Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Центрального Черноземья России

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Центрального Черноземья России"

На правах рукописи

Мутных Елена Сергеевна

Особенности природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Центрального Черноземья России

03.02.02- вирусология

11 ДЕК 2013

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

005543886

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

кандидат медицинских наук

Дзагурова Тамара Казбековна Бернштейн Алла Давыдовна

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент,

Федеральное государственное бюджетное Карганова

учреждение «Институт полиомиелита и Галина Григорьевна

вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» РАМН, заведующая лабораторией

доктор медицинских наук, профессор, Дерябин

Федеральное государственное бюджетное Петр Григорьевич

учреждение «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, заместитель директора

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера"

Защита состоится 27 декабря 2013 года в Ючасов на заседании Диссертационного совета Д 001.026.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН по адресу 142782, Москва, поселение Московский, посёлок Институт полиомиелита, 27 км Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан «,2(> » ноября2013 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук

В.Н. Ляпустин

Общая характеристика работы Актуальность исследования. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) представляет собой одну из наиболее распространенных среди населения России природно-очаговых болезней с прогрессирующей динамикой заболеваемости. По данным Роспотребнадзора РФ за период с 2000 по 2012 гг. было зарегистрировано 92 394 случая ГЛПС на территориях 58 из 83 субъектов Российской Федерации (в среднем, 5,2 случая на 100 тыс. населения). Более 98% случаев заражения ГЛПС зарегистрировано в 46 из 58 административных субъектов Европейской части России, главным образом, в очагах, приуроченных к лесным ландшафтам [Ткаченко и др., 2011].

Хантавирусы - возбудители ГЛПС передаются респираторным путем, а источником заражения людей служат мышевидные грызуны, выделяющие вирус с экскретами (слюна, моча, кал) во внешнюю среду.

Полученные в последние десятилетия данные существенно изменили сложившиеся представления об этиологической природе заболеваний ГЛПС на территории Европейской части России, где ранее все случаи этой инфекции связывали только с вирусом Пуумала, основным резервуаром которого в природе является европейская рыжая полевка, Муойех glareolus. В конце прошлого века были выявлены природные очаги циркуляции ранее не известных в России высоко патогенных для человека вирусов-возбудителей ГЛПС, относящихся к двум иммунологически и генетически отличающимся подтипам хантавируса Добрава/Белград (далее Добрава) [Ткаченко и др., 2011; Ткаченко и Дзагурова, 2011]. В очагах лесостепной зоны Центрального региона РФ, в том числе Центрального Черноземья, выявлен подтип Добрава-Аа (ДОБ-Аа), основной (резервуарный) хозяин которого западный подвид полевой мыши, Арос1етих agrarшs а^гапш, а в Причерноморье - подтип вируса Добрава (ДОБ-Ар), ассоциированный с кавказской лесной мышью, Ароёетияропйст [К1етра гЛ а1., 2008].

К настоящему времени доказана этиологическая роль пяти видов хантавирусов в структуре заболеваемости ГЛПС в России: Хантаан, Сеул и Амур - в регионах Дальнего Востока, а также Пуумала и Добрава в регионах Европейской части. То есть, сложилась такая ситуация, когда под одним названием «ГЛПС» регистрируются, по крайней мере, пять этиологически самостоятельных хантавирусных инфекций. Вопрос о реальном количестве существующих в природе хантавирусов остается открытым, как и вопрос об эпидемиологической опасности еще не выявленных к настоящему времени гено-и серотипов, их природных резервуарах и носителях. Становится всё более очевидной зависимость клинических и эпидемиологических проявлений этих

инфекций от их этиологической обусловленности, выражающейся в принадлежности возбудителя к определённому хантавирусному генотипу или подтипу, каждый из которых имеет своего резервуарного хозяина, поддерживающего природные очаги ГЛПС [Ткаченко и др., 2011; Ткаченко, Дзагурова, 2011].

В связи с выше изложенным, проблема заболеваемости ГЛПС, вызываемой разными хантавирусами, приобретает особое значение для здравоохранения в плане проведения эффективной диагностики, лечения и профилактики ГЛПС. Особенно обостряется эта проблема на тех очаговых территориях, где циркулируют одновременно два патогенных для человека хантавируса, как это имеет место в Центральном Черноземье.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение этиологических, эпидемиологических и эпизоотологических особенностей природных очагов ГЛПС на территории Центрального Черноземья России (на примере Тамбовской области, типичной для этого региона), а также совершенствование существующей системы мониторинга этой инфекции.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести серологическое исследование сывороток крови больных ГЛПС с целью выявления хантавирусных серотипов, играющих этиологическую роль в структуре заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области.

2. Изучить структуру заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области за период с 2006 по 2012 годы.

3. Определить напряжённость и структуру естественного иммунитета населения по отношению к хантавирусам и оценить качество клинической диагностики ГЛПС.

4. Выделить и идентифицировать штаммы хантавирусов - возбудителей ГЛПС в Тамбовской области.

5. Определить видовой состав мелких млекопитающих - природных резервуаров и носителей хантавирусов, являющихся источником заражения людей ГЛПС.

6. Дифференцировать природные очаги ГЛПС на основе эпидемиологических, эпидемиологических и эпизоотической показателей.

7. Выявить связь между эпидемической и эпизоотической активностью очагов, где циркулируют вирусы Добрава и Пуумала.

Научная новизна

В результате комплексных исследований на ранее мало изученной очаговой территории Центрального Черноземья получены новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок у нас в стране и за рубежом:

1. Впервые выявлены сочетанные природные очаги циркуляции двух высоко патогенных для человека хантавирусов Пуумала и Добрава на территории Тамбовской области, в ландшафтном и социальном отношении типичной для Центрального Черноземья России.

2. Впервые изолированы в культуре клеток вирусные штаммы от полевых мышей, идентифицированные как генотип Куркино вируса Добрава (Доб-Аа).

3. Установлены различия эпидемиологического процесса при заболевании людей ГЛПС, вызываемой вирусами Пуумала и Добрава (условия заражения, сезонность заболевания, социальное положение больных).

4. Впервые доказана доминирующая роль вируса Добрава в этиологической структуре заболеваемости ГЛПС среди жителей Тамбовской области в период эпидемиологических вспышек с преобладанием заболеваний лёгкой и средней тяжести, а также наличие субклинических форм инфекции.

5. Для вирусов Добрава и Пуумала установлена эпидемиологическая значимость полевой мыши, А.а^апш и рыжей полёвки М^1агео1и.ч как резервуарных хозяев и источников заражения людей.

6. Впервые охарактеризованы ранее неизвестные региональные особенности сезонной динамики ГЛПС, вызванной вирусом Добрава. Выявлена ограниченность сезона вспышечной заболеваемости холодным временем года и корреляция зимних подъёмов с активностью эпизоотического процесса в популяциях полевой мыши - природного резервуара вируса Добрава.

Практическая значимость работы

Данные о характере эпидемического проявления ГЛПС в сочетанных природных очагах циркуляции хантавирусов Добрава и Пуумала и эпизоотического процесса в популяциях полевой мыши и рыжей полёвки -носителей этих вирусов - могут служить основой при планировании проведения профилактических мероприятий и прогнозировании эпидемической ситуации хантавирусных инфекций, вызываемых этими вирусами. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволяют установить истинные размеры заболеваемости в регионе, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции, выявить лёгкие и клинически стертые формы, о которых

ранее сведений не имелось. Анализ данных по изучению иммунной структуры населения по отношению к хантавирусам позволяет выделить группы повышенного риска заболевания ГЛПС, что является основой формирования контингентов лиц, подлежащих профилактической вакцинации, и определяет рациональный порядок её проведения.

Результаты исследований нашли отражение в различных документах организационно-методического характера по борьбе с ГЛПС как на региональном, так и федеральном уровнях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На территории Тамбовской области, типичной для Центрального Черноземья, циркулируют высоко патогенные для человека хантавирусы Добрава и Пуумала, и существуют сочетанные очаги этих вирусов.

2. Этиологическая структура заболеваемости в 2006-2012 гг. была неоднородна в разные эпидсезоны; вирус Добрава играл доминирующую роль в период эпидемической вспышки ГЛПС с преобладанием заболеваний лёгкой и средней тяжести.

3. Из 12 видов мелких млекопитающих, обитающих на очаговой по ГЛПС территории, эпидемиологическое значение имеют лишь полевая мышь А.а^апш и рыжая полевка М^1агео1из - резервуарные хозяева вирусов Добрава и Пуумала, соответственно, и источники заражения людей.

4. Штаммы вируса Добрава, выделенные из легких полевых мышей, отловленных в Тамбовской области, относятся к подтипу ДОБ-Аа (Куркино), циркулирующему в лесостепной зоне Европейской части России.

5. Заболеваемость ГЛПС, ассоциированная с вирусами Добрава (ГЛПС-ДОБ) и Пуумала (ГЛПС-ПУУ) на территории Тамбовской области имеет различную многолетнюю и сезонную динамику, а именно, ГЛПС-ДОБ характеризуется высокой интенсивностью эпидемического процесса в период редких вспышек, с максимумом в зимние месяцы и крайне низкой заболеваемостью в межэпидемический период. Напротив, ГЛПС-ПУУ проявляется в виде спорадических случаев во все сезоны без резких подъемов по годам.

6. Заражение людей вирусом Добрава происходит от полевых мышей, в основном, сельских жителей в процессе ухода за животными, заготовки кормов и прочих сельскохозяйственных работ. Заражение вирусом Пуумала происходит от рыжих полевок, в основном, среди городского населения при посещении леса, во время работы и проживания на садово-дачных участках, на охоте и рыбалке.

7. Различия в эпидемическом проявлении ГЛПС-ДОБ и ГЛПС-ПУУ напрямую связаны с динамикой численности и биотопической приуроченностью

резервуарных хозяев каждого из этих вирусов и эпизоотической активностью природных очагов.

8. Уровень естественного иммунитета населения, специфической лабораторной диагностики и регистрируемая заболеваемость ГЛПС указывает на низкое качество клинической диагностики ГЛПС в Тамбовской области.

Внедрение результатов исследования

Основные результаты исследования внедрены и используются в работе Центра МЗ РФ и РАМН по борьбе с ГЛПС, г. Москва; Референс-центра Роспотребнадзора по мониторингу ГЛПС, г. Москва; ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тамбовской области» г. Тамбов, Управление Роспотребнадзора по Тамбовской области, г. Тамбов.

Апробация материалов диссертации

Материалы исследования доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях по геморрагической лихорадке с почечным синдромом (г. Воронеж, 2010, г. Тамбов, 2008 и 2011, гг. Сочи, 2009); Веер, научн-практ. конференции «Вакцинология, Москва, 9-10 ноября 2010; VIII Intern. Conf. on HFRS, HPS and Hantaviruses. Athens, Greece, 2010; IX Intern. Conf. on HFRS, HPS and Hantaviruses. Beijing, China, 2013; научн-практ. конференции «Молекулярная диагностика», 2010; 21st Annual GfV Meeting, Berlin, Germany, 2011; Всеросийской научно-практическая конференции с международным участием "Современные аспекты природной очаговости болезней", Омск, ноябрь 2011; X съезде Всероссийского общества Эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 12-13 апреля 2012 г.

Публикации

По результатам выполненных исследований опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 128 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 63 отечественных 53 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 33 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Материалы собраны в сотрудничестве с Управлением Роспотребнадзора по Тамбовской области, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тамбовской области». Объем исследованных материалов представлен в Таблице 1.

Таблица 1. Материалы исследований

Группы Объект исследования Количество определений

Больные ГЛПС и лица с диагнозом, не исключающим ГЛПС Сыворотки крови 215

"Здоровое" население Сыворотки крови 4500

Мелкие млекопитающие Органы, кровь 4619

Клетки. Перевиваемая линия клеток почек зелёной мартышки VERO-E6 (АТСС CRL-13001); среда роста — 2МЕМ с 5% телячьей сыворотки; после заражения вирусом применяли ту же среду без сыворотки.

Вирусы. При типировании вновь выделенных штаммов в реакции нейтрализации использованы штаммы вирусов Пуумала (CG-1820/Уфа-83), Хантаан (76-118), Сеул (80-39) и Добрава (Belgrade -1, Аа 4053/Тула-02, Аа1856/Липецк-02, Ар 1586/Сочи-01).

Сыворотки. Для типирования штаммов использовали сыворотки реконвалесцентов ГЛПС из Липецкой, Тамбовской областей и из Причерноморья, а также экспериментальные сыворотки крови кроликов, иммунизированных вирусами Пуумала, Хантаан, Сеул и Добрава.

Непрямой метод иммунофлюоресценции (МФА). Диагностику ГЛПС, а также определение популяционного иммунитета, осуществляли с помощью «Диагностикума ГЛПС культурного, поливалентного для непрямого метода иммунофлуоресценции»производства ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН, по инструкции производителя. Антитела в настоях сердец грызунов определяли также с использованием поливалентных антигенов «Диагностикума ГЛПС», применяя анти-мышиные люминесцирующие антитела производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Типирование антител проводили с использованием моновалентных культуральных антигенах вирусов Пуумала, Добрава, Сеул и Хантаан и соответствующих антивидовых люминесцирующих антител.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения антигенов хантавирусов в органах мелких млекопитающих. Использовали тест-систему "Хантагност" производства ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова согласно инструкции производителя.

Критерием инфицированное™ грызунов хантавирусами служило

8

выявление у них вирусного антигена и/или специфических антител.

Метод выявления фокусобразующих единиц (ФОЕ) в культуре клетокосуществляли в соответствии с ранее описанным (Дзагурова и др., 2008), согласно которому монослой клеток УЕШЭ-Еб, выращенных в 24-луночных панелях, заражали 10-кратными разведениями вируса. После контакта с клетками при 37 °С в течение 1часа вносили 0,4 - 0,6 % метилцеллюлозное покрытие. После инкубации при 37 °С в течение 6-7 дней полужидкое покрытие удаляли и монослой фиксировали абсолютным спиртом. Инфекционные фокусы выявляли методом твердофазного ИФА. На фиксированный монослой вносили специфические анти-хантавирусные антитела и инкубировали 1 час при 37 °С. Далее лунки промывали и вносили меченный пероксидазой хрена белок "А". После контакта (1 час 37 °С) и отмывки вносили индикаторную систему (0,05% диаминобензидина тетрахлорида, 0,02% МС12 и 0,01% Н202). Количество инфицированных колоний клеток (ФОЕ) в виде темно-коричневых или темно-серых пятен определяли визуально. Титр вируса выражали в виде ^ ФОЕ в 1 мл вносимого для инфицирования клеток образца.

Реакция нейтрализации (РН). Нейтрализующие антитела по отношению к вирусам Пуумала, Хантаан, Сеул и Добрава определяли в РН по редукции числа ФОЕ в культуре клеток УЕЯО-Еб [Дзагурова и др., 2008]. Сыворотки в 4-х кратных разведениях смешивали с 50-100 ФОЕ вируса и инкубировали 1 час при 37 °С. Выживший вирус определяли методом ФОЕ. Титр вируснейтрализующих антител определяли по 80% подавлению числа ФОЕ.

Изоляцию штаммов хантавирусов проводили в соответствии с ранее описанной методикой [ТкасИепко аи а1., 1984], в соответствии с которой на монослой клеток УЕЯО-Еб вносили инокулят, содержащий, по результатам ИФА, хантавирусный антиген. В качестве инокулята использовали 10% суспензию легочной ткани грызунов. Пересев клеток проводили через 12-14 дней после инфицирования. Начиная со 2-го пассажа, контролировали размножение вируса по выявлению специфического антигена в клетках методом МФА. Часть инфицированных клеток каждого пассажа хранили при -60±5 °С до окончания эксперимента, продолжительность которого ограничивалась 5-6 пассажами.

Эпидемиологические исследованиязаболеваемости ГЛПС в Тамбовской области в 2006-2012 гг. проводились по картам эпидемиологического обследования с использованием стандартных методик. Анализ эпидемиологических характеристик проводили по эпидсезонам (май-апрель следующего года).

Эпизоотологические методы исследования

Учеты численности и отлов мелких млекопитающих для эпизоотологического исследования проводили совместно с сотрудниками зоологического отделения ФБУЗ «ЦГиЭ в Тамбовской области». Отлов мелких млекопитающих осуществляли методом ловушко-линий при помощи давилок Геро, по стандартной методике, не менее 200 ловушко-суток (л-с) в каждый тур учета, всего выполнено 48 ООО л-с. Определяли генеративное состояние и возраст грызунов [Карасева и др., 2008]. Показатель численности рассчитывали, исходя из количества особей на 100 л-с.

Статистические методы

Сведения о численности анализируемых групп были получены в Тамбовском областном комитете государственной статистики «Тамбовская область в цифрах» за 2006-2011 гг.. При статистическом анализе материалов оценивались: средне-арифметические показатели, погрещности средних величин, достоверность различий между величинами оценивалась с помощью точного критерия Фишера. Статистические расчеты с помощью программы Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

1. Нозоареал и структура заболеваемости ГЛПС

С 1985 г. до зимней вспышки ГЛПС в 2006-2007 гг. на территории Тамбовской области было зарегистрировано всего 6 случаев ГЛПС, этиологически связанных с хантавирусом Пуумала. Анализ заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области позволил выделить вспышечные (эпидемические) (20062007 гг., с повышенной заболеваемостью (2011-2012 гг.) и условно межэпидемический (2008-2010 гг.) периоды. Эпидемические период характеризовался резким подъёмом заболеваемости: за период зимней вспышки 2006-2007 гг. был зарегистрирован 91 случай ГЛПС, а в эпидсезон 2011-2012 гг. 23 случая. Относительный показатель суммарной заболеваемости двух эпидемических периодов составлял 10,4 на 100 тыс. населения. В межэпидемический период наблюдалась спорадическая заболеваемость с небольшими подъемами в 2008-09 и 2011-12 эпидсезоны.

За период 2006-2012 гг. на территории области было зарегистрировано 134 лабораторно подтвержденых случая заболевания ГЛПС в 17 из 23 административных районах и 5 городах областного подчинения (Тамбов, Котовск, Мичуринск, Рассказово, Уварово). Более половины всех случаев ГЛПС (57,5%) было зарегистрированы на территории 3 сельских районов - Тамбовском, Бондарском, Мичуринском (28, 17 и 13%, соответственно). Показатели заболеваемости ГЛПС по районам области варьировали от 3 до 175,6 на 100 тыс.

населения (рис. 1). Часто такой разброс зависел от качества клинической диагностики.

Сравнительный анализ показателей заболеваемости ГЛПС во время вспышки позволил провести градацию территории области по уровням заболеваемости (рис.1). Высокий уровень заболеваемости наблюдался в 4 районах (больше 10 на 100 тыс. населения), в 8 - средний (от 10 до 30), в 5 - низкий (меньше 10). В 6 районах случаи ГЛПС не выявлены. Однако, нельзя исключить возможность заболевания жителей этих районов, поскольку на их территориях выявлены инфицированные грызуны, то есть, установлены природные очаги циркуляции хантавирусов-возбудителей ГЛПС и серопозитивные по отношению к хантавирусам лица среди «здорового» населения, что говорит о возможно клинически недиагностированных случаях заболевания (см. разделы 2,3). Территориями высокого уровня заболеваемости заболеваемости ГЛПС являются Тамбовский, Бондарский, Мичуринский и Пичаевский районы, где проживают около 50 % всего населения области.

\ Низкий уровень : Случаи ГЛПС не выявлены

Рис. 1. Градация по уровню заболеваемости ГЛПС и выявленные природные очаги хантавирусной инфекции в Тамбовской области

Следует отметить, что все 134 случая заболевания ГЛПС на территории Тамбовской области подтверждены серологически.

Из 134 случаев заболеваний 96 (71,6%) случаев ГЛПС были связаны с хантавирусом Добрава и 38 (28,4%)- с Пуумала.

Показатель заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области за период с 2006 по 2012 годы среди жителей сельских районов области составил на 100 тысяч населения 22,8 и был достоверно выше такового среди городских жителей - 4,8 (р<0,05). Соотношение сельских и городских жителей среди больных ГЛПС-ДОБ, достоверно отличалось 90,6 и 9,4% (р<0,05), соответственно, а ГЛПС-ПУУ -44,7 и 55,3%, соответственно.

Сезонная динамика заболеваемости ГЛПС характеризовалась постепенным нарастанием заболеваемости с ноября по март месяц. 51 % от всех больных было зарегистрировано за период с декабря по февраль. С марта отмечено снижение числа случаев до минимального уровня в летние месяцы (по 1 случаю). Заболеваемость, вызванная вирусом Добрава, имела вспышечный характер, на которую пришлось 97% больных ГЛПС. Случаи были зарегистрированы в промежутке между ноябрём и апрелем с наивысшим подъёмом заболеваемости в январе - феврале (79%). Напротив, заболеваемость ГЛПС, вызванная вирусом Пуумала, носила спорадический характер в виде отдельных случаев на протяжении всего года.

Возрастная структура заболеваемости ГЛПС представлена на рис. 2. В сельской местности наибольшие показатели заболеваемости приходится на возрастную группу 30-49 лет (43%). Заболеваемость сельского населения трудоспособного возраста 20-49 лет достоверное превышала уровень заболеваемости лиц аналогичной группы, проживающих в городах, в 3 раза (р<0,05).

Рис. 2. Возрастная структура заболеваемости ГЛПС среди городского и сельского населения Тамбовской области

Заболеваемость ГЛПС среди мужчин была достоверно выше, чем у женщин -76% и 24%, соответственно (р<0,05). Показатели заболеваемости ГЛПС

всего 15-19 л. 20-29 л. 30-39 л. 40-49 л. 50-59 л. детей ш городское СеЛЬСКОе

60 и старше

у мужчин в сельской местности были в 2 раза выше заболеваемости женщин и в 4 раза выше показателей заболеваемости мужчин в городах.

Среди работающих сельских жителей на долю работников сельского хозяйства приходилось 18,3% больных, служащие и инженерно-технические работники (ИТР) составляли 28,8%, учащиеся - 11,5%. В городах структуру больных в основном формировали служащие и ИТР (63,3%), а также учащиеся (6,7%). Среди неработающей группы населения, как в сельской местности, так и в городах, было установлено, что основную долю заболевших, составляли официально неработающие лица трудоспособного возраста (41,3 % и 26,7%, соответственно). Видимо, это связано с тем, что они работают неофициально у частных лиц (фермеров, перевозчиков и т.п.), часто сезонно, либо работают на своем хозяйстве.

Установлено, что условия заражения вирусами Пуумала и Добрава отличаются. Число городских жителей среди больных ГЛПС-ПУУ, достоверно превышало число сельских (р<0,05) и составило 84% (от общего числа больных ассоциированных с вирусом Пуумала), напротив, среди больных ГЛПС-ДОБ подавляющее большинство составили сельские жители (более 70% от числа ассоциированных с вирусом Добрава).

Анализ данных заражения больных ГЛПС в зависимости от вида хантавируса представлен на рис. 3. Вирусом Пуумала заражались во время посещения леса, проживания на дачах, садово-огородных участках, а вирусом Добрава, в основном, при уходе за скотом и других сельскохозяйственных работах, как в производственных условиях, так и по месту жительства. Наиболее значимыми видами деятельности, ассоциированными с риском заражения ГЛПС-ДОБ, являются разборка стогов, перевозка сена, соломы, фуража, приготовление и раздача кормов и т.п.

Ведущее место в структуре условий заражений занимает ГЛПС-ДОБ. Это подтверждает установленный факт того, что заболеваемость ГЛПС на территории области смещена в сторону сельского населения трудоспособного возраста.

прочие виды сельхоз. работ ---15,3. ПУУ ®ДОБ

уход за скотом садово-огородные _______„Л 10.5

131,6

участки, дачи

посещение леса »3,1 дашш 152,6

Рис.3. Место заражения больных ГЛПС в зависимости от вида хантавируса

Широкий диапазон клинических симптомов при ГЛПС затрудняет дифференциальную диагностику ГЛПС от других, сходных по симптоматике заболеваний, что нередко приводит к ошибкам при постановке клинического диагноза. В связи с этим, для установления этиологии заболевания и подтверждения клинического диагноза ГЛПС необходимы лабораторные исследования крови больного.

Всего за период изучения было исследовано 215 сывороток крови от лихорадящих больных и больных со сходной с ГЛПС симптоматикой, поступавших в стационары области, из них положительными оказались 134 образца. Первичный клинический диагноз ГЛПС или «ГЛПС ?» был выставлен только в 21% случаев (28 больных). Остальные 106 больных ГЛПС проходили с другими диагнозами. Несовпадения специфического лабораторного и предварительного клинического диагнозов были связаны, в основном, с ошибками клинической диагностики.

Пациенты обращались за врачебной помощью позже 5-го дня от начала заболевания, что было вызвано недостаточной информированностью населения об опасности заражения и основных симптомах данной инфекции. После обращения в лечебное учреждение значительных задержек с госпитализацией в стационар не было. В то же время при первичном обращении диагноз ГЛПС был выставлен только у незначительного количества больных, и большинство пациентов было госпитализировано (нередко не в инфекционные больницы) с другими диагнозами. Установление окончательного диагноза ГЛПС оказывалось возможным лишь после проведения специфической серодиагностики, то есть после получения положительных результатов исследования сыворотки крови на присутствие антител к хантавирусу-возбудителю ГЛПС.

Перечень первичных клинических диагнозов у больных с установленным серологическим диагнозом ГЛПС отличался разнообразием нозологических форм: 32% составляли нефрологические заболевания (острый и хронический пиелонефриты, гломерулонефрит, почечная колика, токсическая нефропатия); 23% - респираторные заболевания (ОРЗ, ОРВИ, грипп, пневмония, бронхит, ларингит); 7% - заболевания, ассоциированные с абдоминальной патологией (холецистит, панкреатит, ОКИ, энтероколит, острый гастроэнтерит, язва 12-ти перстной кишки); 1% - гинекологические заболевания (кровотечение), лихорадка неясного генеза - 8%. Прочие диагнозы (менингит, артрит, ишемическая болезнь, токсическое действие неизвестного свойства) составляли 8%. Существенных различий клинических форм течения болезни у больных ГЛПС, этиологически обусловленной вирусами Пуумала и Добрава, не было выявлено.

2. Иммунная прослойка населения Тамбовской области по отношению к хантавирусам

В период 2011-2013 гг. с помощью МФА было исследовано 4500 сывороток крови людей, проживающих во всех 23 районах Тамбовской области.

Серопозитивные лица к хантавирусам выявлены в 21 районе области из 23.

Установлено, что в среднем процент серопозитивных лиц к хантавирусу среди «здорового» населения, составлял 4,3%. Частота выявления лиц сероположительных к хантавирусам в различных районах области варьировала от 1 до 13%. Уровень иммунной прослойки населения к хантавирусам на территории области неоднороден. Анализ территориального распределения сероположительных лиц к хантавирусам по их интенсивности позволил провести градацию территории области по трем степеням эпидемической напряжённости и риском заражения ГЛПС, относительно областного показателя: административные территории с низкой (выявление антител в 1-4%) иммунной прослойкой населения 10 из 23 районов (Бондарский, Гавриловский, Знаменский, Кирсановский, Мичуринский, Мордовский, Сампурский, Староюрьевский), средней (выявление антител в 5-8%) иммунной прослойкой населения в 7 из 23 районов (Петровский, Пичаевский, Первомайский, Рассказовский, Ржаксенский, Уметский, Мучкапский) и высокой (выявление антител в 9-12%) иммунной прослойкой населения в 4 из 23 районов (Гавриловский, Сосновский, Моршанский, Инжавинский).

Серопозитивные лица были выявлены не только на территориях районов, где регистрировались манифестные формы заболевания ГЛПС, но и на территориях районов, где по данным официальной статистики случаи ГЛПС не были зарегистрированы. Положительные находки не были обнаружены на территориях 2-х районов (Жердевский, Токаревский), что можно объяснить небольшим количеством обследованного материала.

При серотипировании в МФА специфические антитела к хантавирусу Добрава были выявлены у 84,7% серопозитивных лиц, а к хантавирусу Пуумала — у 15,3%. При этом, у сельских жителей антитела выявляли достоверно чаще, чем в городах - 84,5 и 15,5, соответственно (р<0,05). Это подтверждает факт более интенсивного распространения эпидемического процесса при ГЛПС в сельской местности. Структура сероположительных лиц среди иммунной прослойки населения выглядела следующим образом: 20-39 лет не превышала 10%, 40-49 лет - 35%, 50 лет и старше - 49%. Среди сельского населения структуру сероположительных определяли лица 20-29 лет (6,7%), 40-49 лет (43,8%), 60 лет и старше (50,5%). Доля мужчин, серопозитивных к хантавирусам в возрасте

старше 40 лет, была достоверно выше, чем доля женщин того же возраста. В городах иммуноструктуру серопозитивных к хантавирусам сформировали лица обоих полов, около 50% приходилось на группу 30-39 лет. Группу 20-29 лет формировали мужчины - 40%. Сероположительные лица подросткового возраста, как среди сельских, так и городских жителей не было выявлено. Анализ профессиональной занятости показал, что 44,8% серопозитивных лиц являются официально работающими в различных сферах трудовой деятельности, среди которых 39,8% проживают в сельской местности.

Результаты исследования сывороток крови «здорового» населения свидетельствуют о наличии сочетанных очагов инфекции, где циркулируют хантавирусы Добрава и Пуумала, и принадлежности таких территорий к эпидемиологически опасным по риску инфицирования населения двумя видами хантавирусов. Факт выявления антител среди «здорового» населения в районах, где не регистрировали случаи заболевания ГЛПС, обусловлен как наличием атипичных и бессимптомных форм инфекции, так и низким уровнем диагностики, компетенцией местных врачей, допускающих ошибки при выставлении клинического диагноза, особенно в ситуациях с новой для них инфекцией.

3. Циркуляция хантавирусов в природных очагах ГЛПС

Многочисленные эпидемиологические наблюдения, серологические, вирусологические и молекулярные исследования показали, что каждый генотип или геновариант хантавируса имеет лишь одного резервуарного хозяина (вид или подвид), способного поддерживать очаги. Невозможность его замены в этом качестве другими теплокровными животными определяет видоспецифичность данной инфекции. Показано, что характерные черты очагов хантавирусов определяются биологией их основных хозяев [Бернштейн и др., 2010]. В связи с этим особенно важным оказывается мониторинг численности, инфицированности и стациального (биотопического) распределения видов, которые служат резервуаром хантавирусной инфекции.

В результате зоологических и эпизоотологических исследований, проводимых в 2006 - 2012 гг. на территории Тамбовской области, было отловлено 4649 мелких млекопитающих 12 видов, из которых 4107 составили фоновые виды: лесная мышь, полевая мышь, рыжая полевка и обыкновенная полевка (в среднем 41%, 23%, 16% и 8% среди отловленных, соответственно). По годам численность и соотношение данных видов относительно друг друга были не одинаковы, что, видимо, зависит от изменяющихся условий обитания каждого вида.

1873 зверьков из числа фоновых видов принадлежали к видам-резервуарам патогенных для человека хантавирусов Добрава и Пуумала (полевая

мышь и рыжая полевка). При этом рыжую полевку встречали во все сезоны преимущественно в лесах и в меньшей степени лесополосах и садовых участках. Полевая мышь в теплое время года живет в полях, брошенных садах, по балкам ручьев, бурьянах, а с осени часто заселяет стога, омёты и надворные постройки. Остальные виды встречаются заметно реже, хотя и составляют специфику ландшафтов.

Рис.4. Динамика численности грызунов-резервуарных хозяев хантавирусовДобрава и Пуумала (средние показатели по эгшдсезонам по всем стациям)

Анализ динамики численности полевой мыши показал, что за максимумом ее численности в период вспышки ГЛПС, обусловленной вирусом Добрава (ГЛПС-ДОБ), последовал резкий спад с последующим постепенным восстановлением. Численность рыжей полевки держалась в основном на низком уровне с небольшими подъемами в 2008-2009 и 2011-2012 гг. (Рис.8).

В результате эпизоотологических исследований было обследовано на инфицированность хантавирусами 3122 особи мелких млекопитающих 12 видов. Наличие хантавирусных антител установлено у 7 видов и только у 4 из них выявлен хантавирусный антиген в легких. (Табл.2).

Таблица 2

Инфицированность мелких млекопитающих фоновых видов и доля каждого из них среди обследованных особей и среди активных вирусоносителей

К-во (абс.) % особей с антиге ном % особей Доля, %

Виды обследо ванных с антите лами среди обслед. среди особей с антигеном среди особей с антителами

Полевая мышь 603 8,6 23,5 22,5 71,2 44,4

Рыжая полевка 514 1,4 6,8 19,2 9,7 10,9

Обыкн. полевка 203 4,4 8,9 7,6 12,5 5,6

Лесная мышь 1405 0,3 8,9 52,5 5,6 39,1

Итого 2677 2,7 12,0 100,0 100,0 100,0

Наблюдения за очагами позволили выделить 3 типа эпидсезонов с разным уровнем заболеваемости, связанной с геновариантом ДОБ-Аа вируса Добрава и

17

вирусом Пуумала, отличающиеся соотношением видов в населении грызунов, их численностью и инфицированностью хантавирусами. Вспышка ГЛПС, обусловленая вирусом Добрава в 2006-07 гг. (ГЛПС-ДОБ) - I тип, среди населения грызунов проходила на фоне повышеной численности, которая преобладала полевая мышь, причём среди инфицированных особей с антигеном в лёгких (активных вирусоносителей) - 85%. Ее инфицированность в разгар эпизоотии (январь-апрель 2007 г.) была почти поголовной (79 особей с антителами из 84 обследованных), при этом доля активных вирусоносителей достигала 35%, а их численность была 10 на 100 л-с. Среди носителей вируса ДОБ-Аа доля этого вида превышала 92% (63 из 68 серотипированных).

198

/

\

1524

\|

\ /

44

;;

955

13

В

90 80 70

о 60

а

я 50 §•0 40 о Е зо g 20 х 10

¡¡¡¡полевая мышь | рыжая полевка! (лесная мышь |_)обыкновенная полевка

■ДОБ

п nw

30

10 ц _

i и 1 2

2006-07

2008-09; 2011-12

2007-08; 2009-10; 2010-11

III

эпидсезоны

Рисунок 5. Соотношение фоновых видов грызунов: среди обследованных (А), средиантигеноносителей (Б) и число случаев заболевания ГЛПС-ДОБ и ГЛПС-ПУУ при разной эпизоотической ситуации (В). I, II, III - типы эпидсезонов (см. текст)

Таким образом, были получены данные подтверждающие ведущую роль полевой мыши в поддержании очагов ГЛПС-ДОБ и как источника заражения людей этим вирусом на эндемичной территории.

В эпидсезоны 2008-09 и 2011-12 гг. (II тип) наблюдался рост численности рыжей полёвки, что отражалось в повышении её доли как в населении грызунов, и среди инфицированных особей. Соответственно, увеличивалось число случаев ГЛПС, ассоциированных с вирусом Пуумала (ГЛПС-ПУУ). Однако, процент рыжих полёвок с антигеном в лёгких и в эти годы был невелик (в среднем 1,1%), а численность активных вирусоносителей не превышала 3 особей (в среднем 0,4%) на 100 л-с. Поэтому больших вспышек ГЛПС, вызываемых вирусом Пуумала, которые характерны для оптимума ареала рыжей полёвки, здесь не отмечено.

Численность полевой мыши в эти годы и её инфицированность были сравнительно невелики и заметных показателей достигали лишь в отдельных точках. Поэтому случаи ГЛПС-ДОБ, встречались ещё реже, чем ГЛПС-ПУУ.

В остальные эпидсезоны (2007-08; 2009-10 и 2010-2011 гг. - III тип) заболеваемость людей практически отсутствовала (2 случая ГЛПС-ПУУ и 1 случай ДОБ-ГЛПС отмечены лишь в 2007-08 гг.). Основные хозяева вирусов ДОБ-Аа и Пуумала были очень малочисленны и среди грызунов преобладала лесная мышь. Ее численность в эти периоды выросла в среднем в два раза, и эти грызуны заняли доминирующее положение среди обследованных особей (Рис. 5). Инфицированность лесной мыши в этот период была еще ниже, чем в 2007 г. При этом во все годы у большинства особей выявляли только антитела, чаще в низких титрах, а антигеноносители были единичны. Это может указывать на несущественную роль малой лесной мыши в циркуляции хантавирусной инфекции.

Особый интерес представляют данные, отражающие характер циркуляции различных хантавирусов у отдельных видов грызунов - основных и случайных хозяев тех или иных серотипов (генотипов) этих вирусов, при разной эпизоотической ситуации.

При типировании сывороток крови фоновых видов грызунов было показано, что в разгар эпизоотии ГЛПС-ДОБ 87% всех серотипированных особей имели антитела к вирусу ДОБ-Аа, а у основного хозяина этого вируса - полевой мыши, этот показатель был максимальным - 97% (рис. 3). Во все последующие эпидсезоны, после затухания эпизоотии, связанной с вирусом ДОБ-Аа, антитела к нему обнаруживали только у четверти серотипированных грызунов, в основном у полевой мыши (у 12 из 14). Остальные особи были инфицированы «полёвочьими» вирусами: Пуумала или Тула.

полевая мышь лесная мышь рыжая и обыкновенная

полевки

шДОБ ОПУУ

Рисунок 5. Процентное соотношение особей инфицированных вирусами ДОБ-Аа и ПУУ/Тула среди грызунов фоновых видов (А) и по группам видов (Б) в период вспышки ГЛПС-ДОБ (I) и в последующие эпидсезоны (ИДИ) в Тамбовская обл. 20062012 гг.

Очень показательно в этом плане соотношение находок антител к циркулирующим в сочетанных очагах вирусам у самого многочисленного на обследованной территории вида - малой лесной мыши. У этих грызунов, как мы уже отмечали, лишь в исключительных случаях выявляли вирусный антиген (4 из 1405 обследованных), хотя антитела фиксировали значительно чаще. В период активной эпизоотии ГЛПС-ДОБ 2006-07 гг. при большой численности инфицированных полевых мышей у большинства серотипированных лесных мышей также выявляли антитела к этому вирусу. В то же время, во все последующие эпидсезоны, начиная с VII 2007г. по ноябрь 2011г. у этих грызунов преобладали антитела к «полёвочьим» вирусам (87%) более распространённым в этот период в природных очагах (рис. 5). Таким образом, у 1 случайного хозяина - лесной мыши наблюдается типичный «зрПоуег», т.е. она

получает тот вирус, который носят наиболее многочисленные на этой территории основные хозяева инфекции.

Все обследованные рыжие и серые полёвки имели антитела лишь к своим вирусам Пуумала и/или Тула, которые мы не имели возможности идентифицировать при помощи метода МФА. Даже в разгар эпизоотии ГЛПС-ДОБу единичных обследованных особей мы не выявили антител к вирусу ДОБ-Аа.

Обыкновенной полёвки, в нашем материале представлены в небольшом количестве, т.к. метод л-с мало пригоден для учёта их численности. В то же время, судя по данным ФБУЗ Тамбовской области, можно сказать, что наиболее многочисленны эти грызуны были в 2007-08гг. и 2009-10гг., когда заболеваемость ГЛПС была минимальной или не регистрировалась. Т.о., обыкновенная полёвка, как и малая лесная мышь, не участвует в распространении патогенных для человека хантавирусов. Особи, у которых зарегистрирован вирусный антиген или антитела к хантавирусу, вероятно, заражены вирусом Тула, специфичным для серых полёвок.

В результате вирусологического исследования образцов лёгочной ткани полевых мышей, отловленных в Тамбовской области, при заражении клеток УЕЯО-Е6 удалось выделить два хантавирусных штамма. Иммунологические исследования вновь выделенных штаммов в перекрёстных опытах МФА и РН с известными штаммами вирусов Пуумала, Хантаан, Сеул и Добрава (подтипы ДОБ-А^ ДОБ-Ар, ДОБ-Аа) позволили установить их видовую специфичность и принадлежность к подтипу ДОБ-Аа вируса Добрава, циркулирующего и в других очагах ГЛПС лесостепной зоны Центрального региона Европейской России. [Дзагурова и др., 2008].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных материалов показал, что на территории Тамбовской области существуют очаги двух хантавирусов, вызывающих заболевания людей: Добрава и Пуумала, основные (резервуарные) хозяева которых - полевая мышь и рыжая полевка, соответственно. На части обследованной территории существуют сочетанные очаги этих вирусов. Кроме того, в популяциях обыкновенной полевки здесь же, вероятно, циркулирует хантавирус Тула, непатогенный для человека [ОаугПоуБкауа 1990; Гавриловская и др., 2009]. Такая же картина наблюдается на других очаговых территориях европейской лесостепи [Апекина и др., 2007; Михайлова и др. 2008; Бернштейн и др., 2010; Р1уизшп е1 а1., 1994].

Территория Тамбовской области практически вся эндемична по ГЛПС. Во всех районах обнаружены случаи заболевания людей и/или иммунная прослойка, и/или инфицированные грызуны.

Хантавирус Добрава распространен по всей территории области, обнаружен во всех 23 районах области, в отличие от вируса Пуумала, который обнаружен в 16 районах из 23, что связано со стациональной и биотопической привязанностью основных видов резервуарных хозяев (рис. 6).

- случаи ГЛПС-ДОБ

- случаи ГЛПС-ПУУ

- серопозитивных случаи ДОБ среди иммунной прослойки

- серопозитивных случаи ПУУ среди иммунной прослойки

- сочетанные очаги ДОБ-ПУУ инфекции (по иммунная прослойка)

- сочетанные территории ДОБ-ПУУ инфекции (по случаям ГЛПС)

- лесные территории

- отлов полевых мышеи

- инфицированные полевые мыши

□ - отлов рыжих полевок | - инфицированные рыжие полевки

Рис. 6. Распределение случаев ГЛПС-ПУУ и ГЛПС-ДОБ и серопозитивных ли: среди иммунной прослойки (А) и грызунов (Б) на территории Тамбовско, области.

Сочетанные очаги обнаружены в 15 районах из 23 (рис. 6).

От полевых мышей, отловленных в очагах, выделены два штамма вируса Добрава, по результатам иммунологических исследований отнесенные к подтипу ДОБ-Аа, циркулирующего также на территории соседних областей Центрального региона РФ [Дзагурова и др., 2008; Юешра а! а1., 2008]. Циркуляция вирусов Добрава и Пуумала в очагах происходит автономно, а их эпизоотическое и эпидемическое проявление принципиально отличается. В период наших наблюдений случаи заражения вирусом Пуумала были немногочисленны, и заболеваемость мало колебалась по годам и имела спорадический характер, в отличие от активных очагов в оптимуме ареала рыжей полевки [Бернштейн и др., 2010; Жигальский и др., 2013]. Это обусловлено, вероятно, небольшой площадью лесных биотопов, где обитает рыжая полевка, ее относительно невысокой численностью и низкой инфицированностью на большей части территории области.

Проявление ГЛПС-ДОБ имело ярко выраженный вспышечный характер, характерно и для других очагов этого вируса в лесостепной зоне Центрального региона РФ [Апекина и др, 2007; Транквилевский и др., 2007; Ходякова и др., 2009; Бернштейн и др, 2010]. В Тамбовской области в период наших наблюдений массовое заражение людей вирусом Добрава происходило лишь в короткий период с ноября 2006 г. по апрель 2007 г. [Мутных и др., 2011], а затем регистрировали лишь единичные случаи этой инфекции.

В период вспышки была подтверждена ведущая роль полевой мыши как основного хозяина и источника заражения людей вирусом Добрава на обследованной территории. Резкий подъем заболеваемости ГЛПС-ДОБ происходил на фоне столь же заметного подъема численности полевой мыши и ее инфицированности. Во время вспышки доля активных вирусоносителей в популяции этих грызунов достигала максимальных значений. Непосредственной причиной возникновения эпидемических вспышек в такой ситуации служат миграции мышей в холодное время года в сельские населенные пункты, стога и омёты, вследствие чего контакты людей с инфицированными грызунами значительно увеличиваются [Бернштейн и др., 2010].

Таким образом, мы выявили прямую связь эпизоотической и эпидемической активности хантавирусных очагов разных типов с динамикой популяций их резервуарных хозяев. Было также показано, что виды мелких млекопитающих,эволюционно не связанные с хантавирусами [[-Чуиыпт, Моггипоу, 2001], в том числе многочисленная на обследованной территории лесная мышь, не участвуют активно в эпизоотиях, ассоциированных с вирусами Пуумала и

Добрава-Аа, и не могут поддерживать эпизоотический процесс после его затухания в популяциях полевой мыши и рыжей полевки. Таким образом, ониоказываются лишь случайными хозяевами хантавирусной инфекции и не играют роли в заражении людей, соответственно, не имеют эпидемиологического значения.

Из всего сказанного следует, что для прогнозирования уровня заболеваемости ГЛПС на территории области и грамотного проведения неспецифической профилактики необходим постоянный мониторинг уровня численности,миграционной активности и инфицированное™ основных хозяев инфекции.

ВЫВОДЫ

1. На территории Тамбовской области установлено существование сочетанных природных очагов 2-х патогенных для человека хантавирусов -Пуумала и Добрава, носителями которых являются рыжая полевка и полевая мышь. На большей части территории выявлены сочетанные очаги этих вирусов. И очаги не патогенного для человека вируса Тула, резервуарный хозяин — обыкновенная полевка.

2. Установлено, что из 12 видов мелких млекопитающих, обитающих на очаговой по ГЛПС территории, эпидемиологическое значение имеют лишь полевая мышь и рыжая полевка.

3. Штаммы вируса Добрава, выделенные от полевых мышей, отловленных в природных очагах Тамбовской области, серологически идентифицированы как подтип вируса Добрава ДОБ-Аа (Куркино), циркулирующий и на других территориях лесостепной зоны Европейской части России.

4. Проведен анализ структуры заболеваемости ГЛПС, установлено, что заболеваемость ГЛПС, ассоциированная с вирусами Добрава (ГЛПС-ДОБ) и Пуумала (ГЛПС-ПУУ) на территории Тамбовской области, имеет различную многолетнюю и сезонную динамику, а также принципиальные различия эпидемического процесса ГЛПС:

а) ГЛПС-ДОБ характеризуется высокой интенсивностью эпидемического процесса в период редких вспышек, с максимумом в зимние месяцы и крайне низкой заболеваемостью в межэпидемический период. Группу риска составляют в основном сельские жители, преобладает сельскохозяйственный и бытовой тип заражения.

б) ГЛПС-ПУУ проявляется в виде спорадических случаев во все сезоны, без резких подъемов по годам. Группу риска составляют в основном городские жители, преобладает заражение при посещении лесных территорий.

5. Выявлено, что вирусы Добрава и Пуумала в сочетанных очагах циркулируют автономно в популяциях своих основных хозяев. Различия в эпидемическом проявлении ГЛПС-ДОБ и ГЛПС-ПУУ напрямую связаны со спецификой динамики численности и биотопической приуроченности грызунов -носителей каждого из этих вирусов и особенностями эпизоотического процесса в их популяциях.

6. Анализ данных об инфицированное™ хантавирусами грызунов, заболеваемости населения и наличие иммунной прослойки среди населения доказывает, что вся территория Тамбовской области эндемична по ГЛПС.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мутных Е.С., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Калинкина Е.В., Коротина H.A., Апекина Н.С., Соцкова С.Е., Толстова Г.А., Суворин А.П., Ткаченко Е.А. Эпидемические, эпизоотологические и этиологические особенности вспышки геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Тамбовской области в 2006-2007 гг. // Вопросы вирусологии. — 2011. — №6. — С.41-47.

2. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Окулова Н.М., Коротина H.A., Транквнлевский Д.В., Морозов В.Г., Юннчева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С., Смирнова М.С., Леонович O.A., Шевелёв А.Б., Малкин Г.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в России - проблема XXI века // Вестник Российской академии естественных наук. — 2012. — №1. — С. 48-54.

3. Окулова Н.М., Калинкина Е.В., Миронова Т.А., Сапельников С.Ф., Егоров C.B., Майорова А.Д., Власов A.A., Мутных Е.С. К экологии полевой мыши (ApodemusagrariusPall.) в лесостепном Черноземье. III. Состав популяции и размножение // Поволжский экологический журнал. — 2012. — № 3. — С.268-277.

4. Dzagurova Т.К., Witkowski Р.Т., Tkachenko Е.А., Klempa В., Morozov V.G., Auste В., Zavora D.L., Iunicheva I.V., Mutnih E.S., Kruger D.H. Isolation of Sochi virus from a fatal case of hantavirus disease with fulminant clinical course // Clinical Infectious Diseases. — 2012. — V. 54. — № 1. — P. E1-E4..

5. Калинкина Е.В., Мутных Е.С.. Миронова Т.А. Мелкие млекопитающие как носители природно-очаговых инфекций в Тамбовской области. Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых // Материалы конференции молодых сотрудников и аспирантов ИПЭЭ им. А.Н. Северцова, Москва. — 2008. — С. 148-152.

6. Транквилевский Д.В., Стрыгина С.О., Кутузов A.B., Клепиков О.В., Бернштейн А.Д., Мутных Е.С.. Дзагурова Т.К. Динамика относительной численности полевой мыши в открытых лугополевых стациях Воронежской области // Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова. Медицинская вирусология. — 2009,—Т. XXVI . — С. 197-199.

7. Транквилевский Д.В., Кутузов A.B., Каменева М.Г., Стёпкин Ю.И., Бернштейн А.Д., Мутных Е.С., Дзагурова Т.К. Сравнительная оценка инфицированности хантавирусами мелких млекопитающих в стациях с различной экотонной структурой на примере аннинского района Воронежской области // Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова. Медицинская вирусология. — 2009. — Т. XXVI. — С. 200-203.

8. Ходякова И.А., Щукина И.А., Мурашкина А.Н., Савельев С.И., Бернштейн А.Д., Дзагурова Т.К., Седова Н.С., Мутных Е.С. Особенности очагов ГЛПС на территории Липецкой области // Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова. Медицинская вирусология. — 2009. — Т. XXVI. — С.206-208.

9. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Окулова Н.М., Коротина H.A., Транквилевский Д.В., Морозов В.Г., Юничева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С.. Смирнова М.С., Леонович O.A., Шевелёв А.Б., Малкин Г.А. Современное состояние проблемы геморрагической лихорадки с почечным синдромом в России. Национальные приоритеты России // Материалы Всеросийской научно-практической конференции с международным участием "Современные аспекты природной очаговости болезней", Омск. — 2011.— №2. — С. 18-22.

Ю.Мутных Е.С.. Калинкина Е.В., Толстова Г.А., Суворин А.П., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Коротина H.A., Ткаченко Е.А. Ретроспективный анализ вспышки ГЛПС в Тамбовской области в 2006-2007 гг. // Материалы X Всероссийского съезда научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва. — 2012. — С.174-175.

Благодарности

Выражаю глубокую благодарность за помощь в проведении исследований, внимание к работе, ценные рекомендации и тёплое отношение моим научным руководителям - кандидату медицинских наук Тамаре Казбековне Дзагуровой и кандидату биологических наук Алле Давыдовне Бернштейн.

Глубоко признательна доктору медицинских наук, профессору Евгению Александровичу Ткаченко за помощь и внимание при выполнении и написании диссертации.

Благодарю всех сотрудников лаборатории геморрагических лихорадок за помощь в исследованиях, результатом которых явилась данная работа.

Искренне признательна за плодотворное сотрудничество заместителю начальника Управления Роспотребнадзора по Тамбовской области Галине Алексеевне Толстовой, а также главному врачу ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тамбовской области» Тихоновой Галине Алексеевне, заместителю главного врача по эпидвопросам Суворину Александру Петровичу, заведующей лабораторией ООН Кречетовой Людмиле Федоровне и, особенно, начальнику зоологического отделения Калинкиной Елене Валерьевне и биологу Молодцовой Ольге Александровне.

Благодарю рецензентов и оппонентов данной работы Карганову Галину Григорьевну, Ломакину Наталью Федоровну, Дерябина Петра Григорьевича.

Благодарю директора и администрацию ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН за предоставленную возможность прохождения аспирантуры и выполнения диссертационной работы в Институте.

Выражаю глубокую признательность Ольге Алексеевне Медведкиной и Лидии Юрьевне Романовой за оказанную помощь и поддержку.

Подписано в печать: 26.11.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 273 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мутных, Елена Сергеевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

ИМ. М.П.ЧУМАКОВА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

04201452905

На правах рукописи

МУТНЫХ ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

Особенности природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Центрального Черноземья России

03.02.02 - вирусология

Диссертация

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Т.К.Дзагурова

кандидат биологических наук А.Д.Бернштейн

МОСКВА-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15

Глава 1. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) 15

1.1 Краткий исторический обзор изучения ГЛПС 15

1.2 Клиника ГЛПС 16

1.3 Этиология ГЛПС 18

1.4 Эпидемиология ГЛПС 23

1.5 Специфическая лабораторная диагностика ГЛПС 30

1.6 Профилактика ГЛПС 33 ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35 Глава 2. Материалы и методы исследований 35

2.1 Ландшафтно-географическая характеристика, растительный и

35

животный мир, климат Тамбовской области (краткая справка)

2.2 Эпидемиологические и эпизоотологические методы

39

исследования

2.3 Иммунологические и вирусологические методы исследования 41

2.4 Статистические методы 45 Глава 3. Структура заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области 47

3.1 Нозоареал ГЛПС 47

3.2 Сезонная динамика заболеваемости ГЛПС

3.3 Распределение заболеваемости ГЛПС по возрастным группам 53

3.4 Возрастной и половой состав больных ГЛПС 60

3.5 Анализ условий заражения ГЛПС в Тамбовской области 64

3.6 Соотношение клинической и серологической диагностик

67

ГЛПС

Глава 4. Иммунная структура населения Тамбовской области по

73

отношению к хантавирусам

4.1 Выявление сероположительных к хантавирусам лиц,

серотипирование

4.2 Половой, возрастной и профессиональный состав лиц с антителами к хантавирусам ГЛАВА 5. Циркуляции хантавирусов на территории Тамбовской области 78

5.1 Видовой состав мелких млекопитающих 79

5.2 Циркуляции хантавирусов среди мелких млекопитающих 83

5.3 Эпизоотологические особенности циркуляции хантавирусов в эпидемический и межэпидемический периоды

5.4 Связь эпидемического проявления очагов ГЛПС с динамикой популяций основных хозяев и с особенностями их биологии

5.5 Выделение и идентификация хантавируса 96 ОБСУЖДЕНИЕ 101 ВЫВОДЫ 113 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115

86

88

з

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом

ПУУ - Пуумала

ХТН - вирус Хантаан

СЕУ - вирус Сеул

ДОБ - вирус Добрава/Белград

АМУ - вирус Амур

ГЛПС - ДОБ - ГЛПС, вызванная вирусом Добрава/Белград

ГЛПС - ПУУ - ГЛПС, вызванная вирусом Пуумала

ХПС - хантавирусный пульмональный синдром

ИФА - иммуноферментный анализ

ФОБ - фокусобразующие единицы

МКА — моноклональные антитела

МФА - метод флюоресцирующих антител

РН - реакция нейтрализации

УЕЯО-Еб - перевиваемая линия клеток почек зеленой мартышки ММ - мелкие млекопитающие л-с - ловушко-сутки

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) представляет собой одну из наиболее распространенных среди населения России природно-очаговых болезней с прогрессирующей динамикой заболеваемости. По данным Роспотребнадзора РФ за.период с 2000 по 2012 гг. было зарегистрировано 92 394 случая ГЛПС на территориях 58 из 83 субъектов Российской Федерации (в среднем, 5,2 случая на 100 тыс. населения). Более 98% случаев заражения ГЛПС зарегистрировано в 46 из 58 административных субъектов Европейской части России, главным образом, в очагах, приуроченных к лесным ландшафтам [56].

Хантавирусы - возбудители ГЛПС передаются респираторным путем, а источником заражения людей служат мышевидные грызуны, выделяющие вирус с экскретами (слюна, моча, кал) во внешнюю среду.

Полученные в последние десятилетия данные существенно изменили сложившиеся представления об этиологической природе заболеваний ГЛПС на территории Европейской части России, где ранее все случаи этой инфекции связывали только с вирусом Пуумала, основным резервуаром которого в природе является европейская рыжая полевка, Муос1е8 §1агео1из. В конце прошлого века были выявлены природные очаги циркуляции ранее не известных в России высоко патогенных для человека вирусов-возбудителей ГЛПС, относящихся к двум иммунологически и генетически отличающимся подтипам хантавируса Добрава/Белград (далее Добрава) [56; 57]. В очагах лесостепной зоны Центрального региона РФ, в том числе Центрального Черноземья, выявлен подтип Добрава-Аа (ДОБ-Аа), основной (резервуарный) хозяин которого западный подвид полевой мыши, Арос1етш а^апш а§гапш, а в Причерноморье -подтип вируса Добрава (ДОБ-Ар), ассоциированный с кавказской лесной мышью, АроёеггшБ ропйсш [77.1].

К настоящему времени доказана этиологическая роль пяти видов хантавирусов в структуре заболеваемости ГЛПС в России: Хантаан, Сеул и

Амур - в регионах Дальнего Востока, а также Пуумала и Добрава в регионах Европейской части. То есть, сложилась такая ситуация, когда под одним названием «ГЛПС» регистрируются, по крайней мере, пять этиологически самостоятельных хантавирусных инфекций. Вопрос о реальном количестве существующих в природе хантавирусов остается открытым, как и вопрос об эпидемиологической опасности еще не выявленных к настоящему времени гено- и серотипов, их природных резервуарах и носителях. Становится всё более очевидной зависимость клинических и эпидемиологических проявлений хантавирусных инфекций от их этиологической обусловленности, выражающейся в принадлежности возбудителя к определённому хантавирусному генотипу или подтипу, каждый из которых имеет своего резервуарного хозяина, поддерживающего природные очаги ГЛПС [56, 57].

В связи с выше изложенным, проблема заболеваемости ГЛПС, вызываемой разными хантавирусами, приобретает особое значение для здравоохранения в плане проведения эффективной диагностики, лечения и профилактики ГЛПС. Особенно обостряется эта проблема на тех очаговых территориях, где циркулируют одновременно два патогенных для человека хантавируса, как это имеет место в Центральном Черноземье.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучение этиологических, эпидемиологических и эпизоотологических особенностей природных очагов ГЛПС на территории Центрального Черноземья России (на примере Тамбовской области, типичной для этого региона), а также совершенствование существующей системы мониторинга этой инфекции.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести серологическое исследование сывороток крови больных ГЛПС с целью выявления хантавирусных серотипов, играющих

этиологическую роль в структуре заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области.

2. Изучить структуру заболеваемости ГЛПС в Тамбовской области за период с 2006 по 2012 годы.

3. Определить напряжённость и структуру естественного иммунитета населения по отношению к хантавирусам и оценить качество клинической диагностики ГЛПС.

4. Выделить и идентифицировать штаммы хантавирусов - возбудителей ГЛПС в Тамбовской области.

5. Определить видовой состав мелких млекопитающих - природных резервуаров и носителей хантавирусов, являющихся источником заражения людей ГЛПС.

6. Дифференцировать природные очаги ГЛПС на основе эпидемиологических и эпизоотологических показателей.

7. Выявить связь между эпидемической и эпизоотической активностью очагов, где циркулируют вирусы Добрава и Пуумала.

Научная новизна

В результате комплексных исследований на ранее мало изученной очаговой территории Центрального Черноземья получены новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусных лихорадок у нас в стране и за рубежом:

1. Впервые выявлены сочетанные природные очаги циркуляции двух высоко патогенных для человека хантавирусов Пуумала и Добрава на территории Тамбовской области, в ландшафтном и социальном отношении типичной для Центрального Черноземья России.

2. Впервые изолированы в культуре клеток вирусные штаммы от полевых мышей, идентифицированные как генотип Куркино вируса Добрава (ДОБ-Аа).

3. Установлены различия эпидемического процесса при заболевании людей ГЛПС, вызываемой вирусами Пуумала и Добрава (условия заражения, сезонность заболевания, социальное положение больных).

4. Впервые доказана доминирующая роль вируса Добрава в этиологической структуре заболеваемости ГЛПС среди жителей Тамбовской области в период эпидемических вспышек с преобладанием заболеваний лёгкой и средней тяжести, а также наличие субклинических форм инфекции.

5. Для вирусов Добрава и Пуумала установлена эпидемиологическая значимость полевой мыши, A.agrarius и рыжей полёвки М^1агео1ш как резервуарных хозяев и источников заражения людей.

6. Впервые охарактеризованы ранее неизвестные региональные особенности сезонной динамики ГЛПС, вызванной вирусом Добрава. Выявлена ограниченность сезона вспышечной заболеваемости холодным временем года и ••' корреляция зимних подъёмов с активностью эпизоотического процесса в популяциях полевой мыши - природного резервуара вируса Добрава.

Практическая значимость работы

Данные о характере эпидемического проявления ГЛПС в сочетанных природных очагах циркуляции хантавирусов Добрава и Пуумала и эпизоотического процесса в популяциях полевой мыши и рыжей полёвки -носителей этих вирусов, могут служить основой при планировании проведения профилактических мероприятий и прогнозировании эпидемической ситуации хантавирусных инфекций, вызываемых этими вирусами. Результаты сравнительной оценки эффективности клинической и специфической лабораторной диагностики ГЛПС позволяют установить истинные размеры заболеваемости в регионе, расширить представление о диапазоне клинических проявлений инфекции, выявить лёгкие и клинически стертые формы, о которых ранее сведений не имелось. Анализ данных по изучению иммунной структуры населения по отношению к хантавирусам позволяет выделить группы

повышенного риска заболевания ГЛПС, что является основой формирования контингентов лиц, подлежащих профилактической вакцинации, и определяет рациональный порядок её проведения.

Результаты исследований нашли отражение в различных документах организационно-методического характера по борьбе с ГЛПС как на региональном, так и федеральном уровнях:

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. Методические рекомендации по клинике, дифференциальной диагностике, лечению, диспансеризации и специфической лабораторной диагностике. Тамбов, 2008; приказы, постановления, годовые отчеты и прогнозы Управления Роспотребнадзора в Тамбовской области.

Личное участие автора в получении результатов

Автором самостоятельно проведен обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме, самостоятельно собраны полевые материалы от мелких млекопитающих, а также лабораторно исследованы органы животных и сыворотки крови больных с диагнозом ГЛПС, с подозрением на эту инфекцию, а также сыворотки крови доноров для выявления иммунной прослойки населения. Совместно с сотрудниками лаборатории геморрагических лихорадок проведены вирусологические исследования по выделению и идентификации вирусных штаммов, а также типирование антител в сыворотках крови больных ГЛПС по принадлежности к хантавирусам - возбудителям ГЛПС. Совместно с сотрудниками ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Тамбовской области проведен сбор и анализ эпидемиологической документации. Самостоятельно проведена статистическая обработка полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На территории Тамбовской области, типичной для Центрального Черноземья, циркулируют высоко патогенные для человека хантавирусы Добрава и Пуумала, и существуют сочетанные очаги этих вирусов.

2. Этиологическая структура заболеваемости в 2006-2012 гг. была неоднородна в разные эпидсезоны; вирус Добрава играл доминирующую роль в период эпидемической вспышки ГЛПС с преобладанием заболеваний лёгкой и средней тяжести.

3. Из 12 видов мелких млекопитающих, обитающих на очаговой по ГЛПС территории, эпидемиологическое значение имеют лишь полевая мышь A.agrarius и рыжая полевка М^1агео1ш - резервуарные хозяева вирусов Добрава и Пуумала, соответственно, и источники заражения людей.

4. Штаммы вируса Добрава, выделенные из легких полевых мышей, отловленных в Тамбовской области, относятся к подтипу ДОБ-Аа (Куркино), циркулирующему в лесостепной зоне Европейской части России.

5. Заболеваемость ГЛПС, ассоциированная с вирусами Добрава (ГЛПС-ДОБ) и Пуумала (ГЛПС-ПУУ), на территории Тамбовской области имеет различную многолетнюю и сезонную динамику, а именно, ГЛПС-ДОБ характеризуется высокой интенсивностью эпидемического процесса в период редких вспышек, с максимумом в зимние месяцы и крайне низкой заболеваемостью в межэпидемический период. Напротив, ГЛПС-ПУУ проявляется в виде спорадических случаев во все сезоны без резких подъемов по годам.

6. Заражение людей вирусом Добрава происходит от полевых мышей, в основном, сельских жителей в процессе ухода за животными, заготовки кормов и прочих сельскохозяйственных работ. Заражение вирусом Пуумала происходит от рыжих полевок, в основном, среди городского населения при посещении леса, во время работы и проживания на садово-дачных участках, на охоте и рыбалке.

7. Различия в эпидемическом проявлении ГЛПС-ДОБ и ГЛПС-ПУУ напрямую связаны с динамикой численности и биотопической приуроченностью резервуарных хозяев каждого из этих вирусов и эпизоотической активностью природных очагов.

8. Уровень естественного иммунитета населения, результаты специфической лабораторной диагностики и регистрируемая заболеваемость ГЛПС указывают на низкое качество клинической диагностики этой инфекции в Тамбовской области.

Внедрение результатов исследования

Основные результаты исследования внедрены и используются в работе Центра МЗ РФ и РАМН по борьбе с ГЛПС, г. Москва; Референс-центра • Роспотребнадзора по мониторингу ГЛПС, г. Москва; ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тамбовской области» г. Тамбов, Управление Роспотребнадзора по Тамбовской области, г. Тамбов.

Апробация и публикация материалов исследования

Материалы исследования доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях по геморрагической лихорадке с почечным синдромом (г. Воронеж, 2010, г. Тамбов, 2008 и 2011, гг. Сочи, 2009); Веер, научн-практ. конференции «Вакцинология, Москва, 9-10 ноября 2010; VIII Intern. Conf. on HFRS, HPS and Hantaviruses. Athens, Greece, 2010; IX Intern. Conf. on HFRS, HPS andHantaviruses. Beijing, China, 2013; научн-практ. конференции «Молекулярная диагностика», 2010; 21st Annual GfV Meeting, Berlin, Germany, 2011; Всеросийской научно-практическая конференции с международным участием "Современные аспекты природной очаговости болезней", Омск, ноябрь 2011; X съезде Всероссийского общества

Эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 12-13 апреля 2012 г.

и

По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ, из них 1 - в зарубежной печати, 9 - в отечественной центральной печати, в том числе 4 публикаций в ведущих рецензируемых журналах (из списка ВАК).

1. Мутных Е.С., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Калинкина Е.В., Коротина Н.А., Апекина Н.С., Соцкова С.Е., Толстова Г.А., Суворин А.П., Ткаченко Е.А. Эпидемические, эпизоотологические и этиологические особенности вспышки геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Тамбовской области в 2006-2007 гг. // Вопросы вирусологии. — 2011. — №6. — С.41-47.

2. Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Бернштейн А.Д., Окулова Н.М., Коротина Н.А., Транквилевский Д.В., Морозов В.Г., Юничева Ю.В., Завора Д.Л., Баловнева М.В., Соцкова С.Е., Мутных Е.С., Смирнова М.С., Леонович О.А., Шевелёв А.Б., Малкин Г.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в России - проблема XXI века // Вестник Российской академии естественных наук. — 2012. — №1. — С. 48-54.

3. Окулова Н.М., Калинкина Е.В., Миронова Т.А., Сапельников С.Ф., Егоров C.B., Майорова А.Д., Власов А.А., Мутных Е.С. К экологии полевой мыши (Apodemus agrarius Pall.) в лесостепном Черноземье. III. Состав популяции и размножение // Поволжский экологический журнал. — 2012. — № 3. — С.268-277. ;

4. Dzagurova Т.К., Witkowski Р.Т., Tkachenko Е.А., Klempa В., Morozov V.G., Auste В., Zavora D.L., Iunicheva I.V., Mutnih E.S., Kruger D.H. Isolation of Sochi virus from a fatal case of hantavirus disease with fulminant clinical course // Clinical Infectious Diseases. — 2012. — V. 54. — № 1. — P. E1-E4.

5. Калинкина E.B., Мутных E.C.. Миронова T.A. Мелкие млекопитающие как носители природно-очаговых инфекций в Тамбовской области. Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых // Материалы конференции молодых сотрудников и аспирантов ИПЭЭ им. А.Н. Северцова, Москва. — 2008. — С. 148-152.

6. Транквилевский Д.В., Стрыгина С.О., Кутузов А.В., Клепиков О.В., Бернштейн А.Д., Мутных Е.С.. Дзагурова Т.К. Динамика относительной численности полевой мыши в открытых лугополевых стациях Воронежской �