Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса (Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) и в инициированных из них каллусных культурах

Зайцева, Светлана Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса (Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) и в инициированных из них каллусных культурах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса (Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) и в инициированных из них каллусных культурах"

На правах рукописи

□ОЗОБ9751

ЗАЙЦЕВА Светлана Михайловна

ОБРАЗОВАНИЕ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ ТИССА {Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) И В ИНИЦИИРОВАННЫХ ИЗ НИХ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ

03 00 23-Биотехнология, 03 00 12-Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2007

Москва 2007

003059751

Работ выполнена в лаборатории лииидного и фенольпого метаболизма Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН, г Москва

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор биологических наук

Загоскина Наталья Викторовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Калашникова Елена Анатольевна Соловченко Алексей Евгеньевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Главный Ботанический Сад им Н В Цицина РАН

Защита состоится "25" мая 2007г в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 220 043 10 при Российском Государственном Аграрном Университете - МСХА имени К А Тимирязева, по адресу 137550, г Москва, ул Тимирязевская, 49 e-mail karIov@timacad ru тел/факс 977-94-33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева по адресу 137550, г Москва, ул Тимирязевская, 49

Автореферат разослан апреля 2007г и размещен на сайте университета

\v\vw Ьтасай ги

Ученый секретарь

Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г И Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Для высших растений характерно образование так называемых "вторичных" соединений, к которым относятся фенольные соединения, синтезирующиеся практически во всех клетках (Harborne, 1980, Запрометов, 1993) Установлено участие этих веществ в формировании клеточных стенок, дыхании, фотосинтезе, аллелопатии, а также защите растений от стрессовых воздействий (Лукнер, 1979, Запрометов, 1996) Они имеют и важное практическое значение На окислительных превращениях фенольных соединений основаны технологические процессы в пищевой и легкой промышленности В медицине широко применяются лекарственные препараты, изготовленные на их основе, которые обладают капилляроукрепляющим, противовоспалительным, антисклеротическим, противолучевым и противоопухолевым действием (Барабой, 1976, 2001, Запрометов, 1993, Куркин, 1996, Тюкавкина, 2004, Плотников, 2005)

В последнее время большое внимание исследователей обращено на растения тисса (род Taxus), обладающие способностью к синтезу уникального соединения — таксола (таксоидов), успешно используемого в терапии онкологических заболеваний (Guy, Scott 1996, Guillemard, 1999, Borekdohalska 2000, Huang, 2000, Lee, Kim 2001) Фармо-кинетические особенности таксола проявляются в способности блокировать анафазу митотического деления, связываясь с цитоскелетом раковой клетки (Bicamumpaka, 1998, Pradier, 1999, Miller, 1999, Барабой, 2001) Таксоиды представляют собой дитерпеноиды, в структуре которых присутствует 3-(Ы-метиламино)-3-фенилпропаноилоная структура, являющаяся производным фенольной природы Следовательно, их биосинтез осуществляется при участии как изопреноидного, так и фенольного метаболизма Взаимосвязь этих метаболических путей уже отмечалась в литературе (Пасешниченко, 1995) Однако данных о фенольных соединениях и их образовании в растениях тисса крайне мало (Орлова, 1977, El Moclafor, 1996, Das, 1993, Kawamura, 2000)

Поскольку растения тисса относятся к реликтовым видам и имеют ограниченный и труднодоступный ареал распространения в природе (Гумбатов 1989, Александрова, 1999), большое практическое значение приобретает инициация из них каллусных и суспензионных культур, как возможных источников биологически активных и лекарственных препаратов

Целью настоящей работы являлось изучение фенольного метаболизма у двух представителей рода Taxus - тисса ягодного (Т baccata L) и тисса канадского (Т canadensis Marsh.), значительно отличающихся по морфо-

физиологическим характеристикам, а также у инициированных из них каллусных культур

В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Изучить образование и состав фенольных соединений листьев, стеблей и корней тисса ягодного и тисса канадского

2 Исследовать изменения в образовании мономерных и полимерных форм фенольных соединений и активности ¿-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) в процессе вегетации побегов тисса ягодного и тисса канадского

3 Выяснить внутритканевую и внутриклеточную локализацию фенольных соединений в различных органах тисса

4 Получить каллусные культуры тисса ягодного и тисса канадского и изучить их способность к синтезу фенольных соединений

5 Исследовать изменения в содержании, составе и локализации фенольных соединений в процессе пассирования клеток тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro

Научная новизна. Впервые проведено изучение фенольного метаболизма растений тисса (Т baccata L и Т canadensis Marsh), значительно отличающихся по морфо-физиологическим характеристикам, и его изменений в условиях m vitro

Показано, что тисс ягодный характеризуется более высокой способностью к накоплению фенольных соединений (особенно флавоноидов) по сравнению с тиссом канадским При этом в обоих случаях содержание полифенов было выше в листьях и стеблях растений, чем в корнях

Фенольные соединения тисса представлены фенилпропаноидами и флавоноидами - флаванами (катехинами и проантоцианидинами), а также флавонолами В надземных органах растений состав фенольного комплекса более разнообразен, чем в подземных, преимущественно за счет образования флавонолов, которые не синтезируются в корнях

Показано, что образование суммы растворимых фенольных соединений, флавонолов, флаванов, проантоцинидинов и лигнина меняется по мере роста растений тисса, что в большей степени выражено в побегах первого года вегетации При этом активность ФАЛ, «ключевого» фермента биосинтеза полифенолов, не является критерием биосинтетической способности тканей

Выяснено, что инициация каллусных культур тисса зависит от онтогенетического состояния эксплантов и от содержания в них фенольных соединений Формирование каллусных клеток более интенсивно происходит

на эксплантах зимнего периода вегетации, по сравнению с таковыми летнего периода вегетации

Показано, что в условиях т vitro фенольный метаболизм клеток тисса меняется Это проявляется и на количественном их уровне и на качественном составе Во время первых циклов культивирования содержание фенольных соединений в каллусных культурах значительно выше, чем в тканях интактного растения (особенно у культур тисса ягодного) По мере дальнейшего пассирования уровень фенольных соединений либо продолжает увеличиваться, что характерно для культур тисса ягодного, или может снижаться, что отмечалось у культур тисса канадского При этом значительное содержание фенольных соединений в каллусных клетках приводит к их гибели (каллусы тисса ягодного)

Установлено, что накопление фенольных соединений в каллусных культурах тисса обусловлено активацией ФАЛ, уровень которой во всех случаях был в 3-7 раз выше, чем в исходных тканях

Показано, что растворимые фенольные соединения (флавоноиды и фенилпропаноиды) накапливаются в вакуолях, а также в специализированных клетках - вместилищах (фенол-запасающие клетки) как в тканях интактного растения, так и в каллусных культурах Иногда они обнаруживаются и в межклетниках Полимерные формы фенольных соединений (лигнин) откладываются в клеточных стенках В каллусных культурах прослеживается прямая взаимосвязь между их способностью к синтез фенольных соединений и числом клеток-вместилищ

Научно-практическое значение. Полученные данные вносят значительный вклад в понимание особенностей образования фенольных соединений в растениях, в частности у представителей рода Taxus и инициированных из них каллусных культурах Установление высокой способности молодых тканей тисса (побеги первого года вегетации) к накоплению фенольных соединений может быть использовано в оценке качества растительного сырья Важное значение принадлежит и результатам о том, что высокий уровень фенольных соединений в культурах т vitro приводит к их гибели Это еще раз свидетельствуя о разнообразной роли этих представителей вторичного метаболизма в жизни растений

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной ботанической конференции "Botanicgarden"(Freiburg, 2002), на V и VI Международных симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва-Пущино, 2003, 2005), V съезде

Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004), региональной конференции ОФР (Орел, 2006), расширенном семинаре лаборатории липидного и фенольного метаболизма ИФР РАН (Москва, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 44 рисунка Список литературы содержит 361 источник, из которых 251 на иностранных языках

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследований служили растения тисса ягодного (Taxus baccata L) и тисса канадского (Taxus canadensis Marsh), произрастающие на территории Главного ботанического сада РАН (Москва), а также инициированные из них каллусные культуры

Инициация каллусных культур и условия субкультивирования Для инициации каллусных культур использовали однолетние побеги тисса летнего и зимнего периодов вегетации (июль и январь) Материал стерилизовали и помещали на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую НУК (0,5 мг/л), 2,4-Д (2 мг/л), кинетин (0,5 мг/л), бензиламинопурин (1,5 мг/л), а также сахарозу (25 г/л) и агар (7%) Каллусные культуры выращивали в темноте при температуре 26°С и относительной влажности воздуха 70% Продолжительность цикла культивирования составляла 28 дней

Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений, флаванов, флавонолов, проантоцианидинов и лигнина осуществляли спектрофотометрическими методами Растительный материал экстрагировали горячим 70% или 96%-ным этанолом Содержание суммы растворимых фенольных соединений в этанольных экстрактах определяли с реактивом Фолина-Дениса, содержание флаванов - с 1%-ным раствором ванилина в 70% H2SO4 (поглощение при 725 и 500 нм, соответственно) (Запрометов, 1971) Калибровочные кривые строили по (-)-эпикатехину Содержание флавонолов определяли с 0,5%-ным водным раствором AlCb (при 415 нм) Калибровочная кривая - по рутину (Gage, Wendei, 1950)

Содержание проантоцианидинов определили в этанольных экстрактах по реакции с бутанольным реактивом (при 550 нм) (Запрометов, 1974)

Для определения содержания лигнина материал последовательно экстрагировали этанолом, смесью этанол + бензол (1 2), эфиром и горячей водой (Запрометов, 1979, Загоскина и др, 1993) Свободный от экстрактивных веществ остаток гидролизовали 0,5н NaOH (36 ч, при 80°С) Охлажденный гидролизат центрифугировали (3000 об/мин, 10 мин) и в надосадочной фракции проводили спектофотометрическое (при 610 нм) определение содержания лигнина по реакции с 2,6-дихлорхинонхлоримидом (Carceller et al, 1971) Калибровочную кривую строили по феруловой кислоте

Определение активности ФАЛ. Для выделения фермента использовали Na-боратный буфер (рН 8,8), содержащий ЭДТА (0,5мМ), дитиотреитол (ЗмМ) и поливинилпирролидон (Шипилова, Запрометов, 1977) Активность фермента определяли по методике Цукера (Zuker, 1965) проводя спектрометрическое определение образования /и/тс-коричной кислоты из L-фенилаланина (поглощение при 290 нм)

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976) Определение содержания хлорофилла а и b проводили спектрофотометрическим методом (поглощение при 665 и 649 нм, соответственно) в этанольных экстрактах, с использованием коэффициентов, найденных Смитом и Бенитезом (Шлык, 1971)

Изучение состава фенольпых соединений. Для разделения фенольных соединений этанольные экстракты упаривали и использовали для одномерной и двумерной хроматографии в тонком слое (0,25мм) микрокристаллической целлюлозы (растворители 1-й — н-бутанол - уксусная кислота - вода, 40 12 28, 2-й - 10%-ная уксусная кислота) Идентификацию веществ проводили на основании данных специфической флуоресценции в УФ-свете, по значениям Rf сравнительно с метчиками-стандартами и по качественным реакциям со специфическими реагентами (Шталь, 1965, Запрометов 1971, Мийдла, 1975, Запрометов, Загоскина, 1987)

Определение тканевой и внутриклеточной локализации фенольных соединений проводили на срезах тканей интактных растений тисса (25 мкм) и на временных давленных препаратах, приготовленных из свежих тканей каллусных культур Для выяснения локализации фенольных соединений использовали 0,008% раствор реактива "Fast Blue" - на все классы полифенолов (Soukurova, 2000), 0,01% ванилиновый реактив - на флаваны и флорглюцин - на лигнин (Приступа и др, 1970, Запрометов и др, 1996)

Препараты просматривали и фотографировали с помощью светового микроскопа Ergavall ("Karl Ziess, " Германия)

Для электронно-микроскопических исследований растительный материал фиксировали глютаровым альдегидом (2,5%) в натрий-фосфатном буфере (pH 6,8) (Muller, Greenwood, 1978) и в завершение заключали в Эпон Ультрамикротомные срезы подкрашивали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца, а затем просматривали на микроскопе JEM - 100В (" JeoF\ Япония)

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях Все результаты обработаны статистически На графиках и в таблицах представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Содержание фенольных соединений в различных органах тисса

Первостепенной задачей являлось выяснение особенностей накопления соединений фенольной природы в различных органах растений тисса Определение их суммарного содержания показало более высокую биосинтетическую способность тисса ягодного по сравнению с тиссом канадским (рис 1) Наиболее ярко эти различия проявлялись в хвое, где их уровень был выше О высокой способности надземных тканей растений к накоплению полифенолов неоднократно сообщалось в литературе (Волынец, Прохорчик,1983, Wagner, 2003) В стебле содержание фенольных соединений ниже (на 38% и 20% в тиссе ягодном и тиссе канадском, соответственно) Наименьшее их накопление характерно для корня Отличия в содержании фенольных соединений в различных органах и видах растений отмечались и другими исследователями (Запрометов, 1964, Juntheikki, 2000, Wagner, 2003)

Как известно, одними из наиболее распространенных в зеленых тканях растений полифенолами являются флавонолы (Запрометов, 1993) В тиссе ягодном их количество было больше (на 20-30%), чем в тиссе канадском (рис 1 Б) Как и в случае суммарного содержания полифенолов, в хвое уровень флавонолов был выше, чем в стебле В корнях образования этих веществ не происходило, что, по-видимому, обусловлено отсутствием в них хлоропластов - одного из основных мест их синтеза (Запрометов, Николаева, 2003)

Ранее было показано, что для растений тисса характерна способность к синтезу флаванов (Das, 1993, Chattopadhyay, 1999, 2000) Их содержание у двух видов тисса было практически одинаковым и наиболее высоким в хвое

Значительное накопление флаванов характерно и для корней, где на их долю приходилось 60% и 80% от суммарного содержания фенольных соединений (для тисса ягодного и тисса канадского, соответственно), что возможно, связано с образованием таких их производных, как проантоцианилины. Наименьшее же накопление флаванов отмечено в стебле. Все это еще раз подтверждает различия в путях метаболизма фенольных соединений не только в различных органах растений, но к их видах, о чем сообщалось в литературе (Запромегов, 1964,ТвУп1тга, 1976; Уигйче^кк!, 2000).

