенной с сечением выходной апертуры 25x40 мы на растоянии 60 мм от ее края. Средняя величина плотности потока мощно сти (ППМ) оценивалась исходя из измеренных значений интенсивности ЭМИ на выходе волноводного тракта и общей площади экспонированной поверхности в пределах телесного угла, образуемого стенками рупорной антенны. Локальная неоднородность ППМ в пределах облучаемой поверхности (10x10 мм), измеренная с помощью зонда на диоде Шоттке, составила ±20'/.. Значение удельной поглощенной энергии (УПЭ), измерявшееся при помощи акустического метода (Полникоз и Путвинский, 1988) не превышало 4 мВт/г. Облучение проводили как в режиме свипирования в полосах по 200 МГц, так и на отдельных частотах с нестабильностью 15 МГц.

Облучение бактерий в логарифмической фазе роста. Эксперименты выполняли по методике, близкой к описанной ВескЗом, при этом особое внимание уделялось соблюдению требований, которые необходимы для микроволновой индукции профага X в клетках E.coli. (Использование богатой среды, облучение экспоненциально растущих клеток, поддержание ростовых условий во время всего опыта и использование ППМ от 0.1 до 0.5 мВт/с кг). В каждой серии экспериментов бактерии облучались на

одной и той же стадии развитя культуры клеток. Облучение проводили на нитроцелюлозных фильтрах фирмы Millipor с диаметром пор 0.4 мкм. Во время облучения фильтры с осажденными клетками находились в пластиковых чашках Петри на подкладках, смоченных L-средой. Следили, чтобы клетки во время облучения не подсыхали. При облучении контрольный образец, экранированный от воздействия ММВ, находящился в идентичных условиях с опытным. После облучения фильтры с бактериями вместе с подкладками помещали в свежую питательную среду и инкубировали при 37 0С на качалке необходимое для созревания фаговых частиц время.

Модифицированная методика облучения синхронной культуры была использована с целью стабилизации параметров эксперимента и увеличения К^ по сравнению со спонтанным уровнем. Синхронизация клеток со стационарной фазы роста проводилась по способу, описанному ранее (Webb, 1980). Отмытые в физиологическом растворе клетки последовательно выдерживали по 15 мин при 40 °С и 4°С и после 30 минутной инкубации в свежей среде облучалиТО мин в стандартных условиях. При таком временном режиме по имеющимся данным (Webb, 1979) синхронная культура лизогенных бактерий наиболее подвержена действию изучаемого излучения. После облучения и 30 минутной инкубации клетки отделяли от свободного фага центрифугированием или фильтрованием через нитро-целлюлозные фильтры и инкубировали 15 мин в свежей среде для созревания индуцированных ММВ фаговых частиц.

Облучение стационарной культуры бактерий проводили в.стеклянных чашках Петри в тонком слое (ЬЧ мм) минимальной среды М9. Образцы облучались 10 мин при ППМ=0.1 мВт/см 2 (УПЭ=0.6 мВт/г). В каждом эксперименте клетки облучались на одной и той же стадии развитя культуры клеток (начало стационарной фазы, при ODggg^.l). После обработки, бактерии помещали в физраствор на 60-70 мин, после чего переносили в L-среду или среду М9 с ростовыми добавками. Клетки инкубировали при 37°С на качалке для созревания фаговых частиц. Через определенные промежутки времени из растущей культуры отбирали пробы для определения титра фага и концентрации клеток.

Статистическую обработку результатов экспериментов осуществляли

на ПЭВМ с помощью программных пакетов SUPERCALC, STATGRAPHICS и SURFER.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЩЕНИЕ 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МИЛЛИМЕТРОВЫХ ВОЛН НА ЛИЗОГЕННЫЕ КЛЕТКИ Е. COLI ДИКОГО ТИПА.

