Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности культивирования клеток растений семейства тиссовых - продуцентов дитерпеноида таксола

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности культивирования клеток растений семейства тиссовых - продуцентов дитерпеноида таксола"

На правах рукописи

РГБ ОД

- 6 СЕН 2009

Уразбахгина Нурия Анасовна

(

ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА ТИССОВЫХ -ПРОДУЦЕНТОВ ДИТЕРПЕНОИДА ТАКСОЛА

03. 00. 12 - Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2000

Работа выполнена в лаборатории регуляции метаболизма культивируемых клеток растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.Г. Мардамшин Научный консультант:

доктор химических наук, профессор М.С. Мифтахов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.Р. Кудоярова кандидат биологических наук Р.К. Байбурина

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им. КАТимирязева

Защита состоится "имзыл. 2000 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 064.13.09 при Башкирском государственном университете.

Адрес: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет БашГУ, ауд. 332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан "juO.iL 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Д-6.Н. Г.Г. Кузяхметов

Ет ■ т. £ -ц о. ¿¿к о

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Известно, что продукты вторичного метаболизма растений нашли широкое применение в пищевой промышленности, парфюмерии, медицине. Растения семейства Тиссовых оказались уникальным источником дитерпеноида, получившего тривиальное название таксол, для которого характерна антиопухолевая активность. Этот дитерпеноид состоит из природного алкалоида баккатина 1П, содержащего в 13-ом положении атома углерода боковую цепь. Молекулярный вес таксола 852.93, формула СдтНлТТОм, точка плавления 213-216°С, максимальное содержание в растениях - 0.02%. Функция данного дитерпеноида в самих растениях не известна. В связи с низким содержанием таксола в растительном сырье (так, для получения 1 кг таксола необходимо переработать около 10 тонн коры) и низкой скоростью роста растений семейства Тиссовых (годовой прирост не превышает 3 см), а также ограниченностью сырьевых запасов, возникла необходимость в получении клеточных культур этого вида растения. Однако при работе с каллусными и суспензионными культурами исследователи столкнулись с рядом проблем, а именно: низкой скоростью роста и слабой жизнеспособностью, а также невысоким содержанием таксола. Во многих случаях гибель клеток, культивируемых в асептических условиях, происходила уже через 2-3 пассажа. Учитывая большую потребность в таксолё для лечения ряда онкологических заболеваний, цель работы заключалась в получении каллусной ткани Тисса ягодного с повышенным содержанием дитерпеноида таксола. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- проведение сравнительного анализа каллусообразования на различных экс-плантах Тисса ягодного и Тисса дальневосточного и изучение влияния сезонности на данный процесс.

- получение каллусной ткани и суспензионной культуры Тисса ягодного - продуцентов таксола.

- анализ особенностей культивируемых клеток Тисса ягодного.

Научная новизна работы.

Получена каллусная ткань Тисса ягодного с содержанием таксола, примерно равным его максимальному содержанию в природном сырье.

Показано, что повышенное накопление таксола происходит в каллусе, полученном на базальной и апикальной части хвои, собранной в зимний период.

Установлены, по крайней мере, две причины, обусловливающие низкую скорость роста культивируемых клеток гисса: задержка пика митотической активности в цикле выращивания каллусов и нарушение цитокинеза.

,. Практическая значимость.

Результаты исследований расширяют представление об особенностях биологии клеток растений, культивируемых in vitro, и могут быть использованы при работе с другими видами хвойных.

Метод выращивания каллусов на границе раздела питательных сред с различной концентрацией минеральных солей может применяться для повышения жизнеспособности первичных каллусов небольшого размера.

Каллусная ткань Тисса ягодного с повышенным содержанием таксола в дальнейшем может быть использована для наработки данного дитерпеноида.

Апробация работы.

: Материалы диссертационной работы докладывались на 7-й Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Алушта, 1998); на республиканской конференции "Современные проблемы естествознания на стыках наук" (Уфа, 1998); на Международной научно-практической конференции "Сервис большого города" (Уфа, 1999); на IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999).

Публикации.

. . По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит го введения, глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на /03 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает ЛИ_ наименований, в том числе 1^/1 - на иностранных языках.

Объект и методы исследования.

В качестве объекта исследования служили каллусные культуры, полученные из хвои и стеблей Тисса ягодного (Taxus baccata L.) и Тисса дальневосточного (Taxus cuspidata Siebold et Zucc. ex Endl., обозначаемый дугами систематиками как Тисс остроконечный). Тисс ягодный произрастал в течение 25 лет на территории Ботани-

ческого сада-института Уфимского научного центра РАН. Двухлетние саженцы Тисса дальневосточного были получены из Хабаровского края и выращивались в течение одного года на территории опытного участка Института биохимии и генетики УНЦ РАН. Индукция каллусообразования и последующее культивирование проводили на питательной среде Гамборга и Эвелега [Gamborg and Eveleigh, 1968]. Выращивание каллусов проводили в темноте при 22-24 °С. Субкультивирование осуществляли через 21 сутки.

Определение прироста сырой биомассы каллусной ткани проводили стандартным методом [Бутенко, 1964]. Выделение ДНК из каллусной ткани Тисса ягодного проводили по методу Грахема в модификации Мардамшина и Геращенкова [Graham, 1978; Мардамшип, Геращеиков, 2000].

Электрофоретическое разделение препаратов ДНК в агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием проводили стандартным методом [Ма-ниатис и др., 1984].

Определение содержания таксола в каллусных тканях проводили по методу [Heinstein et al., 1996]. Анализ проводили на хроматографе "Waters-484" при комнатной температуре. В качестве неподвижной фазы использовали Zorbax ODS № 16632 и Separon SGX NH2. Элюентом служила смесь H20:CH2CN (ацетонитрил):ТГФ (тетра-гидрофуран) = 58:33:9. Хроматографирование проводили при длине волны 227 нм. В качестве стандартного образца использовался таксол фирмы Briston-Myers Squibb S.p.A. Содержание таксола в образцах оценивали, используя метод абсолютной калибровки для концентраций таксола 0.005, 0.01, 0.5, 1.0 мг/мл.

Анализ таксола осуществляли методом ЯМР. Спектры ЯМР ]Н и 13С получали яа спектрометре "Bruker АМ-300" с рабочей частотой 300 МГц и 75.47 МГц соответственно. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан, растворителем служил CDCI3 (дейтерохлороформ). УФ-спектры сняты на приборе "Specord VI400", структуру соединения устанавливали на основе данных ЯМР !Н и 13С.

Для цитологического анализа фиксацию растительного материала проводили в зеактиве Кларка, состоящего из смеси 96%-ного этанола и ледяной уксусной кислоты '3:1). Для приготовления временных препаратов каллусы помещали на предметное ¡текло в каплю красителя (2 % ацетокармин) и нагревали над спиртовкой до легкого ошения. Затем накрывали покровным стеклом и заостренной спичкой надавливали на

объект исследования [Прозина, 1960]. Полученные временные давленые препараты просматривали при помощи световых микроскопов NU-2 и Jenamed-2 при различном увеличении объектива с использованием зеленого светофильтра. Наиболее интересные участки препаратов фотографировали на пленку Микрат 300 с применением мнк-рофотонасадки МФН-1.

Результаты и их обсумедение 1. Характеристика каллусной ткани из Т. baccata L. и Т. cuspidata Sieb, et Zucc.

Частота каллусообразоваиия и формирование каллусной ткани на различных эксплантах Т. baccata L. и Т. cuspidata Sieb, et Zucc., собранных в зимний период, представлены в таблице 1.

Т.С____1

1 avjjinUíl i

Частота каллусообразоваиия на эксплантах Taxus baccata L. и Taxus cuspidata

Sieb, et Zucc.

Эксплант Кол-во эксплан-тов Частота каллу-сообра-зова-ния, % Формирование каллуса

Базаль-ная часть хвои Апикальная часть хвои По всей поверхности экс-планта Размер первичного каллуса

1)Т. baccata 2-летняя хвоя 210 41 68 28 1

2) Т. baccata 1-летняя хвоя 39 49 11 7 2

3)Т. cuspidata 1-летняя хвоя 60 53 32 5

4) Т. baccata стебель 68 33 23 5

5) Т. cuspidata стебель 79 82 . 65 5

6) Т. cuspidata корень 74 60 ш 44 . 5

Примечание: Размер первичного каллуса оценивался в балльной системе визуально. За единицу принят размер каллуса, который формировался на двухлетней хвое Taxus baccata L.

Из полученных данных видно, что частота каллусообразоваиия на однолетней хвое Тисса ягодного и Тисса дальневосточного практически одинакова (разница 4 %),

т.е. не наблюдалось видовых особенностей по данному параметру. Возрастные особенности экспланта Т. baccata L. оказали большее влияние на частоту каллусообразо-вания (различие составляло 8 %). Различие между двумя анализируемыми видами семейства Тиссовые наблюдалось по местоположению первичного каллуса, образованного на экспланте: если у Тисса ягодного каллус формировался только на базальной или апикальной части хвои (на базальной примерно в два раза чаще), то у Тисса дальневосточного - по всей поверхности. При этом размер каллуса, образованный на двухлетней хвое Т. baccata L., не превышал примерно 1.5 мм3, а на однолетней хвое этого же вида он был приблизительно в 2-3 раза больше.

Небольшой размер первичного каллуса в первом случае привел к тому, что при пересадке на свежую питательную среду он не был жизнеспособным.