Рис 1. Содержание суммы растворимых фенольных соединений (А), флавонолов (Б) и флаванов (В) в различных органах растений тисса ягодного и гнсса канадского.

Фенольный комплекс растений тисса Поскольку состав фенольных соединений в растениях тисса практически не исследован, то представлялось важным его изучение В побегах тисса ягодного обнаружено 37 соединений фенольной природы, тогда как у тисса канадского лишь 26. Как показали наши данные, основными компонентами фенольного комплекса растений тисса являлись флавоноиды. Наиболее разнообразный их состав характерен для хвои и стеблей тисса по сравнению с корнями. В значительной степени это связано с образованием флавонолов, биосинтез которых обусловлен функционированием в надземных органах хлоропластов.

На основании данных качественных реакций, кислотного гидролиза и сравнения с метчиками-стандартами в составе фенольного комплекса растений гисса предварительно идентифицированы нарингенин, рутин, моно-

и ди- гликозиды кемпферола и кверцетина, (+)-катехин, (-)-эпикатехин, а также оксибензойная, гентгоиновая, ванилиновая, феруловая и хлорогеновая кислоты

Изменение феиолыюго метаболизма в процессе вегетации растений тисса. Одним из процессов, обуславливающих рост растений, является фотосинтез, служащий основой как трофического, так и энергетического его обеспечения (Головко, 1999) Определение содержания хлорофилла а и Ь показало, что у тисса ягодного уровень этих пигментов во всех случаях был выше, чем у тисса канадского (табл 1) При этом динамика их накопления в процессе вегетации была довольна близка

Таблица 1

Содержание хлорофилла (мг/г свежей массы) в побегах тисса ягодного и тисса канадского в различные периоды вегетации_

Период вегетации побег Тисс ягодный Тисс канадский

Хлорофигч а Хлорофип Ь аЪ Хлорофилл а Хлорофилл Ь а/Ь

весна первого года вегетации 96,3±2 1 75,6±1,б 1,26 39,6±0,6 17,6±0,3 2,25

второго года вегетации 356,1±4,9 271,6±2,6 1,3 57,2±0,8 23,1±0,3 2,47

лето первого года вегетации 312,8±4,3 172,8±2,1 1,8 144,9±1,9 80,4±0,9 1,79

второго года вегетации 316,1±4,4 178,4± 2,2 1,71 148,2± 108,4±1,7 1,36

осень первого года вегетации 264,3±3,6 104,1±1,8 2,5 188,0±2,2 78,4±0,8 2,39

второго года вегетации 205,2±3,1 142,8±1,9 1,43 156,9±2,1 92,4±0,9 1,7

Известно, что образование фенольных соединений происходит практически во всех растительных тканях, хотя и зависит от вида и органа растения, а также фазы его развития (Запрометов, 1993) Как уже отмечалось выше, растения тисса ягодного и тисса канадского значительно отличаются по морфо-физиологическим характеристикам, поэтому для понимания особенностей их фенольного метаболизма важно было изучить динамику образования полифенолов в течение вегетационного периода Исследования проводились на побегах тисса первого и второго года вегетации

Основным показателем биосинтетической способности тканей растений в отношении синтеза фенольных соединений является определение суммарного содержания растворимых фенольных соединений (Запрометов, 1975) Как

следует из представленных на рис 2 А данных, содержание суммы растворимых фенольных соединений в побегах тисса значительно менялось по мере вегетации Весной их накопление как в тиссе ягодном, так и в тиссе канадском было наименьшим В летний период оно увеличивалось, а к осени - снижалось (в большей степени у тисса ягодного) Все эти изменения наиболее ярко проявлялись в побегах первого года вегетации (молодые активно растущие органы), тогда как в побегах второго года вегетации (зрелые ткани) они были незначительны

Содержание флавонолов, доминирующих компонентов фенольного комплекса побегов тисса, было выше у тисса ягодного, по сравнению с тиссом канадским В обоих случаях оно менялось по мере вегетации (рис 2 Б) При этом весной их было меньше, чем летом и осенью В большей степени эти различия проявлялись в молодых активно растущих тканях (побеги первого года вегетации) Следует также подчеркнуть, что побеги второго года вегетации накапливали больше флавонолов, чем побеги первого года, особенно на начальных этапах роста (весна)

Что касается флаванов, которые являются частью флавоноидного комплекса растений, то динамика их накопления значительно отличалась от приведенных выше (рис 2 В) Можно отметить, что растения тисса канадского накапливали гораздо больше веществ флавановой природы (особенно в осенний период), в отличие от тисса ягодного При этом побеги второго года вегетации характеризовались наибольшим их накоплением

В состав флаванов, входят также проантоцианидины, являющиеся олигомерами флавановой природы Содержание проантоцианидинов в побегах тисса канадского было выше, чем в побегах тисса ягодного (рис 2 Г) Оно менялось по мере их роста и во всех случаях снижалось к концу вегетации (осень) у тисса ягодного

Помимо так называемых растворимых, то есть мономерных, фенольных соединений в растениях образуется фенольный полимер лигнин, являющийся обязательным компонентом клеточных стенок растений (Запрометов, 1996, Вои(1е1, 2000, Горшкова, 2004) Определение его содержания не выявило особых различий в способности побегов тисса ягодного и тисса канадского к его образованию (рис 2 Д) В то же время в побегах первого года вегетации количество лигнина было несколько выше, чем в побегах второго года

Ферментом, занимающим ключевую позицию между первичным и вторичным метаболизмом, является ФАЛ, катализирующая дезаминирование Ь-фенилаланина с образованием /я/?анс-коричной кислоты, которая служит

предшественником подавляющего большинства соединений фе ноль ной природы, в том числе фенилпропаноидов, флавоноидов и лигнина (Jones, 1984: Залрометов, 1996, Boudet, 2000).

Рис. 2. Содержание суммы растворимых феиольных соединений (А), флавонолов (Б), фпаванов (В), проантоцианидинов (Г) и лигнина (Д), а также активность ФАЛ (Е) в побегах тисса ягодного и тисса канадского равных периодов вегетации.

Определение активности ФАЛ показало се отличие у тисса ягодного и тисса канадского (Рис. 2 Е). Так, в побегах первого года вегетации ее активность изменялась наиболее значительно у тисса ягодного, по сравнению с тиссом канадским. В побегах второго года вегетации активность ФАЛ была значительно выше у тисса канадского, особенно осенью.

Ряду авторов удалось показать существование прямой взаимосвязи между активностью ФАЛ и накоплением в тканях растений фенольных соединений (Camm, Towers, Запрометов, 1996; Загоскина, 1990; Boudet, 2000), Для тисса во многих случаях эта корреляция не прослеживается. Так, наибольшая

активность ФАЛ характерна для молодых, только что начавших свой рост однолетних побегов тисса ягодного, где накопление полифенолов минимально Это согласуется с предположениями исследователей о том, что высокая активность ФАЛ не всегда обуславливает большое накопление полифенолов (Шипилова, Запрометов, 1977, Мидла, 1977, Teramoto, Ishikura, 1985, Олениченко, 2006)

Таким образом, растения тисса обладают высокой способностью к синтезу веществ фенольной природы (особенно тисс ягодный) Эти соединения представлены как мономерными (фенилпропаноиды и флавоноиды), так и полимерными (лигнин) формами При этом наибольшее накопление фенольных соединений отмечается в молодых тканях тисса Это может быть следствием активных метаболических процессов, характерных для данного периода их развития Что же касается снижения уровня полифенолов к концу вегетации, особенно у тисса ягодного, то это может быть следствием их катаболизма, о чем сообщалось в литературе (Запрометов, 1993, Жанаева, 1998) В случае же тисса канадского, накапливающего значительное количество фенольных соединений (особенно флавановой природы) в осенний период, то это вероятно обуславливает его высокую зимостойкость, поскольку эти вещества выполняют антиоксидантную и криопротекторную функцию (Olsson, 1998, Blokhina, 2003)

Локализация фенольных соединений в растениях тисса Как следует из выше изложенного, во всех органах растений тисса происходит образование полифенолов В связи с этим следующей нашей задачей являлось изучение их локализации

Фенольные соединения были обнаружены в эпидермальных, паренхимных и проводящих тканях растений тисса Они локализовались в специализированных фенол-запасающих клетках-вместилищах (эпибластах) (рис 3 Д, Ж, 3), клеточных стенках (рис 3 А, В) и иногда в межклетниках (рис ЗВ,Г)

В корне фенольные соединения обнаружены в эпидермальных тканях (в клеточных стенках), а также в клетках паренхимы и в некоторых клетках флоэмы (рис 3 А, Б) Реакция на флаваны (с ванилиновым реактивом) совпадала с окрашиванием на сумму растворимых фенольных соединений (реакция с Fast Blue) Что касается лигнина, то он откладывался в клеточных стенках эпидермы и сосудах ксилемы (рис 3 В)

Рис 3. Локализация фенольных соединений в корне ( А-В), стебле (Г-Е) и листе (Ж,3) тисса (увеличение 3,2x16; 7x20).

А реакция на флаваиы; G, Г, Д, Ж. 3 - реакция на сумму фенольных соединений, В, Е, - реакция на лигнин.

ЭП - эпидерма, П - пареихима, ЭНД - эндодерма, ФЛ - флоэма, КС - ксилема, СЦ -сердцевина, ГМ - губчатый мезофилл.

В стебле фенол ьные соединения присутствуют во всех клетках эпидермы, как в клеточных стенках, так и в вакуолях (в виде аморфного и гранулированною материала; рис. 3 Г, Д). Они также встречаются в клетках паренхимы и флоэмы. Единичные фенол-запасающие клетки обнаружены в сердцевине. Лигнин локализован в наружных клеточных стенках эпидермы и сосудах ксилемы (рис. 3 Е).

В листе фенольные соединения локализованы в эпидерм ал ьных клетках (в клеточных стенках и вакуолях) и в замыкающих клетках устьиц. В клетках губчатого мезофилла они присутствуют в виде гранулированных включений в клетках-вместилшцах (рис. 3 3). Фенольные соединения обнаружены также в

паренхимной обкладке проводящего пучка и флоэмы (рис. 3 Ж). Лигнин был в замыкающих клетках устьиц и смолоходах, иногда в нижнем слос кутикулы, а также в сосудах ксилемы Такая локализация лигнина в растительных тканях характерна для многих растений (Столько уз, 2000; ЯапосЬа, 2002).

Использование метода электронной микроскопии показало, что эпиб ласты имеют большую центральную вакуоль, в полости которой сосредоточены фенольные соединения в виде гранулированных включений (рис. 4 А). Наряду с этим в тиссе было отмечено образование и таких клеток, где полифенолы находились в микровакуолях цитоплазмы (рис. 4 Б).

Рис. 4 Внутриклеточная локализация фенольиых соединений в клетках тисса (В-вакуоль, МкВ - мик-ровакуоли, Ц - цитоплазма).

Образование фенольных соединении в каплусных культурах тисса тонною и тисса канадского. Поскольку растения тисса относятся к редким реликтовым видам и имеют ограниченный ареал распространения в природе (Гумбатов: 1989; Александрова, 1999), то перспективным направлением является получение из них культур in vitro, как возможных источников биологически активных и лекарственных препаратов. Многими исследователями отмечались трудности при введении этих растений в культуру и низкая жизнеспособность полученных каллусов (Уразбахтина, 2000; Das, 2002). Известно, что фенольные соединения влияют на кал л у сообразован ие. Поэтому мы использовали летние и зимние экспланты тисса, значительно отличающиеся по содержанию фенольных соединений (см. рис. 2 и 6).

Процесс каллу сообразован и я на летних экспл антах двух видов тисса начинался на 21-27 дни культивирования, что сопровождалось потемнением питательной среды (рис. 5). Аналогичная тенденция отмечалась и другими авторами при введении в культуру тканей с высоким содержанием полифенолов (Compton, Preece, 1986, Raghuvashi. 1995). Первичные каллусы, инициированные из летних эксплантов тисса имели плотную консистенцию, коричневый цвет и низкую скорость роста (рис. 5 А), Перенесение их на

свежую питательную среду (через 30-35 дней) не приводило к улучшению роста культур и после двух пассажей они становились темно коричневыми и погибали.

Рис- 5. Инициация каллусных клеток на эксплантах тисса летнего (А) и зимнего (Б) периодов вегетации.

При использовании зимних эксплантов процесс дедифференцировки каллусных клеток происходил быстрее - на 10 - 16-й дни культивирования (рис. 5 Б). Возможно, это связано с более низким содержанием в них фенольных соединений. К седьмому пассажу наблюдалось потемнение клеток и снижение темпов роста культур. При этом каллусы тисса ягодного погибали, тогда как каллусы тисса канадского продолжали расти еще достаточно длительное время (более 20 пассажей), но с очень маленьким приростом. Все это свидетельствует об адаптации клеток тисса канадского к росту в условиях in vitro, чего не наблюдалось для клеток тисса ягодного.

Введение тканей молодых побегов тисса в культуру in vitro приводило к изменениям в фенольном метаболизме. Накопление фенольных соединений в клетках увеличивалось, особенно у культуры тисса ягодного (рис. 6). К седьмому пассажу содержание в нем растворимых фенольных соединений превышало таковое интактного растения почти в три раза. В тоже время накопление флаванов в каллусных культурах в большинстве случаев было несколько ниже, чем в исходных эксплантах. Следствием этого являлось уменьшение их доли в суммарном содержании фенольных соединений (до 16% у культур, инициированных из летних эксплантов, и до 34% у культур, инициированных из зимних эксплантов).

У каллусных культур тисса канадского во время первых пассажей накопление растворимых фенольных соединений также превышало таковое исходных эксплантов (в 3-м пассаже - в полтора раза, а в 7-м более чем в два раза), хотя к 7-му пассажу их уровень резко снижался (рис. 6 Б). Низкая биосинтетическая способность характерна и для длительно пассируемого каллуса.

Рис. 6. Содержание растворимых фенольных соединений (ФС) и флаванов (ФЛ) в летних (А) зимних (Б) эксплантах тисса ж одною и тисса канадского, а также в инициированных из них каллусных культу рах

Уровень активности ФАЛ в каллусных культурах тисса также значительно отличался от такового исходных эксплантов (рис. 7). Во время 7-го пассажа, в каллусах тисса канадского он был в 3 раза выше, чем в интактных тканях, а в каллусах тисса ягодного - в 7 раз. Это сог ласуется и с высоким содержанием в них фенольных соединений (см. рис. 6). О корреляции между активностью ФАЛ и усилением накопления полифенолов сообщалось в литературе (Carnrn, Towers, 5973; Загоскина, 1990; Запрометов, 1996; Boudet,2000).

narviyc 7-го пассажа

спга*т кэ.^с 7-го лэссама

•ик -1

Рис. 7. Активность ФАЛ в эксплантах и каллусных культурах тисса ягодного и тисса канадского.

Все это свидетельствует о том, что в условиях in vitro у каллусных культур тисса происходят не только морфологические, но и физиологе-биохимические изменения.

Исследование фенольного комплекса каллусных культур выявило его отличия от такового in vivo. Он становился значительно проще и содержал 15 соединений фенольиой природы Основными его компонентами, также как и у интактных растений тисса, являлись флаваны - (+)-катехин, (-)-эпикатехян и проантоцианидины. Образования флавонояов в каллусах не происходило и это естественно, поскольку культуры выращивали в отсутствии света (в гетеротрофных условиях), а, судя по имеющимся к настоящему времени

данным, основным местом синтеза этих представителей фенол ьного метаболизма являются хдоропласты (Запрометов, 1994, Запромстов, Николаева. 2003). Среди фенолкарбоновых кислот были гентизиновая, ванилиновая и кофейная кислоты.

Следует также отметить, что по мере пассирования каллусных культур тисса ягодного состав флзваповых компонентов менялся, за счет более разнообразного «набора» проантоцианидинов. У каллусных культур тисса канадского тенденция была иной, а к 21-му пассажу в составе фснольного комплекса было лишь три соединения фенолъной природы.

Локализация фенольных соединений в каллусных культурах тисса.

Использование гистохимических методов позволило выяснить локализацию фенольных соединений, в том числе и флаванов, уже на раннем этапе инициации каллусов из сегментов побегов тисса, где они локализовались в цитоплазме паренхимных клеток и межклетниках. При этом на границе экспланта и каллуса, формировался слой клеток с полифенодами. который как бы отделял их друг от друга (рис. 8 А). Такой «защитный слой» с полифенолами был замечен и в апогеотропных корнях саговниковых растений, отделяющих зону симбиотических бактерий (Лобакова и др, 2004).

Цитологические исследования показа™, что культуры тисса ягодного и тисса канадского, как и большинство растительных культур in vitro, состояли из клеток пар енхи много типа, разной величины, формы и степени вакуолизации (рис.8). Изредка среди них встречались м ер и сте магические очаги, представленные мелкими клетками с крупными ядрами, В каллусных культурах тисса на начальных этапах культивирования фенольные соединения обнаруживались иногда в цитоплазме и клеточных стенках паренхимных клеток, а также в межклетниках (рис.8 А).

Рис 8. Локализация фенольных соединений в каллусных культурах тисса первого (А) и третьего (Б) пассажей.

А. - реакция на фпаваны (увеличение 3,2x16 V, £ - реакция на сумму фенольных соединений (увеличение 7x20).

У калпусных культур тисса третьего пассажа наблюдалось образование специализированных фенол-запасающих клеток (клеток-вместилищ). Первоначально фенольные соединения в этих клетках накапливались в цитоплазме (м икр о вакуолях), а затем в центральной вакуоле в виде аморфного и фан у л иро ванн о го материала (рис. 8 Б).

К седьмому пассажу число клеток, дающих реакцию на фенольные соединения, значительно увеличивалось и было максимальным, особенно у каллуса тисса ягодного, что согласуется и с данными по содержанию в нем фенольных соединений. Полифенолы локализовались в основном в клетках-вместилищах расположенных в виде небольших групп (по 3-8 клеток). Эти клетки (эпибласты) размерам превышали паренхим ные в 2-3 раза (рис 9). У каллуса тисса канадского в этот период отмечается меньшее количество клеток-вместилищ, чем у тисса ягодного. Для него характерно формирование фенол-запасающих клеток сильно-вытянутой формы, длина которых превышала ширину в 5-7 раз. К 15-му пассажу они встречались крайне редко. Реакция на фенольние соединения изредка обнаруживалась в цитоплазме (в вакуолях в виде гранулированных включений).

Г ~ Д' и ! >'•}>

Рис. 9. Локализация фенольных соединений и флаванов в каллусных культурах тисса ягодного (А, Б) и тисса канадского (В-£); 7-й пассаж. Увеличение 7x20.

А, Б, Г, Д - реакция на сумму фенольных соединений; В, Е - реакция на флаваны.

Таким образом, введение тканей молодых побегов тисса в культуру in vitro приводило к повышению их способности к синтезу фенольных соединений Это проявлялось как на уровне накопления полифенолов в каллусных культурах, так и на уровне их локализации, когда формировалось значительное количество клеток-вместилищ, содержащих эти вещества При этом фенольные соединения являются одним из факторов, оказывающим влияние на жизнеспособность клеточных культур Высокое содержание фенольных соединений в клетках вызывало гибель культур, что наблюдалось после двух циклов пассирования каллусов этих видов тисса, инициированных из летних эксплантов, и семи циклов пассирования каллусов тисса ягодного, инициированного из зимних эксплантов В тоже время каллусная культура тисса канадского сохраняла жизнеспособность, по-видимому за счет отбора клеток с низкой способностью к синтезу фенольных соединений Низкая биосинтетическая способность длительно-пассированного каллуса тисса канадского согласуется и с крайне бедным спектром синтезируемых в нем фенольных соединений

ВЫВОДЫ

1 Впервые изучен фенольный метаболизм двух представителей рода Taxus -тисса ягодного (Г baccata L) и тисса канадского (Г canadensis Marsh)

2 Показано, что в большинстве случаев тисс ягодный характеризуется более высокой способностью к синтезу фенольных соединений, чем тисс канадский Это проявляется как на уровне накопления фенольных соединений, так и на их качественном составе

3 Наибольшее содержание фенольных соединений, в том числе флавонолов, флаванов, проантоцианидинов и лигнина, отмечено в побегах тисса (особенно хвое), а наименьшее - в корнях Аналогичная тенденция прослеживается и на уровне их качественного состава, который наиболее разнообразен в хвое, а проще всего в корнях

4 Образование фенольных соединений меняется по мере вегетации растений тисса Наибольшее содержание суммы растворимых фенольных соединений и флавоноидов отмечено летом, тогда как содержание флаванов и, в некоторых случаях, лигнина - осенью

5 Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы, являющейся одним из основных («ключевых») ферментов фенольного метаболизма, в большинстве случаев не является критерием способности тканей тисса к накоплению фенольных соединений

6 Фенольные соединения в побегах тисса локализуются в эпидермальных и паренхимных тканях, а также в клетках сосудисто-проводящих пучков, где они находятся в клетках-вместилищах, клеточных стенках и иногда в межклетниках

7 Инициация каллусных культур из эксплантов однолетних побегов тисса сопровождается значительным повышением их способности к синтезу фенольных соединений, в том числе и флаванов, что наиболее ярко проявляется у каллусов тисса ягодного

8. Показана зависимость процесса каллусоообразования и последующего роста культур тисса от содержания фенольных соединений в клетках чем оно выше, тем более вероятна их гибель

Список публикаций по материалам диссертации.

1 Зайцева С.М , Александрова М С , Загоскина Н В "Сезонные изменения содержания полифенолов в двух видах тисса (Taxus baccata and Taxus canadensis)" // Abst "Botanicgarden " Freiburg 2002 p 307

2 Зайцева С.М, Загоскина Н В, Александрова М С Об образовании фенольных соединений в растениях тисса // Сборник тезисов IV Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» Пущино - Москва 2003 с 191

3 Зайцева С.М, Загоскина Н В Каллусные ткани тисса ягодного и тисса канадского и образование в них фенольных соединений // Сборник тезисов V Съезда Общества физиологов растений России, Пенза 2003 г С 509510

4 Зайцева С.М., Дубравина Г А , Загоскина Н В Каллусные культуры тисса ягодного и образование в них фенольных соединений// Тезисы докладов VI Симпозиума по фенольным соединениям Москва 2004 с 37

5 Дубравина Г А , Зайцева С.М., Загоскина Н В Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедифференциации тканей тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro // Физиология растений 2005 Т 52 С 755-762

6 Зайцева С.М., Дубравина ГА Высокое содержание растворимых фенольных соединений как возможная причина апоптоза каллусных культур тисса // Сборник тезисов VI Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» Москва -Пущино 2005 Т 3 303-306

7 Зайцева С.М, Загоскина Н В Фенольные соединения тисса канадского и изменения в их образовании во время вегетации // Сборник

статей региональной конференции ОФР посвященной памяти Ефремова С И Орел 2006 С 119

8 Загоскина Н В , Зайцева С.М., Александрова М С Изменения в образовании фенольных соединений при введении клеток тисса ягодного (Taxus baccatä) и тисса канадского (Taxus canadensis) в культуру т vitro II Биотехнология 2007 №1 С 29-34

Выражаю признательность своему научному руководителю дбн HB Загоскиной, а также не ГА Дубровиной, дбн, проф В Б Иванову, дбн OA Гореловой, кбн MC Александровой и всем сотрудникам лаборатории липидного и фенольного метаболизма ИФР РАН за консультации и помощь в проведении исследований

1,25 печ л

Зак 368

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайцева, Светлана Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фенольные соединения

1.1.1. Структура фенольных соединений

1.1.2. Биосинтез фенольных соединений

1.1.3. Функции фенольных соединений

1.2. Особенности образования и локализации фенольных соединений в тканях и клетках растений

1.2.1. Образование фенольных соединений

1.2.2. Локализация фенольных соединений

1.3. Клеточные культуры растений и возможности их использования для изучения фенольного метаболизма

1.3.1. Способность клеточных культур растений к синтезу фенольных соединений

1.3.2. Регуляция синтеза фенольных соединений в клеточных культурах растений

1.4. Растения и каллуспые культуры тисса и их способность к образованию вторичных соединений

1.4.1. Ботаническое описание рода Taxus

1.4.2. Образование вторичных соединений в растениях тисса

1.4.3. Способность клеточных культур тисса к синтезу вторичных соединений

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Инициация каллусных культур и условия культивирования

2.3. Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений, флавапов, флавонолов, проантоцианидипов и лигнина

2.4. Определение активности L-феиилаланинаммиак-лиазы

2.5. Определение содержания хлорофилла

2.6. Определение содержания свободных аминокислот.

2.7. Изучение комплекса фенольных соединений.

2.8. Определение тканевой и внутриклеточной локализации фенольных соединений 51 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Содержание и состав фенольных соединений различных органов тисса ягодного (Taxus baccata L.) и тисса канадского

Taxus canadensis Marsh.).

3.1.1. Содержание фенольных соединений в различных органах тисса.

3.1.2. Состав фенольных соединений различных органов тиса 57 3.1.3 Сравнение состава фенольных соединений побегов тисса ягодного и тисса канадского

3.2 Особенности фенольного метаболизма растений тисса ягодного и тисса канадского.

3.2.1 Рост побегов тисса ягодного и тисса канадского и содержание в них хлорофилла

3.2.2. Изменения в образовании различных соединений фенольной природы во время вегетации побегов тисса

3.2.3. Изменение активности L-фенилаланинаммиак-лиазы во время вегетации побегов тисса.

3.3. Локализация фенольных соединений в различных органах растений тисса

3.3.1. Локализация фенольных соединений в корнях тисса

3.3.2. Локализация фенольных соединений в стеблях тисса

3.3.3. Локализация фенольных соединений в хвое тисса

3.4. Образование фенольных соединений в каллусных культурах тисса ягодного и тисса канадского

3.4.1.Инициация и рост каллусов тисса ягодного и тисса канадского.

3.4.2. Образование фенольных соединений в каллусных культурах тисса ягодного и тисса канадского.

3.4.3. Фенольный комплекс каллусных культур тисса ягодного и тисса канадского.

3.4.4. Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы в каллусных культурах тисса 94 5.5. Локализация фенольных соединений в каллусных клетках тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro

Введение Диссертация по биологии, на тему "Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса (Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) и в инициированных из них каллусных культурах"

Фенольные соединения являются одними из наиболее распространенных в растениях представителями вторичного метаболизма, образование которых свойственно практически всем их клеткам (Лукнер, 1979; Harborne, 1980; Запрометов, 1993). В настоящее время установлено участие этих веществ в формировании клеточных стенок, фотосинтезе, дыхании, аллелопатии, сверхчувствительности и некротизации, а также защите растений от ряда стрессовых воздействий.

