Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности образования фенольных соединений у различающихся по уровню плоидности чайных растений и соответствующих им каллусных культур

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности образования фенольных соединений у различающихся по уровню плоидности чайных растений и соответствующих им каллусных культур"

рт Ь V»

22 -

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ФЕДОСЕЕВА Виктория Геннадьевна

ОСОБЕННОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ У РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО

УРОВНЮ ПЛОИДНОСТИ ЧАЙНЫХ РАСТЕНИЙ И СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, в лаборатории вторичного метаболизма.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор М.Н. ЗАПРОМЕТОВ

кандидат биологических наук

Н.В. ЗАГОСКИНА

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук З.Б. ШАМИНА

доктор биологических наук В.В. МАЗИН

Ведущее учреждение — Главный ботанический сад РАН.

Защита состоится 13 июня 1995 г. в 10 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета К 002.45.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан ............... 1995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

АЗАРКОВИЧ

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фенольные соединения являются одними из ¡аиболее распространенных в растениях так называемыми "веществами 5Торичного происхождения". Накопленные к настоящему времени данные юзволяют утверждать, что они являются необходимыми и активными метаболитами клеточного обмена. Так, полимер фенольной природы лиг-шн, участвуя в построении клеточных стенок, предохраняет растения )Т механических повреждений и внедрения патогенов (Запрометов, L985; Heilemann. Klinkott, Wray, 1988). Мономерные фенольные соеди-1ения выступают в качестве защитных агентов в патогенезе растений (фитоалексины), служат сигнальными веществами при взаимодействии с шсроорганизмами (Rhodes, 1985; Harborne, 1994). Общеизвестно также участие фенольных соединений в процессах фотосинтеза и дыхания (Запрометов, 1970).

Несмотря на большие успехи, достигнутые в изучении фенольных соединений (Harborne, 1989; Запрометов, 1993; Маргна,1991), многие юпекты их образования и роли в жизнедеятельности растений до сих юр не полностью выяснены.

Известно, что изменение генома растений сопровождается значительными изменениями в их физиологических и биохимических функциях (Мокроносов, 1981; Пустовойтова, 1985). Однако данные о влиянии >фовня плоидности клеток на их способность к синтезу вторичных соединений немногочислены и противоречивы. Так, например, в суспензионной культуре клеток Catharanthus roseus удвоение числа хромосом сопровождалось снижением способности к образованию алкалоидов (Deis, Zenk, 1982). Аналогичная тенденция выявлена и для Anchusa Officinalis в отношении розмариновой кислоты (Chaprln, Ellis, 1984). В го же время на суспензионной культуре сои было показано, что в ■слетках с более высоким уровнем плоидности способность к синтезу зторичных соединений была выше (Zaman, 1988).

В последние десятилетия для решения многих аспектов жизнедеятельности растений, в том числе и вторичного метаболизма, широкое эаспространение приобрела культура клеток и тканей растений, дающая возможность иметь дело со значительно более однородным материалом, зыращиваемым в строго контролируемых условиях (Бутенко, 1964).

Чайное растение, синтезирующее разнообразные фенольные соединения, преимуществено флавановой природы, а также полученные из не-"0 каллусные культуры успешно используются для изучения различных аспектов фенольного метаболизма (Курсанов, 1952; Запрометов, 1964; Цжемухадзе, 1967; Forrest, 1969; Запрометов и др., 1979; Загоскина. 1981).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение взаимосвязи между уровнем плоидности растительных клеток и их способностью к образованию фенольных соединений на примере диплоидных и тетраплоидных форм чайных растений, инициированных из них каллусных культур, а также каллусных культур, длительно выращиваемых в условиях in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности образования различных растворимых фенольных соединений (основных компонентов фенольного комплекса чайного растения - флаванов и проантоцианидинов, а также суммы растворимых фенольных соединений) и их предшественников (свободных L-фе-нилаланина и L-тирозина) у диплоидных и тетраплоидных растений сортов "Кимынь" и "Местный".

2. Получить каллусные культуры из отличающихся по уровню плоидности чайных растений и изучить их способность к образованию фенольных соединений, в том числе и флавановых производных.

3. Исследовать цитогенетические характеристики и особенности образования фенольных соединений у трех штамов длительно пассируемых каллусных культур чайного растения (сорт "Местный").

4. Используя воздействие колхицина, получить полиплоидные каллусные культуры чайного растения и изучить их цитогенетические характеристики и способность к образованию фенольных соединений.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые показало, что у диплоидных форм двух сортов растений чая "Местный" и "Кимынь" способность к образованию растворимых фенольных соединений была выше, чем у тетраплоидных их форм. Более продуктивным в отношении синтеза этих веществ являлся сорт "Местный". При инициации каллусных культур из отличающихся по уровню плоидности растений специфика фенольного метаболизма исходных тканей сохранялась. Это проявлялось как в более высокой способности каллусных культур листового происхождения к образованию фенольных соединений по сравнению с культурами стеблевого происхождения, так и в сохранении сортовых особенностей их образования. При этом каллусные культуры ин-циированные из диплоидных растений содержали больше фенольных соединений, по сравнению с культурами инициированными из тетраплоидных растений. При повышении уровня плоидности клеток каллусных культур как в процессе длительного пассирования, так и под влиянием колхицина, способность к накоплению фенольных соединений снижалась и изменялись их морфологические характеристики, в частности за счет увеличения размеров клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют наши представления об особенностях образования фенольных соединений в растениях с различным уровнем плоидности. Более высокая способность к синтезу растворимых фенольных соединений свойственна клеткам с диплоидным набором хромосом.

Результаты представляют и определенный практический интерес в связи с изучением различных сортов чайных растений. Наиболее перспективной для производства чая является диплоидная форма чайного растения сорта "Местный", содержащая значительные количества фенольных соединений. Селекция полиплоидных форм не способствовала получению высокопродуктивных в отношении синтеза фенольных соединений растений .

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты докладывались на Международной конференции по биологии культивируемых клеток и биотехнологии (Новосибирск, 1988). на IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990), на V всесоюзной конференции молодых ученых (Киев, 1992), на III сьзде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1994), а также на научных семинарах в лаборатории вторичного метаболизма ИФР РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на //& страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 8 таблиц, 32 рисунка. Список литературы, включает ссылки, в том числе (?<? иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили листья и зеленые неодревесневшие стебли молодых флешей интактных чайных растений (Camellia sinensis L.) диплоидных и полиплоидных (тетраплоидных) форм сортов "Местный" (грузинская разновидность) и "Кимынь", а также инициированные из них каллусные культуры и культуры, отличающиеся длительностью пассирования в условиях in vitro.

Тетраплоидные формы растений были получены в отделе физиологии и радиобиологии ВНИИЧиСК (Анасеули, Грузия) при воздействии на семена колхицином (Тавдгиридзе, 1979) и были любезно предоставленны нам д. б. н. И. Г. Керкадзе.

Для инициации каллусных культур использовали сегменты листьев и молодых зеленых стеблей 2-3-листных побегов (флешей) диплоидных и

тетраплоидных растений сортов "Местный и "Кимынь" собранных в июне месяце 1992 г. на опытном участке Чаквинского филиала ВНИИЧиСК .

Длительно пассируемые каллусные культуры были инициировании из молодых неодревесневших стеблей чайного растения сорта "Местный" в 1972 и в 1977 годах (штамм ЧС-1-1 и ЧС-2, соответственно) (Корец-кая, Запрометов, 1975; Загоскина, 1981). Штамм ЧС-1-2 спонтанно выделился из штамма ЧС-1-1 в 1980 году.

Основная питательная среда для роста каллусных культур чайного растения содержала минеральные соли по Хеллеру (Бутенко, 1964), витамины по Уайту (Бутенко, 1964), цитрат железа - 35 мг/л, аденин -5 мг/л, пантотенат кальция - 0,1 мг/л, миоинозит - 20 мг/л, глюкозу - 25 г/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту - 5 мг/л, дрожжевой экстракт - 1 г/л и агар - 7 г /л (Корецкая, Запрометов, 1975).

Для получения полиплоидных культур штаммы ЧС-1-1 и ЧС-2 выращивали на среде с колхицином (0,1% и 0,03%, 2-3 пассажа).

В течение всего периода роста тканей соблюдались стандартные условия: температура 27° С, относительная влажность воздуха 70%, темнота. Продолжительность цикла культивирования составляла 7 недель. .

О характере роста каллусных культур судили по изменению прироста свежей биомассы тканей за определенные периоды времени (10-кратная повторность).

Содержание воды в тканях определяли путем их высушивания до постоянного веса при 105° С (3-кратная повторность).

Для проведения цитогенетических исследований калусные ткани фиксировали смесью Карнуа (20 час.; 20°С), промывали последовательно 70%~нда, 50%-ным, 30%-ным водным этанолом и дистиллированной водой. Для размягчения тканей проводили гидролиз 1%-ным раствором пектиназы (24 часа, 36° С). Материал окрашивали ацето-гематоксили-ном (20 час.; 20°С) и мацерировали в смеси хлоралгидрата с глицерином. Для определения митотического индекса анализировали 5000 клеток на давленых препаратах. Числа хромосом подсчитывали на 50-60 метафазных пластинках. Размеры клеток определяли с помощью окуляр-микрометра, измеряя их большие (D) и малые (d) диаметры (у 100 клеток). В работе использовали микроскоп Ergaval (Karl Zeiss, Германия) .

Определение содержания суммы растворимых Фенольных соединений, флаванов. проантоцианидинов и флавонолов . Фенольные соединения извлекали из лиофильно высушенного материала экстракцией горячим 96%-ным этанолом. Содержание суммы растворимых фенольных соединений определяли спектрофотометрически с помощью реактива Фолина-Дениса

(поглощение при 725 нм), содержание флаванов (катехины + проантоци-анидины) - с 1%-ным раствором ванилина в 70%-ной H2S04 (поглощение при 500hm). ( Swain, Hillis,1959; Запрометов, 1971). Калибровочные кривые в обоих случаях строили по (-)-эпикатехину .

Содержание проантоцианидинов определяли спектрофотометрически с бутанольным реактивом (поглощение при 550 нм) (Stafford, Cheng, 1980). Калибровочную кривую строили по цианидину.

Содержание флавонолов определяли по реакции с 0,5%-ным водным раствором хлористого алюминия (поглощение при 415 нм) (Gage, Wendel, 1950). Калибровочную кривую строили по рутину.

Анализ Фенольных соединений. Для идентификации фенольных соединений этанольные экстракты хроматографировали в тонком слое микрокристаллической целлюлозы (растворители: н-бутанол - СН3С00Н -вода, 40:12:28 и 2%-ная СН3 СООН). Хроматограммы проявляли 1%-ным раствором ванилина в конц. HCl, 1%-ным этанольным раствором FeCI3 и смесью равных обьемов 1%-ных водных растворов FeCI3 и K3tFe(CN6)].

Определение содержания свободных L-Фенилаланина и L-тирозина. Лиофильно высушенный материал экстрагировали 80%-ным этанолом, объединенные экстракты фильтровали, упаривали (водяная баня, 70° С) и анализировали с помощью аминокислотного анализатора (ААА-339 М, фирма "Kovo", ЧССР) (Тимощенко и др., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ДИПЛОИДНЫХ И ТЕТРАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЯХ ЧАЯ И ИНИЦИИРОВАННЫХ ИЗ НИХ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ

Диплоидные и тетраплоидные сорта растений чая и содержание в них Фенольных соединений. Из двух изученных нами сортов чайного растения, сорт "Местный" оказался более мелколистным и характеризовался большей интенсивностью окраски листовых пластинок, чем сорт "Кимынь". В пределах каждого сорта между диплоидными и тетраплоид-ными формами существовали некоторые морфологические различия, хотя они и не позволяли судить об уровне плоидности растений.

Характерной особенностью чайного растения является способность к синтезу разнообразных соединений фенольной природы, на долю которых в листья приходится до 60% от сухого веса (Курсанов, 1952; Запрометов, 1964; Джемухадзе, 1967; Дараселия и др.. 1989). Основными компонентами фенольного комплекса являются флавоноиды, представленные простыми и галлированными формами катехинов и димерными и олигомерными проантоцианидинами, а также флавонолы (Запрометов,

- 8 -

1964; Джемухадзе, 1967; Чхиквишвили, 1985).

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений и флаванов в листьях и молодых стеблях показало, что изученные сорта чайного растения отличались по способности к синтезу фенольных соединенй. У растений сорта "Местный" их содержание было выше, чем у растений сорта "Кимынь" (рис.1,2). В большей степени эти различия проявлялись у тетраплоидных форм.

Во всех случаях в листьях содержание растворимых фенольных соединений было в 2-3 раза выше, чем в молодых неодревесневших стеблях. Это согласуется и с ранее полученными данными о более высокой биосинтетической способности листьев (Запрометов, 1964; Джемухадзе, 1967; Цоциашвили, Бокучава, 1989).

Диплоидные формы растений содержали большие количества фенольных соединений по сравнению с тетраплоидными (рис.1,2). Это касалось и суммы фенольных соединений, и, в меньшей степени, флаванов. Накопление проантоцианидинов (димеров и олигомеров флавановой природы), наоборот, было выше у тетраплоидных форм (табл.1).

Таблица 1

Содержание проантоцианидинов в листьях и стеблях диплоидных ( I) и тетраплоидных (II) растений чая ( мг/г сухой массы)

Сорт Орган т II

Местный лист 32,60 39,60

стебель 34,15 67,60

Кимынь лист 45,10 60.00

стебель 29,00 75,15

Содержание же флавонолов не зависело от уровня плоидности растений и их сортовых характеристик. Их образование характерно, главным образом, для листьев, тогда как в стеблях они присутствуют в незначительных количествах.

Следует также отметить, что диплоидные и тетраплоидные чайные растения не отличались по составу синтезируемых ими фенольных соединений. Однако у тетраплоидных форм наблюдалось некоторое увеличение доли проантоцианидинов в фенольном комплексе.

Как известно, основными ароматическими предшественниками фенольных соединений являются Ь-фенилаланин и, в меньшей степени, Ь-тирозин (Маргна, 1991). По некоторым представлениям интенсивность

А

Б

2

& 40 >

£ 20 0

Диплоид

Тетраплоид

Диплоид

Тетраплоид

Рис.1 Содержание суммы растворимых фенольных соединений (1) и флаванов (2) в стеблях (А) и листьях (Б) диплоидной и тетраплоидной форм чайного растения сорта "Местный"

Диплоид

Тетраплоид

2 200

8

Диплоид

Тетраплоид

Рис. 2. Содержание суммы растворимых фенольных соединений (1) и флаванов (2) в стеблях (А) и листьях (Б) диплоидной и тетраплоидной форм чайного растения сорта "Кимынь"

фенольного метаболизма в значительной степени зависит от имеющегося в клетках фонда свободного Ь-фенилаланина. В ряде случаев, например, для злаков и для чайного растения (Запрометов, Бухлаева. 1971) было показано эффективное использование в качестве предшественника фенольных соединений не только Ь-фенилаланина, но к 'Ь-тирозина.

Определение содержания свободных Ь-фенилаланина и Ь- тирозина показало, что во всех случаях их количество в листьях чайных растений несколько ниже, чем в молодых неодревесневших стеблях (табл.2). У диплоидных форм содержание этих аминокислот практически во всех случаях заметно выше по сравнению с тетраплощщыми; формами, что согласуется и с содержанием в них фенольных соединений. Следует также отметить, что у растений сорта "Местный" содержание свободных Ь-фенилаланина и Ь-тирозина выше по сравнению с растениями сорта "Кимынь".

Таким образом, диплоидные и тетраплоидные формы растений чая (сорта "Местный" и "Кимынь") отличаются по способности к синтезу фенольных соединений. Для диплоидных форм растений чая характерна более высокая способность к синтезу фенольных соединений по сравнению с тетраплоидными их формами. ■ Это проявляется как на уровне содержания предшественников (свободных Ь-фенилаланина и Ь-тирозина), так и на уровне содержания самих растворимых фенольных соединений, включая и характерные для чая флавановые производные.

Таблица 2.

Содержание свободных Ь-фенилаланина (I) и Ь-тирозина

(II) (мкмоль/г сухой массы) в диплоидных и тетраплоидных растениях чая сортов "Местный" и "Кимынь"

сорт Уровень Орган I II

плои дно сти.

Местный 2 п лист 3, 05 5,8

стебель 3, 25 3.2

Местный 4 п лист 0,2 0,3

стебель 4, 55 3,25

Кимынь 2 п лист 0, 35 1,45

стебель 1.7 3.75

Кимынь 4 п лист 0, И 0,44

стебель 0, 65 2,15

35 30 25 20 -15 -10 5 0

- и -

Диплоид

Тетраплоид

Диплоид

Тетраплоид

Рис. 3. Содержание суммы фенольных соединений (1) и флаванов (2) в каллусных культурах листа (А) я стебля (Б) диплоидной и тетраплоидной форм чайного растения сорта "Кимынь" (5 пассаж).

1 1

|Н|нв 1

Диплоид

Тетраплоид

Рис. 4. Содержание суммы растворимых фенольных соединений (1) и флаванов (2) в каллусных культурах стебля диплоидной и тетраплоидной форм чайного растения сорта "Местный" (5 пассаж) 30 т-1-

„ 25 -

1 20

2

? 15

Ь ^ 10

& 5Н

О

Диплоид

I Г^г-Гг-'---^- х' ~ *

Тетраплоид

Ркс. 5. Содержание суммы растворимых фенольных соединенна (1) и флаванов (2) в каллусных культурах листа чайного растения сорта "Кимынь". (10 пассаж)

Каллусные культуры. инициированные из диплоидных и тетраплоид-ных сортов чайного растения и содержание в них Фенольных соединений. В литературе имеется ограниченное число публикаций о культурах тканей чайного растения (Forrest, 1969; Корецкая, Запрометов, 1973; Нисанка, 1983; Kato, 1985). В известной степени это связано с трудностями их инициации, обсуловленными содержанием значительных количеств легко окисляющихся фенольных соединений.. (Anonymons. 1978; Compton, Ргеесё, 1986).

Каллусные культуры, инициированные из листа и стебля диплоидных и тетраплоидных растений во время первых 5-ти пассажей почти не отличались по морфологическим характеристикам. Они имели светло-желтый цвет, были компактными и очень плотными. По мере дальнейшего пассирования.начали проявляться различия между культурами инициированными из диплоидных и тетраплоидных форм растений. Так, каллусы, инициированные из листьев диплоидной формы сорта "Кимынь", оставались плотными и имели светло-коричневый цвет. Каллусные же ткани, инициированные из листьев тетраплоидной формы . этого сорта, стали рыхлыми, светло-желтого цвета и легко распадались на отдельные кусочки. Аналогичная тенденция отмечалась и для каллусных культур инициированных из стеблей растений сорта "Местный".

Ранее было показано, что введение тканей чайного растения в культуру сопровождается снижением их способности к синтезу фенольных соединений (Корецкая, • Запрометов, 1975). Наблюдается также и обеднение состава фенольного комплекса, хотя способность к образованию характерных для чая флавановых производных сохраняется (Forrest, 1969; Корецкая, Запрометов, 1975). Последние представлены лишь простыми формами катехинов - (+)-катехином и (-)-эпикатехином. а также проантоцианидинами.

В нашем случае, у всех инициированных из чайных растений каллусных тканей, содержание суммы фенольных:соединений и флаванов было значительно ниже, чем в тканях интактного растения (рис. 3,4) Что же касается проантоцианидинов (одних из основных компонентов фенольного комплекса каллусных культур чайного растения)' (Корецкая, запрометов. 1975), то здесь наблюдалась другая тенденция. Так, если в стебле растений диплоидной формы сорта "Местный" содержание проантоцианидинов составляло 34,15 мг/г сухой массы, то в инициированной из него каллусной ткани оно было вдвое вше (70 мг/г сухой массы). Эта же закономерность, хотя и менее выражено, была характерна и для сорта "Кимынь".

Каллусные культуры иницированные из листа и стебля различались между собой по содержанию фенольных соединений (рис.3,4). Культуры

5 11 18 24 29 35 39 46

Сутки

Б

Сутки

В

Сутки

Рис. 6. Динамика роста каллусных культур чайного растения штаммов ЧС-1-1 (А),ЧС-1-2 (Б) кЧС-2 (В).

Сугкк

Б

О 1 3 5 7 8 11 14 16 18 24 29 35 39 46

Сутки

Сутки

Рис. 7. Изменение митотической активноности в процессе роста каллусных кулгур чайного растения штаммов ЧС-1-1 (А), ЧС-1-2 (Б) и ЧС - 2 (В).

листового происхождения во всех случаях содержали несколько большие количества как суммы растворимых фенольных соединений, так и флава-нов, по сравнению с каллусами стеблевого происхождения, что согласуется и с данными, полученными на интактных растениях чая. В условиях In vitro в известной мере сохранялись и особенности образования фенольных соединений свойственные различным сортам чайных растений. Так, каллусные культуры, инициированные из растений сорта "Местный" содержали большее количество фенольных соединений, по сравнению с культурами, инициированными из растений сорта "Кимынь".

Что же касается различий в способности к образованию фенольных соединений у каллусных культур, инициированных из диплоидных и тет-раплоидных форм растений чая каждого сорта, то они проявились лишь по мере культивирования. После 10-го пассажа каллусные культуры, инициированные из диплоидных форм, содержали больше как суммы растворимых фенольных соединений, так и флаванов, по сравнению с кал-лусными культурами инициированными из тетраплоидных форм (рис.5).

При инициации каллусных культур происходили изменения в фондах предшественников фенольных соединений - свободного L-фенилаланина и свободного L-тирозина, по сравнению с интактными тканями (табл.3). При этом в большинстве случаев в каллусных культурах наблюдалось снижение содержания свободного L-тирозина.

Таблица 3

Содержание свободных L-фенилаланина (I) и L-тирозина (II) (мкмоль/г сухой массы) в каллусных культурах инициированных из диплоидных и тетраплоидных растений чая сортов "Местный" и "Кимынь"

Сорт Уровень Орган I II

плоидности

Местный 2 п стебель 2.93 1.35

Местный 4 п стебель 1.84 0. 15

Кимынь 2 п лист 1,20 0,25

стебель 1,62 1.75

Кимынь 4 п лист 1,5 0,00

стебель 1.05 0.00

Как и в интактных растениях, содержание этих ароматических аминокислот было выше у каллусных культур, инициированных из экс-плантов сорта "Местный". В культурах инициированных из диплоидных растений в большинстве случаев накопление свободных L-фeнилaлaнинa и Ь-тирозина было выше, чем в культурах, инициированных из тетрап-

лоидных сортов.

В целом, при введении тканей чайного чайного растения в культуру в них в известной мере сохранялись сортовые особенности и специфика фенольного метаболизма листа и стебля чайного растения. При этом, как интактные растения, так и каллусные культуры с более высоким уровнем плоидности характеризовались меньшей' способностью к синтезу фенольных соединений.

ДЛИТЕЛЬНО ВЫРАЩИВАЕМЫЕ КАЛЛУСНЫЕ КУЛЬТУРЫ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ: МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, ПЛОИДНОСТЬ

Содержание Фенольных соединений в длительно пассируемых кал-лусных культурах чайного растения с различным уровнем плоидности. Известно, что культивируемые In vitro клетки и ткани растений являются гетерогенными клеточными популяцими, состав которых может меняться по мере пассирования (Шамина, 1981; Кунах, 1990). При этом во многих случаях длительное пассирование сопровождается повышением уровня плоидности клеток, что в свою очередь отражается как на их морфологических, так и на биохимических характеристиках (Фролова, 1978; Шамина, 1981; Dolezel, Novak, 1985; Бутенко, 1991; Tawakley et. al., 1992; Губарь, Кунах, 1992).

Длительно выращиваемые в условиях In vitro каллусные культуры чайного растения стеблевого происхождения различались по морфологическим характеристикам. Штамм ЧС-1-1, инициированный из молодого неодревесневшего стебля и выращиваемый в культуре на протяжении 20 лет, представлял собой рыхлый светло-желтый каллус, состоящий из сгруппированных в небольшие агрегаты крупных вакуолизированных клеток (D=71.43±3.34 мкм; d=48,60±2,51 мкм) с утолщенными клеточными стенками.

Штамм ЧС-2, также инициированный из молодого неодревесневшего стебля и субкультивируемый в течение 15 лет, представлял собой плотный светло-коричневый каллус, состоящий из небольших по размеру клеток (D=38,27+1,65 мкм; d=24,35+0,84 мкм) с довольно мелкими вакуолями и тонкими клеточными стенками.

Штамм ЧС-1-2, спонтанно выделившийся из штамма ЧС-1-1 и субкультивируемый на протяжении 12 лет. по размеру клеток (D=42,91±1,63 мкм; d=25,12+1,03 мкм) и другим морфологическим характеристикам значительно отличался от исходного штамма и был близок к штамму ЧС-2. \

Исследование ростовых характеристик каллусных культур показало, что во всех случаях прирост тканей в течении пассажа был не вы-

60 50

I "0

3

I 30

ё 20 £

10 о

< Зп > < 4п >

Рис. 8. Распределение клеток по уровню шговдности у каллусных культур штаммов ЧС-1-1 (А), ЧС-1-2 (Б) и ЧС-2 (В).

Сутки

Б

Сутки

В

Сутки

Рис. 9. Изменение содержания суммы растворимых фенольных соединений (1) и флаванов (2) в каллусных культурах чайного растения штаммов ЧС-1-1 (А), ЧС-1-2 (Б) иЧС-2 (В).

соким (рис. 6) и не отражался типичной S-образной кривой характерной для большинства культивируемых клеток и тканей растений (Носов, 1991). По содержанию воды ткани этих штаммоамало отличались друг от друга . Более оводненным являлся штамм ЧС-1-1 (92-93%), по сравнению со штаммами ЧС-1-2 и ЧС-2 (86-89%). По мере роста культур значительных изменений в величине этого показателя не наблюдалось .

Для всех штаммов характерна низкая интенсивность клеточных делений обычно не превышающая 1,4% (рис.7). Наиболее низкий ее уровнь отмечен у штамма ЧС-1-1. По мере роста каллусных культур наблюдались изменения в величине митотического индекса, более выраженные у штаммов ЧС-1-2 и, особенно, ЧС-2.

Исследование цитогенетических характеристик каллусных культур показало, что все три штамма представляли собой миксоплоидные культуры и содержали клетки различного уровня плоидности (от 1 п до 5-6 п) (рис. 8), как это характерно и для большинства культивируемых in vitro клеток и тканей растений (Фролова, 1981; Butenko, 1985; Со-ловьян и др., 1994). Наибольший размах изменчивости по этому показателю наблюдался у штамма ЧС-1-2 . При этом, у штамма ЧС-1-1 модальный класс составляли тетраплоидные клетки (60% от суммы проанализированных метафаз), тогда как у. штаммов же ЧС-1-2 и, особенно, ЧС-2 доминировали диплоидные клетки, характерные для интактного растения чая (2 п = 30) (Керкадзе, 1983; Kato, 1989). На их долю приходилось 60% и 76% от суммы проанализированных метафаз (соответственно) .

Определение содержания различных форм фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения показало, что Наиболее низка способность к их образованию у штамма ЧС-1-1, а наиболее высока - у штамма ЧС-2 (рис.9). При этом по мере роста каллусных культур образование в них фенольных соединений менялось (рис.9). У штамма ЧС-1-1 эти изменения выражены очень слабо, тогда как у штаммов ЧС-1-2 и,' особенно, ЧС-2 они более значительны, во всех случаях наибольшее количество суммы фенольных соединений и флаванов обнаружено в первые 20 дней культивирования. Во второй половине цикла выращивания их содержание в тканях снижалось.

Кроме того, наибольшее накопление растворимых фенольных соединений во всех штаммах каллусных культур чайного растения совпадало с периодом интенсивных клеточных делений (см. рис.9). Особенно четко это проявлялось у штаммов ЧС-2 и ЧС-1-2, для которых характерна довольна высокая способность к образованию фенольных соединений. Такая закономерность согласуется с ранее полученными данными о максимальном содержании фенольных соединений в молодых побегах (фле-

0.8 0.7

I °'6

« 0.5

0

& 0.4

1 0.3

Й 0.2 Ж

0.1 о

ЧС-1-1

ЧС-1-2

Рис.10. Содержание свободного Ь-фенилаланина в каллусных культурах стебля чайного растения.

45 4035 3025 20 15

8 ж

ж 10

5 -0

Рис. 11. Распределение клеток по уровню плоидности у линии Л-2, полученной после обработки каллусной культуры штамма ЧС - 2 колхицином (0.03%).

ЧС-2

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

1

1

2

Л1

Л2

Рис. 12. Содержание суммы растворимых фенолышх соединений (1) и флаванов (2) в двух линиях каллусных культур чайного растения штама ЧС-2, полученных после обработки колхицином (0.03%).

- 21 -

шах) чайного растения (Запрометов, 1964).

Определение содержания свободных ароматических аминокислот показало, что каллусные культуры чайного растения отличались по содержанию свободного L-фенилаланина, тогда как свободный L-тирозин в них практически не накапливался (рис. 10). Наибольшее количество свободного L-фенилаланина было характерно для штамма ЧС-2 по сравнению со штаммами ЧС-1-2 и, особенно ЧС-1-1, что согласуется и с содержанием в этих каллусных тканях фенольных соединений.

Таким образом можно заключить, что у длительно выращиваемых в условиях in vitro каллусных культур чайного растения способность к образованию фенольных соединений зависит прежде всего не от условий их инициации и длительности пассирования, а от наличия характерных для самого чайного растения диплоидных клеток. Повышение же уровня плоидности каллусных культур приводило к снижению содержания растворимых фенольных соединений в тканях, что согласуется и с данными получеными на интактных растениях чая.

Влияние колхицина на каллусные культуры чайного растения и на образование в них фенольных соединений. В целях направленной полип-лоидизации растительных тканей часто используют обработку колхицином что, как правило, сопровождается значительным увеличением размеров и скорости роста клеток (Dolezel, Binarova, 1989;Манжулин и др., 1991) и изменением их биохимических характеристик (Мокроносоз, 1981; Пустовойтова, 1985).

Длительно пассируемые каллусные культуры чайного растения штаммов ЧС-1-1 и ЧС-2, отличающиеся как по уровню плоидности клеток. так и по способности к образованию фенольных соединений . по-разному реагировали на воздействие колхицином. У штамма ЧС-1-1 происходили необратимые изменения тканей, приводящие к их гибели. У штамма же ЧС-2 при культивировании на среде с низкой концентрацией колхицина (0,03%) после 10-го пассажа сформировалось две линии -Л-1 и Л-2. Одна из которых (Л-l) по морфологическим характеристикам не отличалась от исходного штамма ЧС-2, и представляла собой медленно растущий каллус светло-коричневого цвета, плотный и компактный (индекс роста 400 %). Входящие в него клетки имели небольшие размер (D=41,72+0,8 мкм; d=29,53+0,66 мкм) . Судя по всему, линия Л-1 - это оставшаяся без изменений клеточная популяция штамма ЧС-2.

Каллусная же ткань линии Л-2 значительно отличалась от каллус-ной ткани линии Л-1. Она представляла собой сильно оводненный темно-коричневый каллус очень мягкой консистенции с хорошим индексом роста (более 500 %). Клетки этой ткани были довольно крупными и ва-куолизированными (D= 51,14+1,31 мкм; d= 35,79±0,78 мкм).

Исследование цитогенетических характеристик этих культур показало, что у линий Л-1 в делящейся популяции преобладали клетки с диплоидным набором хромосом, как это было характерно для каллусной ткани штамма ЧС-2. Что же касается каллусной ткани линии Л-2, то в ней доминировали триплоидные клетки (рис.11). Увеличивалось и количество тетраплоидных клеток.

Таким образом, обработка каллусной ткани штамма ЧС-2 колхицином способствовала полиплоидизации некоторой части входящих в нее клеток что и привело к формирование новой каллусной культуры в виде линии Л-2. О том, что эта линия является полиплоидной культурой свидетельствуют данные подсчета числа хромосом, а также ее морфологические характеристики, в частности большие размеры клеток, как это и характерно для полиплоидных культур (Мокроносов, 1981; Манжу-лин и др., 1991).

Определение содержания фенольных соединений выявило значительные различия в биосинтетической способности каллусных культур линий Л-1 и Л-2 (рис. 12). Для линии Л-1 характерно более высокое накопление этих соединений, по сравнению с линией Л-2, и близкое к таковому штамма ЧС-2. В большей степени это касалось содержания флавано-вых производных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение уровня плоидности клеток каллусной культуры чайного растения вызванное действием колхицина приводит к снижению их способности к образованию растворимых фенольных соединений, как это отмечалось и во всех вышеописанных случаях.

- 23 -ВЫВОДЫ

1. Использование диплоидных и тетраплоидных чайных растений сортов "Местный" и "Кимынь", инициированных из них каллусных культур. а также длительно пассируемых каллусных культур позволило выяснить взаимосвязь между уровнем плоидности клеток и их способностью к образованию фенольных соединений.

2. Для диплоидных форм различных сортов чайных растений характерно более высокое суммарное содержание растворимых форм фенольных соединений и, в меньшей степени, флаванов по сравнению с тетрапло-идными формами. По способности же к накоплению флавонолов таких различий не обнаружено.

3. При инициации каллусных культур из листа и стебля различных по уровню плоидности чайных растений сохраняется не только способность к синтезу фенольных соединений, в том числе и флавановых производных, но и характерная для тканей исходного растения специфика их образования.

4. Наибольшее накопление фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения совпадает с периодом интенсивных клеточных делений.

5. У каллусных культур чайного растения способность к образованию фенольных соединений зависит, главным образом, не от длительности их пассирования, а от наличия и количества характерных для самого исходного чайного растения диплоидных клеток.

6. Повышение уровня плоидности клеток каллусных культур чайного растения как в процессе длительного пассирования, так и под влиянием колхицина, сопровождается снижением способности к накоплению фенольных соединений, а также изменением морфологических характеристик тканей, в частности увеличением размеров клеток.

7. Между содержанием свободного Ь-фенилаланина и содержанием растворимых фенольных соединений существует четкая взаимосвязь как у интактных растений, так и у различных штаммов каллусных культур чайного растения.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Загоскина Н.В., Федосеева В. Г. Особенности фенольного метаболизма двух штаммов каллусных культур чайного растения, выращиваемых на среде с 2.4 Д. сборн. "Регуляция жизнедеятельности растений химическими средствами". Ярославль. 1988. с. 73-80.

2. Федосеева В.Г., Загоскина Н. В., Фролова Л.В., Запрометов М.Н. Характеристика трех штаммов каллусных культур чайного растения в связи с их способностью к образованию фенольных соединений. Тез.

Междунар. конф. по биологии культивируемых клеток и биотехнологии. Новосибирск. 1988. с. 70-71.

3. Федосеева В.Г. Культура ткани чайного растения: образование фенольных соединений и митотическая активность. Тез. IV Всес. конф. молодых ученых по физиологии раст. клетки. Минск. 1990. с. 88.

4. Zagoskina N. V., Frolova L.V., Fedoseeva V.G. Correlation of phenolic production with mitotic activity In Camellia sinensis three cell strains. Abstr. 7 Int. Congr. on Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam. 1990. p. 317.

5. Федосеева В.Г. Особенности действия различных гормоноподоб-ных эффекторов на образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения. Тез. V Конф. молодых ученых по актуальным проблемам физиол. растений и генетики. Киев. 1992. с. 58.

6. Федосеева В.Г., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Влияние гормональных эффекторов на образование фенольных соединений в каллусных, тканях чайного растения, отличающихся по уровню плоидности. Тез. III съезд всерос. об-ва физиологов растений. Санкт-Петербург 1993. с. 224.

7. Загоскина Н.В., Фернандо С.Ч., Федосеева В.Г., Запрометов М.Н. К вопросу о способности диплоидных и полиплоидных сортов чайных растений к образованию фенольных соединений. Сельскохозяйственная биология. N5. 1994. с. 117-119.

8. Загоскина Н.В., Федосеева В.Г., Фролова Л. В., Азаренкова Н.Д., Запрометов М.Н. Культура тканей чайного растения: дифференциация, уровень плоидности и образование фенольных соединений. Физиол. растений. Т.41. N5. 1994. с. 762-767.