Различия в местоположении первичного каллуса, образованного на хвое Т. baccata L. и Т. cuspidata Sieb, et Zucc., по всей видимости, объясняются следующими причинами: в зимний период растения Т. baccata L., интродуцированные в условия Башкирии 25 лет назад, впадают в состояние покоя и каллусообразование обеспечивается лишь меристематическими клетками, локализованными на базальной и апикальной части хвои. Растения же Т. cuspidata Sieb, et Zucc., не адаптированные к зимним условиям Башкирии (2-х летние растения выращивали в течение 1 года), согласно теории профессора JI.C. Сергеева [Сергеев и др., 1962], не впадают в состояние покоя, и каллусная ткань образуется как за счет меристематических клеток, так и за счет дедифференцировки специализированных клеток хвои. Подтверждением данного предположения являются данные по каллусообразованию на стеблевых сегментах. Частота каллусообразования на стеблевых эксплантах Т. cuspidata Sieb, et Zucc. была примерно в 2.5 раза выше, чем у Т. baccata L. Формирование первичного каллуса на отрезках стеблей у обоих видов тисса происходило по всей поверхности. Аналогичное явление также было характерно для корневых эксплантов Т. cuspidata Sieb, et Zucc.

Каллусные ткани Тисса ягодного н Тисса дальневосточного, полученные из хвои и стебля, различались по консистенции. Если для каллусной ткани Тисса ягодного были характерны каллусы плотной консистенции, то каллусы Тисса дальневосточного были рыхлыми.

Как упоминалось выше, размер первичного каллуса, образованного па двухлетней хвое, отличался небольшим размером. Скорее всего, это объясняется уменьшением скорости пролиферации меристематических клеток, поскольку двухлетняя хвоя Т. Ьасса1а Ь. практически достигла своего максимального размера. Известно, что каллусы небольшого размера отличаются плохой жизнеспособностью.

Наилучших результатов, повышающих их жизнеспособность, удалось достичь при использовании предложенной нами техники выращивания небольших кусочков каллуса на границе раздела питательных сред, имеющих одно- и двукратную концентрации минеральных солей (рис. 1). В качестве контрольных вариантов служили кал-лусные ткани, культивируемые на той же питательной среде с одно- и двукратной концентрацией минеральных солей. В опытном варианте произошло 3-5-кратное увеличите прироста сырой биомассы каллусов по сравнению с контрольными вариантами. По всей видимости, этот эффект был обусловлен изменением концентрации гормонов в каллусной ткани, а именно, ауксинов и цигокининов, которые, как известно, вызывают деление и растяжение клеток [Регуляторы..., 1979].

Рис. 1. Схема выращивания каллусных тканей на границе раздела питательных сред х1 - однократная концентрация минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга х2 - двукратная концентрация минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга

В основе предложенного способа выращивания каллусов на границе раздела питательных сред лежит известная процедура локального внесения удобрений, при которой только часть корневой системы растений находится в непосредственном контакте с минеральными солями. Это вызывает достоверное увеличение массы корневой системы растений по сравнению с растениями, выращенными в почве, в которую удобрения были внесены традиционным (вразброс) способом [Трапезников и др., 1999]. В пользу предположения об изменении гормонального балланса при выращи-

конгроль

контроль

опыт

вании каллусов на границе раздела питательных сред могут служить данные, полученные при изучении гормонального баланса растений пшеницы при локальном внесении удобрений. При этом происходило увеличение биомассы надземной и подземной части растений в опытном варианте по сравнению с контрольными. Наблюдавшиеся изменения биомассы происходили параллельно с изменениями концентраций ауксинов и цигокишшов [Иванов, 1990; Иванов и др., 1993; Иванов и др., 1994]. На основании этих экспериментов можно заключить, что нами разработан простой способ повышения жизнеспособности каллусов небольшого размера.

В таблице 2 представлены данные по относительному приросту сырой биомассы каллусов в течение первых 6 пассажей при их культивировании в темноте.

Таблица 2

Сравнительный анализ скорости относительного прироста каллусных тканей Taxus baccata L. и Taxus cuspidata Sieb, et Zucc.

Эксплант Относительный прирост сырой биомассы каллуса (%)

3 пассаж 4пассаж 5 пассаж 6 пассаж

1) Т. Ьасса1а хвоя 2-летних побегов 23 42 48 43

2) Т. Ьассгиа хвоя 1-летних побегов 40 62 53 61

3) Т. cuspidata хвоя 1-летних побегов 37 54 61 63

4) Т. Ьасса1а стебель 10 25 27 29

5) Т. cuspidata стебель 9 12 7 11

6) Т. cuspidata корень 1 2 - -

Для дальнейших исследований были использованы каллусные ткани Т. Ьасса1а Ь., полученные из хвои и стеблей.

Следует отметить, что культивируемые клетки отличались невысокой скоростью роста, наименьшей она была у каллусной ткани, полученной из корней. Кроме того, последние отличались плохой жизнеспособностью и погибли через 4 пассажа. Для ускорения роста клеток, выращиваемых в асептических условиях, меняют условия их выращивания, в частности, компоненты питательной среды (чаще всего регуляторы роста), переносят на свет (или наоборот в темноту) и т.д. Свет не оказал стимулирующего эффекта на рост каллусных тканей. При изменении регуляторов роста и/или их соотношения каллусные ткани погибали. На слабую жизнеспособность каллусных тканей тисса указывали Л.Г. Филонова и др. [1996], C.B. Некора и В.М. Ко-мов [1999]. Это дает основание считать, что используемая нами питательная среда была наиболее оптимальной, поскольку каллусы оставались жизнеспособными более 26 пассажей (18 месяцев).

2. Анализ содержания таксола в каллусной ткани Тисса ягодного

Результаты хроматографического анализа экстрактов каллусных тканей стеблевого и листового происхождения Тисса ягодного представлены на рисунках 2 и 3. Положение таксола на хроматограмме устанавливали по времени его удержания на колонке по отношению к стандартному раствору таксола производства фирмы "Bristol-Myers Squibb S.p. А". Кроме того, дополнительное подтверждение соответствия данного пика на хроматограмме дигерпе-ноиду таксолу получили при совместном хроматографировашш экстрактов каллусных тканей и стандартного таксола. Как видно из рис. 3, в каллусной ткани, полученной из стеблей, анализируемый дитерпеноидхроматографически не детектировался.

Идентификация таксола, синтезируемого культивируемыми in vitro клетками Тисса ягодного, полученного из хвои, была осуществлена методом ЯМР |3С и ЯМР 'Н. Полученные спекгры соответствовали спектрам стандартного раствора таксола и литературным данным [Woods and Nakanishi, 1966].

Содержание таксола в каллусных тканях, полученных из хвои, которые определяли методом абсолютной калибровки по отношению к стандартному таксолу различных концентраций, составляло 0.018 %.

Согласно литературным данным, содержание таксола в каллусной ткани Т. brevifolia Nutt составляло 0.02 % (через 2 месяца от начала культивирования) и 0.012 % (через 6 месяцев) [Ма-

кото, 1994], в каллусной ткани, полученной из побегов Т. Ьасса1а Ь. - 0.0096 % (30-дневный каллус), и 0.0038 % (50-дневный каллус) [Филонова и др., 1996].

Рис. 2. Хроматограмма экстракта каллусной ткани, инициированной из хвои Taxus baccata L. (зимний эксплант). Стрелкой указано положение пика, соответствующего по времени удержания таксолу.

Рис. 3. Хроматограмма экстракта каллусной ткани, инициированной из стебля Taxus baccata L. (зимний эксплант).

Известно, что максимальное содержание таксола в растениях Тисса не превышает 0.02% [Шретер, 1975]. Т. е. полученная нами линия каллусной ткани Тисса ягодного является высокопродуктивной и практически не уступает по содержанию таксола натуральному сырью. Однако следует отметить низкий процент прироста сырой биомассы данного каллуса (не более 80%).

Низкая скорость роста клеток тисса, выращиваемых в асептических условиях, отмечалась всеми авторами, работающими с этой культурой [Borman, 1992; Fett-Neto et al., 1994 a, b; Макото, 1994; Heinstein et al., 1996; Филонова и др., 1996; Музарок и др., 1999].

3. Влияние сезонности на каллусообразование и содержание таксола в

культивируемых тканях Taxus baccata L.

Известно, что скорость роста каллусных тканей и содержание в них продуктов вторичного метаболизма зависят от очень многих факторов. В их числе генетика и эпигенетика экспланта, возраст экспланта и его физиологическое состояние, исходное содержание в растениях практически важных продуктов биосинтеза, состав питательной среды, условия культивирования [Бутенко, 1986; Носов, 1991; Носов, 1999]. Поэтому не исключалась возможность того, что каллусные ткани, полученные из Тисса ягодного в разные периоды их вегетации, могут обеспечить получение клеточных линий, отличающихся высокой скоростью роста и повышенным содержанием таксола. Кроме того, можно было допустить, что это могло позволить получить каллусную ткань стеблевого происхождения, в которой детектировался бы анализируемый ди-терпеноид. Для выяснения данного вопроса каллусы были инициированы из хвои и стебля однолетних побегов Тисса ягодного, собранных в мае. Известно, что в весенний период происходит активация ростовых процессов и метаболизма растений. Поэтому было обще признанным, что каллусные ткани лучше всего получать из весенних эксплантов [Бутенко, 1964]. Кроме того, известно, что максимальное содержание таксола в хвое растений семейства Тиссовых приходится на конец мая - начало июня и оно составляет около 0.02 % [Шретер, 1975]. В отличие от зимних эксплантов, первичный каллус образовывался по всей поверхности хвои Т. baccata L., как и в случае зимних эксплантов Т. cuspidata Sieb, et Zucc. Это подтверждает высказанное предположение (см. раздел 1), что различия в местоположении первичного каллуса на хвое Т. baccata L. и Т. cuspidata Sieb, et Zucc. были обусловлены физиологическим состоянием эксплантов.

Каллусные ткани, полученные из хвои и стеблей в весенний период вегетации, отличались более высокой скоростью роста по сравнению с каллусами, инициированными из эксплантов, собранных в зимний период (табл. 3, также см. табл. 2).

Таблица 3

Относительная скорость прироста сырой биомассы каллусных ткапей Тисса ягодного (%), инициированых из эксплантов, собранных в весенний период

Эксплант Относительный прирост сырой биомассы каллуса (%)

3 пассаж 4пассаж 5 пассаж 6 пассаж

Однолетняя хвоя 80 78 50 72

Стебель однолетних побегов 91 87 40 69

Как видно из этой таблицы, относительная величина прироста сырой биомассы каллусных тканей в 3-4-ом пассажах выше, чем у каллусных тканей, инициированных из эксплантов. собранных в зимний период (см. табтт 2). Однако следует отметить, что при дальнейшем культивировании скорость прироста снизилась, и практически не наблюдалось отличий от каллусов, инициированных в зимний период. Величина прироста в последующие пассажи составляла 40-80 %.

Дитерпеноид таксол в экстрактах каллусной ткани стеблевого происхождения хроматографически также не детектировался, как и в случае стеблевого каллуса, инициированного из эксплантов, собранных в зимний период. Но он присутствовал в каллусе, полученном из хвои (рис. 4). Бри этом содержание таксола составляло 0.0017 %, что примерно в десять раз ниже, чем в каллусной ткани, полученной из хвои, собранной в зимнее время.

Поскольку первичный каллус образовывался по всей поверхности хвои, то его основная масса была инициирована за счет дедифференцировки специализированных клеток, а не меристематических, локализованных на базальной и апикальной частях хвои. В этом, скорее всего, одно из главных отличий каллуса, сформированного на зимних и весенних эксплантах. По всей видимости, это в значительной степени и предопределило различие по содержанию таксола в культивируемых in vitro клетках, полученных из хвои, собранных в разные сезоны вегетации Taxus baccata L. Отсутствие таксола в каллусных тканях стеблевого происхождения, по-видимому, объясняется действием определенных эпигенетических факторов, поскольку клетки тисса в составе хвои и стебля имеют различную степень и направленность дифференцировки.

4 8 12 ló 20 24 2s 32 млн

Рис. 4. Хроматограмма экстракта каллусной ткани, инициированной из хвои Taxus baccata L. (весенний эксплант ). Стрелкой указано положение пика, соотвествующего по времени удержания таксолу.

Отсутствие таксола в клетках каллусной ткани стеблевого происхождения не исключает возможность того, что в каллусе могут синтезироваться другие классы таксанов, характерные для целых растений или новые классы. (Ввиду отсутствия соответствующих метчиков подобная работа нами не проводилась). В каллусной ткани Taxus wallichiana Zucc. было показано наличие нового таксана 2-дезацитоксидециннамоил-таксанина, не характерного для целых растений, и, кроме того, детектировались два известных соединения 2-дезацетоксин-таксанин и 2а-ацетоксибревифолиол [Chattopadhyay, Sharma, 1995]. В каллусной ткани, полученной из игл семи разновидностей тисса, детектировалось наличие 7-эпи-Юдезацетилтаксола, цефаломаннина и 7-эпи-10-дезацетилцефалло-маннина [Ellis et al., 1996]. В суспензионной культуре Taxus brevifolia Nutt. установлено наличие цефаломаннина и баккагина Ш [Hinnstein et al., 1996]. В каллусной культуре Taxus cuspi-data Sieb, et Zucc. присутствуют таксановые дитерпеноиды юннаксан, таксюгашшн, такеюннанин С, юннанксан,таксюннанин-7-Ь-ол[Музарокидр., 1999].

4. Суспензионная культура Т. baccata L.

Как упоминалось выше, каллусные ткани тисса характеризовались низкой скоростью роста. Не исключалась возможность того, что прирост биомассы мог увеличиться при культивировании клеток в жидкой питательной среде. Основой для такого предположения служил тот факт, что при переводе каллусных тканей в суспензионную культуру менялись условия существования клеток. Это - механический стресс при перемешивании, изменение условий аэрации, изменение степени агрегированно-сти клеток. Суспензионная культура была получена из каллусных тканей листового происхождения (зимний вариант) путем механической диссоциации каллусов с помощью гомогенизатора Поттера. Суспензионная культура Тисса ягодного представляла собой мелкоагрегированную популяцию клеток. Интересной особенностью данной культуры являлось то, что питательная среда изменяла свой цвет от желтого до оранжевато-розового. С проблемой спонтанного покраснения цвета питательной среды суспепзиошюй культуры Taxus х media Rehd. также столкнулись R. Enarsha и сотрудники [1994]. Необходимо отметить, что выделения каллусами окрашенных продуктов метаболизма в питательную среду не наблюдалось.

Прирост биомассы клеток суспензионной культуры составил около 50-60 %. Т. е., низкая скорость роста была характерна как для каллусов, так и для суспензии. Исходя из литературных данных, можно сделать вывод, что прирост биомассы клеток растений семейства Тиссовых при выращивании в жидкой питательной среде не превышал 100% [Heinstein et al„ 1996].

Определение содержания таксона в культуралъной жидкости и в клетках суспензии проводили хромато графически. При этом необходимо отметить, что таксол детектировался как в клетках тисса, так и в питательной среде. Это говорит о том, что определенная часть синтезированного клетками дитерпеноида секретируется в среду культивирования. В таблице 4 суммированы данные по содержанию данного дитерпеноида в суспензионной культуре и каллусной ткани, а также в хвое и стебле экс-плантов, из которых были инициированы каллусы. Из таблицы видно, что содержание таксола как в клетках суспензионной культуры, так и в среде культивирования было меньше, чем в каллусной ткани, из которой была получена суспензия.

Таблица 4

Содержание дитерпеноида таксола в каллусных тканях и суспензионной культуре Taxus baccata L.

Анализируемый объект Содержание таксола (%)

Каллус из однолетней хвои (зима) 0.018

Каллус из стебля однолетних побегов (зима) Не детектируется

Каллус из однолетней хвои (весна) 0.0015

Каллус из стебля однолетних побегов (весна) Не детектируется

Клетки суспензионной культуры 0.0013

Суспензионная жидкость 0.0018

Однолетняя хвоя 0.004

Стебель однолетних побегов 0.006

Эти результаты показывают, что смена условий существования клеток тисса привела к снижению содержания искомого дитерпеноида, а скорость прироста биомассы осталась примерно на том же уровне, что и у каллусных тканей.

5. Цитологическая характеристика каллусной ткани Taxus baccata L.

Известно, что популяция соматических клеток растений генетически гетеро-генна и физиологически асинхронна. Однако, несмотря на это, клетки растений, культивируемые in vitro, в целом проходят фазы ростового цикла, характерные для клеток в составе целых растений. Рост популяции клеток в цикле периодического выращивания характеризуется сигмоидальной кривой, которую подразделяют на лаг-фазу, фазу ускоренного роста, фазу экспоненциального роста, фазу замедленного роста, стационарную фазу и фазу деградации [Бутенко, 1999]. Синтез ДНК начинается в лаг-фазе, а интенсивное деление клеток, состоящее, как правило, из 1-2 пиков, приходится на экспоненциальную фазу. В этой же фазе наблюдается рост клеток растяжением [Бутенко, 1999].

На рис. 5 представлены кривые роста каллусных тканей, полученных из хвои и стебля (зимний эксплант). Как видно из этого рисунка, прирост биомассы происходил лишь в интервале между 12 и 15 сутками культивирования. Отсутствие прироста в последующие дни выращивания каллусов могло быть обусловлено различными при

Рис. 5. Анализ относительного прироста сырой биомассы каллусных тканей, полученных из хвои (—) и га стебля (—) Гахаэ Ьасса1а Ь. Точки фиксации 1, 2, 3, 4, 5, б соответствуют 3, б, 9, 12, 15, 18 суткам субкультивирования

5

о 6

Е В О С

0

ГГ 3 4

1 ?

а г 5 I3

г о та

В. 2

о Ч

° 1 О 1

4,8

гг

3,1 |

2,5

1,7

1 I

I •ф;

1

6 12 18 Время субкультивирования, сутки

Рис. 6. Сравнительный анализ относительного содержания ДНК в двух типах каллус-ной ткани в расчете на единицу сырой биомассы

Примечание. За единицу принято содержание ДНК каллуса, полученного из стеблей, на шестые сутки субкулътивирования.

чинами, в том числе и гибелью клеток. Т.е., с одной стороны, могло происходить деление и растяжепие клеток, а с другой - их гибель. Косвенным критерием процессов разрушения могла служить деградация ДНК. Однако электрофоретический анализ препаратов ДНК не подтвердил это предположение: ДНК была интактной и мигрировала в агарозном геле в виде дискретной зоны. Анализ содержания ДНК в расчете на единицу сырой биомассы на 6, 12 и 18 сутки субкультивирования (рис. 6) показал, что имеется четко выраженная тенденция к увеличению содержания ДНК в цикле выращивания каллусов. Эти результаты были несколько неожиданными. Дело в том, что максимальный пик митотической активности обычно наблюдается в течение 1/3 - 1/2 периода субкультивирования, затем наступает рост за счет растяжения клетки. Поэтому содержание ДНК в расчете на единицу биомассы к концу цикла выращивания, как правило, уменьшается.

