Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического контроля RecA-независимой индукции профага λ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Розанов, Дмитрий Вячеславович, Москва

#

* ' /

ч

'Л

Л/ /

•7 -у ^ - |

I- /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙНАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

РОЗАНОВ Дмитрий Вячеславович

н

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЯЕСА-НЕЗАВИСИМОЙ

ИНДУКЦИИ ПРОФАГА X

03. 00. 15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: кандидат биологических наук

Синеокий С. П.

тосква-

1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................ 4

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Адаптация клеток Escherichia coli

к воздействиям окружающей среды".................................................................................. 8

1. Введение............................................................................................................................. 8

2. Схемы сигнальной трансдукции в бактериях................................................................. 10

2.1. Внутриклеточная передача сигналов через коммуникативные

модули........................................................................................................................ 10

2.2. Фосфорилирующие активности сенсоров и эффекторов...................................... 12

2. 3. Сигнальные свойства сенсоров и эффекторов....................................................... 16

2. 4. Осморегуляция.......................................................................................................... 19

2. 5. Ассимиляция азота................................................................................................... 22

2. 6. Хемотаксис................................................................................................................ 26

3. Регуляция синтеза капсульного полисахарида в. клетках

Escherichia coli К12........................................................................................................... 32

3.1. Введение.................................................................................................................... 32

3. 2. Регуляция: обзор....................................................................................................... 33

3.3. RcsB и RcsC составляют двухкомпонентную регуляторную

систему....................................................................................................................... 34

3. 4. Lon расщепляет RcsA............................................................................................... 37

3.5. RcsA взаимодействует с RcsB для стимуляции транскрипции

генов cps.................................................................................................................... 38

3.6. Модель синтеза клеточной капсулы....................................................................... 39

4. SOS ответ клеток Escherichia coli..................................................................................... 41

4. 1. Введение.................................................................................................................... 41

4. 2. SOS система................................................................................................................ 41

4. 3. Развитие модели регуляции SOS системы............................................................. 44

4. 4. Тонкая настройка SOS системы.............................................................................. 46

5. Выживание клеток при голодании и стрессах в стационарной фазе

развития.............................................................................................................................. 47

5.1. Введение.................................................................................................................... 47

5. 2. Ген rpoS кодирует регулятор стационарной фазы, имеющий

сходство с вегетативными а факторами................................................................. 49

5. 3. RpoS-зависимые гены и их клеточные функции................................................... 50

5. 4. Как RpoS контролирует генную экспрессию......................................................... 54

5. 5. Перспективы.............................................................................................................. 55

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................. 57

1. Среды и химические вещества......................................................................................... 57

2. Бактериальные штаммы и бактериофаги........................................................................ 58

3. Плазмиды........................................................................................................................... 63

4. Перенос мутации из плазмиды в хромосому.................................................................. 70

5. Спот-тест и количественное определение эффективности индукции

профагаА............................................................................................................................. 70

6. Определение эффективности адсорбции фага к............................................................ 72

III. РЕЗУЛЬТАТЫ.................................................................................................................. 73

1. Выделение неиндуцибельных (1псГ) мутантов, генетическое

картирование мутаций и комплементационный анализ................................................ 73

2. Клонирование генов Escherichia coli, чья сверхэкспрессия приводит к

11есА-независимой индукции профага X......................................................................... 74

2. 1. Избыток ЯсэА и БбгА в клетке приводит к ЯесА-независимой

индукции профага X................................................................................................. 77

2. 2. Эффект сверхпродукции ЯсэА и ЭбгА на индукцию других

лямбдоидных профагов............................................................................................ 79

2. 3. Количественное определение эффективности ЯесА-независимой

индукции профага X................................................................................................. 80

2. 4. Роль генов г а-А, гс$В и (кгА в ЯесА-независимой индукции

профага X................................................................................................................... 90

2. 5. Эффект сверхпродукции репрессора фага X на индукцию

лямбдоидных профагов посредством системы ЯсзАВС...................................... 93

2. 6. Механизм индукции профага X посредством ЯсбА и БбгА РНК......................... 94

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................................100

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................106

ЛИТЕРАТУРА.......................................................................................................................109

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Взаимоотношения фага X и клеток Escherichia coli являются наиболее детально изученным примером взаимодействия вируса с клеткой-хозяином. Достигнутые в этой области успехи связаны с тем, что и фаг X, и клетки Е. coli являются одними из наиболее подробно исследованных с генетической точки зрения организмов. Умеренные бактериофаги способны развиваться двумя способами, а именно: лизировать чувствительные клетки или идти по лизогенному пути развития, при котором фаговый геном поддерживается в клетке в неактивном состоянии посредством репрессии его генов одним или несколькими репрессорами (Lamont et al., 1989; Roberts and Devoret, 1983).

