Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.)

Загоскина, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.)
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ.К.А. ТИМИРЯЗЕВА

Р Г f) О А На "Р^3* РУКОПИСИ

ЗАГОСКИНА Наталья Викторовна

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ГЕТЕРОТРОФНЫХ И ФОТОКИКСОТРО«ШХ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ ( Camellia sinensis L.)

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997

- г -

Работа выполнена в лаборатории вторичного метаболизма Института физиологии растении им.К.А.Тимирязева Российской академии наук

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор Ы.Н.Запрометов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.А.Пасешииченко доктор биологических наук, профессор А.М.Носов доктор биологических наук В.В.Мазин '

Ведущая организация: Главный ботанический сад им.Н.В.Цицина Российской академии наук, Москва

Защита диссертации состоится 'У^-"" j2.it (е^р-У 1998 г. в 11 час. на заседании диссертационного совета Д.002.45.01 при Институте физиологии растений им.К. А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая , 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан декабря 1997 г.

И.о.ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук Ю.В.Балнокин

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из характерных особенностей высших растений является их способность к синтезу так называемых "вторичных соединений". Важное место среди них принадлежит чрезвычайно разнообразным по своей структуре фенольным соединениям, свойственным практически всем растительным тканям.

Фенольные соединения в недалеком прошлом считали конечными продуктами обмена ( метаболическими"отходами"), тогда как сейчас, в свете современных взглядов на физиологию, биохимию и молекулярную биологию растений, их относят к необходимым и активным клеточным метаболитам. Установлено их участие во многих окислительно-восстановительных процессах, в регуляции ряда ферментативных реакций , в процессах фотосинтеза, роста, развития и репродукции, а также в построении клеточных стенок, защите растений от механических повреждений и внедрения патогенов , в качестве сигнальных компонентов при взаимодействии с микроорганизмами и др. ( Курсанов, 1952; Запрометов, 1964, 1993; Oettmeier et. al., 1972; Harborne, 1982, 1994; Rhodes, 1985; Heilemann et.al, 1988; Matern, Kneusel, 1988; Strack, 1988).

Фенольные соединения имеют и важное практическое значение. На их окислительных превращениях основаны технологические процессы в ряде отраслей пищевой промышленности. В медицине они используются в качестве лекарственных препаратов капилляроукреп-ляющего, противовоспалительного, антисклеротического, противолучевого, противоопухолевого и иного действия (Запрометов, 1964; Барабой, 1976; Минаева, 1978).

В образовании фенольных соединений принимают участие шикиматный и ацетато-малонатный (поликетидный) пути биосинтеза. По шикиматному пути из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата происходит образование простейших фенольных соединений (протокатеховой и галловой кислот) и ароматических аминокислот (L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана). Эти аминокислоты в дальнейшем используются как на синтез белка, так и фенольных соединений, а также и некоторых других веществ ( Davis, 1955; Запрометов, 1974; Crawford, 1975; Boudet et.al., 1985). До 60% всей биомассы растений синтезируется с использование углерода шикиматного пути (Jensen, 1986). Помимо шикиматного пути,

используемого, главным образом, для синтеза фенилпропаноидов и лигнина, в образовании фенольных соединений, а именно флавоноидов, принимает участие и ацетато-малонатный путь , связаный с метаболизмом жирных кислот. Из малонил-КоА ( с промежуточным образованием подикетида) образуется кольцо А молекул флавонидов, а из продуктов шикиматного пути - кольцо В (Grisebach, 1962; Запрометов, 1964).

В изучении биосинтеза фенольных соединений к настоящему времени достигнуты значительные успехи : выяснены основные этапы, выделены и исследованы многие ферменты, принимающие участие в этих процессах, а также изучена их внутриклеточная локализация (Запрометов,1964,1993; Gross,1981; Hah1brock,1981; Grisebach, 1984; Hrazdina, Wagner,1985; Haslam,1986; Harborne,1989).

В тоже время до сих пор не ясны механизмы регулирующие накопление фенольных соединений в тканях и клетках растений, а также причины приводящие к изменениям в их образовании. Имеющийся по этому вопросу фактический материал носит большей частью эмпирический характер и ограничивается, главным образом, данными по отдельным их классам , не касаясь рассмотрения всей совокупности синтезируемых в клетках фенольных соединений ( как мономерных, так и полимерных ). Знание же количественных закономерностей образования разнообразных по своей структуре фенольных соединений и выяснение первопричин возникновения изменений в этих процессах имеет существенное теоретическое и практическое значение.

Для изучения этих вопросов успешно используются клеточные культуры растений, сохраняющие способность к синтезу некоторых характерных для интактного растения фенольных соединений (Butcher, 1977; Dicosmo, Towers, 1983; Hinderer, Seitz, 1988; Stafford, 1991). Удобство этих культур определяется достаточной их однородностью, быстрым ростом , отсутствием влияния других тканей и органов , а также всего растения в целом (Бутенко, 1964). Стерильные условия выращивания культур позволяют строго контролировать режимы их питания и воздействия других факторов (освещение, температура и т.п.).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение особенностей фенольного метаболизма растительных клеток, отличающихся уровнем структурной организации, и поиск

факторов, определяющих их биосинтетическую способность, используя для этого обладающие интенсивным фенольным метаболизмом растения чая , а также инициированные из них гетеротрофные и фотомиксотрофные каллусные культуры.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности фенольного метаболизма, в листьях и стеблях растений чая, используя для этой цели определение активности ключевого фермента этого процесса, а именно L-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ), а также образование мономерных ( фенилпропаноиды, флавоноиды) и полимерных (лигнин) фенольных соединений и изучение их состава.

2. Выяснить изменения в фенольном метаболизме происходящие при введении листа и стебля чайного растения в культуру in vitro.

3. Выяснить влияние некоторых эпигенетических и генетических факторов на способность каллусных культур чайного растения к образованию фенольных соединений.

4. Изучить действие света на фенольный метаболизм каллусных культур чайного растения и оценить вклад хлоропластов в синтез различных классов фенольных соединений.

Научная новизна исследований. Впервые проведено изучение особенностей образования различных классов фенольных соединений (фенилпропаноидов, флавоноидов, лигнина) у тканей и клеток растений, отличающихся уровнем их структурной организации , на примере растений чая, характеризующихся специализированным обменом направленным на синтез и накопление веществ фенольной природы, а также инициированных из него гетротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур.

Выявлены различия в фенольном метаболизме листьев и стеблей 3-листных побегов чайного растения . В листьях интенсивность образования фенольных соединений выше, чем в стеблях, что особенно. четко проявляется в отношении образования фенилпропаноидов и флавоноидов (катехинов и флавонолов) и в значительно меньшей степени лигнина. При этом уровень активности ФАЛ не является критерием биосинтетической способности тканей чайного растения к синтезу фенольных соединений.

Показано, что введение листьев и стеблей чайного растения в культуру in vitro и выращивание их в гетротрофных (темновых) условиях приводит к- значительным изменениям в фенольном

;

метаболизме , что проявляется , как в ослаблении синтеза мономерных фенольных соединений (фенилпропаноидов и флавоноидов) на фоне увеличения синтеза полимерных ( лигнин) форм, так и в изменении качественного состава.

В каллусных культурах комплекс мономерных фенольных соединений значительно беднее по сравнению с исходными эксплантами, приближаясь к таковому корней исходного растения. В нем присутствуют, главным образом, типичные для чайного растения флаваны ( как катехины, так и проантоцианидины), а также оксибензойные кислоты, но теряется способность к образованию галловой кислоты, галлоильных эфиров катехинов и флаво'нол-гликозидов.

Лигнин каллусных культур, по своему строению также отличается от такового интактных растений и приближается к более простому типу лигнина, близкому к лигнину травянистых растений.

Доказано, что в каллусных культурах чайного растения способность . к синтезу фенольных соединений , особенно фенилпропаноидов и флавоноидов, зависит от состава их клеточных популяций. В случае преобладания у них характерных для интактного растения клеток с диплоидным набором хромосом (2п=30) способность к синтезу мономерных фенольных соединений выше, чем у культур содержащих клетки более высокого уровня плоидности (три- и тетра-плоидные).

Впервые показано, что образование еще одного класса характерных для чайного растения флавоноидов, а именно флавонолов ( агликоны кверцетин и кемпферол), происходит лишь после длительного выращивания калллусных культур в условиях освещения и формирования в них хлоропластов, что свидетельствует об их участии в образовании этих фенольных соединений. Установлена зависимость образования фенольных соединений от количества хлоропластов и их ультраструктурной организации.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют прежде всего теоретическое значение, расширяя наши представления о механизмах регуляции синтеза фенольных соединений в клетках растений.

Получение каллусных культур чайного растения, выяснение особенностей образования в них катехинов, установление влияния плоидности на биосинтетическую способность клеток, , а такке

селекция штаммов, сохраняющих достаточно высокую способность к синтезу флаванов.в том числе и катехинов, обладающих Р-витаминной активностью, может найти применение в промышленной биотехнологии.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и демонстрировались на III, IV, V Всесоюзных симпозиумах по фенольным соединениям (Тбилиси, 1976; Ташкент, 1982; Таллин, 1987); IV, V и VII Всесоюзных (Международных) конференциях "Культура клеток растений и биотехнология" (Кишинев, 1983; Новосибирск, 1988; Москва, 1997); Международном симпозиуме "Качество чая - здоровье человечества" (Китай, 1987); IV Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" ( Киев, 1988); VI конгрессе Федерации общества физиологов растений (Югославия, 1988); конференции " Фотосинтез и продукционный процесс" (Саратов, 1989 ); II, III съездах Всеоюзного общества физиологов растений ( Шнек, 1990 ; Санкт-Петербург, 1994 ); III, IV Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995, 1997), ежегодных симпозиумах "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996; Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 40 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием объектов и методов исследования, трех глав с изложением и анализом результатов, заключения и выводов. Работа содержит 12 таблиц, 46 рисунков и список цитируемой литературы, включающий 300 ссылок, в том числе 240 иностранных.

Исследования по теме диссертации выполнены в лаборатории вторичного метаболизма Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН в период с 1980 по 1996 г.г. В экспериментальной части работы принимали участие Г.А.Субботина (электронно-микроскопические исследования), В.Г.Федосеева (цитогенетические исследования), H.A.Азаренкова, а также В.В.Елкин и О.В.Любавина (Институт органической химии им.Н.Д.Зелинского РАН; изучение состава лигнинов), которым автор выражает глубокую признательность .

- 3 -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объекты. Объектами исследования являлись листья и молодые неодревесневшие стебли растений чая (Camellia sinensis L.), а также инициированные из них каллусные культуры, выращиваемые в темноте или при непрерывном или 16-час. освещении (3600 люкс) на модифицированной питательной среде Хеллера, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту ( 5 мг/л) , дрожжевой экстракт (1 г/л), глюкозу (25 г/л) и агар ( 7 г /л) (Корецкая, Запрометов, 1975). Для повышения уровня плоидности культур использовали их обработку колхицином (0,1% или 0,03%).

Методы. Рост каллусных культур оценивали по ростовому индексу ( прирост сырой биомассы тканей за определенные периоды времени) , содержанию воды ( высушивание тканей до постоянного веса при 105°) и митотической активности.

Размеры клеток, митотический индекс и число хромосом на метафазных пластинках определяли на фиксированном смесью Карнуа растительном материале, обработанном 1%-ным раствором пектиназы и окрашенном гематоксилином (Загоскина и др., 1994) .

Исследование внутриклеточной локализации фенольных соединений проводили на фиксированном формалином материале, используя реакции с хлорным железом ( на сумму растворимых фенольных соединений), с ванилиновым реактивом ( на флаваны -катехины и проантоцианидины) и с флороглюциновым реактивом ( на лигнин) (Запрометов и др., 1979 ).

Для электронно-микроскопических исследований ткани фиксировали глютаровым альдегидом (2,5%) с добавлением кофеина (1%) в Na-фосфатным буфере (рН 6,8) (Стрекова и др., 1989). Ультрамикротомные срезы подкрашивали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца.

Содержание хлорофилла а и b определяли в этанольных экстрактах растительного материала спектрофотометрическим методом ( поглощение при 665 и 649 нм, соответственно) . Количество пигментов рассчитывали с использованием коэффициентов, найденных Смитом и Бенитезом (Шлык, 1971).

Количественное определение растворимых фенольных соединений

осуществляли спектрофотометрическими методами после их извлечения из лиофильно высушенного материала экстракцией 96%-ным этанолом. Содержание суммы растворимых фенольных соединений определяли с помощью реактива Фолина-Дениса (поглощение при 725 нм), содержание флаванов - с использование 1%-ного раствора ванилина в 707.-ной H2SO4 (поглощение при 500 нм) ( Запрометов, 1971). Содержание флавонолов определяли по реакции с 1%-ным водным раствором AICL3 (поглощение при 415 нм ) (Gage, Wendel, 1950).

Для определения содержания лигнина лиофильно высушенный материал последовательно экстрагировали этанолом, смесью этанол+бензол (1:2) , эфиром и горячей водой (Запрометов и др., 1979). Свободный от экстрактивных веществ остаток подвергали гидролизу 0,5 н NaDH ( 36 час., 80°) и в полученнной после центрифугирований (3000 об/мин, 10 минут) надосадочной фракции проводили спектрофотометрическое определение содержания лигнина (610 нм) по реакции с 2,6-дихлорхинонхлоримидом (Carceller et al.,1971).

Изучение состава фенольных соединений проводили с помощью бумажной, тонкослойной и колоночной хроматографии, качественных реакций, УФ-спектроскопии, а также других общепринятых методов (Mabry et. al., 1970; Harborne, 1976; Запрометов, 1974 и др.). Состав фенолкарбоновых кислот ( в виде их триметилсилильных производных, полученных обработкой бис-триметилсилилтрифторацет-амидом) исследовали методом газожидкостной (ГЖХ) хроматографии: хроматограф Хром-41 (ЧССР); детектор - ПИД; колонка стеклянная ( 1,5 м х 3 мм), наполненая 6% 0V-25 на Хром W-AW-HMDS (100-200 меш) и 5% ДЭГЯ на Хром W-AW-HMDS (100-200 меш) ; температура tk 135°С и tk 160°С, tn 220°С; скорость газа-носителя ( азот) 50 мл/мин .

Состав лигнина анализировали методом щелочного нитробензольного окисления с последующей газожидкостной хроматографией продуктов расщепления ( Загоскина и др., 1993). Продукты окисления переводили в триметилсилильные производные обработкой бис-триметилсилилтрифторацетамидом и их состав определяли на газокидкостном хроматографе ЛХМ-8 МД (модель ЛХМ-8 ВД, СССР); детектор пламенно-ионизационный; колонка из нержавеющей стали (2.5 м х 3 мм), наполненная Chromosorb N-AW-DMCS 0.16 - 0.20 мм + 5% БЕ-30; температура испарителя

275°С; температуру термостата программировали от 100° до 270°С, 6°С /мин; скорость газа носителя (азот) 30 мл/мин. Содержание продуктов щелочного расщепления лигнина определяли по стандартным методикам ( Вигдергауз, 1978).

Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы определяли по методическим принципам, разработанным Дукером (Zucker, 1965), проводя спектрофотометрическое определение образования транс-коричной кислоты из L-фенилаланина ( поглощение при 290 нм) при 30°С (Запрометов, Ермакова, 1986).

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1979).

ОСОБЕННОСТИ ФЕНОЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА РАСТЕНИЙ ЧАЯ .

Характерной особенностью чайного растения является его специализированный обмен, направленный на синтез разнообразных соединений фенольной природы ( Запрометов, 1952; Курсанов, 1952; Roberts, Wood, 1953; Джемухадзе, 1961; Запрометов, 1964; Цоциашвили, Бокучава, 1989).

Состав фенольных соединений. Основными компонентами фенольного комплекса растений чая являются флавоноиды . Это флаваны ( катехины и их биогенетические аналоги проантоцианидины), а также флавонолы ( рис. 1). Катехины представлены простыми и галлированными формами (-)-эпикатехином, (+)-катехиноы, (-)-эпигаллокатехином,

(+)-галлокатехином, (-)-эпикатехингаллатом, (-)-эпигаллокатехин-галлатом и (-)-галлокатехингаллатом , состав которых наиболее разнообразен в листьях ( Запрометов, 1964). В составе проантоцианидинов идентифицированы проантоцианидин В-2 [(-)-эпикатехин-(4-8)- (-)-эпикатехин], проантоцианидин В-4 Ц+)-катехин-(4-8)- (-)-эпккатехин] и проантоцианидин (-)-зпигаллокатехин-(4-8)- 3-0-галлоилкатехин (Nonaka et. al., 1984). Их образование характерно, главным образом, для корней и одревесневших стеблей растений (Запрометов, 1964). Флавонолы (кемпферол, кверцетин и мирицетин) присутствуют в листьях растений в виде их гликозидов, у которых сахарные остатки представлены глюкозой и рамнозой (Ульянова, 1965; Чхиквишвили и др., 1986).

он о

(-)-эпикатехин

кемпферол (!?1=!?2=Н) кверцетин (Rl=OH•, 1?2=Н) мирицетин №1=Р2=0Н)

ОН

проантоцианидин В-1

Рис.1. Фенольные соединения чайного растения.

В растениях чая синтезируются и более простые фенольные соединения - оксибензойные кислоты. Основным их представителем является гапловая кислота. В меньших количествах были найдены м-дигалловая, зллаговая, хлорогеновая, изохлорогеновая. п-кумарилхинная я галлоилхинная кислоты (Запрометов, Бухлаева, 1963; Запрометов,1964; Цоциашвили, Бокучава, 1989 ). Метод газо-жидкостной хроматографии показал наличие в этанольных экстрактах листьев и молодых стеблей побегов чайного растения также ванилиновой и сиреневой кислот.

Помимо мономерных фенольных соединений , в растениях чая происходит и синтез фенольного полимера лигнина , о котором было

известно лишь то, что он содержит меньшее количество метоксильных групп, по сравнению с лигнинами других древесных пород ( (Егоров, 1954).

1 — ванилин, 2 — о-охсифенилэтилкетон, 3 — ванилиновая кислота, 4 -сиреневый альдегид, 5 -сиреневая кислота, 6 - неидентифицированное соединение.

I — ванилин, 2 — сиреневый альдегид, 3 — сиреневая кислота.

Рис.2. ГЖХ-хроматограммы продуктов щелочного нитробензольного окисления лигина ели (А) и одревесневшего стебля чайного растения (Б).

Сравнение хроматограмм продуктов щелочного нитробензольного окисления лигнина древесины ели и лигнина одревесневших стеблей чайного растения показывает, что состав лигнина стеблей более сложен ( рис. 2 ). Объясняется это , по-видимому, тем, что у богатых фенольными соединениями растений, каким является чайное растение, в составе лигнинов, наряду с оксикоричными структурами,

сополимеризуются и такие более сложные и легко окисляемые полифенолы, как флаваны ( катехины и проантоцианидины ) (Запрометов, 1988; Stafford, 1988). Поэтому на хроматограмме продуктов окисления лигнина одревесневшего стебля чайного растения пики ванилина, сиреневого альдегида и сиреневой кислоты сопровождаются многочисленными пиками неидентифицированных продуктов. Примерно такая же картина характерна и для хроматограмм продуктов окисления лигнинов стеблей и листьев молодых побегов чайного растения. Поэтому в дальнейшем приводятся лишь данные по содержанию образующихся при окислении лигнина ароматических альдегидов и соответствующих оксибензойных кислот.

Основными компонентами лигнина чайного растения являются гваяцильные и сирингильные структуры, что свидетельствует о его принадлежности к гваяцил-сирингильному типу, характерному для древесных растений (Грушников, Елкин, 1973; Gross, 1979). Среди продуктов щелочного нитробензольного окисления лигнина листьев обнаружены ванилин (42,4% ), сиреневый альдегид и сиреневая кислота ( 24,6% и 33,0% , соответственно). В молодых же стеблях соотношение этих компонентов иное: 81,5% (ванилин ) 5,4% (сиреневый альдегид) , 13,1% (сиреневая кислота). Следовательно, лигнин стеблей характеризуется меньшей степенью метоксилирования, чем лигнин листьев, поскольку в его составе доминируют гваяцильные структуры , представленные в продуктах окисления ванилином, тогда как в лигнине листьев - сирингильные структуры, представленные сиреневым альдегидом и сиреневой кислотой.

Содержание фенольных соединений. Определение суммарного содержания растворимых фенольных соединений, а также флаванов и флавонолов в молодых 3-листных побегах (флешах) трех сортов растений чая - "Местный" ( наиболее широко распространенная грузинская разновидность, вывезенная из Китая в конце прошлого века), "Кимынь" ( интродуцированный в Западной Грузии крупнолистный китайский сорт) и "Колхида" (выведен грузинскими селекционерами) , свидетельствует о том, что в листьях их количество в 1,5-2 раза выше, чем в стеблях (табл.1). При этом различия в накоплении флавонолов более значительны, чем различия в накоплении флаванов ( в 5 и 2 раза, соответственно).

Наиболее продуктивным в отношении образования фенольных соединений и, главным образом, флаванов, является сорт "Местный".

Таблица 1.

Содержание фенольных соединений в листьях и стеблях 3-листных побегов различных сортов растений чая

Сорт Органы Сумма растворимых фенольных соединений Флаваны Флавонолы Лигнин (мг/г своб. от экстракт, в-в остатка)

(мг/г сухой массы)

Местный листья 210,3+11,7 155,1+9,1 32,3+2,4 2,7+0,2

стебли 105,9+7,3 82,4+7,9 6,5+0,9 2,5+0,2

Кимынь листья 200,1+10,4 128,2+1,2 33,1+1,5 2,4+0,09

стебли 90,3+6,1 55,9+4,7 6,3+0,7 2,3+0,1

Колхида листья 87,7+7,8 45,3+5,6 34,6+0,6 2,0+0,08

стебли 70,6+6,5 32,4+3,4 4,7+0,2 1,8+0,09

Сорт "Кимынь" также характеризуется довольно высокой способностью к их образованию, хотя деля флаванов в суммарном содержании растворимых фенольных соединений у него ниже, по сравнению с сортом "Местный" (60% и 73X, соответственно). Сорт же "Колхида" обладает низкой способностью к их образованию. Однако эти различия касаются преимущественно мономерных (растворимых) Фенольных соединений, и в значительной меньшей степени лигнина. Листья и стебли побегов одного сорта растения содержат практически одинаковое его количество, что свидетельствует о значительной стабильности биосинтеза лигнина как в различных тканях, так и сортах растений чая.

Интенсивность образования фенольных соединений , как было показано в ряде случаев, определяется активностью ФАЛ, (Hahlbrock et.al., 1976; Hrazdina, Parsons, 1982) . Активность этого фермента в листьях флешей богатого фенольными соединениями сорта "Местный" несколько выше, чем в стеблях (1,25+0,02 и 1,03+0,01 нмоля транс-коричной кислоты/ мг белка/ мин)I Однако эти различия

значительно меньше, чем различия в суммарном содержании растворимых фенольных соединений в этих органах (табл.1). Из этого следует, что уровень активности ФАЛ не является критерием способности органов чайного растения к образованию фенольных соединений, как это отмечалось и другими авторами ( Westcott, Henshaw, 1976; Шипилова, Запрометов, 1977; Teramoto, Ishikura, 1985).

Локализация фенольных соединений. В тканях чайного растения мономерные фенольные соединения локализуются в специализированных клетках-Еместилищах (эпибластах), дающих положительную реакцию как на все фенольные соединения (с хлорным железом) , так и более специфическую - на флаваны ( с ванилиновым реактивом). В листе эти клетки-вместилища расположены, главным образом, во флоэмной и ксилемной паренхиме , а в стебле - в субэпидермальном слое, в коре стебля и, в основном, в области сосудисто-волокнистых пучков (в примыкающей к механической ткани флоэмной паренхиме, а также в паренхиме ксилемы, проходящей между сосудистыми элементами до клеток сердцевины) .

Что же касается лигнина, то судя по характерной реакции с флороглюцинвым реактивом, как в листе, так и в стебле, он откладывается в стенках сосудов ксилемы и элементах механической ткани .

Таким образом, молодые побеги растений чая обладают высокой способностью к синтезу фенольных соединений . Более интенсивно этот процесс осуществляется в листьях, для которых характерно значительное накопление фенольных соединений, особенно флавоноидов, и более разнообразный их спектр по сравнению с молодыми стеблями. Возможно это связано с функционированием в них хлоропластов, как одного из мест синтеза фенольных соединений в клетках зеленых растений.

ФЕНОЛЬНЬЙ МЕТАБОЛИЗМ ГЕТЕРОТРОФНЫХ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ

Для моделирования физиологических процессов в последние десятилетия успешно используются клеточные культуры растений, сохраняющие в условиях in vitro основные эпигенетические и генетические характеристики исходного растения, а также

способность к синтезу ряда вторичных соединений, в том числе и фенольной природы.

Сведения об особенностях образования фенольных соединений в культурах клеток и тканей чайного растения весьма немногочисленны и в основном получены в Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева (Корецкая, Запрометов, 1975; Запрометов и др., 1979; Загоскина, Запрометов, 1979; Багратишвили и др., 1981; Николаева, Запрометов, 1991; Загоскина и др., 1993; 1995). Что же касается других исследований , то они , главным образом, посвящены вопросам его микроразмножения (Frish, Camper, 1985, 1987; Kato , 1989; Вечернина, 1991; Иддагода, 1991; Wachira, Ogada ,1995 ).

Морфологические и цитологические характеристики каллусных культур. Каллусные культуры инициировали из эксплантов листьев и стеблей 3-листных побегов растений чая. Они представляли собой компактные плотные каллусы светло-желтого цвета , состоящие из небольших по размеру клеток паренхимного типа (D=38,27+l,66 и d=24,35+0,84 ) с мелкими вакуолями и тонкими клеточными стенками. Содержали округлое или овальное ядро с одним-двумя ядрышками. Встречались и клетки меристемоподобного типа расположенные в виде небольших групп или очагов. В стеблевом каллусе их количество было больше (5,3-9,6 %), чем в листовом (2,9- 7,3%).

Дифференциация в культурах выранена слабо. Отмечается формирование единичных или расположенных группами трахеидальных элементов укороченной формы и, изредка, тяжей сосудов нормальной протяженности. В каллусах стеблевого происхождения количество трахеидальных элементов неколько выше по сравнению с каллусами листового происхождения (0,3-0,8 % против 0,2%), что, очевидно, является следствием более высокой меристематизации стеблевой ткани. Наблюдаются и вторичные утолщения клеточных стенок.

По данным электронно-микроскопических исследований в клетках каллусных культур присутствуют немногочисленные этиопласты (3-5 на срез) со светлой стромой и зачатками мембранной системы в виде проламеллярных тел (Запрометов и др., 1994) . Митохондрии у них мелкие, округлой формы. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи развиты слабо. Мультивизикулярные тела заполнены аморфным содержимым.

Все это свидетельствует о более простом' уровне как тканевой,

так и внутриклеточной дифференциации каллусных культур.

Содержание фенольных соединений. Инициация каллусных культур из листьев и стеблей богатых фенольными соединениями растений чая сортов "Местный" и "Кимынь" приводит к снижению их биосинтетической способности, как это и характерно для большинства клеточных культур растений (Alfermann,Reinhard, 1978; Zaprometov, 1989; Stafford, 1991). Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в каллусных культурах в 4-5 раз ниже, чем в исходных эксплантах (рис. 3) . Аналогичная тенденция характерна и для флаванов ( основных компонентов фенольного комплекса растений чая), доля которых снижается и составляет около 50-60% от содержания суммы растворимых фенольных соединений (в листьях она выше , до 80%).

В каллусных культурах чайного растения синтезируется и лигнин, что в ряде случаев отмечалось и для других клеточных культур растений (Бардинская, Сафонов, 1959; Carceller et. al., 1971; Robert et. al., 1989). При этом его содержание в них даже выше, чем в исходных тканях , и более четко проявляется в каллусах стеблевого происхождения .

Активность ФАЛ в каллусных культурах также несколько выше, чем в исходных тканях чайного растения. Так, если в листе чайного растения активность ФАЛ составляла 1,25+0,02 нмоль транс-коричной кислоты/мг белка/ мин, то в инициированной из него каллусной культуре - 1,57+0,03 нмоль транс-коричной кислоты/мг белка/мин. Аналогичная тенденция отмечалась и для каллусной культуры стебля.

Таким образом, введение листа и стебля чайного растения в культуру приводит к значительным изменениям в их фенольном метаболизме, проявляющимся в снижении образования как суммы растворимых соединений , так и флаванов, а также в увеличении образования лигнина, что наиболее ярко проявляется в начале их субкультивирования (рис. 4). В дальнейшем ( после 15-20 пассажей) содержание суммы растворимых фенольных соединений и флаванов в культурах почти не меняется, тогда как содержание лигнина несколько уменьшается, оставаясь все же на более высоком уровне, по сравнению с исходными тканями интактного растения.

Каллусные культуры в определенной мере сохраняют особенности образования фенольных соединений, свойственные как тканям, так и сортам исходных растений. Так, культуры листового происхождения

- 18 -Сорт "Местный"

ж а к о

I 8

о «

0 о

1 ь'

Ль,

Ъ.

лг.стсгоа жало с

стеблегоЗ кэллус

Сорт "^ОНЫНЬ"

ляетовоЗ хал-яс

стебле802 яаллзс

■з -

в|

"I!

Рис.3. Содержание суммы растворимых фенольных соединений

(1), флаванов (2) и лигнина (3) в листьях и стеблях

растений мая сортов "Местный" и "Кимынь", а также в инициированных из них каллусных культурах.

Рис.4. Изменения в содержании суммы растворимых фенольных соединений (1), флаванов (2) и лигнина (3) при субкультиЕировании каллусной культуры листа чайного растения (сорт "Местный").

содержат больше растворимых фенольных соединений, по сравнению со стеблевыми, а культуры инициированные из растений чая более богатого фенольными соединениями сорта "Местный" характеризуются более высокой способностью к образованию растворимых фенольных соединений и , особенно, флаванов , по сравнению с культурами инициированными из сорта "Кимынь". Эти данные согласуются с утверждением о том, что "наследственная информация, заложенная в растительной клетке, определяет ее метаболизм в условиях in vitro" (Бутенко, 1964). Важность изучения генетики и эпигенетика эксплантов, используемых для получения культур клеток и тканей, отмечалась и в других исследованиях (Шамина, 1980; Носов, 1991 ).

Локализация фенольных соединений. В каллусных культурах, также как в листьях и стеблях чайного растения, растворимые фенольные соединения и флаваны накапливаются , главным образом, в клетках-вместилищах, которые по форме существенно не отличаются от окружающих их клеток ( рис.5) . Эти клетки-вместилища располагаются беспорядочно (одиночно или группами) по краю

Рис.5. Локализация фенольных соединений в каллусных культурах листа чайного растения ( а - реакция с ванилиновым реактивом на флаваны (ув.3,2x16), б - реакция с хлорным железом на раствооримые фенольные соединения (ув.3,2x16), в-г - реакция с флороглюциновым реактивом на лигнин и лигноподобные соединения (ув.3,2x40).

меристиматических очагов или среди основной массы

паренхимоподобных клеток и обычно удалены от трахеидальных элементов.

Лигнин обнаруживается в некоторых неравномерно утолщенных клеточных стенках паренхимоподобных клеток и трахеидальных элементов, а иногда и в содержимом и оболочках некоторых клеток-вместилищ , расположенных около тесно примыкающих друг к другу групп клеток . Вероятно, в каллусных культурах существует несбалансированность между биосинтезом промежуточных продуктов лигнификации и активной поверхностью для их отложения ( в виде полисахаридных матриц вторичных клеточных стенок трахеидальных элементов), что и приводит , в некоторых случаях, к их накоплению в клетках-вместилищах, дающих реакцию с флороглюцином ( на лигнин). По-видимому, это промежуточные продукты образования лигнина , структура которых пока не выяснена.

Рост каллусных культур и образование фенольных соединений. Известно, что образование фенольных соединений меняется по мере роста клеточных культур растений. Например, часто отмечается значительное накопление фенольных соединений при переходе клеток к стационарной фазе роста (Davis, 1972 ; Zenk et.al., 1977; Cvikrova et. al., 1988 и др.) , хотя иногда сообщается и о максимальном их образовании во время экспоненциальной фазы роста (Ibrahim, Edgar, 1976), что свидетельствует о различной взаимосвязи синтеза фенольных соединений с ростом клеток.

400

Э;

Рис. 5. Динамика роста (А) каллусной культуры стебля

чайного растения и изменение ее оводненности (Б).

30 Дни

Каллусные культуры чайного растения являются медленно растущими культурами с низким индексом роста и слаб эй митотической активностью (рис.6,7).

Рис.6. Изменение митотической активности в процессе роста каллусной культуры стебля чайного растения.

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений и флаванов показывает , что более интенсивное их образование происходит в начальные периоды роста культур, достигая максимального значения к середине линейной фазы ( 30-й день культивирования), причем преимущественно за счет более простых нефлавановых соединений ( рис. 7 А). Во второй половине цикла выращивания содержание фенольных соединений постепенно снижается ( в случае флаванов в меньшей степени).

Сутки

• 9 1

Дни

¡0

Рис.7. Изменения в содержании суммы растворимых фенольных соединений (1), флаванов (2) и лигнина (3) по мере роста каллусной культуры стебля

чайного растения.

Что же касается лигнина, то его образование по мере роста культур меняется не столь значительно ( рис. 7 Б). Оно несколько увеличивается к концу пассажа , что происходит на фоне снижения суммарного содержания растворимых фенольных соединений. В начале же культивирования наблюдается противоположная тенденция содержание растворимых фенольных соединений увеличивается, а содержание лигнина уменьшается. Из этого можно заключить, что предшественники фенольных соединений и, в частности, транс-коричная кислота, могут преимущественно вовлекаться либо в синтез растворимых фенольных соединений, в том числе и флаванов, либо в синтез лигнина, что, по-видимому, связано с физиологическим состоянием клеточных культур (деление или растяжение, а также формирование вторичных клеточных стенок , как места отложения лигнина).

Определение активности ФАЛ в каллусных культурах показало некоторые ее изменения на протяжении роста (Загоскина и др., 1990). В целом же, к концу выращивания она несколько возрастает , хотя строгая корреляция между активностью ФАЛ и образованием фенольных соединений отсутствует.

Способность к образованию фенольных соединений в известной мере связана с сезонностью, т.е. с временем года, на которое приходится рост культур (табл.2).

Зависимость содержания суммы растворимых фенольных соединений в каллусной культуре стебля чайного растения от времени культивирования ( ткань 30-дневного возраста)

Таблица 2.

Время

культивирования

Фенольные соединения (мг/г сухой массы)

1978 год

1986 год

февраль

март

июль

25,5+1,2 37,4+1,5 50,3+1,7

33,0+1,3 45,4+1,5 66.7+1,8

Наиболее интенсивное их образование культурах отмечается в

летние месяцы , а минимальное в феврале . Мартовский пассаж занимает промежуточное положение. Аналогичные тенденции, но выраженные в меньшей степени, отмечены и в отношении накопления флаванов и лигнина (Загоскина и др., 1990).

Следует также отметить, что сезонность в большей степени оказывает влияние на активность ФАЛ, чем на синтез различных форм фенольных соединений. Так, если в культуре июльского пассажа, активность фермента примерно в 2 раза выше, чем в культуре растущей в феврале , то по суммарному содержание растворимых фенольных соединений и лигнина они отличаются лишь на 20-30% и 30-35%, соответственно. Таким образом, возрастание активности ФАЛ не сопровождается адекватным усилением синтеза как растворимых фенольных соединений, так и лигнина. Это еще раз подтверждает положение о том, что ФАЛ не является лимитирующим ферментом в биосинтезе фенольных соединений. По современным представлениям у подавляющего большинства растительных тканей средний, а во многих случаях даже самый низкий, уровень активности ФАЛ оказывается достаточным для того, чтобы обеспечить в десятки и сотни раз большее превращение Ь- фенилаланина в транс-коричную кислоту, чем понадобилось бы для максимального биосинтеза в них фенольных соединений (Маргна, 1983).

Период активной вегетации грузинского чайного растения продолжается с середины марта по конец августа - начало сентября (Джемухадзе, 1961). При этом наибольшее количество фенольных соединений накапливается в молодых побегах в июле - августе. В феврале же чайное растение лишь начинает выходить из периода зимнего покоя и в соответствии с этим каллусная ткань февральского пассажа обладала наиболее низким биосинтетическим потенциалом по отношению к образованию растворимых фенольных соединений и лигнина. Следовательно, несмотря на длительное выращивание в стандартных условиях (темнота, постоянная температура и влажность), каллусные культуры чайного растения в той ини иной мере хранит генетическую информацию о сезонности роста и развития исходного растения.

Состав фенольных соединений каллусных культур. Введение тканей интактных растений в культуру часто приводит не только к количественным, но и к качественным изменениям в составе синтезируемых ими вторичных соединений, в том числе и фенольной

природы (Teuscher, 1973; Alfermann, Reinhard, 1978; Hinder, Seitz, 1988).

Исследование фенольного комплекса каллусных культур чайного растения свидетельствует о значительном его обеднении по сравнению с таковым исходных тканей (Загоскина, 1981). Хотя в нем и преобладают характерные для интактного растения флаваны , однако катехины представлены лишь (+)-катехином и (-)-эпикатехином, тогда как галлированные катехины отсутствуют. Становится разнообразее спектр проантоцианидинов, в составе которых обнаружены проантоцианидины В-1 и В-2 (Запрометов, Загоскина, 1987) .

Состав биогенетически более простых фенольных соединений Ce-Ci ряда также меняется. В нем обнаружены п-оксибензойная, протокатеховая, ванилиновая и сиреневая кислоты , которые присутствуют главным образом, в виде гликозидов, а свободные формы появляются лишь к концу пассажа, когда наблюдается также образование кофейной кислоты ( соединение Сб-Сз ряда). Однако в каллусных культурах отсутствует синтез характерной для тканей молодых флешей растений галловой кислоты (Запрометов, Бухлаева, 1959). Все это свидетельствует о большом сходстве состава растворимых фенольных соединений гетеротрофных каллусных культур с таковым корней чайного растения.

Лигнин каллусных культур заметно отличается от лигнина тканей чайного растения по составу и соотношению продуктов щелочного нитробензольного окисления ( табл. 3).

В нем содержатся не только гваяцильные (ванилин, ванилиновая кислота) и сирингильные (сиреневый альдегид, сиреневая кислота) структуры, но также и значительное количество п-оксифенильных (п-оксибензальдегид и п-оксибензойная кислота) структур , что обусловлено, по-видимому, несколько иной структурой синтезируемого в каллусных культурах лигнина. Судя по этим данным, он относится к филогенетически более примитивному типу лигнина близкому к лигнину травянистых растений ( Манская, Кодина, 1964; Грушников, Елкин, 1973).

Таким образом, инициация каллусных культур из листа и стебля чайного растения приводит к значительным изменениям в их фенольном метаболизме: уменьшается способность к образованию растворимых фенольных соединений и меняется их состав: расширяется

Таблица 3.

Содержание ароматических альдегидов и соответствуюших оксибензойных кислот в продуктах щелочного нитробензольного окисления лигнина каллусных культур чайного растения ( в % от их суммы)

Каллус Продукты окисления

1 2 3 4 5 6

Листовой 57,4 - 10,5 6.8 25,3

Стеблевой 55,5 17,7 10,2 - 5,8 10,8

1 - ванилин, ' 2 - ванилиновая кислота, 3 - сиреневый альдегид, 4 - сиреневая кислота, 5 - п-оксибензойный альдегид, 6 - п-оксибензойная кислота

спектр биогенетически более простых фенилпропаноидных соединений ( Cß-Ci и Сб-Сэ ряд) и уменьшается - биогенетически более сложных ( флавоноидов , Се-Сз-Сб ряд ). Что же касается полимерных фенольных соединений (лигнин), то несмотря на увеличение его образования, по своему составу он отличается от такового интактного растения и относится к филогенетически более простому типу лигнина. Вероятно, эти изменения могут являться следствием изменений условий роста клеток ( гетеротрофный тип питания, наличие глюкозы и 2,4-Д в питательной среде и др.), ослабления дифференциации и специализации клеток, а также частичной потерей реализации генетический информации в условиях in vitro (Бутенко, 1977; Butcher, 1977; Fukuda, Komamine, 1982; Носов, 1991).

УРОВЕНЬ ШЩДНОСТИ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ И ОБРАЗОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Уровень плоидности ядра относится к числу важных цитогеиетичес.ких факторов, определяющих физиологические и биохимические характеристики растений (Green, 1977; Challes, 1981: Мокроносов, 1981). К настоящему времени нет ясности в

вопросе о взаимосвязи между уровнем плоидности клеток и их способностью к синтезу вторичных соединений. Имеющиеся в литературе данные по этому вопросу немногочислены и достаточно противоречивы. В одних случаях при увеличении уровня плоидности клеток образование фенольных соединений увеличивалось, тогда как в других - уменьшалось ( Zaman, 1979 ; Deus, Zenk, 1982; Chaprin, Ellis, 1988 ). Для выяснения этого вопроса мы использовали длительно пассируемые каллусные культуры стебля чайного растения ( сорт "Местный") , отличающиеся морфо-физиологическими характеристиками и способностью к синтезу фенольных соединений, а также попытались получить культуры с более высоким уровнем плоидности, используя для этого их обработку колхицином.

Особенности образования фенольных соединений у длительно пассируемых каллусных культур чайного растения с различным уровнем плоидности. Культивируемые in vitro клетки и ткани растений являются гетерогенными клеточными популяцими, состав которых меняется по мере пассирования , часто в сторону повышения в них числа хромосом (Фролова, 1978; Шамина, 1981; Dolezel Novak, 1985; Бутенко, 1991; Tawakley et. al., 1992; Губарь, Кунах, 1992 ; Соловьян, 1994).

Таблица 4.

Морфо-физиологические характеристики штаммов каллусных культур стебля чайного растения

Штамм Год Морфология Размеры клеток (мкм) Ростовой

инициации D d индекс,%

ЧС-1 1972 г., рыхлый 71,4+3,3 ■ 43.6+2.5 550

стебель

ЧС-2 1977 г., плотный 38,2+1,6 24,3+0,8 480

стебель

ЧС-1-2 1980 г., плотный 42,9+1,6 25,1+1,1 430

спонтанная

селекция из

штамма ЧС-1

Как следует из представленных в таблице 4 данных , штамм

ЧС-1 к моменту исследования представляет собой рыхлый светло-желтый каллус, состоящий из сгруппированных в небольшие агрегаты крупных вакуолизированных клеток с утолщенными клеточными стенками. Дифференциация у него выражена очень слабо ( единичные трахеидальные элементы) . Два других штамма - ЧС-2 и ЧС-1-2 по морфологическим характеристикам близки друг к другу и представляют собой плотные светло-коричневые каллусы, состоящие из небольших по размеру клеток с мелкими вакуолями и тонкими клеточными стенками . Трахеидальные элементы у этих штаммов встречалются довольно часто, особенно у штамма ЧС-2.

Все штаммы являются медленно растущими культурами и содержат клетки различного уровня плоидности (от 1 п до 5-6 п) (рис. 8 ), что характерно для большинства культивируемых in vitro клеток и тканей растений (Фролова, 1981; Butenko, 1985).

ЧС-1 ЧС-1-2 ЧС-2

Наибольший размах изменчивости по этому показателю наблюдается у штамма ЧС-1-2. Штамм ЧС-1 по этому признаку значительно отличается от двух других штаммов, у него модальный класс составляют тетраплоидные клетки, на долю которых приходится 60% от суммы проанализированных метафаз. У штаммов же ЧС-1-2 и, особенно, ЧС-2 доминируют характерные для интактного растения чая диплоидные клетки ( 2 п = 30; Ка^, 1993), составляющие 60% и 76% от суммы проанализированных метафаз, соответственно.

Следует отметить наличие взаимосвязи между уровнем плоидности каллусных культур и их морфологическими характеристиками . Так, штаммы ЧС-1-2 и ЧС-2, содержащие

Рис.8. Распределение клеток по уровню плоидности у штаммов каллусных культур стебля чайного растения (возраст 15 дней).

Уровень плондности, л

преимущественно диплоидные клетки имеют более низкий индекс роста и состоят из более мелких клеток, по сравнению со штаммом ЧС-1, содержащим преимущественно тетраплоидные клетки. В ряде других случаев также отмечалась прямая взаимосвязь между числом хромосом и размерами клеток ( Cooper et. al., 1964; Мокроносов, 1981; Манжулин и др., 1991 ).

Таблица 5.

Содержание фенольных соединений и активность L-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) в различных штаммах каллусных культур чайного растения

Штамм Содержание Содержание Активность

флаванов лигнина ФАЛ

(мг/г сухой (мг/г свободного (нмоль транс-

массы) от экстрактивных веществ остатка) коричной к- ты/ мг белка/мин)

ЧС-1 1,8+0,05 1,9+0,03 0,71+0,11

ЧС-1-2 45,3+3,4 2,2+0,07 1,11+0,09

ЧС-2 60,2+3,9 2,8+0,09 1,55+0,21

Наиболее низка способность к образованию фенольных соединений у штамма ЧС-1, а наиболее высока - у штамма ЧС-2 (табл. 5. ). В большей степени различия проявляются в накоплении флавановых производных, где разница почти 30-кратная, и в меньшей степени лигнина ( в 1,5 раза). Штамм ЧС-1-2 по способности к синтезу фенольных соединений значительно ближе к штамму ЧС-2, нежели к штамму ЧС-1 из которого он выделился в результате спонтанной селекции.

Что касается активности ФАЛ, то в низко продуктивном штамме ЧС-1 она в 2 раза ниже, чем в высокопродуктивном штамме ЧС-2 . Можно отметить наличие корреляции между активностью ФАЛ и способностью тканей к образованию лигнина, как это иногда отмечалось и в других случаях (Zucker, 1972; Camm, Towers, 1973; Hrazdina, Creasy, 1979; Jones, 1984; Сергейчик, 1987).

Приведенные данные свидетельствуют о значительном отличии штамма ЧС-1 от двух других штаммов (ЧС-2 и ЧС-1-2) по

морфологическим, физиологическим и цитогенетическим характеристикам, а также по способности к образованию фенольных соединений. Для него характерна низкая интенсивность фенольного метаболизма,что проявляется как на уровне активности ФАЛ, так и в накоплении лигнина и, особенно, растворимых фенольных соединений (фенилпропаноидов и флавоноидов). У штаммов же ЧС-1-2 и, особенно, ЧС-2, способность к синтезу фенольных соединений значительно выше и можно даже отметить наличие взаимосвязи между числом характерных для интактного растения диплоидных клеток и содержанием в каллусных культурах фенольных соединений (особенно флавоноидов).

Все это свидетельствует о том, что у длительно выращиваемых в условиях in vitro каллусных культур чайного растения способность к образованию фенольных соединений зависит от наличия в них характерных для самого чайного растения диплоидных клеток, тогда как повышение уровня плоидности каллусных культур, приводит к снижению их способности к синтезу фенольных соединений (особенно растворимых их форм ).

Изменения в образовании фенольных соединений при полиплоидизации каллусных культур под действием колхицина. В целях направленной полиплоидизации растительных тканей часто используют их обработку колхицином (Armstrong, Robertson, 1960; Dolezel, Binarova, 1989), что, как правило, сопровождается значительным увеличением размеров и скорости роста клеток (Манжулин и др., 1991, Dolezel, Binarova, 1989).

Штамм ЧС-2, у которого в делящейся популяции преобладали диплоидные клетки, а содержание фенольных соединений было довольно высоким, оказался устойчивым к действию колхицина (0,03%) и при последующем культивировании на основной питательной среде после 10-го пассажа в нем сформировалось две линии - Л-1 и Л-2.

Каллусная ткань линии Л-1 по морфологическим характеристикам аналогична исходному штамма ЧС-2 и представляет собой медленно растущий каллус (индекс роста 400 %) светло-коричневого цвета, плотный и компактный, состоящий из небольших по размеру клеток. Каллусная ткань линии Л-2 является сильно оводненным темно-коричневым каллусом очень мягкой консистенции с хорошим индексом роста (более 500 Z). Клетки этой культуры крупные

(0=51,14+1,31 мкм; (1=35,79+0,78 мкм) и вакуолизированные.

Рис.9. Распределение клеток по уровню плоидности у линии Л-2, полученной после обработки каллусной культуры штамма ЧС-2 колхицином (0,03%). Возраст ткани 15 дней.

У линии Л-1 в делящейся популяции преобладают клетки с диплоидным набором хромосом, как и в каллусной ткани штамма ЧС-2, тогда как у линии Л-2 доминируют триплоидные клетки и увеличивается количество тетраплоидных клеток (рис. 9). Все это свидетельствует о том, что обработка каллусной ткани штамма ЧС-2 колхицином способствует полиплоидизации некоторой части входящих в нее клеток, что и приводит к формированию новой полиплоидной каллусной культуры в виде линии Л-2.

Рис.10. Содержание суммы растворимых фенольных соединений (1), флаванов (2) и лигнина (3) в двух линиях каллусных культур чайного растения, полученных после обработки штамма ЧС-2 колхицином (0,03%).

Определение содержания фенольных соединений выявило значительные различия в биосинтетической способности этих линий (рис. 10). Для каллусной культуры линии Л-1 характерно более высокое содержание как суммы растворимых фенольных соединений, так и флаванов по сравнению с каллусной культурой линии Л-2 и близкое к таковому штамма ЧС-2 ( рис. 10). В большей степени это касалось накопления флавановых производных. Что же касается лигнина, то значительных различий в его содержании у этих линий не обнаружено.

Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение уровня плоидности клеток каллусной культуры чайного растения как в процессе длительного пассирования, так и под влиянием колхицина, сопровождается снижением способности к накоплению фенольных соединений, особенно фенилпропаноидов и флавоноидов. В тех же случаях, когда в клеточных культурах преобладают характерные для интактного растения диплоидные клетки, способность к синтезу фенольных соединений сохраняется на довольно высоком уровне. При этом чем больше в клеточной популяции содержится клеток с диплоидным набором хромосом, тем выше их биосинтетическая способность .

Следует однако отметить, что различия в интенсивности фенольного метаболизма у каллусных культур чайного растения с различным уровнем плоидности не влияют на качественный состав синтезируемых ими соединений.

СВЕТОРЕГУЛЯЦИЯ ФЕНОЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА В КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ

Одним из наиболее эффективных факторов воздействия на образование фенольных соединений в растительных клетках является свет ( гепк, 1967; МсС1иге,1975, 1979; Запрометов,1987 ). в отличии от многих других эффекторов, он не только стимулирует их синтез, но и способствует новообразованию некоторых из них. Например, в суспензионной культуре клеток петрушки освещение "запускало" синтез флавоноидов (НаМЬгок, 1977), , а в каллусных тканях плодов апельсина и лимона лишь при их выращивании в условиях непрерывного освещения наблюдалось образование флавонов

и флавонолов (Brunet, Ibrahim, 1973). В тоже время, в каллусных культурах чайного растения свет вызывал лишь увеличение образования расторимых фенольных соединений, но не способствовал изменению их качественного состава (Корецкая, Запрометов, 1975).

Ранее в опытах с молодыми побегами чайного растения было обнаружено, что хлоропласты являются одним из компартментов синтеза катехинов в зеленых тканях чайного растения (Запрометов, 1964).

Все это и послужило основанием для изучения особенностей синтеза различных фенольных соединений ( растворимых их форм и лигина) по мере формирования в каллусных культурах чайного растения хлоропластов и превращения их в фотомиксотрофные культуры.

Влияние света на образование фенольных соединений в каллусных культурах . Длительно выращиваемые в темноте каллусные культуры чайного растения переносили в условия круглосуточного освещения , которое, судя по литературным данным, способствует быстрому формированию в них хлоропластов (Dalton, Peel, 1983). Это приводит к уплотнению каллусов и появление у их основания слоя пигментированных клеток с розово-красной антоциановой окраской. Через 3 пассажа на верхней части каллуса начинают появляться зеленые клетки , количество которых по мере субкультивирования увеличивается и постепенно вся поверхность каллусной ткани имеет зеленый цвет. Такая фотомиксотрофная (иными словами частично фотоавтотрофная) каллусная культура представляет собой компактный плотный каллус зеленого цвета, состоящий из относительно мелких клеток одинакового размера (31,8 - 32,3 мкм). Для нее характерено повышение уровня тканевой дифференциации , что проявляется в увеличении числа клеток-вместилищ с фенольными соединениями ( 22% в фотомиксотрофном каллусе , 18% в гетеротрофном ). Усиление дифференциации каллусных тканей под влиянием света наблюдалось и для культур тканей цитрусовых (Brunet, Ibrahim, 1973).

Как свидетельствуют данные электронно-микроскопических исследований, формирующиеся в каллусной культуре хлоропласты отличаются от хлоропластов клеток мезофилла листа чайного растения (рис. 11). Так, если хлоропласты клеток мезофилла имеют хорошо развитую внутреннюю структуру ( большое число гран -

Рис.11. Ультраструктурная организация хлоропластов фотомиксотрофного каллуса (возраст 5 и 8 недель, а и б, соответственно) и листа (в) чайного растения

13-15, состоящих из 20-45 светлых тилакоидов), то хлоропласта каллусных культур содержат небольшое число гран (до 5), стопки тилакоидов в гранах небольшие (3 - 14), межгранные тилакоиды четко выражены. Строма хлоропластов светлая, встречаются единичные пластоглобулы и крахмальные зерна, что свидетельствует об их фотосинтетической активности. Хотя ультраструктурная организация хлоропластов по мере субкультивирования каллусов в условиях освещения менялась ( Стрекова и др., 1985), однако они не достигали нормального развития их мембранной системы, чему , по-видимому, препятствовало как наличие глюкозы в питательной среде, так и их выращивание в не физиологических условиях непрерывного освещения ( Биль, Опарина, 1975; Семененко, 1985).

Свет вызывает значительные изменения в образовании фенольных соединений в каллусных культурах (рис. 12 ).

200'-

0 1 (темнота}

3 7

пассажи

еВгп7

/ 3

[темнота]

тссзуеи

Рис.12. Влияние многократного субкультивирования в условиях непреры-вого освещения на образование суммы растворимых фенольных соединений (1), флаванов (") и лигнина (3) в каллусной культуре листа чайного растения (возраст 40 дней).

Так, в тканях первого светового пассажа содержание суммы всех растворимых фенольных соединений и флавачов резко снижалось. При последующем субкультивировании на свету их образование увеличивалось и к 5-у пассажу более чем в 2 раза превышало их

количество в исходных ( выращиваемых в темноте) культурах . В дальнейшем содержание флаванов в культурах почти не менялось, тогда как количество суммы растворимых фенольных соединений продолжало возрастать с прежней или даже несколько большей скоростью. Столь большое различие между содержанием суммы растворимых фенольных соединений и флаванов (никогда ранее не наблюдавшееся нами в выращиваемых в темноте каллусных культурах чайного растения) может объясняться формированием в них хлоропластов, которые начинают вносить заметный вклад в образование фенольных соединений.

Что касается лигнина, то перенесение каллусных культур в условия освещения первоначально оказываю четко выраженное стимулирующее действие на его образование и уже к концу 1-го светового пассажа его содержание в ткани удваивалось по сравнению с темновым контролем . При дальнейшем же пассировании на свету способность к лигнинообразованию практически не менялась, что значительно отличалось от характера изменений в содержании растворимых фенольных соединений.

Таким образом, при выращивании каллусных тканей чайного растения в световых условиях образование растворимых форм фенольных соединений и образование лигнина не подчиняются единой закономерности. В первую очередь усиливается синтез лигнина, а затем образование растворимых фенольных соединений.

Образование фенольных соединений в фотомиксотрофных каллусных культурах чайного растения, выращиваемых при различной длительности освещения. Величина биосинтетической активности тканей зависит от продолжительности светового воздействия, его интенсивности и качественного состава (Мокроносов, 1988; Исозшо, 1983) . Мы сравнили особенности образования различных фенольных соединений в фотомиксотрофных каллусных культурах длительно выращиваемых при непрерывном или 16-час. освещении.

Фотомиксотрофные каллусные культуры чайного растения, выращиваемые при различной длительности светового воздействия , отличались по морфологическим характеристикам. В условиях непрерывного освещения формировался плотный каллус темно-зеленого цвета, тогда как в условиях 16-час. фотопериода каллус был менее плотный и имеел светло-зеленый цвет. Это согласуется и с данными по содержанию в них хлорофилла , которое почти в 4 раза выше в

культурах выращиваемых при непрерывном освещении (табл.6).

Таблица 6.

Содержание хлорофилла в фотомиксотрофных каллусных культурах стебля чайного растения, выращиваемых при различной длительности светового воздействия ( возраст тканей 30 дней)

Длительность светового воздействия, часы

хлорофилл а

хлорофилл Ь

отношение хлорофилла а/Ь

мг/г свежей массы ткани

24 16

1,95+0,15 0,52+0,05

•0,95+0,05 0,23+0,03

2,05 2,26

Условия непрерывного освещения способствали лучшему росту культур , чем условия 16-час. фотопериода (прирост сырой биомассы составлял 450% и 330%, соответственно).

Таблица 7.

Содержание фенольных соединений в фотомиксотрофных каллусных культурах стебля чайного растения, выращиваемых при различной длительности светового воздействия ( возраст тканей 30 дней)

Длительность светового воздействия, часы

Сумма

растворимых

фенольных

соединений

Флаваны

Лигнин (мг/г своб. от экстракт, в-в остатка)

(мг/г сухой массы)

24 16

105,9+9,7 71,3+6,1

70,1+4,9 44,9+3,7

4,0+0,7 3,1+0,3

Как показали наши исследования, по мере роста фотомиксотрофных культур содержание в них фенольных соединений

менялось и более значительно в условиях непрерывного освещения (Загоскина и др., 1990). При этом характер этих изменений был одинаков: постепенное возрастание их количества с начала культивирования и до середины линейной фазы роста, а затем уменьшение, как это отмечалось и для гетеротрофных культур.

В тоже время в условиях непрерывного освещения накопление фенольных соединений в культурах было выше , чем в условиях 16-час. фотопериода, что особенно ярко проявлялось в отношении суммы растворимых фенольных соединений и флаванов (табл.7). По количеству лигнина отличия были выражены в значительно меньшей степени.

Это свидетельствует о том, что интенсивность фенольного метаболизма в фотомиксотрофных каллусных культурах чайного растения в значительной степени определяется режимом светового воздействия при их выращивании, что, вероятно, связано с формирование в них хлоропластов, как одного из центров синтеза фенольных соединений. Непрерывное освещение в большей степени способствует этому процессу, чем освещение с 16-час. фотопериодом, и это, в свою очередь, приводит к более интенсивному синтезу в них фенольных соединений, особенно мономерных форм, и в меньшей степени лигнина.

Состав фенольных соединений фотомиксотрофных каллусных культур. Поскольку, судя по литературным данным, свет не только стимулирует синтез фенольных соединений, но и способствует новообразован™ некоторых из них , мы сравнили состав фенольного комплекса фотомиксотрофных и гетеротрофных каллусных культур (табл.8). Содержащие хлоропласты фотомиксотрофные каллусные культуры обладают значительно большим разнообразием синтезируемых ими фенольных соединений. Как и в случае гетеротрофных культур, в них обнаружены флаваны : катехины (также лишь (+)-катехин и (-)-эпикатехин) и проантоцианидины. Принципиальное же их отличие состоит в том, что в них синтезируется еще один характерный для листьев чайного растения класс флавоноидов , а именно флавонолы . Последние представлены двумя агликонами : кемпферолом и кверцетином , а также флавонол-гликозидами. Из-за малого количества материала детальная идентификация флавонол-гликозидов не была осуществлена, однако среди продуктов кислотного гидролиза суммы флавонол-гликозидов в качестве агликонов обнаружены

кемпферол и кверцетин, а сахарные фрагменты представлены глюкозой и рамнозой. Судя же по хроматографическим характеристикам в их составе присутствуют характерные для листьев чайного растения кемпферол-3-глюкозид и кверцетин-3-глюкозид (Чхиквишвили, 1985). Из-за малого

Таблица 8.

Фенольные соединения листа чайного растения (ЧР) и инициированных из него гетеротрофных (ГКК) и фотомиксотрофных (ФКК) каллусных культур

Класс

Соединения

ЧР

ГКК

ФКК

Катехины (+)-катехин (+)-катехин (+) -катехин

(-)-эпикатехин (-)-эпикатехин (-) -эпикатехин

(+)-галлокатехин -

(-)-эпигаллокатехин

(-)-эпикатехингаллат -

(-)-эпигадлокатехингаллат - -

Флавонолы

Оксибензойные кислоты

Оксикоричные кислоты

кверцетин

кемпферол

мирицетин

галловая

ванилиновая

сиреневая

п-оксибензойная

протокатеховая

ванилиновая

сиреневая

кофейная

кверцетин кемпферол

п-оксибензойная протокатеховая ванилиновая сиреневая п-кумаровая кофейная феруловая

Помимо флавонол-гликозидов частично фотоавтитрофнке каллусные культуры синтезируют еще одно флавоноиднее соединение с розово-красной окраской. При его кислотном гидролизе образуется агликон цйанидин. Как указывалось выше, образование этого антоциана наблюдалось на гораздо более ранних, чем образован!!-? хлоропластов, стадиях культивирования каллусных тканей е световых

условиях и, таким образом, не имело прямого отношения к формированию и функционированию в них хлоропластов.

В составе комплекса фенольных соединений частично фотоавтотрофных культур наблюдаются и некоторые другие различия , не влияющие, впрочем, существенно на количественное соотношение между флавановыми и нефлавановыми фенольными соединениями. Было замечено образование п-кумаровой и феруловой кислот, но образования галловой кислоты так и не наблюдалось.

В целом полученные данные свидетельствуют о том, что значительное увеличение относительной доли нефлавановых полифенолов в сумме растворимых фенольных соединений фотомиксотрофных (частично фотоавтотрофных) каллусных культур чайного растения (по сравнению с выращиваемыми в темноте гетеротрофными культурами) объясняется появлением у таких содержащих хлоропласта тканей способности синтезировать флавонолы (агликоны и гликозиды). Это является доказательством того, что именно хлоропласты принимают участие в синтез этих соединений в зеленых клетках растений.

Фотомиксотрофные каллусные культуры чайного растения отличаются от гетерофных культур и по составу синтезируемого ими лигнина . В продуктах щелочного нитробензольного окисления лигнинов этих культур присутствуют лишь ванилин и сиреневая кислота, с весьма значительным преобладанием последней. В листовом каллусе на их долю приходится 26,2% и 73,8%, соответственно, а в стеблевом - 10,5% и 89,5%. Это свидетельствует о большей однородности лигнина фотомиксотрофных культур и значительном его отличии от лигнина гетеротрофных культур (см. табл. 3 ). Лигнин фотомиксотрофных каллусных тканей чайного растения может быть отнесен к гваяцил-сирингильному типу с высокой степенью метоксилирования, как это отмечалось и в случае лигнина листа чайного растения . Такая особенность синтеза лигнина как в фотомиксотрофных каллусных культурах, так и в листе чайного растения, вероятно, объясняется активацией под влиянием освещения не только ферментов начальных этапов биосинтеза фенилпропаноидов (Ь-фенилаланинаммиак-лиазы, 4-гидроксилазы транс-коричной кислоты и О-метилтрансферазы кофейной кислоты), но и ферментов, ответственных за формирование синаповой кислоты (5-гидроксилазы феруловой кислоты и О-метилтрансферазы

5-оксиферуловой кислоты) (Hahlbrock, 1977).

Все это свидетельствует о том, что формирование хлоропластов в каллусных культурах чайного растения и приближение ультраструктурной организации клеток к таковой интактного растения, способствует и "нормализации" фенольного метаболизма. Это проявляется как в значительном усилении образования растворимых фенольных соединений ( преимущественно за счет новообразования флавонолов), так и в приближении состава синтезируемых каллусными культурами фенольных соединений к исходным тканям чайного растения. Однако и в этом случае не происходит синтеза характерной для чайного растения галловой кислоты и расширения комплекса катехинов, а именно образования галлокатехинов - (-)-зпигаллокатехина, (+)-галлокатехина, и галлоильных эфиров - (-)-эпикатехингаллата и (-)-эпигаллокатехингаллата, на долю которых приходится до 90% общего содержания катехинов в молодых побегах чайного растения (Запрометов, 1964).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фенольные соединения относятся к числу одних из наиболее распространенных в растительном мире представителей вторичных соединений, образование которых свойственно практически всем растениям (Сарканен и др., 1975; Wardrop, 1981; Saka, Goring, 1985). Они чрезвычайно разнообразны по своей структуре и включают как мономерные (фенилпропаноиды, флавоноиды), так и олигомерные и полимерные (дубильные вещества, лигнин) соединения.

Использование растений чая, характеризующихся специализированным обменом направленным на синтез соединений фенольной природы, а также инициированных из них гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур показало, что интенсивность метаболизма фенольных соединений и их качественный состав зависят от физиологического состояния растений и специализации клеток. В молодых активно метаболизируюших тканях, наиболее Еысока способность, к синтезу растворимых фенольных соединений, как это наиболее ярко проявлялось в листьях молодых побегов растений растений, синтезирующих преимущественно флавоноиды (флаваны и флавонолы), а также . более простые фенольные соединения

(фенилпропаноиды). Аналогичная тенденция характерна и для каллусных культур чайного растения, где наиболее высокое содержание растворимых фенольных соединений также приходилось на период интенсивных клеточных делений, хотя их качественный состав бел беднее и представлен лишь фенилпропаноидами и флаванами.

Что же касается синтеза такого типичного представителя "вторичных" полимерных соединений фенольной природы как лигнин, то его образование является довольно консервативным процессом, изменяющимся под влиянием различных физиологических факторов в значительно меньшей степени, чем синтез мономерных фенольных соединений. Можно лишь отметить, что увеличение накопления лигина характерно для клеток с низкой интенсивностью "первичного" метаболизма как это наблюдалось в гетеротрофных каллусных культурах чайного растения.

Основным предшественником фенольных соединений является L-фенилаланин, образующийся по шикиматному пути биосинтеза . Установлено, . что шикиматный путь функционирует как в цитозоле, так и в хлоропластах (Jensen, 1986; Morris et.al., 1989). При этом шикиматный путь, локализованный в цитозоле, является неполным и в его функционировании важную роль играют процессы транспорта промежуточных его продуктов между пластидами и цитозолем (Fiedler et.al., 1985). В зависимости от энергетического состояния клеток основная роль в биосинтезе фенольных соединений может принадлежать шикиматному пути, локализованному в каком-то одном из этих компартментов (Осипов, 1990).

Исходя из этого можно предположить, что в гетеротрофных клетках основным источником фенилпропаноидных структур является шикиматный путь локализованный в цитозоле и приводящий преимущественно к синтезу фенилпропаноидов и лигнина , и в значительно меньшей степени к синтезу флавоноидов. Следует также отметить, что особенностью цитозольного шикиматного пути является отсутствие механизма регуляции по принципу ретроингибирования, то есть он ооладает свойством суперпродукции, когда биосинтетическая активность определяется не потребностью в продукте, а только наличием энергии и субстрата. Все это и приводит к тому, что у растущих в гетеротрофных условиях каллусных культур чайного растения фенольный метаболизм направлен преимущественно на

образование фенольного полимера лигнина.

В случае же формирования в клетках хлоропластов, как это наблюдается в фотомиксотрофных каллусных культурах и клетках листьев и стеблей молодых побегов чайного растения , где также функционирует шикиматный путь , а также образуются энергетические эквиваленты (АТФ, НАДОНг и др.), происходит значительное усиление синтеза мономерных фенольных соединений. Это проявляется как в увеличении их накопления , так и в расширении спектра синтезируемых веществ, преимущественно флавоноидов (флаванов и флавонолов). Судя по данным полученным, на фотомиксотрофных культурах, именно хлоропласты ответственны за синтез характерных для листьев чайного растения флавонолов.

Синтез же лигнина не зависит от шикиматного пути локализованного в хлоропластах. Увеличение количества лигнина в выращиваемых на свету культурах в большей степени обусловлено повышением активности некоторых ферментов фенольного метаболизма под действием света (НаЪПэгоск е1.а1., 1979). В то же время хлоропласты все-же вносят определенный вклад в биосинтез лигнина, связанный с изменением его состава и приближением его к таковому листьев растений чая. Это, по-видимому, является следствием объединения в этих условиях биосинтетической активности начальных реакций пластидного и цитозольного шикиматных путей с помощью внутриклеточного транспорта предшественников фенольных соединений из хлоропластов в цитозоль.

Все это свидетельствует о важной роли хлоропластов в фенольном метаболизме растительных клеток , в том числе и в биосинтезе одного из классов флавоноидных соединений, а именно флавонолов.

ВЫВОДЫ

1. На примере сортов "Местный", "Кимынь" и "Колхида" показано, что способность тканей чайного растения к синтезу фенольных соединений зависит от их эпигенетических и генетических характеристик. Наиболее высока она листьях молодых 3-листных побегов.

2. Инициация каллусных культур из листа и стебля чайного растения приводит к изменениям в фенольном метаболизме, что

проявляется в значительном снижении способности к образованию фенилпропаноидов и флавоноидов ( в том числе и характерных для интактного растения флаванов) на фоне увеличения образования фенольного полимера лигнина.

Меняется и качественный состав синтезируемых фенольных соединений. В каллусных культурах он значительно беднее , приближаясь к составу фенольных соединений корней. Хотя, как и в случае интактного растения, основными компонентами фенольного комплекса являются флаваны ( катехины и проантоцианидины), однако в каллусных культурах катехины представлены лишь простыми их формами - (+)-катехином и (-)-эпикатехином. Образования же характерных для чайного растения флавонол-гликозидов, галловой кислоты и более сложных катехинов не происходит.

3. Несмотря на довольно высокую способность каллусных культур к синтезу лигнина, по своему качественному составу он отличается от такового исходных тканей. В продуктах щелочного нитробензольного окисления лигнина содержатся не только гваяцильные и сирингильные структуры ( как это характерно для лигнина растений чая), но и значительное количество и-оксифенильных структур . Такой лигнин является более примитивным, близким к лигнину травянистых растений.

4. В условиях in vitro сохраняются особенности фенольного метаболизма свойственные как сортам , так и органам растений чая. В большей степени это проявляется в отношении образования суммы растворимых фенольных соединений и флаванов, и , в меньшей степени, лигнина.

5. Способность к образованию фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения зависит от наличия в них характерных для чайного растения диплоидных клеток (2п=30). Повышение уровня плоидности каллусных культур, как при их длительном субкультивировании в условиях in vitro, так и под влиянием колхицина, сопровождается преимущественнно снижением способности к образованию фенилпропаноидов и флавоноидов, и в гораздо меньшей мере лигнина.

6. Перенесение гетеротрофных каллусных культур чайного растения в условия освещения способствует активации фенольного метаболизма, что первоначально приводит к усилению синтеза лигнина, а затем фенилпропаноидов и флавоноидов.

7. Формирование в клетках каллусных. культур хлоропластов сопровождается не только увеличением образования фенольных соединений , но и расширением их спектра, а именно образованием флавонолов и их гликозидов, приближая состав фенольного комплекса фотомиксотрофных культур к таковому листа чайного растения. Это может свидетельствовать о том, что именно хлоропласты ответственны за синтез флавонолов. При этом даже в фотомиксотрофных культурах не происходит образования (-)-эпигаллокатехина, (+)-галлокатехина, (-)-эпикатехингаллата и ( - )-эпигаллокатехингаллата, на долю которых приходится до 90% общего содержания катехинов в молодых побегах чайного растения.

В отличие от культивируемых в темноте гетеротрофных каллусных культур, лигнин фотомиксотрофных культур относится к гваяцил-сирингильному типу, приближающемуся по строению к лигнину листьев чайного растения.

8. Интенсивность фенольного метаболизма в фотомиксотрофных каллусных культурах чайного растения в значительной степени определяется режимом светового воздействия при их вырашивании. Непрерывное освещение способствует большей активации биосинтеза фенольных соединений, что проявляется на уровне образования конечных продуктов фенольного биосинтеза (судя по интенсификации образования растворимых фенольных соединений и в меньшей степени лигнина).

СПИСОК

основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В, Стрекова В.Ю., Морозова Г.А. Образование фенольных соединений и процесс дифференциации в каллусной культуре чайного растения // Физиология растений. 1979. Т.26. В.З С.485-491.

2. Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. О возможных причинах нарушения процесса лигнификации в культуре ткани чайного растения // Физиология растений. 1980. Т.27.В.6. С. 1192-1200.3. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А. Локализация пероксидазы и лигнина в тканях чайного растения и в полученных и них каллусных культурах// Физиология растений. 1982. Т.29. В.2. С.302-311.

4. Zagoskina N.V. Influence of kinetin on the formation of phenolic compounds and growth in tea plant tissue cultures// Plant metabolism regulation. Sofia. 1982. P.322-325.

5. Загоскина H.B., Запрометов M.H. Образование фенольных соединений в постоянно освещаемых каллусных культурах чайного растения// Тезисы 1У Всес.симпоз. по фенольным соединениям. "ФАН" Уз.ССР. Ташкент. 1982. С.33-34.

6. Елкин В.В., Любавина О.В, Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Изучение лигнина каллусных тканей чайного растения // Тезисы 1У Всес.симпоз. по фенольным соединениям. "ФАН" Уз.ССР. Ташкент. 1982. С.30-31.

7. Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В..Запрометов М.Н. Гормональная регуляция процесса дифференциации и синтеза фенольных соединений в культуре ткани чайного растения// Тезисы 1У Всес.симпоз. по фенольным соединениям. "ФАН" Уз.ССР. Ташкент. 1982. С.98-99.

8. Загоскина Н.В., Загоскина Н.В. Фенольные соединения каллусных культур чайного растения и возможности регуляции их образования// Тезисы докладов IV Всес. конференции "Культура клеток растений и биотехнология". Кишинев. "Штиинца" 1983. С.56-57.

9. Zagoskina N.V., Zaprometov M.N. Effect of light on the formation of phenolic compounds in tea callus cultures// Light and hormonal interaction in plants. Abstracts. Humbolt Univ. Berlin. 1985 P.136-137.

10. Загоскина H.B., Запрометов М.Н. Фенольные соединения каллусных культур чайного растения и возможность регуляции их образования// Культура клеток растений и биотехнология. М. Наука. 1986. С.49-51.

11. Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В. Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения// Физиология растений. 1986. Т.22. В.6. С.356-364.

12. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В. Еще об одном доказательстве участия хлоропластов в биосинтезе фенольных соединений // Физиология растений. 1987. Т.34. В.1. С.165-172.

13. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Некоторые аспекты регуляции фенольного метаболизма в каллусных культурах чайного растения // Тезисы У Всес. симп. по фенольным соединениям. Таллин. 1987. С. 48-49.

14. Усик Т.В., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Активность фенилаланинаммиаклиазы и образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения, выращенных при различных условиях освещения // Тезисы У Всес. симп. по фенольным соединениям. Таллин. 1987. С.50.

15. Zaprometov M.N., Zagoskina N.V. Regulation of phenolic compounds formation in cultured of tea plant (Camellia sinensis) // Proceedings of International Tea-Quality-human Health Symposium.China. 1987. P.62-65.

16. Загоскина Н.В., Субботина Г.A., Стрекова В.Ю., Запрометов М.Н. Взаимосвгзь между ультраструктурной организацией хлоропластов и синтезом фенольных соединений в каллусных тканях чайного растения // Тезисы 1У Всес. симп. "Ультраструктура растений". Киев. 1988. С.15.

17. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. О механизмах регуляции образования фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения // Тезисы межд. конф."Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск. 1988. С.71-72.

18. Zagoskina N.V. Lignification and changes of phenolic formation in tissue culture of tea plants // 6-th congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. Yugoslavia. Abstracts. 1988. P.118.

19.Стрекова В.Ю., Загоскина H.B., Субботина Г.А., Запрометов М.Н. Влияние длительного освещения на синтез фенольных соединений и формирование хлоропластов в каллусной ткани чайного растения // Физиология растений. 1989. Т.36. В.1. С. 83-88.

20. Загоскина Н.В., Усик Т.В., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения: активность L-фенилаланинаммиак-лиазы, образование фенольных соединений и сезонная вариабельность // Физиология растений. 1990. Т.37. В.З. С.511-517.

22. Загоскина Н.В., Усик Т.В., Запрометов М.Н. Влияние длительности освещения на фенольный метаболизм фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения // Физиология растений. 1990. Т.36. В.6.' С. 1089-1095.

23. Zagoskina N.V., Zaprometov M.N. Chloroplasts involvement in the phenolic compound biosynthesis in tea-plant callus tissue // ХУ-е International conference Groupe Polyphenols. Paris.France. Abstracts. 1990. P.109.

24. Загоскина Н.В. Особенности фенольного метаболизма гетеротрофных и фотомиксотрофных культур тканей чайного растения // Сб.тезисов 11 Сьезда Всес. об-ва физиологов растений. Минск. 1990. С.73

25. Загоскина Н.В., Усик Т.В., Запрометов М.Н. Фенилаланинаммиак-лиаза и образование фенольных соединений в гетеротрофных каллусных культурах чайного растения // Сб.тезисов 11 Сьезда Всес. об-ва физиологов растений. Минск. 1990. С.80.

26. Frolova L.V., Zagoskina N. V., Fedoseeva V.6 Correlation of phenolic production with mitotic activity in Camellia sinensis three cell strains // Yll Internat. Congress on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam. Abstracts. 1990. P.317.

27. Загоскина H.B., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения: некоторые аспекты образования полифенолов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М. Наука. 1991. С.32-36.

28. Загоскина Н.В., ЕлкинВ.В., Лобавина О.В., Запрометов М.Н Лигнин чайного растения и инициированных из него каллусных культур // Физиология растений. 1993. Т.40. В.З. С.465-469.

29. Zaprometov M.N., Zagoskina N.V., Elkin V.V. Comparative study of lignins produced by the tea-plant and by tea-plant derived callus tissues // Phytochemistry. 1993. V.32. N.3. P.709-712.

30. Загоскина Н.В., Азаренкова Н.Д., Любомилова М.В., Веренчиков С.П., Запрометов М.Н. Фенолкарбоновые кислоты в каллусной ткани чайного растения // 111 сьезд Всерос.об-ва физиол. растений. Санкт-Петерб. 1993.Тезисы докл. N. 1. С.102.

31. Федосеева В.Г., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Влияние гормональных эффекторов на образование фенольных соединений в каллусных тканях чайного растения отличающихся по уровню плоидности // 111 сьезд F.cepoc. об-ва физиол. растений. Санкт-Петерб. 1993.Тезисы докл. N. 2. С.102.

32. Загоскина Н.В., Федосеева В.Г., Фролова Л.В., Азаренкова Н.Д., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения: дифференицация, уровень плоидности, образование фенольных соединений // Физиология растений. 1994. Т.41. В. 5. С.762-767.

33. Загоскина Н.В., Фернандо С.Ч., Федосеева В.Г., Азаренкова Н.Д., Запрометов М.Н. К вопросу о способности диплоидных и полиплоидных сортов чайных растений к образованию фенольных

соединений // Сельскохозяйственная биология. ' 1994. N 5. С. 117-119.

34. Загоскина Н.В. Каллусные культуры растений: гормоноподобные соединения и полифенолы // 111 Междунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений". М. 1995. С. 222-223.

35. Загоскина Н.В. Фенольные соединения в клеточных культурах растений // Физиолого-биохимические основы физиологии растений. М. 1997. С.20.

36. Загоскина Н.В. Фенольный метаболизм в культурах растительных клеток // VI международная конференция "Биолгия культивируемых клеток и биотехнология". М. 1997. С.50.

37. Загоскина Н.В., Федосеева В.Г., Запрометов М.Н. Образование фенольных соединений у каллусных культур чайного растения с различным уровнем плоидности // Физиология растений. 1997. Т.44. N 6. С.931-934.

Информация о работе

Загоскина, Наталья Викторовна
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.12

Автореферат

Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.) - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы