Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ЭМИ СВЧ на регуляторные системы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ЭМИ СВЧ на регуляторные системы Escherichia coli"

На правах рукописи

□ОЗОВЗОЭ8

Антипов Сергей Сергеевич

ВЛИЯНИЕ ЭМИ СВЧ НА РЕГУЛЯТОРНЫЕ СИСТЕМЫ Escherichia coli.

03,00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Пущино-2007

003063098

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН (г Пущино)

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Озочииь Ольга Николаевна

Официальные оппопеитыг

доктор биологических наук, профессор

Чемерис Николай Константгаювич

доктор биологических nayic

Железная Людмила Алексеевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН, Москва

Защита диссертации состоится «24» мая 2007 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, Московская область, г. Пущино, ул, Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул. Институтская, 3

Автореферат разослан «¿'❖»апреля 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.038.01,

кандидат биологических наук

Смолихина

?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Неотъемлемой частью среды обитания любого организма является Магнитное поле (МП) Земли и электромагнитное излучение (ЭМИ) Солнца. Вариации их интенсивности, обусловленные внешними или техногенными факторами, вызывают адаптивную реакцию практически у всех живых организмов. Этим обусловлен интерес к детальному изучению механизмов биотропного влияния электромагнитных излучений. Их воздействие на биологические объекты зависит от частоты и интенсивности, наличия и типа модуляции, от поляризации излучения и режима экспозиции. Предложено несколько гипотез о физико-химических механизмах рецепции ЭМИ ¡файле высоких частот (более ЗОГГц с длиной волны меньше 10мм). Доминирующей концепцией является представление об их резонансном поглощении биологическими системами. Однако излучения низкой интенсивности, более длинноволнового диапазона, влияющие на многие биологические процессы, имеют энергию кванта меньше чем Ю^эВ. Это значительно ниже энергии тепловых колебаний (кТ=10"2эВ) Поэтому механизм их слияния на клеши, в целом, остается малопонятным, хотя сама «проблема кТ» также требует, по-видимому, более строгой формулировки [Бинта и др.200б]. Очевидно, что для поиска первичных мишеней электромагнитного воздействия нетепловой природы иа клеточном и молекулярном уровнях проще всего использовать одноклеточные микроорганизмы, реакция которых на МП и ЭМИ не может быть опосредована наиболее чувствительными к действию ЭМИ нервной и эндокринной системами [Гапеев, Чемерис 2007]. Поэтому в качестве объектов исследования в данной работе были использованы два штамма кишечной палочки 0Escherichia coli, Exoli), которая является одним из наиболее изученных биологических объектов.

Влияние МП и ЭМИ на метаболизм кишечной палочки изучается с шестидесятых годов прошлого века, но полученные данные во многом неоднозначны и даже противоречивы. Tax, Веббом и Доддсом [Webb & Dodds, 1968] было установлено, что МП с частотой 136Гц и интенсивностью 7 мкВт ингибирует деление клеток E.coli, не вызывая их гибели. Снижение скорости роста бактерий в МП было также зарегистрировано в работах [Strasak et aL 1998, 2002 (50Гц, 2 7-21.5mT), Ramon et al 1981 (60 и 600Гц, 2mT) и Li et al. 2004 (пульсирующее МП, 62 кГц, 160mT)] Однако по данным [Nascimento et al., 2003], МП (60Гц, интенсивность 5G), наоборот, приводило к повышению метаболизма глюкозы и, следовательно, к активации роста клеток. Аналогичный эффект под действием ЭМИ СВЧ (3,07 ГГц) был обнаружен в работе [Anderstam et al, 1983] Таким образом, данные о влиянии МП и ЭМИ на такую интегральную характеристику клеточной популяции как скорость роста неоднозначны,'

Было установлено, что облучение E.coli градиентным МП (5,2-6,1Т) уменьшает гибель клеток во время стационарного роста [Shoda et al., 1999; Okuno et al. 2001]. Этот эффект был выражен слабее для клеток, дефектных по гену rpoS, кодирующему с^'-субъеднницу РНК полимеразы. На стационарной фазе роста от38 замещает а70 в структуре фермента и распознает особую группу промоторов При введении репортерного гена lacZ под контроль такого промотора в МП была зарегистрирована повышенная продукция соответствующей мРНК [Tsuchiya et al., 1999]. Это значит, что действие МП сопряжено с индукцией в клетках транскрипционной активности, что согласуется с данными [Shcheglov et al 2002], показавшими, что экспозиция стационарно растущих клетох ЭМИ КВЧ (51.75ГТц, 10" "мкВт/см2) приводит к уменьшению компактности нуклеоида. Участие о33 в адаптивном ответе указывает но то, что МП восприниматься клеткой как стрессовый фактор, но в работе [Nakasono, Saiki 2000] методом двумерного электрофореза клеточных белков не удалось зарегистрировать индукции МП (5-100Гц, 10-14тТ) биосинтеза таких белков, как DnaK, RecA и UspA, которые продуцируются клеткой в различных неблагоприятных условиях роста. Авторы заключили, что МП не является стрессовым фактором для Kcoh

Этот вывод противоречит данным, полученным в работах [Chow, Tung 2000 и Li, Chow 2001]. В них под действием МП (50Гц, 0.4-1 2тТ) был зарегистрирован повышенный синтез шаперонов DnaK и DnaJ Он также противоречит результатам, опубликованным в статьях [Del Re et al. 2006] н [Cairo et al., 1998], свидетельствующих об увеличенном синтезе DnaK, GroEL (50Гц, lmT), и RpoH (60Гц, l.lmT), соответственно. Tax как ген гроН кодирует о^-субъедишшу РНК-шшшеразы, контролирующую транскрипцию оперонов dnaKJ и groEL, а также экспрессию генома в условиях температурного шока, эти данные предполагают возможность теплового воздействия МП на клетки, что мало вероятно.

Наверное самыми удивительными являются данные о том, что в ответ на МП (4.5Гц, 1 51), в клетке накапливаются а-субьедшшцы РНК-полимеразы и бедок регуляции терминации транскрипции NusA [Goodman et al. 1994], а в бесклеточной системе под воздействием МП (72Гц, 007-1.1Т) [Goodman et al, 1993] зарегистрировала индукция и других субьединиц транскрипционного комплекса. Гены этих белков находятся под контролем регуяяторных сетей, адаптирующих рост бактерий к условиям среды. Их усиленная продукция соответствует представлению о позитивном влиянии МП на динамику роста бактерий, но противоречит данным о том, что МП воспринимается клетками как стрессовый фактор, т.к. в этом случае синтез белков транскрипционного аппарата должен снижаться Тем не менее, способность МП влиять на экспрессию конкретных генов можно считать вероятной. Кроме указанных выше фактов, об этом свидетельствуют данные работы [Potenza et al., 2004], в которой анализировали ДНК-копии клеточных мРНК, полученные с помощью случайных праймеров. Под действием

постоянного МП (ЗООтТ) была зарегистрирована измененная транскрипция 4 генов, один из которых, вероятно, кодирует трапепозазу.

Таким образом, на сегодняшний день опубликовано довольно много работ, посвященных изучению реакции клеток E.coh на электромагнитные излучения. Имеющиеся данные фрагментарны, в большинстве случаев получены на клетках, подвергнутых действию МП, и, зачастую, противоречивы. В какой-то степени это отражает общую ситуацию в магшггобиолопш, которая находится на стадии накопления и осмысления данных, необходимых для последующего концептуального моделирования Очевидно, что наиболее плодотворными на данном этапе могут оказаться новые подходы. Поэтому в данной работе был использован метод индивидуального тестирования генной экспрессии с помощью PCR в реальном времени.

Цель работы:

Поиск внутриклеточных систем, способных реагировать на ЭМИ СВЧ. Задачи исследования:

1. изучить влияния ЭМИ СВЧ переменной частоты (8,15-18ГГц, время перестройки 1 мсек) и низкой интенсивности (ImkBt/cm1) на рост клеток Е.сой,

2. сравнять спектры белков, синтезируемых в нативных и подвергнутых действию ЭМИ СВЧ клетках и, используя физико-химические свойства полнпептидов, провести отбор генов, которые потенциально могут быть задействованы в формировании адаптивного ответа.

3. изучить зависимость эффективности экспрессии отобранных генов от ЭМИ СВЧ.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что облучение суспензии клеток Kcoli ЭМИ СВЧ сопровождается дифференциальными изменениями в уровне экспрессии генов rpoS, rpoH, rpoA, троВ, dps н hns, характер которых аналогичен изменениям, происходящим при переходе к стационарному росту. Это значит, что под воздействием ЭМИ СВЧ популяция стационарно растущих клеток нуждается в дополнительной стабилизации уже достигнутой фазы роста. Впервые зарегистрировано влияние ЭМИ СВЧ па продукцию в клетках мРНК генов fepA и fes, кодирующих рецептор внешней мембраны для транспортеров ионов кедеза и цитоплазматнческий белок, освобождающий Fe2* га комплекса с эптероб актином, соответственно. Если зарегистрированные изменения синтеза fepA- и /«-мРНК сопровождаются аналогичными изменениями в продукции соответствующих белков, это должно приводить к ограничению транспорта в клетки Fe2* и к ускоренной утилизации уже поступивших в цитоплазму ионов железа. На основании

полученных данных сформулирована гипотетическая модель рецепции ЭМИ СВЧ клетками. Центральную роль в ней играет мультифункциональный гомододекамерный белок Dps. Он является мажорным белком нуклеоида, обеспечивая компактность генома во время стационарного роста, окисляет находящийся в цитоплазме Fe и накапливает до 500 ионов Fe^ в виде кора Модель предполагает стабилизацию металлопротешгового комплекса ЭМИ СВЧ и объясняет зарегистрированные изменения декомпактизацией генома, обусловленной диссоциацией части молекул Dps из структуры нуклеоида

Научпо-ирактпчсское значение

Полученные данные свидетельствуют о влиянии ЭМИ СВЧ на экспрессию конкретных генов E.coli Это значит, что регуляторные элементы этих генов могут быть использованы в тест-системе для мониторинга уровня техногенного ЭМИ в окружающей среде.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференции молодых ученых «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва 2004, 2005, 2007), на конференции «Постгеномная эра в биологии и биотехнологии» (Казань 2004), на П1 съезде биофизиков России (Воронеж 2004) и Путинской конффенхщи молодых ученых «Биология - наука ХМ века» (Пущино2005)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературных данных, Материалов и методов исследования, Результатов и их обсуждения, Заключения, Выводов и Списка литературы (148 ссылок) Она изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 11 таблиц

Список принятых сокращений: ЭМИ - электромагнитное излучение; СВЧ

- сверхвысокие частоты; МП -магнитное поле, ПААГ - полиакриламидный гель, SDS - додецилсульфот натрия, аРНК - антисмысловые РНК; кДНК-фрагменты ДНК, полученные в реакции обратной транскрипции с мРНК; п.н.

- пара нуклеотидов, PCR - полимеразная цепная реакция

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

osbcirr псслсдоеонпя

Бшо шюльгскпю дга штампа кншсчшй шжгшс Е. colt КР7600 W3110 (laclg lacZ ЛЯ galK2 galTZ2) (Ecofi W3110) и ExvU В/г WU-36-10-11-12 (leu*, ty^ Sqs^) (Ecofi W12). Дж! £oaft W3110 гизесгпа поожя нуюеепвдкя гюсжягстатынхп. гшоло [Horiuchi, et al., 2004], гены, транскрипция которых изменяется при тепловом шоке [Ozoline, et al., 2004] и при деструкции гена rpoS (данные О Н.Озошшь).

Условия росте бгиггерпй

На начальном этапе работа для исследования были использованы клетки, выраздешше при УРС па среде LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl), а также клетки, выращенные на 1,5 - 2% бакгоагаре. В дальнейшем эксперименты проводили на клетках, растущих в жидкой среде LB приЗСРС

Рве. 1. Схема рабочей гамеры. 1-гсперятор, 2-вошовод, 3-рупор пргмоугольной антенны, Н-рассгохние между рупором тленны н облучаемым объектом; 4-кЕмера ккхубатора, 5-платформа мехашгесской нетшпш, 6-полотяо защитного экрана; 7, 8-места крепягшм опытного и контрольного образцов

Устная хажаетет шпв ЭМИ СЕЧ

Для облучения использовали генератор качающейся частоты Я2Р-76/2 с диапазоном частот 8,15-18 ГГц и периодом перестройки 1мсек. Средняя плотность потока энергии в зоне опытного образца была 1мхВт/смг. Эксперименты проводили в специально сконструированном термостате (Рис. 1). Он состоял из двух камер, которые были отделены друг от друга непроницаемым для ЭМИ СВЧ экраном. Опытный образец находился под рупором антенны (25x34см) на расстоянии 80см от объекта. Аэрация обоих образцов осуществлялась с использованием общей механической качалки, помещенной на дно термостата. Режим экспозиции и периодичность отбора

проб указана в тексте Для стандартизации условий мощность электромагнитного излучения регулярно тестировали. Центр облучаемого флакона фиксировали на платформе, в которой средняя плотность потока энергии составляла ХмхВт/см2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние ЭМИ СВЧ на динамику роста клеток Е.соИ

Так как имеющиеся в литературе данные о влиянии МП и ЭМИ на рост бактериальной культуры исключительно противоречивы (см. выше), вначале было исследовано влияние ЭМИ СВЧ на динамику роста использованных в работе штаммов На Рис. 2 показаны полученные зависимости оптической плотности клеточной суспензии от времени культивирования. Для штамма 7/3110 наблюдалось небольшое снижение скорости роста на ранней экспоненциальной фазе, но перед выходом на стационар, наоборот, было обнаружено некоторое опережение в росте опытной культуры. Для клеток ЭМИ СВЧ оказалось стимулирующим. Небольшое подавление (~Э%) наблюдалось только в одном эксперименте в течение первого часа экспозиции. Это значит, что противоречия в литературных данных можно объяснять не только различиями в физических характеристиках излучений, но и свойствами использованных штаммов. Важно, что в обоих случаях излучение способствовало опережающему выходу клеток на стационар.

Время роста (мня)

Рис. 2. Вдмние электромагнитного поля па рост клеток Е.соЬ ФЗ110 [А] и Е.сок W12 [В] при 37°С. Оптическая плотность на разных стадиях роста представлена в процентах к максимальному значению и усреднена по трем экспериментам. Сплошной линией обозначены кривые роста контрольной культуры, пувггпрпой - кривые роста культуры, подвергнутой действию ЭМИ СВЧ

2. Влияние ЭМИ СВЧ на спектр растворимых белков, содержащихся в лнзате клеток Е. соН.

Несмотря на слабо выраженный ответ на ЭМИ СВЧ у штамма 'ЧУЗ! 10, его бимодапьность можно было рассматривать, как свидетельство адаптация

клеток к неблагоприятному, но не деструктивному воздействию. Если это так, то излучение могло вызвать специфические изменения в спектре белков, содержащихся в бактериальных клетках, причем эти изменения должны были появиться уже иа стадии угнетенного роста. Для проверки этого предположения из клеток E.coh W3110, подвергнутых двух-, трех-, четырех-и пятичасовому воздействию ЭМИ, был получен суммарный экстракт растворимых белков. Эти белки были сопоставлены с контрольными образцами методом SDS-электрофореза в 15% ПЛАТ Для трех полипептидов с молекулярными массами (MW) порядка 90, 35 и 31Ша уже во время угнетенного роста наблюдалось некоторое увеличение во внутриклеточном содержании. Менее выраженная, но такая же тенденция была обнаружена и для белков с массой ~70 и ~38kDa. Т.е., ЭМИ СВЧ, не приводя к глобальным изменениям, влияет на спектр экстрагированных белков. Это согласуется с возможностью существования у кишечной палочки системы адаптивного ответа на электромагнитное излучение, но обнаруженные изменения были выражены очень слабо, что могло быть следствием поглощения части энергии электромагнитной волны раствором или отражения ее пластиковой стенкой флакона. Поэтому была поставлена серия опытов, в которой действию ЭМИ СВЧ подвергали колонии клеток, растущих в открытых чашках Этот способ, однако, не привел к усилению регистрируемых изменений. Стало ясно, что стенка флакона не является серьезным препятствием для электромагнитной волны. Поэтому во всех последующих экспериментах работали с клетками, растущими в зяидкой среде.

Полосы, соответствующие молекулярной массе ~70 и ~32kDa, в принципе, могли относиться к белкам теплового шока, шаперону DnaK (68,9kDa) и о32 (32.3kDa), индукция которых МП была зарегистрирована ранее [Chow, Tung 2000; Li, Chow 2001; Del Rectal. 2006; Cairo et al., 1998]. Для оценки такой вероятности, в следующей серии опытов было изучено влияние ЭМИ СВЧ на спектр белков, синтезируемых в клетках обоих штаммов при пониженной (30°С) температуре, а время эхепозиции варьировали от 5 до 110 мин. В таких условиях для теплового шока температура, по крайней мере локально, должна повыситься на 121радусов, что невероятно. Увеличение интенсивности всех перечисленных выше белковых полос было обнаружено увв после 5- 20-минутной экспозиции (Рис 3). Эхо свидетельствует против того, что зарегистрированные изменения опосредованы тепловым воздействием ЭМИ СВЧ. Полипептиды, содержание которых изменялось под действием ЭМИ, оказались одинаковыми для клеток Ecoli W12 и W3110, поэтому в дальнейшем работали только со штаммом W3110. Причем до экспозиции ЭМИ клетки растили до поздней стационарной фазы, что обеспечило стандартные условия во всех экспериментах. ■

Клнф. ЭМИ

м 1 ь и ь

тоа > 67k.DK > .

«кГм >

ЗОкПв > £

■ |

.... ■

\

20кОл > Коаграль ЭМИ СВЧ

I

Рже. 3 Элеггрофореграмиы растворимой фрахцаи белков, павучевных из сумшрного лизата клегм Е. соЧ выращенных ва среде ЬВ при тешкратуре 30°С. М-мвркеры имдасумрного веса; ■ и Ь - контрольные к опытные образцы, экспонированные ЭМИ СВЧ 5 и 20 мин, соответственно

Э. Апалм растворимых белком Е.соИ методом двумерного электрофорез*

Отсутствие глобальных изменений во фракции экстрагированных белков и ограниченность числа полипептидов с измененным содержанием в клетках позволяли надеяться на возможность идентифмкацви рсашрующеи на ЭМИ СВЧ регуляторной системы Е.соИ. Поэтому на следующем этапе белки, присутствующие в лнзатах опытных и контрольных культур, были исследованы методом двумерного электрофореза (Рис. 4).

В экстрактах белков, полученных из экспонированных ЭМИ клеток, было обнаружено ожидаемое увеличение концентрации двух полипептндов с молекулярной массой ~90к0а; одного или двух белков с М1рУ ~70Ша, а также полкпептидов с М\гУ -42, ~35 и ~Э2Ша. Кроме этого, наблюдается интенсификация двух пятен в области ~31-30Ша, одного пятна с МУ^ ~18Ша и снижение в содержании нескольких белков, в том числе, полипептидов с М\У >50 кОа и ЗбкОа. Нам не удалось обнаружить значительной интенсификации пятен, по и нзоэдеггрической точке (ХР) соответствующих о38 (37.8Ша, 4.7). А для полипептнда, близкого по параметрам к а-субьединице РНК-долимеразы (Зб.4Ша, 4.78), вместо ожидаемого по литературным данным [Скнккшш й а1. 1994) увеличения биосинтеза, в клетках, подвергнутых ЭМИ СВЧ, мы, наоборот, наблюдали его уменьшение. И хота это еще не означает, что именно а-су&ьединицей, а не каким-то другим белком, близким к ней по МТгУ и 1Р, обусловлено это уменьшение, такая вероятность велика, так как а является одним из мажорных белков у Е.со0, а вблизи предполагаемой области ее

[А} Контрольные клетки

94600 ' 66200 • 45000 '

31000

4.5 РН 7.0

[В] Клетки, подвергнутые действию ЭМИ СВЧ

94600 -66200 ■ 45000 •

31000 ■

4.5 plf \ 7.0

I >

I *

[С] Прогретые клетки

31000

Рже. 4. Результаты анализа фршдаи растворимых бел tos, экстрагированных из клеток Е. coli Will0, осгвноалениых через 16 часов после иячшга досубащщ [А]; подвергнутых действию ЭМИ СВЧ в течение аоспедяего чеса fB1 или температурвочу слогу (47°С) в течеша последних 30 «инут [С]. Г едя окрашены питратои серебра. Слева приведена кшшйрима uü MW. Внизу rejsdt угазава развертка по pH. Дяж сопоставлена* электрофорараша белыми цифрами ктюиуиероьвЕЫ одянакашс

полипгатнды. Стрелками па панели [AJ указаны поляпептнды, содержание iorapbs* иод действием ЭМИ СВЧ умеиъгаа<?гс*. Стрелками на пмели (В] указаны подйпептцда, соДержвнге которых иод действие* ЭМИ СВЧ увеличивается . Стрелками на нанелв {С] указаны псипшептиды, содержание которых увеличиваете* в уьдови** теплового шока.

миграции есть только одно большое пятно, интенсивность которого тоже снижается. В любом случае, задачей следующего этапа стала идентификация белков с измененной экспрессией в опыт' иых образцах.

4. Предварительная шдентяфш-хаиня белков, потенциально реагируют« и* ЭМИ СВЧ.

В «акте длд решения этой задачи можно использовать три подхода;

1. Определять ¡Ч-кшщевые последов агельности пояипептидов с измененным содержанием во фракции растворимых белков.

2. Провести иммуноблотпшг с помощью специфических антител

3. Используя PCR в реальном времени сравнить уровень экспрессии соответствующих генов в клетках контрольных и опытных образцов.