Это противоречие могло объясняться особенностями митотического цикла клеток каллусной ткани тисса. Проведенный анализ (рис.7) показал, что максимальный пик митотической активности каллусных тканей листового и стеблевого происхождения приходится на 15 сутки субкультивирования. Поскольку цикл субкультивироьа-ния продолжался 21 сутки (на 23-25 сутки наступала фаза деградации клеток), то по всей видимости, фаза роста клеток растяжением была ограничена во времени. Возможно, это является одной из основных причин низкой скорости роста каллусов. Следует отметить, что каллусы листового и стеблевого происхождения незначительно различались между собой по митотической активности в цикле выращивания и составляли: на 3 сутки субкультивирования 0.04%; на 6-ой - 0.2%; на 9-ый - 1.6%; 12-ый - 0.3%; 15-ый - 0 %; 18-ый день - 0.3%, соответственно.

Эти данные, в свою очередь, также находились в некотором противоречии с результатами сравнительного анализа относительного содержания ДНК в двух типах каллусов на 6, 12 и 18 сутки субкультивирования.

Возможным объяснением этого противоречия могло быть увеличение содержания ядер в каллусной ткани листового происхождения по сравнению с каллусами, полученными из стеблей. Основанием для такого предположения являлись литературные данные, согласно которым в процессе культивирования клеток in vitro наблюдаются различного рода аномалии клеточного цикла, приводящие к появлению многоядерных клеток. Обычно клетки растений, культивируемые in vitro, являются

S

6 т

1 2 3 4 S 6

точки фиксирования

Рис. 7. Анализ митотической активности каллусных тканей, полученных из хвои и стеблей Тисса ягодного

ДШ — каллус, полученный из листьев

каллус, полученный из стеблей

Точки фиксации: 1, 2, 3, 4, 5, 6 соответствуют 3, б, 9, 12, 15, 18 суткам субкультивирования

одноядерными, однако у моркови и табака встречались двуядерные клетки [Cooper et al., 1964], а у кормовых бобов, табака, традесканции, ячменя, пиона - трехъядерные [Yamada and Sinoto, 1967; Kallak, 1968; Cionini et al., 1978; Shamina et al., 1978].

Сравнительный анализ числа многоядерных клеток (рис. 8) в каллусной ткани листового и стеблевого происхождения представлен в таблице 5. Полученные результаты показали, что, с одной стороны, происходит процесс увеличения многоядерных клеток в обоих типах каллусов в цикле выращивания, и с другой - более высокое содержание многоядерных клеток в каллусах, полученных из хвои. По всей видимоста,

Рис. 8. Многоядерные клетки каллусной ткани Taxus baccata L. СМх450. 1-одноядерные клетки, 2-двуядерные, 3-трехъядерные, 4-четырехъядерные, 5 -шестиядерные.

последнее обстоятельство в некоторой степени определило различное содержание ДНК в каллусных тканях, полученных из хвои и стебля Тисса ягодного.

Следует отметить, что в работах, проведенных другими авторами, лишь упоминается о встречаемости двух- или трехьядерных клеток

Таблица 5

Содержание многоядерных клеток (%) в каллусной ткани Taxus baccata L.

Дни субкультивирования Каллус, полученный из хвои Каллус, полученный из стебля

3 0.01 0.01

6 0.02 0.01

9 0.08 0.03

12 0.09 0.05

15 5.54 2.91

18 6.65 3.62

В случае же каллусной ткани Тисса ягодного мы наблюдаем высокий процент многоядерных клеток (до 6.65 %); количество ядер в клетке варьирует от 1 до 6. Не исключено, что данное явление - характерная особенность каллусной ткани Тисса ягодного.

Описанные выше результаты наших исследований дают основание предполагать, что низкая скорость роста каллусов тиссовых обусловлена, по крайней мерс, двумя факторами: нарушением цитокинеза, приводящим к появлению многоядерных клеток, и поздним вступлением клеток в митоз, в результате чего, по-видимому, не происходит роста клеток растяжением.

Заключение

Использование клеточных культур в качестве источника продуктов вторичного метаболизма, имеющих практическое значение, является одной из основных задач биотехнологии. Увеличение количества видов растений, вводимых в культуру in vitro, изучение особенностей биологии свободноживущих клеток является необходимым этапом для решения вышеуказанной задачи.

С другой стороны, результаты, полученные при исследовании клеток, культивируемых в асептических условиях, расширяют представление о функционировании целого растения, механизмах, обеспечивающих их устойчивость к экстремальным условиям существования. В этой связи хочется отметить, что анализ особенностей кал-лусообразования на хвое Taxus baccata L. и Taxus cuspidata Sieb, et Zucc., собранной в зимний и весенний периоды, позволил получить новые факты, демонстрирующие механизмы адаптации растений к пониженным температурам.

Анализ влияния сезонности сбора эксплантов на продуктивность культивируемых клеток показал, что каллусная ткань Тисса ягодного образуется только на апикальной или базальной части хвои. При этом содержание таксола в каллусе было примерно на уровне его максимального содержания в растениях. Поскольку в весенних эксплантах хвои каллус образуется по всей поверхности, то это приводит к более высокой степени гетерогенности каллусаой ткани, и высокопродуктивные клетки в ней, по всей видимости, не являются доминирующими. Следствием этого явилось то, что содержание анализируемого таксола в этом каллусе было в 10 раз ниже, чем в каллусе, полученном из зимних эксплантов. Нельзя исключить вероятности того, что воздействие различных экстремальных факторов на растения перед сбором эксплантов может оказаться новым подходом, который позволит получать более однородные линии с высоким содержанием вторичных соединений.

Цитологический анализ позволил выявить два фактора, которые в определенной степени обусловливают низкую скорость роста каллусной ткани тисса. Эти результаты свидетельствуют о том, что использование различных физиологических способов повышения прироста биомассы, скорее всего, будет неэффективным. Успех в этом направлении, по-видимому, можно ожидать лишь в случае использования экспериментального мутагенеза с последующей клеточной селекцией.

Выводы

1. Установлено влияние сезонных изменений физиологического состояния растений Taxus baccata L. на местоположение первичного каллуса, образованного на хвое. У зимних эксплантов каллус формируется только на базальной или апикальной части, а у весенних - на всей поверхности хвои. Формирование первичного каллуса па хвое интродуцированного в условиях Южного Урала Taxus cuspidata Sieb, et Zucc., в отличие от Taxus baccata L., не зависело от сезонности, и он образовывался по всей поверхности хвои.

2. Предложен простой способ, повышающий жизнеспособность первичного каллуса небольшого размера при его дальнейшем пассировании, суть которого заключается в культивировании каллусов на границе раздела питательных сред с одно-и двукратной концентрацией минеральных солей.

3. Показано влияние эпигенетики экспланта на содержание таксола в культивируемых клетках Тисса ягодного. Данный дитерпеноид хроматографически детектировался лишь в кагшусной ткани, инициированной из хвои, н не обнаруживался в тканях, индуцированных из стеблей. При этом содержание таксола в каллусе, полученном из апикальной и базальной частей хвои (зимний эксплаят) в 10 раз выше, чем в каллусе из весеннего экспланта, и составляло около 0.018%, что примерно равно его максимальному содержанию в природном сырье.

4. В суспензионной культуре Taxus baccata L., полученной из каллуса, инициированного из хвои (зимний эксплант), содержание таксола в 10 раз ниже, чем в исходной каллусной ткани.

5. Установлено, что низкая скорость роста каллусов растений тиссовых обусловлена, по крайней мере, двумя факторами: нарушением цитокинеза, приводящим к появлению многоядерных клеток, н поздним вступлением клеток в митоз, в результате чего, по-видимому, не происходит роста клеток растяжением.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Уразбахтина H.A., Мардампшн А.Г. Каллусообразование у Taxus baccata L. // Материалы 7-й Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (7-13 сентября, 1998 г., Алушта). - Симферополь.-1998.-С.191.

2. Мардампшн А.Г., Уразбахтина H.A. Культура клеток растений как альтернативный источник биологически активных соединений // Сборник докладов республиканской конференции "Современные проблемы естествознания на стыках наук "(Ю-12 октября 1998 г., Уфа).-Уфа. - 1998. - С. 111-112.

3. Уразбахтина H.A., Мардампшн А.Г. Получение суспензионной культуры Тисса ягодного // Тезисы докладов Международной научно-практической конференции "Сервис большого города" (20-21 мая 1999 г., Уфа). - Уфа. -1999.-С. 194-195.

4. Уразбахтина H.A., Мардампшн А.Г. Сравнительная характеристика каллус-ных тканей Тисса ягодного Taxus baccata L. и Тисса японского Taxus cuspi-data Sieb, et Zucc. H Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений России (4-9 октября 1999 г., Москва). - Москва. - 1999. - С.718.

5. Уразбахтина H.A., Мардампшн А.Г. Получение каллусной ткани из листьев Taxus baccata L. II Биотехнология. - 1999. - N° 4. - C.55-56.

6. Уразбахтина H.A., Мардамшин А.Г. Особенности каллусообразовани из хвои Taxus baccata L. // Растительные ресурсы. - 2000. - Т.36,- вып. 1. - С.64-66.

7. Мардампшн А.Г., Уразбахтина Н.А, Чибиряев C.B., Трапезников В.К. Способ ускорения роста каллусных тканей растений // Растительные ресурсы (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уразбахтина, Нурия Анасовна

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика растений Taxus baccata L. и Taxus cuspidata Siebold et Zucc ex Endl.

1.2. Алкалоиды растений семейства Тиссовые

1.2.1. Противоопухолевая активность таксола

1.2.2. Механизм действия таксола

1.3.Культура клеток растений как источник продуктов вторичного метаболизма

1.3.1. Общая характеристика клеток, культивируемых in vitro

1.3.2. Вторичные метаболиты культивируемых клеток растений

1.3.3. Способы повышения содержания вторичных метаболитов в культурах клеток растений

2. Материалы и методы

2.1. Объект исследования

2.2. Условия получения и культивирования каллусных тканей

2.3. Определение прироста сырой биомассы каллусной ткани

2.4. Выделение ДНК

2.5. Фракционирование ДНК в агарозном геле

2.6. Анализ содержания таксола методом ВЭЖХ

2.7. Анализ таксола методом ЯМР

2.8. Цитологическая характеристика каллусной ткани

2.9. Использованные реактивы

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Характеристика каллусной ткани Taxus baccata L. и Taxus cuspidata Sieb, et Zucc.

3.2. Анализ содержания таксола в каллусной ткани Тисса ягодного

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности культивирования клеток растений семейства тиссовых - продуцентов дитерпеноида таксола"

Актуальность темы. Известно, что продукты вторичного метаболизма растений нашли широкое применение в пищевой промышленности, в парфюмерии, в медицине. Растения семейства Тиссовые оказались уникальным источником дитерпеноида, получившего тривиальное название таксол, проявляющего антиопухолевую активность.

Этот дитерпеноид состоит из природного алкалоида баккатина III, который содержит в 13-ом положении атома углерода боковую цепь. Молекуляро ный вес 852.93, формула С47Н51Ы0145 точка плавления 213-216 С, максимальное содержание в растениях - 0.02%.

Функция данного дитерпеноида в самих растениях не известна. В связи с низким содержанием таксола в растительном сырье (так, для получения 1 кг таксола необходимо переработать около 10 тонн коры) и низкой скоростью роста растений семейства Тиссовые (годовой прирост не превышает 3 см), а также ограниченностью сырьевых запасов, возникла необходимость в получении клеточных культур этого вида растения. Однако при работе с каллусными и суспензионными культурами этих растений исследователи столкнулись с рядом проблем, а именно: для этих клеточных культур характерна низкая скорость роста, невысокое содержание таксола, а также низкая жизнеспособность. Во многих случаях гибель клеток, культивируемых в асептических условиях, происходила через два-три пассажа. Нам известен случай, когда каллусная ткань была жизнеспособна в течение 24 пассажей. Учитывая большую потребность в таксоле для лечения ряда онкологических заболеваний, цель работы заключалась в получении каллусной ткани Тисса ягодного с повышенным содержанием дитерпеноида таксола. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи; 5

- проведение сравнительного анализа каллусообразования на различных эксплантах Тисса ягодного и Тисса дальневосточного и изучение влияния сезонности на данный процесс;

- получение каллусной ткани и суспензионной культуры Тисса ягодного продуцентов таксола;

- анализ особенностей культивируемых клеток Тисса ягодного.

Научная новизна работы.

Получена каллусная ткань Тисса ягодного с содержанием таксола, примерно равным его максимальному содержанию в природном сырье.

Показано, что повышенное накопление таксола происходит в каллусе, полученном на базальной и апикальной части хвои, собранной в зимний период.

Установлено, что имеются, по крайней мере, две причины, обусловливающие низкую скорость роста культивируемых клеток тисса: задержка пика митотической активности в цикле выращивания каллусов и нарушение цитокинеза.

Практическая значимость.

Результаты исследований расширяют представление об особенностях биологии клеток растений, культивируемых in vitro, и могут быть использованы при работе с другими видами хвойных.

Каллусная ткань Тисса ягодного с повышенным содержанием таксола может быть использована для наработки данного дитерпеноида в лабораторных условиях.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы докладывались на 7-й Международной научно-практической конференции "Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье" (Алушта, 1998); на республиканской конференции "Современные проблемы естествознания на стыках наук" (Уфа, 1998); на Международной научно-практической конференции "Сервис 6 большого города" (Уфа, 1999); на IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Благодарности.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. А.Г. Мардамшину, научному консультанту д.х.н., профессору М.С. Миф-тахову за всестороннюю помощь на всех этапах работы. Я также благодарна сотрудникам лаборатории регуляции метаболизма культивируемых клеток растений Института биохимии и генетики Шарафутдиновой Г.Г., Гугучкиной JI.M., Султанаевой И.В., сотрудникам лаборатории синтеза низкомолекулярных биорегуляторов Института органической химии к.х.н. Ахметвалееву P.P., Кузнецову О.М. за помощь при проведении экспериментальной части работы. 7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Уразбахтина, Нурия Анасовна

Выводы.

1. Установлено влияние сезонных изменений физиологического состояния растений Taxus baccata L. на местоположение первичного каллуса, образованного на хвое. У зимних эксплантов каллус формируется только на базальной или апикальной части, а у весенних - на всей поверхности хвои. Формирование первичного каллуса на хвое интродуцированного в условиях Южного Урала Taxus cuspidata, Sieb, et Zucc. в отличие от Taxus baccata L., не зависело от сезонности, и он образовывался по всей поверхности хвои.

2. Предложен простой способ, повышающий жизнеспособность первичного каллуса небольшого размера при его дальнейшем пассировании, суть которого заключается в культивировании каллусов на границе раздела питательных сред с одно- и двукратной концентрацией минеральных солей.

3. Показано влияние эпигенетики экспланта на содержание таксола в культивируемых клетках Тисса ягодного. Данный дитерпеноид хроматографи-чески детектировался лишь в каллусной ткани инициированной из хвои, и не обнаруживался в тканях, индуцированных из стеблей. При этом содержание таксола в каллусе, полученном из апикальной и базальной частей хвои (зимний эксплант) примерно в 10 раз выше, чем в каллусе из весеннего экспланта, и составляло около 0.018%, что примерно равно его максимальному содержанию в природном сырье.

4. В суспензионной культуре Taxus baccata L., полученной из каллуса, инициированного из хвои (зимний эксплант), содержание таксола ниже в 10 раз, чем в исходной каллусной ткани.

5. Установлено, что низкая скорость роста каллусной ткани тиссовых обусловлена, по крайней мере, двумя факторами: нарушением цинокинеза, приводящим к появлению многоядерных клеток и поздним вступлением клеток

84 в митоз, в результате чего, по-видимому, не происходит роста клеток растяже нием.

85

Заключение

Использование клеточных культур в качестве источника продуктов вторичного метаболизма, имеющих практическое значение, является одной из основных задач биотехнологии. Увеличение количества видов растений, вводимых в культуру in vitro, изучение особенностей биологии свободноживущих клеток является необходимым этапом для решения вышеуказанной задачи.

С другой стороны, результаты, полученные при исследовании клеток культивируемых в асептических условиях, расширяют представление о функционировании целого растения, механизмах, обеспечивающих их устойчивость к экстремальным условиям существования. В этой связи хочется отметить, что анализ особенностей каллусообразования на хвое Taxus baccata L. и Taxus cus-pidata Sieb, et Zucc., собранной в зимний и весенний периоды позволил получить новые факты, демонстрирующие механизмы адаптации к пониженным температурам.

Анализ влияния сезонности сбора эксплантов на продуктивность культивируемых клеток показал, что каллусная ткань Тисса ягодного образуется только на апикальной или базальной части хвои. При этом содержание таксола в каллусе было примерно на уровне его максимального содержания в растениях. Поскольку в весенних эксплантах хвои каллус образуется по всей поверхности, то это приводит к более высокой степени гетерогенности каллусной ткани и высокопродуктивные клетки в ней, по всей видимости, не являются доминирующими. Следствием этого явилось то, что содержание анализируемого таксола в этом каллусе было в 10 раз ниже, чем в каллусе, полученном из зимних эксплантов. Нельзя исключить вероятность того, что воздействие различных экстремальных факторов на растения перед сбором эксплантов может оказаться новым подходом, который позволит получать более однородные линии с высоким содержанием вторичных соединений.

82

Цитологический анализ позволил выявить два фактора, которые в определенной степени обуславливают низкую скорость роста каллусной ткани тис-са. Эти результаты свидетельствуют о том, что использование различных физиологических способов повышения прироста биомассы, скорее всего будет не эффективным. Успех в этом направлении, по-видимому, можно ожидать лишь в случае использования экспериментального мутагенеза с последующей клеточной селекцией.

83

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уразбахтина, Нурия Анасовна, Уфа

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки М.: Мир.-Т.2.-1994.-С.420.

2. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве-Новосибирск: ИЦиГ СО РАН-1993.-241с.

3. Блюм Я.Б. Организация цитоскелета протопластов и соматических гибридов растений: интеграция функции клетки // Итоги науки и техники. Биотех-нология.-М.: ВИНИТИ.-1988.-Т.9.-С.166-207.

4. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Культуры трансформированных клеток растений как новый источник получения продуктов вторичного метаболизма // Успехи современной биологии.-1992.-Т.112.-№3.-С.342-349.

5. Булгаков В.П., Козыренко М.М., Журавлев Ю.Н. Увеличение образования шиконина и n-флюорофенилаланинрезистентных клеток Lithospermum erythrorhizon // Тез. докладов конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология".-Алматы.-1993.-С.171.

6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений.-М.: Наука.-1964.-272с.

7. Бутенко Р.Г. Физиология клеточных культур, состояние и перспективы // Физиология растений.-1978.-Т.25.-ВЫП.5.-С. 1009-1024.

8. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и био-технология.-М.: Наука.-1986.-С.З-20.

9. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе.-М.: ФБК-ПРЕСС-1999.-160с.86

10. Валеев Ф.А., Горобец Е.В., Мифтахов М.С. 3-иодлевоглюкозенон и хи-ральный циклопропан // Известия АН. Серия химическая.-1997.-№6.-С.1242.

11. Валиева Р.Д. Фенольные соединения каллусной ткани солодки голой и регуляция их биосинтеза// Автореф. дисс. канд. биол. наук.-Уфа: 1999.-24с.

12. Валиева Р.Д., Мардамшин А.Г., Ахметов P.P. Получение каллусной ткани аконита белоустого // Сборник "Результаты научных исследований преподавателей биологического факультета БГУ".-Уфа: Баш. гос. ун-т.-1997.-С.36-38.

13. Васильев A.B., Гулисашвили В.З. Дендрофлора Кавказа.-Т.З.-Тбилиси: АН Грузинской ССР.-1959.-407с.

14. Воробьев Т.И. Лесная энциклопедия.-Т.2.-М.: Советская энциклопедия.-1986.-631с.

15. Гайсина И.Н., Селезнева Н.К., Тихонов О.В., Спирихин Л.В., Мифтахов М.С. Одностадийное превращение сульфохлоридов в ß-замещенные акролеины // Известия АН. Серия химич.-1997.-№10.-С.1900-1901.

16. Гайсина И.Н., Тихонов О.В., Селезнева Н.К., Абутков A.B., Фатыхов A.A., Спирихин Л.В., Мифтахов М.С. Новые би- и трициклические хиральные блоки для таксола из камфоры // Журнал органической химии.-1999.-Т.35.-вып.7.-С. 1020-1024.

17. Гайсина И.Н., Тихонов О.В., Спирихин Л.В., Мифтахов М.С. Новая синтетическая стратегия получения таксола // Журнал органической химии-1999.-Т.35.-вып.8.-С. 1266-1267.

18. Гордиенко И.И. Деревья и кустарники.-Киев: Наукова думка.-1971.155с.

19. Гостимский С.А. Генетическая изменчивость клеток растений при культивировании in vitro // Успехи современной генетики.-М.: Наука.-1987.-Т.14-С.48-63.87

20. Гроздова Н.Б., Некрасов В.И., Глоба-Михайленко Д.А. Деревья, кустарники и лианы. Справочное пособие.-М.: Лесная промышленность.-1986.-349с.

21. Губайдуллин М.И. Митохондриальный геном Pisum sativum L. при стрессе //Автореф. дисс. канд. биол. наук.-Уфа.-1999.-22с.

22. Джаошвили М.Р., Гогоберидзе М.К., Каранова C.JL Продуктивность штаммов и клеточных линий юкки славной (Yucca gloriosa L.) // Тез. докл. VI Международной конференции «Биология культивируемых клеток и биотехно-логия».-Новосибирск.-1988.-С.60-61.

23. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости // Молекулярные механизмы генетических процессов.-М.: Наука.-1991.-С.123-127.

24. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений.-М.: Наука-1981.-С.37-50.

25. Запрометов М.Н. Фенольные содинения: распространение, метаболизм и функции в растениях.-М.: Наука.-1993-272с.

26. Иванов И.И. Влияние характера распределения элементов минерального питания в среде на содержание фитогормонов в растениях // Казань.-1990.

27. Иванов И.И., Трапезников В.К., Кудоярова Г.Р. Изменение гормонального статуса растений пшеницы под влиянием минерального питания // Физиология и биохимия культурных растений.-1994.-Т.26.-№ 1.-С.32-35.

28. Иванов И.И., Трапезников В.К., Кудоярова Г.Р. Цитокинины и абсцизо-вая кислота в корнях пшеницы при локальном повышении концентрации элементов питания в среде // Физиология и биохимия культурных растений.-1993.-Т.25.-№ 4.-С.356-361.

29. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений-Киев: Наукова думка.-1980.-488с.88

30. Каранова С.JI. Принципы получения практически ценных штаммов культивируемых клеток растений методом экспериментального мутагенеза // Автореф. дисс. доктора биол. наук.-М.-1999.-42с.

31. Каранова С.Л., Горская Н.В., Бутенко Р.Г. Сомаклональные вариации в культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall. // ДАН СССР.-1985.-Т.285.-№3.-С.766-768.

32. Каранова С.Л., Носов A.M., Пауков В.Н., Шамина З.Б. Продуктивность различных клеточных линий диоскореи дельтовидной // Тез. докл. IV Всес. конференции «Культура клеток растений и биотехнология».-Кишинев: Штин-ца.-1983.-С.69.

33. Каранова С.Л., Носов A.M., Пауков В.Н., Шамина З.Б. Продуктивность различных клеточных линий диоскореи дельтовидной // Культура клеток растений и биотехнология.-М.: Наука.-1986.-С.83-87.

34. Константинов Ю.М., Ривкин М.И. Возможный свободнорадикальный механизм возникновения сомаклональной изменчивости у растений // Молекулярные механизмы генетических процессов.-М.: Наука-1991.-С.127-129.

35. Корецкая Т.Ф., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения (Camellia sinensis) как модель для изучения условий образования фенольных соединений // Физиол. раст.-1975.-Т.22.-№2.-С.282-288.

36. Корецкая Т.Ф., Запрометов М.Н. Фенольные соединения в культуре ткани чайного растения (Camellia sinensis) и влияние света на их образование // Физиол. раст.-1975.-Т.22.-№5.-С.941-946.89

37. Кузнецов С.И., Чуприн П.Я., Подгорный Ю.К. Деревья и кустарники, культивируемые в Украинской ССР (голосеменные). Справочное пособие. Киев: Наукова думка.-1985.-200с.

38. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедиффе-ренцировки и каллусообразования in vitro // Физиология растений.-1999.-Т.46.-№6.-С.919-929.

39. Кунах В.А., Войтюк Л.И., Алхимова Е.Г., Алпатова Л.К. Получение каллусных тканей и индукция органогенеза у Pisum sativum // Физиология растений.- 1984.-Т.31.-вып.З.-С.542-548.

40. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и жи-вотных.-М.: Мир.-1979.-548с.

41. Мардамшин А.Г. Получение суспензионной культуры солодки голой // Биотехнология солодки.-Уфа: Принт.-1995.-С. 19-20.

42. Мардамшин А.Г. Митохондриальный геном Pisum sativum.-Уфа: Ги-лем.-1999.-112с.

43. Мардамшин А.Г. Особенности структурной организации митохондри-ального генома высших растений // Автореф. дисс. доктора биол. наук.-М-1999.-47с.

44. Мардамшин А.Г., Геращенков А.Г. Способ получения чистых препаратов тотальной и митохондриальной ДНК из каллусных тканей // Физиология растений.-2000.-№2.-С.332-334.

45. Мардамшин А.Г., Губайдуллин М.И. Метилирование митохондриальной ДНК каллусной ткани гороха посевного // Тез. докл. IV Съезда Общества физиологов растений России (Москва, 4-9 октября 1999).-М.-1999.-С.628.

46. Мардамшин А.Г., Загидуллин A.M., Валиева Р.Д., Зиякаева K.P. Сравнительное изучение митохондриальных геномов целых растений и культивируемых клеток гороха посевного // Доклады АН.-1997.-Т.355.-№2-С.273-275.90

47. Нестерович Н.Д., Дерюгина Т.Ф., Лучков А.И. Структурные особенности листьев хвойных.-Минск: Наука и техника.-1986.-97с.

48. Новиков А.Л. Определитель хвойных деревьев и кустарников.-Минск: Вышэйшая школа.-1967.-210с.

49. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений.-М.: Наука.-1991 .-С. 5-20.

50. Носов A.M. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиология растений.-1994.-Т.41.-С.873-878.

51. Носов A.M. Культура клеток высших растений уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений.-1999.-Т.46.-№ 6.-С.837-844.

52. Прозина Н.И. Ботаническая микротехника.-М.: Высшая школа.-1960.206с.

53. Растительные ресурсы России и сопредельных государств: часть I Семейства Lycopodiaceae - Ephedraceae, часть II - Дополнение к 1-7 томам.-СПб.: Мир и семья-95.-1996.-571с.

54. Регуляторы роста растений (под редакцией Г.С. Муромцева).-М.: Ко-лос.-1979.-246с.

55. Сергеев Л.И., Сергеева К.А., Мельников В.К. Морфогенетическая периодичность и зимостойкость древесных растений.-Уфа: изд-во АН СССР.-1961.-223с.

56. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.-Киев: Наук. думка.-1990.-280с.91

57. Сидоров В.А., Сидорова Н.В. Сомаклональная изменчивость источник генетического разнообразия у растений // Цитология и генетика-1987.-Т.21.-№3.-С.230-237.

58. Скаукрофт У.Р. Сомаклональная изменчивость: миф о клональном единообразии // Мобильность генома растений.-М.: Агропромиздат.-1990.-С.228-260.

59. Тахтаджян A.JL, Лазаренко A.C. Жизнь растений.-М.: Просвещение.-1978.-T.IV.-447C.

60. Трапезников В.К. Физиологические основы локального применения удобрений.-М. : Наука.-1983.-176с.

61. Трапезников В .К., Иванов И.И., Тапьвинская Н.Г. Локальное питание растений.-Уфа: Гилем.-1999.-250с.

62. Усенко A.B. Хвойные деревья и кустарники Дальнего Востока. -Хабаровск: Хабаровское книжное изд-во.-1966.-95с.

63. Усенко A.B. Деревья, кустарники и лианы Дальнего Востока.-Хабаровск: Хабаровское книжное изд-во.-1984.-2-е изд.-272с.

64. Филонова Л.Г., Малышева Л.В., Грахов В.П., Блюм Я.Б. Особенности каллусогенеза и биосинтез таксола in vitro у Тисса ягодного // Биотехнология.-1996.-№8.-С.38-44.

65. Фролова Л.В. Особенности популяций культивируемых клеток // Культура клеток растений.-М.: Наука.-1981.-С.5-16.

66. Фролова Л.В. Цитогенетическая изменчивость и автоселекция растительных клеток в условиях in vitro // Биотехнология.-М.: Наука.-1984.-С.272-277.

67. Шевелуха B.C., Дегтярев C.B., Артамонова Г.М., Калашникова Е.А., Новиков H.H., Калашников Д.В., Ковалев В.М. Сельскохозяйственная биотехно-логия.-М.: МСХА.-1995.-310С.92

68. Шретер А.И. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока.-М.: Медицина.-1975 .-328с.

69. Alfermann A.W., Reinhard Е. Isolation of anthocyanin producing and non-producing tissue cultures of Daucus carota: influence if auxin on anthocyanin production // Experientia.-1971.-V.27.-P.353-354.

70. Allen R.D., Weiss D.C., Hayden J.H. Cliding movement of and bidirectional transport along single native microtubules from squid axoplasm: evidence for an active role of microtubules in cytoplasmic transport // J. Cell. Biol-1985-V.100-P.1736-1752.

71. Americal Society of Hospital Pharmacists. Technical Assistense Bulletin on Handling Cytotoxic Drugs in Hospitals // Am. J. Hosp. Pharm.-1990.-V.47.-P.1033-1049.

72. Anderson S., Lewis-Smith A.C., Smith S.M. Methylation of ribosomal RNA genes in petunia hibrid plants, callus cultures and regenerated shoots // Plant Cell Repts.-1990.-V.8.-P.554-557.

73. Bajer A.S., Mole-Bajer J. Drugs with colchicine-like effects that specifically disassemble plant but not animal microtubules // Ann. N. Y. Acad. Sci.-1986.-V.466.-P.767-484.

74. Bajer A.S., Mole-Bajer J. Reorganization of microtubules in endosperm cells and cell fragments of the higher plant Haemanthus in vivo // J. Cell. Biol.-1986.-V.102.-P.263-281.

75. Bauch H.J., Leistner E. Aromatic metabolites in cell suspensions cultures of Gallium molluga L. // Planta Med.-1978.-V.33.-P.105-123.

76. Bayley P.M., Manser E.J. Assembly of microtubules from nucleotide-de-pleted tubulin // Nature.-1985.-V.318.-P.683-685.93

77. Bayliss M. W. Factors affecting the frequence of tetraploid cells in a predominantly diploid suspension culture of Daucus carota // Protoplasma-1977.-V.92.-P.109-115.

78. Beltramo D.M., Arce C.A., Barra H.S. Tyrasination of microtubules and non-assembled tubulin in brain slices // Eur. J. Biochem.-1987.-V.162.-P.137-141.

79. Bergen L.G., Borisy G.G. Tubulin-colchicine complex inhibits microtubule elongation at both plus and minus ends // J.Biol.Chem.-l983.-V.258.-P.4190-4194.

80. Bergman L. Effect of kinetin on the formation of lignin and the differentiation in cultures tissue of Nicotiana tabacum // Planta.-1964.-V.62.-P.221-254.

81. Bohm H. Secondary metabolism in cell cultures of higher plants and problems of differentiation // Secondary metabolism and cell differentiation (Ed. By M. Luckner, L. Novel, N. Bohm.-Springer.-1987.-P.103-123.

82. Borman S. New strategies devised for prodicting taxol // Chem. and Eng. News.-1992.-V.70.-P.8.

83. Brown P.T.H. DNA methylation in plants and its role in tissue culture // Ge-nome.-1989.-V.31.-P.717-729.

84. Brown P.T.H., Lorz H. Molecular changes and possible origins of somaclonal variation // Somaclonal variation and crop improvement (ed. Semal J.).-Dorsrecht: Nijhoff.-1986.-P. 148-152.

85. Brunei G., Ibrahim R.K. Tissue culture of citrus peel and its potential for fla-vonoid synthesis // Ztschr. Pflanzenphysiol.-1973.-B.69.-S.152-162.

86. Cabral F.R. Isolation of Chinese hamster ovary cell mutantns requiring the continuous presence of taxol for cell division // J. Cell. Biol.-1983.-V.97-P.22-29.

87. Cabral F.R., Abaraham I., Gottesman M.M. Isolation of a taxol resistant Chinese hamster ovary cell mutant that has an alteration in a-tubulin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-1981.-V.78.-P.4388-4391.94

88. Cabral F.R., Wible L., Brenner S., Brinkley B.R. Taxol-requiring mutant of Chinese hamster ovary cells with ompaired mitotic spindle assembly // J. Cell. Biol.-1983.-V.97-P.30-39.

89. Cambray-Deakin M.A., Burgoyne R.D. Posttranstational modification of oc-tubulin: acetylated and detyrosinated forms in axons of rat cerebellum // J. Cell. Biol.-1987.-V.104.-P. 1569-1574.

90. Carlier M.F. Guanosine-5'-tripnosphate hydrolysis and tubulin polymerization // Mol.Cell Biochem.-1982.-V.47.-P.97-113.

91. Chattopadhyay S.K., Sharma R.P. A taxane from the himalajan yew. Taxus // Phytochemistry.-1995.-V.39.-P. 1935-1936.

92. Chourey P.S., Kemble B.J. // V Intern. Congr. Plant. Tissue. Cell. Culture.-Tokyo, Japan.-1982.-P.425-426.

93. Cionini P.G., Bennici A., D'Amato F. Induzione dela proliferazione cellulare in esplanti da cotiledoni di Vicia faba coltivati in vitro: analisi citologica e densi-tometra del DNA // Gazz. Bot. Ital.-1978.-V.l 12.-P.314-315.

94. Cionini P.G., Bennici A., D'Amato F. Nuclear cytology of callus induction and in vitro. I. Callus from Vicia faba cotyledons // Protoplasma.-1978.-V.96.-P.101-102.

95. Cleveland D.W. The multrutubulin hypothesis revisited: What have were learned? // J. Cell. Biol.-1987.-V.104.-P.381-383.

96. Clinical Oncological Society of Australia. Guidelines and recommendation for safe handling of antineoplastic agents //Med. J. Australia.-1983.-V.l.-P.426-428.

97. Cooper L.S., Cooper D.C., Hildebrandt A.C., Riker A.J. // Amer. J. Bot.-1964.-V.51.-P.284-290.

98. D'Amato F. Chromosome number variation in cultures cells and regenerated plants //Frontiers of plant tissue cultures.-Calgary: 1 APTC.-1978.-P.287-295.95

99. De Buyser J., Hartmann C., Henry Y., Rode A. Variation in long-term wheat somatic tissue culture // Can. J. Bot.-1988.-V.66.-P.1891-1895.

100. Dix P.J. Cell line selection // Plant Cell Culture Technology. Oxford; London: Blackwell sci. Publ.-1986.-P. 143-201.

101. Ellis D.D., Zeldin E.L., Brodhage M., Russin W.A., McCown B.H. Taxol production in nodule cultures of Taxus // J. Natur. Prod.-1996.-V.59.-P.246-250.

102. Fett-Neto A.G., Melanson S. J., Nicolson S.A., Penninhton J.J., Dicosmo F. Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and amino acid, feeding to cell cultures of Taxus cuspidata // Biotechnol. and Bioeng.-1994a.-V.44.-P.967-971.

103. Fett-Neto A.G., Zhang W.J., Cosmo F. Kinetics of taxol production, growth and nutrient uptake in cell suspensions of Taxus cuspidata // Biotechnol and Bio-eng.-l 994b.-V.44.-P.205-210.

104. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem.-1968.-V.46.-P.414-412.

105. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or larhe tissue masses // Anal. Biochem. 1978.-V.85.-P.609-613.

106. Hahlbrock K., Betz B., Gardiner S.E. Enzyme induction in cultured cells // Frontiers of plant tissue culture.-Calgary.-1978.- P.317-324.

107. Hargreaves A.J., Wandosell F., Avila J. Phosphorylation of tubulin enhances its interaction with membranes // Nature.-1986.-V.323.-P.827-828.

108. Heble M.R., Narayanaswamy S., Chadha M.S. Tissue differentiation and plumbagin synthesis in variant cell strains of Plumbago zeylonica in vitro // Plant Sci. Lett.-1974.-V.2.-P.405-409.96

109. Heinstein P., Jhou J.-J., Wang M., Liu Y.-C., Chen X., Chen D., Hoke S.H., Cooks R.C., Chang C. Taxol and taxane formation in plant cell culture // J. Chem. Soc. Perkin Trans. l.-1996.-№8.-P.845-851.

110. Horio T., Hotani H. Visualization of the dynamic instability of individual microtubules by dark-field microscopy // Nature.- 1986.-V.321.-P.605-607.

111. Jones R.B. Safe handling of chemotherapeutic agents: a report from the Mount Sinai Medical Center // Cancer J. For Clinicians.-1983.-Sept./Oct.-P.258-263.

112. Kallak H. Cell division and chromosome number in the tissue culture of nicotiana tabacum // Biol. Plant.-1968.-V.10.-P.199-204.

113. Kaul B., Stohs S.J., Staba E.J. Dioscorea deltoidea callus and suspension cultures // Lloydia.-1969.-V.32.-P.347-359.

114. Kemble R.J., Shepard J.F. Cytoplasmic DNA variation in a potato protoclo-nal population // Ibid.-1984.-V.69.-P.211-216.

115. Kim Zin-Hoon, Yun Jeohg-Hwon, Hwang Yohg-Soon, Byun Sang Yo, Kimm Dong-H. Production of taxol and related taxanes in T. brevifolia cell cultures: Effect of sugar // Biotechnol. Lett.-1995.-V.17.-P.101-106.

116. Krammer G., Singhofer-Wowra M., Seedorf K. Meluyn L. A plasmodial a-tubulin cDNA from Physarium polycephalum nucleotide sequence and comparative analysis // J. Mol. Biol.-1985.-V.183.-P.633-638.

117. Kumar N. Taxol-induced polymerization of purified tubulin // J. Biol. Chem.-1981.-V.256.-P. 1043 5-10445.97

118. Makoto C. Production of taxol by Taxus cells cultivation // Chem. and Chem Jnd.-1994.-V.47.-№1.-C.58-59

119. Maliga P. Isolation, characterization and utilization of murant cell lines in higher plant // Int. Rev. Cytol. Percpectives in Plant Cell and Tissue Culture-New York: Acad. Press.-Suppl.2.-1980.-P.225-250.

120. Maliga P. Isolation and characterization of mutants in plant cell culture // Annu. Rev. Plant Physiol.-1984.-V.35.-P.519-542.

121. Marchant H.J. In: The cytoskeleton in Plant Grows and DevelopmentLondon: Acad. Press.-1982.-P.285-319.98

122. Masuda K., Kikuta Y., Rijino K., Okazava Y. Preferential synthesis of mitochondrial DNA during the initial stage of tissue growth in potato explant cultures // J. Fuc. Agr. Hokkaido Univ.-1994.-V.66.-P.13-25.

123. Mattehews B.F., De Bonte L.K. Chloroplast and mitochondrial DNAs of carrot and its wild relatives // Plant. Mol. Biol. Rep.-1985.-V.3.-P.12-14.

124. Meredith C.P. Selecting better crops from cultured cells // Gene manipulation in plant iprovement.-New York: Plenum Publ. Co.-1984.-P.503-528.

125. Mitchison T., Kirschner M. Dynamic instability of microtubule growth // Nature.-1984.-V.312.-P.237-242.

126. Mizjalili N., Linden J.C. Methyljasmonate induced production of taxol in suspension cultures of Taxus cuspidata: Ethylene intraction and induction models // Biotechnol.Progr.-1996.-V.12.-P. 110-118.

127. Muller E., Brown P.T.H., Hartke S., Lorz H. DNA variation in tissue-culture-derived rice plants // Theor. Appl. Genet.- 1990.-V.80.-P.673-679.

128. Murashige T., Scoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue // Physiol. Plant. 1962.-V.15.-P.473-479.

129. Negruk V.J., Eimer G.J., Redichrina T.D. Diversity of Vicia faba circular mtDNA in whole plants and suspension cultures // Theor. Appl. Genet.-1986.-V.72.-P.541-547.

130. Nicolaou K.C., Dai W.-M., Guy R.K. Chemistry and Biology of Taxol // Angew.chem.Int. Ed. Endl. -1994.-V.33.-P. 15-44

131. Nicolaou K.C., Yang Z., Liu J.J., Ueno H., Nantermet P.G., R.K. Guy, C.F. Claiborne, J.Renaud, Couladouros E.A., Poulvannan K., Sorensen E.J. Total synthesis of taxol //Nature.-1994.-V.367.-P.630-634.

132. OSHA Work Practice guidelines for personel dealing with cytotoxic (antineoplastic) drugs // Am. J. Hosp. Pharm.-1986.-V.43.-P.l 193-1204.

133. Palevitz B.A. // Protoplasma.-1981.-V.107.-P.115-125.99

134. Pariente F., Prasad V., Luduena R.F., Manso-Martinez R. Effeccts of ATP and cyclic AMP on the in vitro assembly and stability of manimalian brain microtubules // Mol. and Cell. Biochemistry.- 1987.-V.74.-P.43-54.

135. Peschle V.M., Phillips R.L. Genetic aplication of somaclinal variation in plants // Adv. Genet.-1992.-V.30.-P.41-75.

136. Phillips R.L., Kaeppler S.M., Olhoft P. Genetic instability of plant ticcue cultures: Breakdown of normal controls // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.-V.91.-P.5222-5226.

137. Piperno G., Fuller M.T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated from of a-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms //J. Cell. Biol.-1985.-V.101.-P.2085-2094.

138. Piperno G., LeDizet M., Chang X.-J. Microtubules containing acetylated a-tubulin in mammalian cells in culture // J. Cell. Biol. -1987.-V.104.-P.289-302.

139. Pring D.R., Levings C.S. Heterogenety of maize cytoplasmic genomes among male-sterile cytoplasm // Genetics.-1978.-V.89.-P. 121-136.

140. RaffE.C. Genetics of microtubule systems //J. Cell. Biol.-1984.-V.99-P.l10.

141. Reinert J., Clauss H., Ardenne R. Anthicyanbildung in Geweberulturen von Haplorarpus gracilis in Licht verschiedener Qualitat // Naturwissensehaften.-1964.-Bd.51.-S.87-88.

142. Rode A., Hartmann C., De Buyser J., Henry Y. Evidence for a direct relationship between mitochondrial genome organization and regeneration ability in hexap-loid wheat somatic tissue cultures // Curr. Genet.-1988.-V.14.-P.387-394.100

143. Sacristan M.D. and Melchers G. The caryological analysis of plants regenerated from tumourous and other callus cultures of tobacco // Mol. Gen. Genet.-1969.-V.105.-P.317-333.

144. Saffness M., Cordell G.A. Taxus alkoloids in: the alkoloids // Chemistry and pharmacology.-1985 .-P.6-18.

145. Sanderlend N. Nuclear cytology // Plant cell and tissue culture.-1977.-V.2.-P. 177-206.

146. Scheetz M.P., Vale R., Schnapp B. Different axoplasmic proteins generate movement in opposite directions along microtubules in vitro // Cell.-1986.-V.43.-P.623-632.

147. Schiff P.B., Fant J., Horwitz S.B. Promotion of microtubule assebmly in vitro by taxol //Nature.-1979.-V.227.-P.665-667.

148. Schiff P.B., Horwitz S.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1980.-V.77.-P.15611565.

149. Schulze E., Kirschner M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells // J.Cell. Biol.-1987.-V. 104.-P.277-288.

150. Scragg A.H., Fowler M.W. The mass culture of plant cells // Cell culture and somatic cell cenetisc of plants. Vol.2. Cell growth, nutrition, cytodifferentiation and cryopreservation (ed. I.K. Vasil).-London: Academic press.-1985-P.103-128.

151. Shah R.R., Subbaiah K.V., Mehta A.P. // Can. J. Bot.-1976.-V.54.-P.12401245.

152. Shamina Z.B., Schennert E.U., Koblitz H. // Plant Sci. Lett.-1978.-V.13.-P.177-184.

153. Spurck T.P., Pickelt-Heaps J.D. On the mechanism of anaphase A: evidence that ATP is needed for microtubule disassembly and not generation of polewards force. // J. Cell. Biol.-1987.-V.105.-P.1691-1705.101

154. Staba E J. Production of useful compounds from plant tissue cultures // Pros. V intern, congr. plant tissue and cell culture. Tokio.-1982.-P.25-30.

155. Stickland R.G., Sanderland N. Prodaction of anthocyanins, flavonols and chlirogenic acids by cultured cullus tissues of Haplopappus gracilis // Ann. Bot.-V.36.-P.443-457.

156. Strobel G.B., Stierle A.A., Stierle D.B. Taxol production by Taxomyces an-dreanae // The Research and Development Institute.-Патент 5322779 США, МКИ5С07Д 305,00; С 07Д 407/00/ (опубликовано 21.06.94).

157. Suzuki M., Makagawa К., Fukui H., Tabata M. Relatinship of berberin producing capability between Thalictrum plants and their tissues cultures callus culture and suspension cell culture //Plant. Cell Rep.-1987.-V.6.-P.260-263.

158. Tabata M. Recent advances in the production of medical substances by plant all cultures // Plant tissue culture and its biotechnological application. Springer.-1977.-P.3-16.

159. Tabata M., Mizurami H., Hirqora N., Konoshima M. // Phytochemistry.-1974.-V. 13 .-P.927-932.

160. Taxol process gets boost from National Cancer Institute // Ghem. Eng. Progr.-1991.-V.87.-P.24.

161. Thorpe T.A. Carbohydrate availatility and shoot formation in tobacco callus cultures // Physiol. Plantarum.-1974.-V.30.-P.77-81.

162. Villasante A., Wang D., Dobner P.Six mouse a-tubulin mRNAs encode five distinct isotypes. Testis-specific expression of two sister genes // Mol. Cell. Biol-1986.-V.6.-P.2309-2419.

163. Wani M.C., Taylor H.L., Wall M.E., Coggon P., Mc Phail A.T. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel-antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia // J. Am. Chem. Soc-1971.-V.93.-P.2325-2327.

164. Widholm J.M. Differential expression of amino acid biosynthetic control isoenzymes in plants and cultured cell // Plant Cell Cultures: Results and Perspectives -Amsterdam: Elsevier.-1980a.-P. 157-159.

165. Widholm J.M. Selection of plant cell lines which accumulate compounds // Plant tissue culture us a source of biochemicals.-Flprida: CRC Press.-1980b.-P.99-114.

166. Wiechremesinhe E.R.M., Arteca R.N. J. Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and production of taxol // Plant Physiol.-1994.-V.144.-P.183-188.

167. Woods M.C., Naranshi K. The NMR spectrs of taxinine and its derivatives.-Tatrahedron.-1966.-V.22.-P.243-258.

168. Zenk M.N., El-Shagi H., Schulte U. Anthraquinone production by cell suspension cultures of Morinda citrofolia // Planta Med. Suppl-1975.-P.79-101.