Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности трансмиссии ядер у ядерно-цитоплазматических гибридов Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Особенности трансмиссии ядер у ядерно-цитоплазматических гибридов Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

Особенности трансмиссии ядер у ядерно-цитоплазматических гибридов Засскаготусеъ сегег'тае

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Санкт-Петербургский государственный Технологический институт (технический университет) и институте цитологии РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ст. научн. сотр.

Михайлова Наталья Павловна кандидат биологических наук, доцент Журавлева Галина Анатольевна

Ведущая организация; государственное учреждение научно-исследовательский инсгипуг эксперементальной медицины РАМН.

Защита состоится че/ час, на заседании

диссертационного совета Д 212.230.04 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете) по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр.,26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). Замечания и отзывы но данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург. Московский пр., 26, СПбТИ(ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан "/У л.________2004 г.

Гинак Анатолий Иосифович

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.т.н.

—1 '/ /

(

Т.Б.Яисицкая

2099

!1<\\ЦЬ- 1У

-3-

Актуальность проблемы

Дрожжи Засскаготусез сегеу'ш'ше являются объектом фундаментальных лабораторных исследований, а таюке широко применяются в микробиологической промышленности.

В настоящее время в связи с успехами генной инженерии является актуальным использование в биотехнологии штаммов микроорганизмов с измененными свойствами. Методами клеточной инженерии создаются денуклеированные клетки, для получения новых сочетаний ядер клеток одних высших эукариот и цитоплазмы других. Использование генетических методов для создания новых промышленных штаммов представляется весьма актуальным. Изучать взаимовлияние ядер и цитоплазм разных клеток удобнее на модели одноклеточных низших эукариотов, используя гетерокарионы дрожжей-сахаромицетов.

У этих организмов была получена мутация в гене КАЮ, вызывающая запаздывание кариогамии по отношению к плазмогамии. Получаемые при этом гетерокарионы создают уникальную возможность для изучения двух различных ядер в одной клетке.

Зиготы, несущие нормальную и мутантную аллель гена КАШ, а также их первые почки, в большинстве своем быстро очищаются, т.е. оказываются гомогенными в отношении как ядерных, так и митохондриальных геномов. Очищение гетерокариотических клеток от одного из ядер может быть рассмотрено в свете недавно разработанной концепции программированной клеточной гибели у дрожжей. Её наиболее изученной и распространенной формой является апоптоз. Рассмотрение актуального вопроса - осуществляется ли гибель ядер в гетерокарионах по типу апоптоза - является предметом данной диссертации.

Цели и задачи исследования

1. Исследовать явление скрытого гетерокариоза.

2. Сравнить клеточный состав зиготических гетерокариотических клонов в

двух типах скрещивания, отличающихся сопряжением аллелей генов МАТ

и КАШ.

3. Использовать частичный педигри-анализ для выявления разных по фенотипу пар зигота/почка (или мать/дочь). Оценить количественно разные классы этих пар и, таким образом, охарактеризовать интенсивность процесса деградации ядер в зиготе. Сравнить данные, полученные в разных скрещиваниях.

4. Выяснить, как внешние воздействия, вызывающие задержку в почковании зигот, сказываются на частоте появления разных м/д пар.

5. Выяснить, как сказывается на трансмиссии и деградации ядер в зиготе обработка родительских гаплоидов агентами, вызывающими наследственные изменения цитоплазматических факторов (мтДНК и прионов).

6. Изучить цитологическими методами наличие в гетерокарионах таких типичных черт апоптоза, как накопление активных кислородных радикалов (ROS) и деструкция ядер.

Научная новизна

В настоящей работе исследуется явление так называемого скрытого гетерокариоза. Впервые предложена эффективная система отбора двуядерных клеток, одно из ядер которых фенотипически не экспрессировано.

Впервые в потомстве гетерокариона показана зависимость отхождения родительского ядра в первую почку от того, какую аллель гена КАЮ это ядро несет.

Рассмотрены варианты КАЮ х karl скрещиваний, у которых один из родителей лишен митохондриальной ДНК, а также варианты, когда гаплоиды обрабатывались гуанидин гидрохлоридом (GuHCl), вызывающим элиминацию некоторых дрожжевых прионов.

С помощью изогенных штаммов, отличающихся прионовой формой белка, участвующего в терминации трансляции [PSI+] фактора, впервые получены свидетельства в пользу влияния прионов на деградацию родительских ядер в гетерокарионе.

Изучалось накопление свободных радикалов у гетерокарионов и впервые получены данные в пользу связи апоптоза с гетерокариотической ядерной деградацией.

Научно-практическая значимость работы

Гетерокарионы позволяют изучать влияние различных химических агентов и условий культивирования на деградацию ядер. Это важно для селекции дрожжей и получения новых промышленных штаммов, так как именно гетерокарионы являются первичным продуктом близкородственных межвидовых скрещиваний.

Полученные результаты позволят проводить контроль за выживаемостью дрожжевых штаммов и оптимизировать условия их культивирования.

В нашей работе мы впервые показали роль апоптоза в гибели ядер в дрожжевых гетерокарионах.

Мы показали связь прионизации белков с механизмами адаптации клетки и ее влияние на деградацию ядер.

Апробадия работы

Материал работы был представлен на конференции 6-го химического форума Санкт-Петербург "Технохимия-2004" (25-28 мая 2004г.).

По теме диссертации опубликовано 4 статьи в научных журналах.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 106 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 123 источника, из них 13 на русском языке. Работа содержит 10 рисунков и 17 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выявление функции мутации кат 1-1 в репликации и деградации ядер в зиготах. Определение частоты появления различных фенотипических классов в парах мать (зигота) / дочь (первая почка) при педигри-анализе в различных скрещиваниях.

2. Изучение влияния цитоплазматических факторов, а также различных условий культивирования на трансмиссию и деградацию ядер в гетерокарионах.

-63. Выявление признаков апоптической гибели ядер в дрожжевых гетерокарионах.

Личный вклад автора состоял в непосредственном проведении генетических, биохимических и цитологических экспериментов, в том числе микроманипулировании, выполнении процедур окрашивания, микровидеосъемки дрожжевых клеток и статистической обработки данных педигри-анализа.

Автор благодарит за помощь в работе Невзглядову О.В., Сойдла Т.Р., а также Михайлову Е.В.

Методы, применяемые в работе

В работе использовались такие генетические методы, как цитодукция (замена цитоплазмы), получение мутантов с дыхательной недостаточностью, элиминация прионов, а также педигри-анализ; молекулярно-биологические методы, включающие трансформацию бактериального штамма, выделение ДНК из бактериальных и дрожжевых клеток, блот-гибридизацию по Саузерну; цитологические методы для выявления активных кислородных радикалов, морфологии ядер и амилоидных структур в клетках дрожжей; статистическая обработка данных, полученных при педигри-анализе.

Результаты исследований

Получение и анализ гетерокарионов со скрытым ядром От скрещивания множественно маркированных родителей (ММР) YPH500 и F592, имеющих Ura фенотип, и г ho' деривата штамма К5-13, несущего только одну ауксотрофность по гистидину и мутацию karl, были получены цитодук-танты, которые имели г ho' цитоплазму и экспрессирующееся ядро от К5-13 (см. рис.1, а). Цитодуктанты His' тина переносились на синтетическую среду без добавок для обнаружения прототрофных клонов (см. рис.1, б), а также на среду, содержащую 5-фтороротовую кислоту (FOA), селективную для клеток, несущих скрытое ядро Ura родителя, которое стало экспрессироваться. В наших опытах на FOA давали колонии вторичного роста, ММР фенотипа только те клоны, которые прорастали на М среде. Чтобы правильно идентифицировать клоны, выросшие на FOA, их снова отсевали на эту среду и переносили на ряд селективных сред. При этом на среде M+ura вырастают гибридные клоны, поте-

рявшие одну из гомологичных хромосом с геном дикого типа ШАЗ. На среде М+ига+Ыя идет селекция клеток с ядром от К5-13, приобретших 11га" фенотип в результате спонтанного мутагенеза (они на схеме заключены в прямоугольник). На среде с комплексными добавками, в которых нуждаются ММР штаммы, можно отобрать клетки, не растущие на двух других средах. На рисунке 1 (в) они заключены в овал.

МЕЛ

Прототрофы

МЕЛ+Ыв

Прототрофы и цитодуктанты кагР типа ауксотрофные по гиотидину

УЕРБ

М

БОА

БОА

М+ига М+ига+Ыэ М1 добавки, необходимые ММР

а: селекция цитодуктантов, полученных от скрещивания ММР[>/ю+] х кагР[г/го ] на УЕРБ

в: идентификация клонов среди цитодуктантов кагР типа

б: скрининг скрытых гетерокарионов отобранных на среде РОА

Рисунок 1 - Селекция цитодуктантов и выявление среди них скрытых гетерокарионов (ГКс)

Идентичность фенотипа клонов, отобранных на БОА, с фенотипом ММР говорит о том, что в клетках первоначально отобранных цитодуктантов с экспрессируемым ядром от штамма кагР в скрытом виде присутствовало ядро от ММР штамма, и т.о. дает основание считать часть цитодуктантов кагР типа, скрытыми гетерокарионами (ГКс).

Блот-гибридизация по Саузерну ГКс, взятых с УЕРО, и его дериватов, отобранных на соответствующих селективных средах (М и БОА), подгверждает получение штаммов, в которых четко проявляются аллели, пришедшие от ММР из цитодуктантов кагР типа.

тпн

5.8

12 3 4 #» Л» »»**

2.5

- # Ш.

3 4 5 »0- Ш

« йй' -Щ Шг ■ «ш ш

а б в

Рисунок 2 - Блот гибридизация суммарной клеточной ДНК из НКс и их митотических сегрегантов

а - гибридизация с пробой на TRP1 после гидролизации геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI; б - гибридизация с пробой на LEU2 после гидролизации геномной ДНК эндонуклеазой Bgttl; в - гибридизация с пробой на URA3 после гидролизации геномной ДНК эндонуклеазой BgRl. 1 - гибрид YPH500xK5-13, 2 -YPH500, 3 - ГК/YEPD, 4 - ГКс/М, 5 - ГКс/FOA.

Влияние аллелей гена KAMI на сегрегацию ядра в первую почку гетерокариона, а также на деградацию ядер в зиготе

Высокая летальность гетерозигот karllKARl и большое количество зигот с "одноядерным" фенотипом указывают на деградацию двух или одного из родительских ядер соответственно. Роль karl-1 можно выявить с помощью педигри-анализа при изучении пар зигота/почка (мать/дочь), отличающихся своим фенотипом. Различные комбинации репликации и деградации родительских ядер в ПС зиготе дают разные классы материнско-дочерних (м/д) пар. Схема, представленная на рисунке 3, показывает наиболее вероятные события, которые приводят к появлению тех или иных пар. Подсчитав количество пар в каждом из шести различных классов, можно оценить степень деградации соответствующих ядер до или после репликации.

Г/а а/а-

Рисунок 3 - Возможные комбинации репликации и деградации родительских ядер в зиготе при почковании

Было проанализировано девять различных скрещиваний, в пяти из которых мутантная аллель каг1 сопряжена с МАТ а, а в четырёх с МЛТа. Для всех м/д пар были определены частоты, приведенные в таблице 1. Частоты являются отношением х/(И-х), где х - число м/д пар соответствующего класса, а N - сумма всех м/д пар, анализированных в данном скрещивании. Под обозначением м/д

пар "однородительского" типа указано ядро, деградация которого (А) приводит зиготу к соответствующему фенотипу. Цифры в таких столбцах показывают эффективность деградации соответствующего ядра, либо еще нереплицирован-ного или неотошедшего в первую почку, Н/р, либо успевшего реплицироваться или сегрегировать, Р.

Таблица 1 - Сравнительные частоты различных пар мать/дочь в скрещиваниях аКАК! х акаг! и акаг1 х тКАЯ! типа

скрещивания ядерный фенотип N

а/а А a H/p a/а А а Р Г/а a/a А а Н/р а/а А а Р Г/а Г/Г з/ГК

тип скрещивания: аKAR] х akarl

YPH857 х К5-13 0,23 0,32 0,15 0,14 0,06 0,03 0,15 0,10 128

169t х T9a-ND1 0,41 0,21 0,30 0,08 0,02 0,24 0,02 0,02 0,06 52

YTK79 х К5-13 0,23 0,39 0,08 0,08 0,08 0,10 0,19 43

LL20 х T2b-ND2 0,48 0,29 0,08 0,05 0,18 0,00 0,03 0,18 40

Е aKA Rl х akarl 0,30 0,30 0,15 0,09 0,11 0,03 0,10 0,12 263

тип скрещивания: а karl х aKARl

К5-5А х YPH499 0,22 0,05 0,07 0,35 0,24 0,10 0,11 0,09 88

YPH925 x 168t 0,04 0,18 0,03 0,48 0,20 0,16 0,09 0,07 59

К5-5А х DC-5 0,04 0,07 0,07 0,51 0,28 0,16 0,11 0,09 59

T4a-ND2 x AB 1380 0,02 0,07 0,02 0,88 0,18 0,27 0,04 0,04 47

K5-5A x OT56g 0,04 0,02 0,02 0,79 0,04 0,24 0,18 0,08 52

£ а karl x &KAR1 0,08 0,09 0,05 0,54 0,19 0,17 0,11 0,07 305

В таблице 2 результаты сгруппированы по четырем колонкам. Соотношение з/а:з/а (з - зиготический клон) представляет пропорцию м/д пар, почки которых получили "а" и "а" родительские ядра соответственно, (а/а+а/а+Г/а): (а/а+а/а+Г/а). Частоты всех классов, сохранивших оба ядра либо в зиготе, либо в почке, позволяют оценить общую выживаемость ядер. (Частота класса Г/Г при этом не учитывалась, т.к. этот класс скорее характеризует эффективность слияния ядер в зиготе).

Частоты комбинированных классов, приведенные в третьей и четвертой колонках, характеризуют эффективность деградации в зиготе "а" и "а" ядер соответственно.

Оба типа скрещивания характеризуются равным количеством классов

Таблица 2 - Сравнительные частоты комбинированных фенотипических классов пар мать/дочь в различных каг!скрещиваниях _

комбинированные м/д классы

отношение Г/а+Г/а+з/ГК а/а+а/а а/а+ a/a

скрещивания "а" и "а"ядер, ядерная деградация деградация

входящих в выживаемость "а" ядра в "а" ядра в

первую почку зиготах зиготах

тип скрещивания: оtKARl х аkarl

YPH857 х К5-13 2,70 0,35 0,32 0,58

169txT9a-NDl 3,00 0,44 0,93 0,24

YTK79 х К5-13 2,60 0,43 0,34 0,54

LL20 х T2b-ND2 4,20 0,29 0,90 0,38

£ осKAR1 х -лкаг! 2,80 J 0,37 0,49 0,46

тип скрещивания: а karl х aKARl

К5-5А х YPH499 0,54 0,31 0,60 0,44

YPH925 х 168t 0,35 0,31 0,26 0,90

К5-5А х DC-5 0,24 0,40 0,34 0,68

T4a-ND2x 0,13 0,38 0,21 1,10

AB 13 80

K5-5A x OT56g 0,23 0,41 0,15 1,20

£ аkarl x 'aKARJ 0,31 0,34 0,31 0,76

а/а и a/а (табл. 1), хотя значения для отдельных скрещиваний могут значительно варьировать и отличаться от среднестатистических данных.. Таким образом, можно полагать, что после сегрегации в почку "а" ядра, вероятность деградации реплицированного ядра "а" равна деградации нереплицированного ядра "а".

Таблица 2 показывает, что в скрещиваниях а KAR1 х а karl отношение з/а : з/a равно 2,8. Таким образом, ядро "а" является для первой почки более предпочтительным. В скрещиваниях а karl х aKAR1 в первую почку в основном мигрирует "а" ядро, т.к. всреднем соотношение з/а:з/а равно 0,31. Так как пары Па менее многочисленны, чем а/а или а/а, а пары Г/а менее многочисленны, чем а/а или а/а, можно заключить, что выживание двух ядер в зиготе более редкое событие, чем выживание только одного из них, независимо от типа скрещивания (табл. 1). Сравнение результатов двух типов скрещиваний позволяет сформулировать простое правило: в первую почку вероятнее войдет то ядро, которое несет аллель дикого типа KARL

Влияние задержки роста зигот на ядерную трансмиссию и накопление ROS при различных комбинациях аллелей MA Т и КАЮ

Создание условий, способствующих замедлению роста зигот, таких как:

низкая температура, недостаток питательных компонентов, либо их суммарное воздействие, дало дополнительную информацию при изучении их потомства. Были проанализированы скрещивания двух различных типов: aKAR1 х alear! и akarl х aKAR1 (YPH857 х К5-13 и К5-5 х YPH499) Полученные данные представлены в таблицах 3 и 4.

Для изучения влияния задержки роста зиготы суспендировались в воде, выдерживались три часа при 30° или 10°С, и рассевались на YEPD с последующей инкубацией также при 30°С или 10°С. Образование почек у всех зигот происходило с запаздыванием. Образование почек у всех зигот происходило с запаздыванием. Кроме того, в последней графе таблицы 4 приводится определяемый цитологически показатель накопления ROS, а именно процент светящихся клеток после окрашивания дигидрородамином 123 под люминесцентным микроскопом.

Анализируя таблицы 3 и 4, можно заключить, что в обоих скрещиваниях наиболее эффективной оказывается инкубация зигот в воде в течение 3-х часов при 30°С. Зиготы, полученные от скрещивания aYPH857 х аК5-13 (сxKARl х а karl) после инкубации в воде 3 часа при сравнении с контролем проявляют четыре отличия:

1) значительное увеличение классов м/д с первой почкой "а" типа скрещивания;

2) снижение деградации "а" ядер, на что указывает уменьшение класса а/а;.

. 3) повышение общей выживаемости ядер в зиготе, на что указывает

значительный рост классов Г/а и Г/а;

4) значительное накопление ROS (см. рис. 4, б). Поскольку клеточная выживаемость не уменьшается (данные не приведены), а ядерная выживаемость даже значительно возрастает' (табл. 4), накопление ROS, обнаруженное в нащих экспериментах, очевидно не вызвано апоптозом, но,

скорее, используется дрожжевой клеткой как сигнал, который, возможно, инициирует дополнительный раунд репликации "а" ядра.

Таблица 3 - Оценка влияния некоторых неблагоприятных воздействий на различные фенотипические классы м/д пар___

классы м/д

скрещивания а/а а/а Г/а й/й а/а Г/а з/гк

Да А а А а Аа

Н/р Р Н/р Р

тип скрещивания: clKARI х akarl (aYPH857 х аК5- 13)

Контроль - Н2О 30и 3h -4,9 + 10 +4,1'

Контроль-H20 3üu3h+C + 11'" -4,7' +4,9"

Контроль - YEPD 10°3h -3,5 +6,7**

Н20 30°3h - H2030u3h+C +4,2' -3,6 +4,5'

H20 30u3h-H20 10u3h +4,3"

YEPD 10u3h-H20 10° 3h -7,8" -3,8*

тип скрещивания: a karl x slKARI (aK5-5 x aYPH499)

Контроль - H2030ü 3h -6,6" +3,6 -9,0 +10 +3,7

Контроль - Н2ОЗОи 3h+C

Контроль - YEPD 10" 3h +4,8*

H2030u3h-H2030u3h+C +4,4" .J0"'

Il2030"3h-H2010(,3h

YEPD10u3h-H2010ü3h -5,3'

в таблице представлены оценки различий, полученных в данном варианте опыта мри сравнении с контролем методом С помощью и ''+■"' показано отклонение от контрольного варианта в меньшую и большую сторону соответственно. В таблице представлены оценки у\ Звездочки: *, ** и *** означают вероятности "нулевых" гипотез равные 0,95, 0,99 и 0,999 соответственно.

а б в г

Рисунок 4 - Аккумуляция ROS в зиготах после различных внешних воздействий

а, б - зиготы от скрещивания YPH857 х К5-13 (aKAR1 х акагГу. в, г - зиготы от скрещивания YPH499 х К5-5 (a KARl х a ¡cari); a, в - контрольные зиготы;

б, г - зиготы после 3-х часов инкубации в 1120 при 30°С. Стрелками показано накопление ROS в части зиготы.

Таблица 4 - Оценка влияния некоторых неблагоприятных воздействий на комбинированные фенотипические к^а£сьш/д_11ар _

комбинированные классы м/д отно- %

отноше- I Уи+ Г 7а а/а+а/а а/а-1- а/а шение кле-

скрещивания ние "и" И "а" ядер + з/ГК ядерная деградация "а" деградация "а" деградации ток, с

ВХОДЯ- выжива ядра в ядра в ядра "а" ЯОБ

ЩИХ в -ем ость зиготах зиготах к дег-

первую радации

ночку ядра"а"

тип скрещивания: а КАЯ! х а каг! (о. УРН К 57 х аК5-13)

УРН857 х К5-13 Контроль 2,70 0,35 0,32 0,58 18

УРН857 х К5-13 н2озо°зь 0,67 0,72 0,15 0,41 45

УРН857 х К5-13 н2озо°зы-с 1,60 1,10 0,07 0,38 15

УРН857 х К5-13 Н2010°ЗЬ 0,86 0,62 0,30 0,47 59

УРН857 х К5-13 УЕРШ00ЗЬ 0,94 0,69 0,25 0,63 -3,9* ■ 63

Контроль - Н2030и311 -20,"б"* ~ +7.4" ;'..'■■ -5,3

Контроль - Н2ОЗОиЗЬ+С +12""

Контроль - У1;РОЮиЗЬ -7,0 : +3,8* ;

Н2ОЗОиЗЬ - Н2ОЗОиЗИ+С • +5.6*

Н2ОЗОиЗЬ-Н2ОЮиЗЬ

УЕРВЮиЗЬ-Н2ОЮи311

тип скрещивания: икаг! х &КАк! (аК5-5 х а УР11499)

1С5-5А х УРН499 Контроль 0,54 0,31 0,60 0,44 66

К5-5А х УРН499 №030° ЗЬ 1,10 0,75 0,22 0,45 : -з.5 30

К5-5А х УРН499 н2озо°зь+с 0,55 0,38 0,38 0,58 41

К5-5А х УРН499 Н2ОЮ°311 0,46 0,58 0,19 0,74 : -8,1" 34

К5-5А х УРН499 УЕР010°ЗЬ 0,68 0,29 0,39 0,96 44

Контроль - Н2О30°ЗЬ +8,5" -7,5"

Контроль - Н2030°ЗЬ+С

Контроль - УЕРБ10и ЗЬ !+4,8*~

Н2030° ЗЬ - Н2ОЗОиЗЫ-С -4,2* :/■

н2030"311 - 1ЬОЮиЗЬ -5,8*

УЕР010иЗЬ-Н2010иЗЬ

в таблице представлены индексы х/(1Ч—х) и их сравнение с контрольными вариантами. Для а/а, а/а и Г/а использовались Ыа, для а/а, а/а и Г/а—и для ГК—N. Темные

поля отведены для оценки различий, полученных в данном варианте опыта при

2

сравнении с контролем методом % .

Зиготы, полученные от скрещивания К5-5 х YPH499 (akarl х aKAR1) после инкубации в воде 3 часа также проявляли четыре основных отличия, при сравнении с контролем:

1) значительное увеличение классов м/д с первой почкой "а" типа скрещивания;

2) снижение деградации "а" ядер, на что указывает уменьшение класса а/а;

3) повышение выживаемости ядер в зиготе, на что указывает рост классов ШиГ/а;

4) уменьшение накопления ROS (см. рис. 4, г).

Отличия (2) и (3) совпадают, а эффект (1) хоть и не совпадает, но приводит к тому же результату: повышается доля первых почек, несущих ядро с мутантяой аллелью гена KARL

Выдерживание при пониженной температуре на YEPD в скрещивании 1-го типа достоверно увеличивает эффективность гетерокариоза, причем этого не происходит, если клетки выдерживать на холоду в воде. Содержание зигот при 10 °С приводит к накоплению ROS в любом варианте опыта.

Выдерживание при пониженной температуре в скрещивании 2-го типа, независимо от того, содержатся зиготы в Н20 или на YEPD, приводит к более эффективной деградации "а" ядра в зиготе. Однако, дополнительным накоплением ROS по сравнению с контролем это не сопровождается.

Влияние цитоплазматически наследуемых факторов на ядерную трансмиссию и деградацию ядер в гетерокарионах

Были изучены цитоплазматические факторы, влияющие на ядерную трансмиссию и деградацию в двух типах karl скрещиваний: aKARI х akarl и а karl х üKARl (YPH857 х К5-13 и К5-5 х YPH499). Использовались GuHCI, элиминирующий некоторые прионовые белки, EtBr, элиминирующий мтДНК, а также цитодукция (условно названная заменой цитоплазмы). Данные представлены в таблице 5.

Первая цифра в каждой секции принадлежит контрольному варианту (для данного сравнения). 41 означает скрещивание YPH499 х К5-5, и 42-47 - его производные. 31 означает скрещивание YPH857 х К5-13 и 32-36, 38 - его производные. Скобки обозначают замену цитоплазмы; rhov и rho° ~ интактную и элиминированную мтДНК соответственно; GuIICl означает, что штаммы были обработаны GuHCl перед скрещиванием. В контрольных вариантах приведены все значения x/(N-x). Во всех других случаях значения x/(N-x) представлены только тогда, когда отличия от контрольного варианта статистически достоверны. Если экспериментальные данные отличаются от контрольных менее, чем в 1.4 раза, то ячейка остается пустой, если более чем в 1,4 раза (но статистически достоверное отличие не достигается), то указан только знак " + " или"-".

Согласно табличным данным (секция 1, столбец 1), присутствие/отсутствие митохондриального генома может влиять на вероятность вхождения в первую почку соответствующего ядра. Сравнение скрещиваний 41-45 и 41-44 позволяет предположить, что отсутствие мтДНК по всей видимости увеличивает вероятность вхождения ядра в первую почку, независимо от МАТ и KAR1 аллелей, которые оно содержит. В то же время генетический фон или иное сочетание аллелей гена KAR1 и МАТ может уменьшать этот эффект до незначительного уровня (сравнить 31-34, 31-35).

Третья секция таблицы 5 показывает, что присутствие прионов от МАТа KAR1 гаплоида способствует сегрегации его ядра в первую почку (сравнить 3132). Также следует отметить, что если GuHCl обработка МАТа KAR1 родителя значительно уменьшает долю "а" ядра в первой почке (сравнить 31-32), обработка МАТа karl родителя приводит к незначительному увеличению отношения з/«:з/а (сравнить 41 -43).

В скрещивании aKARl х akarl (31) суммарная выживаемость ядер значительно увеличивается после элиминации мтДНК МАТа родителя. Замена цитоплазмы у МАТа. родителя при скрещивании с rho° партнером также приводит к высокому уровню ядерной выживаемости (таблица 5, вторая секция, сравнить 34-38). Воздействие GuHCl эффективно стимулирует суммарную

выживаемость у скрещивания аКАК1 х акаг1 независимо от обработанного родителя (таблица 5, секция 3, 31-32, 31-33).

Таблица 5 - Влияние цитоплазматических обработок гаплоидов, вовлеченных в каг!

скрещивания на различные фенотипичесхше классы м/д пар

комбинированные классы мать/дочь

отноше- Г/а+Г/а а/а+а/а а/а + а/а

скрещивания ние "а" и +3/ГК деграда- деграда- N

"а" ядер в выжива- ция "а" ция "а"

первой емость

ядер

1. элиминация мтДНК у "а" и "а" родителей, скрещенных с г1ю+

41: аКАЮгко+ х акаг1г1ю+ 0,54 0,31 0,60 0,44 88

45: гЬо+ х гЬо° +1,21* - + 45

44: До0 х гЬо+ -0,15** + -0,08*** + 0,89* 53

31: аКАЯ1тЬо+ х акаг1гко+ 2,67 0,35 0,32 0,58 128

34: г!ю0 х г1ю+ + + + 80

35: г1ю+ х г1ю0 +0,79** - 68

2. влияние замены цитоплазмы у "а" и "а" родителей, скрещенных с гЬо°

44:аКАШ гЬю° х акаг1 гко+ 0,15 0,47 0,08 0,89 53

47:гЬо°х[] - +0,30* 47

А5\ъКАВ.1 Ню'' х акаг] гко° 1,21 0,22 0,73 0,67 45

46: []хг1ю° -0,19* • + 62

35: а&4ЛМо+х акаг1гЪо° 1,94 0,79 0,19 0,54 68

36: [ ] хгЬо0 + 55

34: аКАИк\ю°хакаг1г1ю+ 2,28 0,51 0,45 0,51 80

38: гЬо° х [ ] + +1,16* - - 67

3. воздействие виНС! на "а" и "а" родителей, скрещенных с гЬо+

41: йКАЮгЬо* х акаг1гко+ 0,54 0,31 0,60 0,44 88

43: гЬо+ х -ОиНС1 + 53

42: -ОиНС1 х г/го1 57

31: аКАЯк\ю+ х акаг1гкд* 2,67 0,35 0,32 0,58 128

32: -&1НС1 х ±о+ -0,53*** +0,82** -0,09** 60

33: гЬон х -ОиНС! - +0,86** - 69

см. примечание к таблице 3

Согласно третьему столбцу деградация аКАК1 ядра понижалась, когда мтДНК у данного родителя отсутствует (секция 1, 41-44); когда у аКАК1 родителя заменена цитоплазма и он скрещивается с гко° партнером (секция 2, 45-46). Деградация яКАЯ! ядра повышалась при замене цитоплазмы у акаг!

партнера (секция 2, 44-47). Деградация akarl ядра в скерещивании MATaKARl х МАТа karl менялась мало. Сильное уменьшение деградации можно видеть только в случае, когда а штамм обрабатывался GuHCl (секция 3,31-32).

Согласно данным 4-го столбца деградация akarl ядра возрастает, когда у aKAR1 партнера элиминирована мтДПК (секция 1, 41-44).

Таким образом наличие мтДНК при родительских ядрах является важным фактором, регулирующим процесс их дегардации в зиготе.

Проверка гипотезы об участии прионов в ядерной трансмиссии у гетерокарионов

Опыты, свидетельствующие о роли прионов в трансмиссии гетерокарио-тических ядер, были получены с использованием изогенных штаммов дрожжей (штамм, являющийся донором [PSI+] фактора - OT56/g {adel-14, psi+), и штамм реципиент [PSI*] фактора АН/В (adel-14, karl-1, psi")). -

Цитодуктанты [PSI+] с ядром от АН/В, полученные от скрещивания OT56/g psi+ х АН/В psi", отбирались микроманипулированием как потомки гетерокариотических зигот. Два из них, gB/cyt6 и gB/cytl9, использовались в дальнейшей работе.

Изменение фенотипа служило удобным индикатором для селекции [PSI+J цитодуктантов. Так как штаммы несут нонсенс-мутацию в гене ADE1, супрес-сия этой мутации с помощью [PSI+] фактора приводит к изменению цвета коло-ний -вместо красного, они становятся розоватыми, а со временем - белыми.

Результаты частичного педигри-анализа приведены в таблице'6, в которой в столбце "скрещивания" названия и генотипы штаммов даны в условном сокращенном виде.

Согласно данным таблицы 6 можно предположить, что прионы нужны для защиты собственного ядра в зиготе и, уменьшая его деградацию, способствуют более частой сегрегации в первую почку. Сравнивая пару 1-6 (табл. 6), можно наблюдать, как прион [Р8Г], пришедший к "а" ядру, обеспечивает повышение частоты сегрегации "а" ядра в первую почку.

Следует отметить, что разные цитодуктанты с "а" ядром, очевидно, полу-

чают разный набор и (или) разное количество прионов. В результате их скрещивания с одним и тем же родителем совершенно по-разному сказываются на общей выживаемости ядер и на выживании "а" ядра в зиготе (табл. 6, скрещивания 5-7).

Таблица б - Влияние [PSI+] на комбинированные фенотипические классы м/д пар.

скрещивания комбинированные классы м/д отношение деградации ядра "а"к деградации ядра "а"

отношение "а" и "а" ядер, входящих в первую почку Г/оМТ/а -1-з/ГК ядерная выжива -емость ala+odа деградация "а" ядра в зиготах а/от-н а/а деградация "а" ядра в зиготах

1. аВ х ag (psi" х psi+) 0,16 1,20 0,29 0,26 1,10

2. аВ х ag-GuHCl (psi" X psi") 0,60 0,65 0,38 0,46 0,83

3. aB-GuHCl x ag (psi" X psi+) 0,35 0,59 0,17 0,88 0,19

4. «B-GuHCl x ag-GuHCl (psi" x psi") 0,19 1,22 0,21 0,33 0,64

5. aB/6 x ag-GuHCl (psi"+ X psi") 0,78 0,45 0,49 0,49 1,00

6. agB/19 xag (psi+ x psi+) 0,65 1,08 0,47 0,16 2,9

7. <agB/19 x ag-GuHCl (psi+ x psi") 0,60 1,36 0,16 0,27 0,59

8. agB/19-GuHCl x ag (psi" x psi+) 0,21 0,42 0,72 0,39 1,90

см. примечание к таблице 3

О наличии активного в отношении воздействия на ядерную деградацию приона, отличного от [PSI+] фактора, говорят данные по сравнению скрещиваний 1-3: после обработки GuHCl «psi" штамма - увеличивается выход "а" в первую почку (недостоверно), уменьшается выживаемость ядер и сильно увеличивается деградация "а" ядра в зиготе, в основном за счет реплицированного "а". Цитологические признаки апоптоза в KARllkarl гетерокарионах Полученные нами данные по деградации ядер в гетерокарионах и по влиянию на этот процесс karl мутации позволяют предположить, что в гетеро-кариотических зиготах могут происходить апоптозо-подобные процессы. Чтобы

проверить это предположение, мы проанализировали накопление свободных радикалов (ROS) в зиготах от разных скрещиваний, содержащих и не содержащих мутацию karl.

Как видно из рисунка 5, ROS реакция, являясь типичной для апоптоза. часто наблюдается в зиготах YPH499 (МАШ KAR1) х К5-5А (MATakarl; рис. 5, б, в), но практически отсутствует в KAR1/KARI гомоаллельных зиготах YPH499 (.MAT&KARJ) х 1691 {МАТа КАК!) (рис.5, а).

В различных скрещиваниях для наблюдения за изменениями в ядерной структуре, являющимися также типичным признаком апоптоза, зиготы окрашивались DAPI (рис. 5, г, д). Такие изменения встречаются в karlíKARl зиготах (рис. 5, д). Отсутствие изменений в ядерной морфологии представлено на рисунке 5 (г). Проводитесь двойное окрашивание, одновременно демонстрирующее совладение результатов накопления ROS и черт деструкции ядра. Результаты представлены на рисунке 5 (е, ж).

Данные, полученные цитологическими методами, позволяют предположить, что в зиготах karlíKARl типа наблюдаются черты апоптоза - накопление ROS и деструкция ядра.

а б в г д е ж

Рисунок 5 - Аккумуляция ROS и ядерная деструкция в дрожжевых зиготах.

а, б, в -•• зиготы, окрашенные дигидрородашпкш 123; г, д -- зиготы кагЬ'КАК! типа, окрашенные ОАР1; е, ж - зиготы кагИКАШ типа после двойного окрашивания. ВАР1 и дшвдрородамином 123; е.....вид.зигот в голубом фильтре, выявляющем ОАР1 флуоресценцию; ж - вид зигот в красном фильтре, выявляющем свечение родамина 123.

Выводы

1. Предложен эффективный метод выявления гетерокарионов со скрытым ядром.

2. С помощью частичного педигри-анализа обнаружена закономерность, общая -для всех скрещиваний, один из родителей которых несет мутацию каг1: вероятность отхождения в первую ночку ядра с КАЯ1 аллелью выше, чем у ядра

1JHb гусскии фон

!!> 2006-4 2099

с мутантной karl-1 аллелью. Эффект замедленной сегрегации в первую почку karl ядра может быть компенсирован замедлением почкования зиготы.

3. На трансмиссию и деградацию ядер в зиготе в значительной мере влияет наличие мтДНК, причем этот эффект зависит от клеточного пола: элиминация мтДНК у "а" гаплоида приводит к деградации в зиготе ядра того же родительского штамма.

4. Показано влияние цитодукции на сегрегацию ядра в первую почку, причем этот эффект зависит от аллели гена KAR1 у цитодуктанта: чужая цитоплазма эффективнее влияет на ядро с karl-1 мутацией.

5. Обработка родительского штамма GuHCl может влиять как на деградацию ядра в зиготе, так и на частоту его отхождения в первую почку. Показана способность [PSI+] фактора (или какого-то иного, сопутствующего ему приона) как снижать деградацию "своего" ядра в зиготе, так и увеличивать эффективность его сегрегации в 1-ю почку.

6. В цитологических опытах удалось показать, что однородительское наследование у гетерокарионов коррелирует с признаками апоптоза — накоплением активных форм кислорода (ROS) и изменением ядерной морфологии.

Список работ по теме диссертации

1. Выявление скрытых "незаконных" ядер при тетрадном анализе диплоидного потомства гетерокарионов у Saccharomyces cerevisiae! Невзглядова О. В., Гайворонский А. А., Артемов A.B., Смирнова Т. И., Сойдла Т. Р.// Генетика. - 2001. - Т. 37, №6. - С.754 - 761.

2. Факторы, влияющие на частоту скрытого гетерокариоза у Saccharomyces cerevisiae! Невзглядова О. В., Гайворонский А. А., Артемов A.B., Сойдла Т. Р.// Генетика. - 2002.-V.38,№3.-~С.293 -299.

3. Concealed nuclei in Saccharomyces strains (minireview)/ Nevzglyadova O.V., Artyomov A.V., Gaivoronski A.A., Soidla T.R.// FEMS Yeast Res. - 2002. -V.2, №4. - P.471 - 479.

4. The impact of manipulations with cytoplasmaticaliy inherited factors on nuclear transmission and degradation in yeast heterokaryons/ Nevzglyadova О. V., Artyomov A, V., Mikhailova E.V., Soidla T. R.// Current Genetics. - 2004. - V.45, № 5.- P.273-282.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Артемов, Алексей Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 Обзор литературы.

1.1 Мутация karl и её использование для получения и исследования гетерокарионов у дрожжей-сахаромицетов.

1.2 Апоптоз у дрожжей.

1.3 Основные свойства прионов у низших эукариот.

ГЛАВА 2 Материалы и методы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 3 Получение и анализ гетерокарионов со скрытым ядром.

ГЛАВА 4 Влияние сочетания аллелей локусов МАТ и KAR1 на выживаемость зиготических клонов.

ГЛАВА 5 Влияние аллелей гена KAR1 на сегрегацию ядра в первую почку гетерокариона, а также на деградацию ядер в зиготе.

ГЛАВА 6 Влияние задержки роста зигот на ядерную трансмиссию и накопление ROS при различных комбинациях аллелей МАТ и KAR1.

ГЛАВА 7 Влияние цитоплазматически наследуемых факторов на ядерную трансмиссию и деградацию ядер в гетерокарионах.

7.1 Влияние разных цитоплазматических воздействий на селекцию ядра, сегрегирующего в первую почку.

7.2 Влияние разных цитоплазматических воздействий на ядерную деградацию.

ГЛАВА 8 Проверка гипотезы об участии прионов в ядерной трансмиссии у гетерокарионов.

ГЛАВА 9 Цитологические признаки апоптоза в ХЛЛ7/А;<зг7гетерокарионах.

ГЛАВА 10 Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности трансмиссии ядер у ядерно-цитоплазматических гибридов Saccharomyces cerevisiae"

Актуальность проблемы

Данная диссертационная работа относится к разряду фундаментальных исследований. Она посвящена изучению взаимоотношений ядерных и цитоплазматических структур в гетерокарионах дрожжей.

В настоящее время методами клеточной инженерии, пользуясь денуклеированными клетками, создают новые сочетания ядер клеток одних высших эукариот и цитоплазмы других. При этом, одной из существенных проблем оказывается взаимодействие генетических и эпигенетических факторов.

Изучать взаимовлияние ядер и цитоплазм разных клеток удобнее на модели одноклеточных низших эукариотов, используя гетерокарионы дрожжей-сахаромицетов. У этих организмов была получена мутация в гене КАШ, вызывающая запаздывание кариогамии по отношению к плазмогамии. Получаемые при этом гетерокарионы создают уникальную возможность для изучения дифференциальной трансмиссии ядер. При этом, так как дрожжи являются хорошо генетически изученным объектом, можно исследовать влияние на этот процесс таких цитоплазматически наследуемых факторов, как митохондриальная ДНК и прионовые изоформы отдельных клеточных белков. Данных о том, какие факторы цитоплазмы влияют на конкурентноспособность ядер, в литературе до сих пор нет. Более того, несмотря на то, что прионовая наследственность усиленно изучается у дрожжей, определена функция только очень немногих прионов.

Гетерозиготы КАЯ1/каг1, а также их первые почки, в большинстве своем быстро очищаются, т.е. оказываются гомогенными в отношении как ядерных, так и митохондриальных геномов. Наблюдения ряда авторов говорят о конкурентных отношениях ядер, неспособных слиться, т.к. выживает либо одно родительское ядро, либо другое.

Очищение гетерокариотических клеток от одного из ядер может быть рассмотрено в свете недавно разработанной концепции программированной клеточной гибели у дрожжей. Её наиболее изученной и распространенной формой является апоптоз. Апоптоз может запускаться как внешними факторами, например УФ излучением и изменением состава питательной среды, так и внутренними, например старением. При этом характерными чертами апоптоза являются накопление свободных радикалов в митохондриях и деградация ядерной ДНК.

Рассмотрение вопроса - осуществляется ли элиминация ядер в гетерокарионах по типу апоптоза — представляется весьма актуальным.

Научная новизна

В настоящей работе исследуется явление так называемого скрытого гетерокариоза. Впервые предложена эффективная система отбора двуядер-ных клеток, одно из ядер которых фенотипически не экспрессировано.

Впервые в потомстве гетерокариона показана зависимость отхожде-ния родительского ядра в первую почку от того, какую аллель гена КАК1 это ядро несет.

Рассмотрены варианты КАШ х каг1 скрещиваний, у которых один из родителей лишен митохондриальной ДНК, а также варианты, когда гаплоиды обрабатывались гуанидин гидрохлоридом (СиНС1), вызывающим элиминацию некоторых дрожжевых прионов.

С помощью изогенных штаммов, отличающихся прионовой формой белка, участвующего в терминации трансляции [Р81+] фактора, впервые получены свидетельства в пользу влияния прионов на деградацию родительских ядер в гетерокарионе.

Изучалось накопление свободных радикалов у гетерокарионов и впервые получены данные в пользу связи апоптоза с гетерокариотической ядерной деградацией. ь

Цели и задачи исследования

1. Исследовать явление скрытого гетерокариоза.

2. Сравнить клеточный состав зиготических гетерокариотических клонов в двух типах скрещивания, отличающихся сопряжением аллелей генов МАТ и KAR1.

3. Использовать частичный педигри-анализ для выявления разных по фенотипу пар зигота/почка (или мать/дочь). Оценить количественно разные классы этих пар и, таким образом, охарактеризовать интенсивность процесса деградации ядер в зиготе. Сравнить данные, полученные в разных скрещиваниях.

4. Выяснить, как внешние воздействия, вызывающие задержку в почковании зигот, сказываются на частоте появления разных м/д пар.

5. Выяснить, как сказывается на трансмиссии и деградации ядер в зиготе обработка родительских гаплоидов агентами, вызывающими наследственные изменения цитоплазматических факторов (мтДНК и прионов).

6. Изучить цитологическими методами наличие в гетерокарионах таких типичных черт апоптоза, как накопление активных кислородных радикалов (ROS) и деструкция ядер.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Артемов, Алексей Вячеславович

выводы

1. Предложен эффективный метод выявления гетерокарионов со скрытым ядром.

2. С помощью частичного педигри-анализа обнаружена закономерность, общая для всех скрещиваний, один из родителей которых несет мутацию karl: вероятность отхождения в первую почку ядра с KAR1 аллелью выше, чем у ядра с мутантной karl-1 аллелью. Эффект замедленной сегрегации в первую почку karl ядра может быть компенсирован замедлением почкования зиготы.

3. На трансмиссию и деградацию ядер в зиготе в значительной мере влияет наличие мтДНК, причем этот эффект зависит от клеточного пола: элиминация мтДНК у "а" гаплоида приводит к деградации в зиготе ядра того же родительского штамма.

4. Показано влияние цитодукции на сегрегацию ядра в первую почку, причем этот эффект зависит от аллелй' гена KAR1 у цитодуктанта: чужая цитоплазма эффективнее влияет на ядро с karl-1 мутацией.

5. Обработка родительского штамма GuHCl может влиять как на деградацию ядра в зиготе, так и на частоту его отхождения в первую почку. Показана способность [PSI+] фактора (или какого-то иного, сопутствующего ему приона) как снижать деградацию "своего" ядра в зиготе, так и увеличивать эффективность его сегрегации в 1-ю почку.

6. В цитологических опытах удалось показать, что однородительское наследование у гетерокарионов коррелирует с признаками апоптоза -накоплением активных форм кислорода (ROS) и изменением ядерной морфологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Артемов, Алексей Вячеславович, Санкт-Петербург

1. Helfant A.H. Composition of the spindle pole body of Saccharomyces cerevisiae and the proteins involved in its duplication// Curr. Genet. 2002. -V.40.-P.291 -301.

2. Huffaker T.S., Thomas J.H., Botstein D. Diverse effect of beta-tubulin mutations on microtubule formation and function// J. Cell Biol. 1998. - V.106. -P.1997 - 2010.

3. Knop M., Pereira G., Schiebel E. Microtubule organization by the budding yeast spindle pole body// Biol. Cell. 1999. - V.91. - P.291 - 304.

4. Schild D., Ananthaswamy H.N., Mortimer R.K. An endomitotic effect of a cell cycle mutation of Saccharomyces cerevisiae!I Genetics. 1981. - V.97. — P.551 - 562.

5. Byers B., Goetsch L. Duplication of spindle plaques and integration of the yeast cell cycle// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1974. - V.38. -P. 123 - 131.

6. Knop M., Strasser K. Role of the spindle pole body of yeast in mediating assembly of the prospore membrane during meiosis// EMBO J. 2000. - V. 19. - P.3657 - 3667.

7. Byers B. Multiple roles of the spindle pole body in the life cycle of Saccharomyces cerevisiae. In: Wettstein D von, Kielland-Brandt M, Stenderup A (eds) Molecular genetics in yeast. Munksgaard, Copehagen. 1981.

8. Baum P., Furlong C., Byers B. Yeast gene required for spindle pole body duplication: homology of its product with Ca binding proteins// PNAS USA. - 1986. - V.83. - P.5512 - 5516.

9. Rose M.D., Fink G.R. KAR1, a gene required for function of both intranuclear and extranuclear microtubules in yeast// Cell. 1987. - V.48. -P. 1047- 1060.

10. Conde J., Fink G.R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion// PNAS USA. 1976. - V.73. - P.3651 - 3655.

11. Fink G.R., Conde J. Studies on KAR1, a gene required for nuclear fusion in yeast. In: Fink G.R., Ba P. (eds) International cell biology. The Rockefeller University Press, New York, 1976 - 1977.

12. Rose M.D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae// Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. - V.12. - P.663 - 695.

13. Asymmetric mitotic segregation of the yeast spindle pole body/ Vallen E.A., Scherson T.Y., Roberts T., Zee K.V, Rose M.D.// Cell. 1992. - V.69. -P.505 - 515.

14. Separate domains of KAR1 mediate distinct functions in mitosis and nuclear fusion/ Vallen E.A., Hiller M.A., Scherson T.Y., Rose M.D.// J. Cell Biol. 1992.-V.l 17.-P.1277- 1287.

15. Genetic interactions between CDC31 and KAR1, two genes required for duplication of the microtubule organizing center in Saccharomyces cerevisiae/ Vallen E.A., Ho W., Winey M., Rose M.D.//Genetics. 1994. - V.l37.-P.407^22.

16. Biggins S., Rose M.D. Direct interaction between yeast spindle pole body components: Karlp is required for Cdc31p localization to the spindle pole body// J. Cell Biol. 1994. - V.l25. - P.843 - 852.

17. The Cdc3 lp binding protein Karlp is a component of the half bridge of the yeast spindle pole body/ Spang A., Geissler S., Grein K., Schiebel E.// J. Cell Biol. - 1995. - V.128. - P.863 - 877.

18. Khalfan W., Ivanovska I., Rose M.D. Functional interaction between the PKC1 pathway and CDC31 network of SPB duplication genes// Genetics. -2000. V.l55. - P. 1543 - 1559.

19. Wright R.E., Lederberg J. Extranuclear transmission in yeast heterokaryons// PNAS USA. 1957. - V.43. - P.919 - 923.

20. Lancashire W.E., Mattoon J.R. Cytoduction: A tool for mitochondrial genetic studies in yeast// Mol. Gen. Genet. 1979. - V.l70. - P.333 - 344.

21. Юрченко Л.В. Гетерокариоз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae!! Генетика. 1982.- Т.18, №9.- С.1412- 1422.

22. Скрытые гетерокарионы в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Псевдоплейотропная супрессия в множественно маркированном штамме YPH857/ Невзглядова О. В., Давыденко С. Г., Смирнова Т. И,, Сойдла Т. Р.// Генетика. 1998. - Т. 34, № 12. - С. 1597 - 1602.

23. Скрытые гетерокарионы в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Модельные опыты/ Невзглядова О. В, Давыденко С. Г., Смирнова Т. И., Сойдла Т. Р.// Генетика. 1998. - Т. 34, №12. - С. 1603 - 1609.

24. Скрытые гетерокарионы в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Условия проявления скрытого ядра/ Невзглядова О. В., Смирнова Т. И., Гайворонский А. А., Сойдла Т. Р.// Генетика. 2000. - Т. 36, №8. - С.1 - 8.

25. Выявление скрытых "незаконных" ядер при тетрадном анализе диплоидного потомства гетерокарионов у Saccharomyces cerevisiae! Невзглядова О. В., Гайворонский А. А., Артемов А.В., Смирнова Т. И., Сойдла Т. Р.// Генетика. 2001. - Т. 37, №6. - С.754 - 761.

26. Факторы, влияющие на частоту скрытого гетерокариоза у Saccharomyces cerevisiae/ Невзглядова О. В., Гайворонский А. А., Артемов А.В., Сойдла Т. Р.// Генетика. 2002. - V.38, №3. - С.293 - 299.

27. Concealed nuclei in Saccharomyces strains (minireview)/ Nevzglyadova O.V., Artyomov A.V., Gaivoronski A.A., Soidla T.R.// FEMS Yeast Res. 2002. - V.2, №4. - P.471 - 479.

28. Wyllie A.H., Kerr J.F.R, Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis// International review of Cytology. 1980. - V.68. - P.251 - 306.

29. Apoptosis in yeast: a new model system with applications in cell biology and medicine/ Madeo F., Engelhardt S., Herker E., Lehmann N., Maldener C., Proksch A., Wissing S., Frohlich K-U.//Curr. Genet. 2002. - V.41. -P.208 - 216.

30. Anti-apoptotic versus pro-apoptotic signal transduction: checkpoints and stop signs along the road to death/ Jarpe M.B., Widmann C., Knall C.,

31. Schlesinger Т.К., Gibson S., Yujiri Т., Fanger G.R., Gelfand E.W., Johnson G.L.// Oncogene. 1998.- V. 17, №11. -P. 1475- 1482.

32. Madeo F., Fröhlich E., Fröhlich K-U. A yeast mutant showing diagnostic markers of early and late apoptosis// J. Cell Biol. 1997. -V. 139. -P. 729 - 734.

33. Cell death with predominant apoptotic features in Saccharomyces cerevisiae mediated by deletion of the histone chaperon ASF1/CIA1/ Yamaki M., Umehara Т., Chimura Т., Horikoshi MM Genes to cell. 2001. - V.6. - P.1043 - 1054.

34. A truncated form of KlLsm4p and the absence of factors involved in mRNK decapping trigger apoptosis in yeast/ Mazzoni C., Mancici P., Verdone L., Madeo F., Serafín A., Herker E., Falcone CM Mol. biol. cell. 2003. - V. 14. -P.721 -729.

35. A caspase-related protease regulates apoptosis in yeast/ Madeo F., Herker E., Maldener C., Wissing S., Lachelt S., Herían M., Fehr M., Lauber K., Sigrist S., Wesselborg S., Fröhlich K-U.// Mol. cell. 2002. -V.9. - P.l - 20.

36. Manon S., Chaudhuri В., Guerin M. Release of cytochrome С and decrease of cytochrome С oxidase in Bax-expressing yeast cells, and prevention of these effects by coexpression of Bcl-xL// FEBS Lett. 1997. - V.415. - P.29 - 32.

37. CED-4 induces chromatin condensation in Saccharomyces pombe and is inhibited by direct physical association with CED-9/ James C., Gschmeissner S., Fraser A., Evan G.I.// Curr. Biol. -1997. V.7, № 4. - P.246 - 252.

38. Yeast as a model to study apoptosis/ Christophe F., Mathieu P., Agathe Т., Bernard M.// Bioscience Reports. 2002. - V.22, №1. - P.59 - 79.

39. Xu Q., Reed J.C. The mitochondrial F0F1-ATPase proton pump is required for function of the proapoptotic protein Bax in yeast and mammalian cells// Mol.Cell. 1998. - V.l, №3. - P.337 - 346.

40. The mitochondrial F0F1-ATPase proton pump is required for function of the proapoptotic protein Bax in yeast and mammalian cells/ Matsuyama S., Xu Q., Velours J., Reed J.C.// Mol. Cell. 1998. - V.l. - P.327 - 336.

41. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic BAX and antiapoptotic BCL-2/ Schlesinger P.H., Gross A., Yin X.M., Yamamoto K., Saito M., Waksman G., Korsmeyer S.J.// PNAS USA. 1997. - V.94. - P. 11357 - 11362.

42. The influence of oxygen toxicity on yeast mother cell-specific aging/ Nestelbacher R., Laun P., Vondrakova D., Pichova A., Schuller C., Breitenbach M.// Exp.Gerontol. 2000. - V.35. - P.63 - 70.

43. Oxygen stress: a regulator of apoptosis in yeast/ Madeo F., Frohlich E., LigrM., GreyM., Sigrist S.J., WolfD.H., Frohlich K-U.// J. Cell Biol. 1999. -V.145. - P.757 - 767.

44. Nestelbacher R., Laun P., Breitenbach M. Images in experimental gerontology. A senescent yeast mother cell//Exp. Gerontol. 1999. - V.34. -P.895 - 896.

45. D.Granot., A. Levine, E. Dor-Hefetz. Sugar-induced apoptosis in yeast cells// FEMS Yeast Research. 2003. - V.4. - P.7 - 13.

46. Yoon H.J., Carbon J. Participation of Birlp, a member of the inhibitor of apoptosis family, in yeast chromosome segregation events// PNAS USA. -1999.-V.96.-P.13208- 13213.

47. Cell division regulation by BIR1, a member of the inhibitor of apoptosis family in yeast/ Li F., Flanary P.L., Altieri D.C., Dohlman H.G.// J.Biol.Chem. 2000. - V.275. - P. 6707 - 6711.

48. Harris B.Z., Lim W.A. Mechanism and role of PDZ domains in signalling complex assembly// J.Cell Sci. 2001. - V. 114. - P.3219 - 3231.

49. Clausen T., Southan C., Ehrmann M. The HtrA family of proteases: Implication for protein composition and cell fate//Mol. Cell. 2002. - V. 10. -P.443 - 455.

50. Pallen M.J., Wren B.W. The HtrA family of serine proteases// Mol. Microbiol. 1997. - V.26. - P.209 - 221.

51. Fahrenkrog В., Sauder U., Aebi U. The S.cerevisiae HtrA-like protein Nmalllp is a nuclear protease that mediates yeast apoptosis// Journal of Cell Science. 2004. - V.l 17. - P.l 15 - 126.

52. A role for the actin cytoskeleton in cell death and aging in yeast/ Gourlay C.W., Carpp L.N., Steven P.T., Ayscough K.R.// J. Cell Biol. 2004. -V.l64, №6. - P.803 - 809.

53. Lewis K. Programmed death in bacteria// Microbiology and Molecular Biology. 2000. - V.64, №3. - P.503 - 514.

54. Chronological aging leads to apoptosis in yeast/ Herker E., Jungwirth H., Lehmann K.A., Maldener C., Frohlich K-U., Wissing S., Buttner S., Fehr M., Sigrist S., Madeo F.// J. Cell Biol. 2004. - V.l64, №4. - P.501 - 507.

55. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiael Fabrizio P., Battistella L., Vardavas R., Gattazzo C., Liou L-L., Diaspro A., Dossen J.W., Gralla E.B., Longo V.D.// J. Cell Biol. -2004. V. 166. - P. 1055 - 1067.

56. Bursch W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death// Cell Differ. 2001. - V.8. - P.569 - 581.

57. Zhao J., Fleet G.H. Degradation of DNA during the autolysis of Saccharomyces cerevisiael/ J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V.30. - P.l75 - 182.

58. Wysocki R., Kron S.J., Yeast cell death during DNA damage arrest is independent of caspase or reactive oxygen species// J. Cell Biol. 2004. - V.l66. -P.311 -316.

59. Prion protein biology/ Prusiner S.B., Scott M.R., DeArmond S.J., Cohen F.E.// Cell. 1998. - V.93. - P.337 - 348.

60. Cox B.S. a cytoplasmic suppressor of supersuppression in yeast// Heredity. 1965. - V.20. - P.505 - 521.

61. Неоднозначность трансляции у дрожжей: генетический контроль и модификация/ Тиходеев О.Н., Гетманова Е.В., Тихомирова B.JL, Инге-Вечтомов СТ.II Молекулярные механизмы генетических процессов. М.: Наука, 1990.-С.218-228.

62. Сох B.S., Tuite M.F., McLaughlin C.S. The psi factor of yeast: a problem in inheritance// Yeast. 1988. - V.4, №3. - P.159 - 178.

63. Chernoff Y.O., Uptain S.M., Lindquist S.L. Analysis of prion factors in yeast// Enzymology. 2002. - V.351. - P.499 - 538.

64. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова B.M. Рецессивные супрессоры у дрожжей// Генетика. 1970. - Т.6. - С. 103 - 115.

65. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae/ Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telkov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G.// Gene. 1988. - V.66. -P.45 - 54.

66. Deletion analysis of the SUP35 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein/ Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V., Dagkesamanskaya A.R., Didichenko S.A.,

67. Chernoff Y.O., Inge-Vechtomov S.G., Smirnov V.N.// Mol. Microbiol. 1993. -V.7. - P.683 - 692.

68. Wickner R.B. URE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.// Science. 1994. - V.264. — P.532 — 535.

69. Maddelein M.L., Wickner R.B. Two prion-inducing regions of Ure2p are nonoverlapping// Mol. Cell Biol. 1999. - V.19. - P.4516 - 4524.

70. Mechanism of inactivation on prion conversion of the Saccharomyces cerevisiae Ure2 protein/ Baxa U., Speransky V., Steven A.C., Wickner R.B.// PNAS USA. V.99, №8. - P.5253 - 5260.

71. Sondheimer N., Lindquist S. Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast// Mol.Cell. 2000. - V.5. - P. 163 - 172.

72. Santoso A., Chein P., Oserovich L.Z., Weissman J.S. Molecular basis of a yeast prion species barrier// Cell. 2000. - V.100. - P.277 - 288.

73. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PSI(+). prion in Saccharomyces cerevisiae/ Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S. W.// Genetics. 1997. - V. 147. - P.507 - 519.

74. Prions affect the appearance of other prions: the story of PIN+./ Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W.// Cell. 2001. - V.106. -P.171 -182.

75. Interactions among prions and prion "strains" in yeast/ Bradley M.E., Edskes H.K., Hong J.Y., Wickner R.B., Liebman S.W.//PNAS USA. 2002. -V.99.-P.16392- 16399.

76. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog/ Coustou V., Deleu C., Saupe S., Begueret J.// PNAS USA. 1997. - V.94. - P.9773 - 9778.

77. Prions of Yeast and Fungi. Proteins as genetic material/ Wickner R.B., Edskes H.K., Maddelein M.-L., Taylor K.L., Moriyama H.// J. Biol. Chem. 1999. -V.274.-P.555 -558.

78. Edskes H.K., Gray V.T., Wickner R.B. The URE3. prion is an aggregated form of Ure2p that can be cured by overexpression of Ure2p fragments// PN AS USA. 1999. - V.96. - P. 1498 - 1503.

79. PSI . prion generation in yeast: characterization of the "strain" difference/ Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Valouev I.A., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D.//Yeast. 2001. - V. 18.-P. 489 - 497.

80. King C.-Y., Diaz-Avalos R. Protein-only transmission of three yeast prion strains// Nature. 2004. - V.428. - P.319 - 323.

81. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences/ Tanaka M., Chien P., Naber N., Cooke R., Weissman J.S.// Nature. 2004. - V.428. - P.323 - 328.

82. Molecular basis of a yeast prion species barrier/ Santoso A., Chein P., Osherovich L.Z., Weissman J.S.// Cell. 2000. - V.100. - P.277 - 288.

83. Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor psi+./ Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B.-I., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W.// Science. 1995. - V.268. - P.880 - 884.

84. Тер-Аванесян М.Д., Кушниров В.В. Прионы: инфекционные белки с генетическими свойствами// Биохимия. 1999. - Т.64, №12. - С.1382 - 1390.

85. Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast/ Wegrzyn R.D., Bapat K., Newnam G.P., Zink A.D., Chernoff Y.O.// Mol. Cell. Biol. 2001. -V.21.-P.4656- 4669.

86. Guanidine hydrochloride inhibits the generation of prion "seeds" but not prion protein aggregation in yeast/ Ness F., Ferreira P., Cox B.S., Tuite M.F.// Mol. Cell. Biol. 2002. - V.22, №15.- P.5593 - 5605.

87. The elimination of the yeast PSI+. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation/ Ferreira P.C., Ness F., Edwards S.R., Cox B.S., Tuite M.F.// Mol. Microbiol. 2001. - V.40. - P.1357 - 1369.

88. Glover J.R., Lindquist S. Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins// Cell. 1998. -V.94. - P.73 - 82.

89. Liebman S.W., Derkatch I. The yeast PSI+. prion: making sense of nonsense// J. Biol. Chem. 1999. - V.274, №3. - P. 1181 - 1184.

90. Cox B.S., Ness F., Tuite M.F. Analysis of the generation and segregation of propagons: entities that propagate the PSI+. prion in yeast// Genetics. 2003. - V. 165. - P.23 - 33.

91. Chaperones that cure yeast artifical PSI+. and their prion-specific effects/ Kushnirov V.V., Kryndushkin D.S., Boguta M., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D.// Curr. Biol. 2000. - V. 10. - P. 1443 - 1446.

92. Liebman S.W., Derkatch I.L. The yeast PSI+. prion: making sense of nonsense// J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - P. 1181 - 1184.

93. Schwimmer C., Masison D.C. Antagonistic interaction between yeast PSI+. and [URE3] prions and curing of [URE3] by Hsp70 protein chaperon Ssalp but not by Ssa2p// Mole. Cell. Biol. 2002. - V.22, №11.- P.3590 - 3598.

94. Edskes H.K., Wickner R.B. A protein required for prion generation: URE3. induction requires the Ras-regulated Mksl protein// PNAS USA. 2000. - V.97, №12. - P.6625 - 6629.

95. An antiprion effect of the anticytoskeletal drug latrunculin A in yeast/ Bailleul-Winslett P.A., Newnam G.P., Wegrzyn R.D., Chernoff Y.O.// Gene Expression. 2000. - V.9. - P. 145 - 156.

96. Prions affect the appearance of other prions. The story of PIN*./ Derkatch I.L., Bradley M.E., Hong J.Y., Liebman S.W.// Cell. 2001. - V.106. -P. 171 - 182.

97. Masison D., Wickner R.B. Prion-inducing domain of yeast Ure2p and protease resistance of Ure2p in prion-containing cells// Science V.273- P.93-95.

98. Landsbury P.T., Caughey Jr., Caughey B. The chemistry of scrapie infection: implications of the 'ice 9' metaphor//Chem. Biol. 1995. - V.2. -P.l -5.

99. Инге-Вечтомов С.Г. Возможная роль неоднозначности трансляции в эволюции// Мол. Биол. 2002. - Т.36, №2. - С.268 - 276.

100. True H.L., Lindquist S.L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity// Nature. 2000. - V.407. - P.477 -483.

101. True H.L., Berlin I., Lindquist S.L. Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits// Nature. -2004.-V.431.-P.184- 187.

102. The HET-s prion protein of the filamentous fungus Podospora anserina aggregates in vivo into amyloid-like fibrils/ Dos Reis S., Coulary-Salin В., Forge V., Lascu I., Begueret J., Saupe S.J.// J. Biol. Chem. 2002. - V.277. -P.5703 - 5706.

103. Методики по генетике дрожжей—сахаромицетов/ Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Л.: Наука, 1976. - 112 С.

104. Sherman F., Fink G.R., Hicks J.B. Laboratory course manual for methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. - 186 P.

105. Boeke J.D., Lacroute F., Fink G.R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance// Mol. Gen. Genet. 1984. - V.197. - P.345 - 346.

106. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. N.Y. Cold Spring Harbor Lab, 1989. - 479 P.

107. Dujon B. (1981) Mitochondrial genetics and functions. In: Strathern JM, Jones EW, Broach JR (eds) Molecular biology of the yeast Saccharomyces. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. P.505 - 635.

108. Zakharov I.A., Yarovoy P.P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast// Mol. Cell Biochem. 1977. - V.14- P. 15 - 18.

109. Dagert M., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells // Gene. 1979. - V.6. -P.23 - 29.

110. Isolation of yeast histone genes H2A and Н2В/ Hereford L., Fahrner K., Woolford J., Jr. etal.//Cell. 1979.-V. 18.-P. 1261 - 1271.

111. Gebeyehu G., Rao P.Y., Chan P.S. Novel biotinylated nucleotide-analogs for labeling and colorimetric detection of DNA//Nucl. Acids Res. 1987. - V.15, № 11.-P.4513-4534.

112. Закс JI. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1972.598 С.

113. Chernoff Y.O. Mutation processes at the protein level: is Lamarck back?// Mutat. Res. 2001. - V.488. - P.39 - 64.

114. Dependence and independence of PSI+. and [PINT]: a two-prion system in yeast?/ Derkatch I.L., Bradley M.E., Masse S.V.L., Zadorsky S.P.,

115. Polozkov G.V, Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W.// EMBO J. 2000. - V.19. -P.1942- 1952.

116. Инге-Вечтомов С.Г. Матричный принцип в биологии (прошлое, настоящее, будущее ?)// Экологическая генетика. 2004. - T.l. - С.6 - 15.

117. Baluska F., Volkmann D., Barlow D.W. Eukaryotic cells and their cell bodies: cell theory revised// Ann. Bot. 2004. - V.94. - P.9 - 32.

118. Baluska F., Volkmann D., Barlow D.W. Cell bodies in a cage// Nature. 2004. - V.428. - P.371.