Два последних метода позволяют ответить на вопрос, изменяется ли в клетках содержание конкретного белка или мРНК. Они подходят для проверки предположений, сделанных на основании каких-то других данных Первый метод можно использовать только для пошптептидов, которые мигрируют в «незаселенной» или «слабозаселенной» области, а также после дополнительного фракционирования. В противном случае, в перенесенном на мембрану пятне окажется несколько полипегогидов, причем искомым, зависящим от ЭМИ, совсем не обязательно окажется наиболее представленный. Для Е coli достаточно полную информацию о том, какого типа полипептиды могут мигрировать в пятнах с измененной интенсивностью, можно получить в соответствующих базах данных. Качество разделения белков в условиях двухмерного электрофореза позволяло достаточно точно определить величину молекулярной массы и изоэлекгрнческой точки. Поэтому была предпринята попытка выявил, наиболее перспективные для дальнейшего анализа белки, используя базу данных Colibn (http'/genolist.pasteur fi/ColibriГ)

Таблица 1. Гены, кодирующие белки с 18.1<MW<19JbDa и 5.6<1Р<6.2

гея MW (Юа) 1P Фупкетспглыия принадлежность кодируемого бежа Нала-та я тип промотора Доля мРНК в суммарной фракции ГПК El стационарной фззе(%) Ншяхпхе ПрОЦЕПТПОГО СОДерЕЛПЕЭ mFHK оря переходе к стя-циопврвов фазе

dps 1&55 565 Регулятор траяежршщии Хелзтор келста о70, о3» 0.116 7Л6

fabA 1&83 613 Дегидратаза о70 0013 032

hstV 18.95 5.94 Белок теплового шока а° 0016 197

moaB 1852 567 Фермент биосинтеза о™ 0009 145

rsd 18.10 5 59 Анти б70-фак1ор о70,0м 001 2.73

ш 18 TO 5£9 Акцептор нуклеотидов 0.026 0.3

ybjP 1JUS5 606 Функция неизвестна 0.(Ш 122

ydsS 1BJB0 571 Белок адгезии 0.023 041

yidF 1904 582 Регулятор транскрипции 029

yncA 19.10 5.85 Ацегшггрансфераза 0.047 0 51

zur 1911 ssrt Рехулкгор транскрипции аозз 058

Анализ был проведен для всех 11 полипептидов, отмеченных на Рис. 4А и 4В. Результат для одного из них приведен в Таблице 1, Он имеет расчетную молекулярную массу 18.7Ы5а и теряет заряд при рН б, В геноме Е.соН только 11 генов кодируют белки, отличающиеся от расчетного не более чем на 3%, а от расчетной 1Р на 0.3 единицы. Среди них может быть ген, кодирующий интересующий нас белок. Ддя выбора наиболее вероятных кандидатов было использовано 4 критерия. Понятно, что искомый белок должен иметь М1^ и 1Р, максимально близкие к расчетным. Наиболее соответствующие по этим параметрам кандидаты отмечены жирным шрифтом во втором и третьем столбцах Таблицы !. Кроме этого, концентрация белка в клетке должна быть достаточной для его обнаружения на геле. Так как у нас не было данных о процентном содержании всех белков в стационарно растущих клетках, в качестве параметра, характеризующего их продукцию, использовали процентное содержание соответствующих мРНК [КеН^ег « а]. 2000]. В пятом столбце отмечены кандидаты, содержание мРНК которых выше среднего (0.022%). Так как подвергнутые действию ЭМИ СВЧ клетки переходили к стационарному росту раньше, чем контрольные, четвертым критерием был факт индукции генной экспрессии при переходе К стационарному росту (ХеНт^ег е1 а1. 2000]. Перспективными кандидатами считали такие, которые отбирались хотя бы по двум критериям.

23 Транспорт ыутияшацил Дг * С Й Прецессии.- ,ТНК и РНК П Ё2АРегул*мири

( ,V "Г __^

Мембранные белки \ ¡^

Функция не шеестна [ ЙЗ

Ферменты |

20 в IV 4о П ¡- >|пи» годержинж-

Рвс, 5. Процентное содержание генов разных категорий я геаоме (слева) в среди оюбранных кандидатов (справа).

Общее число белков, мигрирующих в анализируемых участках геяя, составляет 193. Среди них наиболее вероятными кандидатами являются 58 белков. Их распределение но функциям показано на Рис 5. Процентное содержание ферментов среди них оказалось приблизительно таким же, как в геноме. Регуляторов транскрипции и белков процессинга нуклеиновых кислот - немного больше, а мембранных белков, наоборот, меньше, что «ожег быть следствием анализа фракции растворимых беиков. Неожиданно мы обнаружили, что среди отобранных кандидатов непропорционально много белков транспорта и утилизации ионов железа. По формальным критериям оказались отобранными 5 из 2] полипептидов, мигрирующих в анализируемой области геля. Кроме этого, в Таблице 1 и пяти других

оказались гсяы, транскрибируемые с участием о38 (пятый столбец), а в четырех таблицах - гены, кодирующие белки теплового шока. Это указывало на необходимость детальной проверки регулонов <г® и о30. Поэтому на следующем этапе сравнили растворимые фракции белков, полученных из клеток, подвергнутых ЭМИ СВЧ и нагреванию (Рис. 4В и 4С).

Температурный шок во всех случаях приводил к очень большим изменениям во фракции растворимых белков, но ае вызывал интенсификации пятен, соответствующих белкам с MW -90 kDa. Самые большие изменения наблюдались для полипептидов, теряющих заряд при кислых рН. В области 70kDa среди них есть пятно, интенсифицируемое ЭМИ СВЧ (1Р=5.2), а также пятно, более соответствующее расчетной ГР (4.64) для DnaK (Colibri). Так как расчетная IP может отличаться от настоящей, а из литературы было известно об индукции МП синтеза DnaK, была проведена серия экспериментов с использованием монокл овальных антител к HSP70. Результат одного из таких опытов показан на Рис. 6. В этих экспериментах растущие клетки разделяли на три части. Первую часть оставляли при 37° н использовали в качестве контроля, вторую подвергали бО минутному действию ЭМИ СВЧ, а третью нагревали 30 минут при 47°С. Видно, что нагревание клеток, приводит к явной интенсификации полосы в области 70kDa. Под действием ЭМИ содержание DnaK в образцах тоже увеличивалось, хотя это увеличение было гораздо меньше, чем а случае температурного шока.

Рис, 6. Результат имиуноблотошта фракция рветворимыг полипептидов, получеяннх ta клеток, остановленных на стационарной фазе рост л подвергнуты* действ во ЭМИ СВЧ или нагреванию. Каждый ич образцов был получен из I мл клеточной суспенаки и пшшостъю нанесен sa гель.

5. Зависимость экспрессии генов от ЭМИ СВЧ.

Увеличение биосинтеза DnaK согласуется с литературными данными и косвенно указывает ва возможность индукции ЭМИ СВЧ регулона теплового шока, то* как синтез ЖшК-мРНК начинается с промоторов, распознаваемых специфичной для этого регулона О33. С помощью метода количественной PCR и геноспецифнческих прайм еров была исследована зависимость огс ЭМИ СВЧ экспрессии гена граН (кодирует о31). Для этого из контрольных и опытных культур была получена суммарная фракция клеточных РНК. С использованием встречного праймера (rpoHJorw) были получены ДНК-копии гроН-мРНК, а амплификацию (ожидаемая длина продуктов - 108 п.н.) проводили с использованием гграймеров гроН jorw и rpoH_rev, За накоплением ашшпеонов в реальном времени следили по

^70 кДи

увеличению эмиссии SYBR green I (Рис, 7А), Эти а следующие эксперименты были выполнены с использованием трех независимо полученных препаратов РНК, а в каждом эксперименте делали три повтора с разным разведением матрицы. В качестве позитивного контроля использовали пробы, содержащие ДНК, а в качестве негативного - пробы, содержащие РНК, проведенные через реакцию обратной транскрипции без добавления ревертазы. Во всех случаях полученные продукты анализировали алектрофорегичесхи с тем, чтобы исключить возможность регистрации сига ада неспецифического синтеза или димеризацяи прайм еров (Рис. 7С). Дря каждого гена подбор условий осуществляли индивидуально.

/Л) filKIKininfГЬ фл}йрс*нс*«п KAHILI* FAM 01 Лй4*|>я ЦИК.IM

X 1*1

IB)

. till

; îoo

I

ICI

141

I il?

ТВ

k.Ulk IHK

5 S

__ с.

£ i

~ Л 4 M

Ml IM 7*

Ряс. 7. Результаты кишздетвевной PCR дгас гоня троН. [А]: Зависимость флуоресценции ort числа цтшов для но «рольного (сплошнм днвяи) н опшного (пунггнр) образцов. [В): Усредненный результат по всем экспериментам (серый стголбик). Нормирояаявде число ймшшховов дл* контрольных образцов принято за 100% (белый столбик); [С]: Контроль «ЛеЦифячнос«! PCR (показаны продукта, полученные с кДНК. ДНК (¡ютятнаяый контроль) н РНК {нег#гнаный контроль).

Данные, показанные на Рис. 7В, однозначно свидетельствуют о негативном влиянии ЭМИ СВЧ на экспрессию гена троН. Это предполагает снижение, а не увеличение транскрипции гена dnaK, xont биосинтез белка увеличивался (Рис. 6). Поэтому на следующем этапе аналогичным образом бшш исследована зависимость от излучения экспрессии гена dnaK. Оказалось, что под воздействием ЭМИ СВЧ концентрация шаперонной мРНК в суммарной фракции РНК падает до 13.7*6.7% (р<0.00003). С учетом данных, представленных на Рис. 6, это указывало на наличие регуляторных механизмов, действующих без участия о32.

Так как мРНК гена dnaK очень нестабильна (время нолужизни составляет всего 2-3 минуты) бьша предпринята попытка поиска регуля торного механизма, способного повлиять на ее стабильность. Такую функцию, в частности, могут выполнять антисмысловые РНК (аРНК), синтезируемые с кодирующего участка этого гена. Для синтеза аРНК нужны промоторы. Поэтому с использованием компьютерной программы PLatProm в кодирующей области dnaK был осуществлен поиск возможных промоторов, и в коше гена были найдены две потенциальные точки инициации антисмысловой транскрипции (PI и Р2 на Ряс. 8). Для того, чтобы проверить, присутствуют ли в препаратах РНК, выделенных из клеток E.coli,

ожидаемые аРНК, ДНК-копии были независимо получены с использованием праймеров (ЬшК^от и (¡паК геу (см. Рис. 8), а затем в реакцию добавляли встречный прайыер и следили за накоплением амплнконов.

2 10

I

В -8

1,

я В а

с

уаэ/

оп,'.:

¿паК_Гоп*

1—Г

Р1

Р2

12*00

150«

Пшнции ав гене™ческой карте

Рне. 8. Результаты яонска промоторов вблизи оперона ЗлоК-бла]. Расположение в длина гонов не генетический карте указаны чержьши нрямоугапьнюсами выше (для ЛлаК и ЛпаТ) в ниже (да* гига уааГ) оси X. Стгшбикаыи показано расположение промоторов, найденных программой Р1асР(ого- Стрелками указано направление синтеза РНК.

На Рис. 9 в качестве примера показан один из трех таких экспериментов. Они однозначно свидетельствуют о том, что аРНК с кодирующей части гена АпаК синтезируется. Во всех случаях было зарегистрировано большее число мРНК, чем аРНК Под действием ЭМИ СВЧ содержание аРНК увеличивалось, но количественно оценить это увеличение не удалось, т.к. в двух из трех экспериментов аРНК в препаратах контрольных клеток вообще не детектировалась.

кЛПК'

[>ць; «РНК •>■'! 1К

Рис. 9. Результаты РСЯ-аканяза РНК-продуктов, синтезируемых с кодирующей последовательности гена длаК. Показаны шплнконы, полученные с ДНК-колий мРНК и аРНК, а также с ДНК позитивный контроль) в РНК (негативный контроль).

Таким образом, под действием ЭМИ СВЧ, так же, как под действием МП, в клетках Е.соИ увеличивается содержание шаперона ОоаК. Это увеличение нельзя объяснить индукцией регулона теплового шока, так как экспрессия гена гроН в клетках, подвергнутых ЭМИ СВЧ, снижается, но можно объяснить стабилизацией ЛюЯ-мРНК за счет увеличенного синтеза аРНК. В

целом, полученные данные свидетельствуют против тепловой природы оказываемою ЭМИ СВЧ воздействия

Кривые, представлепные на Рис. 2„ демонстрируют опережающий переход подвергнутых действию ЭМИ СВЧ клеточных популяций к стационарному росту. Так как переход к стационарной фазе сопровождается переключением транскрипции с промоторов, распознаваемых о70, на промоторы сг18, а в литературе имеются данные об активации МП опосредованной 0м транскрипции [Shoda et al„ 1999; Okuno et aL 2001], было исследовало влияние ЭМИ СВЧ на экспрессию гена троЗ, кодирующего ом. Зарегистрирована очень небольшая (137±44%), но достоверная активация транскрипции этого гена (Рис. 10). Так как до облучения анализируемые культуры уже находились на стационарной фазе, такая активация может свидетельствовать о том, что под действием излучения клетки нуждаются в дополнительной стабилизации оптимального дня сложившихся условий режима роста. Если это верно, то действие ЭМИ СВЧ должно отражаться и на экспрессии генов, зависящих от о". Поэтому было исследовано влияние ЭМИ СВЧ на экспрессию гена dps, который имеет промотор, узнаваемый о5*.

Ряс, 10. Влияние ЭМИ СВЧ «м экспрессию гсаоа rpoS, dps, hits, грев и гроА. Усредненное по воем опытам содержание тестируемых мРНК ■ препаратах РГЖ, полученных из подвергнутых действию ЭМИ СВЧ клеток приведено в процентах к их содержащие в контрольны! образцах.

ШНТ. rpoS

гроА граВ

Оказалось, что излучение стимулирует транскрипцию этта-о гена (Рис. 10), что очень важно, так как Dps является мажорным белком нуклеоида во время стационарного роста и своеобразным маркером этого состояния клеточной популяции. Это позволило нам предположить, что в адаптации клеток к ЭМИ СВЧ задействована типичная для стационарного роста защитная система клеток, а не какая-то другая регуляторкая система, реализующаяся с участием О*18- Поэтому на следующем этапе было исследовано влияние излучения на экспрессию генов, которые не содержат промоторов для с38, но реагируют на переход к стационарному росту. В качестве таких генов были выбраны kns - он кодирует типичный для эксв оненшальной фазы белок пуклеоида, а также гроА и гроВ, кодирующие а- и р т субъедигощы РНК-полимеразы. Экспрессия всех этих генов нрн выходе на стационар должна снижаться. Именно такого типа изменения и были зарегистрированы для

всех трех генов (Рис 10). Следует отметить, что уменьшение эффективности экспрессии гена гроА противоречит данным Гудмана и соавторов [1994], полученным при облучении клеток магнитным полем. Это противоречие, тем не менее, не следует рассматривать как принципиальное, так как воздействию МП подвергали экспоненциально растущие клетки, а действию ЭМИ СВЧ - клетки, находящиеся в фазе стационарного роста. Внутриклеточная концентрация а-субъединицы зависит от фазы роста, уменьшаясь прн переходе к стационарной фазе. В свободном состоянии она формирует димеры, способные взаимодействовать с ДНК. Благодаря этому днмер а входит в состав нуклеоида, компактность которого по литературным данным [Shcheglov et al 2002] и белковый состав по нашим данным (см. результат анализа генов dps и hns на Рис 10) зависят от излучения. Кроме того, и то, и другое зависит от фазы роста. Не исключено, поэтому, что разные изменения в экспрессии гена гроА во время логарифмического н стационарного роста являются следствием этих перестроек генома.

Так как уменьшение во внутриклеточном содержании белковых и РНК-продуктов генов гроА, гроВ, гроН и hns, а также увеличение экспрессии генов dps н rpoS, характерно для перехода к стационарному росту, мы считаем, что под дзйствпем ЭМИ СВЧ включается регулсторшш система, стаЗплшпруюшая резким стационарного роста клеточной популяции.

Одно из наиболее интересных предположений, сделанных в результате анализа двумерных электрофореграмм, заключалось в том, что ЭМИ СВЧ может влиять на систему транспорта нонов железа. Кластеры ионов железа, формирующиеся, например, внутри додехамера Dps, благодаря своим ферромагнитным свойствам, теоретически, могут быть первичными сенсорами электромагнитного излучения. Основным регулятором транскрипции генов, кодирующих белки транспорта и утилизации ионов железа, является белок Fur. Но достоверного различия в уровне экспрессии гена fur зарегистрировать не удалось (Рис 11) Это, тем не менее, не исключает участия самой системы транспорта ионов железа в адаптивном ответе клеток, так как регулятором транскрипции является не свободный Риг, а комплекс этого белка с Fe2*. Связываясь с промоторами, этот комплекс в абсолютном большинстве случаев ингибирует транскрипцию зависящих от него генов. Недостаток или избыток Fe+ в клеши сдвигает равновесие между свободным Fur и его комплексом с Fe24. Это, а не измененная эффективность синтеза репрессора, влияет на транскрипцию контролируемых генов. Неопределенный результат, полученный для fur, побудил нас исследовать влияние ЭМИ СВЧ на экспрессию гена fes, находящегося под негативным контролем Fur. Он кодирует энтерохолин-эстеразу, т.е. белок, освобождающий ионы Fe2* из комплекса с энтеробактином. Белковый продукт этого гена был отобран среди 58 наиболее вероятных кандидатов, синтез которых в подвергнутых ЭМИ СВЧ клетках может увеличиваться. Полученные результаты (Рис. 11) также

свидетельствуют о позитивном влиянии ЭМИ на синтез /¿í-mPHK, хотя их надежность находится на пределе достоверности. Из-за этого был протестирован еще один ген - fepA, Он транскрибируется дивергентно гену fes с общей ре1"уляторной области и кодирует рецептор для транспортеров ионов железа. Полученные результаты свидетельствуют о противоположном влиянии ЭМИ на синтез fes- и/еМ-мРНК, как оно и должно быть, так как промоторы этих генов перекрываются, и активация одного гена, теоретически, должна приводить к ингибированию соседнего, Разнокаправлеиность влияния ЭМИ СВЧ на синтез fes- и /ерА-мРНК свидетельствует против участия Fur в обусловленном излучением изменении экспрессии этих генов, так как для обоих генов Fur является репрессором. Синтез РНК с этих генов зависит от активаторов cÀMP-CRP и FNK [Regulon htfp;//regulondb,ccg.unarn,mx/]. Кроме этого, транскрипцию с гена Jes могут ингибнровать свободные димеры а-субъединицы РНК-полимеразы [Purtov et al 2005], снижение внутриклеточного содержания которых, в принципе, объясняет активацию синтеза /èî-mPHK h связанное с этим ингибирование транскрипции fepA. Т.е., экспрессия, по крайней мере, трех генов, кодирующих белки транспорт а я утилизации железа (dps, fes и fepA), тваскт от ЭМИ СВЧ

Рнс. 11, Влияние ЭМИ СВЧ на экспрессию генов fur, fes и /ерА. Усредненное по всем онытам содержание тестируемых м РНК в препаратах РНК, полученных из подвергнутых действию ЭМИ СВЧ клеток, приведено в ¡ipoцентах к их содержанию в

контрольных образцах.

50!)

s m

8

S, 3fifi

I

I

I 100

far

№

EÉÜ1

fepA

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью этой работы был поиск внутриклеточных систем, способных реагировать на воздействие ЭМИ СВЧ, В результате проделанной работы мы исключили возможность тепловых эффектов как факторов, влияющих на ретужггориый системы клеток, и предлагаем гипотетическую модель, объясняющую обнаруженные изменения (Рис. 12). Помимо наших данных, эта модель базируется на том, что белковый продукт одного из исследованных нами .геном, Dps, выполняет в клепке три разные функции. В виде додекамера ои является мажорным белком 1гукяеоида во время стационарного роста. Не связанный с ДНК Dps взаимодействует с

Í9

двухвалентным железом, окисляет его до трехвалентного и накапливает до 500 ионов трех- и, по-видимому, двухвалентного железа в виде кора.

Рве. 12. Гипотетическая модель рецепции ЭМИ СВЧ бактериальной клеткой.

• Мы считаем, что комплекс (Fe^wi(XriDps) 12 может быть нервичлой мишенью электромагнитного излучения, и предполагаем, что излучение стабилизирует его структуру.

• Стабилизация металлоцротеияового комплекса неизбежно должна привести к диссоциации часта додекамеров Dps с ДНК, т.е. частично перевести нуклеоид в состояние, характерное для интенсивной транскрипции, что не соответствует уже сложившимся условиям роста.

• Дня того, чтобы восстановить нарушенное равновесие, в клетке включаются стандартные ком пенса горн we механизмы, типичные для стационарного роста, которые ограничивают интенсивность транскрипции и энергоемкий биосинтез до оптимального уровня. В эту программу входит: повышение уровня транскрипции гена rpoS; обусловленное этим повышение синтеза мР1П£ гена dps; снижение продукции белков транскрипционного, трансляционного и реплихатнвиого аппарата, включая TtpoA, RpoB И RpoH, а также

дифференцированное изменение в экспрессии других белков нуклеоида, в частности, H-NS.

• Уменьшение концентрации 0м (ген гроН) закономерно приводит к снижению уровня dnaK-uPHK, но так как этот шаперон нужен клетке во время стационарного роста, востребованными становятся механизмы поспрапскрипцяошгой регуляции, одним из которых может быть стабилизация мРНК антнсмысловым РНК-продуктом.

• Репрессор генов, кодирующих белки транспорта и утилизации ионов железа, Fur, может, по-видимому, совсем не участвовать в адаптивном ответе, так как наблюдаемые изменения во внутриклеточном содержании fes- и/ерЛ-мРНК противоположны и объясняются снижением продукции свободных димеров а-субъеднницы РНК-полимеразы, которая может ингибироватъ транскрипцию гена fes. Т.е изменения в синтез с fes- и fepA-мРНК могут быть побочным эффектом компенсаторного механизма, ограничивающего продукцию белков транскрипционного аппарата

Эта модель непротиворечиво объясняет все результаты, полученные для стационарно растущих клеток. Она основывается на особых свойствах Dps и предполагает, что первичной мишенью ЭМИ СВЧ является металло-белковый комплехс, а не какие-то более сложные клеточные системы.

Выводы

1. Электромагнитное поле переменной частоты (8,15-18 ГГц) и низкой интенсивности (1 мкВт/см2) влияет на рост клеток E.colt, способствуя более быстрому выходу на стационарную фазу. ЭМИ СВЧ пе вызывает глобальных изменений в спектре синтезируемых в клетке белков, но влияет на экспрессию ряда генов

2. Экспозиция стационарно растущих клеток ЭМИ СВЧ приводит к таким изменениям в экспрессии генов rpoS, гроН, rpoA, rpoB, dps, hns и fepA, которые характерны для перехода к стационарной фазе. Это указывает на то, что популяция подвергнутых излучению клеток нуждается в дополнительной стабилизации ресурсосберегающего режима.

3. Под действием ЭМИ СВЧ снижается внутриклеточное содержание мРНК генов гроН и dnaK Это свидетельствует против индукции излучением регулона температурного шока и против тепловой природа оказываемого воздействия Зарегистрировано позитивное влияние ЭМИ СВЧ на синтез шаперона DnaK (белковый продукт гена dnaK), которое предполагает наличие рзгуляторпого механизма, действующего на посттранскрипционном уровне.

4. ЭМИ СВЧ влияет на эхспрессшо генов fepA,fes и dps, кодирующих белки транспорта и утилизации ионов железа. Характер обнаруженных изменений предполагает ограничение транспорта Fe внутрь клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статья

1. Антипов С С.. Озолинь О Н., Фесенко Е Е, «Облучение клеток Escherichta coli ЭМИ СВЧ низкой интенсивности влияет на спектр синтезируемых беклков» //Биофизика, Т.50, стр.: S30-35,2005;

2. Brock-Volchansfa A S, Purtov УшА., Lukyanov V.l., Kostyanicina E.G., Antipov S.S.. Deev A.A., Ozokne O.N. «Mapping of potentially transcribed regions in the genome of Ecoli by new promoter-search algorithm».// Bioinformatics of genome regulation and structure, v 1, pp 42-45,2004;

Тезисы докладов

3. Антипов C.C. «Влияние ЭМИ СВЧ низкой интенсивности на метаболизм E.coh». Сборник тезисов конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва 9-12 февраля 2004;

4. Озолинь OJH., Брок-Волчанский АС., Пургов ЮА., Лукьянов В.И, Костяницина Е Г, Антипов С С.. Деев АА «Картирование регуляторных участков в геноме Kcolb Сборник тезисов конференции «Постгеномная эра в в биологии и биотехнологии». Казань 17-18 июля 2004;

5. Озолинь О.Н., Брок-Волчанский A.C., Пуртов Ю.А., Лукьянов В.И., Костяницина Е Г, Антипов С.С.. Деев А А. «Картирование регуляторных участков в геноме E.coh» Ш съезд биофизиков России, Воронеж 24-29 июля 2004,

6. Антипов С.С. «Сопоставление спектра экспрессируемых белков E.coh в условиях теплового шока и облучения ЭМИ СВЧ низкой интенсивности». Сборник тезисов конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва 7-10 февраля 2005;

7. Антипов С.С. «Адаптивный ответ клеток Е coli на воздействие ЭМИ СВЧ низкой интенсивности» Сборник тезисов конференции «Биология - наука XXI века». Пущино 18-22 апреля 2005;

8. Антипов С.С «Облучение клеток Escherichia coli ЭМИ СВЧ не вызывая глобальных изменений клеточного метаболизма влияет на экспрессию генов». Сборник тезисов конференции «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва 4-8 февраля 2007.

Отпечатано: ИПА. А. Кулаков, г. Серпухов, Борисовское шоссе, 18, тел.: 8-915-200-86-98, 39-11-20 Подписано в печатъ:20.04.2007 г. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антипов, Сергей Сергеевич

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ИЗЛУЧЕНИЙ (обзор литературы)

Физические характеристики электромагнитных полей

Теоретические модели рецепции ЭМИ и проблема кТ

Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты ^

Современные представления о влиянии ЭМИ на метаболизм Е.соИ

Регуляторные системы клеток Е.соИ, потенциально задействованные в рецепции ЭМИ СВЧ.

Регуляторные системы бактериальной клетки, влияющие на синтез <т

Регулон температурного шока и механизмы регуляции биосинтеза а32.

Механизм экспрессии а-субъединицы РНК-полимеразы и ]ЧиэА.

Белки нуклеоида.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние ЭМИ СВЧ на регуляторные системы Escherichia coli"

Неотъемлемой частью среды обитания любого организма является Магнитное ноле(МП) Земли и электромагнитное излучение (ЭМИ) Солнца. Вариации их интенсивности,обусловленные внешними или техногенными факторами, вызывают адантивную реакциюпрактически у всех живых организмов. Этим обусловлен интерес к детальному изучениюмеханизмов биотрошюго влияния электромагнитных излучений. Их воздействие набиологические объекты зависит от частоты и интенсивности, наличия и тина модуляции,от ноляризации излучения и режима экснозиции. Предложено несколько гипотез офизико-химических механизмах рецепции ЭМИ крайне высоких частот (более ЗОГГц сдлиной волны меньше 10мм). Доминирующей концепцией является представление об ихрезонансном поглощении биологическими системами. Однако излучения низкойинтенсивности, более длинноволнового диапазона, влияющие на многие биологическиепроцессы, имеют энергию кванта меньше чем 10' эВ. Это значительно ниже энергиитепловых колебаний (кТ=10'ЪВ). Поэтому механизм их влияния на клетки, в целом,остается малононятным, хотя и сама «проблема кТ» также требует, по-видимому, болеестрогой формулировки [Бинги и др. 2006]. Так, помимо молекулярных мишеней, в клеткахмогут присутствовать относительно крупные частицы с макроскопическим магнитныммоментом, а взаимодействие биологического объекта с электромагнитным излучениемможет развиваться в отсутствие теплового равновесия и иметь многоквантовый характер[Бинги и др. 2006]. Очевидно, что для поиска первичных мишеней электромагнитноговоздействия нетепловой природы на клеточном и молекулярном уровнях проще всегоиспользовать одноклеточные микроорганизмы, реакция которых на МП и ЭМИ не можетбыть опосредована наиболее чувствительными к действию ЭМИ нервной и эндокриннойсистемами [Гапеев, Чемерис 2007]. Поэтому в качестве объектов исследования в даннойработе была использована кишечная налочка {Escherichia coli, E.coli), которая являетсяодним из наиболее изученных биологических объектов.Влияние МП и ЭМИ на метаболизм Е.соИ изучается с шестидесятых годов нрощлоговека, но полученные данные во многом нротиворечивы. Так, Веббом и Доддсом [1968]было установлено, что МП с частотой 136Гц и интенсивностью 7мкВт ингибируетделение клеток Е.соИ, не вызывая их гибели. Снижение скорости роста бактерий в МПбыло также зарегистрировано в работах [Strasak et al. 1998; 2002 (50Гц, 2.7-21.5mT);Ramon et al. 1981 (60 и 600Гц, 2mT) и Li et al. 2004 (пульсирующее МП, 62кГц, 160mT)].Однако по данным [Nascimento et al., 2003], МП (60Гц, интенсивность 5G), наоборот,приводило к повышению метаболизма глюкозы и, следовательно, к активации ростаклеток. Аналогичный эффект под действием ЭМИ СВЧ (3,07 ГГц) был обнаружен вработе [Anderstam et al., 1983]. Таким образом, данные о влиянии МП и ЭМИ на такуюинтегральную характеристику клеточной популяции как скорость роста неоднозначны.Совместно с предыдущими данными это указывает на то, что МП восприпимаетсяклеткой как стрессовый фактор, но методом двумерного электрофореза клеточных белковне удалось зарегистрировать индукции МП (5-100Гц, 10-14тТ) биосинтеза DnaK, а такжетаких белков, как RecA и UspA, которые продуцируются клеткой в различпыхнеблагоириятпых условиях роста [Nakasono, Saiki 2000]. Поэтому авторы последнейпубликации сделали вывод, что МП не является стрессовым фактором для Е.соИ. Таким образом, на сегодняшний день опубликовано довольно много работ,посвященных изучению реакции клеток Е.соИ на электромагнитные излучения.Имеющиеся данные фрагментарны, в больщинстве случаев нолучены на клетках,подвергнутых действию МП, и, зачастую, противоречивы. В какой-то степени этоотражает общую ситуацию в мапштобиологии, которая находится на стадии накопления иосмысления данных, необходимых для последующего концептуального моделирования.Очевидно, что наиболее нлодотворными на данном этапе могут оказаться новые подходы.Поэтому в данной работе для поиска регуляторной системы клетки, снецифическиреагирующей на ЭМИ СВЧ, был иснользован метод индивидуального тестированиягенной экснрессии с помощью PCR в реальном времени.ФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕЭЛЕКТРОМАГИИТИЫХ ИЗЛУЧЕНИЙ (обзор литературы)

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Антипов, Сергей Сергеевич

выводы

1. Электромагнитное поле переменной частоты (8,15-18 ГГц) и низкой интенсивности (1мкВт/см2) влияет на рост клеток E.coli, способствуя более быстрому выходу на стационарную фазу. ЭМИ СВЧ не вызывает глобальных изменений в спектре синтезируемых в клетке белков, но влияет на экспрессию ряда генов.

2. Экспозиция стационарно растущих клеток ЭМИ СВЧ приводит к таким изменениям в экспрессии генов rpoS, rpoH, rpoA, rpoB, dps, hns и fepA, которые характерны для перехода к стационарной фазе. Это указывает на то, что популяция подвергнутых излучению клеток нуждается в дополнительной стабилизации ресурсосберегающего режима.

3. Под действием ЭМИ СВЧ снижается внутриклеточное содержание мРНК генов гроН и dnaK. Это свидетельствует против индукции излучением регулона температурного шока и против тепловой природы оказываемого воздействия. Зарегистрировано позитивное влияние ЭМИ СВЧ на синтез шаперона DnaK (белковый продукт гена dnaK), которое предполагает наличие регуляторного механизма, действующего на посттранскрипционном уровне.

4. ЭМИ СВЧ влияет на экспрессию генов fepA,fes и dps, кодирующих белки транспорта и утилизации ионов железа. Характер обнаруженных изменений предполагает ограничение транспорта Fe2+ внутрь клетки.

Заключение

Главной целью работы был поиск внутриклеточных систем, способных реагировать на воздействие ЭМИ СВЧ. В качестве модельного объекта была выбрана кишечная палочка как наиболее изученный биологический объект. Тем не менее, анализ литературных данных показал, что реакция этого микроорганизма на МП и ЭМИ изучена фрагментарно, а полученные результаты во многом противоречивы. Поэтому работа была начата с изучения влияния ЭМИ СВЧ на самую интегральную характеристику клеточной популяции - динамику роста. Оказалось, что ЭМИ СВЧ влияет на рост использованных в работе бактериальных штаммов E.coli W12 и E.coli W3110. Несмотря на то, что это влияние оказалось немного отличающимся для двух штаммов, в обоих случаях наблюдался ускоренный переход клеток к стационарному росту. В случае E.coli W3110 был зарегистрирован бимодальный ответ клеточной популяции на воздействие ЭМИ СВЧ: уменьшение скорости роста на ранней и увеличение ее на средней логарифмической фазе роста. Это предполагало «включение» ЭМИ СВЧ какого-то адаптационного регуляторного механизма, обеспечивающего полноценный рост бактерий.

Для поиска реагирующей на ЭМИ СВЧ регуляторной системы в бактериальных клетках было исследовано влияние электромагнитного поля на спектр растворимых белков и эффективность экспрессии 10 генов. Выбор тестируемых генов был сделан с использованием результатов, полученных методом одномерного и двумерного электрофорезов фракции растворимых белков суммарного лизата клеток, и, в значительной степени, опирался на литературные данные. В результате проделанной работы мы исключили возможность тепловых эффектов как факторов, влияющих на регуляторные системы клеток, и предлагаем следующую модель, объясняющую обнаруженные изменения (Рис. 22). Помимо данных о влиянии ЭМИ СВЧ на экспрессию конкретных генов, эта модель базируется на том, что экспозиция стационарно растущих клеток ЭМИ СВЧ приводит к таким изменениям в их экспрессии, которые характерны для перехода к стационарной фазе, а также на том, что белковый продукт одного из генов с зависящей от ЭМИ СВЧ экспрессией (dps) выполняет в клетке три разные функции. В качестве додекамера он является мажорным белком нуклеоида во время стационарного роста. Не связанный с ДНК Dps взаимодействует с двухвалентным железом, окисляет его до трехвалентного и накапливает до 500 ионов трех- и, по-видимому, двухвалентного железа в виде кора.

1. Мы считаем, что комплекс (Fe3+)400-500 ионов - (Dps)i2 может быть первичной мишенью электромагнитного излучения, и предполагаем, что излучение стабилизирует его структуру.

2. Стабилизация металлопротеинового комплекса неизбежно должна привести к диссоциации части додекамеров Dps с ДНК, т.е. частично перевести нуклеоид в состояние, характерное для интенсивной транскрипции, что не соответствует уже сложившимся условиям роста.

3. Для того, чтобы восстановить нарушенное равновесие, в клетке включаются стандартные компенсаторные механизмы, типичные для перехода к стационарному росту, которые ограничивают интенсивность транскрипции и энергоемкий биосинтез до оптимального уровня. В эту программу входит: повышение уровня транскрипции гена rpoS; обусловленное этим повышение синтеза мРНК гена dps; снижение продукции белков транскрипционного, трансляционного и репликативного аппарата, включая RpoA, RpoB и RpoH, а также дифференцированное изменение в экспрессии других белков нуклеоида, в частности, уменьшение продукции H-NS.

4. Уменьшение концентрации ст (ген гроН) закономерно приводит к снижению уровня dnaK-uVWl, но так как этот шаперон нужен клетке во время стационарного роста (по данным [Selinger et al. 2000] содержание dnaK-wPWL на стационарной фазе в 3.4 раза больше, чем на экспоненциальной), востребованными становятся механизмы посттранскрипционной регуляции, одним из которых может быть стабилизация мРНК антисмысловым РНК-продуктом.

5. Репрессор генов, кодирующих белки транспорта и утилизации ионов железа, Fur, может, по-видимому, совсем не участвовать в адаптивном ответе, так как ЭМИ СВЧ не влияет на количество его мРНК в клетках, а наблюдаемые изменения во внутриклеточном содержании fes- и fepA-uVHK противоположны. Их относительное изменение можно объяснить снижением продукции свободных димеров а-субъединицы РНК-полимеразы, которая способна ингибировать транскрипцию гена fes. Т.е. изменения в синтезе fes- и /e/vl-мРНК могут быть побочным эффектом компенсаторного механизма, ограничивающего продукцию белков транскрипционного аппарата.

Рис. 23. Гипотетическая модель рецепции ЭМИ СВЧ бактериальной клеткой.

Эта модель непротиворечиво объясняет все результаты, полученные для стационарно растущих клеток. Она основывается на особых свойствах Dps и предполагает, что первичной мишенью ЭМИ СВЧ является металло-белковый комплекс, а не какие-то более сложные регуляторные системы клеток. Негативное влияние ЭМИ СВЧ на количество мРНК гена fepA и позитивное влияние излучения на количество мРНК гена dps, в случае, если синтез мРНК и соответствующих белков коррелируют между собой [Gygi et al. 1999], л , предполагает снижение в клетках концентрации свободных ионов Fe . Это снижение может быть следствием уменьшенного транспорта Fe2+ из внешней среды через рецептор FepA, а также повышенной эффективностью его окисления и депонирования додекамерами Dps.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антипов, Сергей Сергеевич, Пущино

1. Алешенков М.С. (1997.) Энергоинформационная безопасность человека и государства./ Алешенков М.С. Родионов Б.Н., Титов В.Б., Ярочкин В.И. М.: Паруса, -62 с.

2. Бецкий О.В. (2000.) Лечение электромагнитными полями / Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Лебедева H.H./ Биомедицинская радиоэлектроника. Т. 12, е.: 11-30.

3. Бинги В.Н. (1997.) Механизм магниточувствительного связывания ионов некоторыми белками. / Биофизика, Т.42, с.338-342.

4. Бинги В.Н. (2006.) Парадокс магнитобиологии: анализ и перспективы./ Бинги В.Н., Миляев В.А., Чернавский B.C., Рубин А.Б./ Биофизика. Т.51(3), с.:553-559.

5. Гапеев А.Б. (1993.) Действие непрерывного и модулированного ЭМИ КВЧ на клетки животных./ Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е., Храмов Р.Н./ ДАН. Т. 332, N 4., е.: 515-517.

6. Гапеев А.Б., Чемерис Н.К. (2007.) Механизмы биологического действия электромагнитного излучения крайне высоких частот на организменном уровне./ Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. Т. 5-7, в печати.

7. Давыдов Б. И. (1984.) Биологическое действие, нормирование и защита от электромагнитных излучений / Давыдов Б. И., Тихончук В. С., Антипов В. В. М:. Энергоатомиздат, - 176 с.

8. Девятков Н.Д. (1983.) Роль синхронизации в воздействии слабых электромагнитных сигналов миллиметрового диапазона волн на живые организмы. / Девятков Н.Д., Голант М.Б., Тагер A.C. / Биофизика. Т.28. №5., с.:895 - 896.

9. Жадин М.Н. (1996.) Действие магнитных полей на движение иона в макромолекуле: Теоретический анализ. / Биофизика. Т41, с.:832-850.

10. Илларионов В.Е. (1998.) Медицинские информационно-волновые технологии.- М.: ВЦ МК "Защита",-233с.

11. Исмаилов Э.Ш. (1985.) Биофизические действия СВЧ-излучений. М.: Энергоиздат,-156 с.

12. Лехтлаан-Тыниссон Н.П. (2004.) Эффект сверхслабых полей на культуры бактерий Escherichia coli и Staphylococcus aureus.! Лехтлаан-Тыниссон Н.П., Шапошникова Е.Б, Холмогоров В.Е./ Биофизика. -Т.49(3), е.: 519-523.

13. Макеев В.М. (1993.) Стохастический резонанс и его возможная роль в живой природе. / Биофизика. Т.З 8, с.: 194-201.

14. Пресман А. С. (1968.) Электромагнитные поля и живая природа. М.: Наука. - 298с.

15. Симонов А.Н. (1986.) Влияние постоянного магнитного поля на формирование бислойных липидных мембран./ Симонов А.Н., Лившиц В.А., Кузнецов А.Н. / Биофизика, Т.31, с.:777-780.

16. Трчуниан А. (2001.) Мембранотропный эффект электромагнитного облучения сверхвысоких частот Escherichia coliJ Трчуниан А., Оганджаниан Е., Саркисиян Е. и др./ Биофизика. Т.46(1). с.:69-76.

17. Холодов Ю.А. (1991.) Минуя органы чувств./ Новое в жизни, науке и технике./ Сер. Биология. Т. 11. с. :25-29.

18. Хомутов Г.Б. (2004.) Возможная роль ионов железа в изменении состава ДНКкомплексов и их магнитные свойства в процессе клеточного цикла./ Биофизика. -Т.49(1), е.: 140-144.

19. Шеин А.Г. (2001.) Некоторые аспекты воздействия СВЧ-излучения сантиметровогодиапазона на зерно/ Биомедецинская радиоэлектроника. Т. 1. с.:5-9.

20. Adair R.K. (1991.) Constraints on biological effect of weak extremely low frequency electromagnetic fields. / Phys. Rev. A, V.43, p.: 1039-1048.

21. Adey W.R (1982.) Effects of weak amplitude-modulated microwave fields on calcium efflux from awake cat cerebral cortex./ Adey W.R., Bawin S.M., Lawrence A.F./ Bioelectromagnetics. V.3(3) p.:295-307.

22. Alipov Y.D., Belyaev I.Y. (1996.) Difference in frequency spectrum of extremely-low-frequency effects on the genome conformational state of AB 1157 and EMG2 E. coli cells./ Bioelectromagnetics V.17(5) p.:384-7.

23. Almiron M. (1992.) A novel DNA binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.l Almiron M., Link A. J., Furlong D., Kolter R./ Genes Dev. V.6, p.:2646-2654.

24. Anderstam B. (1983.) Studies of possible genetic effects in bacteria of high frequency electromagnetic fields./ Anderstam B., Hamnerius Y., Hussain S., Ehrenberg L./ Hereditas, V.98(l) p.:l 1-32.

25. Atlung, T., H. Ingmer. (1997.) H-NS: a modulator of environmentally regulated gene expression./Mol. Microbiol. V.24 p.:7-17.

26. Azam T.A. (1999.) Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid./ Azam T.A, Iwata A., Nashimura A.,et al./ J. Bacteriol, V. 181 (20) p.:6361-6370.

27. Azam T.A. Ishihama A. (1999) Twelve Species of the Nucleoid-associated Protein from Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity./ J. Biol. Chem. -V.274, p.: 33105-33113.

28. Azam T.A. (2000.) Two types of localization of the DNA-binding proteins within the Escherichia coli nucleoid./ Azam T.A., Hiraga S., Ishihama A./ Genes to Cells. V.5, p.:613-626.

29. Bardwell J. C. A, Craig E. (1984) Major Heat Shock Gene of Drosophila and the Escherichia coli Heat-Inducible dnaK Gene are Homologous./ PNAS, V.81, p.: 848 - 852.

30. Bardwell J.C.A., Craig E.A. (1987.) Eukaryotic Mr 83,000 Heat Shock Protein Has a Homologue in Escherichia coli.l PNAS. V.84 p.: 5177 - 5181.

31. Barnes F.S. (1998.) A model for detection of weak ELF electric and magnetic fields. / Bioelectroch. Bioener., V.47, p.:207-212.

32. Bearson S. M. D. (1996.) The stationary-phase sigma factor sigma S (RpoS) is required for a sustained acid tolerance response in virulent Salmonella typhimuriumJ Bearson S. M. D., Lee I.S., Lin J. et al./Mol Microbiol. V.17(l), p.:155-67.

33. Belyaev I.Y. (1998.) Cell density dependent response of E. coli cells to weak ELF magnetic fields./ Belyaev I.Y., Alipobv Y.D., Matronchik A.Yu./ Bioelectromagnetics. V19(5) p.:300-309

34. Belyaev I.Y., Alipov E.D. (2001.) Frequency-dependent effects of ELF magnetic field on chromatin conformation in Escherichia coli cells and human lymphocytes./ Biochim Biophys Acta.-V. 1526(3) p.:269-76.

35. Bernstein J. A. (2002.) Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays./ Bernstein J. A., Khodursky A.B., Pei-Hsun Lin, et al./ PNAS. V.99(15), p.:9697-9702.

36. Bezrukov S.M., I. Vodyanoy. (1997.) Stochastic resonance at the single-cell level / Nature, -V.385, p.:319-321.

37. Bird J. G. (2006.) Functional Analysis of CbpA, a DnaJ homolog and nucleoid-associated DNA-binding Protein./Bird J. G., Sharma S., Roshwalb S.C., et al./J. Biol. Chem. V.281 p.:34349 - 34356.

38. Blackman C.F (1976). Biological effects of electromagnetic waves./ Blackman C.F, Surles M.C., Benane S.C./ J. Microw Power. V.14(3). p.:275-80.

39. Blackman C.F. (1994.) Empirical test of an ion parametric resonance model for magnetic field interactions with PC-12 cells./ Blackman C.F., Blanchard J.P., Benane S.G., House D.E. / Bioelectromagnetics. V.15, p.:239-260.

40. Brocklehurts B., McLauchlan K.A. (1996.) Free radical mechanism for the effects of environmental electromagnetic fields on biological system. / Int. J. Radiat. Biol. V.69, p.:324.

41. Bukau B. (1993.) Regulation of the Escherichia coli heat-shock response./ Mol. Microbiol. -V.9(4) p.: 671-80.

42. Cairo P. (1998) Magnetic field exposure enhances mRNA expression of sigma 32 in E. coli / Cairo P., Greenebaum B., E Goodman./ J. Cell Biochem. V. 68(1). p.:l-7.

43. Calvanovskis J., Sandblom J. (1998.) Periodic forcing of intracellular calcium oscillators. Theoretical studies of the effects of low frequency fields on the magnitude of oscillation. / Bioelectroch. Bioener., V.46, p.:161-174.

44. Ceci P. (2004) DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus./ Ceci P., Cellail S., Falvo E., et al./ Nucleic Acids Research. V.32(19), p.:5935-5944.

45. Chang Y.Y. (1994) Expression of E.coli pyruvate oxidase (Pox B) depends on the sigma factor encoded by the rpoS (katF) gene / Chang Y.Y., Wang A.Y., Cronan, et al./ Mol. MicrobioLV.il. P. 1019-1028.

46. Chemeris N.K. (2004.) DNA damage in frog erythrocytes after in vitro exposure to a high peak-power pulsed electromagnetic field./ Chemeris N.K., Gapeyev A.B., Sirota N.P., et al./ Mutation Res. V.558, p.:27-34.

47. Chiabrera B. (1985.) Electric and magnetic field effects on ligand binding to the cell membrane./ In A. Chiabrera, C. Nicolini, and H.P. Schwan, editors/ Interaction Between Electromagnetic Field and Cell,, Plenum, New York, p.253-280.

48. King-Chuen Chow, Wai Lin Tung. (2000.) Magnetic field exposure stimulates transposition through the induction of DnaK/J. synthesis. / Boichem. Boiphys. Research V. 270, p.:745 -748.

49. Craig E. A. (1993.) Heat shock proteins: molecular chaperones of protein biogenesis./ Craig E. A., Gambill B. D., Nelson R. J./ Microbiol. Rev. V.57 p.:402-414.

50. Craig E.A., Gross C.A. (1991.) Is hsp70 the cellular thermometer?/ Trends Biochem Sci. -V.16(4) p.:135-40.

51. Dardalhon M. (1981.) Studies on possible genetic effects of microwaves in procaryotic and eucaryotic cells./ Dardalhon M., Averbeck D., Berteaud A.J./ Radiat Environ Biophys. -V.20(l) p.: 37-51.

52. Dartigalongue C. (2001.) Characterization of the Escherichia coli E regulon./ Dartigalongue C., Missiakas D., Raina S / J. Biol. Chem. V.276, p.:20866-20875.

53. Del Re B (2003.) Extremely low frequency magnetic fields affect transposition activity in Escherichia coli J Del Re B, Garoia F, Mesirca P, et al./ Radiat Environ Biophys. V.42(2) p.:113-8.

54. Del Re B (2004.) Various effects on transposition activity and survival of Escherichia coli cells due to different ELF-MF signals./ Radiat Environ Biophys. V.43(4) p.:265-70.

55. Del Re B. (2006.) Synthesis of DnaK and GroEL in Escherichia coli cells exposed to different magnetic field signals./ Bioelectrochemistry. V.69, p.:99-l 03.

56. Donato G., Kawula T. H. (1998.) Enhanced Binding of Altered H-NS Protein to Flagellar Rotor Protein FUG Causes Increased Flagellar Rotational Speed and Hypermotility in Escherichia colli J. Biol. Chem. Vol. 273(37), p.:24030-24036.

57. Drlica K., Rouviere-Yaniv J. (1987.) Histone-like proteins of bacteria./ Microbiol. Rev. V.51, p.:301—319.

58. Durney C.H. (1988.) Resonant DC AC magnetic fields: calculated response. / Durney C.H., Rushforth C.K., Anderson A.A./ Bioelectromagnetics. - V.9, p.:315-336.

59. Dutta S.K. (1979) Lack of microbial genetic response to 2.45-GHz CW and 8.5- to 9.6-GHz pulsed microwaves / Dutta S.K., Nelson W.H., Blackman et al./ J. Microw Power. V.14(3), p.: 275-80.

60. Dutta S.K. (1994.) Frequency-dependent alterations in enolase activity in Escherichia coli caused by exposure to electric and magnetic fields./ Dutta S.K., Verma M., Blackman C.F./ Bioelectromagnetics. V.15(5), p.:377-83.

61. Fesenko E.E. (1995.) Preliminary microwave irradiation of water solutions changes their channel-modifyingactivity./ Fesenko E.E., Geletyuk V.l., Kazachenko V.N., Chemeris N.K./ FEBS Lett.-V. 366(1), p.: 49-52.

62. Fesenko E.E., Gluvstein A.Ya. (1995.) Changes in the state of water, induced by radiofrequency electromagnetic fields./ FEBS Lett V.367(l) p.:53-55.

63. Finkel, S. E., Johnson R. C. (1992.) The Fis protein: it's not just for DNA inversion nymore./ Mol. Microbiol. V.6, p.:3257-3265.

64. Gamer J. (1996.) A cycle of binding and release of the DnaK, DnaJ and GrpE chaperones regulates activity of the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma32 / Gamer J., G Multhaup, T Tomoyasu, et al./ EMBO J. V.15, p.: 607 - 617.

65. Gerdes S. Y. (2003.) Experimental Determination and System Level Analysis of Essential Genes in Escherichia coli MG1655./ Gerdes S.Y., Scholle M.D., Campbell J.W., et al./ J. Bacterid. -V. 185 p.:5673 5684.

66. Goodman E.M. (1993) Altered proteins synthesis in a cell-free system exposed to a sinusoidal magnetic field / Goodman E.M., Greenebaum B., Marron M.T. / BBA. V. 1202(1), p.:107-112.

67. Goodman E.M. (1994) Magnetic fields after translation in Escherichia coli J Goodman E.M., Greenebaum B., Marron M.T./ J. Bioelectromagnetics. - V.15(l), p.: 77-83.

68. Gusev V.A. Schulze-Makuch D. (2005.) / Low frequency electromagnetic waves as a supplemental energy source to sustain microbial growth / Naturwissenschaften. 2005. V. 92(3), p.: 115-120.

69. Gygi S.P. (1999.) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast./ Gygi S. P., Rochon Y., Franza B.R., Aebersold R./ Mol. Cell. Biol. V.19 p.:1720 - 1730.

70. Hengge-Aronis R. (1993.) Survival of hunger and stress: the role of rpoS in stationary phase gene regulation in Escherichia coli J Cell. V.72. p: 165-168.

71. Hengge-Aronis R. (1996.) Back to log phase: sigma S as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli J Mol. Microbiol. V.21(5) p.:887-893.

72. Hengge-Aronis R. (1999.) Interplay of global regulators and cell physiology in the general stress response of Escherichia coliJ Curr. Opin. Microbiol., V.2(2) p.:148-152.

73. Horiuchi S. (2001.) Drastic high magnetic field effect on suppression of Escherichia coli death / Horiuchi S., Ishizaki Y., Okuno K., et al. / Bioelectrochemistry. vol.53, p.: 131-139.

74. Hwang D.S., Kornberg A. (1990.) A novel protein binds a key origin sequence to block replication of an E. coli minichromosome./ Cell. V.63(2), p.: 325-331.

75. Igarashi K. (1989.) Promoter selectivity of E.coli RNA polymerase: omega factor isresponsible for the ppGpp sensitivity /. Igarashi, K., Fujita, N., Ishihama, A. / Nucl. Acids Res. V. 16, p.: 8755-8765.

76. Ishihama, A. (1999.) Modulation of the nucleoid, the transcription apparatus, and the translation machinery in bacteria for stationary phase survival./ Genes Cells. V.3 p.:135-143.

77. Justo O.R. (2006.) Growth of Escherichia coli under extremely low-frequency electromagnetic fields./ Justo O.R., Perez V.H., Alvarez D.C., Alegre R.M./ Appl. Biochem. Biotechnol.-V. 134(2) p.:155-163.

78. Jishage M., Ishihama, A. J (1995.) Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in Escherichia coli: intracellular levels of a70 and cr38. / J. Bacteriol. V. 177, p.:6832-6835.

79. Johansson J. (2001.) Heteromeric Interactions among nucleoid-associated bacterial proteins: localization of StpA-stabilizing regions in H-NS of Escherichia coli J Johansson J., Eriksson S., Sonden B. et al./ J. Bacteriol. V. 183 (7) p.: 2343-2347.

80. Johnson R. C. (1986.). Host protein requirement for in vitro site-specific DNA inversion./ Johnson R. C., M. F. Bruist, M. I. Simon./ Cell. V.46 p.:531-539.

81. Kaiser F. (1996.) External signals and internal oscillation dynamics: biophysical aspects and modeling approaches for interaction of weak electromagnetic fields at the cellular level./ Bioelectroch. Bioener. V.41 p.:3-18.

82. Kajitani M. (1994.). Regulation of the Escherichia coli hfq gene encoding the host factor for phageQb./ Kajitani M., A. Kato, A. Wada, et al./J. Bacteriol. V.176 p.:531-534.

83. Kakeda M. (1995) An Escherichia coli curved DNA-binding protein whose expression is affected by the stationary phase-specific sigma factor os./ Kakeda M., Ueguchi C., Yamada H., et al./ Mol. Gen. Genet. V. 248 p.:629-634.

84. Kim J. (2004.) Fundamental structural units of the Escherichia coli nucleoid revealed by atomic force microscopy./ Kim J., Shige H. Yoshimura, et. al./ Nucleic Acids Research, V. 32 (6) p.: 1982-1992.

85. Kobayashi A.K. (1995.) Ferromagnetism and EMFs./ Kobayashi A.K., Kirschvink J.L., Nesson M.H. / Nature. V.374, p.:123.

86. Kropinski A.M. (1994.) Sinusoidal 60 Hz electromagnetic fields failed to induce changes in protein synthesis in Escherichia coli.1 Kropinski A.M., Morris W.C., Szewczuk M.R./ Bioelectromagnetics. V. 15(4) p.:283-91.

87. Siegele D A, Kolter R (1993.) Isolation and characterization of an Escherichia coli mutant defective in resuming growth after starvation./ Genes & Dev. V.7 p.:2629 - 2640.

88. Lange R., Hengge-Aronis R. (1994.) The nlpD gene is located in an operon with rpoS on the Escherichia coli chromosome and encodes a novel lipoprotein with a potential function in cell wall formation./Mol. Microbiol., V.13(4), p.:733-43.

89. Lease R.A., Belfort M. (2000.) A trans-acting RNA as a control switch in Escherichia coir. DsrA modulates function by forming alternative structures. / PNAS V.97 p.: 9919.

90. Lednev V.V. (1991.) Possible mechanism for the influence of weak magnetic fields on biological systems. / Bioelectromagnetics, V.12, p.:71-75.

91. Lednev V.V. (1995.) Comments on "Clarification and application of an ion parametric resonance model for magnetic field interaction with biological systems" by Blanchard and Blackman. / Bioelectromagnetics. V.16 p.:268-269.

92. Liboff A.R. (1985.) Geomagnetic cyclotron resonance in living cells. / J. Biol. Phys. V.13 p.:99-102.

93. Li S.H., Chow K.C. (2001 .)Magnetic field exposure induces DNA degradation./ Biochem Biophys Res Commun. V.280(5), p.:1385-1388.

94. Li M. (2004.) Sterilization of Escherichia coli cells by the application of pulsed magnetic field./ Li M., Qu J.H., Peng Y.Z./ J Environ Sci (China). V.16(2) p.:348-352.

95. Liu K. (1996.) Role of Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit in modulation of pausing, termination and anti-termination by the transcription elongation factor NusA./ Liu K„ Zhang Y„ Severinov K., et al./ EMBO J. V. 15(1) p.: 150-161.

96. Loewen P.C., Hengge-Aronis R. (1994.) The role of the sigma factor sigma S (KatF) in bacterial global regulation./Annu. Rev. Microbiol. V. 48 p.:53-80.

97. Maeda H. (2000.) Competition among seven Escherichia coli a subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase./ Maeda H., Fujita N., Ishihama A./ Nucleic Acids Res. V.28 p.:3497--3503.

98. Mah T.F. (2000.) The a-subunit of E. coli RNA polymerase activates RNA binding by NusA/ Kuznedelov K., Mushegian A., Severinov K., Greenblattl J./ Genes & Development V.14, p.:2664-2675.

99. Majdalani N. (1998) DsrA RNA regulates translation of RpoS message by an anti-antisense mechanism, independent of its action as an antisilencer of transcription./ Majdalani N., Cunning C., Sledjeski D., et al./ PNAS. V.95 p.: 12462- 12467.

100. Mathews DH. (2004.) Incorporation chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure./ Mathews DH, Disney M.D., Childs J.L. et al./ P roc Natl Acad Sei USA.-VA01, p.:7287-7292.

101. McCarty J.S., Walker G.C. (1991.) DnaK as a Thermometer: Threonine-199 is Site of Autophosphorylation and is Critical for ATPase Activity./ PNAS. V.88 p.:9513.

102. McLeod B.R. (1992.) Electromagnetic gating in ion channels. / McLeod B.R., A.R. Liboff, Smith S.D./ J. Theor. Biol. V. 158, p.: 15-31.

103. Muffler A. (1996.) The RNA-binding protein HF-I, known as a host factor for phage Qb RNA replication, is essential for rpoS translation in Escherichia coli J Muffler A., Fischer D., Hengge-Aronis R./ Genes Dev. V. 10 p.: 1143-1151.

104. Nagai H. (1991.) Interplay of Two Cis-Acting mRNA Regions in Translational Control of v1 Synthesis During the Heat Shock Response of Escherichia coli / Nagai H., Yuzawa H, Yura T./PNAS.-V. 88. p.: 10515-10519.

105. Nakasono S., Saiki H., (2000) Effect of ELF Magnetic Fields on Protein Synthesis in Escherichia coli K12 / Radiation research V.154, p.:208-216.

106. Nascimento L.F.C. (2003.) Glucose consume and growth of E.coli under electromagnetic field./Nascimento L.F.C., Boturo G. Jr., Mota R.P./ Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo. V.45(2) p.:65-67.

107. Oakley B.R (1980.) A simplified ultrasensitive silver stain for detecting protein sinpolyacrylamide gels / B.R. Oakley, D.R. Kirsch and N.R. Morris// Anal Biochem. V. 105(2). p.: 361-363.

108. O'Farrell P. H. (1975.) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins./ J. Biol. Chem. V. 250. p.: 4007 - 4021.

109. Okuno K. (2001.) Disappearance of growth advantage in stationary phase (GASP) phenomenon under a high magnetic field./ Okuno K., Fujinami R, Ano T, Shoda M./ Bioelectrochemistry V.53(2) p.: 165-169.

110. Oshima T. (2006.) Escherichia coli Histone-Like Protein H-NS Preferentially Binds to Horizontally Acquired DNA in Association with RNA Polymerase./ Oshima T., Ishikawa S., KurokawaK. et al./DNARes.-V.13, p.:141 -153.

111. Ozoline O.N. (1997.) Non-canonical sequence elements in the promoter structure. Cluster analysis of promoters recognized by Escherichia coli RNA polymerase./ Ozoline O.N., Deev A.A., Arkhipova UN J Nucleic Acids Res. V. 25 p.:4703 - 4709.

112. Potenza L.(2004.) Effects fects of a static magnetic field on cell growth and gene expression in Escherichia coli J Potenza L., Ubaldi L., De Sanctis R., et al./Mutation Research. V.561 p.:53-62.

113. Pratt L.A., Silhavy T.J. (1996.) The response regulator SprE controls the stability of RpoS. / PNAS.-V.93 p.: 2488-2492.

114. Purtov Yu.A. (2005.) Free Dimer of E. coli RNA Polymerase a subunit is a potential transcription regulator./ Purtov Yu.A., Ishihama A., Ozoline O.N./ JBSD. V. 22(6), p.:796.

115. Ramon C. (1981.) Inhibition of growth rate of Escherichia coli induced by extremely low-frequency weak magnetic fields./ Ramon C., Ayaz M., Streeter D.D. Jr./ Bioelectromagnetics. V.2(3) p.:285-289.

116. Richardson J.P. (1996) Structural Organization of Transcription Termination Factor Rho./ J. Biol. Chem. V.271(3) p.: 1251-1254.

117. Richmond C.S. (1999.) Genome-wide expression profiling in Escherichia coli K12./ Glasner J.D., Mau R., et al./ Nucleic Acids Res. V.27 (19) p.: 3821-3835.

118. Riley M. (2006) Escherichia coli K-12: a cooperatively developed annotation snapshot./ Riley M. ,Abe T., Arnaud M.B., et al./ Nucleic Acids Res. V. 34(1): 1-9.

119. Schweder T. (1996.) Regulation of Escherichia coli starvation sigma factor (sigma s) by ClpXP protease./ Schweder T., Lee K.H., Lomovskaya O., Matin A. / J. Bacterid. V.178 p.: 470 - 476.

120. Selinger D.W. (2000.) RNA expression analysis using a 30 base pair resolution Escherichia coli genome arrays./ Selinger DW, Cheung KJ, Mei R, et al./ Nature Biotechnol V.18p.: 1262-1268.

121. Selinger D.W. (2003) Global RNA half-life analysis in Escherichia coli reveals positional patterns of transcript degradation./ Selinger D.W., Saxena R.M., Cheung K.J., et al./ Genome Res.-V.13 p.:216 223.

122. Shcheglov V.S. (2002.) Cell-to-cell communication in response of E. coli,cells at different phases of growth to low-intensity microwaves / Shcheglov V.S., Alipov E.D., Belyaev l.YJ BiochimBiophysActa- V. 1572(1).p.: 101-106.

123. Shoda M. (1999.) Bacterial growth under strong magnetic field // Shoda, M., K. Nakamura, et al./ Electricity and Magnetism in Biology and Medicine / Edited by Bersani, Kluwer, Academic /Plenum Publishers -p.: 215-217.

124. Solgado H. (2006) RegulonDB (version 5.0): Escherichia coli K-12 transcriptional regulatory network, operon organization, and growth conditions./ Salgado H., Gama-Castro S., Peralta-Gil M., et al./Nucleic Acids Res. V.32 p.: 6643 - 6649.

125. Steiner U.E., Ulrich T. (1989.) Magnetic field effects in chemical kinetics and related phenomena. / Chem. Rev. V.89, p.:51-147.

126. Stelzl U. (2003.) RNA-structural Mimicry in Escherichia coli Ribosomal Protein L4-dependent Regulation of the S10 Operon / Stelzl U., Zengel J.M., Tovbina M., et al. / The J. of Biol. Chem. V. 278(30) p.: 28237-28245.

127. Strasak L. (1998.) The effect of low-frequency electromagnetic fields on living organisms / Strasak L., Vetterl V., Smarda J. / Sb. Lek. V. 99(4). P. 455-64.

128. Strasak L. (2002.) Effects of low-frequency magnetic fields on bacteria Escherichia coli J Strasak L, Vetterl V, Smarda J./ Bioelectrochemistry. V.55(l-2) p.:161-164.

129. Tanaka H. (1993.) Properties of DNA-binding of HU heterotypic and homotypic dimers from Escherichia coli J Tanaka H., Goshima N., Khono K et al./ J. Biochem. V.l 13 p.:568-572.

130. Tsuchiya K. (1999.) High magnetic field enhances stationary phase-specific transcription activity of Escherichia coli / Tsuchiya, K., K. Okuno, T. Ano, et al. // Bioelectrochem. Bioenerg.-V.48. p.: 383-387.

131. Ueguchi C. (1994.) An analogue of the DnaJ molecular chaperon in Escherichia coli.l Ueguchi C„ M. Kakeda, H. Yamada, T. Mizuno. Proc. Natl. Acad. Sei. USA V.91 p.: 10541058.

132. Velkov V. V. (2001.) Stress-induced evolution and the biosafety of genetically modified microorganisms released into the environment / J Biosci. V. 26(5) p.: 667-683.

133. Webb S.J., Dodds D.D. (1968.) Inhibition of Bacterial Cell Growth by 136 gc / Microwaves. Nature.-V. 218 p.: 374-375.

134. Williams, R. M., S. Rimsky. (1987.) Molecular aspects of the E. coli nucleoid protein, H-NS: a central controller of gene regulatory networks./ FEMS Microbiol. Lett. V.156 p.:175-185.

135. Yim, H.H. (1994.) Molecular characterization of the promoter of osmY an RpoS-dependent gene / Yim H.H., Brenis, R.L., Villarejo, M./ J. Bacteriol. V. 176. p.: 100-107.

136. Yura T., (1993.) Regulation of the heat-shock response in bacteria./Nagai H., Mori H./ Annu. Rev. Microbiol. V.47, p.:321-350.

137. Zhang, Z., M. Belfort (1992.) Nucleotide sequence of a newly identified Escherichia coli gene, stpA, encoding an H-NS-like protein./ Nucleic Acids Res. V.20, p.:6734-6742.

138. Zhao G. (2002.) Iron and Hydrogen Peroxide Detoxification Properties of DNA-binding Protein from Starved Cells./ Zhao G., Ceci P., Ilari A.,et al./ J.of Biol. Chemistry. V. 277(31), pp. 27689-27696.

139. Zhou Y.N. (1988.) Isolation and characterization of Escherichia coli mutants that lack the heat shock sigma factor a32./ Zhou Y.N., Kusukawa N., Erickson J. et al./ J. of Bacteriol. -V.170 (8), p.: 3640-3649.1. БЛАГОДАРНОСТИ

140. Самую большую благодарность хотелось бы выразить моему научному руководителю д.б.н. Озолинь Ольге Николаевне, которая приняла меня таким, какой я был, и помогла стать мне таким, какой я есть сейчас.