1.1. Исследование частотной зависимости микроволновой индукции профага в бактериях дикого типа

Для выяснения вопроса, о влиянии миллиметровых волн на индукцию профага X в клетках E.coli К12 дикого типа, была исследована зависимость К j от частоты низкоинтенсивного ЭМИ после облучения штамма N99CX) ММВ в интервале частот от 70.0 до 70.8 ГГц. Эта-область частот выбрана на основании данных Вебба, обнаружившего в этом диапазоне резонансную лизогенную индукцию с максимумом на частоте 70.4 ГГц (Webb, 1979). Изменение индукции было обнаружено в области частот от 70.3 до 70.6 ГГц при облучении клеток N99CX) с ППМ 0.4 мВт/см 2. Частотная зависимость К ^ в каждом отдельном эксперименте имела выраженный максимум, когда выход свободного фага увеличивался под действием миллиметровых волн в довольно узкой полосе, и заметно не отличался от спонтанного уровня на других частотах. Так как экспериментальные условия и диапазон частот совпадали с использованными Веббом, полученные в настоящей работе данные были апроксимированы такими же, как у него колоколоо<5разными кривыми с одним максимумом и полушириной около 50 МГц. График на рис.1 представляет результаты одной из трех-серий опытов. В каждой серии индукция профага X под влиянием микроволн регистрировалась в 4 последовательных экспериментах, выполненных в течение 4-5 недель. В каждом отдельном опыте исследовалась реакция бактерий, облученных на 4-6 частотах из интервала от 70.1 до 70.8 ГГц, причем пробы клеток до облучения на каждой частоте находились в одинаковых условиях.

Одновременно с индукцией профага определялась концентрация клеток в суспензии перед началом титрования фага. Это делалось для того, чтобы контролировать возможное влияние миллиметровых волн на скорость роста использованных клеток, так как темп деления лизоген-ных бактерий, по-видимому, может влиять на индукцию профага. В

результате обнаружили, что титр клеток после инкубации облученных бактерий в свежей среде не коррелировал с величиной К:.

Рис. 1. Зависимость индукции профага X в клетках E.coli от частоты ЗМИ ( штамм - N99CX); log-фаза роста; облучение: 30 мин, 0.4 мВт/см 2, среда-BHIB, 37 °С) Подавляющее большинство авторов, регистрировавших биологические эффекты низкоинтенсивных миллиметровых волн, отмечали резонансный характер взаимодействия данных ЭМИ с живыми системами (Залюбовская, 1970; Девятков, 1973; Grundler et al., 1977; Webb, 1979; Севастьянова и др., 1983). Эти данные побудили исследовать частотные распределения полученных экспериментальных значений К ^ Учитывая значительные погрешности определения К р а также известную нестабильность параметров индукции профага X от опыта к опыту, целесообразно было решить вопрос о том являются ли обнаруженные в данной работе максимальные значения К ^ статистически значимо отличающимися от значений К : на других частотах.

7.0 Г К«

6.0

70.26......7б.'3'6......76.40......70.55

Частота, ГГд

Среднее значение максимального К ^ в каждой экспериментальной серии определялось в процессе статистической обработки. При этом вычислялось среднее значение частоты ЭМИ, соответствующее максимуму и являющееся средним частотного распределения К ^. Было показано, что максимальный К^ на одной из частот в каждой серии опытов статистически значимо Ср<0.05) отличался от К ^ на соседних с ней опытных частотах, как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения частоты. Таким образом установлено, что в каждой серии экспериментов миллиметровые волны частотозависимо индуцируют профаг X в бактериях Е.coli N99CX) в области частот от 70.3 до 70.6 ГГц.

Частотозависимый характер влияния миллиметровых волн на лизо-генную индукцию в Е.coli позволяет предположить, что взаимодействие данной биосистемы с ЭМИ детерминируется какими-то резонаторами на субклеточном уровне, хотя возможно, что резонирующими структурами являются как сами клетки, так и клеточные популяции, в виде которых клетки участвуют в гизненно важных процессах (Шапиро, 1988). Именно на уровне клеточных ассоциаций с характерными размерами порядка миллиметров концепция физики живого рассматривает биоэффекты ММВ, как проявление фундаментальной роли микроволн в существовании живых систем (Ситько, 1989).

