Дитерпеновые гликозиды в интактных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni)

Бондарев, Николай Ильич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дитерпеновые гликозиды в интактных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni)
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Дитерпеновые гликозиды в интактных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni)"

БОНДАРЕВ Николай Ильич

ДИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ В ИНТАКТНЫХ РАСТЕНИЯХ И КУЛЬТУРАХ //V Р77Ж> СТЕВИИ (Йота геЬашИапа Вег*ош)

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 з ОКТ 2011

Орел-2011

4856913

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет»

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор

Носов Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

Павловская Нинель Ефимовна

доктор биологических наук, профессор

Лобакова Елена Сергеевна

доктор биологических наук, профессор

Заякин Владимир Васильевич

Ведущая организация: Российский государственный аграрный

университет - МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита состоится 21 октября 2011 года в^ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.183.05 при Орловском государственном университете по адресу: 302026, г. Орел, ул. Комсомольская, 95. Телефон: (4862) 777318 Факс: (4862) 777332

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Орловского государственного университета по адресу: 302026, г. Орел, ул. Комсомольская, 95.

Автореферат разослан " 20" сентября 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, к.б.н., доцент

И.Г. Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Дитерпеноиды - одна из важнейших групп соединений специализированного обмена высших растений. Особый интерес изучение метаболизма дитерпеноидов приобрело благодаря открытию чуть более 10 лет назад альтернативного метилэритритолфосфатного пути (МЕР-пути) биосинтеза изопреноидов, который функционирует в пластидах наряду с классическим мевалонатным путем (MVA-путем), проходящим в цитозоле [Lichtenthaler et al., 1997; Lichtenthaler, 1998; Пасешниченко, 1998; Rohmer, 1999]. Это поставило перед учеными ряд вопросов, касающихся совместного функционирования этих путей. Однако к настоящему времени метаболизм дитерпеноидов (состав и содержание этих веществ в растении и их динамика в онтогенезе, закономерности и локализация их синтеза и накопления) и его регуляция изучены недостаточно. Не ясна также роль многих соединений этой группы в жизнедеятельности растений. Подобные фундаментальные исследования имеют и очевидную практическую значимость, поскольку многие дитерпеноиды являются коммерчески ценными веществами. Некоторые из них обладают уникальными свойствами как, например, обнаруженные в листьях эндемика Парагвая Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae) дитерпеновые гликозиды (ДГ), агликоном которых является стевиол. Эти соединения примерно в 300 раз слаще сахарозы [Kinghorn and Soejarto, 1986]. Они низкокалорийные, характеризуются отсутствием токсичности и мутагенности и практически не усваиваются организмом человека [Tateo et al., 1990; Lyakhovkin et al., 1993; Matsui et al., 1996; Geuns, 2000]. ДГ чрезвычайно перспективны в качестве сахарозаменителей для людей, страдающих от нарушений углеводного обмена и, особенно, для больных диабетом, так как они обладают гипогликемическими свойствами [Gregersen et al., 2004].

Основная трудность изучения вторичного метаболизма высших растений заключается в том, что он является ткане- и фазоспецифичным процессом. В этой ситуации эффективно использовать различные модельные системы, из которых наибольший интерес представляют культуры in vitro. Оптимальным решением для проведения исследований является использование как интактных растений стевии, так и объектов in vitro (культур клеток, тканей и побегов). Изучение культур стевии in vitro актуально также с целью их практического применения для массового микроклонального размножения растений, а также в качестве альтернативных стабильных источников ДГ, что особенно важно в связи с трудностью размножения стевии семенами и высокими требованиями к условиям культивирования, ограничивающими возможности выращивания на плантациях.

Цель исследования - выяснение закономерностей метаболизма дитерпеновых гликозидов и его регуляция в интактных растениях и культурах in vitro Stevia rebaudiana Bertoni.

Задачи исследования:

1. Разработка комплексного метода анализа ДГ, включающего в себя их экстракцию, очистку, разделение и идентификацию.

2. Определение влияния генотипа объекта на состав, содержание и распределение ДГ как в интактных, так и in vitro растениях.

3. Изучение динамики содержания ДГ в онтогенезе растений.

4. Выяснение особенностей биосинтеза и накопления ДГ в полученных культурах клеток и тканей различного генотипического и эпигенетического происхождения.

5. Выявление взаимосвязи ростовых процессов с биосинтезом ДГ.

6. Определение влияния различных факторов культивирования (углеводное и минеральное питание, регуляторы роста, температура, спектральный состав света, интенсивность и продолжительность освещения) на процессы роста и биосинтеза ДГ в культурах клеток и растениях in vitro.

7. Исследование ультраструктуры клеток растений и культур in vitro с целью локализации биосинтеза и накопления ДГ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень накопления ДГ как в интактных, так и in vitro растениях коррелирует с интенсивностью их роста и зависит от условий культивирования и фазы онтогенеза, тогда как состав и соотношение ДГ определяются генотипом растения.

2. Аккумуляция ДГ определяется степенью дифференциации ткани: в дедифференцированных клетках она минимальна, а при морфогенезе происходит ее увеличение.

3. Биосинтез и накопление ДГ проходит в специальных образованиях -железках, а также в некоторых клетках эпидермы и мезофилла растений и клетках миксотрофных каллусных культур.

4. Свет является наиболее значимым фактором, обуславливающим интенсификацию биосинтеза ДГ в связи с его стимулирующим воздействием на формирование мембранной системы пластид и их активное функционирование.

5. Биосинтез ДГ проходит по МЕР-пути в тилакоидах хлоропластов, откуда предшественник ДГ и гиббереллинов - энт-каурен диффундирует в цитозоль, где на мембранах агранулярного эндоплазматического ретикулума осуществляется дальнейший биосинтез ДГ.

Научная новизна результатов исследований. Разработан комплексный метод анализа ДГ, включающий в себя их экстракцию, очистку, разделение и идентификацию и позволяющий определять состав и содержание ДГ в небольшой навеске биомассы.

Впервые проведено комплексное исследование состава ДГ, их индивидуального содержания, распределения в органах и динамики накопления в течение онтогенеза у различных генотипов растений стевии как in vivo, так и in vitro. Выявлено, что качественный состав и соотношение ДГ определяется генотипом, а количественное содержание зависит от условий культивирования.

Впервые комплексно изучены закономерности биосинтеза и аккумуляции ДГ в культурах стевии in vitro различного происхождения и проведен сравнительный анализ их образования у объектов, отличающихся по степени дифференциации клеток: суспензионные культуры, гетеро- и миксотрофные каллусные культуры, морфогенный каллус, побеги и растения in vitro. Показано наличие у них штаммовой специфичности в отношении процессов роста и биосинтеза ДГ.

Выявлена положительная корреляция между содержанием ДГ и ростом растений, при культивировании как in vivo, так и in vitro. Установлено, что состав ДГ у растений in vitro идентичен их спектру в интактных растениях. Показано, что дедифференцированные культуры клеток содержат минорные количества ДГ, а их состав беднее по сравнению с донорными растениями. При морфогенезе и

формировании побегов, процессы биосинтеза и накопления ДГ восстанавливаются.

Впервые проведено комплексное изучение влияния различных внешних факторов (углеводное и минеральное питание, регуляторы роста, температурные режимы, спектральный состав света, интенсивность излучения, фотопериод) на процессы роста и биосинтеза ДГ в культурах стевии in vitro. Показана возможность регуляции их биосинтеза и накопления.

Впервые детально исследована ультраструктура клеток растений и культур in vitro с целью локализации метаболизма ДГ. Выявлена взаимосвязь между продуктивностью по биомассе, фотосинтезом и биосинтезом ДГ.

Установлено, что начальные этапы биосинтеза ДГ проходят по МЕР-пути в тилакоидах хлоропластов. Впервые идентифицировано электронно-плотное вещество, которым заполнены тилакоиды стевии в период активного вегетативного роста, представляющее собой энт-каурен - предшественник ДГ и гиббереллинов. Предложена схема компартментации биосинтеза дитерпеноидов в растительной клетке.

Практическая значимость работы. Комплексный метод анализа ДГ в небольшой навеске биомассы необходим для массового определения их состава и содержания, используемого в научных исследованиях и в прикладных работах.

Полученные данные о 12 генотипах интактных растений стевии вносят существенный вклад в изучение морфологии, анатомии, цитологии, физиологии и биохимии этой перспективной культуры. Результаты исследований существенно дополняют представления о закономерностях роста и образования ДГ в культивируемых клетках и побегах in vitro, необходимые для их практического использования. Получены и разносторонне охарактеризованы 20 штаммов культур клеток, которые будут использованы в дальнейшей работе с целью изучения регуляции биосинтеза ДГ и получения продуктивных клеточных культур.

Существенное практическое применение в крупномасштабном выращивании свободных от болезней растений имеют данные по регуляции роста побегов стевии и накопления в них дитерпеновых гликозидов при культивировании в биореакторах.

Совокупность экспериментальных данных и теоретические обобщения необходимы для успешного районирования стевии в России и являются методологической и экспериментальной основой направленной модификации растений в растениеводстве и селекции. Знание закономерностей метаболизма ДГ принципиально важно для более полного использования потенциала растений с целью получения БАВ при выращивании в открытом и закрытом грунте.

Материалы диссертации могут быть использованы при чтении лекций на биологических и сельскохозяйственных факультетах вузов России.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и представлены на: ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН; Международной конференции "Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования" (Воронеж, 1995); I-VI Международных симпозиумах "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Москва-Пущино, 1995, 1997, 1999, 2001, 2003, 2005); IV и V Международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997, 1999); VII-IX Международных конференции

"Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Москва, 1997, Саратов, 2003, Звенигород, 2008); Всемирных конгрессах по биологии irt vitro (Washington, 1997; Las Vegas, 1998, США); IV и V съезде Общества физиологов растений (ОФР) России (Москва, 1999, Пенза, 2003); Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 1999); II съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000); 9th International Conference of Horticulture (Czech Republik, Lednice, 2001); Международной конференции «Растительные ресурсы для здоровья человека: возделывание, переработка, маркетинг» (Москва-Сергиев Посад, 2002); Всероссийской конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003); Межрегиональной конференции «Устойчивое развитие: экологические проблемы и защита окружающей среды» (Старый Оскол, 2004); Международной научной конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004); Международной конференции «Регуляция продукционного процесса сельскохозяйственных растений» (Орел, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 40 работ, в том числе 12 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад соискателя. Основные результаты исследований получены автором лично. Личный вклад соискателя заключался в разработке идеи исследований, в постановке задач и проведении экспериментов, в статистической обработке, анализе и интерпретации полученных результатов.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность к.ф.н. Решетник О.В. за помощь при проведении ВЭЖХ-анализа и к.б.н. Сухановой М.А. за содействие в проведении электронно-микроскопических исследований. Автор сердечно признателен всем коллегам, участвовавшим в обсуждении полученных результатов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и обсуждения (4 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Диссертационная работа изложена на 275 страницах машинописного текста, содержит 82 рисунка, 20 таблиц. Список цитируемой литературы включает 350 наименований, из которых 227 зарубежные.

Принятые сокращения и обозначения:

Среда MC - среда Мурасиге и Скуга; НУК - а-нафтилуксусная кислота; ИУК

- 3-индолилуксусная кислота; ИМК - 3-индолилмасляная кислота; 2,4-Д -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; БАП - 6-бензиламинопурин; К - кинетии; 2-iP

- изопентен-2ил-аденин; ГК - гибберелловая кислота; ДГ - дитерпеновые гликозиды; СП - субкутикулярная полость; М - сухая масса клеток, г/л; Мс - сырая масса клеток, г/л; N - число клеток, кл/мл, кл/г.; V - жизнеспособность клеток, %; С - содержание ДГ; 1м, 1мс - индексы роста по сухой и сырой биомассе; ТСХ -тонкослойная хроматография; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ЭПР - эндоплазматический ретикулум; АЭР - агранулярный ЭПР; АГ - аппарат Гольджи; РЦ ФС1 и ФСН - реакционные центры фотосистем 1 и II; МЕР - 2-С-метил-0-эритритол-4-фосфат; MVA - мевалоновая кислота; GAP -D-глицеральдегид-З-фосфат; DXP - 1-деокси-0-ксилулоза-5-фосфат; GGPP -геранилгсранилдифосфат; энт-СРР - энт-копалилдифосфат.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили интактные растения открытого и закрытого грунта, стерильные растения и побеги in vitro, а также каллусные и суспензионные культуры Stevia rebaudiana Bertoni. В работе использовали 12 генотипов (сортообразцов) интактных растений, любезно предоставленных ВНИИСС (и. Рамонь, Воронежская обл.). В закрытом грунте растения выращивали в застекленной теплице при естественном освещении на почвенной смеси, состоящей из равных частей дерновой земли, песка и торфа при температуре воздуха 25-35 °С.

Для получения растений in vitro были использованы меристемы интактных растений. Выращивание растений проводили в пробирках и на роллерном аппарате в специально изготовленных сосудах емкостью 300 мл (длина 215 мм, диаметр 45+2 мм), прототипом которых являлся сосуд биореактора роллерного типа [McCovvn, Joyce, 1991]. Сосуды закрепляли перпендикулярно дискам, скорость вращения которых составляла 4 об./мин. Освещенность в камере варьировала от 2000 до 16000 лк, фотопериод - 16 или 20 часов. При изучении влияния спектрального состава света культивирование осуществляли на красном, зеленом и синем свету (максимумы излучения 710, 510 и 460 нм, соответственно). В отдельных экспериментах растения подвергали УФ-Б излучению (280-320 нм, 0,74 Вт/м2) в течение двух часов.

В качестве эксплантов для получения каллусных культур использовали фрагменты стебля (с), листовые пластинки (л) и черешки листьев (ч) стерильных растений. В исследованиях использовали среду МС, дополненную регуляторами роста: НУК, ИУК, ИМК, 2,4-Д, БАП, К, 2-ÍP, ГК в различных комбинациях.

Выращивание клеток и тканей проводили на среде МС, содержащей НУК (1.0мг/л) и 6-БАП (0.5 мг/л), в темноте или на свету (2000 лк), при температуре 25+1 °С. Каллус культивировали на агаризованной среде, масса трансгшанта -30+5 мг. Суспензионные культуры выращивали в колбах на качалке (100 об/мин) и в барботажном биореакторе с рабочим объемом 800 мл.

Изучение особенностей роста и развития культур in vitro.

Биомассу культур, а также плотность клеток, их жизнеспособность и размер определяли по стандартным методикам [Калинин и др., 1980; Паушева, 1988; Диксон, 1989]. Содержание Сахаров в среде определяли фенол-сернокислотным методом [Методы общей бактериологии, Т. 2, 1984]. Ростовые параметры ц, Т, Y, П рассчитывали по формулам, приведенным в монографии Перта [Перт, 1978].

Нитолого-анатомический анализ

Подготовку материала проводили по общепринятой методике [Паушева, 1988]. Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе Jenaval (Германия).

Цитофотометрия

Для анализа брали высечки из листьев растений. Материал фиксировали смесью этанола и уксусной кислоты (3:1 v/v) в течение суток, а затем хранили в 70% этаноле. Цитофотометрический анализ выполняли на давленых препаратах после окрашивания их по Фельгену (Filkuka, Kleinwachter, 1981). Отмытую ткань гидролизовали в 5N НС1 в течение 35 мин при 20 °С, окрашивали реактивом Шиффа, после 3-кратной отмывки дистиллированной водой готовили давленые

препараты, которые обезвоживали и заключали в DePeX (Serva, Германия). Измерение количества ДНК производили на микроспектрофотометре Reichert-Jung, Univar (Австрия) двуволновым методом (Patau, 1952) при X) =500 нм и Х2 =550 нм. Анализировали по 50 интерфазных ядер на 3 препаратах. В качестве стандарта содержания ДНК (4С=2.1 pg,) использовали клетки апикальной меристемы корня проростков Vigna radiata L. cv. Berken в различных фазах митоза. Математическую обработку результатов проводили с помощью программы, реализующей алгоритм, разработанный Nosov et al. (1983).

