Особенности первичной структуры транскрибируемой ДНК как фактор регуляции транскрипции

Часов, Виталий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности первичной структуры транскрибируемой ДНК как фактор регуляции транскрипции
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности первичной структуры транскрибируемой ДНК как фактор регуляции транскрипции"

•* ' о т - .

На правах рукописи

л1»

г4'- *

Часов Виталий Васильевич

ОСОБЕННОСТИ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ДНК КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущнно 2000

г г

. фг

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Озолинь О.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН им.В.А. Энгельгардта

на заседании Диссертационного совета D200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 Московская обл., г. Пушимо, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан «15 « йлр^^Л 2000г.

Ученый секретарь Диссертационного сов

Брусков В.И.

доктор биологических наук Постникова Г.Б.

Зашита состоится « //

« л_2000г. в час.

кандидат биологических наук

Еочо-о

, *

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клетки одноклеточных организмов постоянно находятся в контакте с окружающей средой и непосредственно подвержены действию ее изменяющихся физико - химических факторов. Следовательно, они должны обладать мощными системами контроля, обеспечивающими их быстрый рост в благоприятных условиях и эффективное выживание в неблагоприятных. Для оптимального жизнеобеспечения клетки система синтеза ключевых макромолекул должна поддерживаться в стабильном и строго сбалансированном состоянии, поэтому необходимо наличие множественных регуляторных систем, чувствительных к изменяющимся факторам и оперативно обеспечивающих экспрессию востребованного набора генов. Для этого бактериальные клетки используют разнообразные регуляторные системы, значительная часть которых функционирует во время транскрипции.

Эффективность транскрипции индивидуальных генов контролируется на всех стадиях транскрипционного цикла. В течение многих лет основное внимание исследователей было направлено на изучение механизмов регуляции транскрипции, действующих при взаимодействии РНК-полимеразы со специальными сигнальными участками ДНК: промоторами и терминаторами, расположенными, соответственно, в начале и в конце каждого гена или оперона. Эти участки ДНК имеют общие для разных генов особенности в их структурной организации и могут быть идентифицированы с помощью специальных алгоритмов. Копируемые во время транскрипции нуклеотидные последовательности генов строго индивидуальны. Тем не менее, они также содержат некоторые структурные особенности, которые прямо или опосредованно влияют на локальную скорость транскрипции и, проявляя зависимость от физико-химических факторов среды, могут приводить к существенному замедлению или даже остановке синтеза РНК. Классическим примером служит временная остановка РНК-полимеразы в лидерной области триптофанового оперона E.coli, которая имеет важное физиологическое значение, поскольку является необходимым элементом регуляторного механизма (аттенюации), с помощью которого осуществляется контроль экспрессии соответствующей группы генов в зависимости от концентрации триптофана в клетке. Это и определяет актуальность детального изучения динамики процессивного движения РНК-полимеразы вдоль ДНК матрицы.

К настоящему времени наиболее признанной является модель «скользящего» движения РНК-полимеразы, в соответствии с которой монотонное движение фермента вдоль ДНК-матрицы может быть нарушено на участках, содержащих определенные регуляторные сигналы, закодированные в нуклеотидной последовательности транскрибируемой ДНК и (или) синтезируемого РНК-продукта. Считается, что решающую роль

играют такие сигналы, как наличие вторичной структуры на конце РНК-продукта и низкая стабильность РНК-ДНК гибрида, образующегося на расплетенной матричной нити ДНК, однако на локальную скорость синтеза РНК оказывают влияние и термодинамические свойства ~10-ти нуклеотидных пар нерасплетенной ДНК, также входящей в состав элонгирующего комплекса, и даже тип нуклеотида, расположенного на 3'-конце РНК-продукта. Вместе с тем, накопленные за последние несколько лет экспериментальные данные не всегда хорошо согласуются с предложенными моделями. Поэтому, существующие представления о механизмах регуляции транскрипции, действующих на стадии элонгации, требуют значительного уточнения. Прогресса в этой области можно достичь, используя комплексный подход, с привлечением современных генетических, биохимических, биофизических, а также статистических методов исследования.

Основные задачи работы. Данная работа является продолжением исследований, направленных на изучение молекулярного механизма продуктивного взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с промоторами AI и D бактериофага Т7, которые были начаты в лаборатории физико-химических механизмов функционирования генома, а затем продолжены в лаборатории молекулярных механизмов клеточного стресса ИБК РАН. Данные, полученные ранее, послужили отправной точкой для последующих исследований. Первоочередной задачей представленной работы было изучение функциональной значимости конформационного перехода, зарегистрированного ранее для комплекса РНК-полимеразы с промотором T7D при температуре ~30°С, который не характерен для комплекса фермента с промотором Т7А1. При выполнении этой задачи было установлено, что повышение температуры приводит к снижению эффективности продуктивного синтеза РНК, инициированного с промотора T7D. Это послужило основанием для детального анализа динамики синтеза РНК с этого промотора, в процессе которого были решены следующие задачи:

- картированы места остановок синтеза РНК в транскрибируемой

области гена, прилегающей к промотору T7D;

- исследовано влияние первичной структуры прилегающей к промотору транскрибируемой ДНК на свойства элонгирующего комплекса.

Заключительный этап работы состоял в поиске общих закономерностей в структуре прилегающих к промотору нуклеотидных последовательностей ДНК, потенциально значимых для динамики перехода транскрипционного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Для решения этой задачи были использованы как статистические, так и экспериментальные методы исследования.

Научная новизна работы. В ходе работы установлено, что температурные условия являются фактором, определяющим соотношение двух типов инициирующих транскрипционных комплексов РНК-полимеразы E.coli с промотором T7D. Эти комплексы различаются между собой по

функциональным и структурным характеристикам. Один из них сохраняет способность в течение длительного времени осуществлять абортивный синтез коротких олигонуклеотидов, в то время как второй легко превращается в элонгирующий комплекс и переходит к продуктивному синтезу РНК. Таким образом, показана возможность регуляции процесса транскрипции в зависимости от температуры, заключающаяся в снижении выхода полноразмерного РНК-продукта в физиологическом диапазоне температур (30-37°С).

В рамках данного исследования картировано положение остановок продуктивного синтеза РНК, осуществляемого с матрицы, контролируемой промотором Т7Б, и установлено, что их причиной являются особенности структурной организации транскрибируемой ДНК.

С помощью статистического анализа обнаружена неизвестная ранее общая особенность в первичной структуре транскрибируемой части генов, которая заключается в периодичном распределении А/Т-треков, и экспериментально показано возможное влияние этих элементов на динамику синтеза РНК.

Практическая ценность работы. Выявленное в данной работе новое свойство первичной структуры транскрибируемой ДНК, прилегающей к промотору, может быть использовано для построения усовершенствованных алгоритмов поиска промоторов и создания эффективных искусственных конструкций для генно-инженерных работ.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 6-7-ой Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Франция, 1995; Испания, 1997); Конференциях по межмолекулярному взаимодействию и конформации макромолекул (Харьков, 1995; Тверь, 1997; Казань, 1999); И-ом Биохимическом съезде (Москва, 1997); П-ом Съезде биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы из^ наименований. Диссертация иллюстрирована № рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Функциональное значение дополнительного конформаинонного превращения комплекса РНК-полнмеразы Е.соН с промотором Т7Р

Ранее методом флуоресцентной метки было проведено сравнительное изучение последовательных конформационных превращений фермента в

процессе комплексообразования РНК-полимеразы E.coli с промоторами Al и D бактериофага Т7. В качестве метки был использован флуоресцеинмономеркуриацетат, специфически связывающийся с Cys269, входящим в состав а-субъединицы фермента. Последовательные конформационные превращения были индуцированы равновесным повышением температуры. Для комплексов фермента с обоими промоторами были зарегистрированы аналогичные последовательные конформационные превращения, приводящие к формированию «открытого» промоторного комплекса. Однако для транскрипционных комплексов, образованных с промотором T7D, был обнаружен один дополнительный конформационный переход, происходящий при температуре ~30°С и не характерный для комплекса фермента с промотором Т7А1.

Конформационные превращения комплексов регистрировали по изменению основных спектральных параметров флуоресцентной метки, которые отражали изменения ее локального окружения. Характер этих изменений свидетельствовал об уменьшении вязкости в микроокружении метки при и в сочетании с данными ДНКазного футпринтинга указывал на реорганизацию контакта а-субъединицы РНК-полимеразы с "upstream"-областью промоторной ДНК. Для некоторых промоторов показано, что наличие контакта между а-субъединицей и промоторной ДНК способно активировать транскрипцию в десятки раз [Ross et al., Science, 262, 1407, 1993], поэтому возникла задача детального изучения функционального значения обнаруженного конформационного перехода. Поскольку этот переход был зарегистрирован при температурах выше температуры образования «открытого» промоторного комплекса, логично было предположить, что его функциональная значимость должна проявиться на последующих стадиях транскрипционного цикла, т.е. на стадиях инициации (абортивный синтез) или элонгации транскрипции.

Чтобы проверить это предположение, была исследована зависимость скорости абортивной и продуктивной реакций от температуры. Параметры абортивного синтеза олигонуклеотидов (образование первых 2-12 фосфодиэфирных связей до отсоединения а-субъединицы) регистрировались с помощью методики Бертранда-Бурграфа с соавторами [Bertrand-Burgraff et al., Nucl. Acids Res., 12, 1697, 1984], согласно которой в качестве элонгирующего субстрата применяется флуоресцентный аналог UTP, содержащий 1-нафтиламин-5-сульфонат по у-положению фосфата. При отсоединении пирофосфата, которое имеет место в процессе образования фосфодиэфирной связи, интенсивность флуоресценции связанной с пирофосфатом метки возрастает в 14 раз. Такое изменение легко регистрируется с помощью спектрофлуориметра и позволяет надежно определять скорость синтеза олигонуклеотидов по динамической кривой зависимости интенсивности флуоресценции от времени.

I 20

О «

ё 15

5 и

1 ю

С9 -С

5 10 15 20 25 30 35 40 Температура (°С)

Рис. 1. Температурная зависимость скорости синтеза олнгонуклеотидов во время абортивного синтеза.

Пробы содержали 0.82нМ активных молекул фермента и 1нМ промотора Т7Э

Температура (°С)

Рис. 2. Температурная зависимость скорости продуктивного синтеза РНК.

Пробы содержали 0.82нМ активных молекул фермента и 1нМ промотора Т7Б

Проведение реакции абортивного синтеза при разных температурах позволило получить температурную зависимость скорости образования продукта (рис. 1). При температуре -30° скорость синтеза олигонуклеотидов резко возрастает. Значительная активация абортивной реакции происходит при той же самой температуре, при которой ранее наблюдались конформационные изменения полимераза - промоторного комплекса. Такая корреляция, несомненно, свидетельствует о функциональной значимости дополнительного конформа-ционного превращения комплекса.