Полифенолы имеют и важное практическое значение. На их окислительных превращениях основаны технологические процессы в пищевой и легкой промышленности. В медицине широко применяются лекарственные препараты, изготовленные на основе фенольных соединений, получившие тривиальное название - биофлавоноиды. Они обладают капилляроукрепляющим, противовоспалительным, антисклеротическим, противолучевым и противоопухолевым действием (Барабой, 1984; Запрометов, 1993; Куркин, 1996, Плотников, 2005).

Несмотря на большой объем исследований до сих пор наши знания о механизмах, участвующих в регуляции синтеза фенольных соединений в растениях, малы (Butcher, 1977; Запрометов, 1978, 1993; Stafford, 1991, Bhalsing, 1998; Dixon, Paiva, 1995; Maries, 2003).

В последнее время большое внимание исследователей обращено на род Taxus, представители которого обладают уникальной способностью к синтезу соединений дитерпеновой природы - таксоидов (таксола). Эти вещества успешно используются в терапии онкологических заболеваний (Guy, Scott 1996; Bicamumpaka, 1998; Pradier, 1999; Guillemard, 1999; Miller, 1999; Borekdohalska, 2000; Hanson, 1998; Барабой 2001; Lee, Kim 2001). В растениях тисса обнаружены и соединения фенольной природы. Однако эти данные крайне немногочисленны (Орлова, 1978; Cisowski, 1997; El Modafar, 1996; Das, 1993; Kawamura, 2000).

Поскольку растения тисса относятся к реликтовым видам и имеют ограниченный, труднодоступный ареал распространения в природе (Гумбатов 1989; Александрова, 2000), большое практическое значение приобретает инициация из них каллусных и суспензионных культур, как возможных источников биологически активных и лекарственных препаратов.

В тоже время до сих пор крайне мало известно о биосинтетической способности различных видов тисса.

Целью настоящей работы являлось изучение фенолыюго метаболизма у тисса ягодного (Taxus baccata L) и тисса канадского (Taxus canadensis Marsh.), значительно отличающихся по морфофизиологическим характеристикам, а также инициированных из них каллусных культур.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить образование и состав фенольных соединений листьев, стеблей и корней тисса ягодного и тисса канадского.

2. Исследовать изменения в образовании мономерных и полимерных форм фенольных соединений и активности ¿-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) в процессе вегетации побегов тисса ягодного и тисса канадского.

3. Выяснить внутритканевую и внутриклеточную локализацию фенольных соединений в различных органах тисса.

4. Получить каллусные культуры тисса ягодного и тисса канадского и изучить их способность к синтезу фенольных соединений.

5. Исследовать изменения в содержании, составе и локализации фенольных соединений в процессе пассирования клеток тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Зайцева, Светлана Михайловна

выводы

1. Впервые изучен фенольный метаболизм двух представителей рода Taxus -тисса ягодного (Т. baccata L.) и тисса канадского (Т. canadensis Marsh).

2. Показано, что в большинстве случаев тисс ягодный характеризуется более высокой способностью к синтезу фенольных соединений, чем тисс канадский. Это проявляется как на уровне накопления фенольных соединений, так и на их качественном составе.

3. Наибольшее содержание фенольных соединений, в том числе флавонолов, флаванов, проантоцианидинов и лигнина, отмечено в побегах тисса (особенно хвое), а наименьшее - в корнях. Аналогичная тенденция прослеживается и на уровне их качественного состава, который наиболее разнообразен в хвое, а проще всего в корнях.

4. Образование фенольных соединений меняется по мере вегетации растений тисса. Наибольшее содержание суммы растворимых фенольных соединений и флавоноидов отмечено летом, тогда как содержание флаванов и, в некоторых случаях лигнина - осенью.

5. Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы, являющейся одним из основных («ключевых») ферментов фенольного метаболизма, в большинстве случаев не является критерием способности тканей тисса к накоплению фенольных соединений.

6. Феиольные соединения в побегах тисса локализуются в эпидермальных и паренхимных тканях, а также в клетках сосудисто-проводящих пучков, где они находятся в клетках-вместилищах, клеточных стенках и иногда в межклетниках.

7. Инициация каллусных культур из эксплантов однолетних побегов тисса сопровождается значительным повышением их способности к синтезу фенольных соединений, в том числе и флаванов, что наиболее ярко проявляется у каллусов тисса ягодного.

8. Показана зависимость процесса каллусоообразования и последующего роста культур тисса от содержания фенольных соединений в клетках: чем оно выше, тем более вероятна их гибель.

Выражаю признательность своему научному руководителю д.б.н. Н.В. Загоскиной. Благодарю н.с. Г.А. Дубравину и А.К. Алявину за помощь в проведении гистохимических исследований, а также к.б.н. М.С. Александрову за предоставление растительного материала, д.б.н. O.A. Горелову за фиксацию тканей тисса для электронно-микроскопических исследований и проф. д.б.н. В. Б. Иванова за консультации.

Я благодарна всем сотрудникам лаборатории липидного и фенольного метаболизма ИФР РАН за консультации и помощь в проведении исследований. Хочу поблагодарить свою семью и близких друзей за помощь, поддержку и терпение. Спасибо.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Первостепенной задачей являлось изучение образования полифенолов в растениях тисса, поскольку в литературе эти данные крайне немногочисленны. Было показано, что в растениях тисса, так же как и в других высших растениях, синтезируются разнообразные соединения фенольной природы, представленные как мономерными (фенилпропаноиды и флавоноиды), так и полимерными (лигнин) формами. Данные фенольные соединения образуются во всех органах растений тисса, но их состав наиболее разнообразен в хвое, что может быть связано с функционированием хлоропластов - одних из основных мест синтеза полифенолов (Запрометов, 1993; Запрометов, Николаева, 2003). При этом состав фенольных соединений наиболее разнообразен в хвое тисса ягодного по сравнению с таковой тисса канадского, что также связано с функционированием хлоропластов, так как уровень хлорофилла в них в 1,5-3 раза выше. Флавоноиды, являющиеся основными компонентами фенольного комплекса растений тисса, представлены преимущественно флаванами (катехинами и проантоцианидинами), флавонолами (рутинном, нарингинином, и их гликозидами кверцитина и кемпферола), и фенолкарбоновыми кислотами (ванилиновая, о-бензойная, ш/?д-кумаровая, кофейная и тд.). Скорее всего, именно образование флавоноидов (одной из наиболее многочисленной группы фенольных соединений) в хвое тисса и обуславливает ее способность к наибольшему накоплению растворимых фенольных соединений по сравнению со стеблями и особенно корнями. О высоком содержании фенольных соединений в зеленых тканях растений не раз сообщалось и в литературе (Волынец, 1983; Wagner, 2003). Все это свидетельствует о некоторых отличиях биосинтеза этих вторичных веществ в различных органах растений, как это неоднократно отмечалось и другими исследователями (Ishikura, 1976; Juntheikki, 2000; Wagner, 2003). Для тисса, как и для некоторых других древесных растений, характерна высокая способность к синтезу фенольных соединений.

В процессе вегетации содержание полифенолов в побегах тисса меняется, особенно в побегах первого года вегетации. В летний период их накопление максимально, а к осени происходит снижение содержания веществ фенольной природы, в большей степени выраженное в побегах тисса ягодного.

Известно, что фенольные соединения обладают криопротекторными свойствами, накапливаясь в клетке, они способны понижать температуру внутриклеточного содержимого и увеличивать зимостойкость растений (Олениченко, 2006). В связи с этим увеличение уровня полифенолов (особенно флавановой природы) в побегах тисса канадского осенью может обуславливать его высокую зимостойкость, по сравнению с тиссом ягодным, что отмечалось в литературе (Александрова, 2000).

Следует также отметить, что у растений тисса отсутствует корреляция между активностью ФАЛ и накоплением фенольных соединений. В частности, у однолетних побегов тисса ягодного наибольшая активность ФАЛ характерна для молодых, только что начавших свой рост побегов, где накопление полифенолов минимально. Это согласуется и с данными других исследователей о том, что высокая активность ФАЛ не всегда обуславливает большое накопление полифенолов (Шипилова, Запрометов, 1977; Teramoto, Ishikura, 1985; Олениченко, 2006).

Как показали наши данные, в растениях тисса фенольные соединения локализуются в эпидермальных слоях листа и стебля, вероятно обеспечивая этим защиту ниже лежащих клеток от воздействия УФ-лучей, а также от ряда других стрессовых воздействий (Blokhina, 2003; Olsson, 1998).

Введение тканей молодых побегов тисса в культуру in vitro приводило к изменениям в фенольном метаболизме, что сопровождалось повышением их способности к синтезу фенольных соединений, в том числе и флаванов. Это проявлялось как на уровне накопления полифенолов в каллусных культурах, так и на уровне локализации, когда формировалось значительное количество клеток-вместилищ, содержащих эти вещества. Кроме того, фенольные соединения являются одним из факторов, оказывающих влияние па жизнеспособность клеточных культур. Высокое содержание фенольных соединений в клетках вызывало гибель культур, что наблюдалось после двух циклов пассирования культур этих видов тисса, инициированных из летних эксплантов, и семи циклов пассирования культуры тисса ягодного, инициированного из зимних эксплантов. В тоже время каллусная культура тисса канадского сохраняла жизнеспособность.

Исходя из этих данных можно предположить, что при длительном пассировании каллуса тисса канадского в условиях in vitro, по-видимому, произошел отбор клеток с низкой способностью к синтезу фенольных соединений, что и позволило им сохранить жизнеспособность. Аналогичная тенденция ослабления образования фенольных соединений отмечалась и при длительном выращивании в условиях in vitro одного из штаммов каллусов чайного растения, что являлось следствием изменения его генетических характеристик, в частности повышения уровня плоидности клеток (Загоскина и др., 1994). Состав фенольного комплекса каллуса тисса канадского был проще, чем у интактного растения и у каллуса тисса ягодного. Кроме того, низкая биосинтетическая способность длительно-пассированного каллуса тисса канадского согласуется и с крайне бедным спектром синтезируемых в нем фенольных соединений. Следует также отметить, что в каллусных культурах тисса активность ФАЛ является определяющим фактором в накоплении фенольных соединений, в отличии от тенденции, которая отмечалась у интактного растения.

Все это свидетельствует о том, что введение клеток тисса ягодного и тисса канадского в культуру in vitro приводило к значительным изменениям в их фенольном метаболизме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцева, Светлана Михайловна, Москва

1. Александрова М.С. Хвойные растения в вашем саду. М. ЗАО "Фитон+", 2000. С. 133-145.

2. Андреева Т.Ф. Количественное определение свободных и связанных аминокислот в растительных тканях // Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука. 1971.

3. Багратишвши Д.Г., Запрометов М.Н. Бутенко Р.Г. Образование фенольных соединений в суспензионной культуре клеток чайного растения и влияние уровня нитрита и гормональных эффектов в питательной среде // Физиология растений. 1980. Т. 27. Вып. 2. С. 404.

4. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. М.: Наука. 1984. 160 с.

5. Барабой В.А., Зинченко В.А. Радиосенсибилизующий эффект таксола на клетки злокачественных опухолей. // Цитология и генетика. 2001, № 1, С. 16-21.

6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука. 1964. 300с.

7. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. XXXV Тимирязевские чтения. М. Наука. 1975.51 с.

8. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука. 1986. С.З.

9. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС. 1999. 160 с.

10. Ванюшин Б.Ф., Александрушкина Н.И., Замятина В.А. Фенольные соединения в системе регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки, роста и развития растений// Сб. тезисов VI Симпозиума по фенольным соединениям. 2004. М. С. 17-18.

11. Волыиец А. П., Прохорчик Р. А. Ароматические оксисоединения -продукты и регуляторы фотосинтеза. Минск: Наука и техника. 1983. 157 с.

12. Ворошилова Г.М. Формирование и строение дальневосточных хвойных // Тез. Докл. I всесоюзи. Конф. По анатомии растений. Л.: 1984. С.40.

13. Головко Е.А., Щербакова Т.А. Фенольные соединения видов Echinacea moench II VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 23.

14. Головко Т.К. Эколого-физиологические факторы продуктивности культурных растений в холодном климате // Агробиологические ресурсы Республики Коми и их радиоциональное использование // Под Ред. Головко и др. Сыктывкар (Коми НЦ Ур О РАН), 1999 с. 55-60.

15. Гармаш Е .В. Зависимость роста растений ячменя от уровняминерального питания и контролированного температурного режима // Физиология растений Т. 52, № 3, 384-891.

16. Дмитриев А. П. Фитоалексины и их роль в устойчивости растений/ Нац. акад. наук Украины, Ин-т клет. биологии и генет. инженерии. -К., 1999.207 с.

17. ДраникЛ. П., Прокопенко А.И Кумарины и кислоты плодов. // Химия природных соединений. 1969. Т.5, С. 437.

18. Друэ/сенко Н.И., Паламарчук Е.П. Изменчивость флавонолов в листьях плодово-ягодных растений // Сб. тез 6 симп. По фенольным соединениям. С.29.

19. Загоскина Н. В., Усик Т. В., Запрометов М. Н. Культура ткани чайного растения: активность Ь-фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ), образование фенольных соединений и сезонная вариабельность // Физиология растений. 1990. Т.37. №3. С. 511-517.

20. Загоскина Н. В., Дубравина Г. А., Алявина А. К., Гончарук Е. А. Влияние ультрафиолетовой радиации (УФ-Б) на образование и локализацию фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения // Физиология растений 2003. Т. 50. № 2. С. 302-308.

21. Загоскина Н.В., Олениченко Н.А. Способность различных сортов пшеницы к образованию фенольных соединений // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №1. С. 113-116.

22. Запрометов М.Н. Биохимия катехинов. 1964. М.: Наука. 295 с.