Можно предположить, что параметры ММЗ, эффективно взаимодействующих с лизогенными бактериями, могут быть связаны с параметрами, определяющими конформационные изменения при внедрении ДНК профага в ДНК бактерии. Это предположение подтверждается данными об изменении частоты, резонансно влияющей на бактерии Е. coli К12, при внедрении в хромосому клетки-хозяина одного или двух участков ДНК "профага X (Beiyaev et al, 1993).

1.2. Изменение средней частоты частотной зависимости К^ во времени.

Средняя частота частотной зависимости <f> в каждом опыте определялась по формуле:

<f>=-.

EKt

При анализе результатов экспериментов йыло обнаружено что <f> изменяется от серии опытов к серии, и даже внутри каждой серии экспериментов. Так значение <f>, определеное в первой серии экспериментов статистически значимо (р<0.05) отличалась от средней <f> второй серии опытов., a <f> второй серии от <f> третьей (р<0.005). Поэтому была сделана попытка исследовать зависимость <f> от календарного времени проведения эксперимента. При проведении корреляционного анализа совокупности данных всех экспериментов выяснилось, что исследуемая зависимость (рис.2) хорошо описывается (р<0.001) функцией:

<Г>=(70.309+0.015) + (0.00147+0.00017)1, где t - время в днях, начиная со дня первого эксперимента. Таким образом, из полученных данных следует, что значение <f> слабо изменяется во времени. Можно предположить, что частотное распределение К j зависит от неконтролируемых внешних факторов геофизической природы. Подобные особенности биологического действия ЭМИ, по- видимому, могут быть одной из причин широко дискутируемой в литературе (Gandhy, 1986; Leal et al., 1988-1989; Ситько, 1989) невоспроизводимости биоэффектов слабых электромагнитных полей.

Рис. 2. Зависимость <f> микроволновой индукции профага X в клетках E.coli N99(X) от времени проведения эксперимента (2 ксня - 27 октября 1988 г.).

1.3. Исследование индукции профага в условиях воздействия, эффективно влиясщего на конформационное состояние генома Имеется литературные данные о влиянии ММВ на конформационное состояние генома E.coli Kl2 в двух интервалах миллиметровых волн (Belyaev et al.,1992). Так, в области 51.76 ГГц было обнаружено отличие частот резонансного влияния ММВ на бактерии, содержащие и не содержащие профаг X (Belyaey et al.,1993). Лизогенные клетки при этом реагировали резонансно на воздействие ЭМИ с частотой 51.74 ГГц в соответствии с предложенной физической моделью. Эти данные побудили провести исследование индукции профага в условиях воздействия, изменяющего конформационное состояние генома в клетках N99CX).

При исследовании влияния ЭМИ с частотой 51.74 на индукцию профага X на стационарной стадии развития бактериальной культуры было проведено 3 эксперимента, в каждом из которых зарегистрированы статистически значимые отклонения уровня спонтанной индукции профага от контрольного уровня. Динамика лизогенной индукции при инкубации бактерий в течение 2 часов имеет общую тенденцию для всех экспериментов возрастать на первой фазе инкубации Сдо 40 минут) и уменьшаться в дальнейшем (60-90 минут). Обычно клетки инкубировались в богатой L-среде, кроме одного эксперимента, когда использовалась среда М9, обогащенная ростовыми добавками. В этом случае динамика созревания фаговых частиц после микроволнового облучения не отличалась существенно от наблюдаемой в других опытах.

2. ВЛИЯНИЕ ММВ НА ГЕННУЮ ЭКСПРЕССИЮ ПРОФАГА X В КЛЕТКАХ Е.COLI С ЗАБЛОКИРОВАННОЙ СИСТЕМОЙ SOS-РЕПАРАЦИИ 2.1. Влияние микроволн на индукцию профага в гесА мутантном штамме E.coli

Эксперименты по изучению воздействия миллиметровых волн на бак терии №9гес/1Ш проводили с использованием модифицированной методики облучения синхронной культуры клеток. В предварительных экспериментах исследовалось действие миллиметровых волн в 5 полосах по 200 МГц из интервала с 70.05 до 71.05 ГГц, при этом частота ЭМИ свипиро-валось с частотой 1 Гц. В результате серии опытов была выявлена тенденция увеличения индукции профага X в полосе от 70.25 до 70.40 ГГц.

В среднем, К ^ в этой области частот увеличивался в 12 раз. Полученные данные позволили нам выбрать частотный диапазон исследования лизогенной индукции в тесА мутантах. На отдельных частотах влияние ЭМИ изучалось в серии экспериментов, выполненных в достаточно узком промежутке времени С2 недели). В каждой из опытов действие микроволн исследовалось на 3-5 частотах, причем каждый облученный образец сравнивался с соответствующим контрольным, который во время экспериментальной процедуры находился в идентичных условиях, но был экранирован от действия микроволн. Выход свободных фаговых частиц определялся по стандартному методу, а каждая проба при титровании высевалась на 3 чашки Петри с Ь-агаром.

По данным серии, состоящей из трех экспериментов, были зарегистрированы уровни индукции профага X, на 2-3 порядка превышающие уровень спонтанной индукции в области частот от 70.2 до 70.6 ГГц

о

Срис.З). Максимальное значение 1Ц составило 1.2-10 при <0=70.39 ГГц и значение статистически значимо (р<0.002) отличалось от К- на других частотах, использованных в эксперименте.

10 *г Kl

10 ' 10 ' 10

10

70.С

Частота, ГГц

Рис. 3. Зависимость индукции профага X в клетках E.coli от частоты ЭМИ С штамм - Ю9гесЛ(Х); log-фаза роста; облучение: 30 мин, 0.4 мВт/см L-среда, 37 °С ).

Известно, что в использованном в настоящей работе гесА мутанте уровень спонтанной индукции профага существенно (по крайней мере на 2 порядка) ниже чем в диком лизогенном штамме. Этим объясняется разница в Kj, полученых в резонансных условиях для г ее А мутантов и штаммов E.coli К12 дикого типа. По проведенным в настоящей работе оценкам, доля клеток, в которых ЭМИ индуцировало переключение генной активности профага в гесЛ-мутантах с лизогенного на литический путь развития, не изменилась по сравнению с нормальными клетками и составила около 0. 01'/. популяции облученных бактерий.

2.2.Оценка участия SOS-системы бактерий в лизогенной

индукции под влиянием миллимеровых волн

Обнаруженный эффект резонансного увеличения индукции профага в клетках Е.со1Ш2 с мутацией в гене гесА имеет существенное значение для понимания роли миллиметровых волн в регуляции генной экспрессии. Дело в том, что продукт бактериального гена тесА многофункциональный белок RecA выполняет исключительно важную роль в процессе переключения генов профага с лизогенного на литический путь развития после действия на систему ДНК-поврездасщих физических или химических факторов окружающей среды (SOS-ответ бактерии)(Walker, 1984). Этот белок при появлении в клетке поврежденной ДНК (ее однонитезых участков) активируется, приобретая протеолитическув активность (Roberts et al, 1977), и разрезает белки репрессоров SOS-генов E.coli и похожий на них Х-репрессор, продукт гена cl После инактивации большей части молекул CI-репрессора (около 9050 (Bailone et al, 1979) освобождается занимаемый ими в динамическом равновесии операторный участок 0 g регуляторной области фаговой ДНК. Клеточный белок РНК-полкмераза при этом получает доступ к промотору Р р, с которого начинает транскрипцию молчавших ранее генов профага X, что приводит к его индукции и последующему лизису клетки-хозяиНа (Ptashne, 1986). Таким образом, белок RecA играет ключевую роль в работе SOS-системы, запускающей индукцию профага X при генотоксичных воздействиях.