Эффективность перехода инициирующих комплексов к элонгации транскрипции зависит от нуклеотидной последовательности промоторов и транскрибируемой части гена и, следовательно, отличается для разных промоторов. В некоторых случаях соотношение абортивной и продуктивной реакций является фактором, определяющим эффективность копирования матрицы [КиЬоп, БЫтатоШ, 1Мо1.Вю1., 256, 449, 1996]. Поэтому, не исключено, что наблюдаемая значительная активация абортивного синтеза влияет на переход транскрипционного комплекса к продуктивной реакции. В связи с этим, следующим шагом в данной работе было исследование температурной зависимости скорости продуктивного синтеза РНК. Для этого, так же, как и в случае абортивной реакции, была использована методика, предложенная Бертрандом-Бурграфом с соавторами.

Значительное изменение зависимости скорости продуктивного синтеза

от температуры происходит при ~30°С (рис. 2). Выше этой температуры прирост скорости почти прекращается. Это является важным результатом, так как, во-первых, свидетельствует о различном характере температурной зависимости для абортивной и продуктивной реакций, а, во-вторых, указывает на возможность существования молекулярного механизма, снижающего эффективность продуктивного синтеза с исследуемого промотора в физиологических температурных условиях (30-37°С). Активация абортивной реакции при повышении температуры может быть составной частью этого механизма при условии, что она обусловлена увеличившимся количеством молекул РНК-полимеразы, вовлеченных в непродуктивную реакцию, а не увеличившейся скоростью образования одной фосфодиэфирной связи. Однако возможности использованного метода не позволяют с уверенностью утверждать, что между активацией абортивного и ингибированием продуктивного синтеза существует прямая связь.

Ограничения данного метода состоят в том, что, во-первых, изучение реакций абортивного и продуктивного синтеза проводится независимо и в разных условиях: абортивный синтез в присутствии только двух инициирующих субстратов, а продуктивный в присутствии всех четырех; во-вторых, при исследовании скорости продуктивного синтеза РНК сам процесс синтеза невозможно отделить от остальных стадий транскрипционного цикла, поэтому в экспериментально определяемую величину скорости синтеза РНК вносят вклад такие процессы, как терминация синтеза РНК, диссоциация элонгирующего комплекса, повторное комплексообразование фермента с промотором и т.д.

Метод однократной инициации транскрипции лишен этих недостатков. Он позволяет одновременно, в рамках одной биохимической пробы, наблюдать продукты как абортивного, так и продуктивного синтеза РНК. Это дает возможность анализировать и сопоставлять каталитические свойства инициирующего и элонгирующего комплексов, формируемых ферментом в идентичных условиях. Поэтому метод однократной инициации транскрипции и был выбран для дальнейших исследований. Суть метода состоит в том, что в реакционную пробу, содержащую предварительно сформированные полимераза - промоторные комплексы, одновременно добавляются субстраты, один из которых содержит радиоактивную метку, и гепарин. Гепарин эффективно связывается со свободной РНК-полимеразой и предотвращает возможность ее повторного взаимодействия с промотором, однако уже сформировавшиеся «открытые» комплексы начинают транскрипцию.

Используя метод однократной инициации транскрипции, синтез РНК осуществляли при температурах 21, 30 и 37°С и останавливали реакцию через 1, 10 и 30 минут. Продукты синтеза разделялись электрофоретически в ПААГ высокого разрешения. Оказалось, что при транскрипции исследуемой ДНК-матрицы образуется большое количество РНК-продуктов (рис.3). Их длина

была определена с помощью продуктов, полученных при добавлении в одну из реакционных проб З'-dATP, прерывающего синтез по положению AMP в цепи РНК. Короткие продукты длиной от 2 до 12 нуклеотидов синтезируются с участка матрицы, взаимодействующего с ферментом в составе инициирующего комплекса. Они являются продуктами абортивного синтеза. РНК, имеющие большую длину, синтезируются элонгирующим комплексом.

По мере увеличения времени синтеза от 1 до 30 минут увеличивается количество абортивных продуктов в пробе, т.е. эти продукты накапливаются (рис.3). Оказалось, что при 37°С по сравнению с и даже 30°С абортивных продуктов накапливается значительно больше. Это полностью соответствует данным, полученным с использованием флуоресцентного аналога ANS-y-UTP, и независимым образом свидетельствует об активации абортивного синтеза, осуществляемого с промотора T7D в физиологически оптимальном температурном диапазоне. Сам факт явного увеличения в течение времени количества абортивных продуктов, синтезируемых в условиях однократной инициации транскрипции в присутствии всех субстратов, означает, что часть комплексов, начавших абортивный синтез, не переходит к продуктивной реакции. Эти комплексы остаются инициирующими на протяжении всего экспериментального времени синтеза (от 1 до 30 мин.). Это указывает на

возможность одновременного существования двух, отличающихся по функциональным параметрам, типов инициирующих

транскрипционных комплексов, один из которых сохраняет способность в течение длительного времени осуществлять абортивный синтез олигонуклеотидов, в то время как второй легко превращается в элонгирующий комплекс и переходит к продуктивному синтезу РНК. Повышение температуры до 30°С и выше, по всей видимости, приводит к перераспределению этих двух типов комплексов, при этом доля комплексов, способных в течение длительного времени осуществлять абортивный синтез, значительно увеличивается.

Чтобы проверить это предположение, был

Рис. 3. Температурная зависимость динамики синтеза РНК с матрицы, контролируемой промотором T7D.

Данные получены методом однократной инициации транскрипции в условиях продуктивной реакции в присутствии всех четырех субстратов.

Крайняя дорожка слева соответствует набору продуктов, образующихся в результате включения в синтезируемую цепь З'-dATP, прерывающего синтез по положению AMP в РНК-продукте.

у 21°С 30°с 37°С

+17: +13:

Г М'ЗО'ПО'ЗО' Г 10'30' ВРЕМЯ СИНТЕЗА (МИН.)

м к

1708

636 532.

343 »

^0(15) -<

ь:

л/

1--

35 С'

25 С'

Рис. 4. Электрофоретическая подвижность комплексов РНК-полн-меразы с промотором Т7Ю, сформированных при разных температурах (негативное изображение).

К - РНК-полимераза - промоторные комплексы.

М - фрагменты ДНК, использованные для калибровки геля (фрагменты были получены после обработки ДНК фага X рестриктазой Р\и11). ЯРс - "закрытый" промоторный комплекс. ЯРо~ "открытый" промоторный комплекс.

использован метод задержки транскрипционных комплексов в геле. При фиксированной температуре метод позволяет регистрировать равновесное распределение различных типов полимераза - промоторных комплексов, соответствующих разным стадиям взаимодействия и имеющих разную электрофоретическую подвижность [Меэсаз е! а!., Шо1.Вю1., 220, 587, 1991]. При 25°С метод позволил зарегистрировать только один комплекс, отличающийся от ЯР с (образуется при низкой температуре) меньшей электрофоретической подвижностью (рис. 4). Топологический анализ показал, что в этих условиях фермент защищает от ДНКазы I протяженный участок промотора от -55 до —+30, а участок ДНК, прилегающий к стартовой точке транскрипции, является локально расплетенным [Масулис и др., Мол. биол., 32, 598, 1998]. Это означает, что комплекс, формирующийся при 25°С, является «открытым» (КРоО и способен осуществлять синтез РНК. При 35°С надежно регистрируется еще один «открытый» комплекс (ИРог), имеющий существенно меньшую

электрофоретическую подвижность по сравнению с Г1Ро1- По топологическим параметрам этот комплекс отличается от ИРо! характером взаимодействия фермента с

"ир5ггеаш"-областью промотора [Масулис И.С., автореферат канд. диссертации]. Таким образом, два типа «открытых» комплексов РНК-полимеразы с промотором Т7Б действительно существуют. Это находится в соответствии с предположением, сделанным на основании предыдущих данных.

Итак, для комплекса РНК-полимеразы с промотором Т7Б обнаружена не характерная для других промоторов зависимость функциональных параметров от температуры (рис. 1-4), следовательно, наблюдаемый ранее дополнительный конформационный переход комплекса РНК-полимеразы с промотором Т70, происходящий при температуре ~30°С, имеет функциональное значение. Причины такого молекулярного механизма активации промотора Т7Э, по-видимому, следует искать в особенностях первичной структуры этого промотора.

Промотор T7D содержит серию прямых повторов элемента CTTTAGG, расположенных симметрично относительно области -35 с периодом в 13 нуклеотидных пар (рис.5). Трек ТТТА, входящий в состав

-ПО -100 -90 -80 -70

AGGCGTCTTT AGGTCTGGTC TTTATGTAGT GTCTTTAGGT CTGGTCTTTA GQTCTGGTCI

-60 -50 -40 -30 -20 -10

TTATGTTTAA ACTTTAAGAT AGGCGTTGAC TAGATGGGTÇ 1ГШЮТСТА GGCTTTAGGT

+ 1 +10 +20 +30 +40 +50

gttggcttta ggatggacgt xaggaggtga ctttaggagg atactttagg agactgtaac

Pnc.5. Нуклеотндная последовательность промотора T7D.

Канонические области -10 и -35 подчеркнуты одной линией; повторяющиеся элементы

подчеркнуты двумя линиями.

элемента CTTTAGG, характеризуется меньшей шириной малой бороздки двойной спирали [Travers, Crit. Rev. Biochem., 22, 181, 1987]. Периодичность в расположении этого элемента может быть причиной сложной пространственной конфигурации промоторной ДНК. Наконец, наличие прямых повторов может привести к образованию однонитевых петель, обусловленных комплементарным взаимодействием между соседними элементами [Горгошидзе и др., Мол.биол., 26, 1263, 1992]. Температура способна влиять на пространственную структуру ДНК. Было проведено специальное исследование, которое показало, что повышение температуры влияет на локальные структурные особенности ДНК промотора T7D в "upstream''-области и, как следствие этого, приводит к реорганизации ее контактов с а-субъединицей фермента [Масулис И.С., автореферат канд. диссертации]. Сопоставление этих результатов с результатами, полученными в данной работе, позволяет понять причину наблюдаемой активации абортивной реакции. Локальные температурно - зависимые изменения в структуре промоторной ДНК в "upstream''-области приводят к модификации ее контактов с ферментом. В результате этого значительная часть инициирующих комплексов приобретает конформацию, способную в течение длительного времени осуществлять только абортивный синтез олигонуклеотидов. Цепь этих событий может лежать и в основе наблюдаемого подавления продуктивной реакции (рис.2), так как часть молекул фермента отвлекается от синтеза полноразмерного продукта. Однако не исключено, что на эффективность продуктивного синтеза РНК, осуществляемого с промотора T7D, оказывают влияние и другие факторы, в частности особенности нуклеотидной последовательности транскрибируемой ДНК. Чтобы проверить это предположение, было проведено специальное исследование.