23. Запрометов М. Н., Шипшова С. В. Фенилаланин-аммоний лиаза и образование фенольных соединений в проростках кукурузы // Физиология растений. 1972. Т.19. № 3. С.498-503.

24. АХ.Запрметов М.Н. Фенольные соединения растений: биосинтез, превращения и функции // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука. 1985. с. 143-162.

25. АА Запрометов М.Н. Светорегуляция вторичного метаболизма растений // физиология растений. 1987. Т. 34. В. 4. С. 698-711.

26. АЪЗапрометов М.Н. Фенольные соединения растений и их биогенез М,:ВИНИТИ. 1988. 188 с.

27. Келес Ю., Онсел И. Рост и содержание ряда растворимых метаболитов у двух видов пшеницы, подвергнутых совместному действию нескольких стресс-факторов. // Физиология растений, 2004, Том 51, № 2, С. 228-233.

28. Кефели В.И. Природные ингибиторы ростаи фитогормоны. М., Наука. 1974. 253 с.

29. Комарипскш Н.А., Кудряшов Л.В. Систематика растений. М.: Из-во министерства просвящения, 1962. 726 с.

30. Корецкая ТФ., Запрометов М.Н. Фенольные соединения в культуре ткани чайного растения и влияние света на их образование // Физиология растений. 1975. Т. 22. В. 2 . С. 282-288.

31. Кузоекина И.Н., Гусева А.В., Ковач Д. Флавоны генетически трансформированных корней шлемника байкальского {Scutellaria baicalensis) и индукция их образования при илиситации метилжасмонатом // Физиология растений, 2005, том 52, № 1, с. 90-96.

32. Куркин В.А. Фенилпропаноиды как биологически активные соединения и стандартные вещества растений // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 100

33. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Авдеева Е.В. Флавоноиды как стандартные вещества растений // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 101.

34. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука. 1976. 646с.

35. Ложникоеа В.И., КондратьеваВ.В. Участие салициловой и оксикоричных кислот в процессе зацветания Табаков разных биотипов // VI симпозиум по фепольным соединениям Москва, 2004, с. 52.

36. Лотова Л.И. Об анатомии коры тисовых, головчатотиссовых и многоплодииковых//Вест. МГУ, 1979. Биология, сер. 16,№3 С.3-12.

37. Лотова Л.И. Анатомия коры хвойных. М.: Наука, 1987. 152 с.

38. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. М.: Мир, 1979. 548 с.71 .Манская С.М., Кодина JI.A., Геохимия лигнина. М.: Наука. 1975. 230 С.

39. Маргна У. В. Взаимосвязь биосинтеза флавоноидов с первичным метаболизмом растений. М.: ВИНИТИ. 1990. 175 с.

40. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. 1978. Новосибирск. Наука. 255 с.

41. Морис П. Образование продуктов вторичного метаболизма в суспензионных культурах клеток. // Биотехнология растений: культура клеток. М. „Агропромиздат,, 1989, С 154-204.

42. Муравьева О.П., Борхвардт B.C. Семейство тисовых (Тахасеае) //Жизнь растений. 1978. М.: Просвещение. Т.4 С. 411-420.

43. Николаева Т.Н. Запрометов М.Н. Активность и субстратная специфичность 0-метилтрансферазы чайного растения и получение изнего каллусной культуры // Физиология растений. 1990. Т.37. Вып. 2. С.378-382.

44. Николаева Т.Н. Изменения в фенольном комплексе хлоропластов листьев фасоли в процессе онтогенеза. // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 61.

45. Осипов В., Салмелин Ю., Осипова С. Фенольные соединения листьев березы: состав и роль в стойчивости к насекомым фитофагам. // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 69.

46. Осипова С., Осипов В., Салмелин 10., Пихлая К. Биосинтез галловой кислоты и гидролизуемых дубильных веществ в листьях березы из промежуточного соединения шикиматного пути // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 67.

47. Пасешникенко В. А. Регуляция терпеиоидиого биосинтеза в растениях и его связи с биосинтезом фенольных соединений // Физиология растений. 1995. Т. 42. № 5. С. 787-804.

48. Пасешниченко В.А. Пренилированные фенольные соединения и их связь с биосинтезом изопреноидов в растениях // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с.70

49. Петров К.А., Софронова В.Е., Чепалов В.А. Стельбены новые природные ингибиторы роста? // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с.71.

50. Ратькин А.В., Евдокимова Л.И. Физиолого-генетические аспекты метаболизма флавоноидов у некоторых высших растений // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с.76.

51. Сапко О.А., Мухамеджанов Б.Г., Кунаева P.M. Образование фенольных соединений в культуре ткани верблюжьей колючки // Физиология растений. 1992. Т. 39. В. 5. С. 1020-1026

52. Сергейчик А. А. Фенилаланин-аммиак-лиаза и фенилпропаноидный метаболизм // Физиология и биохимия культ растений. 1987. Т.19. №3. С.211-220.

53. Сокольская Т.А. Лекарственные средства на основе фенольных соединений растений // VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 129

54. Стрекова В.Ю, Субботина Г.А., О возможных причинах нарушенияпроцесса лигнификации в культуре тканей чайного растения. // Физиология растений, 1980. Т. 27. Вып. 6. С.1192.

55. Субботина Г.А. Способ фиксации растительных тканей с высоким содержанием фенольных соединений // Сельскохозяйственная биология. 1997. № 5. С. 117-119.9Ъ.Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука. 2002.290 с.

56. Тюкаекина H.A. Биофлавоноиды. М.: Издательский дом «Русский врач». 2002. 56 с.

57. Тюкаекина Н. А. Некоторые аспекты современных исследований в области фенольных соединений// VI симпозиум по фенольным соединениям Москва, 2004, с. 12

58. Титов А.Ф., Акимова Т.В. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур / Москва, Наука 2006.

59. Уразбахтина H.A., Мардамшин А.Г. Особенности каллусообразования из хвои Taxus baccata Ь.//Растительные ресурсы. 2000. Т.36. Вып. 1. С. 64-66.

60. Уразбахтина H.A., Мардамшин А.Г. Получение каллусной ткани из листьев taxus baccata L. // Биотехнология. 1999. № 4. С. 55-56.

61. Фуксман И.Л. Влияние природных и антропогенных факторов на метаболизм веществ вторичного происхождения у древесных растений // Петрозаводск. 2002.

62. Чередниченко М.Ю. Трансформация картофеля и табака генами дефензипов и ингибитора протеиназ BWI-la. Автореф. на соиск. уч. степ, к.б.н. Москва 2004.

63. Чернышов В.Д. Физиологическая роль воска эпидермы хвойных Дальнего востока. // Тез. докл. 1 всесоюз. копф. по анатомии растений. Л. 1984. С. 172.

64. Шипилова С. В. О внутриклеточной локализации биосинте фенольных соединений: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. бис наук. М. 1980. 23 с.

65. Шипилова С. В., Запрометов М. Н. Фенилаланин-аммиак лиаза образование катехинов в чайном растении // Физиология растени 1977. Т.24. № 4. С.803-809.

66. Шлык А. А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстракт зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. N Наука. 1971. С. 154-182.

67. Шталь Г. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир. 1965. 508 с.

68. Эсау К. Анатомия растений . М.: Мир, 1969. 564 С.

69. Abrahams S., Tannar G., Larkin P. Identification and biochemic characterization of mutants in the proanthocyanidin pathway in Arabidobi // Plant Physiology, 2002, Vol. 130, P. 561-576.

70. Albrecht H., Yoder J. Flavonoids promote haustoria formation in the ro parasite Triphysaria veasicolor II Plant physiology, 1999, Vol. 119, P. 58 592.

71. Alemanno, L Ramos, T Gargadenec, A Localization and identificatic of phenolic compounds in Theobroma cacao L. somatic embryogenesis. Annals of botany. 2003. Vol. 92,1. 4, P. 613-623.

72. Anderson ED., Owens - JN. Microsporogenesis, pollination, poll< germination and male gametophyte in Taxus brevifolia. // Annals of botan 2000, Vol. 86,1. 5, P. 1033-1042.

73. Angelica, SGM Gemma, H, Iwahori, S. Histochemical observation ar

74. HPLC analysis of phenolic compounds at the graft union of dwarf peach trees grafted onto Prunus tomentosa. // Journal of the Japanese society for horticultural science. 1999, Vol. 68,1. 4, P. 724-733.

75. Aoyagi, H DiCosmo, F Tanaka, H Efficient paclitaxel production using protoplasts isolated from cultured cells of Taxus cuspidate. //Planta medica. 2002. Vol. 68,1. 5, P. 420-424.

76. Banskota A., Tesuka Y. DPPH radical scavenging and nitric oxide inhibitory activities of the constituents from the wood of Taxus yunnanensis //Plantamedical. 2003.

77. Bartsch M., Gobbato E., Saliylic acid independent enhanced disease susceptibilityl signaling in Arabidopsis immunity and cell death is regulated by the moooxygenase FMOl and the nudix hydrolase NUDT7 // Plant cell preview, 2006, vol. 18, P. 1038-1051.

78. Bate-Smiht E.C. The commoner phenolic constituents of plants and their systematic distribution. // Journal biochemistry, 1964, V. 58,1. 1, P. 126.

79. Beike, JKarger, B Meiners, LC-MS determination of Taxus alkaloids in biological specimens. // INTERNATIONAL JOURNAL OF LEGAL MEDICINE. 2003, Vol. 117,1.6, P. 335-339

80. Bhalsing S.R., Maheshwari V.L. Plant Tissue Culture A Potential Source of Medicinal Compounds//J. Scientific and Industrial Research. 1998. V.57. P. 703-708.

81. Bicamumpaka, C, Page, M In situ localization of paclitaxel binding structures: Labeling with a paclitaxel fluorescent analogue. // International journal of molecular medicine. 1998, Vol. 2,1. 2, P. 161-165.

82. Biemenlt S., Tschiesch H. Impact of altered gibberellin metabolism on biomass accumulation, lignin biosynthesis, and photosynthesis in transgenic tobacco plants // Plant physiology, 2004, Vol. 135, P. 254-265.

83. Bieza K., Lois R. An Arabidopsis mutant tolerant to lethal ultraviolet-B levels shows constitutively elevated accumulation of flavonoids and other phenolics // Plant physiology, 2001, Vol. 126, P. 1105-1115.

84. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K. V. Antioxidants, Oxidative Damage and Oxygen Deprivation Stress: a Review // Annals of Botany. 2003. V. 91. P. 179-194.

85. Blout J., Masoud S. Over-expression of cinnamate 4-hydroxylase leads to increased accumulation of acetosyringone in slicited tobacco cellsuspension cultures // Planta, 2002 Vol. 214,1. 6, P. 902-910.

86. Bogs J., Ebadi A., McDavid D. Identification of the flavonoid hydroxylases from grapevine and their regulatition during eruit development //Plant physiology, 2006? Vol. 140,1. 1, P. 279-291.

87. Borekdohalska L., Stiborova M. Texanes anticancer drug with unique mechanism of action. // Chcmicke Listy. 2000, Vol. 94,1. 4, P. 226-229.

88. Boerjan W., Ralph J., Baucher M. Lignin biosynthesis // Annu. Rev. Plant Biol. 2003. V.54. P.519-546.

89. Boudet A., Grazina A. Resent advances in the regulation of the prearomatic pathway // The biochemistry of plant phenolics. Eds. C. Van Sumere, P. Lea. Clarendon Prees. Oxford. 1985. V. 25. P. 135-159.

90. Boudet A. M. Lignins and lignification: Selected issues //Plant Physiol. Biochem. 2000. V 38 P 81-96.

91. Bradford M. M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

92. Brincat M.C. Gibson D.M. Alternation taxol production in plant cellculture via manipulion of the phenylalanineammonialyase pathway. // Biotechnology progress. 2002, Vol. 18,1. 6, P. 1149-1156.

93. Brown D., zeel L., Ellis J. Indentification of novel genes in Arabidopsis involved in secondary cell wall formation using expression profiling and reverse genetics // Plant cell preview, 2005, Vol. 17, P. 2281-2295.

94. Budzianowski J, Budzianowska A. Naphthalene glucoside and other phenolics from the shoot and callus clrures of Drosophyllum lusitanicum II Phytochemistry, 2002, Vol. 61,1. 4, p. 421-425.

95. Buer C., Sukumar P., Muday G. Ethylene modulates flavonoid accumulation and gravitropic responses in root of Arabidopsis // Plant physiology preview, 2006, Vol. 140, P. 1384-1396.

96. Buns R, Asker G, Beck E. The plastids of the Yew tree (Taxus baccata L) ultrostructura and immunocytochemical exsamination of chloroplastic enzymes // Botanica Acta. 1993, Vol. 106,1. 1, P. 32-41.

97. Butcher D.N. Secondary products in tissue cultures // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue, and organ cultures. Eds. F. Reiner, Y.P.S. Bajaj. Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer. 1977. P. 668-693.

98. Camm E. L., Towers G. H. N. Phenylalanine Ammonia Lyase // Phytochemistry. 1973. V.12. P.961-973.

99. Carceller M, Davey M. The influence of sucrose, 2,4-D and kinetin on the growth, fine structure and lignin contant of cultured sycamore-cells // Protoplasma. 1971. V.3 N.5. P. 367-375

100. Casati P, Walbon V. Gene expression profiling in response to ultraviolet radiation in maize gtnotypes with varying flavonoid content // Plant physiology, 2003, Vol. 132,1. 4, P. 1739-1754.

101. Chalker-Scott L. Enviromental significance of anthocyanins in plant stress responses / Photochemistry and Photobiology. 1999. V. 70. N l.P. 19.

102. Chaprin N., Elis B.E. Microspectrophotometric evaluation of rosmarinic acid accumulation in single cultured plant cells // Canad. J. Bot. 1984. V. 62. N. 11. P. 2278-2282.

103. Chattapadhyay Taxus cuspidata root; lignan; (+)-taxiresinoI; (+)-pinoresinol; enantiomer. // Cell free exracts, forsythia-intermedia, biosynyhesis, heterophylla. 2000, Vol. 46,1. 2, P. 167-171.

104. Chattopadhyay SK, Kulshrestha - M. Studies on the Himalayan Yew taxus-Wallichiana - part VI - isolation of nontoxoid constituents. // Indian journal of chemistry section. 1999. Vol. 38,1. 2, P.246-247.

105. Chen H., Chen F. Effect of yeast elicitor on the secondary metabolism of Ti-transformed Salvia miliorhiza cell suspension cultures // Plant cell reports, 2000, Vol. 19,1. 7, P. 710-717.

106. Cherednichenko M., Gladyshko Т., Zagoskina N. Transgenic potato plants and production of phenolic compounds in them // Международный симпозиум физиология трансгенного растения и проблемы биобузопасности, Москва, 2004, с.8.

107. Chevalier М, Perrochon Е, Clement A. Use of image analysis for the study of phenolic compounds of the grape berry skin (Vitis vinifera L., CV Cabernet Franc) // JOURNAL INTERNATIONAL DES SCIENCES DE LA VIGNE ET DU VIN. 2003, Vol. 37,1. 1, P. 63-65.

108. Choi H.K., Kim S.I. Enhancement of paclitaxel production by temperature shift in suspension culture of Taxus chinensis. // Enzyme and microbial technology. 2000, Vol. 27,1.8, P. 593-598.

109. Choi, HK Kim, SI Song, JY Son, JS Localization of paclitaxel in suspension culture of Taxus chinensis. // Journal of microbiology and biotechnology. 2001, Vol. 11,1. 3, P. 458-462.

110. Cisowski, W, KrauzeBaranowska, M, Madziar, B. Thin-layer chromatography of flavonoid dimers from x Cupressocyparis leylandii (Dall. et Jacks.) Dall. and its variation "Naylors Blue". // Chemia analityczna. 1997, Vol. 42,1. 5, P. 635-641.

111. Collinspavao N., Chin C.K. Taxol partitioning in 2-phase plant-cell cultures of Taxus brevifolia. // Journal of biotechnology. 1996, Vol. 49,1. 1, P. 95-100.

112. Compton andPreece, Newl IA., P.T.C. 1986. V. 50. P. 9-18.

113. Das B. Takhi M. Phenolics from needles of Himalayan taxus baccata. // Phytochemistry. 1993, Vol. 33,1. 6, P. 1489-1491.

114. Das B., Rao S.P. A taxoid from needles of Himalayan Taxus baccata. // Phytochemistry, 1995, V. 38,1. 3, P. 671-674.

115. Deluc L.,BarrieuF. Characterization of a grapevine R2R3-MYB transcription factor that regulates the phenylpropanoid pathway // Plant physiology preview, 2006, Vol. 140, P. 499-511.

116. Destaillats, F Wolff, RL Angers, P A new Delta 7-polyunsaturated fatty acid in Taxus spp. seed lipids, dihomotaxoleic (7,11-20 : 2) acid. // Lipids. 2001, Vol. 36,1. 3, P. 319-321.

117. Diaz J., Marapara J. Dianthramide glucosides from tissue cell cultures of Delphinium staphisagria L. II Phytochemistry, 2005, Vol. 66, I. 6, P. 733739.

118. Dixon R.,Paiva N., Stress-indused phynylpropanoid metabolism // Plant cell, 1995, Vol. 7, P. 1085-1097.

119. Fecht-Christoffers M., Fuhrs H. The role of hydrogen peroxide-producing and hydrogen peroxide-consuming peroxidases in the leaf apoplast of cowpea inmangsnese tolerance // Plant Physiology preview, 2006, Vol. 140, P. 1451-1463.

120. Ferguson L.R. Role of Plant Polyphenols in Genomic Stability// Mutation Research. 2001. V. 475. P. 89-111.

121. Fettneto A.G., Dicosmo F. Cell culture of taxus as source of the antinaoplastic drug taxol and related taxanes. I I Biotechnology. 1992. Vol. 19,1. 12, p. 1572-1575.

122. Feucht W, Treutter D, Polster J. Flavanol binding of nuclei from tree species // Plant Cell Reports. 2004, Vol. 22,1. 6. P 430-436.

123. Forkmann G. Heller W. Biosynthesis of flavonoids // Comprehensive natural products chemistry, Amsterdam, Elsevier, 1999, P. 713-748.

124. Freudenberg K., Neish A.C. Constitution and biosynthesis of lignin. Spinger-Verlag. Berlin., Heidelberg. New York. 1968. 500 p.

125. Frohmeyer H, Staiger D. Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants/ balancing damages and protection // Plant physiology, 2003, Vol. 133,1.4, P. 1420-1428.

126. Fryer M.J., The antioxidant effects of thylakoid vitamin E (a-tocopherol) //Plant, Cell Environ. 1992. Vol. 15. p. 381.

127. Furmanova M., Kropczynska D. Influence of water from the surface of 2 Yew (Taxus) species on mites (Tetranychus-Urticae). // Journal of appliedtoxicology. 2002, Vol., 22,1., 2, P., 107-109.

128. Furmanova M., Syklowskabaranek K. Hairy root cultures of Taxus X media as a new source of paclitaxel and 10-deacetylbaccatin-III. // Biotechnology letters. 2000, Vol. 22,1. 8, P. 683-686.

129. Gage T. B., Wendei S. H. Quantitative Determination of Certain Flavonol-3-Glycosides //Analitical Chemistry. 1950. V.22. P.708-711.

130. Gardner RO. Vanillin-hydrochloric Acid As a Histocimical Test// Stain Technology. 1975. V. 50. P. 315-317.

131. Gersbach PV, Wyllie SG, Sarafis V. A new histochemical method for localization of the site of monoterpene phenol accumulation in plant secretory structures // ANNALS OF BOTANY. 2001, Vol. 88,1. 4, P 521525.

132. Gorshkova, TA Salnikov, VV Pogodina, NM Chemikosova, SB Lozovaya, VV Composition and distribution of cell wall phenolic compounds in flax (Linum usitatissimum L.) stem tissues.// Annals of botany. 2000, Vol. 85,1. 4, P. 477-486.

133. Grabber J. H., Hatfield R.D. Ferulate cross-linking in cell walls isolated from maize cell suspensions //Phytochemistry. 1995. Vol 40. P. 1077.

134. Grandmaison J., Olah G., Calsteren M. Characterisation and localization of plant phenolics likely involved in the pathogen expressed by endomycorrizal root // Mycorrhiza. 1993. Vol. 3,1. 4, P. 155-164.

135. Gross G.G. Recent advances in the chemistry and biochemistry of lignin // Biochemistry of plant phenolics. N.Y.: Plenum press, 1979. P. 177-220.

136. Gross G.G. Hydrolysable tannins // Methods in plant biochemistry. Eds.

137. P.N. Dey, J.B. Harborne. V.9. Academic Press. 1993. P. 25-43

138. Grotewold E., Chamberlin M. Engineering secondary metabolism in maize cells by ectopic expression of transcription factors // Plant cell, 1998, Vol. 10? P. 721-740.

139. Guillemard V., Bicamumpaka C. Development of very sentetive luminescence assay for the measurement of paclitaxel and Related taxanes. //Anticancer research. 1999, Vol. 19,1. 6B, P. 5127-5130.

140. Guy R.K. Scott Z.A. Sloboda R.D. Fluorescent taxoids. // Chemistry and Biology. 1996, Vol. 3,1. 12, P. 1021-1031.

141. Hahlbrock K, Scheel D. Physiology and molecular biology of phenylpropanoid metabolism // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 1989. V.40.P. 347-369.

142. Hajnos M.L., Glowniak K. Optimization of the isolation of some taxoids from Yew tissues. // JPS journal of plantar chromatography - moden PLC. 2001, Vol. 14,1. 2, P. 119-125.

143. Hakam N., Simon J. P. Effect of low temperatures on the activity of oxygen-scavenging enzymes in two populations of the C-4 grass Echinochloa crus-galli II Physiologia Plantarum. 1996. V. 97. N. 2. P. 209216.

144. Hall R., Holden M. The accumulation of phnylpropanoid and capsaicinoid compounds in cell cultures and whole fruit of the chilli pepper, Capsicum frutescens Mill 11 1987, Vol. 8,1. 3, p. 163-176.

145. Hano C, Addi M. Differential accumulation of monolicnol-derived compounds in elicited flax (Linum usitatissimum) cell suspension cultures // Planta, 2006, Vol. 223,1. 5, P. 975-989.

146. Hanson-JR. Diterpinoids. //Natural product reports. 1998, Vol. 15, I. 1, P. 93-106.

147. Harborne J. B. Plant phenolics // Secondary plant products / Eds. Bell E. A., Charlwood B. V. Berlin, Heidelberg, New York. Springer-Verlag. 1980. P. 329 402.

148. Harborne J. B. Do natural plant phenols play a role in ecology? // Acta Hort. 1994. N381. P.36-43.

149. Harborne J. B., Williams C.A. Advances in flavonoid research since 1992 // Phytochemistry. 2000. V. 55. P. 481-504.

150. Harborne J.B. Arsenal for survival secondary plant-products. // Taxon. 2000, Vol. 49,1. 3, P. 435-449.

151. Halsam E. Metabolites and metabolism: A commentary on secondary metabolism. Oxford, 1985.16lp.

152. HergertH. L. Forest prod. J. 1960. V. 10, P. 610.

153. Herrmann K. M. The shikimate pathway: early steps in the biosynthesis of aromatic compounds // The Plant Cell. 1995. V. 7. P. 907-919.

154. Higuhi T. Biochemistry of Lignification // Wood Res. 1980. № 66. P. 116.

155. His I., Andeme-Onzighi C. Microscopic studies on mature flax fibers embedded in LR white: immunogoid localization of cell wall matrix polysaccharides // Journal of histochemistry and cytochemistry, Vol. 49, P. 1525-1536.

156. Holstege, DM, Galey, FD, Determination of alkaloid exposure in a model ruminant (goat) using a multiresidue screening method. // Journal of agricultural food chemistry. 1996, Vol. 44,1. 8, P. 2310-2315.

157. Hong Y., Lin-Ling H., Shu D. Pulsed electric field stimulates plansecondary metabolism in suspension of taxus chintnsis II Biotechnology Bioeng. 2004 Dec.

158. Hook I., Wang X.-P. Seasonal variation of neutral and basic taxoid contents in shoots of European Yew (Taxus baccata). // Phytochemistry. 1999. V.52,1. 6, p. 1041-1045.

159. Hudgins J.W., Christiansen E. Methyl jasmonate induces changes mimicking anatomical defenses in diverse members of the Pinaceae and Taxus. // Tree physiology. 2003, Vol. 23,1. 6, P. 361-371.

160. Hutzler, P, Fischbach, R, Heller, W. Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. 1998, Vol. 49, I. 323, P. 953-965.

161. Ishimara K., Arakawa H. Polyphenol production in cell cultures of Cornus kousa // 1993, Vol. 32,1. 5, P. 1193-1197.

162. Ishikura N., Teramoto S. Procyanidins and catechin from callus and cell suspension cultures of Cryptomeria japonica // Agric. Biol. Chem. 1983. V. 47.N.9. P. 1377-1380.

163. Ishikura N. Seasonal changes in contents of phenolic compounds and sugar in Phus, Eucnymus and Acer leaves with special reference to anthocyanin formation in autumn // The Botanical Magazin. 1976. V. 89. N 1016. P. 251-258.

164. Jamamoto H, Jera K., Tsuchiya S.I. Flavonol glucoside production in callus cultures of Epimedium diphyllum // Phytochemistry. 1992. V. 31. N. 3. P. 837-840

165. Janas K. M., Cvikrovâ M., Palagiewicz A., Eder J. Alterations in phenylpropanoid content in soybean roots during low temperature acclimation // Plant Physiol. Biochem. 2000. V. 38.1. 7-8. P. 587-593.

166. Janas K. M, Cvikrovâ M, Palagiewicz A, Szafranska K, Posmyk M. M. Constitutive elevated accumulation of phenylpropanoids in soybean roots at low temperature // Plant Science. 2002. V. 163.1. 2. P. 369-373.

167. Jones D. Phenylalanin ammonia-lyase: regulation of its induction, and its role in plant development // phytochemistry. 1984. V. 23. N. 7. P. 1349 -1359.

168. Jansen M., Noort R., Tan M. Phenol-oxiding peroxidases contridute to the protection of plants from ultraviolet radiarion stress // Plant physiology,2001, Vol. 126, P. 1012-1023.

169. Jeandet P., Doullit-Breuil A. Phytoalexins from the F/'tacetfe:biosynthesis, phytoalexins gene expression in transgenic plants, antifungal activity and metabolism // Journal agricultural food chemistry,2002, Vol. 50, P. 2731-2741.

170. Jha S., Sanyal D., Ghosh B. Improved taxol yield in cell-suspension culture of Taxus wallichiana. I ! Planta medica. 1998. Vol. 64, I. 3, P. 270272.

171. Jones D. H. Phenylalanine ammonia-lyase: regulation of its induction and its role in plant development // Phytochemistry. 1984. V.23. N.7. P. 1349-1359.

172. Juntheikki M.-R., Julkenen-Thtto R. Inhibition of glucosidase and esterase by tannins from Betula, Salix and Pinus species // J. Chemical Ecol. 2000. V. 26. N. 5. P. 1151-1165.

173. Kawamura F, Ohira T, Kikuchi Y. Constituents from the roots of Taxus cuspidate // JOURNAL OF WOOD SCIENCE. 2004, Vol. 50, I. 6, P 548551.

174. Kawamura, F Kikuchi, Y Ohira, T Phenolic constituents of Taxus cuspidata I: Iignans from the roots. // Journal of wood science. 2000.

175. Ketchum -REB, LuongJ.V. Efficient extraction of paclitaxel and related taxoids from leaf tissue of taxus using a potable solvent system, //journal of liquid chromatography and related technologies. 1999, Vol. 22, I. 11, P. 1715-1732.

176. Ketchum REB, Tandon M. Isolation of labeled 9-Dihydrobaccatin-III and Related taxoids from cell-cultures of Taxus canadensis elicited with metal jasmonate. // Journal of natural products. 1999, Vol. 62, I. 10, P. 1395-1398.

177. Kethum REB, Gibson D.M. The kinetics of taxol accumulation in cell-cucpension cultures of Taxus following elicitation with methyl-jasmonate. // Biotechnology and bioengincering. 1999, Vol. 62,1. 1, P. 97-105.

178. Kienitz A, Vogel C, Morales I, Muller R, Bastians H. Partial downregulation of MAD1 causes spindle checkpoint inactivation and aneuploidy, but does not confer resistance towards taxol // ONCOGENE. 2005, Vol. 24,1.26, P. 4301-4310.

179. Kladnik A., Chamusco K. Evidence of programmed cell death in post-ploem transport cell of the maternal pedicel tissue in developning caryopsis of maize // Planf physiology preview, 2004, Vol. 136, P. 3572-3581.

180. Knaggs A. The biosynthesis of shikimate metabolites // The royal socirty of chemistry, 2003, Vol. 20, P. 119-136.

181. Koes R., Quattrocchio F., Mol J. The flavonoid biosynthesis pathway in plants: function and evolution//BioEssays, 1994, Vol. 16, P. 123-132.

182. Koga et al. The scoop on night soil // plant physiology, 2006, Vol. 140.,

183. Kolb C., Martin K., Kopecky J. Effects of natural intensities of visible and UV-radiation on epidermal UV-screening and photosynthesis in grape leaves // Plant physiology, 2001, Vol. 127, P. 862-875.

184. Komali A, Zheng Z. A mathematical model for the growth kinetics and synhesis of phenolics in orégano (Origanum vulgare) shoot cultures inoculated with Pseudomonas species // Process Biochemistry, 1999, Vol. 35,1. 3, P. 227-235.

185. Konczak-fslam /., Okuno S, Yoshimoto M. Composition of phenolics and anthocyanins in a sweet potato cell suspension culture // Biochemical engineering journal, 2003, Vol. 14,1. 3, P. 155-161.

186. Kosieradzka I, Borucki W, Matysiak-Kata I. Transgenic potato tubers as a source of phenolic compounds. Localization of anthocyanins in the peridermis // JOURNAL OF ANIMAL AND FEED SCIENCES. 2004, Vol. 13,1. 2. P 87-92.

187. Krajci J., gross G.G. Ormation of gallotannins in callus cultures from oak (Quercus robur) // Phytochimistry. 1987. V. 26. N. 1. P. 141-143.

188. Kwon I.C., Yoo Y.J., Lee J.H., Hyun J.O. Enhancement of taxol production by in-situ recovery of product. // Process biochemistry. 1998, Vol. 33,1. 7, P. 701-707.

189. Laplaze L., Gherbi H. Flavan-containing cells delimit frankia-infected compartments in casuarinas glauca nodules // Plant physiology, 1999, vol. 121, P. 113-122.

190. Laskaris G., Bounkhay M. Induction of geranylgeranyl diphospate synthase activity and taxane accumulation in Taxus baccata cell-cultures after elicitation by metal jasmonate. // Plant science. 1999, Vol. 147,1. 1, P. 1-8.

191. Lee, NK Kim, HJ Yang, SJ The anticancer mechanisms of taxol-diethylenetriamine pentaacetate conjugate in HT29 human colorectal cancer cells. // Journal of biotechemistry and molecular biology. 2001, Vol. 34,1.3, P. 237-243.

192. Leon J., Rojo E., Sanchez-Serrano J.J. Wound Signaling in Plants// J. Experimantal Botany. 2001. V. 52. N. 354. P. 1-9.

193. Levis N.G. Yamamoto E. Lifnin: occurrence, biogenesis and biodégradation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol/ Eds. Brigss, Jones R.L., Walbot V. California. USA. 19990. V. 41. P. 455-496.

194. Li M, Chen JM, Chen JK. Profiling taxanes in taxus extraction using liquid chromatography/mass spectrometric technique // CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY 2005, Vol. 33, I. 3, P. 333337.

195. Li. J., Ou-Lee T., Raba R. Arabidobsis flavonoid mutants arc hypersensitive to UV-B irradiation // Plant Cell. 1993. Vol. 5. P. 171.

196. Li-Sff, Zhang-H J. Rearranged Taxanes from the bark Taxus-Yunnanensis. // Journal of natural producrs. 2000, V. 63, I. 11, P. 14881491.

197. Li-SH, Zhang-HJ. Taxuyunnanines S-V, new taxoids from Taxus Yunnanensis // Planta Medica. 2002, V. 68,1. 3, P/ 253-257.

198. Lofty S., Fleuriet A. Biocinthesis of phenolic compounds in Vitis vinifera cell suspension cultures: Study on hydroxycinnamoyl CoA : ligase // Plant cell reports, 1989, Vol. 8,1. 2, P. 93-96.

199. Lovelock C, Clough B. Distribution and accumulation of ultravioletradiation-absorbing compounds in leaves of tropical magroves // Planta. 1992, Vol. 188,1. 2, P. 143-154.

200. Lozovaya V. V., Lygin A. V., Zernova O. V., Li S., Hartman G. L., Widholm J. M. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani II Plant Physiology and Biochemistry. 2004. V. 42. P. 671-679.

201. Luo J.P., Mu Q., Gu Y.H. Protoplast culture and paclitaxel production by Taxus yunnanensis. // Plant cell tissue and organ culture. 1999, Vol. 59,1. 1, P. 25-29.

202. Ma Z.Y., Yuan Y.J., WuJ.C. Apoptotic cell-death in suspension cuilures of Taxus chinensis Var. Mairei. // Biotechnology letters. 2002, Vol. 24,1. 7, P. 573-577.

203. Maier W., Peipp H., Schmidt J. Levels of terpenoid glycoside (Blumenin) and cell wall-bound phenolics in some cereal // Plan physiology, 1995, Vol. 109,1. 2, P. 465-470.

204. Maries S., Ray H. New perspectives on proanthocyanidin biochemistry and molecular regulation //Phytochtmistry, 2003, Vol. 64, P. 867-383.

205. Menhard B., Eisenreich W. Taxoids from cell-cultures of Taxus Chinensis. //Phytochemistry. 1998, Vol. 49,1. 1, P. 113-125.

206. Miller, MC Johnson, KR Willingham, MC Apoptotic cell death induced by baccatin III, a precursor of paclitaxel, may occur without G(2)/M arrest. // Cancer chromotherap. 1999, Vol. 44,1. 6, P. 444-452.

207. Moreno p., Heijden R. Elicitor-metiated induction of isochrismatesynthase and accumylation of 2,3-dihydroxy benzoic acid in Catharanthus roseus cell suspension and shoot cultures // Plant cell reports, 1994, Vol. 14, I. 2, P. 188-191.

208. Muller w.C., Greenwood A., The ultrastruture of phenolicstoring cells fixed wisth caffeine // J. exptl. bot, 1978. V. 29. p.757-762.

209. Munzenberger B., Heilemann J. Phenolics of mycorrizas and non-mycorrhizal roors of Norway spruce II 1990, Vol. 182,1. 1, P. 142-148.

210. MyranakaT, Kurose K. Utilisation of extractives from Taxus Tree antifungal activities of flavonoids, Taxinine and its derivatives against Cochliobolus-Miyabeanus and Alternaria-Kikuchiana. // Mokuzai Gakkaishi. 1999, Vol. 45,1. 1, P. 42 55.

211. Nemeth-Kiss V., Forgacs E., Cserhati T., Schmidt G. Determination of Taxol in Taxus Species in Hungary by High-Performance Liguid Chromatography-Diode Array Detection Effect of Vegetative Period// J. Chromatography A. 1996. V. 750. C. 253-256.

212. Olsson L. C„ Veit M., Weissenbock G. and Bornman J. F. Differential flavonoid response to enhanced UV-B radiation in Brassica napus II Phytochemistry. 1998. V. 49. N. 4. P. 1021-1028.

213. Opitz, S Schnitzler, JP Hause, B Schneider, B Histochemical analysis of phenylphenalenone-related compounds in Xiphidium caeruleum (Haemodoraceae). //Planta. 2003, Vol. 216,1. 5, P. 881-889.

214. Pakush A., Matern U. II Experientia. 1970., Vol. 26, P. 1187.

215. Palo R., Sunnerheim K. Seasonal variation of phenolics, crude and cell wall content of birch (betula pendula Roth.) in relation to ruminant in vitro digestibility // Oecologia. 1985, Vol. 65,1. 3, P. 314-318.

216. Parmar V.S. Jha A. Constituents of the Yew Trees. // Phytochemistry. 1999, Vol 50,1. 8, P. 1267-1304.

217. Pasqua G., Monacelli B. The effects of growth regulators and sucrose on anthoceanin production in Camptotheca acuminate cell cultures // Plant physiology and biochemistry, 2005, Vol. 43,1. 3, P. 293-298.

218. Pasqualini S, Piccioni C., Reale L., Edirli L. Ozone-induced cell death in tobacco cultivar Bel W3 plants. The role of programmed cell dearth in lesion formation // Plant physiology, 2003, Vol. 133, P. 1122-1134.

219. Pecket R.C., Small C.J. Occurrence, Location and Development of Anthocyanoplasts//Phytochemistry. 1980. V. 19. N.12. P. 2571-2576.

220. Petersen M., Hauser E. The biosynthesis of rosmarinic asid in suspension cultures of Coleus blumei // Plant cell, tissue and organ. 1994. V. 38. N 2-3. P. 171-179

221. Philips D.A Flavonoids: Plant signsls to soil microbes // Phenolic metabolism in plants. N.Y.: Plenum press, 1992. P. 201-231.

222. Pietta P. Flavonoids as antioxidant // Journal nature product, 2000, Vol. 63, p. 1035-1042.

223. Plazek A., Hura K. Influence of chitosan, pectinase and fugnal metabolites on activation of phenilpropanoid pathway and antioxidant activity in oilseed rape callus // Acta physiologiae plantarum, 2005, Vol. 27, I. 1,P. 95-102.

224. Politycka B. Physiological responses of cucumber to allelochemicals of phenolic compounds // Allelopathy Journal. 2002, Vol. 10,1. 2, P 85-103.

225. Pollak P.E., Vogt T., Mo Y. Chalcone synthase and flavonol accumulation in stigmas and anthers of Petunia Hybrida // Plant Physiol. 1993. Vol. 102. P. 925.

226. Porter L.J. Flavans and proantocyanidins // The flavonoids. Ed. Harborne J. Champton and Hall. 1988. P. 21-62

227. Pourcel L, Routaboul J. Transparent testa 10 Encodes a Laccase-like enzyme involved in oxidative polymerization of flavonoides in arabidobsis seed coat // Plant cell, 2005, Vol. 17,1. 11, P. 2966-2980

228. Qing-Wen Shi, Takauki Oritani. Two biocyclic taxsane diterpenoids from the needles of Taxus Maitei. II Phytochemistry. 1999, V. 50, P. 633636.

229. Raghuvanshi S.S., Sristava A. Plant-Regeneration of Magniera indica Using Liquid Shaker Culture to Reduce Phenolic Exudation // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1995. V. 41.1. 1. P.83-85.

230. Ranocha P., Chabannts M. Laccase down-regulation causes alternations in phenolic metabolism and cell wall structure in poplar // Plant physiology, 2002, Vol. 129, P. 145-155.

231. Rao K.V., Juchum J. Taxanes from the bark of Taxus brevifolia. II Phytochemistry. 1998, Vol 47,1. 7, P. 1315-1324.

232. Rao S.R., Ravishankar G. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites // 2002, Vol. 20,1. 2. P. 101-153.

233. Raskin /. Role of salicylic acid in plants // Annu. Rev. Plant Physiol.

234. Plant Mol. Biol. 1992. Vol. 43. P. 439.

235. Ravanel P., Tissut M., Uncoupling activities of chalcones and dihydrochalcones on isolated mitochondria from potato tubers and mung bean hypocotyls // phytochemistry. 1982. Vol. 21. P. 1845.

236. Rhodes M.J.C. Physiological significance of plant phenolics // The biochemistry of plant phenolics. Oxford: Clerendon press, 1985. P. 99-118.

237. Robberecht R., Caldwell M.M. Protective mechanisms and acclimation to solar ultraviolet-B radiation in Oenothera stricta II Plant Cells Environ. 1983. Vol. 6. P. 477.

238. Roberts SC, Naill M, Gibson DM, Shuler ML. A simple method for enhancing paclitaxel release from Taxus canadensis cell suspension cultures utilizing cell wall digesting enzymes // Plant cell reports 2003. Vol. 21,1 12, P. 1217-1220.

239. Rodrigues L., Oliveira J. Histology of embryogenic responses in soybean anther culture 11 Plant cell, tissue and organ culture, 2005, Vol. 80, I. 5, P. 129-137.

240. Russian W.A., Ellis D.D. Immunocytochemical localization of taxol in Taxus cuspidate. II International journal of plant sciences. 1995, Vol. 156,1. 5, P. 668-678.

241. Sakuta M. Effects of sucrose on betacyanin accumulation and growth in suspension cultures of Phytolacca anericana // Phys. Plantarum. 1987 V. 71. p. 455-458

242. Sakai, J Ando, M Uchiyama, T Production of Taxol((R)) and relatedtaxoids by callus culture of Taxus cuspidate. II Nippon kagaku kaishi. 2002. I. 2, P. 231-238.

243. Salciccioli K., Dicosmo F. An abietane from Taxus cuspidate cell suspension cultures. // Rhytochemistry. 1998, Vol. 49,1. 5, P. 1475-1477.

244. Salminen J., Osipov V., haukioja E. Seasonal variation in the content of hydrolysable tannins in leaves of Betula pubescens II Phytochemistry, 2001, Vol. 57, p. 15-22.

245. Sanchez M., Pena M. Changes in dehydrodiferulic acides and peroxidase activity against ferulic acid associated with xell walls during groeth of Pinus Pinaster hypocotyl //Plant physiology, 1996, Vol. 111,1. 3, P. 941-946.

246. Santiago L., Louro R. Compartmentation of phenolic compounds and phenylalanine ammonia-lyase in ltaves of Phyllanthus tenellus and their induction by copper sulphate // Annals of botany, 2000, Vol. 86, P. 10231032.

247. Sapko O., Kunaeva R. Phenolic compounds of a culture of Alhagi kirghisorum cells // chemistry of natural compounds, 1999, Vol. 35, I. 2, P. 162-164.

248. Saslowsky DE, Warek U, Winkel, BSJ Nuclear localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis II Journal of Biological Chemistry. 2005. Vol. 280, I. 25, P. 23735-23740.

249. Sato J., Castedo L. Taxoids from European Yew, Taxus baccata L.H Phytochemistry. 1998. V. 47. No 5. P. 817-819.

250. Schijen E., Vos C., Tunen A., Bovy A. Modification of flavonoid biosynthesis in crop plants // Phytochemisrty, 2004, Vol. 65, P. 2631-2648.

251. Schmeda-Hirschmann G, Jordan M. Secondary metabolite content in rhizomes, callus cultures and in vitro regenerated plantlets of Solidago chilensis II2005, Vol. 60,1. 1. P. 5-10.

252. Schoch G., Attias R., Belghazi M. Engineering of a water-soluble plantcytochrome P450, CYP73A1, and NMR-based orientation of natural and alternate substrates in the active site // Plant physiology preview, 2003, Vol. 133, P. 1198-1208.

253. Sengupta G., Palit P. Characterization of a lignified secondary phloem fibre-deficient mutant of jute (Corchorus capsularis) II Annals of Botany, 2004, Vol. 93,1. 2, P. 211-220.

254. Shein I., Polyakova G. Accumulation of phenolic compounds in conifer callus cultures in response to wood Blue-Stain fungi // Russian journal of plant physiology, 2001, Vol. 48,1. 2, P. 216-221.

255. Shen-YC, Prakash-CVS. Taxane diterpenoids from root bark of Taiwanese Yew Taxus-Maire'i. II Journal of the Chinese chemical society. 2000, V. 47,1.5, P. 1125-1130.

256. Shetty P., Atallah M. Effects of UV treatment on the praline-linked pentose phosphate pathway for phenolics and L-DOPA synthesis in dark germinated Vicia faba II Process Biochemistry, 2002, Vol. 37, I. 11, P. 1285-1295.

257. Shi Z., yuan Y., Wu J. Biological responses of suspension cultures of Taxus chinensis mairei to shear stresses in the short term // Appl Biochemistry and Biotechnology. 2003, Vol. 110,1. 2, P. 61-74.

258. Shimazaki K., Igarashi T., Kondo N. Protection by the epidermis of photosynthesis against UV-C radiation estimated by chlorophyll a fluorescense //Physiol, plant. 1988. V. 74. P. 34.

259. Shinozaki Y, Fukamiya N. Dataxusin-C and dataxusin-D, 2 novel taxoids from Taxus Yunnanensis. II Journal of natursl products. 2002, Vol. 65, I. 3, P. 371-374.

260. Slimes tad R. Flavanoids in dund and young needles of Picea, pinus and Abies II Biochemical systematics and ecology, 2003, Vol. 31, P. 1247-1255.

261. Son S.H., Chio S.M. Large-scale growth and taxane production in cellcultures of Taxus cuspidate using a novel bioreactor. // Plant cell reports. 2000, Vol. 19,1. 6, P. 628-633.

262. Song, ZY, Yao, XB Wu, M Direct interaction between survivin and Smac/DIABLO is essential for the anti-apoptotic activity of survivin during taxol-induced apoptosis. // Journal of biological chemiatry. 2003, Vol. 278, I. 25, P. 23130-23140.

263. Soukupova J., Cvikrova M. Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Piceaabies) //Research New Phytology. 2000. V. 146. P.403-414.

264. Spencer P. A., Towers G.H.W. Virulence-inducing phenolics compounds detected by Agrobacterium tumefaciens II Plant cell wall polymers. Wash. (D.C.): Amer. Chem. Soc., 1989. P. 383-398.

265. Stafford H.A., Cheng T. Y., The proantocyanidins of Douglas fir seedlings, callus and suspension cultures derived from cotyledons // Phytochemistry. 1980. V. 19. N.l. P. 131-135.

266. Stafford H. Proantocyanidins and the lignin connection // Phytochemistry. 1988. V. 27. N. 1. P. 1-6.

267. Stafford A. Natural products and metabolites from plants and plant tissue cultures // Plant cell and tissue culture. Ed. Stafford A., Warren G. Open Univ. Pfess. 1991. P. 26-47.

268. Stafford H.A. Roles of Flavonoids in Symbiotic and Defense Functions in Legume roots//Bot. Rev. 1997. V. 63. P. 27-39.

269. Stavianakou S.,Lliakopoulos G., Karabourniotis G. Boron deficiency effects on growth, photosynthesis and relative concentrations of phenolics of Dittrichia viscose. II Environmental and experimental botany. 2006, Jul.

270. Stefanowska M., Kuras M., Kacperska A. Low temperature-induced nodifications in cell ultrastructure and localization of phenolics in winter oilseed rape (Brassica napus L.) leaves // Annais of botany, 2002, Vol. 90,1.5, P. 637-645.

271. Stefanowska M., Zobel A.M., Kuras M. Cytochemical localization of phenolic compounds in columella cells of the root cap during maturation of seeds of Brassica napus I. II Plant biology. 2003. Vol. 5,1. 4, P. 378-382.

272. Sterjiades R., Dean J. Extracellular laccases and peroxidases from sycamore maple (Acer pseudoplatanus) cell-suspension cultures Reactions with monolignols and lignin model compounds // Planta, 1993, Vol. 190, I. 1,P. 75-87.

273. Strack D., Mock H. Hydroxycinnamic acids and lignins // Methods in plant biochemistry. Eds P. Dey, J. Harborne V. 9. Academic press. 1993. P. 45-97.

274. Steet H.E. Plant tissue and cell culture // Botanical monographs. V. 14. N. 5-6. P. 1205-1207.

275. Svojanovsky S.R., Egodage K.L. High-Sensitivity ELISA determination of Taxol in various human biological-fluids. // Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 1999, Vol. 20,1. 3, P. 549-555.

276. Swain T. chemistry and biochemistry of plant pigments. Ed. Goodwin T.W. Academic Press. 1976. V. 1. P. 425-442.

277. Swain T., Hallis W.E. The phenolic constituents of Prunus domestica. 1-The phenolic constituents of Pruconstitutients // J. Sci. Food Agric. 1995. V. 10. P. 63-68.

278. Takeda H, Kotake T. Expression and function of cell wall-bound cationic peroxidase in Asparagus somatic embryogenesis // Plant physiology preview, 2003, Vol. 131, P. 1765-1774.

279. Tanaka A., Sakamoto Y., Ishigaki O. An ultraviolet-B-resistant mutant with enhanced DNA repair in Arabidopsis II Plant physiology, 2002, Vol. 129,1. 1, P.64-71.

280. Tecunaga N., Sakakibcira N. Involvement of extracellular dilignois in lignification during tracheary element differentiation of isolated Zinnia mesophyll cells // Plant and cell physiology, 2005, Vol. 46,1. 1, P. 224-232.

281. Teramoto S., Ishikura N. The formation of cathechin and procyanidins in cell suspension cultures of Cryptomeria japonica// Bot. Magazine. 1985. V. 98. N. 1050. P.171-176.

282. Theodoridis G., Dejong C.F. Application of SPE for the HPLC analysis of taxanes from Taxus cell-cultures. // Chromatography. 1998, Vol. 47,1. 12, P. 25-34.

283. Towers G.H.N., Abeysekera B. Cell wall hydroxycinnamate esters as UV-A reseptors on phototrophic responces of higher plsnts a new hypothesis // Phytochemistry. 1984. Vol. 23. P. 951.

284. Treutter D., Polster J. Flavanol binding of nuclei from tree species. // PLANT CELL REPORTS. 2004. Vol. 22,1. 6, P. 430-436.

285. Valluri J., Treat IV. Bioreactor culture of heterotrophic sandalwood cell suspensions utilizing a cell-lift impeller// Plant cell report, 1991, Vol. 10,1. 6, P. 366-370.

286. Vesela, D Saman, D Valterova, I Seasonal variations in the content of taxanes in the bark of Taxus baccata L. // Phytochemical analysis. 1999, Vol.19,1. 6, P. 319-321.

287. Wagner H., Gilbert M., Wilhelm C. Longitudinal leaf gradients of UV-absorbing screening pigments in barley (Hordeum vulgare) II Physiol. Plantarum. 2003. V. 117. N 3. P. 383-391.

288. Wang H.Q., Yu J.T., Zhong J.J. Significant improvement of taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. // Process biochemistry. 2000, Vol. 35,1. 5, P. 479-483.

289. Wang Z.Y., Zhong J.J. Repeated elicitation enhances taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis in bioreactors. // Botechnologyletters. 2002, Vol. 24,1. 6, P. 445-448.

290. Ward, RS. Lignans, neolignans and related compounds. // Natural product. 1997, Vol. 14,1. 1, P. 42-74.

291. Weissenbock G., Hedrich R. Secondary phenolic products in isolated guard cell, epidermal cell and mesophyll cell protoplasts from pea (Pisum sativum) leaves: Distribution and deteminatuion // Pronoplasma, 1986, Vol. 134,1. 2, P. 141-148.

292. Wickremesinhe ERM, Arteca R.N. Taxus callus-cultres initiation, growth optimization and taxol production. // Plant cell tusue and organ culture. 1993, Vol. 35,1. 2, P. 181-193.

293. Williams A. N. Dihydrochalcones of Malus species. // Journal chemical satiation. 1961, V. 9, P. 4133.

294. WilsonC.R., Sauer J.M. Taxines A Review of the mechanism and toxicity of Yew alkaloids. //Taxon. 2001, Vol 39,1. 2-3, P. 175-185.

295. Wingsle G., Karpinski S., Hdllgren J.-E. Low temperature, high light stress and antioxidant defence mechanisms in higher plants // Phyton (Austria). Special issue. Eurosilva 4. 1999. P. 253-268.

296. Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis. // Plant physiology, 2001, Vol. 126, P. 485-493.

297. Yamamoto H., Chamani N., Kitayama A. Flavonoids production in Scutellaria baicalensis callus culture // Plant Cell, Tissue, Organ culture. 1986. V. 5.N.3.P. 219-222.

298. Yang SJ, Fang YM, Chend YS. Lignans, Flavonoids and Phenolic Derivaties from Taxus mairei //Journal of the Chenese Chemical Society. 1999. V. 46.1. 5. P. 811-818

299. Yazaki K, Fukui H, Nishikawa Y, Tabata M. Measurement of phenolic compounds and their effect on shikonin production in Lithospermum cultured cells // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1997, Vol. 61,1. 10, P 1674-1678.

300. Ylstra B., Touraev A., Moreno R. Flavonols stimulate development, germination, and tube growth of tobacco pollen // Plant physiology, 1992, Vol. 100, P. 902-907.

301. Yuan Y.J., Li C., Hu Z.D. Fungal elicitor-induced cell apoptosis cultures of Taxus chinensis for taxol production. // Process biochemistry. 2002, Vol. 38,1. 2, P. 193-198.

302. Yuan Y.J., Li C., Hu Z.D., Wu J.C. Signal-transduction pathway for oxidative burst and taxol production in suspension cultures of Taxus chinensis indused by oligosscchtide. // Ensyme and microbial technology. 2001, Vol. 29,1. 6, P. 372-379.

303. Yuan Y.J., Ma Z.Y. Taxol induced apoptotic cell-death in suspension cultures of Taxus cuspidata. II Biotechnology letters. 2002, Vol. 24, 1. 8, P. 615-618.

304. Zaman K. Phenolic compounds and phenilalanin ammonia lyase activity in two soybean cell lines that differ in ther ploidy levels // Acta societatis. Botanicorum Poloniae 1988. V. 57. N.l. p, 177-186.

305. Zenk M.N. Production of rosmarinic acid by cell-suspension of Coleus blumei // Naturwissenschaften. 1977. V/64. N11. p. 779-782.

306. Zhang, ZQ Su, ZG Catalysis mechanism to increase taxol from theextract of Taxus cuspidate callus cultures with alumina chromatography. // Separation science and technology. 2002, Vol. 37,1. 3, P. 733-743.

307. Zobel A., Kuras M. Cytoplasmic and apoplastic location of phenolic compounds in the covering tissue of the Brassica napus radicle between embryogenesis and germination // Annals of botany, 1989, Vol. 64, I. 2, P. 149-157.

308. Zobel A., Nighswander J. Accumulation of Phenolic compounds in the nicrotic areas of Austrian and red pine needles due to salt spray // Annals of Botany, 1990, Vol. 66, P. 629-640.

Информация о работе

Зайцева, Светлана Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Образование и локализация фенольных соединений в растениях тисса (Taxus baccata L., Taxus canadensis Marsh.) и в инициированных из них каллусных культурах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы