Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное клонирование гена recA Propionibacterium shermanii, изучение его структуры и экспрессии в клетках E. coli

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное клонирование гена recA Propionibacterium shermanii, изучение его структуры и экспрессии в клетках E. coli"

внии

ГЕНЕТИКИ ^ £ЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правы рукописи УДК 575:579.872.1:579.842,11

ПАНКОВА Светлана Викторопна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА iecA PROPIONIBACTERIUM SHERMANII, ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ Е. COLI

03.00.15 - ГЕНЕТИКА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1993

Работа выполнена в секторе эколсго-генетических исследований ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Россия, Москва). j

I

!

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: г

Î

кандидат биологических наук \ С.К.Абилев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: | доктор биологических наук,профессор ; C.B. Каменева кандидат биологических наук С. П. Синеокий

Ведущая организация -Институт микробиологии и эпидемиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

, Автореферат разослан 1994 г.

Защита диссертации состоится ¿/¿¿^fe*^ 1994 г. в ^ — : часов во ВНИИГенетика по адресу: Москва, ул. 1-й Дорожный пр-д, д. 1 ;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИГенетика

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

/

В. И. Щербакова

, Введание""■'' ; Ц&й^шушьяосхъ ¡троблоиц.

; "-'SfetflrtteaoK, продукт гена госА, играет важную роль в метаболизме бактерий. Основной особенностью этого .бежа является его полифункциональность. Благодаря наличию нескольких активностей он непосредственно . или косвенно принимает участие в ряде важных процессов метаболизма, главным из которых является гомологичная рекомбинация, ai помимо нее репарации, мутагенезе, репликации хромосомы, индукции ряда профагов, а также в клеточном делении и проницаемости мембран (Ланцов, 1885; Льюин, 1987). Для Е. coli известно, что продукт гена гесА, а вернее его копротеазная активность позволяет ему быть регулятором тонко настроенной и хорошо скоординированной SOS-системы (Little et. al, 1982). .Неблагоприятные условия,связанные с воздействием химических мутаге-генов,радиации, УФ-света приводят к повреждениям ДНК и остановке репликации. Возникающие- нарушения переводят клетку в состояние стресса и индуцирует реакцию SOS-ответа, направленного в свою очередь на преодсх'онкз последствий этгпс воздействий. Ключевая роль роль в данном случае принадлежит RscA-белку.

Имеются данные, дэнонстрир^дяе наличие аналогов гесА Е.coli (гесА-Ес) у различных видов баоторт'-й и схояесть их структурно-функциональной организации. Исследрванные госА-аналоги комплемен-тирувт функцию гесА-Ес по выживаемости клеток, при воздействии на них таких мутагенных фа)лоров, <*как 4-нитрохинолин-1-ок-сид(4-НХО), штилметансульфонат(ШЗ), митомицин С, налидиксовая кислота (Keener et al., 1984; Kokjohn ot al., 1988; Lao et al., 1659), a TSKJ3 способность индукции некоторых профегоз (Гомельский и др., 1290). В некоторых работах отмечено сходство в в оргаштэпдаи ЭОЗ-сиотог^ы у различных типов бактерий (Love ot al., 1885). .

йэ вшызаьг.сомнения тот факт,*йо для нормального функционирования и развития гевокз, существует необходимость генетической рекомбинации. А ключевая роль в ней тагсяэ принадлежит RecA-белку. Кроме этого интерес к продукту гена гесА обусловлен еда и инте-

/ " "г- 2 - . .;--■: " ■ ресом к организации SOS-системы,поскольку в ее рамках вройсходнз осуществление достаточно быстрых перестроек, ' ведущее К эаадзада бактерий (Echols, 1981; Froudl et al., 1987).

Наиболее изучены гесА-гены грамотрицательных СэкяериЯ.деанщ • о гесд-генах грсшдолсг'.тельн1-1* .бактерий значительна мзшжз. В этой связи актуальными являются исследования гес А-аналогов грам-положительных бактерий и сравнение их структуры ц фушсй с гесА-генами грамотрицательных .

В представленной работе изучали госЛ'Подобньй геи изоасааозо-кислых бактерий Propionibacterium shermanM ,предс?аанг©ла сбви-рного рода грамполояительных бактерий. Пропионозуо- испо-

льзуются в сыроделии,в сельском хозяйстве в кадзсгеэ коздтсяэвта. силосной закваски, консерванта при хранении коубищрййв, ачтаоккс-лительного и витаминного препарата. Prop i on ibaafc 1 im -sherasnii являются промышленными продуцентами витамина В12 иэдицинского назначения. Обширная область применения пропионодьсг бактерий поз-поляет сделать их объектом пристального внишнкя о еозщий биотехнологии и генетики.

Генетика Propionibacterium Shermanii не исследована,est хорошо налаженной системы генетического обмена,хотя шэюса сведения-. • об электропорации клеток пропионовых бактерий, на зф^-тавкость"* этой процедуры невелика (Luchansky et al. ,1988). Щю-тошсаатн этих бактерий имеют чрезвычайно длительный период рогоебрации , что -также не позволяет проводить эксперименты по ис.следа&эаию генетики этих бактерий (Рапоп,1988). . - ;

Таким образом, в научном плане исследование струкгуркой организации и Функционирования различных генов 'пропионозых бактерий-представляет несомненный интерес. .■

Поли и задачи иссладовгшиа. :

Целью данной работы явилось изучение структуры и функглзй те- ' на гесА Propionibacterium shsnronll,его способности активировсагь SOS-систему Е. coli и создание на его основе нового штамму дла-тестирования ДНК-повревдающей'активности химических соединений.

Для-осуществления 'этой цели были поставлены поэтапно следую-. •

щие задачи:

1. Создание банка генов Propionibacterium shermanli и идентификация гесА-гена.

2. Локализация гена и определение внутренних сайтов рестрикции.

3. Изучение экспрессии гена в различных штаммах Б. coll.

: 4. Исследование генного продукта -RecA-белка.

5. Конструирование плазмидных систем для изучения шстивации SOS-системы Е. coli.

6. Изучение возможности использования нового •штало^а с гесА-' аналогом для тестирования химических соединений в SûS-хромотеете

на ДШ-повредда,ощую активность .

Научаяя иовиапа н прззсгтеаюя значимость.

Епервьзз получен банк генов' Propionibacterium shsrmanií, кло- • Шрованы гэеу thrB и recA P. sherman 11 ( rocA-Ps). ГГогсазана спо-собкоск»'киакрошшого гена экспрессироваться в клетках Е. coli, ' в состав? разаг-ян-н сээт-оров для'клонирования, в различных штаммах Е.С011, несуща гссЛ. &i"a продемонстрирована также способность ггсЛ-Rs шщуцгфовать SOS-систему Е.coli, сравнимая со способностью со2с?22'шгого rsna госА. Рассмотрено взаимное влияние гесА-Рз и lonA-raia E.coli (1охА-Ее) з механизме SGS-индук-шш. Цроведонн сеедддагзкня по выживаемости клеток, несущих различные плагмядтшг газнструг^ш с гесА и lexA генами из Е. col 1 и Р. shsnrení 1 о sasгстдготп от дозы мутагенов и УФ-облучения.

С покоцыэ козой аггз^ллдной конструкции проведены исследования целоП.грушш генотсксических агентов различной химической природы. Шдучглзкэ шлгазатели коэффициента индосции SOS-системы в негйзторш случаях даяэ превышали значение подателей для из-Bscsfficro тосхврнсго зггр.чма 5. coli PQ37.

■ ¿хрзбтщзpsßoru.' •

Рецультагы работы докладывались па научном семинаре сектора 21солого-генетических исследований Всероссийского института гене-

• •• ■ ..■ 4 - ''. • .

тики и селекции промышленных микроорганизмов (1990) , па отчетной конференции по молекулярной генетике (Цущино-на-Оке, 1991).

Публикации. .

По теме представленной диииа^гаЦКй опу^ллковакк 3 научных работы, одна работа; находится в печати. ..

СЗъои н структура диссертации. ' \

Диссертация изложена на страницах шнинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и обсуждения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Обзор литературы посвящен современному состоянию знаний о структурно-функциональной организации. гесА-гена и RecA-селка Е. coll и его аналогов у различных еидов микроорганизмов, а вторая часть перспективе исследования генетики пропио-новокислых багаерий, как важных промышленных продуцентов в раз-Еиьающеыся биотехнологическом производстве. Диссертационная работа включает в себя >"табдиц. 3~~(£ото. ■/£ риунков. Список цитируемой литература содержит/^Ул1гхерат?рных источников.

СОДРРХАШ PASXU ; ¡¿¿териалы л ютоды исалздэжзмя.

Бактериальные игашы. В работе использовали культуру пропио-ковокислых бактерий Proplorubacterium sherrranll, устойчивую к антибиотикам канаыицину, . эритромицину- и стрептомицину, с неизвестным генотипом. Для комплементации функции гесА гена по тестам на выживаемость использовали штаммы. E.coll НВ101(гесА13 hsd20 ага!4 proA2 leuB thll. laoYI galK2 latll, rpsL20(Srn R) supE44); C600(recA thr-Bl leuB thll lecYl hsdM tonA stlO.: TnlO(TcR)); AB1157(recA+ F-'thrl lou6 proA2 hls4 argEl thll lacYl ealK2 araU xyllS rr,t!2 tsx33c strAl sup37). Для проведения экспериментов по индукции SOS-систены использовали miaisw

Б.coll ECIOOO (thl(proB-lso) supE44 StrR rocA+). Штаммы бактерий * были получены из Всероссийской коллекции про.чьшенных. шкроорга-нйэмов, из музея культур МГУ им. IL R Ломоносова, из музея культур Института общей гепатита! им. tt. Ii Вавилова.

Культивирование бактерий. Культуру P. sheriranl 1 вырастали на . сложной синтетической среде, содержащей кукурузный экстракт и мел, а тг:<же витамины (Воробьева, 1976). Культивирование Е. coli проводили на L-arape," в качестве твердой среды и в L-бульоне (Ниллер, 1976).

Выделение ДНК. Выделение тотального препарата ДНК Р. shörmani 1 проводили по стандартной методике (Маниатио, 1984). Плазмидную ДНК выделяли методом кипячения (Birnboim, Doly, 1979), ДКЙ ■ очищали центрифугированием в ступенчатом градиенте . плотности цезия.(Маниатис, 1934). Ферментативную обработку ДНК . проводили ферментами производства ШКГФермент" (Литва) в соот-ветотвии с реюзмендацидкл изготовителя, Электрофорез, и алюцию фрагментов ДЕК из агарозы, гибридизацию проводили по общэприня-■ ' ?ым методикам (Улнкатис'и др., 1984).

Создание банка генов Р. д1у--ггдп; i h получение гибридных плаз-¡■ЭД Для клонирования генов Р.кКэгшпи в клетках Е.coli была , получена предстательная кговотека." В качестве клонирующего вектора использовали плазыидкий вектор pVZ281, который поддераи-вали в клетках Е.coli СбС-С(гесА). Вектор бил сконструирован-ранее Зинченко а а (кафедра генетики 1.1ГУ им. Е В. Ломоносова ) на • основе родительской плазмкды RSF1010, несущей устойчивость к стрептомицину и сульфсниламидам. Еектор позволяет осуществлять прямую селекцию по устойчивости к стрептомицину клопов, содержащих рокомбшюнтнуп ДНК со вставкой по уникальному Ва-^!-сайту.

Идентификация белкового продукта и подтверлденио ре.'тЗипа-вдонной функции продукта клонированного гена. Был кспольгован игада-продуцент мини-клеток Е.coli Р678-54 ( Freitag, et. al., iü£>3). Первоначально проводили трансформацию клеток пла-змидой pSPuS с !'лсш:ро1!?,нпж гоеД-геном. При отсм использовали !.:с-тодику приготовления компетентной культуры й трансформации, .приведенную Мани&гисом и' др. ( 1984 ). Отбор трансформзнтов

З'бо/

производили на L-arape с добавлением антибиотика КшС25 мкг/мл). Еироеине клоны зазевали в жидкую питательную среду (LB) и дале< получали по методике мини-клетки. Предварительно прогретые. иг кипящей бане в течение 3 мин мини-клетки, ресуспендироЕанныз з бактериальном буфере и буфере для нанесения проб, нанссил:; по 21 мга на пластину полиакриламндого геля с SDS. ПЛАТ готовили пс стандартной методике, описанной у З&шиатиза и др. (1384),с 10 3 раствором SDS с целью улучшения разделения белков по .массе, а ие по заряд: . После процедуры электрофореза в ПАЛГ проводили радко-автографию для выявления меченых бе-ков по стандартной методике £sji подтверждения ре-ко^бинациоиной функции гена использовали цат Дигап biolO .несувдй мутации по гекаы рекомбинация (¿rec). Cor высев зли на часта! с L-агаром с культурой НВ101 (госА) ц HBiûl (pUC 19:. recA-Ps)В осстаь? плаоад pDIîOi: : гооА-Рз рекоыбинецношгуа фук-.щи» гена подтвердили при иошеда внугршиззшдаой рекоьйика-циь. Опыт проводили с использовало:; пбрздной плаз.чвды рР8,несущей фрагмент хромосомы морекк;: бактерия Vibrio fishsri, содержащей по две копии генов luxA и luxB (гадярук^» su и Jjr-субгбдшшць. фермента лкцифоразьОс мутациями типа "Ггагэ shifL" .Пдаомиду рг£ тр-и'я'ормироваж в НВ101(рВИ01: : гесА-Рз)и ШОЗ(гесА). В результате ¿нутриплазждпей рекокбинацш! начинался синтез акмаиюй ло-циферазы, эатряш'ый количественно по интенсивности свачешю. ' • ■ Уч'гг '-шдукщи 'SOS-cuctomu. при проведении зкеперкмгн-

4 ou по шдаодая SOS-системы применяли колорик^рический ыетод учу?а 'чсгивностц .Ь-гапакгозидяза • Ыотодшф проведения эксперимента била модифицирована следующим образок: ночную культуру с плаэшдами разводили ь свежем-L-Оульоае в. соотьошйнии 1: lü, под-до значения оптической плотности 0Д-6.7-0.8;.. разливали, по колбам и добавляли мутаген, подращивали на клчалке, при,37°С в течение 2-х часов. - ; - . '

Обработанную мутагеном культуру разводили в 5 раз и помещали в ледяную баню на 20 мин. После этого разрушали клеточную мембрану: к 1.8 мл Z-буфера добавляли 0.2 мл культуры из ледяной бани, 20 мкл хлороформа, 10 шеи 0.1 X SD2.. После энергичного встряхивания помещали в термостат на 23°С -па12-3 мин... Реакцию

аапус:<али, добавив. в гсг^дую прсбкртсу 0.4 мл раствора (4 мг/мл)

0-тгерофенил-^-В-галяетсзида в 0.1 1 фосфатном буфере. Бри полутеням раствора реактргю оетакзвлизага добавлен 2 ыл 1 У раствора Na2C0v В состав Z-буфера (на 1л) входили: Na НРО. -16 г; НаН2ГОч'Нг0"-5.5 г; КС1 -0. 75 Г; 1.^30,,7Н О -0.25 Г; SDS -1 г; -меркаптсзтакол -2.7 мл (непосредственно перед опытом). Актив-костг>$- гапактозндаэы определяли по известным формулам, сосанным у Миллера (1975).

Результаты собстгзяшгл исследований

I. Клонирование récA-подобного гена Р. sterranti.

Согдзппе балка генов P.shyrmanli, получении гибридных плаз-

шд, иомшшитярукдя wrai&u thrB и гесА в Е.соП.

Для создания геномной библиотеки хромосомную ДНК Р. shormanu расщепляли рэсхрикгазой Sau3A, отбирая при зтсм удобные для клонирования фрагмзнти» 4-3 !<Ь. Полученные фрагмент« лигирсвали с вектором pVZScl, рзскрилзиным по уникальное; сайту BarHI. Нитрованной сыъсьъ водили а^офор-шуш компетентных клеток Б.col! C6Q0 (rooA). Перед высч-:ом на агаризоганиую сре^у-проводили зкспр?ссшо э L-бульсно в течение 3 чесов, затем высевали на сроду со стрептошщшюк (50 мкг/мл). Выросшее количество ¡ионов (б*1С§ являлосьдостаточны;.! для нахождения в банка уникальных геиоз с вероятностью 0.99. Б результате эксперимента получили -десять независимо отобранных ¡слонов, которые потвердяли наличие вставок при помощи рестрккционного анализа. Размер квитированных фрагыэнтов колебался в интерйлэ от 4.9 до 5.5 kb.

Парзопачалйво проводил!! помок гоноз биосинтеза лейцина и тре-DjííiHa е клонстс; Р.shononii с помощью, комплементации мутации

1-щ и tbi-B ы П. col i СсСО. Для этого высевали клетки на минимальные среды Cea лейцина а треонина. Комплементация мутации leu не была-выявлена .'Один из трех выросших' • аа минимальней среде без греонипа клон .несугий рекомбинантную плаз?лиду с размером встав-

- " . '. - 8 - • . ки 5.1 kb ,был использован для трансформации штаммов' Е.coll СбОО,АВИ57 и В1386 (все thrB). Комплементация функции thrB была полной, комплементации мутации tíu-A. LíirC б соответствующих штамма:: Е.colj кз наблюдалась. Далее в диссертационной работе данные по гену úu-5 F. öi iorrcr.il н? лппужлгшгоя.

Для проведения экспериментов по идентификации Функции recA-подобного гена Р. shenrani i подбирали оптимальное значение длительности воздействия УФ-излучения.на клетки, при котором у штамма Е.coli C6Q0 (гос+) еще появлялись коло:ши хизкеспоссбних клеток, а у штамма СбОО(гесА) рост колоний отсутствовал. Облучение проводили з чашка Петри, УФ-лампой мощность» 15 Вт в диапазоне ьремени от 2 до 120 сек.

Зконо^именты с облучением кхо.ноз из геномной библиотеки УФ-светоы и ' последующем высевом на среди с соответствующие антибиотикам позволит выделить группу устойчивых Г.Г.ОКОВ. Результаты эксперимента обобщены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты отбора ¡локов СоОО,устойчивых к УО и ' стрептомицину.

плазмида/ерэда L-arap.Sm/KM L-агар, Snv'K", У?/'

количество колоний

p\Z351 : - •100 ; 0

pSPu2,3 ICO 3

pSFuS ' ' 100 - 2

Восемь клонов из 'плазмидной группы под cCzy.w рабочим названием pSPu2,3 и два клона группы pSPuS подвергали дальнейшим исп-лол->ваншш. Одна из гибридных плазмид, комплеыеатпрующих RecA-фенотип п: выживаемоеги клеток при ■ обработке ' УФ, 'и

4-}iX0, с наименьшим размером вставки, получила название pSPu5..

Для исследования способности г&сА-подобного гена Р. sherrranl i компенсировать функции белка RecA Е. col 1 в' мутантных штатах

(гэсА) была проведена сзрия экспериментов с плазмидой pSPu5.

Клетки еташа Е. coll СбОО(госА), несущие гибриднур плазмиду, облучали УФ-светом. Результаты эксперимента обобщены в диаграмме зависимости выживаемости клеток от дезы облучения УФ (рис. 1,а). Выживаемость клеток с фенотипом RecA резко уменьшалась в интервале от 2 до 60 сек на 6-7 порядков, в то время как выживаемость СбОО(гос+) и ССОО(гесА) с плазмидой плавно снижалась, уменьшаясь незначительно (на 1-2 порядна). При этом кривая выживаемости штамма с плазмидой располагалась дада выяе кривой щтамма С600 с Фенотипом RocA+ . В качество позитивного контроля использовали штамм С600(гес+) с неповрежденным, нормально функционирующем геном, а в качество-негативного контроля использовали штамм С600 (гесА) -л-э плазмиды. Облучение проводили в интервале времен:! от 2 до 120 с. При этом ночную культуру клеток центрифугировали,ресус-• пендировали в фосфатном буфере до значения оптической плотности D--0. 6. Вносили 3 мл культуры.в чашки Штри обьемом 5 мл и подвергли облучения УФ. После облучения клетки пысесали на авизованную среду с соответствующими антибиотиками и без них.

На'следующем этапе проводили обработку вышеуказанных штаммов такими известном мутагенами,как »«шш»таисульфопат и 4-нит-рохинолин-1-скенл. После центрифугирования ночной культуры клетки ресуспендировади в Í0 мл фосфатного буфера Обработку (Ж (в диапазоне 0.025-2 % ) проводили при 37 с в течение 30 мин, после чего клеточную суспензию высевали на L-arap со Sm (50 мкг/ мл).По той же схеме проводили обработку 4-НХО.Концентрация мутагена находилась в интервале от 5 до 100 мсг/мл. При обработке МЫС выживаемость клеток СбОО(гесА-) падала до нуля у;ю при концентрации 0.25 %, в это .гв время на интервале концентраций 0.05-0.25 7. рывиваемость клеток С600(гесА+) и C600(pSPu5) плавно снижалась, изменяясь на 2-3 порлдга, но даже при концентрации «>тarena 2 Z рост клеток не прекратился. При этом общее значение числа выливших клеток для штамма C600(pSPu5) было немногим больше, чем для C6ÜO с неповрежденным гесА-геном (рис. 1,6). Такую же картину наблюдали и в случае обработки 4-НХО. В интервале малых концентраций мутагена (до 25 мкг/мл) падение выжизаемости для клеток с

J-60S

повреадешшм геном гесА происходило стремительно, smmmwts--клеток умэясалась на б порядгюв. Для штаммов с неповрежденным геном гесА и предполагаемым гесА-аналогом P.shennanil на всем интерзале и малых и большее концентраций происходило плавное падение выживаемости,при концентрации ICO мкг/мл выживаемость изменялась всего ка 2 порядка по сравнению с начальным значением (рис. 1,в>.

Рис.1 (а-в). Зависимость шшшаемсе^. клеток'ох копд&зпрацгм мутагенов

Время оСпучешш УС.С

Putг. iCa-¿)

■f-í - - CSOOfrceA) 2-А- _ С СО О (гее *) з -о - - СбООСрSPu5)

Кояиааграаая Кащагрлвяж 1-ВХО.

¿'Р- с&шап

а- офаботна йГ- обработка

6 - оораЛтяа <f-niunp0XunertuH'f-0KCuQ3,t.

Таким ооразом,впервые был получен банк генов Р.вЬегшгШ.кло-.нированы гены ЬЬгВ и гесА. Исследования .показали полную комплементация функции гена гесА-Ео клонированным аналогом по выливаемо-'-сти клеток при обработк" их различными мутагенами.

Лэкалшадю? гесА-гева и определение внутренних сайтов peer

- 11 -

трикции ' .

Для уточнения границы гена r-эсА, вектор со вставкой расцепляет реетриктазой Sau3A и полученные фрагменты <1,5-2 тпн) дотировали с плазмидкым BeicropoM pUClQ, расцепленным по уникальному вгяш-сайту. Лигированной . смесь» проводили трансформация компетентных клеток Е. col i НШ01. Сто независимо отобранных клонов проверяли на устойчивость к УФ-свету и обработке ММС. 13 клонов проявили устойчивость к УФ и ММС.

Размер вставки -1.7 тпн определили с помощью, рестрикции. Рес-трикшюнный анализ показал, наличие нескольких внутренних сайтов рестрпкциигPstI,KpnI,EcoRI) (рис.2). Плазмидой pUC19 , несущей вставку,провели трансформацию штлммов ССОО (гесА) и'нВ101(гесА). Комплементация функции гесА была полной при проверке клонов на устойчивость к облучению УФ и обработке ЫМС и 4-IDC0. Проведенный гибридизационный анализ по Саузерну показал, что [тонированный фрагмент хромосомной ДНК гибридизуется с идентичным по размеру на хромосоме Р. sharmani v.

Ркс. 2. Внугг>2?й01е сайга рестрикции зставки , несущей гссЛ-ген Р. .-зЬегшпН

Shal Piztt ГсэТИ Fsfcl HirdlII

BaaHI/Sau3A I I ВаггШ/&шЗА

Kpnl Sfcnl

?. kb . ..............

Идоипфшция белуювого продукта reaА-гена P.shermanii✓ Из трех основных существующих лрокариотических систем экс-:ресски in vivo (системы клеток хозяев, облученных У£; мшш-кле-•о'к; млкси-клеток)для . определения молекулярной массы белкового [родукТа клонированного гена гесА Р. shorirani i использовали с не-

i' '■■ 7 ' •'-

тему мини-клеток(Freitag,et. al. ,1986). Шсле процедуры электрофореза в полиакриламидном геле с SDS проводили радиоавтография для выявления меченнн>: белков. На полученной авторадпограмш фореза приведена верхняя четкая полоса, соответствующая белковому продукту клониророваккого гена с молекулярным весом -З'З KD. Молекулярные веса' всех идентифицированных на сегодняшний день белковых продуктов гееА-подобных геноз находятся в интервале от 37 до 43 kD. , Тач например, молекулярный вес ReeА-белка Pseudomonas cepaoie. составлял 41.5 kJ, у Cyanobacteriuin synohococcus-33 kD, Legionella pneun¡ophila-37.2 kD, a y Bacteroides fragilis-39 и 37 kD.

Изучение ракоыбинащюнной способности продукта гона.

-После экспериментов по выживаемости клеток .несущих клониро-. санный ген для прямого подтверждения " рекомбиназной активности RecA-Ps был проведен эксперимент с использованием фага Д irrín biolO, который несет мутации по генам рекомбинации и способен реет и только на штаже бактерий с неповрежденным нормально фушаш-онирущкм гесА-геном. Рост фага на чалках с культурой KS101 с ре-¡«змбикактной плаэыидой подтвердил предподо&энш о тем,что ¡-клонированный ген кошиементирует рэкойинацисниую функцкаВ глчесаре контроля использовали культуру НВ101(гесА)СэЕ плалмиды, на которой рост (Jara отсутствовал. ' .

Вгорш уостом на яодтворяде-вио реког.йинациоЕиой функции геоА -Гз стал опыт с- использованием гибридной нхазмиды pF8 ва .основе pACYCl84 с Фрагментом хромосомы Vibrio fisnei;, зодзрзкагрй "по. дво копии генов luxA и 1ихВ(кодирующие о, и Д-суФьединици лкцкферази) под PI ас-промотором. В гены luxA были введены "frana Ehift''-мутг-щш в сайтах Xhol и Hindi II. В результате внутриплазиидксЯ рекомбинации образуется копия натпвного гена ¿ыцифэразы .синтез которой и был количественно измерен по интенсивности свечения суспензии клеток НЗЮЦрВИСИ::rocA-Рз).кесу^к такта pF8 с 1 их-гена-' im. В качестве контроля использовали crat.ü¡ НШ01(гесА)о pF8. lip;: увеличении оптической плотности суспензии клеток кнтенсиность свечения НВ101СpF8)оставалась одинаково низйэй , а для опитцого ^ ¡ггзнма возрастала на несколько порядков.

11. Изучение экспрессии гвсА-гона Р. stornar.i í в ск?теш индукции SOS-ответа. ,

Далее било логичнш предположить,что госА-подобный ген P.sho-rrani но только выполняет кснстнтутивнуэ функцию,как и его. аналог в Е.coll,но таклэ и индуцибельи.'то функцию. Для экспериментального подтверждения нндуцнбэльности функции гесЛ-Ps была изучена активация SûS-енстеш E.colï.

Для проведения экспериментов по индукции SOS-системы Е.coll г-эсА-геном P.shormnil бнлг поставлены и решены поэтапно следу»-tm задач;!:

- Субклоннровшшз мшш.мального Фрагмента, гсомплементирущ-зго гвсА-функци'л, на плаз миду с плгоокал кругом хозяев, совместимую с рагпстрпрухщей плазм?дой pJE43 (описание конструкции этой пдоз-шди приводится шиз в разделе); осуществление контроля конститутивной фуп:сщ:и по Еьижшемости клеток при обработке их мутагенами и'У&

- Совче п;эниэ редамбинантной плазмиды и регистрирующей плазмы Б птамм-г НВ10! для проведения экспериментов по индукции SCS -скстс-му Е.coli.

- Ссздгяи* п.-5г:.5!дных конструкций, несупих одновременно г«сА и ЬхА г<?ии длл изучения их возмояиого взаимного влияния на SOS-CHíni?)//Е. coli...

- Кгпольвовзш» созданных мазмлдных конструкций з эксаери-уея??* во изучений SOS-ответа различными ДНК-повре-са»-»313! агентам.

Дет гаитроля : за фупкцной гэсА-гена Р. star rani i я сравнения ого футвдяопальнье: зароотсристик с гесА-reном E.coli эксперщг-н-ти г.о субклопировакка и совмещений пгаэуид приводили таю» и для гесА -гена tcoii. То есть, Фактически были созданы две плаз«и.д-ii!î? системы, каждая по которых содерлага ¡»гистрирутоауа плагмиду PJE43 (Д:пе> д;клава и др., 1Ö8C) и р^кокяинантную плазмлду рБ1101 (Jsfforscn c-t. al., 13£9), содерлапухз либо ген госА P. shorrranit, либо,гол гесА Е.coll. А также две плззындныэ конструкция, несуще одновременно госА и Ь>хА Lcoll, совше^нпуо на плазме pBUOl в паре с регистрирующей плззмндой pJE43, и г о с А P.shernanii ¡i lexA Е.poli на pBUOl, созмегенной в стаьаае HB!Gl с плаэкндой pJE43Í ■ *

Для доказательства индуцибельной Функции клонированного recA-гена и косвенным образом наличия копротеазной активности у продукта данного гена нами впервые была предложена систем тестирования Фук1 :цкональнооти rocA-Ps при помощи индукции' SOS-ответа в клетках ¿.coli при обработке их ДНК-повреадащими агентами.

Клонирэваниа гесА-гена P.stonmnil на ляазктзу pBIlOl широкого слекгръ дейотзж

Известно ,что для регистрации индукции SOS-ответа применяют различные виды тест-систем. Киллардэ и до. (1982,1933) разработали Ttícr .позволяйся обнаруживать в:'разини? SOS-генов путем .учета активности Ь-галактозидазы. "Для этого они осуществили встраивание -Jara Ми 1( Ар, la j) в ген sfíA хромосомы Е. col 1, детерминирующей одну из SOS-функций -подавление клеточного деления в ответ на повре»-д^нпе ДЛК . Система дает возможность выявления SOS-индуцирующей ' активности различных химических соединений . Джеджелава и др. / (1983) путем инсерцин Фага Mud (Ар,lac) в ген продукции колицина плазмиды ColEl,создали усовёршенствовашшый вариант SOS-хромоте-ста на илазмидиой основе. Для регистрации SOS-ответа использовали: полученную рекомбнчантную плазмиду pJE43,у которой■ структурные гони 1ас-оперона находятся под контролем промотора гена продук- : ции колицина плазмиды ColEI. ■ .. -

Для pí-гистрации индукции SOS-системы Е.coli rocA-Ps геном использовали SOS-тест. При этом следует отметить,что для:доказательства индуцибелыюсти Функции recA-аналога нами зпервые использовался новый подход, вклдааэдий в себя индукцию SOS-системы Е.colt при ломоед госА-подобного гена, находящегося на плазмидо pBIlOl широкого спектра действия, совмещенной с регистрьфуодзй плазмидой pJE43 в штамме Е.coll НВ101 (гесА). .

Предваригелыю для совмещения плазмиди pJE43 о гибридной ллдзиидой необходимо было вставку с госА-геном перенести из лдг'гмнди pUOlö на плазмиду pBIlOl с широким . кругом хозяев (Друйпер и -др., Ш1). Эга плазмида детерминирует устойчивость .js-v.'Tck i: гпн.^ицину и несет в своем состав»? удобный для клониро-,vví;w пjлил;;;;к(.-р. Клонироооние rooA-гена было осуществлено по.

сааяи HindiII (рис.З.а-б). Для контроля за функцией гвсА -гена в полилинкер рБ1 iOí зонировали по сайтам BamHI н Pstl ген гвсА из Е. col 1. Источником зтаго гена явилась плазыида PDR1453 нг* основе известкой плазмиды pBR322 (Sanear, 1979). Две сконструированные илазмпзы получили условное название pBIlOl(rc) й pBUOl(rsh) (с генами из Е. col i и P.shermanii соответственно).

Рнс.3 С г,» б). Елогароиажо генов recA-Ps(a) и гесЛ-Ес(б) на шааыиду пирокого спектра действия pBIlOi

si ^ m/st&^pS-—I Â • '

ífrecA pPClSM •PI ■ ftsbenwnüj

«f.

pDR1453

__________________гесАЕ.соН'

Как и на предыдущих этапах клонирования и субклонпрованил постоянно осуществлялся кок-'рбль выживаемости клеток, несущи гибридную плаз жду при дейст&ш на них мутагенов. Полученные результаты показали, . что оба фрагмента в ссстаг. - плазмиды рБИС! комплементи;.уют функции гесА-Ес по тесту выживаемости при обрз-

ботке мутагенами.

Индукция SOS-CHCT3WJ E-ooli РзсА-сенои P.stermanii.

Известно, что в ответ на действие мутагенов, вызывающих различные типы первичных повреждений ДНК,, в хромосоме Е.со11 индуцируется выражение ряда опероноа, -контролируемых генами гесА и loxA и детермикирущих так назызаемые SOS-функции. SOS-тест позволяет обнаруживать выражение SOS-гонов путем учета активности -галзктозидазы. В ' плазмидном варианте теста у регистрирующей плазмиды PJE43 с промотора гена ColEl вчитываются структурные гены лактозного оперона, а кроме это"о плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Было бы логичло предположить, что recA-Ps ген способен активировать SOS-систему Е\coli,также icaií и ген госА-Ее. График зависимости Ки -галактозидазы от времени облуче--чения УФ показал,что для штамма HBlOi(recA), несущего плазмиду с с recA-Ps, значение тот! максимума коэффициента индукции смещено в область больших доз обработки Уф-светом. Такое смещение может быть обусловлено различием сродства LoxA-penpeccopa к RecA-продукту гена rocA-Ps и гесА- Ее (рис, 4),

' Ру.с. 4. коэф^-эд-гезаа тпэдущш Ь-гала.'£тоз*щаза ох

Предполагая,что fcecA~Ec активнее взаимодействует с LoxA-pe-прейсором,нежели RocA-Ps,ю:гло,говорить о тоы, что и расщепление LoxA произойдет при большей дозе обручения УФ-светом» т. е. при большем ко-гччествэ поврездений,которые приводят к активации RecA и его способности связываться с LexÁ-Сеяком. Это в своя очередь меняет конформзцию Lo"Л-белка и активирует его автопро-?еазну» активность. Дополнительным подтверждением этого предположения является я тот факт,что кривая зависимости -гаваитозидазы о? времени облучения для штажа НВ101 с плззшдсй pSPuS (нэеуп?й бользий Фрагмент с гвсА-геком) располагается аналогичным образом по откосен»» . к кривой К31С1 (рЗИ01 гс) , как и кривая Н3101СpBHOl rsh). Причем,уровень индукции приблизительно одинаков для всех трех случаев. В точках -гаксимума уровень активности - галактозидазн з 20-<Ю раз виго спонтанного уровня для этамма HBíOl(recA) о регкстрирущзй плазмидсй pJE43. И если скорость достижения махсимальнсго эффекта БОБ-индукции етво для случая с гесА-геном Е, coll, чей с геном P. shorrrani i в составе обеих плоз-мид CpBIlOi и pSPi'5), то скорость снижения эффэкта индукции при дальнейшем росте дозы облучения штаммов для генов гесА Е. col 1 и P. shgnranii в'сотазхо плаомиды pBIlOl становится одинаковой нз том га кктэр?еле времени облучения. . Схожая ситуация наблюдается при обработке выгзпперо'п'-ижннък' шг&чмов о плазюадаыи ШЗ и .4-НЖ>. . ..

'Созяит$ п~лзи11Д!Ш конструкций, нес}ТЩХ одноврзштю гесА я !<у::Л -гот E.coli, a ras-era госЛ Р. star ron i 1 и I&xA E. col J. • ' Основной целью создания,- конструкций ,'несущих одновременно гесА и 1ехА гены,был поиск подходов к изучения, взаимного влияния 'lexA-Ec и гесА-Рз в механизме БОЗ-индукцш! и наличия копротеаз-' ной активности у продута клонированного гена

Поэтому были созданы две " новые плазмидамо- конструкции для определения взаимного влияния 1ехА-Ес и recA-Ps генов на активацию SOS-систему Е. col 1. Ген lexA-Ec '.клонировали г.о ВалШ-сайту . изплазмиды pGC3 (производная! pBR322)(HorИ et.al., 1981)

. -Iß -

на pUCi 9, кесуш/-) в полилкнкере гак устойчивости к хлорамфениколу по сайтам Pst.I и HíndIII. Сцепленный с маркером'анткбиотикоус-тойчивости 1е:<А-г&н перркяонировали на плазмиду pUC19 с геном устойчивости к канамицйну в колииажере по EcoRI-сайту.

Из этой . плаамидной констру}Щии вырезали

Н1псШ1-!'ихШ1-фрагмэнт, несущей ГехА ген, сцепленный с хлорам-Фениколькым мэркором и клонировал:? его по Hindi Ii-сайту .в поли-ликкер плазмиды pBIlDl с геном гесА из Е. col1 и на плазмиду pBliOl с гйксм гесА ив P. shernanli.

Новые плагмидные конструкции получили условные названия рВИОКгесА lex А) и рВИОЦгесА lexA sh) (с генами гесА-Ео и loxA-Eo, а также recA-Ps и. 1ехАтЕс-соответственно). '

Эти плазмидц исследовали teat; и две предыдущие о гесА-генами в клет!са>: E.coli НВ101 с комплементацией RecA-фенотипа по гесту викнпеемости при обработке клеток УФ, 1£¿C и 4-HXÖ. .

В условиях воздействия на клетки мутагенов и поязления лов-, редценнй, индуцируется активность RooA-ps, необходимого для рз-коЮ;;нащюнной репарации и дальнейшей индукции SOS-системы. Прошение дозы гень !о>:Л приводит к повышению концентрации LoxA-белка, "ствмтм^го" на себя часть синтезируешго RecA-Ps в измененном информационно« варианте под воздействием'поврегде-■ ний в струлгуре ДГЧ11. Это обстоятельство, цо-видяюму, 'cmwr.ev репарационный эффе!гг и процент выживаемости при Определен--, ной дозе мутагена для опига с дополнительной 'ЧехА-цишекьй*' по сравнений с опытом, где на плаакнде присутствует- только один госА-геп. Шлучешшз данные позволяют' сделать вывод о'воашгиои суг,;сгвоваки!Г такого*¡ко взаимодействия -lexA-Ee и гссА-Рз, как и цэзду гвсА-Ес и 1ехА-Ес.

Апробация Kowso иташа в ¡-ячоствэ túü?-c¡:oto,¿j для зтзлз-и№ Лш:-говрвхдащих азвитоп. -

Как было сказано выяо.Киллзрдэ и до. (1982 ,1983) разработали тест,позволяющий обнаруживать выражение SOS-reipü путем учета ектианости b-галактозидаэы. Для втого они осуществили встраивание . Фага KüdíAp.lao) в ген зПА хромосомы Е.со11,дотер».яширувдзЯ од-

, - ¿9-

ну из гак-функций-подавление клеточного деления в ответ на повреждение ДНК. Система дает.ьс<$:лойиость выявления 303-индуцирующей активности различных химических соединений при воздействии на тестер!:ый штамм Р037. Этот штамм является высокочувствительным и позволяет обнаруживать дэж очень слабые повреждения ДНК (соответствующие воздействия на один' пирзя/лдиновый дга:эр в целой хромосоме. . '

При помоем 303-хромотеста провели сравнительные исследования чувствительности нового игам а ¡¡8101(рВИ01:: госА-Рз)и стандартного штамма РП37 к ДНК-повреядзхдэму действию различных химических соединений. Вещества мо.гно, подразделить на несколько групп по принципу воздействия на »Ж К группе алкшшрухяцих нояо отнести: биметил,этнжэт2?!сулгфонат,ме?илтр1фор?«тапсуль^нат к 3,3-дкмет:?л-1 - фенил- триазе п.

К группе ¿дзкхширувдих агентов кокио отнести: бисбензимид, дискондия, 2-иитрсФлуорвн, нитрофуразон и нитрофурактоин. К группа !.'Од;гЬ'.1П-1ру!ОЗзтх оснований:" цитозик-арабинозид. По типу воздействия яа ДНК к возникновения димороз УЗ-облучение Объединила П Группу С 4-НИТРОХ1ШОДПН-1-ОКСИДОМ. Антибиотик !.:И;о:.!ИЦ!Ш С бнл 51.*3ргч в кзчэстге бифункционального азкилирук^го агент А аитибистм: .^лзсхзцан использовали в качестве агента, специфически зызывзщ-л'о гтиишов! ' еайтч в стругауре. молекул дни.

Результат;: эксперимента обобщены а таблице привгд*ниоЯ

Таблица 2. .Индукция ЗОЗ-ствета химическими 1фтат€-нами.различи«г/. Групп в. итамах Р037 и;НВ101 '

Веществр/Еггамм ■ ! РС37 • ■НВ101

концентрация коэффициент индукции

этнлметансульфэнат 40 9. 03 8.12

биыетил ; АО 8.75. 5. 21

1. 3,3-диметил-1-фэ-нил-триазен * метилтрифггорметая-сульфонат 10 1 . во -3.66 1.42 4,09 1.53

нитрофуралтоин БО 29.8 ' 28,04

£-нитрофлуорен 25 24, гг 53

нстрофуразон 50 25 18,68 Б. 94 22,07 4 ,08 -

бисбензнмид 25 1,93 2.9

цитозин-арчбинозид 25 . 13,16 16,61

мнтомиции 0 1 •з.-зо. .."< Б. 58

блеомицин 100 й.вз

4-НХО . . БО 6.49 7.39 .

У* I Ш1В ' 1 7,61

а гиачоине концентраций даны б мкг/мл

Б-.-даст в а тестировали е концентрациях параллельно на двух ¡¡.таксах и получили кривые зависимости индукции БОо-ответа от ко-нц-:-ит рации вец«ства . В таблице 2 приведены максимальные значения Ки (ксэ№пи'лнта индукции)к концентрации вещротс.при (соторых на-С-лвдас~тря максимальная индукция ЗОБ-ответа. Анализ представленных данных показывает,что штамм НВ101 по своей чувствительности к действию иошлмшнгх агентов не отличаете« от птамчз Р(}37 и- дали доказывает более высокую чувствительность к действию ряда н^тро-

■ .•■■••.-■.- - 21 -соодиноний и МИТ0МИЦКК7 С. Известно,что PQ37 в отличии от НВ101 , имеет мутации uvrB и rfa ,повьсаготе его чувствительность к действию ряда мутагенных веществ . Поэтому введение в штамм НВ101 подобны/ мутаций может сделать "ого в перспективе конкурентности бным тесг-штаммом для SOS-хромотеста

Таким образом,нами получен новый птамм с клонированным гесА-геном P. shermanti .который ыояет быть использован в качестве тест-ст&чма з SOS-хромотесте для изучения ДЯК-повреящахяцей активности химических соединений.

вывода

1. Впервые была получена -геномная библиотека грамположитель-ннх пропионовоккелых бактер!й5 Propionibacterium sher¡T¡anii и впервые' клонированы гены thrB и гесА. Проведено исследование структурно-функциональных особенностей гэсА-гека.

• 2. Продемонстрирована способность данного гесА-гена комплектировать функции гесА E.coli в составе различных плазмид, в различных тес А-мутантах E.'cóli. Наименьший размер фрагмента ДНК, шахэментирущий госА-функции .составил 1.7 тпн. Определены вну-tpeinnie сайты pecTpHKiçni .

3.Идентифицирован белковый продукт' клонированного гена и -определен молекулярный вес,который соответствовал известным на сегодняшний день RecA-беякам и составлял -39 кО.

4. Продеъюнстрирована способность гена гвсА-Рз к ■ SCS-ответа в клетках Б. coli; наравне с геном гееА-Ее з

с использованием системы SOS^xpoMorecTa.

5.Созданы конструкции на основе плазмиды pBIlOl -,несущие одновременно rocA ?. shermani 1 и lexA Е. col 1, для изучения возможного взаимного влияния '.¿сА-Рз и 1вхА-Ес. Показано,что в опытах по индугадеи SOS-ответа эти конструкции веду? себя такав .как и го?А

-, Ее íi lesA-Ec..

индукции опытах с

. •■' - 22 - ; •-."

^ ' < Ч, ■ • , ''

6. Проведано сравнительное'азученка SOS-ictSTO'py^sro потенциала бадызоа группы генгяокоа^ашк агентов на штаммах PQ37 и и НВ101. ХЬказано, что новыа Еггиы шкет быть использован в качестве кия^атора генотоксичвоетя химичесгах: соединений в SOS-xpo-иотесте. * -

Штериалы диссертаций оаубижованы в следующих работах:

1. Шккова С.Е, Абилов С. К. Молекулярное клонирование генов биосинтеза треонина r Propionibacterium shermanli в клетках Escharichia colt. Генетика, 1093, КЗ, Т.29, с. 539-542. ,

2. Канкова-С. Е , Абилев С. К. . Тарасов Е А., Огаркова О. А. Клонирование гесА-гена пропионовокислых бактерий Prcpicnihactoriun shermanil . в'кяазках Ecoll. Генетика, 1S33, N5, Т. 29, с. 777-784.

а Шнкоаа С.Е., Абилев С. К., Тарасоа RA. toÄöKy.S3paoe кн>~ нировазша генов Prepiurjifcaolerluri shenranii на илазжду широкого снектра действий, PsiisTKKa, 1933, Но, Т. 29, с. 914-921.

ÜV-/CV.