а) Т7Э

-> +10 +20 +30 +40 +50 +60 +70

ссСТТТАССткттс;с;стттл ССатссаССТ ТАССасстса СТТТЛССасс лтаСТТТЛСС асасгсталс лсатассслс

ватага иьнммидц иытаыл и=зеэ еяежи

АСАСАСАСАС АСТСАЛССТА АСАСССАААС АСАААСССАА СССТСЛТССС СЛЛСССТТЛС ССААСССТСЛ АССТСААССС ААССТТСЛСТ ТТАССТСЛТТ СССТССССТТ ТЛССТАСССС СТЛТСССССЛ ЛСТТТАССТС ССТЛСАСТСТ СЛСА

б) ЭА82

-» +10 +20 +30 +40 +50 +60 +70

ссСТТТАССт вТГСССТТТЛ ССЛТССЛСГ.Т ТАССАССТСЛ СТТТАССЛСС ЛТЛСТТТАСС АСАСТСТААС АСЛТАСССЛС АСАСАСАСАС АС

в) ЭД82+

+10 +20 +30 +40 +50 +60 +70

ссСТТТАССт рТГСсСТТТА ССАТССАССТ ТАССасстса СТТТЛССАСС АТАСТТТАСС АСАСТСС77Т а ССТАССС АС АСАСАСАСАС АС

г) ЭД82

-> +10 +20 +30 +40 +50 +60 +70

СССТТТАССТ гТТСССТТТА ССАТССАССТ ТАССАССТСА СТТТЛССАСС АТАстттлсс лслстсТЛЛс АСАТЛСССЛС ЛСАСЛСЛСЛС ас

д) ОД82С42

-> +10 +20 +30 +40 +50 +60 +70

ссстттлсст еттсссТТТА с;слтс;<;лсс;Т ТАссасстса стттлсслсс ЛСАстттасс асастсТААс асатасссас асасасасас ас

е) БД82С58

-> +10 +20 +30 +40 +50 +60 +70

СССТТТАССТ яТТСССТТТЛ ССАТССАССТ ТАССАССТСА СТТТЛССАСС ЛТЛСПТАСС ЛСЛСТСТСАС АСАТАСССАС ЛСАСЛСЛСЛС АС

Рис. 6. Нуклсотидная последовательность транскрибируемой ДМК-матрниы, прилегающей к промотору Т7[).

а) полноразмерная матрица, содержащая 224 нуклеотидные пары (заштрихованными полосами показаны области, в которых наблюдались остановки синтеза РИК)

б) матрица, укороченная до положения +82 (повторяющиеся элементы СТТТЛОО выделены укрупненным шрифтом).

в) матрица, укороченная до положения +82 и содержащая дополнительный повторяющийся элемент СТТТЛОО, введенный с заданной периодичностью в положение +57/+63 (замененная область подчеркнута).

г) матрица, укороченная до положения +82 (А/Т-треки выделены укрупненным шрифтом).

д) матрица, укороченной до положения +82 и содержащая замену Т-»С в положении +42, которая устраняет А/Т-трск в этом месте (замененное основание подчеркнуто).

е) матрица, укороченная до положения +82 и содержащая замену Л->0 в положении +58, которая устраняет Л/Т-трск в этом месте (замененное основание подчеркнуто).

2. Зависимость свойств элонгнрующего комплекса от нуклеотндной последовательности прилегающей к промотору транскрибируемой ДНК

Анализ РНК-продуктов, синтезируемых с промотора T7D, свидетельствует о том, что, наряду с полноразмерной РЖ (224 нуклеотида), синтезируется большое количество укороченных продуктов (рис.3). В результате прерывания синтеза, обусловленного включением в цепь РНК 3'-dATP, можно достоверно определить длину синтезируемых РНК и, соответственно, участки на ДНК-матрице, приводящие к остановке синтеза. Оказалось, что в транскрибируемой области, прилегающей к промотору, элонгирующий комплекс останавливается в местах, соответствующих положению периодически повторяющегося элемента CTTTAGG (рис. 6а). Следовательно, наличие этого элемента или периодичность его расположения может оказывать влияние не только на свойства инициирующего комплекса, но и динамику синтеза РНК во время элонгации.

Для того, чтобы исследовать влияние периодичности в расположении элемента CTTTAGG на свойства элонгирующего комплекса, была использована видоизмененная матрица, содержащая один дополнительный сегмент CTTTAGG, помещенный в соответствии с естественным периодом (13 нуклеотидных пар) в область +57/+63 (рис.бв). Так как неоднократные попытки клонировать промотор T7D оказались безуспешными, мутантные конструкции получали в полимеразной цепной реакции (PCR). Эта технология требовала предварительного укорочения исходной матрицы, для того чтобы длина праймера была достаточной для введения желаемой замены. Исходная матрица была укорочена до положения +82 (рис.66). Укороченная матрица оказалась очень удобным контролем, так как при ее транскрипции наблюдалось значительно меньше остановок синтеза по сравнению с полноразмерной матрицей (рис. 7, DA82). Это, по-видимому, обусловлено тем, что в процессе укорочения были удалены участки ДНК, стабилизирующие некоторые особенности в структурной организации прилегающей к промотору части гена. При наличии в области +57/+63 дополнительного повторяющегося элемента восстанавливалась способность элонгирующего комплекса задерживаться в местах, первоначально выявленных для полноразмерной матрицы (рис.7, DA82+). Это означает, что:

- контролируемая промотором T7D транскрибируемая ДНК не является аморфной матрицей и подвержена кооперативным структурным перестройкам;

- процессивность элонгации для этой матрицы зависит от особенностей вторичной структуры транскрибируемой ДНК;

- периодичность расположения элемента CTTTAGG вносит вклад в формирование этих особенностей.

Учитывая возможность кооперативных перестроек в структуре исследуемой матрицы, нельзя было исключить вероятность того, что

структура ДНК в прилегающей к промотору области может влиять на динамические свойства элонгирующих комплексов опосредованно, т.е. через изменение структуры инициирующего комплекса. Поэтому структуры инициирующих комплексов РНК-полимеразы с промоторами DA82 и DA82+ были исследованы методом футпринтинга ДНКазой I (выявляет участки промотора, вступающие в контакт с РНК-полимеразой) и методом футпринтинга перманганатом калия (выявляет наличие локальных структурных деформаций в полимераза - промоторных комплексах). Эти методы не выявили никаких изменений топологических параметров «открытого» промоторного комплекса укороченной матрицы по сравнению с полноразмерной матрицей T7D. Но оказалось, что введение дополнительного повторяющегося элемента CTTTAGG в транскрибируемую часть гена влияет на структуру «открытого» промоторного комплекса (рис.8). Размер области контакта с ферментом и положение стартовой точки транскрипции не изменяются, однако анализ комплекса РНК-полимеразы с промотором DA82+ методом футпринтинга перманганатом калия выявил наличие дополнительных сайтов, гидролизуемых КМл04 (+10 и -37). Перманганат калия специфически модифицирует тимидины в однонитевых или

деформированных участках ДНК, имеющих нарушения стэкинга азотистых оснований, следовательно, появление дополнительных сайтов, гидролизуемых КМпС>4, свидетельствует о возникновении структурных деформаций, нарушающих стабильность двойной спирали в области контакта с ферментом в «открытом» промоторном комплексе.

Рис. 7. Зависимость свойств элонгирующего комплекса от периодичности расположения повторяющегося элемента CTTTAGG.

Данные получены методом однократной инициации транскрипции в условиях продуктивной реакции при температуре 21°С.

T7D - полноразмерная транскрибируемая матрица, содержащая 224 нуклеотидные пары. DA82 - матрица, укороченная до положения +82 DA82+ - матрица, укороченная до положения +82 и содержащая дополнительный повторяющийся элемент CTTTAGG, введенный с заданной периодичностью в положение +57/+63.

Крайняя дорожка слева соответствует набору РНК-продуктов, которые образуются при транскрипции матрицы DA82 в результате включения в синтезируемую цепь З'-dATP

T7D

+81 :> К «83

+75 > +65 > '

+53 = ; +48 >

-5. .

S4HI* $ а

+38 > -

+30 > -

+25 > ~ +22 > "

+17 > •»

+13 г-

-а-

1' 2' 5'15' 1' Т 545' 1' 2' 5'15' ВРЕМЯ СИНТЕЗА (мии)

Jffl-u.1 mr„o ДНКшя! JMnO,

DA 82 DA 82+

Рис. 8. Зависимость структу ры комплексов РНК-полнмеразы с промотором T7D от периодичности расположения повторяющегося элемента CTTTAGG в прилегающей к промотору транскрибируемой области.

DA82 - фрагмент ДНК, содержащий T7D промотор с укороченной до положения +82 транскрибируемой матрицей.

D482+ - фрагмент ДНК, содержащий T7D промотор с укороченной до положения +82 транскрибируемой матрицей, в которую введен дополнительный повторяющийся элемент CTTTAGG.

Горизонтальными скобками отмечены дорожки, на которые были нанесены пробы, содержащие свободную ДНК (РНК-пол.-) или полимераза - промоторные комплексы (РНК-полЛ), обработанные ДНКазой I или КМп04 соответственно.

G - продукты гуанин - специфического гидролиза, служащие маркерами. Вертикальными скобками отмечена область контакта с РНК-полимеразой.

Это значит, что периодичность в расположении элемента CTTTAGG в прилегающей к промотору транскрибируемой части гена влияет на динамические свойства элонгирующего комплекса и на структуру ДНК в составе инициирующего комплекса. Это важный экспериментальный факт, свидетельствующий о том, что структура транскрибируемой ДНК может влиять на динамические свойства элонгирующего комплекса опосредованно, через изменение структуры инициирующего комплекса.

Следующим шагом в данной работе было изучение вопроса о том, каким образом на свойства элонгирующего комплекса может влиять элемент CTTTAGG сам по себе.

Из опубликованных данных известно, что наиболее весомыми факторами, которые могут дестабилизировать элонгирующий комплекс и

приводить к остановкам транскрипции, являются низкая стабильность РНК-ДНК гибрида, который образуется вблизи каталитического центра РНК-полимеразы, и наличие вторичной структуры на 3'-конце РНК-продукта [Nudler, J. Mol. Biol., 288, 1-12, 1999]. При прохождении РНК-полимеразой участка CTTTAGG возможно образование слабой вторичной структуры РНК на З'-конце из-за комплементарного спаривания ChUcGhA, а содержащийся в последовательности CTTTAGG трек ТТТА может быть причиной низкой стабильности формируемого на этих участках РНК-ДНК гибрида. И полноразмерная, и укороченная матрицы содержат одинаковые повторяющиеся элементы CTTTAGG, однако при транскрипции укороченной матрицы наблюдается значительно меньше остановок (рис.7). Кроме этого, ближайший к положению +26 повторяющийся элемент отличается от остальных на одно основание: CGTTAGG вместо CTTTAGG (рис.6). Замена Т на G повышает прочность РНК-ДНК гибрида и уменьшает вероятность образования вторичной структуры РНК. Соответственно, вероятность остановки РНК-полимеразы вблизи этого места должна была бы также уменьшиться, однако результат оказался противоположным, т.е. остановка элонгирующего комплекса вблизи положения +26 является наиболее стабильной и не зависит от генетических манипуляций с матрицей (рис.7). Все эти данные свидетельствуют о том, что остановки элонгирующего комплекса, наблюдаемые при транскрипции исследуемой матрицы, нельзя объяснить с помощью таких факторов, как низкая стабильность РНК-ДНК гибрида и образование вторичной структуры на конце РНК-продукта.

Не исключено, что влияние элемента CTTTAGG на свойства элонгирующего комплекса может быть обусловлено еще одной причиной, которая заключается в следующем. Элемент СТТТА, входящий в состав повторяющегося сегмента CTTTAGG, является также составной частью неканонического элемента промоторной ДНК СТТТАС, выявленного методом кластерного анализа в "upstream"- области промоторов [Ozoline et al., Nucí. Acids Res., 25, 4703, 1997]. Именно этот элемент находится на границе поверхности контакта фермента с промотором и, следовательно, он способен вступать во взаимодействие с РНК-полимеразой. Кроме этого, фермент эффективно взаимодействует с А/Т-богатыми участками, расположенными вблизи положений -55 и -45 у многих промоторов, и с каноническим элементом -10. Таким образом, наличие А/Т-трека (нуклеотидной последовательности, состоящей только из оснований А и Т) в структуре повторяющегося элемента может быть причиной его временного взаимодействия с РНК-полимеразой и влиять на динамику ее поступательного движения при транскрипции исследуемой матрицы. В таком случае, это свойство РНК-полимеразы должно иметь значение и для транскрипции других генов, а распределение А/Т-богатых участков в копируемых последовательностях не должно быть случайным. Поэтому было решено более детально проанализировать характер распределения А/Т-пар в

-«О -40 -20

80 100 120

Э <

ь.

ы §

о ь-

415 промоторов

промоторной ДНК и прилегающей к промотору транскрибируемой части генов.

Для этого методами статистического анализа было исследовано 415 негомологичных промоторных последовательностей, включающих участок от положения -70 до +150. Нуклеотидные последовательности были переведены в двухбуквенный код, в котором \У=А/Т, а 8=С/С, и исследованы методом кластерного анализа с использованием компьютерной программы СИЛБТ, созданной А.А.Деевым. Программа сравнивала и классифицировала короткие сегменты нуклеотидной последовательности заданной длины в заданном участке промотора. Анализ проводился для разных длин сегментов: от 2 до 10 нуклеотидных пар во всех точках промоторной и около-промоторной ДНК. Кластерный анализ показал, что распределение А/Т- и О/С-пар является неслучайным, как в собственно промоторной, так и в транскрибируемой около-промоторной части генов. Во всех положениях, где наблюдались пики этого неслучайного распределения (-63/-62, -54/-53, -45/-44, -29, -12, +5/6, +23, +40, +56), доминирующей была только одна группа, состоящая исключительно из А/Т-треков, а не какие-то более сложные комбинации А/Т и О/С-пар. Эта закономерность затем была полностью подтверждена методом

консенсусного анализа (рис. 9А). Было показано, что специфический характер распределения А/Т-пар в кодирующей части гена справедлив только для треков длиной, по крайней мере, 3 нуклеотида. Одиночные А/Т-пары и динуклеотиды распределены в транскрибируемой части генов совершенно случайным образом. На рис. 9В и 9С показаны две контрольные гистограммы: распределение эквивалентных О/С-треков в промоторной ДНК и распределение А/Т-треков в непромо-торной ДНК. Видно, что промоторы обеднены в/Сонарами, особенно в положениях, соответствующих максимумам гистограммы на рис 9А.

Локальные максимумы в распределении А/Т-треков находятся на разных расстояниях друг от друга, однако, начиная с канонического элемента -10,

|А1 1«

Ю.

- ЮЖ-жлпжжаулхзп: пл-л:

-60 -40 -20

[В]

1С]

60 И 100 120

415 промоторов

20 4 0 60 »0 100 120

415 фрагментов ДНК р=\\ЛУ\У\У\У

-40 -20 0 20 40 61 10 100

ПОЛОЖЕНИЕ 5'-НУКЛЕОТИДА

Рис. 9. Гистограммы распределения сегмента, содержащего 5 последовательных А/Т-пар в промоторной [А] II непромоторной [С] ДНК, и распределение 5 последовательных С/С-пар в промоторной ДНК [В].

при переходе в транскрибируемую часть гена они расположены регулярно, с периодом, приблизительно равным 16-18 нуклеотидных пар. Это расстояние численно равно длине спейсера (расстоянию между каноническими элементами -10 и -35) и не соответствует внутренней периодичности ДНК. С точки зрения статистики максимумы в распределении АУТ-пар, характерные для транскрибируемой части генов, чрезвычайно достоверны. Во всех случаях число промоторов, имеющих эти элементы, превышает теоретически ожидаемое количество, исходя из их случайного распределения, по крайней мере на 5 стандартных отклонений. Таким образом, в структуре прилегающей к промотору части генов была выявлена совершенно неизвестная ранее особенность. Функциональное значение выявленного свойства пока совершенно не исследовано.

Промотор т7в содержит А/Т-треки вблизи всех оптимальных положений в транскрибируемой области (+6, +23, +40, +56) (рис.бг). Треки, находящиеся рядом с положениями +6 и +23, являются также и составной частью периодически повторяющегося элемента СЛГАвО. Триплеты А41ТА и Т57АА не являются составной частью повторяющегося сегмента СТТТАСО, и вблизи этих положений не наблюдалось значительных остановок транскрипции (рис. 7). Это позволило исследовать влияние АЛГ-треков на динамику синтеза РНК-продукта в этих областях с помощью направленного мутагенеза. В качестве исходной была использована укороченная матрица.

Были получены две мутантные конструкции, одна из которых содержала точечную замену в положении +42 (Т -» С), а другая в положении +58 (А-> в). Обе замены

Рис. 10. Зависимость свойств элонгируюше-го комплекса от характера распределения А/Т-треков в прилегающей к промотору области.

БД82 - матрица, укороченная до положения +82, которая содержит А/Т-треки вблизи всех оптимальных положений.

ОД82С« - матрица, содержащая замену Т->С в положении +42, которая устраняет А/Т-трек в этом месте.

ОД82С58 - матрица, содержащая замену А->0 в положении +58, которая устраняет А/Т-трек в этом месте.

Крайняя дорожка справа соответствует набору РНК-продуктов, которые образуются при транскрипции матрицы Ой$2 в результате включения в синтезируемую цепь З'-ЙАТР

ОД82 ОД82С42 ОД82С58 5

V, ^

'»4 - Г ы

с +81 «= +75 +<5

-=+53 *<+48

- -=+38

- с+30

-» <+25

- <+22

- <+17 •» +13

Г 2' 5' 15' 1' 2* 5' 15' 1' 2' У 15' ВРЕМЯ СИНТЕЗА (ивм)

устраняли А/Т-треки в указанных положениях (рис.бд и бе).

Оказалось, что обе мутации влияют на динамику синтеза РНК в участках, прилегающих к измененному сайту (рис. 10). Так, замена Т+42 —» С способствует остановкам элонгирующего комплекса в положениях +43/+45, которые не наблюдаются на исходной матрице и отличаются от мест остановок синтеза РНК (+45/+49) на нативной (полноразмерной) матрице (рис.7). Аналогичное изменение наблюдается также в области второй замены (рис. 10). Обе точечные замены никоим образом не могут способствовать понижению стабильности РНК-ДНК гибрида или образованию вторичной структуры РНК на З'-конце. Следовательно, полученные данные свидетельствуют о том, что характер распределения А/Т-пар в транскрибируемой части гена влияет на свойства элонгирующего комплекса. Механизм этого влияния пока неясен и требует специального исследования. В качестве рабочих моделей можно предложить следующие:

1. Учитывая высокое сродство РНК-полимеразы к богатой А/Т-парами ДНК, можно предположить, что регулярно расположенные в прилегающей к промотору транскрибируемой части генов А/Т-треки могут использоваться РНК-полимеразой для модуляции ее прочных контактов с промоторной ДНК в процессе перехода транскрипционных комплексов к продуктивному синтезу РНК. В таком случае, отсутствие А/Т-трека в оптимальных положениях может привести к остановкам синтеза РНК. Результаты, полученные в данной работе с использованием мутантных матриц ОД82С42 и ОД82С58 (рис.10),

свидетельствуют в пользу этого предположения.

2. Можно предположить, что регулярно расположенные в транскрибируемой части генов А/Т-треки могут использоваться ферментом для его оптимальной ориентации на промоторе. В таком случае, сделанные в исследуемой матрице замены должны

Рис. 11. Зависимость структуры комплексов РНК-полимеразы с промотором Т7Б от характера распределения А/Т-треков в прилегающей к промотору области.

Горизонтальными скобками отмечены дорожки, на которые были нанесены пробы, содержащие свободную ДНК (РНК-пол-) или полимераза - промоторные комплексы (РНК-по.1+), обработанные ДНКазой I или КМп04 соответственно.

О - продукты гуанин - специфического гидролиза, служащие маркерами.

Вертикальными скобками отмечена область контакта с РНК-полимеразой.

ЛНКиг! ОЬО, ' - ♦ ,Г+~' " ГНКг»04

+11- * . ■и-11

-24- ? -43- *

» ;

-58- __ ^ .

ткж*

,1» 4

+П-

I - ■»

-ц-$5 ?

-24- = «

^ >

-43- '.1

-58-

ОА82

ЬЛ 82С42

повлиять на характер взаимодействия РНК-полимеразы с промотором.

На рис. 11 представлены данные футпринтинга инициирующего транскрипционного комплекса, содержащего исходную матрицу, служащую контролем, и матрицу с заменой в положении +42. Доступными для модификации перманганатом калия являются одни и те же тимидины в структуре обоих промоторов. Это свидетельствует о том, что мутация не влияет на положение стартовой точки транскрипции. Одинаковым оказался размер контактной поверхности исследуемых промоторов с РНК-полимеразой. Однако расположение гиперчувствительных к ДНКазе сайтов отличалось. Для исходной матрицы выявляется гиперчувствительный сайт в положении -46, который слабо выражен для мутантной матрицы. В свою очередь, для мутантной матрицы наблюдается гиперчувствительность для пар -24 и -23. Эти данные свидетельствуют о том, что характер распределения А/Т-треков в прилегающей к промотору транскрибируемой области гена влияет на структуру инициирующего комплекса. Таким образом, подтверждается высказанное выше предположение о том, что регулярно расположенные в транскрибируемой части генов А/Т-треки могут использоваться ферментом для его оптимальной ориентации на промоторе. Исследования в этом направлении могут привести к новым результатам, позволяющим более полно раскрыть функциональную роль периодичного распределения А/Т-треков в прилегающей к промотору области генов, но в любом случае, полученные в этой работе данные указывают на необходимость учета свойств около-промоторной ДНК (наличие повторяющихся элементов, А/Т- треков) при формулировке общих принципов организации промоторных участков ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Доказано функциональное значение конформационного перехода комплекса РНК-полимеразы Е. coli с промотором T7D, происходящего при температуре -30°С. Показано, что при физиологической температуре (35-37°С) одновременно существуют два типа инициирующих транскрипционных комплексов, различающихся между собой по эффективности перехода к продуктивному синтезу РНК, следовательно, регуляция транскрипции отдельных генов может осуществляться с помощью этого физико -химического фактора.