Открытие, что облучение УФ светом лизогенных клеток приводит к индукции некоторых профагов (Lwoff, 1953; Lwoff et al., 1950), было крупным научным достижением, положившем начало изучению механизма индукции профага. С этого времени усилиями многих исследователей был установлен механизм индукции профага посредством УФ света и других воздействий на клетку, вызывающих повреждения в ДНК или задерживающих репликацию, и, как следствие этого, приводящих к появлению одноцепочечной ДНК (Gimble and Sauer, 1986; Little, 1991; Roberts and Devoret, 1983; Walker, 1984, 1996). При этих условиях индуцируется SOS ответ. Белок RecA, активированный одноцепочечной ДНК, способствует автопротеолитическому расщеплению некоторых фаговых репрессоров, также как и расщеплению клеточного репрессора SOS генов, белка LexA. SOS система и SOS-индуцибельные умеренные фаги описаны для многих бактерий (Roberts and Devoret, 1983; Walker, 1996). Во всех этих случаях SOS система является основной системой спонтанной индукции

профагов, которая, по крайней мере в лабораторных условиях, сильно снижается в клетках, несущих мутацию в гене recA (Lamont et al., 1989; Roberts and Devoret, 1983).

Предполагается, что индукция профага, опосредованная SOS системой, служит цели спасения фага, когда клетке грозит гибель при возникновении повреждений в ДНК. В настоящее время известны воздействия окружающей среды, такие как осмотический шок, изменение кислотности среды и т. д., которые не действуют на ДНК, но являются также губительными для клетки. Можно допустить, что такие стрессы способны вызывать индукцию профагов посредством клеточных систем, отличных от SOS системы. Это косвенно подтверждается фактом наличия умеренных бактериофагов, которые не являются SOS-индуцибельными, а в их лизогенных клетках отмечена спонтанная индукция. Хорошо известными примерами таких фагов Е. coli являются Mu и Р2.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в поиске генов Е. coli, чьи продукты участвуют в предполагаемой RecA-незавиеимой индукции профага X. Работа строилась исходя из двух допущений, Во-первых, снижение эффективности индукции профага A,cI857ts, репрессор которого является резистентным к действию RecA, могло бы отражать дефект в клеточном гене, чей продукт необходим для RecA-незавиеимой индукции профага. Во-вторых, трансформация клеток плазмидой, которая содержит ген предполагаемого индуктора, могла бы имитировать условия окружающей среды, необходимые для активации синтеза этого индуктора, и приводить к RecA-незавиеимой индукции профага. В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи исследования:

-выделение мутантов Е. coli К-12, в которых снижена индукция профага XcI857ts; -генетическое картирование мутаций и комплементационный анализ;

-получение банка генов in vivo, трансформация им клеток индикаторного штамма и отбор

клонов с фенотипом Ind+; -рестрикционный анализ клонированных генов, идентификация их продуктов и секвенирование;

-получение банка генов in vivo, трансформация им клеток индикаторного штамма и

отбор клонов с фенотипом Ind+; -рестрикционный анализ клонированных генов, идентификация их продуктов и секвенирование;

-инактивация клонированных генов in vitro, перенос полученных мутаций в хромосому

и комплементационный анализ; -проверка влияния RecA-незавиеимой системы Е. coli, вызывающей индукцию профага

X, на стабильность других лямбдоидных профагов; -проверка влияния увеличенной дозы гена репрессора фага X на

эффективность RecA-незавиеимой индукции; -тестирование на индуцибельность профагов kind при действии RecA-незавиеимой системы.

Новизна результатов. Впервые предложен прямой метод отбора клонированных бактериальных генов, чья сверхэкспрессия влияет на стабильность профага X. В работе впервые выявлена адаптационная система клеток Е. coli, отличная от SOS системы, которая отвечает за RecA-независимую индукцию лямбдоидных профагов. Показано, что гены, вовлеченные в RecA-незавиеимую индукцию профагов, являются ранее идентифицированными генами г es А и dsrA, чьи продукты участвуют в позитивной регуляции синтеза капсульного полисахарида клетки, колановой кислоты (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991; Gottesman et al., 1985; Sledgjeski and Gottesman, 1995; Stout et al., 1991). Комплементационный анализ показал, что: 1. RcsA вызывает индукцию профага в экспоненциальной фазе клеточного роста и его действие зависит от наличия в клетке интактной аллели гена г es В. Ген rcsB также кодирует позитивный регулятор синтеза клеточной капсулы. По-видимому, механизмы активации синтеза

капсульного полисахарида и индукции профага X имеют общие регуляторные стадии; 2. DsrA вызывает RecA-незавиеимую индукцию профага X по двум различным путям. В экспоненциально растущих клетках индукция профага зависит от RcsA и RcsB и происходит, по-видимому, через опосредованную DsrA активацию транскрипции res А. При входе клеток в стационарную фазу развития индукция профага посредством DsrA идет независимо от наличия мутаций в генах rcsA и rcsB. На основании данных об эффективности RecA-независимой индукции профага X при увеличенной дозе гена репрессора фага в клетке был сделан вывод, что индукция посредством системы RcsABC идет или через инактивацию репрессора, или через снижение его синтеза. Исходя из анализа эффективности RecA-незавиеимой индукции профагов Xind было предположено, что индукция посредством RcsA в экспоненциальной фазе клеточного роста идет через инактивацию репрессора, возможно, альтернативной RecA протеазой, в то время как индукция посредством DsrA при входе клеток в стационарную фазу развития происходит, по-видимому, на транскрипционном уровне.

Научно-практическая значимость работы и практическое использование результатов. Результаты изучения генетического контроля индукции профагов в клетках Е. coli позволяют выявлять новые регуляторные гены, а также новые функции продуктов известных регуляторных генов клетки-хозяина. Разработанный подход может быть применен к широкому классу бактерий, для которых известны умеренные фаги.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых ГНИИгенетики (1997).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 228 наименований. Диссертация содержит 9 рисунков и 8 таблиц.

s

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Адаптация клеток Escherichia coli к воздействиям окружающей среды 1. Введение

Жизнь бактерий, как и всего микробного мира, во многом зависит от окружающей среды. Различные природные вещества непрерывно воздействуют на микроорганизм: вид питательного вещества непредсказуем и его концентрация часто бывает недостаточной для роста, возможные конкуренты за их использование могут быть в любом месте нахождения клетки. При возникновении угрозы жизни клетки ее выживание зависит от способности приспосабливаться к природным условиям и быстрой реакции на их изменения. При наличии таких селективных факторов не удивительно, что бактерии в процессе эволюции приобрели различные сигнальные системы, реагирующие на состояние окружающей среды (Bourret et al., 1991; Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992; Ronson et al., 1987; Stock et al., 19896, 1990, 1991). Одной из впечатляющих способностей бактериальных клеток является их движение или миграция в направлении более предпочтительного окружения. Способная к движению клетка проявляет локомоторные ответы при появлении различных стимулов, которые представляют собой: воздействия химических веществ, свет, осмотическое давление, температуру и электрическое или магнитное поле. Таким образом, бактерии могут активно искать оптимальные для жизни условия.

В добавление к миграции бактериальные клетки проявляют множество регуляторных ответов, позволяющим им адаптироваться в данном природном окружении. Появление в окружающей среде новых питательных веществ и

метаболитов, например, включает клеточный аппарат, необходимый для их транспорта и утилизации. Стрессовые условия различного сорта, такие как: голодание, действия антибиотиков, тяжелых металлов, ДНК-повреждающих веществ и т. д., вызывают изменения в генной экспрессии, приводящие, в свою очередь, к индукции различных ответов клетки, необходимых для ее выживания.

Генетические эксперименты последних лет показали, что многие бактериальные ответы, названные адаптивными ответами, контролируются, по крайней мере частично, двухкомпонентными регуляторными системами или сенсорными системами (Bourret et al., 1991; Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992; Ronson et al., 1987). Один компонент такой системы, сенсор, передает принятый из окружающей среды сигнал второму компоненту, эффектору, который обычно непосредственно влияет на генную экспрессию.

Клеточный аппарат, контролирующий проявление адаптивных ответов, выполняет задачи, которые являются фундаментальными для всех сенсорных систем: детекция стимулов окружающей среды, сигнальный процессинг (амплификация и интеграция входящего сигнала) и активация соответствующего регуляторного ответа. Сенсорные системы прокариот являются не только удобными для обработки моделями при исследовании молекулярной основы явлений, происходящих при активации адаптивного ответа клетки, но также помогают в понимании общей внутренней структуры клеточных сигнальных механизмов. Данный обзор коснется трех хорошо изученных сенсорных систем клеток Escherichia coli и Salmonella typhimurium, иллюстрирующих свойства и молекулярные механизмы действия бактериальных сигнальных белков. Все три системы, контроль соотношения поринов во внешней мембране, регуляция экспрессии гена глутамин синтетазы и хемотаксис, используют коммуникативные модули, что является всеобъемлющей сигнальной стратегией в

прокариотах. Подобно эукариотам бактерии в своих сенсорных системах используют обратимое фосфорилирование, характерное при регуляции всех известных адаптивных ответов.

После рассмотрения модели двухкомпонентных систем в обзоре будет представлен механизм контроля синтеза капсульного полисахарида в клетках Е. coli, который, по крайней мере частично, опирается на данную модель регуляции генной экспрессии, а также SOS система, работающая при повреждениях в ДНК, и ответы клетки на губительные воздействия в стационарной фазе развития. Механизмы регуляции SOS ответа и клеточных ответов в стационарной фазе не включают двухкомпонентную систему, типа сенсор-эффектор.

2. Схемы сигнальной трансдукции в бактериях

2.1. Внутриклеточная передача сигналов через коммуникативные модули

Адаптивные ответы в бактериях варьируют от быстрого и кратковременного изменения в уровне транскрипции отдельных генов до глобальных реорганизаций в генной экспрессии и клеточной морфологии. Сигналы из окружающей среды влияют на активности регуляторных белков и вызывают специфичный для данного сигнала тип ответа. Многие из бактериальных сигнальных белков содержат два характерных мотива первичной структуры, служащих для приема и передачи сигнала (Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992). Эти мотивы первичной структуры, называемые коммуникативными модулями, спосо