В использованном нами бактериальном мутанте этот механизм заблокирован, так как белок RecA. в нем дефектный. В данной работе установлено, что при действии ультрафиолета на штамм N99rec/lCX.) в

дозах, которые вызывают в диком штамме индукцию профага, в 20-40 раз превышающую спонтанный уровень, не регистрировалось увеличение выхода фаговых частиц по сравнению с необученным контролем. Следовательно, если бы микроволновая индукция профага шла по тому же механизму, что и под действием ДНК-тропных агентов, ее не удалось бы обнаружить в использованных мутантах. Таким образом, в настоящей работе показано, что принципиальной особенностью специфического действия миллиметровых волн на экспрессию генов профага является то, что ключевая функция индуцибельной системы SOS-репарации бактерий, осуществляемая взаимодействием Rec/i белка с CI-репрессором не реализуется в резонансной микроволновой индукции профага X в клетках Lcoli К12.

При исследовании индукции профага X под влиянием низких концентраций бромистого этидия (EtBr) в гесА мутантных лизогенах в данной работе обнаружено, что концентрации EtBr в области 30-50 мкг/мл статистически значимо могут увеличивать и уменьшать спонтанный уровень выхода свободного фага. Известно, что механизм биологического действия EtBr связан с внедрением данного интерколятора в двойнуа спираль молекулы ДНК, изменяющим ее конформацию. Следовательно, полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности механизма переключения генов профага при изменении конформации макроыолекулярных комплексов. Таким образом, можно предположить , что изменение конформации участка ДНК, участвующего в образовании комплекса с X репрес-сором может приводить к изменению уровня спонтанной индукции профага X. Имеются также литературные данные CSusskind and Botstain, 1975) о возможности изменения индукции профага в гесА мутантах под влиянием антирепрессора - белка вырабатываемого фагом Р22, который обратимо воздействует на конформацию комплекса ДНК - CI-репрессор. Эти данные указывают на возможность переключения генов фага X при конформацион-ных изменениях вышеназванного комплекса.

Так как тригерное переключение генов профага с лизогенного на литическое развитие может произойти только через изменение функционирования комплекса ДНК - Х-репрессор, полученные в настоящей работе результаты означают, что миллиметровые волны действуют на комплекс

ДНК - CI-репрессор таким образом, что в части клеток изменения в конформации комплекса или динамике взаимодействия его компонентов приводят к снятии репрессии. Эффективность индукции профага будет определяться резонансным влиянием ЭМИ либо на конформации проыотор-ного участка, что изменит динамику посадки репрессора, либо на конформации всего комплекса ДНК с белком репрессора. В любом случае генная активность будет переключена в условиях эффективного взаимодействия с ЭМИ только в тех клетках, которые содержат критическое количество молекул репрессора, минимально необходимое для поддержания состояния лизогении (около 10'/. от среднего). В таких клетках к переходу профага на литический путь может привести изменение времени жизни динамического комплекса ДНК с репрессорными дилерами. Полученные следствия предлагаемого механизма нашли подтверждение в проведенных экспериментах, поскольку по сделанным в настоящей работе оценкам во всех исследованных штаммах лизогенкая индукция происходила в небольшой (около 0.01Я) доле клеток, сравнимой с частью бактерий, содержащих критическое количество репрессора.

3. НЕТЕПЛОВОЙ ХАРАКТЕР ДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНЫХ МИКРОВОЛН НА ИНДУКЦИЮ ПРОФАГА X В КЛЕТКАХ E.C0L1 3.1. Изучение.ыоиностной зависимости индукции профага В связи с описанной выше нестабильностью <f>, для получения экспериментальных данных при воспроизводящемся эффекте, облучение клеток №9(Х) проводили в полосе наиболее активно действующих частот от 70.3 до 70.6 ГГц. В каждом из 5 опытов исследовалось действие микроволн с 4-5 различными ППМ, которые варьировали в пределах от 0.05 до 0.5 мВт/см^. Все данные, полученные в пяти экспериментах обрабатывали совместно. На рис.4 представлен график кривой, полученной при регресссионном анализе, где показано (р<0.05), что экспериментальная зависимость К i от ППМ аппроксимируется функцией:

К, = 3.30549[Р)0Л'" .

1 ?

где Р - ППМ миллиметровых ЭМИ в мВт/см . Полученные результаты подтверждают литературные данные по профагу X (V/ebb, 1979) и не противоречат выводам других авторов (Смолянская и Вилекская, 1973; Севастьянова, 1981; Belyaev et al, 1992) о существовании довольно широкой

области мощностей низкоинтенсивных миллиметровых волн, где величины биоэффектов не изменяется существенно при возрастании ППМ.

Рис.4. Зависимость индукции профага X в клетках E.coli от ППМ ЭМИ (штамм - N99CX); log-фаза роста; облучение: 30 мин . свшшрование 70.3-70.5 ГГц, Гсв=1Гц, L-среда, 37 °С). 3.2. Исследование влияния температуры на индукцию профага Несмотря на то, что энергия кванта излучения с используемыми в работе параметрами довольно мала по сравнение с кТ, определяющей тепловые процессы, происходящие в бактериальной клетке, а разогрев образцов во вреая облучения был несущественным (<1°С) и теоретически не мог повлиять на переключение экспрессии генов профага, было исследовано влияние повышения температуры на индукцию профага в исследуемых штаммах бактерий. Экспериментальные культуры N99CX) и N99rec/1(\) подвергались 30 минутной инкубации в водяной бане как в жидкой L-среде, так и на нитроцеллюлозных фильтрах в тех же условиях, что и в опытах по их облучению. Контрольные клетки инкубировались в идентичных условиях но при температуре 37 0 С. Температурная зависимость исследовалась с шагом 0.5-1 °С в области температур от 37 до 42 °С. Полученные данные обрабатывались статистически, при этом не было обнаружено значимых отклонений К ^ от единицы при влиянии какой-либо температуры, как для клеток дикого типа (рис.5), так

и для гесА мутантов (рис.6). Также не удалось аппроксимировать экспериментальные данные монотонно изменяющейся зависимостью при значимом коэффициенте корелляции. Таким образом, полученные результаты можно интерпретировать как доказательство нетеплового характера изучаемых эффектов.

2.0 с К1

1.5

1.0

0.5

т 1 I т . -

37'.Ь' " " 'iä'.'ö' " " Ъб'.У : " ' 4Ö'.b' ' ■ ■ "4 l'.b" " " 4¿'.О " ' ' 4й'.Ь' ' " ' 44 .Ь" Температура, С

Рис. 5. Зависимость индукции профага X в клетках E.coli от температуры ( штамм - N99(X); инкубация: 30 мин, L-среда).

2.0 с

1.5

К,

1.0

0.5

I

L37'.'d "" Зй'.Ь"" " ' äiV.b' " " 4Ö'.'Ö " ' ' 4 i'.0 ' " ' 4i'.ü0''' " " 44.0 ' 45.0 Температура, С

Рис. 6. Зависимость индукции профага X в клетках E.coli от температуры ("штамм N99rec/l(X); инкубация: 30 мин, L-среда).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Низкоинтенсивные миллиметровые волны в интервале 70.3-70.6 ГГц. цкдуцируют экспрессию генов профага X в клетках E.coli К12 N99CX), что приводит к заметному (->-5 раз) увеличению выхода свободного фага.

2. Миллиметровые электромагнитные волны в области 70.4 ГГц с ППМ * 0.4 мВт/см2 резонансно С* 10^ раз) увеличивают индукцию профага X в бактериях E.coli N99rесЛСХ) с блокированной системой SOS-репарации, в то хе время индукция профага X не увеличивается в исследованном мутанте N99rec/l(X) под влиянием дозы ультрафиолета, приводящей к индукции профага в диком штамме, в 20-40 раз превышающей спонтанную.

3. Индуцибельная SOS-система E.coli не принимает участия в механизме резонансной микроволновой индукции профага X, из чего следует принципиальное различие механизмов действия миллиметровых волн и ДНК-поврехдающих факторов на процессы генной экспрессии.

4. Зарегистрировано динамическое изменение уровня индукции профага X в клетках N99CX) после облучения их в стационарной фазе на частоте 51.74 ГГц в условиях, обеспечивающих эффективное влияние на конформационное состояние генома.

5. В бактериальном штамме N99reCi4(X) индукция профага X меняется в несколько 3 раз) под действием низких концентраций бромистого этидия, что свидетельствует о возможности влияния конформационных изменений ДНК на переключения генов профага. Полученные результаты подтверждают гипотезу о влиянии ММВ на динамический комплекс ДНК-Х-репрессор путем изменения его конформации.

6. Показано, что индукция профага X в E.coli под влиянием низко интенсивных микроволн носит нетепловой • характер, так как эффект слабо зависит от мощности излучения в интервале ППМ от 0.1 до 0.5 мВт/см2, и индукция профага не изменяется при повышении температуры на 5°С, что существенно превышает разогрев облучаемых бактерий.

7. Оценки показывают, что переключение генов проофага X происходит примерно в 0.01 У. облученных миллиметровыми волнами бактерий, - что позволяет объяснить результаты по микроволновой индукции профага X в клетках E.coli воздействием ЭМИ на взаимодействие ДНК - CI-белок в клетках, содержащих критическое количество молекул репрессора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алипов Е. Д. .Беляев И. Я., Лукашевский К. В., Лысцов В. Н. и Щеглов B.C. Влияние электромагнитного излучения крайне высокой частоты на геном E.coli в норме и при рентгеновском облучении.-VII Всесоюзное совещание по микродозиметрии, Канев, 14-15 апреля 1989 г., с. 177.

2. Алипов Е. Д., Беляев И. Я., Еднерал Д. И., Измайлов Д. М., Лукашевский К.В., Обухова Л.К., Окладнова О.В. и Щеглов B.C., Специфическое действие электромагнитного излучения крайне высокой частоты на геном и некоторые генетические процессы в норме и при радиационном поражении. - Труды рабочего совещания по генетическому действию корпускулярных излучений. Дубна, ОИЯИ, 1989, с. 150-160.

3. Лукашевский К. В. и Беляев И. Я., Особенности переключения генов профага X в клетках Escherichia coli под влиянием миллиметровых волн. - Фундаментальные и прикладные аспекты использования миллиметровых излучений в медицине. Тезисы докл., Киев, 1989, с. 81.

4. Беляев И. Я., Лукашевский К. В. и Еднерал Д. И. Два аспекта генетического действия ЭМИ КВЧ. Там же, с. 48.

5. Алипов Е. Д., Беляев И. Я., Еднерал Д. И., Измайлов Д. Н., Лукашевский К. В., Лысцов В. Н., Обухова Л. К., Окладнова О.В. и Щеглов B.C. Модификация радиационного, поражения электромагнитны?,! излучением крайне высокой частоты.- I Всесоюзный радиобиологический съезд. Тезисы докл., Москва, 21-27 августа 1989 г., с. 683-884.

6. Лукашевский К. В. Активация генной экспрессии при воздействии ЭМИ КВЧ на примере индукции профага X в клетках E.coli.-Механизмы действия магнитных и электромагнитных полей на биосистемы различных уровней организации. Тезисы докл., Ростов-на-Дону, 1989, с. 259-261.

7. Беляев И. Я. и Лукашевский К. В. Системный отклик биологических

объектов: два аспекта генетического действия ЭМИ КВЧ. - Первый болгаро-советский симпозиум по магнитобиологии и магнитотерапии София, 29 сентября-2 октября 1989 г., с. 14.

£. Алипов Е. Д., Беляев И. Я., Еднерал Д. И., Измайлов Д. М., Лукашевский К. В., Лысцов В Н., Обухова Л. К., Окладнова 0. В. и Щеглов В. С. Генетическое действие электромагнитного излучения крайне высокой частоты в норме и при комбинации с ионизирующими излучениями. - Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов. Сыктывкар, 1989 г., с. 35-37.

9. Lukashevsky К. V. and Belyaev I.Ya. Possible Role of DNAprotein Interactions in Millimeter EMR Action on the Gene Expression.- X International Biophysics Congress, Vancouver, Canada, 3-7 July 1990, p. 550.

10. Belyaev I.Ya., Alipov Ye.D., Shcheglov V.S., Lukashevsky K.V., LystsoY V. N.. The role of genome and its different states in the formation of systemic response of cells to the millimeter waves resonance effect. - Ibid, p. 549.

11. Lukashevsky K.V., Belyaev I.Ya. Induction of Lambda Prophage in the Cells of E. coli by the Millimeter waves.-CUgarov B.N.--ed.), Otklik, Vidguk , Kiev, 1990, pp. 147-157.

12. Belyaev I.Ya., Lukashevsky K.V. Two Aspects of Genetic Effect of the EHF Electromagnetic Irradiation. -Ibid., pp. 125-135.

13. Lukashevsky K.V.and Belyaev I.Ya. Resonance Regulation of Gene Expression in Lysogenic Cells of Escherichia Coli of Wild Type and in Mutants with Blocked System of SOS-reparation under the Effect of Low-intensity Millimeter Waves. - 8th Balcan Biochemical and Biophysical Days, Cluj-Napoca, Romania, 10-14 Sept., 1990, pp. 238-239.

14. Belyaev I.Ya., Alipov Ye.D., Lukashevsky K.V., Shcheglov V.S., Yedneral D. I., and Lystsov V. N.. The role of genome and its different states in the formation of systemic response of cells to the millimeter waves resonant effect.-Ibid, pp. 223 -224.

15. Lukashevsky K.V.and Belyaev I.Ya. Possible Role of DNA-Protein Iteraciion in Millimeter Waves Action of the Gene Expression.-Bioelectromagnetic Simposium (BEMS), XXIII General Assembly of the International Union of Radio Science CURSI), Prague, Czechoslovakia, 28 Aug.-5 Sept., 1990, p. 20.

16. Lukashevsky K.V.and Belyaev I.Ya. Switching of Prophage Lambda Genes in Esherichia coli by Millimeter Waves.- Medical Science Research, 1990, 18, pp. 955-957.

17. Lukashevsky K.V. and Belyaev I.Ya. Investigation of gene activation mechanism under the low-intensity millimeter waves action,- The First Arab Conference on Medical Biophysics Cairo Univ., 15-17 Jan., 1991, p. 25.

18. Belyaev I.Ya., Alipov Ye.D., Shcheglov V.S., Lukashevsky K.V., and Lystsov V. N.. The formation of systemic responce in the E.coli cells through discrete transition between conformational genome states under low-intensive influence of millimeter waves. - Ibid, p. 21.

19. Lukashevsky K.V. and Belyaev I.Ya. Investigation of gene

t

activation mechanism under the low-intensity millimeter waves action. - The ^ International Biophysics Congress and Biotechnology at GAP, Dicle University, 13-15 May 1991, Diyarbakir, Turkey, p. 32.

20. Belyaev I.Ya., Alipov Ye.D., Shcheglov V.S., Lukashevsky K.V., and Lystsov V.N.. The formation of systemic response in the E.coli cells trough discret transition between conformational genome states affected by low-intensity millimeter waves.-Ibid, p. 35.

21. Lukashevsky K.V.and Belyaev I.Ya. Millimeter Waves not only Induce but Reduce Spontaneous Induction of Prophage X in E.coli. In: Transactions of the first congress of The European Bioelectromagnetic Association, Brussels, Belgium, 23-25 January, 1992, p. 43.