2. Показано, что в процессе продуктивного синтеза РНК, инициированного с промотора T7D, происходит множество остановок транскрипции. Картированы места остановок. Показано, что в прилегающей к промотору транскрибируемой области они соответствуют положению периодически повторяющегося элемента CTTTAGG.

3. Показано, что на свойства элонгирующего комплекса влияет структура протяженного участка транскрибируемой ДНК, в частности делеция и вставка элементов, способных участвовать в формировании вторичных структур.

4. Выявлена неизвестная ранее особенность в структурной организации прилегающей к промотору транскрибируемой части генов, которая заключается в периодичном распределении А/Т-треков, и показано возможное влияние этих элементов на динамику синтеза РНК.

Список публикаций по материалам диссертации

1. О.Н.Озолинь, И.С.Масулис, В.В.Часов, Н.Н.Демина, С.Г.Камзолова. Структурно - функциональный анализ промотора T7D и его комплекса с РНК-полимеразой E.coli // Известия Академии наук. Серия химическая, 1995, №7, с. 1369-1374.

2. I.S.Masulis, O.N.Ozoline, V.V.Chasov. Structural - functional relationships in T7D promoter functioning II Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995, v.8, №4, p. 194-195.

3. O.N.Ozoline, I.S.Masulis, V.V.Chasov, A.Ishihama. Functional topology of the bacterial RNA polymerase II Spectroscopy ofBiologyca] Molecules: Modern Trends //Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1997, p.l63 - 164.

4. O.H. Озолинь, И.С. Масулис, B.B. Часов. Структурная характеристика промоторов T7D и Т7А1 и их комплексов с РНК-полимеразой Е. coli II Материалы Второго Съезда Биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997 года, Москва, с.92-93.

5. И.С.Масулис, В.В. Часов, Е.Г.Костяницына, О.Н. Озолинь. Некоторые аспекты белково - нуклеинового узнавания в процессе инициации транскрипции II Молекулярная биология, 1998, No 4, с. 598 - 602.

6. В.В. Часов, И.С. Масулис, О.Н. Озолинь. Особенности элонгации транскрипции, инициированной на промоторе D ДНК фага Т7 // Материалы Н-го Съезда биофизиков России, 22 - 27 августа 1999 года, Москва, с.180-181.

7. O.N. Ozoline, А.А. Deev, M.V. Arkhipova, V.V. Chasov, A. Travers. Proximal transcribed regions of bacterial promoters have a поп - random distribution of AJT tracts II Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, p. 4768-4774.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Часов, Виталий Васильевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая физико - химическая и энзиматическая характеристика РНК- 6 полимеразы Е.соП

2. Характеристика процесса транскрипции

2.1. Образование специфических комплексов РНК-полимеразы с промотором

2.1.1. Структурная организация промоторов

2.1.2. Характеристика процесса комплексообразования РНК-полимеразы с 16 промотором

2.1.3. Регуляция процесса комплексообразования РНК-полимеразы с промотором с 18 помощью внешних факторов

2.2. Инициация транскрипции

2.3. Элонгация транскрипции 23 2.3 .1. Характер движения РНК-полимеразы во время элонгации и факторы, определяющие стабильность элонгирующего комплекса

2.3.2. Регуляция процесса элонгации цепи РНК с помощью внешних факторов

2.4. Терминация транскрипции

2.4.1. Общая характеристика процесса терминации транскрипции

2.4.2. Роль динамики синтеза РНК в регуляции экспрессии генов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности первичной структуры транскрибируемой ДНК как фактор регуляции транскрипции"

Клетки одноклеточных организмов постоянно находятся в контакте с окружающей средой и непосредственно подвержены действию ее изменяющихся физико - химических факторов. Следовательно, они должны обладать мощными системами контроля, обеспечивающими их быстрый рост в благоприятных условиях и эффективное выживание в неблагоприятных. Для оптимального жизнеобеспечения клетки система синтеза ключевых макромолекул должна поддерживаться в стабильном и строго сбалансированном состоянии, поэтому необходимо наличие множественных регуляторных систем, чувствительных к изменяющимся факторам и оперативно обеспечивающих экспрессию востребованного набора генов. Для этого бактериальные клетки используют разнообразные регуляторные системы, значительная часть которых функционирует во время транскрипции.

Эффективность транскрипции индивидуальных генов контролируется на всех стадиях транскрипционного цикла. В течение многих лет основное внимание исследователей было направлено на изучение механизмов регуляции транскрипции, действующих при взаимодействии РНК-полимеразы со специальными сигнальными участками ДНК: промоторами и терминаторами, расположенными, соответственно, в начале и в конце каждого гена или оперона. Эти участки ДНК имеют общие для разных генов особенности в их структурной организации и могут быть идентифицированы с помощью специальных алгоритмов. Копируемые во время транскрипции нуклеотидные последовательности генов строго индивидуальны. Тем не менее, они также содержат некоторые структурные особенности, которые прямо или опосредованно влияют на локальную скорость транскрипции и, проявляя зависимость от физико-химических факторов среды, могут приводить к существенному замедлению или даже остановке синтеза РНК. Изучение структуры транскрибируемой области генов может предоставить ценную информацию как о механизмах регуляции транскрипции, действующих на стадии элонгации, так и об эволюции регуляторных сигналов, закодированных в нуклеотидной последовательности ДНК-матрицы и синтезируемого РНК-продукта.

В рамках данного исследования, предпринятого с использованием современных экспериментальных и статистических методов, удалось выявить неизвестную ранее общую особенность в первичной структуре прилегающей к промотору транскрибируемой части генов, которая может быть потенциально значимой для динамики перехода транскрипционного комплекса к продуктивному синтезу РНК и использоваться транскрипционным аппаратом в качестве дополнительного элемента, обеспечивающего координированную регуляцию экспрессии генов. Полученные данные указывают на необходимость учета свойств прилегающей к промотору транскрибируемой части генов при формулировке общих принципов организации промоторных участков ДНК и могут быть использованы для построения усовершенствованных алгоритмов поиска промоторов и создания эффективных искусственных конструкций для генно-инженерных работ.

Актуальность предпринятого исследования обусловлена фундаментальной значимостью принципов белково - нуклеинового взаимодействия и ключевой ролью процесса транскрипции в регуляции клеточного метаболизма.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Уровень экспрессии индивидуальных генов контролируется на всех стадиях транскрипционного цикла с использованием самых разнообразных механизмов. Наиболее мощные механизмы действуют на стадии комплексообразования фермента транскрипции РНК-полимеразы с промоторными участками разных генов. Эти механизмы определяют частоту актов инициации транскрипции. Наряду с этим, в настоящее время выявлены многочисленные факты, свидетельствующие о том, что продуктивный синтез РНК не является монотонной реакцией. Механизмы регуляции транскрипции, действующие на стадии элонгации, на сегодняшний день являются предметом пристального внимания исследователей. На основе имеющегося материала предложен ряд структурно -функциональных моделей организации элонгирующего комплекса, с помощью которых анализируются причины, способные привести к временным или необратимым остановкам синтеза РНК. Эти модели будут подробно рассмотрены в предлагаемом обзоре. Данные, характеризующие РНК-полимеразу, а также наиболее изученный процесс её комплексообразования с промоторными участками ДНК, будут приведены в объеме, необходимом для понимания основного материала.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Часов, Виталий Васильевич

выводы

1. Доказано функциональное значение конформационного перехода комплекса РНК-полимеразы Е. coli с промотором T7D, происходящего при температуре ~30°С. Показано, что при физиологической температуре (35-37°С) одновременно существуют два типа инициирующих транскрипционных комплексов, различающихся между собой по эффективности перехода к продуктивному синтезу РНК, следовательно, регуляция транскрипции отдельных генов может осуществляться с помощью этого физико -химического фактора.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ключевая роль транскрипции в экспрессии генетической информации и в адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям среды определяет актуальность всестороннего исследования этого процесса. Из всех стадий транскрипционного цикла наименее изученной является стадия элонгации. Так, факторы, определяющие устойчивость комплекса к диссоциации при высочайшей скорости и точности копирования матрицы, до сих пор остаются предметом дискуссии, а механизмы регуляции транскрипции, действующие на стадии элонгации, в последние годы привлекают все большее внимание исследователей. Во время элонгации транскрипции РНК-полимераза способна узнавать и отвечать на внутренние регуляторные сигналы, закодированные в нуклеотидной последовательности ДНК-матрицы и синтезируемого РНК-продукта. Итогом ответа на сигнал может быть временная или необратимая остановка синтеза РНК. При этом уровень имеющихся в настоящее время знаний о структуре элонгирующего транскрипционного комплекса не позволяет в полной мере объяснить молекулярные механизмы, приводящие к этим остановкам. Существующие молекулярно-биологические методы исследования элонгирующих комплексов связаны с необходимостью фиксации транскрипционного комплекса в заданном положении, что, в большинстве случаев, является технически сложной задачей. Это требует развития новых и более широкого применения доступных биофизических и статистических методов исследования. В частности, в отличие от промоторной части генов, нуклеотидные последовательности транскрибируемой области генов не были исследованы статистически.

В данной работе были рассмотрены две возможности регуляции процесса транскрипции, приводящие к снижению выхода полноразмерного РНК-продукта. Так, в ходе работы было установлено, что температурные условия являются фактором, определяющим соотношение двух типов инициирующих транскрипционных комплексов РНК-полимеразы Е.соН с промотором Т7Б. Эти комплексы различаются между собой по функциональным и структурным характеристикам. Один из них сохраняет способность в течение длительного времени осуществлять абортивный синтез коротких олигонуклеотидов, в то время как второй легко превращается в элонгирующий комплекс и переходит к продуктивному синтезу РНК. Цепь этих событий лежит в основе подавления продуктивной реакции, так как часть молекул фермента отвлекается от синтеза полноразмерного продукта.

Полученные на первом этапе данные послужили поводом для более детального исследования свойств элонгирующих комплексов. Это позволило зарегистрировать многочисленные остановки транскрипции, не характерные для большинства промоторов. Было установлено, что причиной этих остановок являются особенности структурной организации транскрибируемой ДНК. Остановки синтеза РНК также снижают эффективность выхода полноразмерного РНК-продукта.

С помощью статистического анализа проводился поиск общих закономерностей в структуре прилегающих к промотору нуклеотидных последовательностей ДНК, потенциально значимых для динамики перехода транскрипционного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Это позволило выявить неизвестную ранее особенность в структуре прилегающей к промотору транскрибируемой части генов, которая заключается в преимущественном присутствии А/Т-треков в нескольких характерных положениях.

Была предпринята попытка выяснить функциональное значение этих элементов, благодаря чему показано их влияние на свойства элонгирующих комплексов. Полученные данные определяют область предполагаемых дальнейших исследований и указывают на необходимость учета свойств прилегающей к промотору транскрибируемой области генов при формулировке общих принципов организации промоторных участков ДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Часов, Виталий Васильевич, Пущино

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. (1994). Молекулярная биология клетки, Москва, Мир, т.2, с. 184-186.

2. Бродолин К.Л., Студитский В.М., Мирзабеков А.Д. (1993). Исследования структуры РНК-лолимеразы E.Coli и ее комплекса с lacUV5 промотором с помощью белок белковых и ДНК-белковых сшивок, образуемых формальдегидом, Молекулярная биология, 27, 1085-1092.

3. Горгошидзе М.З., Минят Э.Е., Горин A.A., Демчук Е.Я., Фарутин В.А., Иванов В.И. (1992). SLS новый тип укладки полинуклеотидной цепи, Молекулярная биология, 26, 1263-1273.

4. Камзолова С.Г., Озолинь О.Н. (1980). Роль уЗ-субъединицы РНК-полимеразы в регуляции активности гена, Молекулярная биология, 14, 759-765.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984). Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.-М. :Мир.

6. Масулис И.С., Часов В.В., Костяницына Е.Г., Озолинь О.Н. (1998). Некоторые аспекты белково нуклеинового узнавания в процессе инициации транскрипции, Молекулярная биология, 32, 598-602.

7. Никифоров В.Г. (1987). РНК-полимераза бактерий: сравнительные исследования, Успехи микробиологии, 21, 105-151.

8. Озолинь О.Н., Утешев Т. А., Камзолова С.Г. (1988). РНК-полимераза рифампицин устойчивого мутанта E.coli имеет измененную селективность к промоторам ДНК фага Т7, Молекулярная биология, 22, 384-392.

9. Aso Т., Lane W.S., Conaway J.W. Conaway R.C. (1995). Elongin (SIII): a multisubunit regulator of elongation by RNA polymerase II, Science, 269, 1439-1443.

10. Auble D.T., Allen T.L., Haseth PL. (1986). Promoter recognition by E.coli RNA polymerase. Effect of substitutions in the spacer DNA separating the -10 and -35 regions, J. Biol. Chem., 261, 11202-11206.

11. Bardeleben C., Kassavetis G.A., Geiduschek E.P. (1994). Encounters of Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase III with its transcription factors during RNA chain elongation, J. Mol. Biol., 235, 1193-1205.

12. Basby S., Ebright R. (1994). Promoter structure, promoter recognition, and transcription activation in procaryotes, Cell, 79, 743-746.

13. Belyaeva T., Griffiths L., Minchin S.,Cole J., Busby S. (1993). The E.coli CysG promoter belongs to the "extended -10" class of bacterial promoters, Biochem. J., 296, 851-857.

14. Berg D., Barrett K., Chamberlin M. (1971). Purification of two forms of E.coli RNA polymerase and of sigma component. In: Meth. Enzymol. Moldave K., Grossman L. Eds., 21, 506-519, Academic Press, New York.

15. Bertrand-Burgraff E., Lefevre J.F., Danne M. (1984). A new experimental approach for studying the association between RNA polymerase and the tet promoter of pBR322, Nucleic Acids Research, 12, 1697-1707.

16. Bertrand-Burgraff E., Dunand J., Fuchs R.P.P., Lefevre J.F. (1990). Kinetic studies of the modulation of ada promoter activity by upstream elements, the EMBO J., 9, 2265-2271.

17. Bossi L. and Smith D.M. (1984). Conformational change in the DNA associated with an unusual promoter mutation in the tRNA operon of Salmonella, Cell, 39, 643-652.

18. Brunner M. and Bujard H. (1987). Promoter recognition and promoter strength in the E. coli system, the EMBO J., 6, 3139-3145.

19. Buc H. and McClure W.R (1985). Kinetic of open complex formation between E.coli RNA polymerase and the lacUV5 promoter, Biochemistry, 24, 2712-2723.

20. Burgess R.R. and Jendrisak J.J. (1975). A procedure for the rapid, large-scale purification of E.coli RNA polymerase involving polymin P precipitation and DNA-cellulose chromatography, Biochemistry, 14, 4634-4638.

21. Burns C.M., Richardson L.V., Richardson J.P (1998). Combinatorial effects of NusA and NusG on transcription elongation and r/zo-dependent termination in E.coli, J. Mol. Biol., 278, 307-316.

22. Burova E., Hung S.C., Sagitov V., Stitt B.L., Gottesman M.E. (1995). E.coli NusG protein stimulates transcription elongation rates in vivo and in vitro, J. Bacteriology, 177, 13881392.

23. Burova E. and Gottesman M.E. (1995). NusG overexpression inhibits Wzo-dependent termination in E.coli, Mol. Microbiol., 17, 633-641.

24. Busby S. and Ebright R. (1994). Promoter structure, promoter recognition and transcription activation in procaryotes, Cell, 79, 743-746.

25. Carpousis A. J. and Gralla J. D. (1980). Cycling of ribonucleic acid polymerase to produce oligonucleotides during initiation in vitro at the lacUVS promoter, Biochemistry, 19, 3245-3253.

26. Chamberlin M.J. and Nierman W.C. (1979). A quantitative assay for bacterial RNA polymerase, J. Biol. Chem., 254, 10061-10069.

27. Chamberlin M.J. (1995). New models for the mechanism of transcription elongation and its regulation, Harvey Lect. ,88, 1-21.

28. Chan B., Busby S. (1989). Recognition of nucleotide sequences at the Escherichia coli galactose operon PI promoter by RNA polymerase, Gene, 84, 227-236.

29. Chan B., Spassky A., Busby S. (1990). The organization of open complex between E.coli RNA polymerase and DNA fragments carrying promoter galPl either with or without consensus -35 region sequences, Biochemical J., 270, 141-148.

30. Chan C.L. and Landick R. (1989). The Salmonella typhimuriiim his operon leader region contains an RNA hairpin-dependent transcription pause site, J. Biol. Chem., 264, 20796-20804.

31. Chan C.L. and Landick R. (1997). Effects of neutral salts on RNA chain elongation and pausing by E.coli RNA polymerase, J. Mol. Biol., 268, 37-53.

32. Cowing D.W., Mecsas J., Record M.T. Jr., Gross C.A. (1989). Intermediates in the formation of the open complex by RNA polymerase holoenzyme containing the sigma factor sigma 32 at the groE promoter, J. Mol. Biol., 210, 521-531.

33. Darst S.A., KubalekE.W., Kornberg R.D. (1989). Three-dimensional structure of E.Coli RNA polymerase holoenzyme determined by electronic crystallography, Nature, 340, 730-732.

34. Darst S.A., Edwards A.M., Kubalek E.W., Kornberg R.D. (1991). Three-dimensional structure of yeast RNA polymerase II at 16A resolution, Cell, 66, 121-128.

35. Darst S.A., Polyakov A., Richter C., Zhang G. (1998). Insights into Escherichia coli RNA polymerase structure from a combination of X-ray and electron crystallography, J. struct, biol, 124,115-122.

36. Das A. (1993). Control of transcription termination by RNA-binding proteins, Annu. Rev. Biochem62, 893-930.

37. Debenham P.G., Pongs O., Travers A.A. (1980). Formylmethionyl tRNA alters RNA polymerase specificity, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 870-874.

38. Dudda R., Hart P. (1973). Pattern recognition and scene analysis, New York.

39. Duval Valentin G. and Ehrlich R. (1986) Interaction between E.coli RNA polymerase and the TetR promoter frompsClOl, Nucl. Acids Res., 14, 1967-1983.

40. Ebright R. and Busby S. (1995). The E.coli RNA polymerase a subunit: structure and function, Current Opinion in Genetics and Development, 5, 197-203.

41. Ellinger T., Behnke D., Bujard H. Gralla ID. (1994). Stalling of coli RNA polymerase in the +6 to +12 region in vivo is associated with tight binding to consensus promoter elements, J. Mol Biol., 239, 455-465.

42. Farnham P.J. and Platt T. (1980). A model for transcription termination suggested by studies on the trp attenuator in vitro using base analogs, Cell, 20, 739-748.81

43. Fujita N. and Ishihama A (1996). Reconstitution of RNA polymerase, Methods Enzymol., 173,121-130.

44. Gaal T., Ross W., Blatter E E., Tang H., Jia X., Krishnan V.V., Assa Munt N., Ebright R.H., Gourse R.L. (1996). DNA-binding determinants of the alpha subunit of RNA polymerase: novel DNA-binding domain architecture, Genes Dev., 10, 16-26.

45. Gamper H.B. and Hearst J.E. (1982). A topological model for transcription based on unwinding angle analysis of E.Coli RNA polymerase binary, initiation and ternary complexes, Cell, 29, 81-90.

46. Glass R.E., Jones S T., Nene V., Nomura T., Fujita N, Ishihama A. (1986). Genetic studies on the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Localisation of a region involved in promoter selectivity, Mol. Gen. Genet., 203, 487-491.

47. Gourse R.L., d Boer H.A., Nomura M. (1986). DNA determinants of rRNA synthesis in E.coli: growth rate dependent regulation, feedback inhibition, upstream activation, antitermination, Cell, 44, 197-205.

48. Gragerov A.I. (1986). Cold sensitive mutations in /? and /T-subunit genes affecting the interaction of RNA polymerase with promoters, Mol. Gen. Genet., 203, 399-403.

49. Gralla J.D., Carpousis A.J., Stefano J.E. (1980). Productive and abortive initiation of transcription in vitro at the lacUV5 promoter, Biochemistry, 19, 5864-5869.

50. Gross G., Fields D.A., Bautz E.K.F. (1976). Characterization of a tsfi mutant RNA polymerase of E.coli, Mol. Gen. Genet., 147,337-341.

51. Gu W., Wind M., Reines D. (1996). Increased accomodation of nascent RNA in a product site on RNA polymerase II during arrest, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 6935-6940.

52. Guajardo R. and Sousa R (1997). A model for the mechanism of Polymerase translocation, J. Mol. Biol, 265, 8-19.

53. Hanna M.M. and Meares C.F. (1983). Topography of transcription path: the leading end of nascent RNA through the E.Coli transcription complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 42384242.

54. Harley B. and Reinolds R.P. (1987). Analysis of E.coli promoter sequences, Nucl. Acids Res., 15, 2343-2361.

55. Hawley D.K. and McClure W.R. (1983). Compilation and analysis of E.coli promoter RNA sequences, Nucl. Acids Res., 11, 2237-2255.

56. Helmann J.D. and Chamberlin M.J. (1988). Structure and function of bacterial sigma factors, Annual Rev. Biochem., 57, 839-872.

57. Hofer B., Muller D., Koster H. (1985). The pathway of E.coli RNA polymerase -promoter complex formation as visualized by footprinting, Nncl. Acids Res., 13, 5995-6013.

58. Horton N., Lewis M., Lu P. (1997). Escherichia coli lac repressor lac operator interaction and the influence of allosteric effectors, J. Mol. Biol., 265, 1-7.

59. Horwitz A.H., Morandi C., Wilcox G. (1980). Deoxiribonucleic acid sequence of araBAD promoter mutants of E.coli,./. Bacterial., 142, 659-667.

60. Jacquet M.A. and Ehrlich R. (1985). In vivo and in vitro effect of mutations in tetA promoter from psClOl: insertion of poly dA/dT stretch in the spacer region does not inactivate the promoter, Biochimie, 67, 987-997.

61. Jeon Y.H., Negishi T., Shirakawa M., Yamazaki T., Fujita N., Ishihama A., Kyogoku Y. (1995). Solution structure of the activator contact domain of the RNA polymerase alpha subunit, Science, 270, 1495-1497.

62. Jeon C. and Agarwal K. (1996). Fidelity of RNA polymerase II transcription controlled by elongations factor TFIIS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13677-13682.

63. Jin D.J. (1994). Slippage synthesis at the galP2 promoter of Escherichia coli and its regulation by UTP concentration and cAMP receptor protein, J. Biol. Chem., 269, 17221-17227.

64. Jin D. J. and Turabough C.L. (1994). An E.coli RNA polymerase defective in transcription due to its overproduction of abortive initiation products, J. Mol. Biol., 236, 72-80.

65. Jin D.J. (1996). A mutant RNA polymerase reveals a kinetic mechanism for the switch between nonproductive stuttering synthesis and productive initiation during promoter clearance, J. Biol. Chem., 271, 11659-11667.

66. Julicher F. and Bruinsma R. (1998). Motion of RNA polymerase along DNA: a stochastic model, Biophysical J., 74, 1169-1185.

67. Kadesch T., Rosenberg S., Chamberlin M.J. (1982). Binding of E.coli RNA polymerase holoenzyme to bacteriophage T7 DNA, J. Mol. Biol., 155, 1-29.

68. Kainz M., Roberts J.W. (1995). Kinetic of RNA polymerase initiation and pausing at the lambda late gene promoter in vivo, J. Mol. Biol., 254, 808-814.

69. Kainz M. and Gourse R. (1998). The C-terminal domain of the alpha subunit of E.Coli RNA polymerase is required for efficient Äfto-dependent transcription termination, J. Mol. Biol., 284, 1379-1390.

70. Kammerer W., Deuschle U., Gentz R., Bujard H. (1986). Functional dissection of E.coli promoters: information in the transcribed region is involved in the late steps of the overall process, EMBO J., 5, 2995-3000.

71. Keene R.G., Luse D.S. (1999). Initially transcribed sequences strongly affect the extent of abortive initiation by RNA polymerase II, J. Biol. Chem., 274, 11526-11534.

72. Keller E.B., Calvo J.M. (1979). Alternative secondary structures of leader RNAs and the regulation of the trp, phe, his, thr, leu operons, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 6186-6190.

73. Kingston R.E., Nierman W.C., Chamberlin M.J. (1981). A direct effect of guanosine tetraphosphate on pausing of Escherichia coli RNA polymerase during RNA chain elongation, J.Biol. Chem., 256, 2787-2797.

74. Kingston R.E., Chamberlin M.J. (1981). Pausing and attenuation of in vitro transcription in the rrrtB operon of E. coli, Cell, 27, 523-531.

75. Knaus R. and Bujard H. (1988). PL of coliphage lambda: an alternative solution for an efficient promoter, the EMBO J., 7, 2919-2923.

76. Komissarova N. and Kashlev M. (1997a). Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 1755-1760.

77. Komissarova N. and Kashlev M. (1997b). RNA polymerase switches between inactivated and activated states by translocating back and forth along the DNA and the RNA, J. Biol. Chem., 272, 15329-15338.

78. Krohn M. and Wagner R. (1996). Transcriptional pausing of RNA polymerase in the presence of guanosine tetraphosphate depends on the promoter and gene sequence, J. Biol. Chem., 271, 23884-23894.

79. Krummel B. and Chamberlin M. (1989). RNA chain initiation by E.Coli RNA polymerase structural transition of the enzyme in early ternary complexes, Biochemistry, 28, 7828-7842.

80. Krummel B. and Chamberlin M. (1992). Structural analysis of ternary comlexes of E.coli RNA polymerase. Individual complexes halted along different transcription units have distinct and unexpected biochemical properties, J. Mol. Biol., 225, 221-234.

81. Kubori T. and Shimamoto N. (1996). A branched pathway in the early stage of transcription by E.coli RNA polymerase, J. Mol. Biol., 256, 449-457.

82. Malhotra A., Severinova E., Darst S.A. (1996). Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E.coli RNA polymerase, Cell, 87, 127-136.

83. Margalit H., Shapiro B.A., Nussinov R, Owens J., Jernigan R.L. (1988). Helix stability in procaryotic promoter regions, Biochemistry, 27, 5179-5188.

84. Mason S.W., Li J., Greenblatt J. (1992). Host factor requirements for processive antitermination of transcription and suppresion of pausing by the N protein of bacteriophage X, J. Biol. Chem., 267, 19418-19426.

85. McAllister C.F. and Achberger E.C. (1988). Effect of polyadenine containing curved DNA on promoter utilization in Bacillus subtilis, J. Biol. Chem., 263, 11743-11749.

86. McClure W.R., Cech C.L. (1978). On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis, J. Biol. Chem., 253, 8949-8956.

87. Meilhammer R. (1975). Effect of bacteriophage T4-indused modification of E.coli RNA polymerase on gene expression in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 4928-4932.

88. Mescas J., Cowing D.W., Gross C.A. (1991). Development of RNA polymerase -promoter contacts during open complex formation, J. Mol. Biol., 220, 587-597.

89. Mindlin S.Z., Ilyina T.S., Voeykova T.A., Velkov W (1972). Genetical analysis of rifampicin resistant mutants of E.Coli K12, Molec. Gener. Genet, 115, 115-121.

90. Mooney R.A., Artsimovich I. and Landick R. (1998). Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation, J. Bacteriology, 180, 3265-3275.

91. Mote J. Jr., Reines D. (1998). Recognition of a human arrest site is conserved between RNA polymerase II and prokaryotic RNA polymerases, J. Biol. Chem., 273, 16843-16852.

92. Mukherjee K. and Chatteiji D. (1997). Studies on the omega subunit of E. coli RNA polymerase its role in the recovery of denatured enzyme activity, Eur. J. Biochem., 247, 884889.

93. Munson L. M. and Reznikoff W. S. (1981). Abortive initiation and long ribonucleic acid synthesis,Biochemistry, 20, 2081-2085.

94. Murakami K., Fujita N., Ishihama A. (1996). Transcription factor recognition surface on RNA polymerase alpha subunit is involved in contact with the DNA enhancer element, The EMBOJ., 15, 4358-4367.

95. Nehrke K.W. and Piatt T. (1994). A quarternary transcription termination complex: reciprocal stabilization by rho factor and NusG protein, J. Mol. Biol., 243, 830-839.

96. Negishi T., Fujita N., Ishihama A. (1995). Structural map of the alpha subunit of E.coli RNA polymerase: structural domains identified by proteolytic cleavage, J. Mol. Biol., 248, 723728.

97. Nomura T., Fujita N., Ishihama A. (1986). Promoter selectivity of E.coli RNA polymerase: alteration by fMet tRNA, Nucl. Acids Res., 14, 6857-6870.

98. Nudler E., Goldfarb A., Kashlev M. (1994). Discontinuous mechanism of transcription elongation, Science, 265, 793-796.

99. Nudler E., Kashlev M., Nikiforov V., Goldfarb A. (1995). Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming, Cell, 81, 351-357.

100. Nudler E., Avetissova E., Markovtsov V., Goldfarb A. (1996). Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex, Science, 273, 211-217.

101. Nudler E., Mustaev A., Lukhtanov E., Goldfarb A. (1997). The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase, Cell, 89, 33-41.

102. Nudler E., Gusarov I., Avetissova E., Kozlov M., Goldfarb A. (1998). Spatial organisation of transcription elongation complex in Escherichia coli, Science, 281, 424-428.

103. Nudler E. (1999). Transcription elongation: structural basis and mechanisms, J. Mol. Biol, 288, 1-12.

104. O'Neill M.C. (1989). E.coli promoters. Consensus as it relates to spacing class, specificity, repeat structures and three dimensional organization, J. Biol. Chem., 264, 55225530.

105. O'Neill M.C. and Chiafari. (1989). E.coli promoters. A spacing class -dependent promoter search protocol, J. Biol. Chem., 264, 5531-5534.

106. OrphanidesG., LeRoy G., Chang C.H., Luse D.S., Reinberg D. (1998). FACT, a factor, that facilitates transcript elongation through nucleosomes, Cell, 92, 105-116.

107. Ozoline ON, Uteshev T.A., Kamzolova S.G. (1991). Specific modification of E.coli RNA polymerase with monomercury derivative of fluorescein acetate, BBA, 1076, 387-394.

108. Ozoline O.N. Uteshev T.A., Masulis I.S., Kamzolova S.G. (1993). Interaction of bacterial RNA polymerase with two different promoters of phage T7 DNA. Conformational analysis, BBA, 1172, 251-261.

109. Ozoline O.N., Tsyganov MA. (1995). Structure of open promoter complexes with E.coli RNA polymerase as revealed by the DNAse I footprinting technique: compilation analysis, Nucl. Acids Res., 23, 4533-4541.

110. Ozoline O.N., Deev A.A., Arkhipova M.V. (1997). Non-canonical sequence elements in the promoter structure. Cluster analysis of promoters recognized by E.coli RNA polymerase, Nucl. Acids Res., 25, 4703-4709.

111. Oxender D.L., Zarawski G., Yanofsky. (1979). Attenuation in the Escherichia coli tryptophan operon: role of RNA secondary structure involving the tryptophan codon region, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 5524-5528.

112. Platt T. (1994). Rho and RNA: models for recognition and response, Mol. Microbiol., 11, 983-990.

113. Polyakov A., Severinova E. and Darst S. (1995). Three-dimentional structure of E.Coli core RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme, Cell, 83, 365-373.

114. Primakoff P., Artz S.W. (1979). Positive control of lac operon expression in vitro by guanosine 5"-diphosphate 3'- diphosphate, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1726-1730.

115. Puhler G., Leffers H., Gropp F., Palm P., Klenk H.P., Lottspeich F., Garrett R.A., Zillig W. (1989). Archaebacterial DNA-dependent RNA polymerases testify to the evolution of the eukariotic nuclear genome, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 4569-4573.

116. Qi F., Turnbough C.L.Jr. (1995). Regulation of codBA operon expression in E.coli by UTP-dependent reiterative transcription and UTP-sensitive transcriptional site switching, J. Mol. Biol., 254, 552-565.

117. Reeder T.C. and Hawley D.K. (1996). Promoter proximal sequences modulate RNA polymerase II elongation by a novel mechanism, Cell, 87, 767-777.

118. Rice G.A., Kane C.M., Chamberlin M.J. (1991). Footprinting analysis of mammalian RNA polymerase II along its transcript: an alternative view of transcription elongation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4245-4249.

119. Richardson J.P. (1993). Transcription termination, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28, 130.

120. Richardson J.P. (1996). Structural organization of transcription termination factor rho, J. Biol. Chem., 271, 1251-1254.

121. Ring B.Z., Yarnell W.S., Roberts J.W. (1996). Function of E.coli RNA polymerase a factor d" in promoter proximal pausing, Cell, 86, 485-494.

122. Roberts C.W. and Roberts J.W. (1996). Base-specific recognition of the nontemplate strand of promoter DNA by E.coli RNA polymerase, Cell, 86,495-501.

123. Roberts J.W. (1996). Transcription termination and its control. In Regulation of gene expression in E.coli, p.27-45, R.G. Landes Company, Austin, TX.

124. Roe J.H., Burgess R.R., Record M.T. (1985). Temperature dependence of the rate constant of the E.coli RNA polymerase XPR promoter interaction, J. Mol. Biol., 184, 441-455.

125. Rokeach L.A., Kassavetis G.A., Zyskind J.W. (1987). RNA polymerase pauses in vitro within the Escherichia coli origin of replication at the same sites where termination occurs in vivo, J. Biol. Chem., 262, 7264-7272.

126. Rosenberg S., Kadesch T.R., Chamberlin M.J. (1982). Binding of E.coli RNA polymerase holoenzyme to bacteriophage T7 DNA, J. Mol. Biol., 155, 31-51.

127. Ross W., Gosink K.K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K, Gourse R.L. (1993). A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase, Science, 262, 1407-1413.

128. Rudd K.E., Bochner B.R., Cashel M., Roth J.R. (1985). Mutations in the spoT gene of Salmonella typhimurium: effects on his operon expression, J. Bacteriol., 163, 534-542.

129. Samkurashvili I. and Luse D.S. (1996). Translocation and transcriptional arrest during transcript elongation by RNA polymerase II, J. Biol. Chem., 271, 23495-23505.

130. Savery N.J., Rhodius V.A., Wing H.J., Busby S.J. (1995). Transcription activation at E.coli promoters dependent on the cyclic AMP receptor protein: effects of binding sequences for the RNA polymerase alpha subunit, Biochem. J., 309, 77-83.

131. Schickor P., Metzger W., Werel W., Lederer H., Heumann H. (1990). Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli, The EMBO J., 9, 2215-2220.

132. Schultz P., Calia H., Riva M., Sentenac A., Oudet P. (1993). Three-dimensional model of yeast RNA polymerase I determined by electron microscopy of two-dimensional crystals, The EMBOJ., 12, 2601-2607.

133. Schmidt M.C., Chamberlin M.J. (1984a). Amplification and isolation of Escherichia coli nusA protein and studies of its effects on in vitro RNA chain elongation, Biochemistry, 23, 197203.

134. Schmidt M.C., Chamberlin M.J. (1984b). Binding of rho factor to Escherichia coli RNA polymerase mediated by misA protein, J. Biol. Chem., 259, 15000-15002.

135. Schmidt M.C., Chamberlin M.J. (1987). NusA protein ofE.coli is an efficient transcription termination factor for certain terminator sites, J. Mol. Biol., 195, 809-818.

136. Severinov K., Mustaev A., Severinova E., Bass I., Kashlev M., Landick R, Nikiforov V., Goldfarb A., Darst S.A. (1995). Assembly of functional E.coli RNA polymerase containing beta subunit fragments, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 4591-4595.

137. Severinov K., Mooney R, Darst S.A., Landick R. (1997). Tethering of the large subunits of E.coh RNA polymerase, J. Biol Chem., 272, 24137-24140.

138. Severinova E., Severinov K., Fenew D., Marr M., Brody E.N., Roberts J.W., Chait B.T., Darst S.A. (1996). Domain organization of the E.coli RNA polymerase sigma 70 subunit, J. Mol. Biol., 263, 637-647.

139. Siebenlist U., Simpson R, Gilbert W. (1980). E.coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters, Cell, 20, 269-281.

140. Sigmund C.D. and Morgan E.A (1988). NusA protein affects transcriptional pausing and termination in vitro by binding to different sites on the transcription complex, Biochemistry, 27, 5622-5627.

141. Spassky A., Kirkegaard, Buc H. (1985). Changes in the DNA structure of the lacUV5 promoter during formation of an open complex with E.coli RNA polymerase, Biochemistry, 24, 2723-2731.

142. Stefano J.E., Gralla J.D. (1980). Kinetic investigation of the mechanism of RNA polymerase binding to mutant lac promoters, J. Biol. Chem., 255, 10423-10430.

143. Straney D.C., Crothers D.M. (1985). Intermediates in transcription initiation from the E.coli lacUVS promoter, Cell, 43, 449-459.

144. Studitsky V.M., Kassavetis G.A., Geiduschek E.P., Felsenfeld G. (1997). Mechanism of transcription through the nucleosome by eukaryotic RNA polymerase, Science, 278, 1960-1963.

145. Sugiura M., Segawa K., Yoshinaga K., Fujio Y., Tto N. (1977). A temperature sensitive mutant of E.coli with an altered RNA polymerase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 739745.

146. Sujatha S., Chatteiji D. (1999). Detection of putative Zn(II) binding sites within Escherichia coli RNA polymerase: inconsistency between sequence-based prediction and 65Zn blotting, FEBSLett., 454, 169-171.

147. Sullivan S.L. and Gottesman M.E. (1992). Requirement for E.coli NusG protein in factor dependent transcription termination, Cell, 68, 989-994.

148. Sweetser D., Nonet M., Young R. (1987). Procariotic and eucariotic RNA polymerases have homologous core subunits, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 1192-1196.

149. Szoke P.A., Allen T.L., Haseth P.L. (1987). Promoter recognition by E.coli RNA polymerase. Effects of base substitutions in the -10 and -35 regions, Biochemistry, 26, 61886194.

150. Travers A. (1984). Conserved features of coordinately regulated Escherichia coli promoters, Nucl. Acids Res., 12, 2605-2618.

151. Travers A. (1987). Structure and function of E.coli promoter DNA, CRC Crit. Rev. in Biochem., v.12, iss. 3, 181-219.

152. Travers A. (1991). DNA binding and kinking sequence dependence and function, Current opinion in structural biology, 1, 114-122.

153. Tu A.H., Turnbough C.L.J. (1997). Regulation of upp expression in Escherichia coli by UTP-sensitive selection of transcriptional start sites coupled with UTP-dependent reiterative transcription, J. Bacteriol., 179, 6665-6673.

154. Uptain S.M., Chamberlin M.J. (1997). Escherichia coli RNA polymerase terminates transcription efficiently at r/zo-independent terminators on single-stranded DNA templates, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 13548-13553.

155. Uptain S.M., Kane C., Chamberlin M.J. (1997). Basic mechanisms of elongation and its regulation,^«/?«. Rev. Biochem., 66, 117-172.

156. Walstrom K.M., Dozono J.M., von Hippel P.H. (1997). Kinetics of the RNA-DNA helicase activity of E.coli transcription termination factor rho. Processivity, ATP consumption and RNA binding, Biochemistry, 36, 7993-8004.

157. Walter G., Zillig W., Palm P., Fuch E. (1967). Initiation of DNA-dependent RNA synthesis and the effect of heparin on RNA polymerase, Eur. J. Biochem., 3, 194-201.

158. Wang M.D., Meier T.I., Chan C.L., Feng G., Lee D.N., Landick R. (1995). Discontinuous movements of DNA and RNA in RNA polymerase accompany formation of a paused transcription complex, Cell, 81, 341-350.

159. Wang M D., Schnitzer M.J., Yin H., Landick R., Gelles J., Block S.M. (1998). Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase, Science, 282, 902-907.

160. Wang Hong-Yun, Elston T., Mogilner A., Oster G. (1998). Force generation in RNA polymerase, Biophysical J., 74, 1186-1202.

161. Whipple F.W., Sonenshein A.L. (1992). Mechanism of initiation of transcription by Bacillus subtilis RNA polymerase at several promoters, J. Mol. Biol., 223, 399-414.

162. Williams R. and Chamberlin M. (1977). Electron microscope studies of transient complexes formed between E.Coli RNA polymerase to DNA, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 3740-3744.

163. Wilson K.S., Conant C.R., von Hippel P H. (1999). Determinants of the stability of transcription elongation complexes: interactions of the nascent RNA with the DNA template and the RNA polymerase, J. Mol. Biol., 289, 1179-1194.

164. Winkler M.E.and Yanofsky C. (1981). Pausing of RNA polymerase during in vitro transcription of the tryptophan operon leader region, Biochemistry, 20, 3738-3744.

165. Woody A.J.M., Woody R.W., Malcolm A.D.B. (1987). Effect of ppGpp on transcription by DNA dependent RNA polymerase from E.coli: circular dichroism, absorption and specific transcription studies, Biophys. Biochem. Acta, 909, 115-126.

166. Yager T.D. and von Hippel P.H. (1987). Transcript elongation and termination in E.Coli. In Escherichia Coli and Salmonella typhimurium, Washington, D.C.: American Society for microbiology, 1241-1275.

167. Yager T.D. and von Hippel P.H. (1991). A thermodynamic analysis of RNA transcript elongation and termination in E.Coli, Biochemistry, 30, 1097-1118.

168. Yang X. and Roberts J.W. (1989). Gene Q antitermination protein of E.coli phages 82 and A suppress pausing by RNA polymerase at a p-dependent terminator and other sites, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 86, 5301-5305.

169. Zhang G, Darst S.A. (1998). Structure of the E.coli RNA polymerase alpha subunit amino terminal domain, Science, 281, 262-266.

170. Zhang G., Campbell E.A., Minakhin L., Richter C., Severinov K, Darst S.A. (1999). Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3A resolution, Cell, 98, 811824.

171. Zillig W., Palm R, Hell A. (1976). Function and reassembly of subunits of DNA-dependent RNA-polymerase. In: RNA polymerase (ed. Losick and Chamberlin), Cold Spring Harbor lab., p. 101-125.

Информация о работе

Часов, Виталий Васильевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2000
ВАК 03.00.02

Диссертация

Особенности первичной структуры транскрибируемой ДНК как фактор регуляции транскрипции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы