Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности транспорта кислорода через мембрану эритроцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности транспорта кислорода через мембрану эритроцитов"

На правах рукописи

Локтюшкин Алексей Владимирович

ОСОБЕННОСТИ ТРАНСПОРТА КИСЛОРОДА ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ ЭРИТРОЦИТОВ

Специальность: 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически?; наук

1

з [.:;. р г:э

Москва 2009

003465591

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Иванов Илья Ильич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич

доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимирович

Ведущая организация:

НИИ физико-химической медицины Росздрава

Защита состоится 9 апреля 2009 г. в_на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « В » марта 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Функцию переноса молекулярного кислорода от легких к клеткам-потребителям у позвоночных животных и человека выполняют специализированные клетки крови - эритроциты. Они наполнены железосодержащим белком гемоглобином, составляющим до 94% сухой массы клетки. В капиллярах легких человека насыщение гемоглобина эритроцитов кислородом происходит за четверть секунды (West, 1985; Endeward et al., 2006). При этом в цитоплазму эритроцита проникает примерно третья часть переносимого им кислорода. Очевидно, что столь быстрая оксигенация эритроцитарного гемоглобина в легких возможна лишь при условии существования весьма интенсивного переноса кислорода через мембрану эритроцитов.

Известно, что мембрана эритроцитов не оказывает существенного сопротивления для диффузии кислорода (Kreuzer, Yahr, I960). Подтверждение этому было получено в модельных экспериментах, выполненных методом остановленной струи. С помощью этого метода можно наблюдать кинетику процесса переноса кислорода из внешней среды в цитоплазму эритроцитов по изменению во времени соотношения окси- и дезоксигемоглобина (Hartridge, Roughton, 1927). Полученные этим методом результаты показали, что скорость поглощения Ог эритроцитами определяется скоростью диффузии, а не химической реакцией взаимодействия Oj с гемоглобином в клетке. Установлено, что основным диффузионным барьером, определяющим скорость переноса Ог в цитоплазму эритроцитов, является высокое диффузионное сопротивление неперемешиваемо-го слоя воды, окружающего клетку, а вклад сопротивления мембраны незначителен (Coin, Olson, 1979; Huxley, Kutchai, 1981; Vandegriff, Olson, 1984; Holland eta/., 1985; Yamaguchi eta!., 1985). Объем, качество и уровень теоретического анализа экспериментального материала, подтверждающего надежность этих представлений, оказались настолько убедительными, что дальнейшие исследования роли мембраны в кислородном газообмене эритроцитов с помощью метода остановленной струи были фактически свернуты более 20 лет тому назад.

Высокая проницаемость мембран эритроцитов для кислорода может быть обусловлена высокой проницаемостью липидного бислоя. Такое объяснение основано на традиционном предположении о том, что проницаемость для кислорода липидного бислоя биологических и модельных мембран близка к проницаемости слоя воды аналогичной толщины. Эти представления вытекают, в основном, из результатов косвенных экспериментов с использованием флуоресцентных и спиновых зондов (Fischkoff, Vanderkooi, 1975; Subczynski et al., 1981; 1989; 1991; 1992; Kusumi et al., 1982; 1986; Ligezaetal., 1998; Subczynski, Wisniewska, 2000; Widomska etal., 2007).

Этой точке зрения, однако, противоречит тот факт, что величина микровязкости липидного бислоя биологических мембран примерно на два порядка выше вязкости воды (Cogan et al., 1973; Edidin, 1974; Sinensky, 1974). В соответствии с законами диффузии, подвижности молекул кислорода в таких средах должны сильно различаться. С этим согласуются результаты прямых

измерений трансмембранных диффузионных потоков Ог через монослойные липидные мембраны, которые показали, что диффузионное сопротивление этих мембран для кислорода на 2-3 порядка выше, чем у слоя воды аналогичной толщины (Blank, 1962; Гуськова и соавт., 2000; Федоров и со-авт., 2000; Ivanov et al., 2004).

В связи с этим возникает вопрос о причинах высокой диффузионной проницаемости мембран эритроцитов для кислорода, в частности, о роли дополнительных путей, облегчающих диффузию молекулярного кислорода через эти мембраны. К настоящему времени показано, что некоторые малые незаряженные молекулы (СО2, NO, NH3, Н2О, Н2О2) могут проникать через биологические мембраны при участии белковых пор (Denker et al., 1988; Preston et al, 1992; Agre et al, 1993; Cooper, Boron, 1998; Forster et al., 1998; Nakhoul et al, 1998; Prasad et al., 1998; Cooper et al, 1999; Niemietz et al., 2000; Herrera et al., 2000; Blank, Ehmke, 2003; Uehlein et al., 2003; Ripoche et al., 2004; Endeward et al., 2006; 2008; Bienert et al., 2007; Saparov et al., 2007). Возможно, что белки обеспечивают высокую проницаемость мембран эритроцитов человека для кислорода.

При регистрации кинетики поглощения кислорода эритроцитами с помощью метода остановленной струи вклад клеточной мембраны в суммарное диффузионное сопротивление на пути кислорода из внешней среды в цитоплазму должен возрасти при существенном снижении мембранной проницаемости. Это снижение может быть обусловлено ингибированием мембранных белков, выполняющих функцию кислородной поры. Таким образом, метод остановленной струи может позволить получить непосредственную информацию о механизмах транспорта кислорода через мембрану эритроцитов.

Цели и задачи. Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов, обеспечивающих высокую проницаемость мембран эритроцитов человека для молекулярного кислорода. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

■ Определить коэффициент проницаемости для кислорода монослойной мембраны из суммарных липидов эритроцитов, сформированной на границе раздела вода/воздух.

■ Исследовать влияние ингибиторов мембранного транспорта (ДИДС, HgCb и иХМБ) на кинетические кривые транспорта воды и анионов через мембрану эритроцитов, а также поглощения кислорода эритроцитами человека.

■ Исследовать влияние HgCb и иХМБ на константу скорости химической реакции дезокси-гемоглобина из эритроцитов человека и кислорода в растворе.

■ Исследовать влияние HgCb на кривые диссоциации оксигемоглобина эритроцитов человека.

■ Исследовать влияние HgCb на микровязкость липидного бислоя мембран эритроцитов человека.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые с помощью прямого метода определен коэффициент проницаемости для кислорода монослойной мембраны, сформированной из суммарных липидов эротроцитов человека. Полученная величина коэффициента проницаемости показывает, что липидный бислой мембраны эритроцитов представляет собой существенный барьер для трансмембранной диффузии кислорода.

Проведено систематическое исследование влияния ртутных сульфгидрильных реагентов (HgCl2 и лХМБ) на кинетику реакции дезоксигемоглобина и кислорода в растворе. Показано, что HgCh приводит к снижению константы скорости реакции. Зависимость константы скорости от концентрации лХМБ носит немонотонный характер.

Исследовано влияние HgCb на равновесие гемоглобина и кислорода в суспензии эритроцитов. Обнаружено, что в присутствии HgCh кривая диссоциации оксигемоглобина эритроцитов смещается в область более высоких концентраций кислорода.

Совокупность полученных результатов свидетельствует, что снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами человека при действии ртутных сульфгидрильных реагентов связано с ингибированием мембранного белка, скорее всего аквапорина AQP1. Таким образом, в настоящей работе впервые получены экспериментальные доказательства участия белка в транспорте кислорода через биологические мембраны.

Научно-практическая значимость работы. Результаты диссертационной работы расширяют имеющиеся представления о механизмах токсического действия соединений ртути на живые организмы. Токсические эффекты этих соединений могут быть частично связаны с нарушением кислородного обеспечения тканей организма в результате снижения сродства гемоглобина к кислороду и уменьшения проницаемости мембран эритроцитов.

Полученные в работе данные позволяют по-иному взглянуть на процессы, обеспечивающие деструктивное и регуляторное действие активных форм кислорода. Можно ожидать, что транспорт с участием мембранных белков имеет место и в случае электронно-возбужденной формы кислорода '02.

В последнее время развиваются представления о роли аквапоринов в кислородном обеспечении клеток, в том числе опухолевых (Титовец, 2007; Echevarría et al, 2007). Аквапорин AQP1 рассматривается как возможная молекулярная мишень противоопухолевой химиотерапии (Endo et al., 1999; Vacca et al., 2001; Hoque et al., 2006). Развиваемые в работе представления позволяют существенно расширить интерпретацию механизмов этого эффекта. Можно ожидать, что регистрация кинетики поглощения кислорода эритроцитами с помощью метода остановленной струи

станет удобным приемом для первичного тестирования модификаторов активности AQP1 в отношении кислородтранспортной функции.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции «Modern spectroscopy methods in studying structure and function of biopolymers in biology and medicine» (Дубна, 2007), научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2007), международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008), семинарах кафедры биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе в журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на_страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована __рисунками и_таблицами. Список литературы содержит_источника (из них_на английском

языке).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Определение коэ(ЬФициента проницаемости для кислорода монослойной мембраны из суммарных липидов эритроцитов. Суммарные липиды эритроцитов экстрагировали из эритроцитарной массы, полученной из крови гематологически здоровых доноров, согласно методике (Rose, 1965). Эрит-роцитарная масса без лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя была получена на Станции переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы.

Монослойную пленку из суммарных липидов эритроцитов формировали в ванне Ленгмю-ра. Липиды в органическом растворителе (гексан/этанол 9 : 1 об.) наносили на поверхность 100 мМ водного раствора КС1 с помощью микрошприца. Монослой формировался после испарения органического растворителя в течение 15 мин. Поверхностное натяжение определяли методом Вильгельми (Birdi, 1989).

Поток кислорода через границу раздела воздушной и водной фаз регистрировали с помощью открытого плоского платинового электрода с площадью поверхности около 0,2 см2. Платиновый электрод находился в водном растворе вблизи от поверхности раздела фаз, рабочая поверхность электрода была направлена вверх и ориентирована строго параллельно межфазной границе.

Потенциал платинового электрода устанавливали на уровне -0,6 В по сравнению с потенциалом хлорсеребряного электрода сравнения. Глубину погружения электрода контролировали с точностью 1 мкм с помощью прецизионного механизма, включающего гидравлический преобразователь, микрометр и шаговый двигатель.

Коэффициент проницаемости монослоя из суммарных липидов эритроцитов определяли по разности профилей диффузионного тока по глубине для чистой межфазной границы и после нанесения липидной пленки, используя алгоритм вычислений, описанный ранее (Гуськова и со-авт., 2000; Федоров и соавт., 2000; Ivanov et al., 2004).

Кинетические эксперименты выполняли на двухволновом спектрофотометре Aminco DW-2, оснащенном приставкой для измерений методом остановленной струи Aminco-Morrow (American Instrument Co., США) (Morrow, 1970). Мертвое время установки - 4 мс. Максимальное временное разрешение в двухволновом режиме - 1 мс.

В кинетических экспериментах использовали кровь из пальца. Кровь собирали в физиологический раствор (0,9% NaCl), содержащий антикоагулянт гепарин. Кровь в физиологическом растворе центрифугировали в течение 5 мин при 1500 х g. Осажденные эритроциты отмывали 3 раза. Концентрацию гемоглобина определяли спектрофотометрически после лизиса клеток по величине оптической плотности раствора при 542 нм (S542 = 13800 М"1 • см"1) (Rossi-Fanelli et al., 1959).

Кинетические кривые поглощения кислорода эритроцитами получали при быстром смешивании анаэробной суспензии клеток (концентрация гемоглобина - 10 мкМ) с изотоническим буферным раствором, находящимся в равновесии с атмосферным воздухом (концентрация Ог до смешивания - 0,25 мМ). Связывание кислорода с гемоглобином в цитоплазме эритроцитов регистрировали в двухволновом режиме (560 и 577 нм), чтобы минимизировать вклад светорассеяния.

Кинетические кривые поглощения иона NCS~ эритроцитами регистрировали при смешивании суспензии клеток с раствором, содержащим NaNCS (0,145 M). Индикатором проникновения иона NCS" служил метгемоглобин. Образование комплекса между метгемоглобином и NCS" регистрировали в двухволновом режиме при 500 и 550 нм.

Для определения коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов (Pj) использовали осмотический метод (Mlekoday et al., 1983; Verkman, 1995). Суспензию эритроцитов в изотоническом буферном растворе смешивали с гипотоническим раствором. Изменение объема клеток регистрировали по изменению светорассеяния суспензии при 590 нм. Коэффициент осмотической водной проницаемости рассчитывали по кинетическим кривым изменения светорассеяния (Roudier et al., 1998).

Кинетические кривые реакции дезоксигемоглобина и кислорода в растворе регистрировали при 430 нм. Раствор гемоглобина получали после лизиса клеток в гипоосмотической среде. Остатки мембран удаляли путем центрифугирования лизата при 16100 х § в течение 10 мин.

Кривые диссоциации оксигемоглобина эритроцитов получали с помощью методики (йеБоиг е1 а1., 1972). Анаэробную суспензию эритроцитов, содержащую фермент каталазу, титровали раствором, содержащим Н2О2 (11 мМ). Титрующий раствор добавляли к суспензии эритроцитов с помощью шприца. Поршень шприца приводился в движение с помощью шагового двигателя. Титрующий раствор поступал в измерительную кювету со скоростью 10 мкл/мин. Переход гемоглобина из де-зокси- в оксиформу регистрировали в двухволновом режиме (448 и 439 нм). Зависимость разности оптических плотностей суспензии АО = £>448-^439 от времени титрования использовали для получения кривой диссоциации оксигемоглобина.

Определение микровязкости липидного бислоя мембран эритроцитов. Микровязкость липидного бислоя мембран эритроцитов измеряли методом ЭПР. В качестве параметра, характеризующего микровязкость бислоя, выступало время корреляции вращательного движения спинового зонда 16-доксилстеариновой кислоты. Кровь из локтевой вены собирали в изотонический раствор, содержащий гепарин. Эритроциты отмывали 3 раза. Готовая эритроцитарная масса содержала 7 ■ 10б клеток/мкл. Спиновый зонд добавляли непосредственно перед измерениями в виде раствора в этаноле, конечная концентрация зонда в пробах 6 • 10"' М.

Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре 3-сантиметрового диапазона РЭ-1307 (СССР). Время корреляции вращательного движения (в секундах) рассчитывали по формуле

т = 6,65 • АН+\ • | ^у^" — 11' Ю-10, где Д//( 1 - ширина низкопольной компоненты спектра, а /+1 и /.1 - амплитуды низкопольной и высокопольной компонент соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Проницаемость для кислорода липидного компонента мембран эритроцитов. При исследовании механизмов транспорта различных соединений через биологические мембраны определение проницаемости липидного компонента мембраны является важной задачей. Существенное различие проницаемости липидного бислоя и нативной мембраны указывает на наличие в последней специализированных систем мембранного транспорта (каналов, пор и переносчиков). В связи с этим на первом этапе работы был определен коэффициент проницаемости для кислорода липидного монослоя, сформированного из суммарных липидов эритроцитов.

Рис. 1. Зависимости величины диффузионного тока (/) от глубины погружения электрода (А):

1 - чистая поверхность воды (контроль);

2 - на поверхность воды нанесен монослой из липидов эритроцитов (поверхностное давление монослоя 27,6 мН/м).

Рис. 2. Зависимость величины коэффициента проницаемости для кислорода монослоя из суммарных липидов эритроцитов (ДОг)) от глубины погружения электрода (А).

0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

h, мм

Для определения коэффициента проницаемости был использован оригинальный метод, разработанный ранее в нашей лаборатории. Основное преимущество данной техники при определении проницаемости липидной мембраны для кислорода состоит в том, что полностью исключаются ошибки, связанные с наличием неперемешиваемых слоев воды. Градиент концентрации кислорода, возникающий между границей раздела фаз и поверхностью работающего электрода, полностью учитывался при расчетах (Ivanov et al, 2004).

Зависимости величины диффузионного тока от глубины погружения электрода для чистой границы раздела воздушной и водной фаз (контроль) и после формирования монослоя из липидов эритроцитов представлены на рис. 1. Начиная с глубины 0,3 мм опытная кривая проходит заметно ниже, чем контрольная, причем разница между током в контроле и опыте растет при уменьшении глубины погружения электрода.

Коэффициент проницаемости липидного монослоя для кислорода рассчитывали с помощью уравнения

Р(02) = -7- • т~7~, где Dw - коэффициент диффузии кислорода в воде, h - глубина поп I- 1т

гружения электрода, / и /„ - диффузионный ток для чистой поверхности воды и после нанесения липидной пленки. Зависимость рассчитанного коэффициента проницаемости монослоя из липидов эритроцитов от глубины погружения электрода представлена на рис. 2. Из этого рис. хорошо видно, что коэффициент проницаемости практически не зависит от глубины погружения электрода (и величины потока кислорода). Отсутствие зависимости подтверждает адекватность данного метода определения проницаемости. Величина коэффициента проницаемости монослойной мембраны из липидов эритроцитов равнялась Р(Ог)| = (3,42 ± 0,11) • 10"5 м/с.

Данная величина коэффициента проницаемости для кислорода согласуется с величинами, полученными в работе (Ivanov et al., 2004) для монослоев из синтетического дипальмитоилфосфа-тидилхолина, фосфатидилхолина из бобов сои и суммарных липидов легочного сурфактанта крыс. Вероятно, что относительная низкая проницаемость для кислорода - это универсальное свойство липидного компонента биологических мембран.

В работе (FischkofF, Vanderkooi, 1975) был определен коэффициент диффузии кислорода в липидном бислое мембраны эритроцитов по тушению флуоресценции гидрофобного зонда пире-на. Коэффициент проницаемости липидного бислоя рассчитывали из величины коэффициента диффузии; по данным работы (FischkofF, Vanderkooi, 1975) он равен для мембраны эритроцитов при 25°С около 0,3 м/с. Эта величина примерно на 4 порядка выше, чем коэффициент проницаемости монослоя из эритроцитарных липидов, полученный нами. Одна из возможных причин столь значительного различия состоит в том, что молекула зонда, встроенная в бислой, формирует структурный дефект, в котором концентрация и диффузионная подвижность кислорода значительно выше, чем в нативной липидной мембране (Ivanov et al., 2004).

Результаты, полученные в работе, показывают, что липидный бислой мембран эритроцитов оказывает существенное сопротивление диффузии кислорода. Однако, согласно литературным данным, мембрана эритроцита имеет весьма высокую кислородную проницаемость. В работе (Kreuzer, Yahr, 1960) показано, что скорость диффузии кислорода в мембране эритроцитов близка к скорости диффузии в цитоплазме. Это означает, что коэффициент проницаемости мембраны эритроцитов для кислорода лишь примерно на порядок ниже, чем коэффициент проницаемости слоя воды, имеющего толщину, равную толщине мембраны (-10"1 м/с). Близкие результаты были получены в работе (Holland et al, 1985). По оценкам Холланда и соавт. коэффициент проницаемости мембран эритроцитов человека равен 7 • 10"3 м/с. Эта величина также существенно выше, чем

■фсмя. с время, с

Рис. 3. Кинетические кривые поглощения кислорода эритроцитами. Эритроциты в деокисгени-рованном изотоническом буфере (77,5 мМ ЫаС|; 47 мМ ^гНРО.»; 11 мМ N34^04; 10 мкМ СаСЬ; рН 7,4) смешаны при 25°С с буфером, находящимся в равновесии с атмосферным воздухом (концентрация кислорода 0,125 мМ после смешивания).

А. Изменения оптической плотности (АО), полученные при длинах волн 560 и 577 нм. Б. Скорректированная на светорассеяние кривая поглощения кислорода эритроцитами (ДО!6о - АОт).

коэффициент проницаемости липидного компонента эритроцитарных мембран, полученный в настоящей работе.

С учетом вышесказанного и полученных нами данных о низкой величине коэффициента проницаемости липидного компонента мембран эритроцитов для СЬ, мы полагаем, что механизм его транспорта через мембрану эритроцитов существенно сложнее, чем предполагалось ранее. Наряду с простой диффузией через бислой должен существовать другой путь переноса кислорода через мембрану эритроцитов человека.

Влияние ингибиторов мембранного транспорта на скорость поглощения кислорода эритроцитами человека. К настоящему моменту установлено, что в транспорте через биологические мембраны ряда малых незаряженных молекул (СО2, N0, ЫНз, Н2О, Н2О2) принимают участие мембранные белки. По аналогии с этими молекулами, было предположено, что именно транспорт кислорода через белковые поры является причиной существенного различия коэффициентов проницаемости липидного компонента и нативной мембраны эритроцитов.

Для выяснения роли белков в транспорте кислорода через эригроцитарную мембрану была использована методика регистрации кинетических кривых поглощения кислорода. Типичные

кривые, полученные при быстром смешивании анаэробной суспензии эритроцитов с изотоническим раствором, находящимся в равновесии с атмосферным воздухом, представлены на рис. 3.

Одной из стадий суммарного процесса поглощения кислорода эритроцитом является диффузия через мембрану. Мы предположили, что ингибирование мембранных белков, выполняющих функцию кислородной поры, должно привести к снижению скорости поглощения кислорода. В качестве ингибиторов в работе были использованы три соединения (диизотиоцианостиль-бен-2,2'-дисульфоновая кислота (ДИДС), HgCh и л-хлоромеркуриобензоат (лХМБ)). Выбор этих соединений связан с тем, что они, согласно литературным данным, ингибировали мембранный транспорт других малых незаряженных молекул (СО2 и NO) (Herrera et al., 2000; Cooper et al., 2002; Endeward et al., 2006).

ДИДС. Ранее было установлено, что инкубация эритроцитов с ДИДС приводит к существенному снижению коэффициента проницаемости их мембраны для СО2 (Cooper, Boron, 1998; Forster et al., 1998; Endeward étal, 2006). Известно, что ДИДС ингибирует анионный обменник - белок полосы 3 мембраны эритроцитов (Tanner, 1993). Чтобы выяснить роль этого белка в транспорте кислорода через мембрану эритроцитов, было исследовано влияние ДИДС на скорость поглощения кислорода.

В предварительных экспериментах была проверена активность ДИДС как ингибитора анионного транспорта (рис. 4). Для этого использовалась методика регистрации кинетики поглощения иона NCS" эритроцитами. В контроле скорость поглощения NCS" клетками соответствова-

дидс

Рис. 4. Влияние ДИДС на кинетику транспорта Рис. 5. Влияние ДИДС на скорость поглоще-

иона N08" через мембрану эритроцитов. ния кислорода эритроцитами (М/тш). Кривая 1 - контроль; Кривая 2-100 мкМ ДИДС.

ИДОМЯ, о

Рис. 6. Влияние ЩС12 на кинетику поглощения кислорода эритроцитами. Кривая 1 - контроль; Кривая 2 - 160 мкМ ^СЬ.

СШкСу. мкМ

Рис. 7. Зависимости скорости поглощения кислорода эритроцитами (1п2/х1/г) (кривая 1) и коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов (Р/) (кривая 2) от концентрации Ь^СЬ (С). Время инкубации эритроцитов с ЩСЬ- 10 мин.

ла литературным данным (Salhany, 1998). В присутствии ДИДС (100 мкМ) поглощение роданит-иона эритроцитами ингибировалось полностью.

Однако ДИДС не влиял на скорость поглощения кислорода эритроцитами (рис. 5). Таким образом, высокая проницаемость эритроцигарной мембраны для кислорода не может, быть целиком связана с белком полосы 3. Тем не менее, полностью исключать участие этого белка в транспорте кислорода нельзя, так как эффект ингибирования ДИДС мог не проявиться на фоне низкой проницаемости неперемешиваемых слоев воды, являющихся основным барьером для диффузии кислорода в цитоплазму эритроцита.

HgCI2 и лХМБ. Наиболее вероятным кандидатом на роль кислородной поры является белок аква-порин 1 (AQP1), который в относительно высоких количествах содержится в мембране эритроцитов (около 2 • 105 молекул/кл.) (Agre et al., 1993). К настоящему моменту показано, что AQP1 принимает участие в транспорте через биологические мембраны СОг и N0. Однако общепринятая функция этого белка - повышение скорости трансмембранного транспорта воды. Транспорт воды через AQP1 ингибируется соединениями тяжелых металлов, в том числе ртути. Для выяснения роли этого белка в транспорте кислорода через мембрану эритроцитов было исследовано влияние HgCh и ртуть-органического соединения «ХМБ на скорость поглощения кислорода эритроцитами.

Для учета возможных неспецифических эффектов HgCl2 и и ХМБ на клетку, исследование влияния этих соединений на скорость кислородного обмена эритроцитов проводилось в сравнительном плане. В качестве контроля использовалось влияние ингибиторов на коэффициент осмо-

Рис. 8. Зависимости скорости поглощения кислорода эритроцитами (1п2/т1/з) (кривая 1) и коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов (Р'/) (кривая 2) от концентрации лХМБ (С). Время инкубации эритроцитов с иХМБ - 40 мин.

О jO 05 1.0 1J5 2.0 С(яХМБ).мМ

тической водной проницаемости мембраны (PJ). Так как осмотический поток воды через мембрану эритроцитов в основном проходит через аквапорин 1, коэффициент проницаемости мембраны для воды является хорошим показателем активности этого белка (Roudier et al., 1998).

Инкубация эритроцитов с HgCb приводила к существенному снижению скорости поглощения кислорода эритроцитами (рис. 6). На рис. 7 представлена концентрационная зависимость данного эффекта HgCb. Кроме того, на рис. 7 приведена зависимость коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов от концентрации HgCb. Коэффициент осмотической водной проницаемости оценивали исходя из скорости разбухания эритроцитов в гипотонической среде. Хорошо видно, что в том же диапазоне концентраций, в котором наблюдалось снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами, падал и коэффициент осмотической водной проницаемости.

Аналогичные результаты были получены и для яХМБ, хотя эффект снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами был выражен слабее и наблюдался при более высоких концентрациях ингибитора. Как и в случае HgClj, диапазоны концентраций, в которых наблюдалось снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами и снижение коэффициента осмотической водной проницаемости практически совпадали (рис. 8).

Процесс поглощения кислорода нативными эритроцитами при быстром смешивании анаэробной суспензии клеток со средой содержащей кислород детально исследован (Coin, Olson, 1979, Huxley, Kutchai, 1981; Vandegriff, Olson, 1984; Holland et al., 1985; Yamaguchi et al., 1985). Установлено, что реакция связывания кислорода дезоксигемоглобином в цитоплазме эритроцита является диффузионно-контролируемой. Притом существенный вклад в кинетику поглощения кислорода вносит диффузия во внеклеточной среде. Наличие диффузионных ограничений связано с высокой константой скорости реакции гемоглобина и кислорода и высокой кислородной проницаемостью немодифицированной мембраны эритроцита. В этих условиях при поглощении кисло-

рода клеткой его концентрация в примембранной области будет снижена по сравнению с концентрацией в объеме среды вдали от поверхности мембраны. Данное снижение обусловлено тем, что скорость диффузии кислорода в среде недостаточна для пополнения примембранного слоя.

Таким образом, при поглощении кислорода нативным эритроцитом градиент концентрации между внешней средой и цитоплазмой клетки будет практически полностью падать в примем-бранном слое, а не на мембране. Наличие примембранного градиента наблюдается и в случае стационарного переноса различных веществ через биологические и модельные мембраны при недостаточно интенсивном перемешивании объемов, разделяемых мембраной. Для описания трансмембранного транспорта веществ в условиях недостаточного перемешивания вводят понятие непере-мешиваемых слоев. Принимается, что градиент концентрации переносимого вещества в омывающей водной фазе между областями, локализованными вдали от поверхности мембраны и непосредственно у её поверхности, падает в пределах неперемешиваемого слоя. При наличии такого слоя измеренный в эксперименте коэффициент проницаемости (Р) занижен и связан с истинным коэффициентом проницаемости мембраны (Рт) следующим соотношением:

1 1 6

— = ——ь —, где S - толщина неперемешиваемого слоя, D - коэффициент диффузии ве-

" "m L)

щества в водной фазе, омывающей мембрану (Вапу, Diamond, 1984).

В некоторых работах понятие неперемешиваемого слоя использовалось и для описания процесса поглощения кислорода эритроцитами (Coin, Oison, 1979; Huxley, Kutchai, 1981). Так как подобное описание является удобным при проведении количественных оценок, оно использовалось и в настоящей работе.

Теоретический анализ процесса поглощения кислорода эритроцитами был проведен в работе Коина и Олсона. С помощью математического моделирования были получены теоретические кривые оксигенации гемоглобина эритроцитов. Наилучшее совпадение теоретических и экспериментальных кривых было получено при толщине неперемешиваемого слоя, равной 2,4 мкм, что соответствует коэффициенту проницаемости слоя 8,8 • 10"3 м/с. Это значение является и нижней границей истинного коэффициента проницаемости мембраны (Coin, Olson, 1979).

Снижение истинного коэффициента проницаемости мембраны эритроцита для кислорода должно привести к снижению толщины неперемешиваемого слоя. При этом вклад мембраны в суммарное диффузионное сопротивление на пути молекулы Oj из внешней среды в цитоплазму эритроцита возрастет.

Механизм снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами в присутствии ртутных SH-реагентов представляется нам следующим образом. HgCh и иХМБ, связываясь с мембранным белком, скорее всего AQP1, приводят к снижению коэффициента проницаемости мембраны эритроцитов для кислорода. При этом коэффициент проницаемости мембраны приближает-

ся к коэффициенту проницаемости липидного бислоя (по данным экспериментов на липидных монослоях он равен ~10"5 м/с). Вследствие падения мембранной проницаемости толщина непереме-шиваемого слоя снижается и «узким местом» процесса поглощения кислорода эритроцитами становится мембрана.

В нашей работе показано, что диапазоны концентраций ингибиторов, в которых наблюдалось снижение скорости трансмембранного транспорта воды и кислорода практически совпадают. Отсюда следует, что чувствительный к HgCh и лХМБ путь транспорта кислорода через мембрану эритроцитов связан в первую очередь с аквапорином AQP1. Однако HgCI2 и иХМБ могут связываться с сульфгидрильными группами различных мембранных белков. Можно предположить, что в транспорте кислорода через мембраны эритроцитов принимает участие не только AQP1, но и другой чувствительный к SH-реагентам белок или белковый комплекс.

Недавно было установлено, что белки комплекса резус-фактора (Rh-комплекса) мембраны эритроцитов участвуют в трансмембранном транспорте СО2 и NH3. При этом оказалось, что транспорт NH3 чувствителен к HgCh (Ripoche et al., 2004). Ранее было высказано предположение, что Rh-комплекс образует и пору для транспорта О2 (Bruce et al., 2003). Хотя результаты настоящей работы не позволяют выявить роль Rh-комплекса в трансмембранном транспорте кислорода, нельзя исключать, что снижение коэффициента проницаемости мембран эритроцитов в присутствии HgCh частично связано и с ингибированием Rh-белков.

Для всех белков семейства аквапоринов характерна сходная пространственная структура. Аквапорины образуют в мембране гомотетрамеры. Каждый из мономеров содержит водную пору. Кроме того, в центре тетрамера также имеется пора, функция которой окончательно не установлена.

Водная пора AQP1 имеет гантелевидную форму с двумя широкими устьями на внеклеточной и цитоплазматической сторонах. Более узкая селективная часть поры имеет минимальный диаметр 2,8 Ä (Murata et al., 2000; Ren et al, 2001; Siu et al., 2001). Минимальный диаметр центральной поры близок к диаметру водной поры и составляет около 3 А (Yool et al., 1996; Anthony et al., 2000; Saparov et al., 2001; Yool, Weinstein, 2002). Исходя только из эффективного диаметра молекулы Ог (около 2,6 Ä), теоретически можно предположить, что транспорт возможен через оба типа пор (Endeward et al., 2006).

Результаты, полученные в настоящей работе, не позволяют точно установить путь молекулы кислорода через AQP1. Известно, что центром связывания соединений ртути в AQP1 является аминокислотный остаток Cys 189, локализованный в водной поре. Эти данные указывают на то, что транспорт кислорода осуществляется преимущественно через водную пору AQP1.

Однако молекулярнодинамические расчеты не подтвердили этого предположения. Недавно было показано, что основной путь молекулы 02 через тегграмер AQP1 представлен центральной

порой. Проникновение молекулы кислорода через водную пору затруднено из-за сильных водородных связей между белком и молекулами воды (Wang et al., 2007). Возможно, что чувствительность транспорта кислорода через AQP1 к HgCh и иХМБ обусловлена конформационным переходом, который индуцируется связыванием ингибитора с Cysl89 водной поры. В результате изменения конформации белка может снижаться кислородная проницаемость центральной поры.

К настоящему моменту конформационные переходы в молекуле AQP1, индуцируемые связыванием HgCh или лХМБ, не выявлены. Однако изменение конформации, вызванное HgCh, показано для другого представителя семейства аквапоринов - растительного белка PMIP31 (Baron etal., 1997).

Для выяснения механизмов влияния ртутьсодержащих ингибиторов на скорость транспорта кислорода в эритроциты важно также знать: 1) как эти ингибиторы влияют на скорость реакции взаимодействия гемоглобина с кислородом, 2) какой эффект они оказывают на положение кривой диссоциации оксигемоглобина и 3) какое влияние эти соединения оказывают на микровязкость липидного бислоя плазматической мембраны эритроцитов.

Влияние НеСЬ и иХМБ на реакцию дезоксигемоглобина и кислорода в растворе. Использованные в настоящей работе ртутьсодержащие SH-реагенты могут проникать через мембрану эритроцитов (Weed et al., 1962; Vansteveninck et al., 1963). В цитоплазме эти соединения взаимодействуют с растворимыми белками, в первую очередь с гемоглобином. Можно предположить, что эффект снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами в присутствии HgCh и лХМБ обусловлен снижением сродства гемоглобина к кислороду, а не снижением мембранной проницаемости. Для проверки этого предположения было исследовано влияние этих соединений на константу скорости реакции дезоксигемоглобина и кислорода в растворе.

Кинетическую кривую реакции регистрировали с помощью метода остановленной струи при смешивании раствора дезоксигемоглобина с раствором, содержащим кислород. Основная трудность получения кинетической кривой состояла в том, что константа скорости исследуемой реакции высока (более 106 М1 • с"1) (Coin, Olson, 1979). Для снижения скорости реакции использовалась низкая концентрация кислорода (62,5 мкМ до смешивания), которая была равна 'А концентрации Ог в растворе, уравновешенном с атмосферным воздухом.

В отсутствие HgCh и иХМБ константа скорости реакции дезоксигемоглобина и кислорода составила 6,05 • 106 М"1 • с"1, эта величина хорошо согласуется с литературными данными (Gibson et al., 1955). В присутствии HgCh константа скорости реакции дезоксигемоглобина и кислорода снижалась (рис. 9, 10). Наибольший эффект наблюдался при концентрации HgCl2 60 мкМ: константа скорости снижалась до 1,13 • 10б М"1 • с"1 (в 5,4 раза по сравнению с контролем).

2 Ь

100

С(НЕС!2), мкМ

Рис. 9. Кинетические кривые реакции дезок- Рис. 10. Зависимость константы скорости ре-

сигемоглобина с кислородом в растворе. Рас- акции дезоксигемоглобина с кислородом

твор дезоксигемоглобина (5 мкМ после сме- (к) от концентрации Ь^СЬ (С).

шивания) смешан с буфером, содержащим

кислород (31,25 мкМ после смешивания). По

оси ординат отложена доля гемовых групп, не

связанных с кислородом

Кривая 1 - контроль.

Кривая 2-60 мкМ Н§С12.

При низких концентрациях иХМБ (до 100 мкМ) константа скорости реакции гемоглобина с кислородом возрастала. Однако при концентрациях 1 и 2 мМ, приводящих к снижению скорости поглощения кислорода эритроцитами, константа скорости была ниже, чем в контроле (рис. 11). Эффект снижения константы скорости в присутствии высоких концентраций иХМБ был выражен слабее, чем эффект Н§С1г и не превышал 50%.

Связывание кислорода гемоглобином в цитоплазме эритроцитов (т.е. химическая реакция гемоглобина и кислорода) процесс, контролируемый диффузией. Отсюда следует, что изменение константы скорости этой реакции в некотором диапазоне не должно привести к существенному изменению скорости поглощения кислорода эритроцитами. Границы этого диапазона были установлены в экспериментах по регистрации кинетики поглощения эритроцитами двух других лиган-дов гемоглобина - оксидов азота и углерода (N0 и СО). Константы скорости реакции этих лиган-дов с гемоглобином в растворе отличаются на два порядка (2 • 10 М" ■ с" для N0 и 2 • 105 М"1 • с" для СО), однако скорости их поглощения эритроцитами практически совпадают (СагЬеп, Сотгое, 1958).

При всех использованных в работе концентрациях ртутных 5Н-реагентов константа скорости реакции дезоксигемоглобина и кислорода превышала величину 2 • 105 М"1 • с"1 (константу скорости реакции НЬ + СО). Таким образом, подобное снижение константы не может быть причиной нарушения режима диффузионного лимитирования процесса поглощения кислорода эрит-

\

Рис. 11. Зависимость константы скорости реакции дезоксигемоглобина с кислородом (к) от концентрации лХМБ (С).

4 -

\

2

10

100

С(лХМБ), икМ

роцитами. Следовательно, только снижение константы скорости реакции гемоглобина и кислорода не может объяснить наблюдавшегося нами снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами в присутствии НёС12 и лХМБ.

Влияние НаСЬ на кривую диссоциации оксигемоглобина. Как было показано в предыдущем разделе, в растворе ЩСЬ приводит к снижению константы скорости реакции дезоксигемоглобина и кислорода. Однако эффекты Ь^СЦ на реакцию НЬ + 02 в разбавленном растворе гемоглобина и в эритроците могут быть различны.

Равновесие гемоглобина и кислорода описывается кривой диссоциации оксигемоглобина. Мы исследовали влияние ЩСЬ на форму этой кривой в эритроцитах. Кривые диссоциации оксигемоглобина получали при титровании анаэробной суспензии эритроцитов, содержащей фермент каталазу, раствором пероксида водорода Н2О2. Благодаря низкой скорости подачи раствора, содержащего Н2О2, для реакции гемоглобина и кислорода обеспечивались условия близкие к равновесию (К1езо\уе/а/., 1972).

Концентрация не связанного с гемоглобином кислорода, соответствующая 50% насыщению гемоглобина ([О2]5о%), для контрольной суспензии эритроцитов равна 10 мкМ. При увеличении концентрации Н^СЬ наблюдалось снижение сродства гемоглобина эритроцитов к кислороду. При 120 мкМ НёС12 величина [О2]5о% возрастала примерно до 27 мкМ (рис. 12).

Форма кривой диссоциации оксигемоглобина изменяется под воздействием целого ряда факторов (температура, концентрация СОг и неорганических фосфатов). Из физиологии хорошо известен эффект Бора, суть которого заключается в существенной зависимости сродства гемоглобина к кислороду от величины рН среды. На рис. 12 представлены кривые диссоциации оксигемоглобина эритроцитов при рН среды инкубации 7,4 и 6,6. Хорошо видно, что кривая, полученная

Кривая 1 (•) - контроль (рН = 7,4; без Кривая 2 (о) - 120 мкМ Нь'С12 (рН = 7,4).

Кривая 3 (—) - рН = 6,6 (без ЩС12).

о

20 40 ВО

Юг].мкМ

80

100

при рН = 6,6, практически совпадает с кривой эритроцитов, проинкубированных с 120 мкМ ЩСЬ (при физиологическом значении рН = 7,4). Для эритроцитов, проинкубированных с 120 мкМ Н§СЬ, скорость поглощения кислорода в 2,5 раза ниже, чем в контроле (рис. 7). Однако скорость поглощения кислорода эритроцитами при изменении рН от 7,4 до 6,6 падает лишь в 1,4 раза. Это означает, что сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина в присутствии не является един-

ственной причиной снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами.

В работе показано, что ЩСЬ и лХМБ могут изменять кинетические и равновесные характеристики реакции гемоглобина с кислородом. Однако наблюдавшиеся изменения не могут полностью объяснить снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами. Эти результаты согласуются с предположением, что снижение коэффициента проницаемости мембраны для кислорода является одной из причин снижения скорости оксигенации гемоглобина эритроцитов под действием ртутьсодержащих БН-реагентов.

Влияние НеСЬ на микровязкость липидного бислоя мембран эритроцитов. Снижение коэффициента проницаемости мембран эритроцитов для кислорода в присутствии ртутьсодержащих вН-реагентов может быть связано не только с ингибированием мембранных белков, но и с замедлением скорости диффузии кислорода через липидный бислой. Коэффициент диффузии кислорода связан с величиной микровязкости бислоя.

Влияние 1^С12 на микровязкость бислоя мембран эритроцитов было исследовано с помощью метода ЭПР. Микровязкость оценивалась по величине времени корреляции вращательного движения (х) спинового зонда 16-доксилстеариновой кислоты.

Как видно из рис. 13 т практически не изменялось с ростом концентрации ЩСЬ. Таким образом, мы не обнаружили изменения микровязкости липидного бислоя мембран эритроцитов в

Рис. 13. Зависимость времени корреляции вращательного движения спинового зонда 16-доксилстеариновой кислоты (х) в суспензии эритроцитов от количества ЩС^.

2 4 6 6 мольное соотношение НвСЛ^гем

присутствии НдСЬ. Следовательно, Н§СЬ не может вызвать существенного снижения коэффициента диффузии кислорода в липидном бислое эритроцитарной мембраны. Результаты об отсутствии влияния Н8С12 на микровязкость бислоя согласуются с предположением, что именно ингиби-рование мембранных белков приводит к снижению коэффициента проницаемости эритроцитарной мембраны для кислорода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые были выявлены некоторые особенности процесса транспорта кислорода через мембрану эритроцитов человека. Было показано, что липидный компонент эритроцитарной мембраны оказывает существенное сопротивление диффузии кислорода. Это означает, что простая диффузия через липидный бислой не может обеспечить наблюдаемой в эксперименте высокой проницаемости мембраны эритроцита для кислорода.

В экспериментах, выполненных методом остановленной струи, было установлено, что процесс поглощения кислорода эритроцитами чувствителен к ртутьсодержащим сульфгидриль-ным реагентам. В контрольных экспериментах было показано, что эффект снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами не связан полностью с влиянием SH-реагентов на гемоглобин и структуру липидного бислоя.

Совокупность результатов, полученных в работе, указывает на значительный вклад мембранных белков в процесс транспорта кислорода через мембрану эритроцитов человека. Наиболее вероятным кандидатом на роль кислородной поры, обеспечивающей высокую скорость диффузии кислорода через эритроцитарную мембрану, является белок аквапорин 1 (AQP1).

Аквапорин 1 в большом количестве (около 2 • 105 молекул/кл.) представлен в мембране эритроцитов человека (Agre et al., 1993). Известно, что AQP1 обеспечивает очень высокую прони-

цаемость эритроцитарной мембраны для воды (Roudier et al, 1998). Однако до сих пор не решен вопрос о функциональной значимости этой высокой водной проницаемости.

Молекула AQP1 содержит антигенные детерминанты группы крови Colton (Prestan et al., 1994; Smith et al, 1994). К настоящему моменту в мире известно 7 человек с фенотипом Colton-null, сопряженным с потерей функционально-активного белка AQP1 (Endeward et al., 2006). Интересно, что у этих людей не обнаружено существенных клинических проявлений отсутствия AQP1, за исключением снижения концентрационной функции почек в условиях водной депривации (King et al., 2001). Осмотическая водная проницаемость мембран эритроцитов людей с фенотипом Col-ton-null существенно снижена (Mathai et al, 1996; Roudier et al, 1998).

Отсутствие нарушений дыхания у людей, лишенных AQP1, на наш взгляд, вполне объяснимо. Известно, что в отсутствие физической нагрузки время нахождения эритроцита в капиллярах легких примерно в 3 раза превышает время установления равновесия по 02 и СОг между гемоглобином и альвеолярным воздухом (Endeward el al., 2006; West, 2008). Это означает, что имеется некоторый запас времени, который может обеспечить надлежащую оксигенацию гемоглобина эритроцитов в условиях сниженной кислородной проницаемости их мембран. Кроме того, нельзя исключать, что в организме людей с фенотипом Colton-null, развиваются изменения, компенсирующие отсутствие AQP1. Возможно, что при недостатке аквапорина 1 повышается уровень экспрессии другого белка или комплекса, участвующего в трансмембранном транспорте кислорода, например Rh-комплекса.

Недавно участие аквапорина 1 в трансмембранном транспорте кислорода было подтверждено в экспериментах на культуре клеток с повышенным уровнем экспрессии этого белка (Echevarría et al., 2007). По сравнению с клетками с нормальным содержанием AQP1 клетки с его повышенным содержанием характеризовались

1) повышенным уровнем экспресии гипоксия-индуцибельных генов в условиях гипоксии;

2) повышенной скоростью продукции одной из субъединиц гипоксия-индуцируемого фактора транскрипции (HIF2a) в условиях гипоксии и повышенной скоростью ее деградации при реокси-генации;

3) повышенной скоростью потери цитоплазматического кислорода в условиях гипоксии.

Кроме того, в этой работе было показано, что в условиях гипоксии уровень экспрессии AQP1 в эндотелии капилляров легких мышей существенно возрастает. Это может означать, что AQP1 принимает участие в адаптации организма к условиям сниженной концентрации кислорода. Возможно, что повышение экспрессии этого белка улучшает кислородное обеспечение тканей путем снижения диффузионного сопротивления для 02 стенки легочных капилляров.

выводы

1. Исследовано влияние монослойных мембран из суммарных липидов эритроцитов на диффузию кислорода через границу раздела фаз вода/воздух. Установлено, что в присутствии липид-ной мембраны стационарный диффузионный поток кислорода через межфазную границу снижается. Рассчитан коэффициент проницаемости монослойной мембраны из суммарных липидов эритроцитов; средняя величина коэффициента проницаемости при поверхностном давлении 27,6 мН/м равна (3,42 ± 0,11) • 10"5 м/с. Полученная величина примерно на 4 порядка ниже ранее принятой в литературе, что свидетельствует о высоком диффузионном сопротивлении липидного бислоя мембраны эритроцитов для кислорода.

2. Методом остановленной струи с двухволновой фотометрической регистрацией исследовано влияние ингибиторов мембранного транспорта (ДИДС, ^СЬ и лХМБ) на кинетические кривые транспорта воды и анионов через мембрану эритроцитов, а также поглощения кислорода эритроцитами.

A) Показано, что инкубация эритроцитов с ДИДС полностью ингибирует анионный транспорт (иона N08") через мембрану эритроцитов, но не приводит к изменению скорости поглощения кислорода эритроцитами.

Б) Получена концентрационная зависимость снижения эффективной константы скорости поглощения кислорода эритроцитами (1п2/Т]/2) от концентрации Н^Ь. Максимальное снижение эффективной константы скорости поглощения кислорода эритроцитами (в 2,8 раза) наблюдалось при концентрации Н£С1г 240 мкМ.

B) Получена концентрационная зависимость снижения эффективной константы скорости поглощения кислорода эритроцитами от концентрации нХМБ. Максимальное снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами (в 1,8 раза) наблюдалось при концентрации иХМБ 2,5 мМ.

3. Установлено, что диапазоны концентраций ^С12 и иХМБ, при которых наблюдалось снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами практически совпадают с диапазонами концентраций, при которых наблюдалось снижение коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов.

4. Методом остановленной струи с фотометрической регистрацией исследовано влияние

Н§СЬ и тгХМБ на константу скорости реакции гемоглобина с кислородом в гомогенном растворе. Показано, что лХМБ в концентрациях, превышающих 320 мкМ, и Ь^СЬ снижают константу скорости реакции гемоглобина с кислородом. Максимальное снижение константы скорости (в 5,4

раза) наблюдалось в присутствии 60 мкМ Ь^СЬ, однако такого снижения недостаточно для выхода процесса поглощения кислорода эритроцитами из режима диффузионного лимитирования.

5. Исследовано влияние НцС^ на кривые диссоциации оксигемоглобина эритроцитов. Показано, что инкубация эритроцитов с ЩОг приводит к сдвигу равновесной кривой диссоциации оксигемоглобина в область более высоких концентраций кислорода, т. е. к снижению сродства гемоглобина к кислороду. Моделирование снижения сродства за счет понижения рН позволило установить, что оно обусловливает не более 50% суммарного снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами при действии Н^Ь.

6. Предложен механизм снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами в присутствии Н§С12 и иХМБ, основанный на ингибировании этими соединениями белка мембраны эритроцитов аквапорина 1.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов И.И., Гуськова Р.А., Локтюшкин А.В., Федоров Г.Е. Мембрана эритроцита: барьер или ворота для кислорода? // Докл. МОИП, 2005, т. 36, с. 53-55.

2. Иванов И.И., Локтюшкин А.В., Гуськова Р.А., Васильев Н.С., Федоров Г.Е., Рубин А.Б. Кислородные каналы мембраны эритроцита // ДАН, 2007, т. 414, № 5, с. 697-700.

3. Локтюшкин А.В., Гуськова Р.А., Федоров Г.Е., Иванов И.И. Проницаемость липидного компонента мембран эритроцитов для кислорода // Сборник статей международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск, Беларусь, 2008, ч. 1., с. 222-224.

4. Локтюшкин А.В., Гуськова Р.А., Федоров Г.Е., Чуркина Л.А., Иванов И.И. Оценка уровня загрязнения природных вод ПАВ полярографическим методом // Материалы научно-практической конференции в рамках международной научно-образовательной школы-конференции по биоинженерии и приложениям «Перспективы развития инноваций в биологии», Москва, 2007, с. 51.

5. Локтюшкин А.В., Чуркина Л.А., Гуськова Р.А., Федоров Г.Е., Иванов И.И. Влияние AgNOî на скорость диссоциации оксигемоглобина // Материалы III Международной научно-практической конференции «Новости научной мысли - 2007», Белгород, 2007, т. 10, с. 54-57.

6. Loktyushkin А. V., Gus 'kova R.A., Fedorov G.E., Ivanov I.I. The influence of HgCh on the rate of oxygen uptake and release by red blood cells // International symposium «Modem spectroscopy methods in studying structure and function of biopolymers in biology and medicine» Abstracts, Dubna, Russia, 2007, p. 30.

Подписано в печать 04.03.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 826 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Локтюшкин, Алексей Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Транспорт незаряженных молекул через биологические мембраны и модельные мембранные системы.

1. 1. 1. Транспорт неэлектролитов через липидный бислой биологических мембран.

1. 1. 2. Облегченная диффузия.

1. 1.3. Диффузия через белковые поры.

1. 1.4. Структура белков семейства аквапоринов.

1. 1. 5. Роль аквапоринов в транспорте газов (СО2, NH3 и NO) через биологические мембраны и модельные мембранные системы.

1. 1.6. Роль белка полосы 3 и комплекса белков резус-фактора в транспорте газов (СО2 и NH3) через биологические мембраны.

1. 2. Проницаемость биологических и модельных мембран для кислорода.

1.2. 1. Метод флуоресцентных зондов.

1. 2. 2. Метод спиновых зондов.

1. 2. 3. Метод монослоев.

1. 2. 4. Роль мембранных белков в трансмембранном транспорте кислорода.

1. 3. Основные характеристики процесса связывания кислорода эритроцитами по данным струевых методов.

1.3. 1. Поглощение кислорода эритроцитами.

1. 3. 2. Дезоксигенация гемоглобина эритроцитов в присутствии дитио-нита натрия.

Цели и задачи исследования.

Глава 2. Материалы и методы.

2. 1. Измерение коэффициента проницаемости для кислорода монослойных мембран из суммарных липидов эритроцитов.

2. 1. 1. Выделение суммарных липидов из эритроцитов.

2. 1.2. Измерение коэффициента проницаемости для кислорода.

2. 2. Кинетические эксперименты.

2. 2. 1. Описание экспериментальной установки.

2. 2. 2. Определение скорости поглощения роданит-иона эритроцитами.

2. 2. 3. Определение скорости поглощения 02 и СО эритроцитами.

2. 2. 4. Определение коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов.

2. 2. 5. Регистрация кинетических кривых взаимодействия гемоглобина и Ог в гомогенном растворе.

2. 3. Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина эритроцитов.

2. 4. Определение микровязкости липидного бислоя мембраны эритроцитов.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Проницаемость липидного компонента мембран эритроцитов для кислорода.

3. 2. Влияние ингибиторов мембранного транспорта на скорость поглощения кислорода эритроцитами.

3.2. 1. ДИДС.

3.2. 2. HgCl2 и гсХМБ.

3.3. Влияние HgCl2 и гсХМБ на кинетику реакции гемоглобина и кислорода в гомогенном растворе.

3. 4. Влияние HgCl2 на кривую диссоциации оксигемоглобина.

3.5. Влияние HgCl2 на микровязкость липидного бислоя мембраны эритроцитов.

3. 6. Структурные основы и физиологическая значимость транспорта через мембрану эритроцитов с участием мембранных белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности транспорта кислорода через мембрану эритроцитов"

Функцию переноса молекулярного кислорода от легких к клеткам-потребителям у позвоночных животных и человека выполняют специализированные клетки крови - эритроциты. Они наполнены железосодержащим белком гемоглобином, составляющим до 94% сухой массы клетки. В капиллярах легких человека насыщение гемоглобина эритроцитов кислородом происходит за четверть секунды (West, 1985; Endeward et al., 2006). При этом в цитоплазму эритроцита проникает примерно третья часть переносимого им кислорода. Очевидно, что столь быстрая оксигенация эритроцитарного гемоглобина в легких возможна лишь при условии существования весьма интенсивного переноса кислорода через мембрану эритроцитов.

Известно, что мембрана эритроцитов не оказывает существенного сопротивления для диффузии кислорода (Kreuzer, Yahr, 1960). Подтверждение этому было получено в модельных экспериментах, выполненных методом остановленной струи. С помощью этого метода можно наблюдать кинетику процесса переноса кислорода из внешней среды в цитоплазму эритроцитов по изменению во времени соотношения окси- и дезоксигемоглобина (Hartridge, Roughton, 1927). Полученные этим методом результаты показали, что скорость поглощения 02 эритроцитами определяется скоростью диффузии, а не химической реакцией взаимодействия О2 с гемоглобином в клетке. Установлено, что основным диффузионным барьером, определяющим скорость переноса О2 в цитоплазму эритроцитов, является высокое диффузионное сопротивление неперемешиваемого слоя воды, окружающего клетку, а вклад сопротивления мембраны незначителен (Coin, Olson, 1979; Huxley, Kutchai, 1981; Vandegriff, Olson, 1984; Holland et al., 1985; Yamaguchi et al, 1985). Объем, качество и уровень теоретического анализа экспериментального материала, подтверждающего надежность этих представлений, оказались настолько убедительными, что дальнейшие исследования роли мембраны в кислородном газообмене эритроцитов с помощью метода остановленной струи были фактически свернуты более 20 лет тому назад. 6

Высокая проницаемость мембран эритроцитов для кислорода может быть обусловлена высокой проницаемостью липидного бислоя. Такое объяснение основано на традиционном предположении о том, что проницаемость для кислорода липидного бислоя биологических и модельных мембран близка к проницаемости слоя воды аналогичной толщины. Эти представления вытекают, в основном, из результатов косвенных экспериментов с использованием флуоресцентных и спиновых зондов (Fischkoff, Vanderkooi, 1975; Subczynski et al., 1981; 1989; 1991; 1992; Kusumi et al., 1982; 1986; Ligeza et al., 1998; Subczynski, Wisniewska, 2000; Widomska et al., 2007).

Этой точке зрения, однако, противоречит тот факт, что величина микровязкости липидного бислоя биологических мембран примерно на два порядка выше вязкости воды (Cogan et al., 1973; Edidin, 1974; Sinensky, 1974). В соответствии с законами диффузии, подвижности молекул кислорода в таких средах должны сильно различаться. С этим согласуются результаты прямых измерений трансмембранных диффузионных потоков 02 через моно-слойные липидные мембраны (Blank, 1962; Гуськова и соавт., 2000; Федоров и соавт., 2000; Ivanov et al., 2004).

В связи с этим, приобретает актуальность вопрос о существовании дополнительных путей переноса молекулярного кислорода через мембрану эритроцитов человека наряду с простой диффузией через липидный бислой. К настоящему времени показано, что некоторые малые незаряженные молекулы (С02, NO, NH3, Н20, Н202) могут проникать через биологические мембраны при участии белковых пор. Возможно, что белки обеспечивают высокую проницаемость мембран эритроцитов человека и для кислорода.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Локтюшкин, Алексей Владимирович

выводы

1. Исследовано влияние монослойных мембран из суммарных липидов эритроцитов на диффузию кислорода через границу раздела фаз вода/воздух. Установлено, что в присутствии липидной мембраны стационарный диффузионный поток кислорода через межфазную границу снижается. Рассчитан коэффициент проницаемости монослойной мембраны из суммарных липидов эритроцитов; средняя величина коэффициента проницаемости при поверхностном давлении 27,6 мН/м равна (3,42 ± 0,11) • 10"5 м/с. Полученная величина примерно на 4 порядка ниже ранее принятой в литературе, что свидетельствует о высоком диффузионном сопротивлении липидного бислоя мембраны эритроцитов для кислорода.

2. Методом остановленной струи с двухволновой фотометрической регистрацией исследовано влияние ингибиторов мембранного транспорта (ДИДС, HgCl2 и яХМБ) на кинетические кривые транспорта воды и анионов через мембрану эритроцитов, а также поглощения кислорода эритроцитами.

A) Показано, что инкубация эритроцитов с ДИДС полностью ингиби-рует анионный транспорт (иона NCS') через мембрану эритроцитов, но не приводит к изменению скорости поглощения кислорода эритроцитами.

Б) Получена концентрационная зависимость снижения эффективной константы скорости поглощения кислорода эритроцитами (ln2/ii/2) от концентрации HgCl2. Максимальное снижение эффективной константы скорости поглощения кислорода эритроцитами (в 2,8 раза) наблюдалось при концентрации HgCl2 240 мкМ.

B) Получена концентрационная зависимость снижения эффективной константы скорости поглощения кислорода эритроцитами от концентрации иХМБ. Максимальное снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами (в 1,8 раза) наблюдалось при концентрации иХМБ 2,5 мМ.

109

3. Установлено, что диапазоны концентраций HgCl2 и гсХМБ, при которых наблюдалось снижение скорости поглощения кислорода эритроцитами практически совпадают с диапазонами концентраций, при которых наблюдалось снижение коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны эритроцитов.

4. Методом остановленной струи с фотометрической регистрацией исследовано влияние HgCl2 и иХМБ на константу скорости реакции гемоглобина с кислородом в гомогенном растворе. Показано, что яХМБ в концентрациях, превышающих 320 мкМ, и HgCl2 снижают константу скорости реакции гемоглобина с кислородом. Максимальное снижение константы скорости (в 5,4 раза) наблюдалось в присутствии 60 мкМ HgCl2, однако такого снижения недостаточно для выхода процесса поглощения кислорода эритроцитами из режима диффузионного лимитирования.

5. Исследовано влияние HgCl2 на кривые диссоциации оксигемоглобина эритроцитов. Показано, что инкубация эритроцитов с HgCl2 приводит к сдвигу равновесной кривой диссоциации оксигемоглобина в область более высоких концентраций кислорода, т. е. к снижению сродства гемоглобина к кислороду. Моделирование снижения сродства за счет понижения рН позволило установить, что оно обусловливает не более 50% суммарного снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами при действии HgCl2.

6. Предложен механизм снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами в присутствии HgCl2 и иХМБ, основанный на ингибировании этими соединениями белка мембраны эритроцитов аквапорина 1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые были выявлены некоторые особенности процесса транспорта молекулярного кислорода через мембрану эритроцитов человека. Использование оригинальной монослойной техники позволило установить, что липидный компонент мембраны эритроцитов оказывает существенное сопротивление диффузии кислорода. Это означает, что простая диффузия через липидный бислой не может обеспечить наблюдаемой в эксперименте высокой проницаемости эритроцитарной мембраны для кислорода.

Для объяснения существенного различия между проницаемостью липидного компонента и нативной мембраны эритроцитов было выдвинуто предположение, что мембранные белки принимают участие в переносе кислорода. Это предположение основано на многочисленных литературных данных об участии белков в трансмембранном транспорте растворенных простых газов и ряда малых молекул неэлектролитов.

Для установления роли белков в транспорте кислорода через эритро-цитарную мембрану использовалась методика регистрации кинетических кривых поглощения кислорода эритроцитами. Обработка эритроцитов ртуть-содержащими сульфгидрильными реагентами приводила в наших экспериментах к существенному снижению скорости поглощения кислорода эритроцитами.

Для интерпретации этого эффекта исследовали влияние SH-реагентов на параметры реакции гемоглобина и кислорода, а также на микровязкость липидного бислоя мембран эритроцитов. Установлено, что обнаруженное снижение сродства гемоглобина к кислороду при действии SH-реагентов не может полностью объяснить наблюдавшегося нами значительного снижения скорости поглощения кислорода эритроцитами. В присутствии SH-реагентов микровязкость липидного слоя мембран эритроцитов практически не менялась. По нашему мнению, полученные в данной работе экспериментальные

107 результаты согласуются с предположением, что снижение коэффициента проницаемости мембраны в результате ингибирования белковых пор является важной причиной снижения скорости оксигенации гемоглобина эритритов при действии ртутных SH-реагентов.

Безусловно, для окончательного подтверждения роли белков (в первую очередь аквапорина AQP1) в транспорте кислорода через мембрану эритроцитов требуются дальнейшие исследования. Это обусловлено, в первую очередь, неспецифичностью использованных нами ингибиторов. Однако следует отметить, что достаточно специфичные к аквапорину ингибиторы до сих пор не обнаружены. Вероятно, результаты, которые позволят окончательно установить роль AQP1 в трансмембранном транспорте кислорода, могут быть получены при исследовании процесса оксигенации гемоглобина эритроцитов, не содержащих аквапорина.

В заключение отметим, что полученные в работе результаты расширяют имеющиеся представления о механизмах токсического действия соединений ртути на живые организмы. Токсические эффекты этих соединений могут быть частично связаны с нарушением кислородного обеспечения тканей организма в результате снижения сродства гемоглобина к кислороду или уменьшения проницаемости для кислорода мембран эритроцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Локтюшкин, Алексей Владимирович, Москва

1. Гусъкова Р.А., Федоров Г.Е., Белевич Н.П., Ахобадзе В.В., Иванов И.И. Влияние липидных монослоев на диффузию кислорода через границу раздела воздух/вода//Биофизика. 2000. Т. 45. С. 654-659.

2. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. Москва: Мир, 1980. 341 с.

3. Титовец Э. П. Аквапорины человека и животных: фундаментальные и клинические аспекты. Минск: Белорусская наука, 2007. 239 с.

4. Федоров Г.Е., Белевич Н.П., Гусъкова Р.А., Ахобадзе В.В., Иванов И.И. Автоматизированная система для измерения диффузионных потоков кислорода через границу раздела воздух/вода// Биофизика. 2000. Т. 45. С. 575-576.

5. Шапигузов А.Ю. Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции // Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 142-152.

6. Эмануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. Москва: Высшая школа, 1974. 400 с.

7. Abumrad N., Harmon С., Ibrahimi A. Membrane transport of long-chain fatty acids: evidence for a facilitated process // J. Lipid Res. 1998. V. 39(12). P. 2309-2318.

8. Agre P., King L.S., Yasui M., Guggino W.B., Ottersen O.P., Fujiyoshi Y., Engel A., Nielsen S. Aquaporin water channels from atomic structure to clinical medicine // J. Physiol. 2002. P. 542. V. 3-16

9. Agre P., Kozono D. Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases // FEBS Lett. 2003. V. 555(1). P. 72-78.

10. Agre P., Preston G.M., Smith B.L., Jung J.S., Raina'S., Moon C., Guggino W.B., Nielsen S. Aquaporin CHIP: the archetypal molecular water channel // Am. J. Physiol. 1993. V. 265(4). P. 463-476.

11. Al-Awqati Q. One hundred years of membrane permeability: does Overton still rule? //Nat. Cell Biol. 1999. V. 1(8). P. E201-E202.

12. Alvarez J., Lee D.C., Baldwin S.A., Chapman D. Fourier transform infrared spectroscopic study of the structure and conformational changes of the human erythrocyte glucose transporter// J. Biol. Chem. 1987. V. 262(8). P. 3502-3509.

13. Anthony T.L., Brooks H.L., Boassa D., Leonov S., Yanochko G.M., Regan J.W, Yool A.J. Cloned human aquaporin-1 is a cyclic GMP-gated ion channel // Mol. Pharmacol. 2000. V. 57(3). P. 576-588.

14. Baron L., Shih C., Wasserman B. Mercury-induced conformational changes and identification of conserved surface loops in plasma membrane aquaporins from higher plants // J. Biol. Chem. 1997. V. 272(49). P. 30672-30677.

15. Barry P.H., Diamond J.M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena //Physiol. Rev. 1984. V. 64(3). P. 763-872.

16. Battino R., Evans F.D., Danforth W.F. The solubilities of seven gases in olive oil with reference to theories of transport through the cell membrane // J. Am. Oil Chem. Soc. 1968. V. 45(12). P. 830-833.

17. Benesch R., Benesch R.E. the chemistry of the bohr effect, i. the reaction of n-ethyl maleimide with the oxygen-linked acid groups of hemoglobin // J. Biol. Chem. 1961. V. 236(2). P. 405-410.

18. Benz R., Bauer K. Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane of gram-negative bacteria. Review on bacterial porins // Eur. J. Bio-chem. 1988. V. 176(1). P. 1-19.

19. Bienert G.P., Moller A.L., Kristiansen K.A., Schulz A., M0ller I.M., Schjoer-ring J.K., John T.P. Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes // J. Biol. Chem. 2007. V. 282(2). P. 1183-1192.

20. Birdi K.S. Lipid and biopolymer monolayers at liquid interfaces. New York: Plenum Press, 1998. 340 p.

21. Blank M. Monolayer permeability and the properties of natural membranes 11 J. Phys. Chem. 1962. V. 66(10). P. 1911-1918.

22. Blank M.E., Ehmke H. Aquaporin-1 and НСОз"-СГ transporter-mediated transport of CO2 across the human erythrocyte membrane // J. Physiol. 2003. V. 50(2). P. 419-429.

23. Blank M., Roughton F. J. W. The permeability of monolayers to carbon dioxide // Trans. Faraday Soc. 1960. V. 56. P. 1832-1841.

24. Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule // Ann. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 175-195.

25. Brooks H.L., Regan J.W., Yool A.J. Inhibition of aquaporin-1 water permeability by tetraethylammonium: involvement of the loop E pore region // Mol. Pharmacol. 2000. V. 57(5). P. 1021-1026.

26. Bruce L.J. Red cell membrane transport abnormalities // Curr. Opin. Hema-tol. 2008. V. 15(3). P. 184-190.

27. Bruce L.J., Beckmann R., Ribeiro M.L., Peters L.L., Chasis J.A., Delaunay J., Mohandas N., Anstee D.J., Tanner M.J. A band 3-based macrocomplex of integral and peripheral proteins in the RBC membrane // Blood. 2003. V. 101(10). P. 4180^1188.

28. Burykin A., Warshel A. What really prevents proton transport through aqua-porin? Charge self-energy versus proton wire proposals // Biophys. J. 2003. V. 85(6). P. 3696-3706.

29. Carlsen E., Comroe J.H. The rate of uptake of carbon monoxide and of nitric oxide by normal human erythrocytes and experimentally produced spherocytes // J. Gen. Physiol. 1958. V. 42(1). P. 83-107.

30. Carruthers A. Facilitated diffusion of glucose // Physiol. Rev. 1990. V. 70(4). P. 1135-1176.

31. Carruthers A. Mechanisms for the facilitated diffusion of substrates across cell membranes //Biochemistry. 1991. V. 30(16). P. 3898-3906.

32. Carruthers A., Melchior D.L. Studies of the relationship between bilayer water permeability and bilayer physical state // Biochemistry. 1983. V. 22(25). P. 5797-5807.

33. Carter E.P., Olveczky B.P., Matthay M.A., VerkmanA.S. High microvascular endothelial water permeability in mouse lung measured by a pleural surface fluorescence method // Biophys. J. 1998. V. 74(4). P. 2121-2128.

34. Cecil R., Snow N.S. The reaction of normal adult human haemoglobin with heavy-metal reagents // Biochem. J. 1962. V. 82. P. 247-255.

35. Chakrabarti N., Tajkhorshid E., Roux В., Pomes R. Molecular basis of proton blockage in aquaporins // Structure. 2004. V. 12(1). P. 65-74.

36. Chakraborty S., Balakotaiah V., Bidani A. Diffusing capacity reexamined: relative roles of diffusion and chemical reaction in red cell uptake of CO, CO2, and NO // J. Appl. Physiol. 2004. V. 97(6). P. 2284-2302.

37. Cogan U., Shinitzky M., Weber G., Nishida T. Microviscosity and order in the hydrocarbon region of phospholipid and phospholipid-cholesterol dispersions determined with fluorescent probes //Biochemistry. 1973. V. 12(3). P. 521-528.

38. Coin J.T., Olson J.S. The rate of oxygen uptake by human red blood cells // J. Biol. Chem. 1979. V. 254(4). P. 1178-1190.

39. Cooper G.J., Boron W.F. Effect of PCMBS on C02 permeability of Xenopus oocytes expressing aquaporin 1 or its C189S mutant // Am. J. Physiol. 1998. V. 275(6). P. 1481-1486.

40. Cooper G.J., Virkki L. V., Boron W. F. Effect of expressing Nodulin 26 on the membrane permeability of Xenopus oocytes to NH3/NH41" and acetic acid // FASEB Journal. 1999. V. 13. P. 26.

41. Cooper G.J., Zhou Y., Bouyer P., Grichtchenko I.I., Boron W.F. Transport of volatile solutes through AQP1 // J. Physiol. 2002. V. 542(1). P. 17-29.

42. Denker B.M., Smith B.L., Kuhajda F.P., Agre P. Identification, purification, and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules // J. Biol. Chem. 1988. V. 263(30). P. 15634-15642.

43. Diamond J.M., Katz Y Interpretation of nonelectrolyte partition coefficients between dimyristoyl lecithin and water // J. Membr. Biol. 1974. V. 17(2). P. 121254.

44. Dzikovski B.G., Livshits V.A., Marsh D. Oxygen permeation profile in lipid membranes: comparison with transmembrane polarity profile // Biophys. J. 2003. V. 85(2). P. 1005-1012.

45. Edidin M. Rotational and translational diffusion in membranes // Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1974. V. 3. P. 179-201.

46. Endeward V., Cartron J.P., Ripoche P., Gros G. RhAG protein of the Rhesus complex is a C02 channel in the human red cell membrane // FASEB J. 2008. V. 22(1). P. 64-73.

47. Endeward V., Gros G. Low carbon dioxide permeability of the apical epithelial membrane of guinea-pig colon // J. Physiol. 2005. V. 567 (Pt 1). P. 253265.

48. Fahrenkrog В., Aebi U. The nuclear pore complex: nucleocytoplasmic transport and beyond //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V. 4(10). P. 757-766.

49. Finkelstein A. Water and nonelectrolyte permeability of lipid bilayer membranes // J. Gen. Physiol. 1976. V. 68(2). P. 127-135.

50. Fischkoff S., Vanderkooi J.M. Oxygen diffusion in biological and artificial membranes determined by the fluorochrome pyrene // J. Gen. Physiol. 1975. V. 65(5). P. 663-676.

51. Forster R.E., Gros G., Lin L., Ono Y., Wunder M. The effect of 4,4'-diisothiocyanato-stilbene-2,2'-disulfonate on C02 permeability of the red blood cell membrane //Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95(26). P. 15815-15820.

52. Furuya S., Naruse S., Ко S.B., Ishiguro H., Yoshikawa Т., Hayakawa T. Distribution of aquaporin 1 in the rat pancreatic duct system examined with light- and electron-microscopic immunohistochemistry // Cell Tissue Res. 2002. V. 308(1). P. 75-86.

53. Garcia A.M., Lodish H.F. Lysine 539 of human band 3 is not essential for ion transport or inhibition by stilbene disulfonates // J. Biol. Chem. 1989. V. 264(33). P. 19607-19613.

54. Garland P.B., Littleford S.J., Haddock B.A. A stopped-flow dual-wavelength spectrophotometer suitable for the study of respiratory chains // Biochem. J. 1976. V. 154(2). P. 277-284.

55. Geers C., Gros G. Carbon dioxide transport and carbonic anhydrase in blood and muscle // Physiol. Rev. 2000. V. 80(2). P. 681-715.

56. Gibson Q.H., Kreuzer F., Meda E., Roughton F.J. The kinetics of human haemoglobin in solution and in the red cell at 37 degrees С // J. Physiol. 1955. V. 129(1). P. 65-89.

57. Gibson Q.H., Roughton F.J. The kinetics of dissociation of the first oxygen molecule from fully saturated oxyhaemoglobin in sheep blood solutions // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1955. V. 143(912). P. 310-334.

58. Giepmans B.N. Gap junctions and connexin-interacting proteins // Cardio-vasc. Res. 2004. V. 62(2). P. 233-245.

59. Gutknecht J. Inorganic mercury (Hg~ ) transport through lipid bilayer membranes//J. Membr. Biol. 1981. V. 61(1). P. 61-66.

60. Gutknecht J., Bisson M.A., Tosteson F.C. Diffusion of carbon dioxide through lipid bilayer membranes: effects of carbonic anhydrase, bicarbonate, and unstirred layers //J. Gen. Physiol. 1977. V. 69(6). P. 779-794.

61. Gwozdzinski K. A spin label study of the action of cupric and mercuric ions on human red blood cells // Toxicology. 1991. V. 65(3). P. 315-323

62. Harries W.E., Akhavan D., Miercke L.J., Khademi S., Stroud R.M. The channel architecture of aquaporin 0 at a 2.2-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. V. 101(39). P. 14045-14050.

63. Hasegawa H, Ma Т., Skach W., Matthay M.A., Verbnan A.S. Molecular cloning of a mercurial-insensitive water channel expressed in selected water-transporting tissues // J. Biol. Chem. 1994. V. 269(8). P. 5497-5500.

64. Herrera M., Hong N.J., Garvin J.L. Aquaporin-1 transports NO across cell membranes // Hypertension. 2006. V. 48(1). P. 157-164.

65. Hill A.E., Shachar-Hill В., Shachar-Hill Y. What are aquaporins for? // J. Membr. Biol. 2004. V. 197(1). P. 1-32.

66. Holland R.A., Shibata H., Scheid P., Piiper J. Kinetics of 02 uptake and release by red cells in stopped-flow apparatus: effects of unstirred layer // Respir. Physiol. 1985. V. 59(1). P. 71-91.

67. Hub J.S., de Groot B.L. Mechanism of selectivity in aquaporins and aqua-glyceroporins // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. V. 105(4). P. 1198-1203.

68. Huxley V.H., Kutchai H. The effect of the red cell membrane and a diffusion boundary layer on the rate of oxygen uptake by human erythrocytes // J. Physiol. 1981. V. 316. P. 75-83

69. Itoh Т., Rai Т., Kuwahara M., Ко S.B., Uchida S., Sasaki S., Ishibashi К Identification of a novel aquaporin, AQP12, expressed in pancreatic acinar cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 330(3). P. 832-838.

70. Ivanov LI., Fedorov G.E., Gus'kova R.A., Ivanov K.I., Rabin A.B. Permeability of lipid membranes to dioxygen I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 322(3). P. 746-750.

71. Jansen M., Blume A. A comparative study of diffusive and osmotic water permeation across bilayers composed of phospholipids with different head groups and fatty acyl chains // Biophys. J. 1995. V. 68(3). P. 997-1008.

72. Jay A. W. Geometry of the human erythrocyte. I. Effect of albumin on cellgeometry//Biophys. J. 1975. V. 15(3). P. 205-222.119

73. Jennings M.L. Oligomeric structure and the anion transport function of human erythrocyte band 3 protein // J. Membr. Biol. 1984. V. 80(2). P. 105-117.

74. Jennings M.L., Solomon A.K. Interaction between phloretin and the red blood cell membrane // J. Gen. Physiol. 1976. V. 67(4). P. 381-397.

75. Jung J.S., Preston G.M., Smith B.L., Guggino W.B., Agre P. Molecular structure of the water channel through aquaporin CHIP. The hourglass model // J. Biol. Chem. 1994. V. 269(20). P. 14648-14654.

76. Kaldenhoff R., Fischer M. Aquaporins in plants // Acta Physiol. (Oxf). 2006. V. 187(1-2). P. 169-176.

77. Kato M, Pisliakov A. V., Warshel A. The barrier for proton transport in aquaporins as a challenge for electrostatic models: the role of protein relaxation in mutational calculations // Proteins. 2006. V. 64(4). P. 829-844.

78. Kaur С., Sivakumar V., Zhang Y., Ling E.A. Hypoxia-induced astrocytic reaction and increased vascular permeability in the rat cerebellum // Glia. 2006. V. 54(8). P. 826-839.

79. Kedem O., Katchalsky A. Thermodynamic analysis of the permeability of biological membranes to non-electrolytes //Biochim. Biophys. Acta. 1958. V. 27(2). P. 229-246.

80. Kiesow L.A., Bless J.W., Nelson D.P., Shelton J.B. A new method for the rapid determination of oxygen-dissociation curves in small blood samples by spec-trophotometric titration // Clin. Chim. Acta. 1972. V. 41. P. 123-139.

81. KingL.S., Choi M., Fernandez P. C., Cartron J.P, Agre P. Defective urinary-concentrating ability due to a complete deficiency of aquaporin-1 // N. Engl. J. Med. 2001. V. 345(3). P. 175-179.

82. King L.S., Kozono D., Agre P. From structure to disease: the evolving tale of aquaporin biology //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. V. 5(9). P. 687-698.

83. Kcebnik R., Locher K.P., Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Microbiol. 2000. V. 37(2). P. 239-253.

84. Koyama Y, Yamamoto Т., Tani Т., NiheiK, Kondo D., FunakiH., Yaoita E., Kawasaki K, Sato N., Hatakeyama K, Kihara I. Expression and localization of aquaporins in rat gastrointestinal tract // Am. J. Physiol. 1999. V. 276(3). P. 621— 627.

85. Kreuzer F., Yahr W.Z. Influence of red cell membrane on diffusion of oxygen//J. Appl. Physiol. 1960. V. 15. P. 1117-1122.

86. Kronzucker H.J., Siddiqi M.Y., Glass A. Kinetics of NH/ influx in spruce // Plant Physiol. 1996. V. 110(3). P. 773-779.

87. Kuchel P. W., Benga G. Why does the mammalian red blood cell have aqua-porins? // Biosystems. 2005. V. 82(2). P. 189-196.

88. Kusumi A., Subczynski W.K., Hyde J.S. Oxygen transport parameter in membranes as deduced by saturation recovery measurements of spin-lattice relaxation times of spin labels //Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. V. 79(6). P. 1854-1858.

89. Lande M.B., Donovan J.M., Zeidel M.L. The relationship between membrane fluidity and permeabilities to water, solutes, ammonia, and protons // J. Gen. Physiol. 1995. V. 106(1). P. 67-84.

90. Lee J.K., Kozono D., Remis J., Kitagawa Y., Agre P., Stroud R.M. Structural basis for conductance by the archaeal aquaporin AqpM at 1.68 A // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. V. 102(52). P. 18932-18937.

91. Lieb W.R., Stein W.D. Quantitative predictions of a noncarrier model for glucose transport across the human red cell membrane // Biophys. J. 1970. V. 10(7). P. 585-609.

92. Lieb W.R., Stein W.D. Non-Stokesian nature of transverse diffusion within human red cell membranes // J. Membr. Biol. 1986. V. 92(2). P. 111-119.

93. Ligeza A., Tikhonov A.N., Hyde J.S., Subczynski W.K. Oxygen permeability of thylakoid membranes: electron paramagnetic resonance spin labeling study // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1365(3). P. 453-463.

94. Liu Z., Shen J., Carbrey J.M., Mukhopadhyay R., Agre P., Rosen B.P. Arse-nite transport by mammalian aquaglyceroporins AQP7 and AQP9 // Proc. Natl. Acad. Sci. 2002. V. 99(9). P. 6053-6058.

95. Lodish H., Berk A., Kaiser C., Krieger M., Scott M., Bretscher A., Ploegh H., Matsudaira P. Molecular Cell Biology. New York: W. H. Freeman, 2007. 1150 p.

96. Low P.S. Structure and function of the cytoplasmic domain of band 3: center of erythrocyte membrane-peripheral protein interactions // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 864(2). P. 145-167.

97. Loewenstein W.R. The cell-to-cell channel of gap junctions // Cell. 1987. V. 48(5). P. 725-726.

98. Ma В., Xiang Y., Mu S.M., Li Т., Yu H.M., Li X.J. Effects of acetazolamide and anordiol on osmotic water permeability in AQPl-cRNA injected Xenopus oocyte // Acta Pharmacol. Sin. 2004. V. 25(1). P. 90-97.

99. Ma J.F., Tamai К., Yamaji N., Mitani N., Konishi S., Katsuhara M., Ishiguro M., Murata Y., Yano M. A silicon transporter in rice // Nature. 2006. V. 440(7084). P. 688-691

100. Macey R.I., Farmer R.E. Inhibition of water and solute permeability in human red cells//Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 211(1). P. 104-106.

101. Magin R.L., Niesman M.R. Temperature-dependent permeability of large unilamellar liposomes // Chem. Phys. Lipids. 1984. V. 34(3). P. 245-256.

102. Marini A.M., Matassi G., Raynal V., Andre В., Cartron J.P., Cherif-Zahar B. The human Rhesus-associated RhAG protein and a kidney homologue promote ammonium transport in yeast // Nat. Genet. 2000. V. 26(3). P. 341-344.

103. Marini A.M., Urrestarazu A., Beauwens R., Andre B. The Rh (rhesus) blood group polypeptides are related to NH4+ transporters // Trends Biochem. Sci. 1997. V. 22(12). P. 460-461.

104. Mathai J.C., Tristram-Nagle S., Nagle J.F., Zeidel M.L. Structural determinants of water permeability through the lipid membrane // J. Gen. Physiol. 2008. V. 131(1). P. 69-76.

105. Mlekoday H.J., Moore R., Levitt D.G. Osmotic water permeability of the human red cell. Dependence on direction of water flow and cell volume // J. Gen. Physiol. 1983. V. 81(2). P. 213-220.

106. Moncada S., Palmer R.M., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology // Pharmacol. Rev. 1991. V. 43(2). P. 109-142.

107. Morrow J.I. A new high resolution stopped-flow apparatus // Instr. Sci. Tech. 1970. V. 2(4). P. 375-387.

108. Murata К., Mitsuoka К., Hirai Т., Walz Т., Agre P., Heymann J.B., Engel A., Fujiyoshi Y. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1 // Nature. 2000. V. 407(6804). P. 599-605.

109. Nakhoul N.L., Davis B.A., Romero M.F., Boron W.F. Effect of expressing the water channel aquaporin-1 on the CO2 permeability of Xenopus oocytes // Am. J. Physiol. 1998. V. 274(2). P. 543-548.

110. Neely J.D., Christensen B.M., Nielsen S., Agre P. Heterotetrameric composition of aquaporin-4 water channels // Biochemistry. 1999. V. 38(34). P. 1115611163.

111. Nielsen S., King L.S., Christensen B.M., Agre P. Aquaporins in complex tissues. II. Subcellular distribution in respiratory and glandular tissues of rat // Am. J. Physiol. 1997. V. 273(5). P. 1549-1561.

112. Nielsen S., Smith B.L., Christensen E.I., Agre P. Distribution of the aquaporin CHIP in secretory and resorptive epithelia and capillary endothelia // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. V. 90(15). P. 7275-7279.

113. Niemietz C.M., Tyerman S.D. Channel-mediated permeation of ammonia gas through the peribacteroid membrane of soybean nodules // FEBS Lett. 2000. V. 465(2-3). P. 110-114.

114. Niemietz C.M., Tyerman S.D. New potent inhibitors of aquaporins: silver and gold compounds inhibit aquaporins of plant and human origin // FEBS Lett. 2002. V. 531(3). P. 443-447.

115. Nikaido H. Porins and specific channels of bacterial outer membranes // Mol. Microbiol. 1992. V. 6(4). P. 435-442.

116. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability//Microbiol. Rev. 1985. V. 49(1). V. 1-32.

117. Olson J., Foley E., Maillett D., Paster E. Measurement of Rate Constants for Reactions of 02, CO, and NO with Hemoglobin / ed. Nagel R. // Hemoglobin Disorders / New Jersey: Humana Press, 2003. P. 65-91.

118. Overton E. The probable origin and physiological significance of cellular osmotic properties // Vierteljahrschr. Naturforsch. Ges. Zurich. 1899. V. 44. P. 88135.

119. Paganelli C.V., Solomon A.K. The rate of exchange of tritiated water across the human red cell membrane // J. Gen. Physiol. 1957. V. 41(2). P. 259-277.

120. Persson В., Argos P. Prediction of transmembrane segments in proteins utilising multiple sequence alignments // J. Mol. Biol. 1994. V. 237(2). P. 182-92.

121. Prasad G.V., Coury L.A., Finn F., Zeidel M.L. Reconstituted aquaporin 1 water channels transport C02 across membranes // J. Biol. Chem. 1998. V. 273(50). P. 33123-33126.

122. Preston G.M., Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons: member of an ancient channel family // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. V. 88(24). P. 11110-11114.

123. Preston G.M., Carroll T.P., Guggino W.B., Agre P. Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell СШР28 protein // Science. 1992. P. 256(5055). P. 385-387.

124. Preston G.M., Jung J.S., Guggino W.B., Agre P. The mercury-sensitive residue at cysteine 189 in the СШР28 water channel // J. Biol. Chem. 1993. V. 268(1). P. 17-20.

125. Preston G.M., Smith B.L., Zeidel M.L., Moulds J.J., Agre P. Mutations in aquaporin-1 in phenotypically normal humans without functional CHIP water channels // Science. 1994. V. 265(5178). P. 1585-1587.

126. Rabenstein D.L., Isab A.A. A proton nuclear magnetic resonance study of the interaction of mercury with intact human erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 721(4). P. 374-384.

127. Ren G., Cheng A., Reddy V., Melnyk P., Mitra A.K. Three-dimensional foldof the human AQP1 water channel determined at 4 A resolution by electron crysitallography of two-dimensional crystals embedded in ice // J. Mol. BioL 2000. V. 301(2). P. 369-387.

128. Riggs A. The binding of N-ethylmaleimide by human hemoglobin and its effect upon the oxygen equilibrium // J. Biol. Chem. 1961. V. 236. P. 1948-1954.

129. Riggs A., Wolbach R. Sulfhydryl groups and the structure of hemoglobin // J. Gen. Physiol. 1956. V. 39(4). P. 585-605.

130. Ripoche P., Bertrand O., Gane P., Birkenmeier C., Colin Y., Cartron J.P. Human Rhesus-associated glycoprotein mediates facilitated transport of NH3 into red blood cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. V. 101(49). P. 17222-17227.

131. Rossi-Fanelli A., Antonini E., Caputo A. Studies on the structure of hemoglobin. II. Properties of reconstituted protohemoglobin and protoporphyrin-globin // Biochim. Biophys. Acta. 1959. V. 35. P. 93-101.

132. Roudier N., Verbavatz J.M., Maurel C., Ripoche P., Tacnet F. Evidence for the presence of aquaporin-3 in human red blood cells // J. Biol Chem. 1998. V. 273(14). P. 8407-8412.

133. Roughton F. J. W. Diffusion and chemical reaction velocity as joint factors in determining the rate of uptake of oxygen and carbon monoxide by the red blood corpuscle // Proc. R. Soc. bond. В Biol. Sci. 1932. V. 111(769). P. 1-36.

134. Roughton F. J. W. Diffusion and chemical reaction velocity as joint factors in determining the rate of uptake of oxygen and carbon monoxide by the red blood corpuscle // Proc. R. Soc. bond. В Biol. Sci. 1932. V. 111(769). P. 1-36.

135. Saadoun S., Papadopoulos M.C., Davies D.C., Bell B.A., Krishna S. Increased aquaporin 1 water channel expression in human brain tumours // Br. J. Cancer. 2002. V. 87(6). P. 621-623.

136. Saadoun S., Papadopoulos M.C., Hara-Chikuma M., Verkman A.S. Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin-1 gene disruption // Nature. 2005. V. 434(7034). P. 786-792.

137. Sada E., Katoh S., Terashima M., Kawahara H., Katoh M. Effects of surface charges and cholesterol content on amino acid permeabilities of small unilamellar vesicles // J. Pharm. Sci. 1990. V. 79(3). P. 232-235.

138. Salhany J.M. A novel rapid-reaction spectrophotometric method for monitoring monovalent anion exchange by human erythrocyte band 3 // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 45(1). P. 181-190.

139. Sanders O.I., Rensing С., Kuroda M., Mitra В., Rosen B.P. Antimonite is accumulated by the glycerol facilitator GlpF in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1997. V. 179(10). P. 3365-3367.

140. Saparov S.M., Kozono D., Rothe U., Agre P., Pohl P. Water and ion permeation of aquaporin-1 in planar lipid bilayers. Major differences in structural determinants and stoichiometry // J. Biol. Chem. 2001. V. 276(34). P. 31515-31520.

141. Saparov S.M., Liu K., Agre P., Pohl P. Fast and selective ammonia transport by aquaporin-8 // J. Biol. Chem. 2007. V. 282(8). P. 5296-5301.

142. Savage D.F., Egea P.F., Robles-Colmenares Y., O'Connell J.D., Stroud R.M. Architecture and selectivity in aquaporins: 2.5 A X-ray structure of aquaporin Z // PLoS Biol. 2003. V. 1(3). P. 334-340.

143. Sidel V.W,. Solomon A.K. Entrance of water into human red cells under an osmotic pressure gradient // J. Gen. Physiol. 1957. V. 41(2). P. 243-257.

144. Sinensky M. Homeoviscous adaptation — a homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. 1974. V. 71(2). P. 522-525.

145. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science. 1972. V. 175(23). P. 720-731.

146. Sirs J.A., Roughton F.J. Stopped-flow measurements of CO and 02 uptake by hemoglobin in sheep erythrocytes // J. Appl. Physiol. 1963. V. 18. P. 158-165.

147. Smith B.L., Agre P. Erythrocyte Mr 28,000 transmembrane protein exists as a multisubunit oligomer similar to channel proteins // J. Biol. Chem. 1991. V. 266(10). P. 6407-6715.

148. Smith B.L., Preston G.M., Spring F.A., Anstee D.J., Agre P. Human red cell aquaporin CHIP. I. Molecular characterization of ABH and Colton blood group antigens // J. Clin. Invest. 1994. V. 94(3). P. 1043-1049.

149. Sohl G., Willecke К Gap junctions and the connexin protein family // Car-diovasc. Res. 2004. V. 62(2). P. 228-232.

150. Sokolov V.S., Pohl P. Membrane transport of singlet oxygen monitored by dipole potential measurements // Biophys. J. 2009. V. 96(1). P. 77-85.

151. Stein W.D. Transport and diffusion across cell membranes. New York: Academic Press, 1986. 685 p.

152. Subczynski W.K., Hopwood L.E., Hyde J.S. Is the mammalian cell plasma membrane a barrier to oxygen transport? // J. Gen. Physiol. 1992. V. 100(1). P. 6987.

153. Subczynski W.K., Hyde J.S. The diffusion-concentration product of oxygen in lipid bilayers using the spin-label Tj method // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 643(2). P. 283-291.

154. Subczynski W.K., Hyde J.S., Kusumi A. Oxygen permeability of phosphati-dylcholine-cholesterol membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86(12). P. 4474-4478

155. Subczynski W.K., Hyde J.S., Kusumi A. Effect of alkyl chain unsaturation and cholesterol intercalation on oxygen transport in membranes: a pulse ESR spin labeling study //Biochemistry. 1991. V. 30(35). P. 8578-90.

156. Subczynski W.K., Markowska E. Effect of carotenoids on oxygen ransport within and across model membranes // Curr. Top. Biophys. 1992. V. 16. P. 62-68.

157. Subczynski W.K., Markowska E., Sielewiesiuk J. Effect of polar carotenoids on the oxygen diffusion-concentration product in lipid bilayers. An EPR spin label study //Biochim. Biophys. Acta. 1991a. V. 1068(1). P. 68-72.

158. Subczynski W.K., Wisniewska A. Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions // Acta Biochim. Pol. 2000. V. 47(3). P. 613-625.

159. Sui H., Han B.G., Lee J.K., Walian P., Jap B.K. Structural basis of water-specific transport through the AQP1 water channel // Nature. 2001. V. 414(6866). P. 872-878.

160. Tajkhorshid E., Nollert P., Jensen M.0., Miercke L.J., O'Connell J., Stroud R.M., Schulten K. Control of the selectivity of the aquaporin water channel family by global orientational tuning // Science. 2002. V. 296(5567). P. 525-530.

161. Tanner M.J. Molecular and cellular biology of the erythrocyte anion exchanger (AE1) // Semin. Hematol. 1993. V. 30(1). P. 34-57.

162. Tanner M.J. The structure and function of band 3 (AE1): recent developments // Mol. Membr. Biol. 1997. V. 14(4). P. 155-165.

163. Tornroth-Horsefield S., Wang Y., Hedfalk K., Johanson U., Karlsson M., Tajkhorshid E., Neutze R., Kjellbom P. Structural mechanism of plant aquaporin gating // Nature. 2006. V. 439(7077). P. 688-694.

164. Trauble H. The movement of molecules across lipid membranes: A molecular theory // J. Membr. Biol. 1971. V. 4(1). P. 193-208.

165. Uchida K., Matsuyama К., Tanaka K., Doi K. Diffusion coefficient for 02 in plasma and mitochondrial membranes of rat cardiomyocytes // Respir. Physiol. 1992. V. 90(3). P. 351-362.

166. Uehlein N., Lovisolo С., Siefritz F., Kaldenhoff R. The tobacco aquaporin NtAQPl is a membrane C02 pore with physiological functions // Nature. 2003. V. 425(6959). P. 734-737.

167. Uehlein N. Otto В., Hanson D.T., Fischer M., McDowell N., Kaldenhoff R. Function of Nicotiana tabacum aquaporins as chloroplast gas pores challenges the concept of membrane C02 permeability // Plant Cell. 2008. V. 20(3). P. 648-657.

168. Unwin P.N., Milligan R.A. A large particle associated with the perimeter of the nuclear pore complex // J. Cell Biol. 1982. V. 93(1). P. 63-75.

169. Vandegriff K.D., Olson J.S. Morphological and physiological factors affecting oxygen uptake and release by red blood cells // J. Biol. Chem. 1984. V. 259(20). P. 12619-12627.

170. VandegriffK.D., Olson J.S. The kinetics of 02 release by human red blood cells in the presence of external sodium dithionite // J. Biol. Chem. 1984a. V. 259(20). P. 12609-12618.i

171. Van Kim C.L., Colin Y., Cartron J.P. Rh proteins: key structural and functional components of the red cell membrane // Blood Rev. 2006. V. 20(2). P. 93110.

172. Vansteveninck J., Weed R.I., Rothstein A. Localization of erythrocyte membrane sulfhydryl groups essential for glucose transport // J. Gen. Physiol. 1965. V. 48. P. 617-632.

173. Verkman A.S. Optical methods to measure membrane transport processes // J. Membr. Biol. 1995. V. 148(2). P. 99-110.

174. Verkman A.S., Hara-Chikuma M., Papadopoulos M.C. Aquaporins new players in cancer biology // J. Mol. Med. 2008. V. 86(5). P. 523-529.

175. Verselis V., White R.L., Spray D.C., Bennett M.V. Gap junctional conductance and permeability are linearly related // Science. 1986. V. 234(4775). P. 461— 464.

176. Viadiu H., Gonen Т., Walz T. Projection map of aquaporin-9 at 7 A resolution // J. Mol. Biol. 2007. V. 367(1). P. 80-88.

177. Waisbren S.J., Geibel J.P., Modlin I.M., Boron W.F. Unusual permeability properties of gastric gland cells //Nature. 1994. V. 368(6469). P. 332-335.

178. Walter A., Gutknecht J. Permeability of small nonelectrolytes through lipid bilayer membranes // J. Membr. Biol. 1986. V. 90(3). P. 207-217.

179. Wang Y., Cohen J., Boron W.F., Schulten K., Tajkhorshid E. Exploring gas permeability of cellular membranes and membrane channels with molecular dynamics // J. Struct. Biol. 2007. V. 157(3). P. 534-544.

180. Warth A., Kroger S., Wolburg H. Redistribution of aquaporin-4 in human glioblastoma correlates with loss of agrin immunoreactivity from brain capillary basal laminae //Acta Neuropathol. 2004. V. 107(4). P. 311-318.

181. Weed R., Eber J., Rothstein A. Interaction of mercury with human erythrocytes // J. Gen. Physiol. 1962. V. 45. P. 395-410.

182. West J.B. Respiratory physiology The essentials. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins, 2008. 192 p.

183. Widomska J., Raguz M., Subczynski W.K. Oxygen permeability of the lipid bilayer membrane made of calf lens lipids // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1768(10). P. 2635-2645.

184. Worman H.J., Brasitus T.A., Dudeja P.K., Fozzard H.A., Field M. Relationship between lipid fluidity and water permeability of bovine tracheal epithelial cell apical membranes//Biochemistry. 1986. V. 25(7). P. 1549-1555.

185. Wu В., Beitz E. Aquaporins with selectivity for unconventional permeants // Cell Mol. Life Sci. 2007. V. 64(18). P. 2413-2421.

186. Xiang TX., Anderson B.D. Permeability of acetic acid across gel and liquid-crystalline lipid bilayers conforms to free-surface-area theory // Biophys J. 1997. V. 72(1). P. 223-237.

187. Yakata K., Hiroaki Y, Ishibashi K., Sohara E., Sasaki S., Mitsuoka K, Fu-jiyoshi Y Aquaporin-11 containing a divergent NPA motif has normal water channel activity // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1768(3). P. 688-693.

188. Yamaguchi K, Nguyen-Phu D., Scheid P., Piiper J. Kinetics of 02 uptake and release by human erythrocytes studied by a stopped-flow technique // J. Appl. Physiol. 1985. V. 58(4). P. 1215-1224.

189. Yang В., Kim J.K., Verkman A.S. Comparative efficacy of HgCl2 with candidate aquaporin-1 inhibitors DMSO, gold, TEA+ and acetazolamide // FEBS Lett. 2006. V. 580(28-29). P. 6679-6684.

190. Yeagle P. The Structure of Biological Membranes. Boca Raton London -New York - Singapore: CRC Press, 2005. 540 p.

191. Yool A.J., Stamer W.D., Regan J. W. Forskolin stimulation of water and cation permeability in aquaporin 1 water channels // Science. 1996. V. 273(5279). P. 1216-1218.

192. Yool A.J., Weinstein A.M. New roles for old holes: ion channel function in aquaporin-1 //News Physiol. Sci. 2002. V. 17. P. 68-72.

193. Zeidel M.L., Ambudkar S. V., Smith B.L., Agre P. Reconstitution of functional water channels in liposomes containing purified red cell СШР28 protein // Biochemistry. 1992. V. 31(33). P. 7436-7440.

194. Zhang D., Kiyatkin A., Bolin J.T., Low P.S. Crystallographic structure and functional interpretation of the cytoplasmic domain of erythrocyte membrane band 3 // Blood. 2000. V. 96(9). P. 2925-2933.

195. Zhou В., Ann D.K., Li X., Kim K.J., Lin H., Minoo P., Crandall E.D., Borok Z. Hypertonic induction of aquaporin-5: novel role of hypoxia-inducible factor-1 alpha // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2007. V. 292(4). P. 1280-1290.