Сканирующая электронная микроскопия

Образцы дегидратировали в растворах этанола восходящей концентрации, высушивали и приклеивали на столик с напыленным на него тонким слоем платины. Просмотр и съемку проводили на сканирующем электронном микроскопе Н-600 (Hitachi) при ускоряющем напряжении 20 кВ и рабочем увеличении 30-2000.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Фиксацию растительного материала проводили по стандартным методикам в глутаральдегиде, с последующей дофиксацией в 1-2% растворе 0s04 или без нее. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III ("LKB", Швеция) и "Тесла". Затем их докрашивали цитратом свинца (Reynolds, 1963). Просмотр и съемку проводили на электронном микроскопе JEM-100B или JEM-7A ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ и рабочем увеличении 5000-20000.

Выделение хлоропластов и тилакоидов

Листья стевии (100 г) гомогенизировали в буфере А (0.33 М сорбит, 50 мМ трицин, pH 8.0, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ ß-меркаптоэтанол). Гомогенат фильтровали через слой марли и два слоя Miracloth ("Calbiochem-Behring", США) и центрифугировали. Осадок органелл ресуспендировали в буфере А и фракционировали в 40/70%-ном ступенчатом градиенте перкола, центрифугируя при 4000 g 30 мин. Отбирали интактные хлоропласты, находившиеся на границе 40 и 70% перкола, промывали буфером А, осаждали и ресуспендировали в том же буфере. Затем их лизировали гипоосмотическим шоком и осаждали тилакоиды центрифугированием.

Определение содержания пигментов.

Навеску сырой массы образцов растирали в 80% растворе ацетона. После экстракции пигментов и спектрофотометрии количественное их содержание рассчитывали по формулам Арнона [Arnon, 1949]. Суммарное содержание хлоро-филлов определяли по максимуму поглощения при 662 нм (хлорофилл а), 645 нм (хлорофилл Ь), 440 нм (каротиноиды) на спектрофотометре Hitachi-557 (Japan).

Определение интенсивности фотосинтеза.

Интенсивность фотосинтеза оценивали по скорости фотосинтетического выделения 02. Навеску материала помещали в амперометрическую ячейку объемом 5 мл, с вмонтированным платиново-серебряным электродом Кларка и герметично закрывали. Скорость фотосинтетического выделения 02 определяли в течение 3-6 минут экспозиции на свету при насыщающей интенсивности света 10 клк.

Активность фотосистем.

Исследование фотохимической активности РЦ ФС оценивали по светоиндуцированным изменениям поглощения хлорофилла П700 (АА700),

принадлежащего РЦ ФС I, а также по светоиндуцированным изменениям переменной флуоресценции хлорофилла (AF) ФС II [Ладыгин, Семенова, 1999].

Для определения состава и содержания ДГ был разработан комплексный метод анализа ДГ, включающий в себя их экстракцию, очистку, разделение и идентификацию. Стандартные образцы ДГ получены из института органической и физической химии КНЦ РАН, Казань. Стандартные образцы каурепоидов любезно предоставлены Prof. Lew Mander и Dr. Tomonobu Toyomasu.

Экстракция и очистка ДГ.

Лиофнльио высушенную и растертую в порошок биомассу помещали в центрифужные пробирки и дважды экстрагировали 100% метанолом в течение 3 и 1 часов на магнитной мешалке. Затем экстракты центрифугировали, после чего объединенные надосадочные жидкости каждого образца упаривали досуха на роторном испарителе при температуре 45-50 °С. Для очистки образцов использовали полипропиленовые Sep-Pak патроны размером 9X20 мм, заполненные обращеннофазовым сорбентом (1 мл) Separan ™SGXC-18, 60 мкм ("Tessek LTD", Чехия).

Анализ ДГ методом ТСХ-денситометрии.

Экстракты образцов наносили на стеклянные пластины с кизельгелем 60 F254 (Merck, Германия, 4*10, 0.2 мм толщиной) или силикагелем (Эстония, 20*10, 0.13 мм). Для разделения веществ использовали несколько систем растворителей. После разделения, хроматограммы высушивааи на воздухе, опрыскивали раствором анисового альдегида или тимола в 95% этаноле [Кирхнер, 1981] с добавлением серной кислоты и сушили в термостате при 110 °С в течение 10 минут до появления пятен. Количественное определение ДГ проводили путем денситометрии пластинок на приборе Chromatogramm Densitometr CD 50, Desaga, Япония - Германия.

Анализ ДГ методом ВЭЖХ.

Определение ДГ проводили на приборе фирмы LKB-Produkter AB, Bromma, Швеция, а также на приборе Agilent 1100, Германия. Детектирование - UV-210 нм, объем калибровочной петли - 10 мкл. В работе использовали стальную колонку Ultro Рас column TSK-OH-120, 250 х 4.6 мм или Zorbax SB-Aq, 150 х 4.6 мм, заполненные обращеннофазовым сорбентом Lichrosorb RP 18 с размером частиц 5 мкм. Разделение проводили в системе растворителей ацетонитрил : вода (85:15) при скорости потока 0,5-1 мл/мин.

Спектры поглощения и излучения определяли на спектрофотометре Hitachi-557 (Japan) и флуоресцентном спектрофотометре Hitacbi-850 (Japan).

Масс-спектрометрия

Масс-спектры определяли методами тандемной масс-спектрометрии на приборе Finnigan MAT LCQ, масс-спектрометрии типа «Электроспрэй» на приборе Finnigan, хромато-масс-спектрометрии на приборах Hewlet Paccard и Agilent Technologies, матричной лазерной десорбционной ионизации (МЛДИ) на приборе Kompact MAL DI 4 (KRATOS Analytical, США).

Каждый опыт проводили 3-4 раза с 10-15 кратной повторностью. Статистическую обработку проводили с учетом критерия Стыодента, определяя достоверность при р<0,05. Использовали метод факторного анализа [Максимов и Семенова, 1991]. В таблицах и на рисунках представлены среднеарифметические величины и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

СОСТАВ, СОДЕРЖАНИЕ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ В ИНТАКТНЫХ И IN VITRO РАСТЕНИЯХ

Наиболее важными факторами, влияющими как на рост и развитие растений, так и на вторичный метаболизм, являются особенности их генотипа и условия выращивания. Поэтому первым этапом исследования было изучение метаболизма дитерпеновых гликозидов у интактных и in vitro растений стевии различных генотипов.

Состав и содержание ДГ у растений различных генотипов

В результате экспериментов было установлено, что среди растений стевии изучаемых генотипов было семь диплоидов, два теграплоида, один пентаплоид и два миксоплоида, содержащих как 2п, так и 4п клетки (табл. 1). Клетки диплоидных растений имели 22 хромосомы, тетраплоидных - 44, миксоплоидных - 22 или 44, а пенташюида - 55 хромосом.

Таблица 1

Происхождение и плоидность растений стевии различных генотипов

№п/п Генотип Происхождение Число хромосом, шт. Плоидность

1 0 Бразилия 22 2п

2 1 Бразилия 44 4п

3 2 Парагвай 22 2п

4 3 Парагвай 22 2п

5 5 Парагвай 22 2п

6 11 Япония 22 2п

7 19 Япония 22 2п

8 27 Парагвай 44 4п

9 28 Парагвай 22,44 2п, 4п*

10 30 Парагвай 22 2п

11 37 ВНИИСС 22, 44 2п, 4п*

12 П ВНИИСС 55 5п

*- миксоплоиды, содержащие как 2п, так и 4п клетки

В листьях и стеблях интактных растений были обнаружены 3 основных (мажорных) ДГ: стевиозид и ребаудиозиды А, С, а также ребаудиозид В.

У интактных растений открытого грунта число побегов, а также сухая масса листьев были наибольшими у растений генотипов 11, 19 и 28 [Бондарев и др., 20076]. Растения этих генотипов в той же последовательности лидировали по накоплению в листьях ДГ (рис. 1 А).

Наименьшее содержание ДГ обнаружено у растений генотипов 1, 3, 27, т. е. у тех, у которых были ниже параметры роста (число побегов и сухая масса листьев). У растений этих же генотипов закрытого грунта, содержание ДГ было в 1.5-2 раза ниже, чем у плантационных растений (рис. 1Б).

При выращивании растений in vitro число и длина побегов были наибольшими у генотипов 1 и 0, у которых обнаружено также наиболее высокое содержание ДГ (рис. 2). В листьях растений других генотипов их содержание не превышало 2 мг/г сухой массы. Число пар листьев, основного места накопления ДГ, было более высоким у растений генотипов 37 и 0, а наименьшим у генотипов 3

и 28. Наибольшую массу сухих листьев накапливали растения тетраплоидного генотипа 1. Корневая система была лучше развита у растений генотипов 19, 27, 37 [Бондарев и др., 20076].

90 80 70 60 50 40 30

о, 20

10 о

Я Ребаудиозид С й! Ребаудиозид А □ Стевиозид

25 1

20 -

15 "

10 -

5 -

27 28

■ Ребаудиозид С й! Ребаудиозид А D Стевиозид

I I

т.

Р щ

19 28 Генотип

30 37

3 11 19 Генотип

Рис. 1. Содержание ДГ в листьях интактных растений стевии различных генотипов, выращенных в открытом (А) и закрытом (Б) грунте. Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Соотношение ДГ у интактных растений, при выращивании на плантациях и в теплице, практически не изменялось (см. рис. 1). Соотношение ДГ у от vitro растений, по сравнению с интактными растениями, в целом было близким (рис. 2). Например, в листьях генотипа 1 все также преобладал ребаудиозид А, в листьях генотипов 11 и 19- ребаудиозид С, а в остальных - стевиозид. У in vitro растений большинства генотипов изменение соотношения ДГ происходило за счет уменьшения доли стевиозида и увеличения ребаудиозидов А и (или) С. Иными словами, относительно высокое суммарное содержание ДГ у генотипов 1, 11 и 19, определялось в основном величиной накопления ребаудиозидов А или С (рис. 2, см. рис. 1).

Исследованные генотипы, за исключением 11 и 19, содержат главным образом ДГ с (3-гликопиранозильными группами: стевиозид и ребаудиозид А, наиболее сладкие и обладающие лучшими вкусовыми качествами, тогда как растения генотипов 11 и 19, накапливающие наибольшее количество ДГ, содержат преимущественно ребаудиозид С - гликозид с а-рамнопиранозилом, обладающий горьковатым привкусом.

Между содержанием ДГ и ростом растений обнаружена сильная положительная корреляция. Так, у интактных растений содержание ДГ значимо (при р<0,05) зависело от числа побегов (г=0.96) и сухой массы листьев (г=0,87). Полученная корреляция свидетельствует в пользу предположения о том, что образование ДГ связано с фиксацией углерода в процессе фотосинтеза. В свою очередь сухая масса листьев положительно коррелировала с числом побегов (г=0,94) и высотой растения (г=0,73).

Ш 1'ебаудиозид С % Ребаудиозид А □ Стевиозид

О 4-

11 19 27 28 30 37

Генотип

Рис. 2. Содержание ДГ в листьях in vitro растений стевии различных генотипов. Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

У растений in vitro высокая положительная корреляция выявлена между содержанием ДГ' и числом (г=0,77), а также длиной (г=0,81) побегов. Однако между содержанием ДГ и числом, а также длиной корней отмечена заметная отрицательная корреляция (г=-0,51 и г=-0,50, соответственно), в то время как накопление сухой массы листьев коррелировало с развитием корневой системы, в частности сухой массой (г=0,81) и длиной (г=0,55) корней. Это свидетельствует о том, что биосинтез ДГ в побегах и растениях in vitro осуществляется независимо от развития у них корневой системы, что не подтверждает предположение Свэнеона [Swanson et al., 1992] о необходимости наличия корней у побегов стевии in vitro для образования ДГ.

Приведенные данные говорят о том, что содержание ДГ было различным не только в зависимости от генотипа растения, но также и от способа и условий культивирования. В то же время состав и соотношение индивидуальных ДГ оставались практически постоянными независимо от условий культивирования.

Распределение ДГ в различных органах

Установлено, что во всех исследованных органах растений присутствовали все три мажорных ДГ (рис. ЗА,Б).

Самое высокое их содержание было обнаружено в листьях растений. В соцветиях и стеблях гликозиды накапливались в значительно меньшем количестве: в 7-10 и 10-16 раза, соответственно. В соцветиях ДГ содержались в основном в листочках обертки (более 1%), а в венчике их содержание было почти на порядок меньше. В семенах количество ДГ было более чем в 1,7-2 раза ниже, чем в соцветиях. Самое низкое содержание этих соединений обнаружено в корнях растений - менее 0.1 % от сухой массы, что в 40 раз ниже, чем в листьях.

? 25

о 20

и*

1 15

г |

§ 10

37 с

ч 3

Корни Стебли Листья Соцветия Семена Корни Стебли Листья Соцветия Семена

Рис. 3. Состав и содержание ДГ в вегетативных и генеративных органах стевии, выращенных в открытом (А) и закрытом (Б) грунте (генотип 0).

Соотношение между ДГ в надземных органах стевии было близким. Основным гликозидом у растений генотипа 0 являлся стевиозид, а меньше всего накапливалось ребаудиозида С. В корнях содержание всех исследуемых ДГ было примерно одинаково.

Яруеность распределения ДГ в надземных вегетативных органах

В верхних активно растущих листьях содержание ДГ было выше, чем в листьях закончивших рост, находящихся в средней части побега (рис. 4).

Наиболее низкое содержание ДГ отмечено в стареющих листьях, расположенных в нижней части побегов. Такая же закономерность выявлена и для аналогичных фрагментов стебля [Вопёагеу е[ а!., 2004].

Содержание ДГ в молодых верхних листьях, по сравнению с нижними, было выше на 30-170% в зависимости от генотипа, причем наиболее сильно увеличивалось количество ребаудиозида А.

Динамика содержания ДГ в вегетативных органах в течение онтогенеза

В течение онтогенеза в надземных вегетативных органах (листья и стебли) происходило накопление ДГ. Так, их содержание плавно увеличивалось в течение виргинильного периода, во время активного вегетативного роста, вплоть до начала цветения (рис. 5). В фазу плодоношения содержание ДГ резко снижалось (в 2 раза).

В подземных вегетативных органах (корнях) также отмечена динамика содержания ДГ (рис. 6), максимальное количество которых, напротив, накапливалось во время вегетативной фазы.

□ Стевиозид Ш Ребаудиозид / ■ Ребаудиозид С]

листочки венчик обертки

К-.

и ч

о,

¡и «

Листья, генотип 0 Листья, генотип 28 Стебли, генотип 0

Листья, генотип 0 Листья, генотип 28 Стебли, генотип

Рис. 4. Содержание ДГ в различных частях побегов стевии. 1 - верхние активно растущие части; 2 - средние части, закончившие рост; 3 - нижние

стареющие часта.

□ Стевиозид

й Ребаудиозвд А ■ Ребаудиозид С

О Стевиозид 0 Ребаудиозид А и Ребаудиозид С

3 20

« 15

и 5

Рис. 5. Динамика содержания ДГ в надземных вегетативных органах растений стевии. Фазы онтогенеза: 1 - вегетативная; 2 - бутонизации; 3 - цветения.

Рис. 6. Динамика содержания ДГ' в корнях интактных растений стевии (генотип 28). Фазы онтогенеза: 1 - вегетативная; 2 - бутонизации; 3 - цветения; 4 -плодоношения Стандартные отклонения среднеарифметических величин менее 5%.

Начиная с фазы бутонизации, отмечали уменьшение их содержания, которое в фазу цветения снижалось в 3 раза. Однако общее количество ДГ в корнях в связи с увеличением сухой массы последних уменьшалось только в фазу цветения. Между содержанием ДГ и большинством параметров роста корневой системы стевии наблюдали высокую (г=0,7-0,9) отрицательную корреляцию.

Таким образом, биосинтез ДГ как в интактных, так и in vitro растениях коррелирует с интенсивностью их роста, что может свидетельствовать о том, что образование ДГ связано с фиксацией углерода в процессе фотосинтеза. Интенсивность роста растений, обуславливающая величину накопления ДГ, зависит главным образом от условий культивирования, а также фазы онтогенеза, в то время как состав и соотношение ДГ определяются генотипом растения.

БИОСИНТЕЗ И НАКОПЛЕНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ

В КЛЕТКАХ IN VITRO И ИХ ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ И ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Как показали исследования, проведенные на интактных и in vitro растениях, биосинтез и накопление ДГ положительно коррелирует с их ростом. Поэтому на следующем этапе исследования были получены 20 штаммов дедифференцированных каллусных и суспензионных культур клеток стевии и выяснены особенности пролиферации клеток и биосинтеза в них ДГ. Для детального изучения были взяты культуры клеток, полученные из растений генотипов 0, 3 и 5, наиболее продуктивные, по предварительным данным, как по биомассе, так и по содержанию ДГ.

Каллусные культуры. Обнаружено, что генотип и тип экспланта оказывали существенное влияние на морфофизиологические характеристики полученных каллусных культур. Самые высокие параметры роста выявлены у каллусной ткани,

полученной из листовых пластинок растений генотипа 0. Интенсивный и стабильный рост был отмечен также у штаммов, полученных из растений генотипа 3. Культуры, полученные из других генотипов, отличались менее стабильными показателями роста [Бондарев, 1998]. На рис. 7 показана динамика параметров роста каллусной культуры (штамм Ос).

Суши

+1м^вю)шусе*Ыв1г. *У%

Рис. 7. Динамика основных параметров роста каллусной культуры стеблевого происхождения генотипа 0.1ми 1Мс - индексы роста по сухой и сырой биомассе; N -число клеток; V - жизнеспособность клеток, %.

Цикл роста каллусной культуры составил 35 суток, затем происходило снижение числа клеток в каллусах, а также их сырой и сухой массы. Интенсивную пролиферацию клеток наблюдали до 20-х суток. В этот момент времени отмечены наибольшая концентрация клеток в 1 г. ткани и максимальный уровень их жизнеспособности. Затем клетки приступали к росту растяжением, однако общее число клеток в каллусе продолжало увеличиваться до 35-х суток.

В течение первых месяцев культивирования в гетеротрофных каллусных тканях, полученных из различных эксплантов растений генотипа 0, отмечали присутствие минорных количеств стевиолбиозида, ребаудиозида В и стевиозида. В остальных культурах эти соединения содержались в следовых количествах. При длительном культивировании (более 2 лет), способность к синтезу даже минорных количеств ДГ клетками гетеротрофного каллуса практически терялась.

Суспензионные культуры. При переходе к глубинному культивированию отличия по параметрам роста в цикле выращивания у культур различного происхождения, сохранялись. На рис. 8 показана динамика роста суспензионных культур различного генотипического и эпигенетического происхождения.

О 5 10 15 20 25 30 35 Сутки "~0л +"3л *3с "*"5л

Рис. 8. Динамика роста суспензионных культур стевии различного происхождения. Штаммы 0л, Зл и 5л получены из листовых пластинок растений генотипов 0, 3 и 5, а штамм Зс получен из фрагментов стебля растений генотипа 3.

Самую интенсивную пролиферацию клеток наблюдали у штамма 0л, полученного из листовых пластинок растений генотипа 0. У штаммов Зс и Зл накопление биомассы происходило медленнее, причем параметры роста между собой были сходными. Наиболее медленный рост был выявлен у культуры 5л (цикл роста - 33 сут.). Это говорит о том. что достоверные различия по параметрам роста наблюдали лишь у культур различного генотипического происхождения.

У суспензионных культур, по сравнению с каллуеными, происходила интенсификация биосинтеза ДГ. Были проанализированы 4 длительно выращиваемые суспензионные культуры: 0л, Зл, Зс и 5л в 4-х точках цикла роста. В этих же точках был проведен анализ культуральной жидкости на предмет выделения в нее ДГ, который дал отрицательный результат. Наиболее высокое содержание ДГ выявлено в штамме стеблевого происхождения Зс (рис.9). В культурах 0л и Зл ДГ присутствовали в минорных количествах. В культуре, полученной из листовых пластинок генотипа 5, содержались лишь следы ДГ. Основным гликозидом во всех культурах был стевиозид. Ребаудиозид А присутствовал не во всех штаммах. Ребаудиозиды С, В и стевиолбиозид содержались в культурах в следовых количествах.

На рис. 10 показана динамика содержания ДГ в суспензионной культуре Зс. Максимальное их накопление обнаружено на 14£ сутки культивирования, то есть в конце экспоненциальной фазы роста (115 мкг/г сухой биомассы). Содержание гликозидов в течение цикла значительно менялось, и уже через трое суток (17-е сутки культивирования) было ниже в 4 раза. Следует отметить, что более высокопродуктивный по ДГ штамм Зс обладал наименьшей агрегированностью клеток, а штамм 5л, почти не содержавший ДГ, имел самые крупные агрегаты.

120

ей 100

О 80

.и

г2 60

и 40

Е. о 20

¡5

И Ребаудиозид С И Ребаудиозид А П Стевиозид

Ол

Зл

Зс

5л

8 6 О

§ 5

сЗ О ° 1 я 4

и2 1 О

О Сухая масса клеток 0 Содержание ДГ

0,9 - 0,8

- 0,7

- 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

с=с

и к

к &

ег о О

0л

Зс

5л

Штамм

Рис. 9. Содержание ДГ (А) и их выход с учетом биомассы (Б) в суспензионных культурах стевии различного происхождения (14-е сутки культивирования). Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

140

I Ребаудиозид С йСйй Ребаудиозид А I I Стевиозид -—Сухая масса клеток

Рис. 10. Динамика роста суспензионной культуры стевии и содержания в клетках ДГ в цикле культивирования (штамм Зс). Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Корреляции между количественным содержанием ДГ в органах донорных растений и полученных культурах не было обнаружено. Это можно объяснить тем, что величина накопления ДГ больше зависит от условий культивирования, чем от генотипических и, тем более, эпигенетических особенностей экспланта. Данные экспериментов свидетельствуют в пользу прямой зависимости между параметрами роста культур клеток и образованием в них ДГ, также как и у растений.

Таким образом, в культурах клеток по сравнению, как с интактными, так и культивируемыми in vitro донорными растениями, содержание ДГ на 2-3 порядка ниже. Обедняется также спектр синтезируемых ДГ. При переходе с поверхностного культивирования к глубинному происходит интенсификация образования ДГ. Подобные результаты были получены при выращивании клеток диоскореи дельтовидной (стероидные гликозиды) [Носов, 1992] и левзеи сафлоровидной (экдистероиды) [Орлова, 1993]. Вероятно, это обусловлено изменениями условий культивирования, в результате чего меняется структурная организация клеточных агрегатов и снабжение их кислородом и питательными веществами, что сказывается и на интенсивности образования соединений вторичного обмена.

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПРОЦЕССЫ РОСТА, РАЗВИТИЯ И БИОСИНТЕЗА ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ У РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ КУЛЬТУР СТЕВИИ IN VITRO

Культуры недифференцированных клеток

Влияние факторов культивирования. Компоненты питательной среды оказывали значительное влияние на рост культур клеток и содержание в них ДГ. Культура клеток стевии по-разному реагировала на различные источники углерода в питательной среде. Клетки не росли на средах с галактозой, арабинозой, рафинозой, рамнозой и сорбитом. Незначительный рост наблюдали на среде с мальтозой. На средах с фруктозой и глюкозой наблюдали интенсивную пролиферацию клеток, но наибольший рост отмечен на среде с сахарозой [Бондарев и др., 1997е], Фактором, лимитирующим дальнейшее накопление биомассы клеток стевии, является сахароза, при исчерпании которой сразу прекращалось увеличение массы клеток и начиналась фаза деградации. Повышение концентрации сахарозы с 2% до 3%, с 3% до 4% и с 4% до 5% пропорционально увеличивало сухую массу клеток, без изменения скорости роста (0,5-0,7 г/л в сутки) [Бондарев и др., 1997е]. Утилизация сахарозы коррелировала с накоплением биомассы. Максимум ее поглощения отмечен в ранней экспоненциальной фазе роста. В дальнейшем ее потребление происходило с одинаковой скоростью, вплоть до полного исчерпания. Экономический коэффициент по сахарозе, при увеличении ее содержания в среде с 3% до 5 % не увеличивался, то есть оптимальное содержание сахарозы в среде составляет 30 г/л.

Повышение концентрации минеральных солей МС с 1/2 до 2 норм приводило к увеличению скорости роста и плотности биомассы [Бондарев и др., 1997е]. Цикл роста укорачивался, а продуктивность по сухой массе повышалась, что связано с нелимитированным поступлением веществ [Носов, 1992]. При стандартной концентрации минеральных солей содержание ДГ было выше на порядок и достигало 190 мкг/г сухой массы. Соотношение ДГ при этом не менялось.

При выращивании каллусной ткани на свету отмечено образование в клетках множества хлоропластов. Влияние света на рост каллуса было неоднозначным: у одних штаммов рост значительное усиливался, а у других - нет. Однако если рост ткани интенсифицировался, то активировался и биосинтез ДГ, содержание которых увеличивалось в 2 и более раз, причем в штамме 0л, как и в опытах с донорными растениями, сохранялось соотношение ДГ, а в штамме 1 л - нет (рис. 11).

о.

Темнота Свет

Рис. 11. Влияние условий освещения на содержание ДГ' в каллусных культурах клеток стевии (штаммы Ол и 1л). Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Таким образом, воздействием факторов культивирования удалось в несколько раз повысить содержание ДГ в культуре клеток. Однако их количество было более чем на порядок ниже, чем в листьях донорных растений, что свидетельствует о зависимости уровня накопления ДГ от степени дифференциации ткани.

Влияние процессов дифференциации. Был проведен анализ содержания ДГ у полученного миксотрофного морфогенного каллуса с хорошо сформированными побегами. Выявлено, что при образовании морфогенных структур и формировании побегов происходило восстановление биосинтеза ДГ' (рис. 12).

* о.

3 о

1.4

1,2

0.8 0,6 0,4 0,2

ШРебаудиозид С -ШРебаудиозид А □ Стевиозид

Культура

Рис. 12. Содержание ДГ в культурах стевии in vitro на разных стадиях дифференциации ткани (5 недель культивирования). Стебли растений in vitro (1), гетеротрофный каллус (2), суспензионная культура (3), миксотрофный каллус (4) и его побеги (5). Стандартные отклонения среднеарифметических величин < 5%.

Так, в морфогенном каллусе (штамм Ол), содержание ДГ было в 4-5 раз выше, чем в суспензионной культуре, а в побегах каллуса - почти в 40 раз, что составляет более трети от количества ДГ, содержащихся в стеблях донорных пробирочных растений.

Растения in vitro

Влияние углеродного и минерального питания. Углеродное питание оказывает существенное влияние на рост растений in vitro и образование в них ДГ. При использовании 3% сахарозы, сухая масса растений была на 20% выше, чем на средах с такими же концентрациями глюкозы и фруктозы, которые по этому параметру практически не отличались [Bondarev et al., 2003з]. Эти данные соответствуют результатам, полученным в опытах с культурой клеток, для которой сахароза также была предпочтительнее. Следует, однако, отметить некоторые особенности развития растений стевии in vitro. Так, корневая система была сильнее развита (на 50-60%) у растений, выращиваемых на средах с фруктозой и глюкозой, чем с сахарозой. Аналогичная закономерность отмечена при сравнении длины побегов. Однако удлинение побегов происходило за счет растяжения междоузлий. Число побегов и число пар листьев не зависело от использования источника углерода.

Культивирование на средах с различными источниками углерода оказывало значительное влияние на накопление ДГ (рис. 13). Наиболее высокое содержание ДГ обнаружено при использовании сахарозы. При выращивании на средах с фруктозой и глюкозой содержание ДГ существенно снижалось. Так, на среде с фруктозой оно было ниже более чем в 2 раза. При повышении содержания сахарозы в среде с 1% до 2%, с 2% до 3% и с 3% до 5%, сухая масса растений, также как и биомасса клеток в опытах с культурами клеток, увеличивалась на 70, 60 и 25%. соответственно.

>к о

У.

fcf

а.

"Ребаудиозид С Д аРебаудиозид А ^ пСтевиозид

п.

Рис. 13. Влияние углеродного и минерального питания на содержание ДГ в листьях стевии. I. фруктоза, 3%; 2. глюкоза, 3%; 3. сахароза, 2%; 4. сахароза, 3%; 5. сахароза, 5%; 6. двойная концентрация минеральных солей МС. Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Повышение содержания сахарозы в среде до 5% способствовало увеличению числа пар листьев, при неизменной длине побегов, а также оказывало существенное влияние на развитие корневой системы. Так, на среде с 5% сахарозой, по сравнению с 1%, число корней увеличивалось в 2,5 раза, а их длина -на порядок. Дальнейшее повышение ее содержания до 8% отрицательно сказывалось на развитии растений: происходило сильное укорочение и утолщение побегов.

С увеличением концентрации сахарозы с 2% до 3% происходило резкое повышение содержания ДГ в листьях (см. рис. 13). При дальнейшем увеличении концентрации сахарозы до 5% содержание ДГ существенно (в 1,5 раза) снижалось, но, благодаря увеличению биомассы, выход ДГ был примерно одинаков. Таким образом, оптимальное для образования ДГ содержание сахарозы в среде - 30 г/л.

Повышение в два раза концентрации минеральных солей МС приводило к значительному увеличению параметров роста растений: длины побегов, длины и числа корней, числа пар листьев, а также биомассы [Вопс1агеу й а1., 2003]. Происходило не только удлинение междоузлий, а формировались нормальные растения. Однако, при двойной концентрации минеральных солей МС, отмечали резкое (на порядок) снижение содержания ДГ в листьях (см. рис. 13).

Влияние регуляторов роста. Добавление в питательную среду регуляторов роста приводило к значительным изменениям в морфологии растений. Так, при добавлении относительно невысоких концентраций (0,1 мг/л) цитокинина (БАП) или цитокинина (БАП) и ауксина (НУК), происходило увеличение числа побегов в 1,5 раза по сравнению с контрольной безгормоналыюй средой. При дальнейшем повышении концентрации этих регуляторов роста увеличения числа побегов не происходило. НУК существенного влияния на формирование корневой системы не оказывала, в отличие от БАП, при добавлении и увеличении концентрации которого происходило ингибирование развития корневой системы. Так, на среде с 0,1 мг/л БАП длина корней была на порядок меньше, чем в контроле, а на среде с 0,3 мг/л - на два порядка. При добавлении в среду цитокитшов (БАП) и ауксинов (НУК), происходило снижение накопления сухой массы по сравнению с контролем [ВошЗагеу й а1., 2003]. При культивировании на среде с гиббереллином (ГК) в концентрации 1-5 мг/л отмечали удлинение побегов и корней за счет вытягивания междоузлий, при этом происходило увеличение их сырой массы. Сухая масса листьев, как и во всех вариантах с добавлением регуляторов роста, была меньше чем на стандартной среде.

Все изученные регуляторы роста оказывали негативное воздействие на образование ДГ по сравнению с контрольной безгормоналыюй средой (рис. 14).

Так, в листьях стевии, выращенной на питательной среде с гиббереллином (ГК) или цитокинином (БАП), содержание ДГ в листьях было ниже в 2-2,5 раза, а при добавлении в среду, уже содержащую цитокинин (БАП), дополнительно ауксина (НУК) в такой же концентрации, содержание ДГ снижалось в 4 раза, по сравнению с контролем (см. рис. 14).

« о

u S

Си

<и

с U

■ Ребаудиозид С ® Ребаудиозид А 0 Стевиозид

12 3 4

Рис. 14. Влияние регуляторов роста на содержание ДГ в листьях стевии. 1. безгормональная среда; 2. ГК (1,0 мг/л); 3. БАП (0,1 мг/л); 4.БАП+НУК (по 0,1мг/л), Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Влияние интенсивности облучения и фотопериода. Установлено, что основные параметры роста растений стевии in vitro при 16-ти часовом фотопериоде были наиболее высокими при интенсивности светового потока 30Вт/м2 [Бондарев и др., 2008]. Несколько другую картину наблюдали при 20 часовом периоде, когда изменение интенсивности светового потока с 8 до 30 Вт/м2 не приводило к достоверному увеличению параметров роста растений стевии in vitro.

Содержание ДГ в листьях растений стевии при увеличении интенсивности лучистого потока с 8 до 30 Вт/м2, при 16 часовом фотопериоде, увеличивалось более чем в 5 раз у диплоида и в 1,5 раза у тетраплоида (рис. 15А). Однако, в связи с тем, что в контроле тетраплоид накапливал ДГ в 4 раза больше чем дигшоид, их содержание выравнивалось. Увеличение освещенности до 60 Вт/м2, приводило к снижению накопления ДГ у диплоида и некоторому повышению у тетраплоида, но на фоне небольшого снижения сухой массы листьев выход ДГ не увеличивался.

Повышение накопления ДГ при увеличении интенсивности света до 30 Вт/м" наблюдали и при 20 часовом фотопериоде. Содержание ДГ в листьях диплоида возрастало примерно в 2 раза, а тетраплоида в 3 раза (рис. 15Б).

При исследовании влияния фотопериода, корреляции между накоплением сухой массы листьев и содержанием в ней ДГ не отмечено. Так, при увеличении длины светового дня с 16 до 20 часов, при интенсивности светового потока как 8, так и 30 Вт/м2, на фоне повышения накопления биомассы для обоих генотипов, содержание ДГ повышалось несущественно, а в некоторых случаях даже снижалось (рис. 16).

□ ребаудиозвд С ЕЗ ребаудиозвд А И стевюзид

и t=t

30 60 8 30 60

Интенсивность светового потока, Вт'м2 Диплоид Тетраппоид

Интенсивность светового

потока, Bi/m2 Дипяоид Тетраппоид

Рис. 15. Влияние интенсивности светового потока на содержание ДГ' в листьях стевии in vitro. (А) - фотопериод 16 часов, (Б) - фотопериод 20 часов. Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

20 т

g 16 о от

14 12 10

г и

5 и

16 20 16 20 16 20 16 20

Фотопериод, ч. Дигаоид Тетраппоид

8 Вт/м2 30 Вт/м2 8 Вт/м2 30 Вт/м2

Рис. 16. Влияние фотопериода на содержание ДГ в листьях растений стевии in vitro. Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Выход ДГ при удлинении светового дня до 20 часов, с учетом накопления биомассы, увеличивался для тетраплоида при интенсивности светового потока как

8. так и 30 Вт/м2, а для диплоида - только при 8 Вт/м2. При удлинении светового дня с 16 до 20 часов, выход ДГ было в 3-4 раза меньше, чем при увеличении интенсивности светового потока, что свидетельствует о том, что накопление ДГ связано с общей радиацией, полученной растением.

Таким образом, оптимальная интенсивность светового потока для^ роста растений in vitro и накопления ДГ в их листьях, составляет около 40 Вт/м", что в 2-3 раза ниже, чем для интактных растений стевии по данным литературы [Ермаков, Кочетов, 1994; Кочетов, Гогичайшвили, 1996]. Оптимальный фотопериод для диплоида составляет 16 часов, для тетраплоида около 20 часов.

Влияние спектрального состава света видимой области. Спектральный состав света оказывал отличающееся воздействие на диплоидный и тетраплоидный генотипы. При воздействии на диплоид (генотип 0) длинноволновой области спектра (красный свет), по сравнению с более коротковолновой (зеленый и синий свет), параметры роста были значительно выше, происходило значительное (в 2 раза) вытягивание стеблей и корней растений, а их масса была больше в 1.5 раза [Бондарев и др., 20106]. В содержании ДГ выявлена такая же закономерность (рис. 17А), т.е. оно коррелировало с развитием растений. На тетраплоид (генотип 1) влияние спектрального состава света было иным. Самые высокие параметры роста и содержание ДГ отмечены при культивировании на зеленом свету (рис. 17Б).

Белый Красный Зеленый Синий Белый Красный Зеленый Синий

Спектральный состав излучения Спектральный состав излучения

Рис. 17. Влияние спектрального состава света на содержание ДГ в листьях растений стевии in vitro. А - диплоид (генотип 0), Б - тетраплоид (генотип 1). Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Такое отличие, на наш взгляд, можно объяснить более высоким содержанием пигментов у тетраплоидов и более развитой анатомической структурой их листовой пластинки, от которых зависит поглощение листом фотосинтетически-активной радиации [Бондарев и др., 20076; Ladygin, Bondarev et al., 2008].

Влияние ультрафиолетовой радиации. При воздействии УФ-Б излучения параметры роста растений были несколько выше, чем в контроле, но содержание ДГ снижалось на 25-30% (рис. 18).

УФ-свет Контроль 1 Контроль 2

Рис. 18. Влияние УФ-Б радиации на содержание ДГ у растений in vitro (генотип 0). Контроль 2 - стандартный режим выращивания (белый свет, 8 Вт/м2). Контроль 1 - стандартный режим плюс видимый свет от УФ ламп, но без УФ излучения. Стандартные отклонения среднеарифметических величин не превышали 5%.

Однако, с учетом повышения сухой массы, выход ДГ снижался не существенно. Снижение содержания ДГ может быть связано с нарушением формирования листовой пластинки и структуры хлоропластов УФ-Б излучением [Noaues et al. 1998].

Таким образом, факторы культивирования оказывают значительное влияние на процессы роста и тканевой дифференциации в культурах in vitro и, как следствие, биосинтез ДГ. Наиболее значимым фактором для его интенсификации является свет, что свидетельствует о том, что образование ДГ проходит в пластидах по МЕР-пути.

УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК СТЕВИИ IN VIVO И IN VITRO.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА ДИТЕРПЕНОВЫХ

ГЛИКОЗИДОВ

В связи с представленными выше данными, на завершающем этапе исследования с целью выяснения локализации и особенностей биосинтеза и накопления ДГ была детально изучена ультраструктура клеток растений и культур in vitro стевии. Основное внимание при этом обращали на органеллы, в которых по данным литературы происходит биосинтез или накопление терпеноидов, а именно пластиды, цитозоль, ЭПР, вакуоли и некоторые другие [Васильев, 1977, 1980; Князьков и др., 1994; Носов, 2005].

Исследование проводили с использованием всех имеющихся объектов стевии, значительно отличающихся по содержанию ДГ: интактное растение, растение in vitro, этиолированные побеги in vitro, гетеро- и миксотрофные культуры клеток. Так, наибольшее количество ДГ накапливается в интактных растениях, в основном в листьях. У пробирочных растений суммарное содержание ДГ в листьях и стеблях в несколько раз ниже по сравнению с интактнымн растениями. У этиолированных побегов от vitro, выросших в темноте содержание ДГ было примерно в 10 раз ниже, чем в листьях in vitro растений, выращенных на свету. Аналогичную закономерность наблюдали и в культуре клеток. При выращивании клеток каллуса на свету, накопление гликозидов достигаю 100 мкг/г сухой массы. В гетеротрофной каллусной ткани, выращенной в темноте, накапливались лишь следовые количества ДГ. Обобщенные результаты исследований по содержанию ДГ у различных объектов стевии приведены в таблице (табл. 2).

Таблица 2

Содержание ДГ в растениях и культурах in vitro (мг/г сухой массы)

Культура Образец Стевиозид Ребаудиозид А Ребаудиозид С Сумма ДГ

Интактные растения (2 п) листья стебли 24.9±3.5 4.510.4 12.0+1.8 2.6010.2 4.6+0.7 0.4Ю.02 41.516.1 7.5+0.6

Интактные растения (4 п) листья стебли 25.412.1 .** 24.5+3.4 6.3+0.4 56.215.5

In vitro растения (2 п) листья стебли 3.310.28 0.810.07 1.91+0.09 0.61+0.03 0.710.02 0.11+0.0 5.91+0.31 1.52+0.07

Этиолированные побеги in vitro (2 п) побеги 0.2810.02 0.18+0.01 0.07Ю.0 0.5310.03

Зеленый морфо-генный каллус* клетки побеги 0.0610.01 0.3910.03 0.0210.0 0.11+0.01 0 0.05+0.0 0.0810.01 0.55+0.03

Гетеротрофный каллус клетки следы 0 0 следы

* - каллус получен из листьев диплоидного растения; **- не анализировали.

Ультраструктура эппдермальных образований стевии

Клетки эпидермиса листа интактных растений имеют извилистые очертания и покрыты тонким слоем кутикулы. Устьица располагаются на адаксиальной и абакснальной поверхностях листа, но на последней их значительно больше. С помощью сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии были детально исследованы обнаруженные ранее [НоАпапп, 1974; Шафферт и др., 1992; Суханова и др., 2001] три типа эпидермальных образований. Выявлено, что:

1- крупные волоски имеют коническую форму, могут быть прямыми или изогнутыми, состоят из 7-10 клеток, а их длина составляет 300-600 мкм (рис. 19А,Б);

2. мелкие волоски более короткие и тонкие по сравнению с крупными волосками, состоят из 5-6 клеток, а их длина колеблется от 50 до 200 мкм;

3. железки состоят из 8-ми клеток, имеют округлую форму и располагаются в углублениях листовой поверхности, а их диаметр составляет 50-60 мкм [Бондарев и др., 2010а].

А Б

Рис. 19. Эпидермальные образования на поверхности листьев S. rebaudiana: А - интактное растение; Б - растение in vitro. KB - крупный волосок, MB - мелкий волосок, Ж - железка. Масштабная линейка - 50 мкм.

У растений in vitro (см. рис. 19Б) число кроющих трихомов и железок в 1,5-2 раза меньше, чем у интактных растений, что положительно коррелирует с содержанием ДГ в листьях. Все три типа эпидермальных образований обнаружены как на адаксиальной, так и на абаксиальной сторонах листьев. На поверхности верхних молодых листьев число железок больше, чем на поверхности стареющих нижних. В этом случае также выявлена положительная корреляция между плотностью железок и содержанием ДГ.

Таким образом, существует положительная корреляция между количеством железок на листьях и уровнем содержания в них ДГ. Отсюда можно сделать предположение о роли этих структур в образовании и накоплении ДГ. То. что дитерпеноиды могут содержаться в железистых трихомах некоторых видов растений семейств Asteraceae и Solanaceae отмечали ранее [Wagner, 1991; Duke, 1991].

В апикальной части железки, выступающей на поверхности листа, имеется субкутикулярная полость (СП), которая может заполняться секретом (рис. 20А).

Рис. 20. Зрелая железка с заполненной (А) и незаполненной (Б) субкутикулярной полостью на поверхности листа 5. геЬаисГшпа. Масштабная линейка - 10 мкм.

Однако, выявлены железки с поврежденной СП и вытекшим из нее секретом, что наблюдали и у некоторых других видов семейства Asteraceae [Duke and Paul,' 1993; A fo lay an and Meyer, 1995]. Встречаются железки с незаполненными Сп! хотя кутикула не несет видимых повреждений и вытекания содержимого не наблюдается (рис. 20Б).

На рис. 21 представлен продольный разрез созревающей железки. Железки, как правило, состоят из восьми двухрядно расположенных клеток. Размеры клеток в апикальной части больше, чем в базальной. Ультраструктура клеток железки сильно меняется, начиная с ее базальной части и заканчивая апикальной, поэтому их можно разделить на три группы. К первой группе относятся ' активно функционирующие клетки с типичной ультраструктурой, находящиеся в базальной части железки. Они имеют пластидный аппарат, митохондрии и небольшие вакуоли. В тилакоидах пластид обнаружена электронно-плотная субстанция. Это свидетельствует об активных метаболических процессах протекающих в них и, вероятно, связанных с синтезом дитерпеноидов, так как число таких тилакоидов возрастает одновременно с увеличением содержания ДГ. Ко второй группе принадлежат клетки с небольшой степенью деструкции и сниженной функциональной активностью, находящиеся в средней части железки. В этих клетках органеллы смещены к клеточной стенке, а значительный объем клетки занят вакуолями средней величины. К третьей группе относятся клетки, находящиеся на конечной стадии деструкции и располагающиеся в апикальной части железки. Они лишены органелл и заполнены большой вакуолью. Как известно, степень сложности ультраструктуры терпеноидогекных клеток коррелирует с интенсивностью процессов синтеза в них секрета [Васильев, 1977].

Рис. 21. Ультраструктура клеток железки 5. геЪаисЧапа. Фиксация в глутаральдегиде без осмирования (А) и с последующим осмированием (Б). В -вакуоль, К - кутикула, КС - клеточная стенка, ОВ - осмиофильное включение, СП - субкутикулярная полость, Хл - хлоропласт. Масштабная линейка - 1 мкм.

Рис. 22. Ультраструктура клеток верхнего эпидермиса молодых листьев интактных растений. Фиксация в глутаральдегиде с последующим осмированием. АЭР - агранулярный ЭПР, В - вакуоль, Гл - глобула, КО - клеточная оболочка, Кр - крахмал. М - митохондрия. ПР - периферический ретикулум, Тл - тилакоид, Хл - хлоропласт. Масштабная линейка- 0.5 мкм.

В пристеночном слое цитоплазмы базальной части клеток обнаружены электронно-плотные округлые глобулы с мелкозернистым содержимым. Они похожи на липидные капли, но отличаются от них зернистой структурой. В этих глобулах, вероятно, проходит следующий этап биосинтеза ДГ. Три типа клеток демонстрируют последовательность накопления секрета в железках, который, по-видимому, представляет собой смесь ДГ, растворимых в воде. Секрет выделяется из апикальных клеток и скапливается в субкутикулярной полости, которая образуется за счет разделения клеточной стенки, часть которой отделяется вместе с кутикулой (см. рис. 21). Прочная кутикула обеспечивает целостность такой полости, приобретающей сферическую форму, и накопление в ней секрета (см. рис. 20).

Ультраструктура клеток листьев интактных растений

Исследование ультраструктуры клеток листьев диплоидных и тетраплоидных растений не выявило существенных различий в их пространственной организации. Что же касается количественных анатомических показателей, таких как размеры клеток, хлоропластов, числа хлоропластов в клетке, то у тетрашгоидов размеры клеток'больше, чем у диплоидов, а число хлоропластов больше в два раза.

Основные эпидермальные клетки верхних и нижних листьев имеют вытянутую форму, клеточная оболочка вторично утолщенная. Цитоплазма электронно-плотная. Митохондрии имеют хорошо развитую систему крист (рис. 22) В клетках хорошо развит агранулярный ЭПР. Клетки молодых листьев содержат вакуоли разного размера с электронно-плотным и электронно-светлым содержимым. У клеток нижних стареющих листьев центральная часть занята крупной вакуолью с мелконитчатым содержимым, напоминающей таннидоносные вакуоли. Имеется также множество вакуолей небольшого размера с электронно-плотным содержимым. Периплазматическое пространство заполнено везикулами.

А Б

Пластиды представлены хлоропластами, обладающими слабо развитой системой тилакоидов, а в строме находится крахмал и небольшие пластоглобулы, а также отложения ферритина. Однако встречаются хлоропласты с хорошо развитой мембранной системой, представленной тилакоидами гран и тилакоидами стромы, причем их внутритилакоидное пространство заполнено электронно-плотным содержимым. В хлоропластах выражен периферический пластидный ретикулум, в зоне развития которого видны контакты внешних мембран с митохондриями и АЭР. Около хлоропластов часто находится АГ. Важной особенностью элидермальных клеток является наличие в цитоплазме округлых глобул, сходных с глобулами железки, размеры которых варьируют от диаметра митохондрий до поперечного диаметра хлоропластов. Эти глобулы заполнены мелкозернистым содержимым. Они находятся в цитоплазме, причем между периферическим пластидным ретикулумом, пузырьками ЭПР и глобулами прослеживается связь, вероятно последние являются элементами АЭР, участвующими в биосинтезе ДГ.

Клетки мезофилла верхних молодых листьев сравнительно крупные с тонкой клеточной оболочкой. Расположение клеток рыхлое, с хорошо выраженной системой межклетников. В клетки имеется одна крупная вакуоль и несколько мелких. Ядро и клеточные органеллы занимают пристеночное положение. Плотный контакт между органеллами свидетельствует об активных метаболических процессах происходящих в клетке. Митохондрии округлой или слегка вытянутой формы с узкими светлыми кристами занимают наиболее "удобную" для контактов с хлоропластами позицию, по 2-3 органеллы сосредоточены в местах стыка пластид. Между соседними хлоропластами располагаются также микротела (пероксисомы), которые тесно связаны как с хлоропластами, так и с митохондриями. Матрикс пероксисом часто содержит кристаллоид, состоящий из параллельных субъединиц (трубочек). Пероксисомы имеют тесную связь с цистернами агранулярного ЭПР. АГ в клетках хорошо развит и, как правило, находится возле хлоропластов. Обнаружено также большое число везикул в периплазматическом пространстве. Хлоропласты вытянутой чашевидной формы расположены вдоль стенок довольно плотно. В них, также как и в хлоропластах зпидермальных клеток, развит периферический пластидный ретикулум. В строме видны небольшие единичные пластоглобулы и крахмальные зерна. Хлоропласты листьев как диплоидных, так и тетраплоидных растений имеют мембранную систему с хорошо развитыми тилакоидами во многих местах образующие граны из 7-15 тилакоидов. Иногда формируются макрограны, включающих в себя до 20-30 тилакоидов. Было обнаружено, что в хлоропластах тетраплоидов накапливается больше крахмала (до 3-4 крупных глобул на срез), чем у диплоидов (обычно 1-2 крупные глобулы на срез).

Следует особо отметить, что все внутритилакоидное пространство хлоропластов листьев как диплоидных, так и тетраплоидных растений было заполнено электронно-плотным содержимым (рис. 23). Данилова и Кашина отмечали преобладание такого модифицированного типа тилакоидов у периллы масличной (Perilla ocymoides L.) при непрерывном освещении и обычного - на коротком дне [Данилова и Кашина, 1999].

Интересно, что стевия, как и перилла, является короткодневным растением и при выращивании в условиях длинного дня усиленно вегетирует, не переходя к цветению. Содержание ДГ в листьях растений, выращиваемых в таких условиях,

выше, чем у растений растущих в условиях короткого дня, то есть наблюдается корреляция между числом тилакоидов с электронно-плотным содержимым и содержанием ДГ. Однако ДГ, как показали наши исследования, отсутствуют в тилакоидах. Электронно-плотное вещество, находящееся внутри тилакоидов, является предшественником ДГ, о чем будет отмечено отдельно.

содержимого), Тл - тилакоид. Фиксация в глутаральдегиде без осмирования. Масштабная линейка- 0,1 мкм.

При фиксации листьев стевии только в глутаральдегиде, на месте пластоглобул остается пустое пространство в результате экстракции их содержимого, в то время как электронно-плотное вещество остается внутри тилакоидов (рис. 23). Кроме того, в цитоплазме и при таком способе фиксации, содержатся элекронно-плотные глобулы или включения неправильной формы. Эти особенности позволяют отличить содержимое тилакоидов и глобул от липидных капель. На рис. 24 показано, что именно содержимое тилакоидов выходит из хлоропласта и собирается в виде округлых глобул, причем картину можно видеть и при стандартной фиксации, когда содержимое пластоглобул остается на месте.

Отличия клеток мезофилла нижних листьев выражаются в том, что вторичная клеточная стенка хорошо развита, а плазмалемма имеет с ней плотный контакт. В пристеночном слое цитоплазмы содержатся электронно-плотные включения. Строма пластид электронно-плотная и содержит пластоглобулы и крупные крахмальные зерна. Центральная вакуоль сильно увеличена. Ее структура становится похожей на таннидоносную, благодаря появлению электронно-плотных хлопьевидных частиц [Суханова, Бондарев и др., 2007в].

Клетки флоэмы верхних листьев в несколько раз меньше, чем клетки мезофилла. Они представлены несколькими типами клеток. Это клетки-спутницы и ситовидные элементы. В клетках-спутницах митохондрии округлой формы с относительно широкими кристами. ЭПР образует небольшие цистерны.

Рис. 24. Выход содержимого тилакоидов стевии в виде глобул с гранулярным материалом. Фиксация в глутаральдегиде без осмирования. Масштабная линейка - 0,1 мкм. Пг - пластоглобула (без содержимого), Гл - глобула.

Хлоропласта расположены вдоль клеточной стенки и имеют в два раза меньшие размеры, чем в клетках мезофилла. Слабо развита мембранная система, [ представленная тилакоидами обоих типов. Клеточные оболочки имеют многочисленные выросты (протуберанцы), что существенно увеличивает , поверхность плазмалеммы и емкость свободного пространства. Подобная структура клеточной оболочки отмечена в клетках-спутницах мелких жилок у единичных представителей некоторых семейств, в том числе и Asteraceae | [Гамалей, 1980]. Факт существования протуберанцев только в клетках-спутницах | флоэмных окончаний листа указывает на то, что эти структуры имеют непосредственное отношение к поглощению ассимилятов из клеток паренхимной обкладки. С плазмалеммой паренхимных клеток сливаются многочисленные | вакуоли мелкого и реже среднего размеров со светлым содержимым. Центральная часть клеток-спутниц иногда занята вакуолью, в которой присутствуют хлопьевидные включения.

Ультраструктура клеток листьев растений in vitro

\ Клетки_мезофилла довольно крупные. Межклетники заполнены

осмиофильным содержимым. Центральная часть клетки занята крупной вакуолью (рис. 25). Агранулярный ЭГ1Р в клетках не развит. АГ развит слабо и находится у клеточной стенки. У плазмалеммы сосредоточено большое число везикул. Внутренняя мембранная структура хлоропластов листьев растений in vitro ( остается достаточно хорошо развитой. При этом сохраняется четкая продольная ориентация всех тилакоидов и гран, характерная для интактных листьев. В них также формируется множество гран. И все же в структуре хлоропластов растений in vitro есть некоторые особенности. Они накапливают мало крахмала ввиду менее интенсивных фотосинтетических процессов. Видимо поэтому, мембранная система хлоропластов растений in vitro более рыхлая, чем в хлоропластах интактных растений. Это в большей степени касается гранальных участков (ослаблена плотность контактов и появляется множество межгранных единичных тилакоидов).

I I

Рис. 25. Особенности ультраструктуры клеток мезофилла листа растений стевии in vitro. На этом и последующих рисунках фиксацию проводили в глутаральдегиде с последующим осмированием. Обозначения как на предыдущих рисунках. Масштабная линейка - 0.5 мкм.

Характерной особенностью хлоропластов растений in vitro является также появление большого числа осмиофильных глобул (до 10 штук на срез одного хлоропласта). Этот критерий указывает на наличие в хлоропластах деструктивных процессов, обычно легко наблюдаемых при действии различных стрессов: дефицита железа, корневой гипоксии и т. д. [Ладыгин, Семенова, 1993, 1999; Staehelin, 2003] Вероятно, эти структурные изменения обусловлены выращиванием растений в закрытых сосудах с низкой диффузией газов на среде с органическим источником углерода, что ингибирует процесс фотосинтеза и формирование тилакоидов [Lucchesini et а!., 2006]. В тилакоидах хлоропластов растений in vitro, в отличие от интактных растений, накопление электронно-плотной субстанции, как правило, не происходит. Таким образом, несмотря на достаточно высокое содержание пигментов и функциональную активность хлоропластов растений in vitro у них отмечены небольшие деструктивные процессы и снижена степень структурирования хлоропластов по сравнению с интактными растениями. Эти особенности ультраструктуры клеток мезофилла растений in vitro коррелируют с резким снижением содержания ДГ в их листьях по сравнению с интактными растениями (см. табл. 2).

Эпидермальные клетки прямоугольной вытянутой формы. Центральную часть клетки занимает крупная вакуоль с мелко-нитчатым содержимым. Митохондрии обычной структуры. Пластиды сходны с пластидами мезофилла, но не содержат

крахмал и пластоглобул.

Клетки флоэмы на срезе имеют округлую форму, они в 3-4 раза меньше, чем клетки мезофилла. Клетки представлены теми же типами, что и у интактных растений. Отличия клеток in vitro растений заключаются в меньшем числе протуберанцев в клетках-спутницах и небольших вакуолей со светлым содержимым, расположенных по периметру клеток паренхимной обкладки, что говорит о менее интенсивном поглощении ассимилятов из последних.

Ультраструктура клеток этиолированных побегов in vitro

Изучение структуры хлоропластов этиолированных побегов in vitro проводили на трех типах листьев: I - эксплантовых листьях, 2 - нижних листьях (почки эксплантов), 3 - верхних зачатках листьев, сформировавшихся в темноте.

Хлоропласты эксплантовых листьев хорошо структурированы. Они содержат большое число развитых тилакоидов способных формировать граны. Однако отдельные хлоропласты содержали в основном слабо развитые тилакоиды, другие наполовину были хорошо структурированными, а наполовину не имели тилакоидов и были заполнены матриксом с мембранными пузырьками. В отдельных хлоропластах наряду с множеством мембранных пузырьков и коротких тилакоидов присутствовали отдельные макрограны. Неоднородность развития мембранной системы хлоропластов является характерной особенностью эксплантовых листьев. Такая неоднородность структурирования предполагает разновозрастность хлоропластов к моменту переноса в темноту и протекание в них деструктивных процессов в темноте, что подтверждается появлением внутри хлоропластов крупных липидных капель.

В пластидах нижних листьев мембранная система практически полностью разрушена, остается лишь небольшое число слабо развитых тилакоидов (рис. 26А).

Рис. 26. Пластиды клеток листьев этиолированных побегов стевии in vitro. А — пластиды клеток нижней листовой пары, Б, В - пропластиды зачаточных листьев.

Такие хлоропласта накапливают большое число пластоглобул, образующихся из липидов, высвобожденных из мембранной системы вследствие потери хлорофилла и разрушения тилакоидов в темноте [Ladygin, Bondarev et al., 2008].

Зачаточные листья верхних ярусов слабо развиты. Они имеют белую окраску, размеры 3-6 мм в длину и 1-2 мм в ширину, что в 4-8 раз меньше размеров листьев растений in vitro. Клетки таких листьев также гораздо меньших размеров и имеют четко выраженную удлиненную форму (рис. 26Б). Пропластиды клеток этих листьев, как правило, имеют округлую форму, в отличие от эллипсоидной или дисковидной, характерной для клеток зеленых листьев. Кроме того, пропластиды не имеют строгой пристенной локализации в клетке. Они могут располагаться в цитоплазме как вблизи клеточной стенки, так и в середине клетки. Размеры пропластид меньше, чем размеры хлоропластов и от 70 до 95% их объема заполнено только матриксом. Мембранная система пластид в редких случаях представлена единичными тилакоидами, обычно имеющих дугообразную или кольцевидную форму и множеством пузырьков. Чаще мембранная система пропластид совсем не развита, можно наблюдать лишь первые этапы ее формирования - мелкие липидсодержащие глобулы и кольцевые структуры, образованные цепочкой пузырьков (рис. 26В).

Клетки гетеротрофных и миксотрофных каллусных культур

Клетки гетеротрофной каллусной ткани довольно крупные. В них интенсивно идет процесс вакуолизации (рис. 27А). ЭПР представлен в основном гранулярной формой. В клетках развит АГ, а также присутствует большое число митохондрий.

А " Б

% з ->.

...8

Щ'

ш- >

' шШШяШШ? 1 *

- " в

* ' с Г', Ф -

- * . V4 J *» - fes

т: '£Я

ч-

Рис. 27. Ультраструктура клетки (А) и пластиды (Б) гетеротрофной каллусной ткани ГЭР — гранулярный ЭПР, П - пластида.

Выращивание клеток каллуса в темноте приводит к практически полной редукции мембранной системы пластид. Оии содержат небольшое число мембранных пузырьков, единичных коротких тилакоидов и осмиофильных глобул. Почти вся пластида заполнена матриксом (рис. 27Б) и ее можно назвать пропластидой.

Клетки миксотрофяых каллусных тканей, выращенные на свету, похожи по своей ультраструктуре на клетки гетеротрофного каллуса (рис. 28). Митохондрии хорошо развиты. Необходимо отметить активное функционирование АГ. Хорошо развит как гранулярный, так и агранулярный ЭПР. В клетках множество вакуолей различного размера с мелконитчатыми включениями.

Рис. 28. Особенности ультраструктуры клеток миксотрофной к&члусной ткани. Д - диктиосома, Пс - полисома. Остальные обозначения как на предыдущих рисунках. Масштабная линейка - 0.5 мкм.

Пластиды имеют округлую форму и слабо структурированы. Часть пластид образует большое число мембранных пузырьков, отдельных тилакоидов и множество осмиоф ильных глобул, которые иногда образуют цепочки округлой формы (рис. 29А). Основная часть объема пластиды заполнена матриксом. Другая часть пластид формирует много небольших единичных тилакоидов, которые образуют граны, состоящие из 2-3 тилакоидов (рис. 29Б).

А Б

Рис. 29. Пластиды клеток миксотрофной калллусной ткани. А - пластида, состоящая из мембранных пузырьков, коротких тилакоидов и осмиофильных глобул, Б — пластида с гранами, состоящими из нескольких тилакоидов.

Активность фотосинтетического аппарата

Для выяснения корреляции между фотосинтезом и биосинтезом дитерпеновых гликозидов была изучена активность фотосинтетического аппарата растений и культур in vitro стевии.

Содержание пигментов в листьях диплоидных и тетраплоидных интактных растений практически не различается (табл. 3). В листьях растений in vitro содержание пигментов было несколько ниже, чем в интактных растениях. В то же время содержание пигментов в каллусной ткани, выращенной на свету, было на порядок ниже, по сравнению с таковым в листьях интактных растений, что наблюдали и для других видов [Pakhlavouni et al, 2000],

Таблица 3

Содержание пигментов в листьях растений и культурах in vitro (мг/г сырой массы)

Культура Хлорофилл а Хлорофилл b Кароти-ноиды Хлорофилл а Хлорофилл b Хлорофиллы Каротиноиды

Листья интактных растений (2 п)* 1.65+0.09 0.62±0.03 0.36+0.03 2.7 6.3

Листья интактных растений (4 п) 1.77±0.12 0.63±0.04 0.39+0.04 2.8 6.2

Листья in vitro растений 1.32±0.11 0.5110.03 0.27+0.03 2.6 6.8

Листья этиолированных побегов in vitro 0.1310.02 0.0310.01 0.03+0.01 4.3 5.3

Миксотрофный каллус 0.17±0.02 0.04+0.01 0.0410.01 4.2 5.2

Гетеротрофный каллус Следы 0 0 - -

* - 2п- диплоидные растения, An - тетрагшоидные растения.

В этиолированных побегах содержание хлорофиллов и каротиноидов было более чем на порядок ниже по сравнению с in vitro растениями. Этиолированная каллусная ткань содержала лишь следовые количества пигментов.

Интенсивность фотосинтеза. Для листьев растений и клеток каллуса световое насыщение скорости фотосинтетического выделения кислорода (СФВК) наблюдали при интенсивности света в пределах 150-250 мкмоль/м2 с (табл. 4).

Таблица 4

Скорость фотосинтетического выделения 02 листьями и культурами клеток in vitro

Насыщающая 02 выделение 02 выделение

Культура интенсивность света [мкмоль/ [мкмоль/

|мкмоль/(м~ с)1 (кг(сухой массы) с)] (г(Хл)с)]

Листья интактных растений (2 п) 230 ±50 37.5 + 6.9 2.310.2

Листья интактных растений (4 п) 254146 38.613.4 2.210.3

Листья растений in vitro (2 ri) 180 + 20 24.313.4 1.910.4

Листья этиолированных побегов - Следы -

in vitro (2 ri)* 5.3 ±0.3

Зеленый морфогеняый 150140 4.110.9

каллус (2 ri) Следы

Гетеротрофный каллус (2 и) - •

* -2п- диплоидные растения, 4п - тетраплоидные растения.

СФВК у листьев растений in vitro был лишь на 20-30% ниже, чем у листьев интактных растений, как ди-, так и тетраплоидов, которые по данному параметру практически не различались. Однако интенсивность фотосинтеза клеток каллуса была примерно в 6-9 раз ниже (на 1 кг сухой массы), либо в 2-3 раза выше (на 1 г хлорофилла) по сравнению с фотосинтетической способностью клеток листьев растений как in vivo, так и in vitro растений (см. табл. 4).

Активность фотосистем. Фотохимическая активность реакционных центров ФС1 и ФСН была наиболее высокой в хлоропластах листьев интактных растений (рис. 30А,Б). Хлоропласты листьев растений ш vitro имели в 2 раза меньшую

активность РЦ обеих ФС. Фотохимическая активность РЦ ФС1 и ФС11 в пластидах этиолированных побегов составляла 15-30%, а в пластидах клеток каллуса на свету - 5-6% от активности реакционных центров обеих фотосистем хлоропластов листьев растений in vitro. Клетки каллуса, росшие в темноте, не обладали фотохимической активностью РЦ ни ФС'1 ни ФСП.

Рис. 30. Фитохимическая активность РЦ ФС! и ФСП в пластидах S. rebaudiana: А— светоиндуцированные изменения в поглощении хлорофилла, принадлежащего РЦ ФС1 (ДА700); Б - изменения в переменной флуоресценции хлорофилла (Fv) ФСП. 1,2- хлоропласты интактных и in vitro растений; 3 - пластиды этиолированных побегов in vitro; 4. 5 - пластиды клеток миксотрофного и гетеротрофного каллуса. Стрелки (t) и (4) означают включение и выключение света, соответственно.

Идентификация электронно-плотного содержимого тилакоидов хлоропластов.

Следует отметить, что, начиная еще с конца 60-х годов, некоторые исследователи при изучении ультраструктуры хлоропластов отмечали необычные тилакоиды, внутреннее пространство которых было заполнено электронно-плотной субстанцией [Israel, Steward, 1967; Stetler, Laetsch, 1969; Steveninck, Steveninck, 1980a; Кашина и др., 1981; Семенова, 1985]. Была выдвинута гипотеза о том, что диморфизм тилакоидов хлоропластов (электронно-прозрачные тилакоиды - обычный тип, а электронно-плотные тилакоиды — модифицированный тип) является структурной основой участия хлоропластов в световых реакциях фотопериодизма [Данилова и Кашина, 1999]. Однако до настоящего времени исследователи не смогли ни идентифицировать электронно-плотное соединение внутри тилакоидов, ни даже предположить его природу.

В связи с выявленной высокой положительной корреляцией между наличием модифицированных тилакоидов и содержанием ДГ, было предположено, что электронно-плотное вещество, находящееся в тилакоидах, является предшественником ДГ. Поэтому была осуществлена идентификация этого соединения. Для этого из листьев стевии были выделены интактные хлоропласты и тилакоиды, как описано в разделе ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ,

Затем, после того как мембраны тилакоидов были разрушены и выделено их содержимое, был проведен его анализ с помощью хромато-масс-спектрометрии.

Было установлено, что ДГ в содержимом тилакоидов стевии отсутствуют, однако в его масс-спектре наблюдали пик протонированного молекулярного иона МН+ 273, означающий присутствие в нем энт-каурека (Мг=272) (рис. 31). Затем был получен масс-спектр, соответствующий масс-спектру энт-каурена из библиотеки спектров «N181-05». Следовательно, именно водонерастворимый энт-каурен является электронно-плотным веществом, присутствующим в тилакоидах некоторых видов растений в определенные периоды онтогенеза.

60-I : I 55

С 1

I 50 ; .1) 1

% 45/

30-п «О

193 196:

47 М1

1 ' 253

158

нн*

141 223 2?3 ,.„

¡за т .,,„ 1 ~п

121 ,; 160 '!Щ -к,

182; а« 230 1,2/ ■■279

123 , . ,М| ^ ^ . ; 11„ ,

12В 140 160 Г

' 200 ' 220 240 25,? 280

т/г

Рис. 31. Масс-спектр содержимого тилакоидов, в котором присутствует энт-каурен Мг=272 (на рис. показан пик протонированного молекулярного иона МН+ 273).

Таким образом, полученные нами данные выявили положительную корреляцию между активностью фотосинтетического аппарата и содержанием ДГ в клетках листьев растений и каллусных тканей. Между количеством железок на листьях и уровнем содержания в них ДГ также обнаружена положительная корреляция. Особенности ультраструктуры клеток железки, а также некоторых клеток эпидермы и мезофилла растений, такие как накопление электронно-плотного вещества внутри тилакоидов, его выход из хлоропластов и образование в цитозоле электронно-плотных глобул с зернистой структурой свидетельствуют об активно протекающих процессах биосинтеза ДГ в них. Биосинтез и накопление ДГ происходит и в клетках миксотрофного каллуса, о чем также свидетельствуют особенности их ультраструктуры и корреляция с содержанием ДГ. Электронно-плотным веществом, которым заполнены тилакоиды стевии в период активного вегетативного роста, является энт-каурен - предшественник ДГ и гиббереллинов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили выявить ряд закономерностей метаболизма дитерпеновых гликозидов в иптактных растениях, а также в культурах in vitro стевии на разных стадиях дифференциации ткани.

У ювепильных in vitro растений содержание ДГ снижается в 5-7 раз по сравнению с хорошо развитыми интактными растениями. При оптимизации условий культивирования in vitro (в биореакторе) развитие растений улучшается, что проявляется в увеличении содержания ДГ, то есть наблюдается зависимость уровня накопления ДГ от степени развития растений. Выращенные поверхностным способом каллусные культуры содержат следовые количества ДГ, но при глубинном культивировании клеток процессы образования и накопления ДГ несколько интенсифицируются. Вероятно, это обусловлено изменениями условий выращивания, в результате чего меняется, как структурная организация клеток, так и снабжение их кислородом и питательными веществами, что в конечном итоге сказывается и на интенсивности образования ДГ. Однако изменение условий культивирования значительно не стимулирует биосинтез и накопление ДГ в дедифференцированных культивируемых клетках. Полученные данные свидетельствуют в пользу зависимости между интенсивностью роста культур клеток, а также растений, как интактных, так и in vitro, и накоплением у них ДГ. У этиолированых побегов in vitro, содержание ДГ снижалось на порядок, по сравнению с растениями in vitro, выращенными на свету. Аналогичную закономерность наблюдали и для гетеротрофной каллусной ткани, в клетках которой содержатся лишь пропластиды, заполненные матриксом с небольшим числом мембранных пузырьков и глобул липидов, пигменты практически отсутствуют, в результате чего биосинтез ДГ не происходит. При переносе каллуса на свет формируются хлоропласты, имеющие тилакоиды и небольшие граны, при этом происходит восстановление биосинтеза ДГ, в результате чего содержание увеличивалось на порядок. При образовании в каллусной ткани морфогенных структур и формировании побегов, содержание ДГ увеличивалось в 5 раз. Такая закономерность свидетельствует о том, что начальные этапы биосинтеза ДГ проходят не в цитозоле по мевалонатному (MVA) пути, а в хлоропластах по метилэритритолфосфатному (МЕР) пути. Об активно протекающих в клетках железки, а также некоторых клеток эпидермы и мезофилла растений процессах биосинтеза ДГ свидетельствуют также особенности их ультраструктуры, что коррелирует с их содержанием. Тот факт, что в каллусе, выращиваемом на свету, содержание ДГ было хотя и выше, чем в гетеротрофном каллусе, однако значительно ниже, чем в растениях, не опровергает сделанного предположения. Клетки каллуса на свету имели хлоропласты со слабо развитой мембранной структурой. Наиболее вероятно, что активному образованию ДГ предшествует период интенсификации хлоропластного изояреноидного биосинтеза, важного для процесса фотосинтеза (фитол, каротиноиды и др.), которые также синтезируются по МЕР-пути [Lichtenthaler, 1998]. Помимо этого, значительная часть ДГ накапливается в железках, которые отсутствуют в недифференцированной ткани. В связи с вышеизложенным, процессы биосинтеза и аккумуляции ДГ связаны с развитием мембранной системы хлоропластов и их активным функционированием, а также с дифференциацией ткани листа и формированием железок.

Цитоплазма

сауреиол

Хлоропласт

Энт-кауреналь

Тилакоид

Энт-кауреновая кислота

Эит-каурен'

■ООРР~Энт-СРР*Эит-кауреи

Пирувет+GAP » DXP -МЕР

Стевиол ~ j

. Эет-?а-гцдроксикауреновая

кислота . У

Гиббер&шшны

Вакуоль

Рис. 32. Компартментация биосинтеза дитерпеноидов в клетке растении

Биосинтез дитерпеноидов проходит в тилакоидах хлоропластов по МЕР-пути, начинающегося с образования Э-глицеральдегид-З-фосфата и пирувата. Ключевым моментом биосинтеза является циклизация геранилгеранилдифосфата с образованием энт-копалилдифосфата и энт-каурена. Затем энт-каурен, обладающий слабой полярностью и повышенным сродством к липидной фазе мембран, покидает тилакоиды и пластиду, диффундируя через мембрану.

Как было показано, между развитием и активностью фотосинтетического аппарата и, как следствие, ростом растений с одной стороны и интенсивностью образования ДГ с другой, существует положительная корреляция. Такую корреляцию можно объяснить тем, что предшественниками синтеза ДГ являются глицеральдегид-3-фосфат и пируват, которые образуются в результате гликолиза из глюкозы, синтезирующейся в процессе фотосинтеза.

Электронно-плотное соединение, содержащееся в тилакоидах стевии в период активного вегетативного роста, идентифицировано как энт-каурен, предшественник ДГ. Помимо этого, энт-каурен является также предшественником гиббереллинов, вероятно поэтому подобные тилакоиды встречали у некоторых видов растений другие исследователи [Steveninck and Steveninck, 1980a,b; Семенова, 1985; Данилова, Кашина, 1999]. Энт-каурен может накапливаться в тилакоидах при определенных условиях, например у короткодневных растений, таких как перилла или стевия, выращиваемых в условиях длинного дня [Данилова, Кашина, 1999; Lady gin, Bondarev et al., 2008; Бондарев и др., 2010а] или у растений, вступающих в фазу цветения [Семенова, 1985, 2005]. Интересно, что содержание гиббереллинов в листьях растений, также как и содержание ДГ, возрастает вплоть до фазы цветения, а потом снижается [Якушкина, 2004].

Таким образом, на основании проведенных нами исследований, с учетом имеющихся данных литературы по МЕР-пути образования изопреноидов [Lichtenthaler, 1997, 1998; Rohmer, 1999], схему компарментации биосинтеза дитерпеноидов можно представить следующим образом (рис. 32).

Дальнейший биосинтез ДГ идет в АЭР, где последовательными реакциями окисления образуются энт-кауренол, энт-кауренал и энт-кауреновая кислота. В этой точке биосинтез ДГ и гиббереллинов расходится [Kim et al., 1996]. Гидроксилированием энт-каурсновой кислоты синтезируется сгевиол, из которого последующими реакциями гликозилирования образуются ДГ, накопление которых осуществляется в вакуолях.

Биосинтез ДГ, находясь в тесной взаимосвязи с биосинтезом гиббереллинов, может воздействовать на пего, а гиббереллины, как известно, участвуют в регуляции роста и развития растений, в том числе формировании регенеративных органов и цветении.

На основании положительной коррелляции между параметрами роста и содержанием ДГ можно предположить, что ДГ служат для защиты растений от членистоногих вредителей и различных патогенных организмов. На эту функцию также указывает то, что ДГ накапливаются в железистых трихомах, которые по мнению некоторых исследователей [Duke, 1994] являются хранилищем защитных веществ от насекомых и патогенов. Наиболее вероятно, что ДГ принадлежат к так называемым полуиидуцибельным соединениям, которые находятся в тканях в виде неактивных предшественников (ДГ), а после соответствующего сигнала превращаются в активное соединение (стевиол).

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплексный метод анализа ДГ, включающий в себя их экстракцию, очистку, разделение и идентификацию.

2. Проанализирован состав и содержание ДГ у разных генотипов интактных и культивируемых in vitro растений стевии. Обнаружено, что:

а) качественный состав ДГ в растениях всех исследованных генотипов одинаков, растения большинства генотипов содержат главным образом ДГ с Р-гликопиранозильными группами: стевиозид и ребаудиозид А, наиболее сладкие и обладающие лучшими вкусовыми качествами, причем основным из них в девяти генотипах является стевиозид, а в одном ребаудиозид А, в то время как растения двух генотипов, накапливающие наибольшее количество ДГ, содержат преимущественно ребаудиозид С - гликозид с а-рамнопиранозилом, обладающий горьковатым привкусом;

б) по величине накопления ДГ вегетативные и регенеративные органы стевии значительно отличаются друг от друга; в порядке убывания содержания ДГ их можно расположить следующим образом: листья, соцветия, стебли, семена, корни; наибольшее содержание ДГ обнаружено в верхних, активно растущих частях побегов, а наименьшее в их нижних фрагментах.

в) в течение онтогенеза в надземных вегетативных органах стевии происходит постепенное накопление ДГ вплоть до начала цветения; в подземных органах, напротив, максимальное содержание ДГ наблюдали в фазу вегетации, в фазу бутонизации оно начинало снижаться, достигая минимума в фазу цветения.

3. Обнаружена сильная положительная корреляция между содержанием ДГ в листьях и некоторыми параметрами роста растений (число и длина побегов, сухая масса листьев). Положительная корреляция между плоидностью и содержанием ДГ опосредована через рост растений. Суммарное содержание ДГ вслед за параметрами роста варьирует под действием внешних факторов, в то время как

состав ДГ и их соотношение являются более устойчивыми признаками, определяющимися генотипом и даже при значительном изменении условий культивирования остаются довольно стабильными.

4. Охарактеризованы морфофизиологические признаки каллусных и суспензионных культур. Показано, что ростовые характеристики культур определяются в большей степени условиями выращивания, затем генотипом донорного растения и в наименьшей мере зависят от эпигенетических особенностей эксплантов.

5. Установлен состав и содержание ДГ в культурах клеток различного генотипического и эпигенетического происхождения. Обнаружено, что:

а) состав ДГ в культурах клеток более беден по сравнению со спектром этих соединений в донорных растениях, гликозиды присутствуют в минорных количествах, причем их содержание в течение цикла роста сильно изменяется;

б) при переходе с поверхностного культивирования к глубинному происходит интенсификация образования ДГ, что обусловлено изменениями структурной организации клеток;

в) корреляция между содержанием ДГ в различных органах донорных растений и полученных культурах клеток практически отсутствует, так как биосинтез ДГ в большей степени зависит от условий культивирования, чем от особенностей эксплантов.

6. Исследованы особенности выращивания культивируемых клеток и растений в условиях биореактора и изучено влияние различных факторов (спектральный состав света, интенсивность облучения, фотопериод, углеводное и минеральное питание, регуляторы роста) на их рост и содержание ДГ. Выявлено преимущество культивирования клеток и растений в биореакторах по сравнению с традиционным выращиванием. Показана возможность регуляции роста и накопления ДГ посредством воздействия этими факторами, наиболее значимым из которых является свет. Процессы биосинтеза ДГ активируются при образовании морфогенных структур и побегов и дальнейшей дифференциации ткани листа и формировании железок.

7. Выявлено, что плотность трихомов выше на поверхности верхних листьев, чем на поверхности нижних, а у растений in vitro ниже, чем у интактных; между числом железок на листьях и уровнем содержания ДГ отмечена положительная корреляция. Железки состоят из трех типов клеток, снижение сложности ультраструктурной организации которых демонстрирует ослабление интенсивности процессов биосинтеза ДГ и последовательность их накопления.

8. Обнаружена положительная корреляция между степенью развития мембран хлоропластов, фотосинтетической активностью и накоплением ДГ в клетках листьев интактных растений и культур in vitro стевии. При выращивании культур клеток и побегов in vitro в темноте, образования ДГ практически не наблюдается, при культивировании на свету формируется мембранная система пластид, происходит их активное функционирование и восстанавление биосинтеза ДГ.

9. Особенности ультраструктурной организации клеток железки, некоторых клеток эпидермы и мезофилла листьев интактных растений, а также клеток миксотрофных каллусных культур (строение пластид, накопление электронно-плотного вещества внутри тилакоидов, развитие АЭР, наличие округлых осмиофильных глобул в цитоплазме и множества вакуолей) свидетельствует об

интенсивности протекания в них биосинтеза ДГ, что коррелирует с их содержание*!.

10. Идентифицировано электронно-плотное соединение, заполняющее внутритилакоидное пространство хлоропластов, представляющее собой энт-каурен, являющийся предшественником ДГ и гиббереллинов.

11. Биосинтез ДГ проходит по МЕР-пути в тилакоидах хлоропластов, откуда энт-каурен, обладающий повышенным сродством к липидной фазе мембран, диффундирует через нее, покидает тилакоиды и пластиду и затем на мембранах АЭР осуществляется дальнейший биосинтез ДГ.

Практические рекомендации

1. Рекомендовать, с целью получения ДГ, для выращивания в открытом грунте в условиях ЦЧР диплоидные генотипы 11 и 19, а для культивирования побегов в биореакторах - генотипы 1 (тетраплоид) и 0 (диплоид), как обладающие наибольшим выходом ДГ.

2. При сортировке сортообразцов в полевых условиях с целью отбора высокопродуктивных по ДГ можно руководствоваться параметрами роста этих образцов, так как биосинтез ДГ коррелирует с ростом растений.

3. Для максимального сбора ДГ, уборку растений стевии, выращиваемых на плантациях, необходимо проводить в конце фазы бутонизации, когда наблюдается оптимальное соотношение биомассы и содержания ДГ.

4. При выращивании побегов стевии в биореакторах с целью размножения необходимо использовать питательную среду, содержащую БАП в концентрации 1.33 цМ, а с целью накопления биомассы и ДГ - безгормональную среду, содержащую 3% сахарозу. Оптимальная интенсивность облучения для роста побегов in vitro и накопления ДГ составляет около 40 Вт/м2, а продолжительность светового дня - 16-20 часов, причем для тетраплоидов необходимы более высокая интенсивность облучения и удлиненный фотопериод.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бондарев Н.И.. Носов A.M. Введение в культуру клеток стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) // «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Материалы 1 Международного симпозиума. Пущино, 1995. С. 169-170.

2. Бондарев Н.И. Оптимизация каллусогенеза и роста в культуре клеток Sievia rebaudiana Bertoni. // «Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования». Тезисы докладов Международной конференции. Воронеж: ВГАУ, 1995. С. 7-8.

3. Бондарев Н.И.. Носов A.M., Корниенко A.B. Влияние фиторегуляторов на рост каллусной ткани стевии (Stevia rebaudiana) // «Регуляторы роста и развития растений» Тезисы докладов IV Международной конференции. М.: РАСХН, 1997а. С. 286.

4. Бондарев Н.И.. Решетняк О.В., Носов A.M. Анализ дитерпеновых гликозидов в культуре клеток стевии (Stevia rebaudiana Bertoni). // «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования». Материалы II Международного симпозиума. Пущино, 19976. Т. 2. - С. 29-30.

5. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Влияние трофических факторов на рост клеток стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) при глубинном культивировании // Материалы II Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Пущино, 1997в. Т. 3. С. 154-155.

6. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Сравнение ростовых параметров суспензионной культуры клеток стевии при выращивании в колбах и ферментере//Тезисы докладов VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". Москва. 1997г. С. 196.

7. Bondarev N.I., Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Diterpenoid glycosides biosynthesis in Stevia rebaudiana tissue culture // World congress on in vitro biology "Defining Cellular Mechanisms in Vitro". Hot Topics. Washington. USA. 1997д. P. 15.

8*. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Влияние факторов культивирования на рост и продуктивность каллусной и суспензионной культур клеток стевии // Биотехнология. 1997е. № 7-8. С.30-37.

9*. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Влияние экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культур клеток Stevia rebaudiana Bertoni.// Физиология растений. 1998. Т. 45. № 6. С. 888-892.

10. Bondarev N.I., Nosov AM. Trophic and hormonal factors influence on Stevia rebaudiana shoots growth in the roller bioreactor. // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 1998. V. 34. № 3 (II). P. 77.

11. Бондарев Н.И. Особенности процессов роста и образования дитерпеновых стевиол-гликозидов в культурах стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro. Автореф. дис____канд. биол. наук. М.: «Биоинформсервис», 1998. 27 с.

12. Бондарев Н.И., Корниенко А.В. Влияние света различного спектрального состава на рост и развитие растений стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro. Труды III Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Москва-Пущино. 1999. С. 265-268.

13. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Влияние регуляторов роста на морфогенез у эксплантов и каллусных культур стевии (Stevia rebaudiana). Тезисы докладов V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений". М.: РАСХН. 1999. Ч. 2. С. 307-308.

14. Бондарев Н.И., Богомолова Н.М. Влияние факторов культивирования на регенерацию растений сахарной свеклы из эксплантов. Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений (ОФР) России и Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия». Москва. 1999. Т. 2. С. 536.

15. Бондарев Н.И. Морфофизиологические характеристики каллусных и суспензионных культур стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) различного происхождения при длительном культивировании. Тезисы докладов Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений". Минск, 1999. С. 26-27.

16. Бондарев Н.И., Богомолова Н.М., Черкасова Н.Н. Регуляция регенерации растений сахарной свеклы из эксплантов. Тезисы докладов II Съезда ВОГИС. С-Пб. 2000. Т. 1.С. 140-141.

17. Бондарев Н.И. Peculiarities of propagation and development of Stevia rebaudiana Bertoni plants in vitro. 9th International Conference of Horticulture. Czech Republik. Lednice. 2001. V. 2. P. 431-433.

18. Бондарев Н.И.. Решетняк О.В., Носов A.M. Особенности роста и образования стевиол-гликозидов в каллусных и суспензионных культурах стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) различного происхождения. Труды IV Международного симпозиума '"Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Москва-Пущино, 2001. Т. 2. 425-427.

19*. Bondarev N.I.. Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Peculiarities of diteфenoid steviol glycoside production in in vitro cultures Stevia rebaudiana. // Plant Sci. 2001. V. 161. P. 155-163.

20*. Bondarev N.I., Reshetnyak O.V., Nosov AM. Features of development of Stevia reabudiana shoots cultivated in the roller bioreactor and their production of steviol glycosides. // Planta Medica. 2002. V. 68. P. 759-762.

21. Суханова M.A., Решетняк O.B., Бондарев Н.И.. Носов A.M., Лобачев В.П., Юртаева Н.М. Качественный и количественный состав дитерпеновых гликозидов линий Stevia rebaudiana Bertoni при различных условиях' выращивания // Материалы I Международной конференции «Растительные ресурсы для здоровья человека (возделывание, переработка, маркетинг)». Сергиев Посад. 2002. С. 54-57.

22. Бондарев Н.И., Решетняк О.В., Носов A.M. Биосинтез дитерпеновых стевиол-гликозидов в гетеро- и мнксотрофных культурах Stevia rebaudiana Bertoni in vitro. Тезисы докладов V съезда ОФР России и Международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии». Пенза. 2003а. С. 505.

23. Бондарев Н.И., Суханова М.А., Решетняк О.В., Носов A.M. Состав и содержание стевиол-гликозидов в надземных и подземных органах Stevia rebaudiana и их динамика в течение онтогенеза. Там же. 20036. С. 379.

24. Суханова М.А., Решетняк О.В., Бондарев Н.И., Носов A.M. Особенности синтеза стевиол-гликозидов в растении Stevia rebaudiana. Там же. 2003в. С. 526.

25. Бондарев Н.И., Ладыгин В.Г., Смолов А.П., Носов A.M. Фотосинтетические характеристики культур стевии in vitro. Тезисы докладов VIII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология". Саратов. 2003г. С. 54-55.

26. Бондарев Н.И. Рост различных линий каллусных культур стевии на протяжении длительного времени. Там же. 2003д. С. 56-57.

27. Бондарев Н.И., Решетняк О.В., Суханова М.А., Носов A.M. Рост растений стевии различных клонов in vivo и in vitro и накопление в них стевиол-гликозидов. Материалы V Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования". Москва-Пущино, 2003е. Т. 1, С. 119-121.

28. Суханова М.А., Решетняк О.В., Бондарев Н.И. Накопление стевиол-гликозидов в растениях Stevia rebaudiana. Материалы Всероссийской конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков". Ярославль. 2003ж. С. 57-58.

29*. Bondarev N.I., Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Effects of nutrient medium composition on development of Stevia rebaudiana shoots cultivated in the roller bioreactor and their production of SGs. // Plant Sci., 2003з. V. 165 (4). P. 845-850.

30*. Bondarev N.I., Sukhanova M.A., Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana Bertoni and its dynamics during ontogenesis.// Biol. Plant. 2004. V. 47. № 2. P. 261-264.

31. Бондарев Н.И. Некоторые результаты и дальнейшие перспективы интродукции стевии (Stevia rebaudiana Bertoni), источника низкокалорийных подсластителей, в Центрально-Черноземном районе. Материалы

Межрегиональной конференции «Устойчивое развитие: экологические проблемы и защита окружающей среды». Старый Оскол: ООО «ТНТ». 2004. С. 112-113.

32. Бондарев Н.И., Решетняк О.В., Носов A.M. Влияние интенсивности света на рост культур Stevia rebaudiana in vitro. Материалы Международной конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений». Саранск: «Мордовский ун-т». 2004. С. 40-41.

33. Бондарев Н.И.. Решетняк О.В., Носов A.M. Влияние интенсивности света и фотопериода на накопление стевиол-гликозидов в культурах Stevia rebaudiana in vitro. I! Материалы VI Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». М.: «РУДН». 2005. Т. 3. С. 234-236.

34. Бондарев Н.И.. Решетняк О.В., Носов A.M. Содержание стевиол-гликозидов в листьях стевии при различных способах культивирования. // «Регуляция продукционного процесса сельскохозяйственных растений». Материалы научно-практической конференции. Орел, 2006. Ч. 1. С. 59-63.

35. Бондарев Н.И., Синявин М.С. Использование биоэлектрических потенциалов растений для анализа общей фитотоксичности питьевой воды и определения степени очистки сточных вод промышленных предприятий // Материалы Всероссийской конференции «Современные проблемы технического, естественнонаучного и гуманитарного знания. Губкин: «Интерфейс». 2007а. 4.1. С. 85-88.

36*. Бондарев Н.И.. Решетняк О.В., Носов A.M. Особенности роста и накопления стевиол-гликозидов у растений Stevia rebaudiana Bertoni различных клонов in vivo и in vitro. // Биотехнология. 20076. № 1. С. 22-28.

37*. Суханова М.А., Бондарев Н.И., Горяева О.В., Андреева С.Е., Носов A.M. Ультраструктурная характеристика клеток растений и каллусных культур Stevia rebaudiana в связи с синтезом стевиол-гликозидов. // Биотехнология. 2007в. № 5. С. 51-59.

38. Ладыгин В.Г., Бондарев Н.И., Носов A.M. Фотосинтетическая способность хлоропластов и синтез стевиол-гликозидов в культурах стевии in vivo и in vitro. Тезисы докладов IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология". Звенигород. 2008. С. 218-219.

39*. Ladygin V, Bondarev N.. Semenova G., Smolov A., Reshetnyak O., Nosov A. Chloroplast ultrastructure, photosynthetic apparatus activities and production of steviol glycosides in Stevia rebaudiana in vivo and in vitro.// Biol. Plant. 2008. V. 52. P. 9-16.

40*. Бондарев Н.И.. Решетняк O.B., Носов A.M. Влияние фотопериода и интенсивности облучения на развитие побегов Stevia rebaudiana in vitro и синтез в них стевиол-гликозидов. //Известия ТСХА. 2008. Вып. 4. С. 102-107.

41*. Бондарев Н.И., Суханова М.А., Г.А. Семенова, Горяева О.В., Андреева С.Е., Носов A.M. Морфология и ультраструктура трихомов ингактных и in vitro растений Stevia rebaudiana Bertoni в связи с образованием и накоплением стевиол-гликозидов // Вестник МГУ. Серия «Биология». 2010а. № 1. С.15-20.

42*. Бондарев Н.И., Решетняк О.В., Носов A.M. Влияние спектрального состава света видимой области и ультрафиолетовой радиации на развитие растений Stevia rebaudiana Bertoni in vitro и биосинтез в них стевиол-гликозидов. // Ученые записки Орловского гос. университета. Серия «Естественные, технические и медицинские науки». 20106. № 4. С. 55-62.

* - Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Подписано в печать 19.09.2011 г. Формат 60x80 1/16 Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times Объём 3 усл. п. л. Тираж 80 экз. Заказ № 64

Отпечатано с готового оригинал-макета на полиграфической базе редакционно-шдательского отдела ФГБОУ ВПО «ОГУ» 302026, г. Орел, ул. Комсомольская, 95 Тел./факс (4862) 74-45-08

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бондарев, Николай Ильич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Дитерпеноиды как одна из важнейших групп изопреноидов (терпеноидов) растений: классификация, строение, биосинтез, функции.

1.2 Особенности и регуляция процессов роста и биосинтеза соединений специализированного обмена в культурах клеток растений.

1.3 Ультраструктура терпеноидпродуцирующих клеток растений.

1.4 Полиплоидия как способ увеличения продуктивности растений.

1.5 Культуры стевии in vitro как модельные системы для изучения закономерностей образования дитерпеноидов.

1.6 Характеристики объектов исследования и синтезируемых ими соединений - дитерпеновых гликозидов.

1.6.1 Характеристика растений Stevia rebaudiana Bertoni.

1.6.1.1 Систематика, морфология, экология, ареал.

1.6.1.2 Особенности размножения и выращивания растений.

1.6.1.3 Состав, содержание и распределение дитерпеновых гликозидов в растении.

1.6.1.4 Другие соединения специализированного обмена стевии.

1.6.1.5 Особенности анатомического строения листа стевии.

1.6.1.6 Влияние внешних факторов на развитие растений и накопление дитерпеновых гликозидов.

1.6.2 Характеристика дитерпеновых гликозидов.

1.6.2.1 Строение и свойства дитерпеновых гликозидов.

1.6.2.2 Биосинтез дитерпеновых гликозидов в клетке.

1.6.2.3 Распространение, функции и биологическая активность дитерпеновых гликозидов.

1.6.2.4 Методы анализа дитерпеновых гликозидов.

1.6.3 Культуры клеток и тканей стевии.

1.6.3.1 Получение.

1.6.3.2 Биосинтез дитерпеновых гликозидов.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Объекты исследования.

2.1.1 Интактные растения стевии и их выращивание.

2.1.2 Получение стерильных растений и культивирование их in vitro.

2.1.3 Индукция каллусогенеза, получение и выращивание каллусных и суспензионных культур.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Изучение особенностей роста культур in vitro.

2.2.2 Исследование ультраструктуры тканей и клеток.

2.2.2.1 Цитолого-анатомический анализ.

2.2.2.2 Цитофотометрия.

2.2.2.3 Сканирующая электронная микроскопия.

2.2.2.4 Трансмиссионная электронная микроскопия.

2.2.3 Выделение хлоропластов и определение фотосинтетических характеристик растений и культур клеток.

2.2.4 Экстракция, очистка и анализ дитерпеновых гликозидов в растительном материале.

2.2.5 Особенности проведения ТСХ и ВЭЖХ и сравнение результатов анализа дитерпеновых гликозидов.

2.2.5.1 ТСХ.

2.2.5.2 ВЭЖХ.

2.2.5.3 Оценка воспроизводимости и сопоставление результатов анализа ДГ, полученных методами ТСХ и ВЭЖХ.

2.2.6 Идентификация ДГ и их предшественников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. СОСТАВ, СОДЕРЖАНИЕ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ В ИНТАКТНЫХ И IN VITRO РАСТЕНИЯХ .'.,.

3.1 Особенности роста растений и аккумуляции в , них дитерпеновых гликозидов в зависимости от морфогенетических особенностей генотипа и условий выращивания.

3.1.1 Интактные растения.;.

3.1.2 Растения in vitro.

3.2 Распределение дитерпеновых: гликозидов в: различных органах интактных растений—.

3.3 Ярусность распределения дитерпеновых гликозидов в надземных вегетативных органах.

3.4 Динамика содержания дитерпеновых гликозидов в вегетативных органах в течение онтогенеза.

Обсуждение.

Глава 4. БИОСИНТЕЗ И НАКОПЛЕНИЕ ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ В КЛЕТКАХ И ИХ ПРОЛИФЕРАЦИЯ ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ И ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ.

4.1 Получение первичных каллусных тканей различного генотипического и эпигенетического происхождения.

4.2 Влияние происхождения экспланта и регуляторов роста на каллусогенез и пролиферацию клеток.

4.3 Морфогенез в культуре эксплантов и каллусной культуре.

4.4 Морфофизиологическая характеристика каллусных и суспензионных культур клеток различного происхождения.

4.4.1 Каллусные культуры.

4.4.2 Суспензионные культуры.

4.5 Состав и содержание дитерпеновых гликозидов в культуре клеток

4.5.1 Каллусные культуры.

4.5.2 Суспензионные культуры.

Обсуждение.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ПРОЦЕССЫ РОСТА, РАЗВИТИЯ И БИОСИНТЕЗА ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ У РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ КУЛЬТУР СТЕВИИ IN VITRO.

5.1 Культуры клеток.

5.1.1 Влияние факторов культивирования на рост каллусной и суспензионной культур клеток.

5.1.1.1 Значимость основных трупп компонентов питательной среды.

5.1.1.2 Влияние углеродного питания.

5.1.1.3 Влияние концентрации минеральных солей.

5.1.1.4 Влияние регуляторов роста.

5.1.1.5 Влияние температурных режимов и освещения.

5.1.1.6 Аппаратурное выращивание суспензионной культуры клеток стевии.

5.1.2 Влияние факторов культивирования на содержание дитерпеновых гликозидов.

5.1.3 Влияние процессов дифференциации в культурах клеток на содержание дитерпеновых гликозидов.

5.2 Растения in vitro.

5.2.1 Влияние способа и условий культивирования на рост и развитие растений стевии и содержание в их органах дитерпеновых гликозидов.

5.2.2 Влияние факторов культивирования на рост растений стевии и накопление в листьях дитерпеновых гликозидов.

5.2.2.1 Влияние углеродного питания.

5.2.2.2 Влияние концентрации минеральных солей.

5.2.2.3 Влияние регуляторов роста.

5.2.2.4 Влияние интенсивности облучения и фотопериода.

5.2.2.5 Влияние спектрального состава света видимой области.

5.2.2.6 Влияние ультрафиолетовой радиации.

Обсуждение.

Глава 6. УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК СТЕВИИ IN VIVO И IN VITRO. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА ДИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ.

6.1 Морфология и ультраструктура эпидермальных образований интактных и in vitro растений.

6.2 Ультраструктура клеток интактных растений и культур in vitro в связи с образованием и накоплением дитерпеновых гликозидов.

6.2.1 Клетки листьев интактных растений.

6.2.2 Клетки листьев растений in vitro.

6.2.3 Клетки этиолированных побегов in vitro.

6.2.4 Клетки гетеротрофных и миксотрофных каллусных культур.

6.3 Идентификация электронно-плотного содержимого тилакоидов стевии.

6.4 Активность фотосинтетического аппарата интактных и in vitro растений, а также культур клеток.

6.4.1 Содержание пигментов.

6.4.2 Интенсивность фотосинтеза.

6.4.3 Активность фотосистем.

Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дитерпеновые гликозиды в интактных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni)"

Актуальность темы. Дитерпеноиды - одна из важнейших групп соединений специализированного обмена высших растений. Особый интерес изучение метаболизма дитерпеноидов приобрело благодаря открытию чуть более 10 лет назад альтернативного метилэритритолфосфатного пути (МЕР-пути) биосинтеза изопреноидов, который функционирует в пластидах наряду с классическим мевалонатным путем (MVA-путем), проходящим в цитозоле [Lichtenthaler et al., 1997; Lichtenthaler, 1998; Пасешниченко, 1998; Rohmer, 1999]. Это поставило перед учеными ряд вопросов, касающихся совместного функционирования этих путей. Однако к настоящему времени метаболизм дитерпеноидов (состав и содержание этих веществ в растении и их динамика в онтогенезе, закономерности и локализация их биосинтеза и накопления) и его регуляция изучены недостаточно. Не ясна также роль многих соединений этой группы в жизнедеятельности растений. Подобные фундаментальные исследования имеют и очевидную практическую значимость, поскольку многие дитерпеноиды являются коммерчески ценными веществами. Некоторые из них обладают уникальными свойствами как, например, обнаруженные в листьях эндемика Парагвая Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae) дитерпеновые гликозиды (ДГ), агликоном которых является стевиол. Эти соединения примерно в 300 раз слаще сахарозы [Kinghorn and Soejarto, 1986]. Они низкокалорийные, характеризуются отсутствием токсичности и мутагенности и практически не усваиваются организмом человека [Tateo et al., 1990; Lyakhovkin et al., 1993; Matsui et al., 1996; Geuns, 2000]. ДГ чрезвычайно перспективны в качестве сахарозаменителей для людей, страдающих от нарушений углеводного обмена и, особенно, для больных диабетом, так как они обладают гипогликемическими свойствами [Gregersen et al., 2004].

Цель исследования - выяснение закономерностей метаболизма дитерпеновых гликозидов и его регуляция в интактных растениях и культурах in vitro Stevia rebaudiana Bertoni. Задачи исследования:

3. Изучение динамики содержания ДГ в онтогенезе растений.

5. Выявление взаимосвязи ростовых процессов с биосинтезом ДГ.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Биосинтез и накопление ДГ проходит в специальных образованиях - железках, а также в некоторых клетках эпидермы и мезофилла растений и клетках миксотрофных каллусных культур.

5. Биосинтез ДГ проходит по МЕР-пути в тилакоидах хлоропластов, откуда предшественник ДГ и гиббереллинов — энт-каурен диффундирует в цитозоль, где на мембранах агранулярного эндоплазматического ретикулума осуществляется дальнейший биосинтез ДГ.

Впервые комплексно изучены закономерности биосинтеза и аккумуляции ДГ в культурах стевии in vitro различного происхождения и проведен сравнительный анализ их образования у объектов, отличающихся по степени дифференциации клеток: суспензионные культуры, гетеро- и миксотрофные каллусные культуры, морфогенный каллус, регенерированные in vitro побеги, растения in vitro. Показано наличие у них штаммовой специфичности в отношении процессов роста и биосинтеза ДГ.

Установлено, что начальные этапы биосинтеза ДГ проходят по МЕР-пути в тилакоидах хлоропластов. Впервые идентифицировано электронно-плотное вещество, которым заполнены тилакоиды стевии в период активного вегетативного роста, представляющее собой энт-каурен -предшественник ДГ и гиббереллинов. Предложена схема компартментации биосинтеза дитерпеноидов в растительной клетке.

Практическая значимость работы. Комплексный метод анализа ДГ в небольшой навеске сухой биомассы необходим для массового определения их состава и содержания, используемого как в научных исследованиях, так и в прикладных работах.

Полученные в процессе исследования данные о 12 генотипах интактных растений стевии вносят существенный вклад в изучение морфологии, анатомии, цитологии, физиологии и биохимии этой перспективной культуры. Результаты исследований существенно дополняют представления о закономерностях роста и образования ДГ в культивируемых клетках и побегах in vitro, необходимые для их практического использования. Получены и разносторонне охарактеризованы 20 штаммов культур клеток, которые будут использованы в дальнейшей работе с целью изучения регуляции биосинтеза ДГ и получения продуктивных клеточных культур.

Существенную практическую значимость имеют ' данные по регуляции роста растений и накопления в их органах дитерпеновых гликозидов при культивировании в биореакторах. Крупномасштабное выращивание свободных от болезней растений стевии в биореакторах перспективно для ее массового микроклонального размножения. Помимо этого, оно служит альтернативой получению растительного сырья на плантациях для извлечения из него ценных ДГ.

Совокупность экспериментальных данных и теоретические обобщения необходимы для успешного районирования стевии в России и являются методологической и экспериментальной основой направленной модификации растений в растениеводстве и селекции. Знание закономерностей метаболизма ДГ в растениях принципиально важно для более полного использования потенциала растений с целью получения этих соединений при выращивании в открытом и закрытом грунте.

Пенза, 2003), Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 1999), II съезде ВОГИС (Санктit.

Петербург, 2000), 9 International Conference of Horticulture (Czech Republik, Lednice, 2001), Международной конференции «Растительные ресурсы для здоровья человека: возделывание, переработка, маркетинг» (Москва-Сергиев Посад, 2002), Всероссийской конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003), Межрегиональной конференции «Устойчивое развитие: экологические проблемы и защита окружающей среды» (Старый Оскол, 2004), Международной научной конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004), Международной конференции «Регуляция продукционного процесса сельскохозяйственных растений» (Орел, 2006).

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность доктору биол. наук, профессору Носову Александру Михайловичу за постоянное внимание к работе, критическое обсуждение результатов и поддержку. Автор сердечно признателен к.ф.н. Решетняк О.В. за помощь при проведении ВЭЖХ-анализа и к.б.н. Сухановой М.А. за содействие в проведении электронно-микроскопических исследований. Автор также искренне благодарен всем коллегам, принимавшим участие в обсуждении полученных результатов.

Принятые сокращения и обозначения:

Среда МС - среда Мурасиге и Скуга [МигазЫ§е, 1962]);

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;

НУК - а-нафтилуксусная кислота;

ИУК - 3-индолилуксусная кислота;

ИМК - 3-индолилмасляная кислота;

БАП - 6-бензиламинопурин;

К - кинетин (6-фурфуриламинопурин);

2-1Р - изопентен-2ил-аденин;

ГК - гибберелловая кислота;

ДГ - дитерпеновые стевиол-гликозиды;

М, Мс - сухая и сырая масса клеток, соответственно, г/л;

N - число клеток, кл/мл;

V - жизнеспособность клеток, %;

Э - концентрация сахарозы в среде, г/л;

X - удельная скорость роста в экспоненциальной фазе, сутки"1; У - экономический коэффициент по сахарозе; Т - время удвоения, сутки;

П - продуктивность клеток по биомассе, г/л в сут.;

С - содержание ДГ;

1м - индекс роста по сухой биомассе;

1Мс - индекс роста по сырой биомассе;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ЭПР - эндоплазматический ретикулум;

АГ - аппарат Гольджи;

РЦ ФС1 и ФСП - реакционные центры фотосистем I и II; МЕР - 2-С-метил-0-эритритол-4-фосфат; MVA - мевалоновая кислота;

ATP, СТР - аденозинтрифосфат и цитозинтрифосфат;

IPP, DMAPP - изопентенил- и диметилаллилдифосфат,

GAP - D-глицеральдегид-З-фосфат,

DXP - 1-деокси-0-ксилулоза-5-фосфат,

GGPP - геранилгеранилдифосфат, энт-СРР - энт-копалилдифосфат.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бондарев, Николай Ильич, Орел

1. Ануфриева Э.Н. Ростовые и биосинтетические характеристики культур клеток Serratula coronata и Ajuga reptans - продуцентов экдистероидов. // Автореферат дис. .канд. биол. наук. М., 1997. 26 с.

2. Ануфриева Э.Н., Володин В.В., Носов A.M., Гарсиа М. Лафон Р. Состав и содержание экдистероидов в растениях и культуре ткани Serratula coronata. II Физиол. раст. 1998, Т. 45. С. 382-389.

3. Атанасов A.B. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: «ИЦ и Г СО РАН», 1993. 241 с.

4. Батурина И.А. Культивирование стевии с использованием метода светокультуры для создания продуктов функционального питания. Автореф. дис. . канд. с/х наук. Красноярск, 2005.

5. Баширова P.M., Усманов И.Ю., Ломаченко Н.В. Вещества специализированного обмена растений (Классификация. Функции) / Уфа. Башкирск. ун-т. 1998. 160 с.

6. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко A.B. Влияние факторов культивирования на рост и продуктивность каллусной и суспензионной культур клеток стевии // Биотехнология. 1997. № 7-8. С.30-37.

7. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко A.B. Влияние экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культур клеток SteviarebaudianaBQrioni.ll Физиология растений. 1998. Т. 45. С. 888-892.

8. Бондарев Н.И. Особенности процессов роста и образования дитерпеновых стевиол-гликозидов в культурах стевии (<Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro. Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: «Биоинформсервис», 1998. 27 с.

9. Бондарев Н.И., Решетняк О.В., Носов A.M. Особенности роста и накопления стевиол-гликозидов у растений St evict rebaudiana Bertoni различных клонов in vivo и in vitro. II Биотехнология. 2007. № 1. С. 22-28.

10. Бреславец Л. П.,Полиплоидия в природе и опыте. М.: Изд-во АН СССР. 1963.364 с.

11. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.: "Наука", 1975, С. 1-50.

12. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука. 1986. С. 3-20.

13. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

14. Васильев А.Е. Особенности эндоплазматического ретикулума в выделительных клетках борщевика. // Цитология. 1969. Т. 11. N 3. С. 298-307.

15. Васильев А.Е. О локализации синтеза терпеноидов в растительной клетке. Растит, ресурсы. 1970. Т. 5. N. 1. С. 29-44.

16. Васильев А.Е. Микротела. Липидные капли. Мультивезикулярные тела. Микротрубочки: Атлас ультраструктуры растительных клеток. Петрозаводск, 1972. С. 190-199.

17. Васильев А.Е. Функциональная морфология секреторных клеток растений. Л.: Наука, 1977. 208 с.

18. Васильев А.Е. Секреторные структуры: Атлас ультраструктуры растительных тканей. Петрозаводск: Карелия, 1980. С. 235-282.

19. Васильева И.С., Пасешниченко В.А. Стероидные гликозиды культуры клеток Dioscorea delltoidea Wall. // Докл. АН СССР. Сер. Физиол. Растений. 1987. Т. 295. №з. С. 767-768.

20. Васильева И.С. Строение и биосинтез стероидных гликозидов растения и культуры клеток диоскореи. // Автореф. дисс. на соиск. уч. степени канд. биол. наук. М., 1989.

21. Воллосович А. Г., Бутенко Р. Г. Культура ткани раувольфии змеиной как продуцента алкалоидов. // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука. 1970. С. 253-257.

22. Володин В.В. Экдистероиды в интактных ратениях и культурах клеток// Автореф дис.д-ра биол. наук. М.:ИФР РАН, 1999. 52 с.

23. Воробьев А. С. Культура клеток диоскореи дельтовидной как продуцент фурастаноловых сапонинов. // Автореферат дис. . канд. биол. наук. М.:НИИБиохиммашпроект, 1991,-26 с.

24. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений. В сб.: Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986, С. 91- 102.

25. Гамалей Ю.В. Мезофилл. Флоэма. / Атлас ультраструктуры растительных тканей. Петрозаводск: Карелия, 1980. С. 97-126, 187-220.

26. Гамбург К. 3., Рекославская Н. И., Швецов С. Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука, 1990. 243 с.

27. Геринг X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении. В сб.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. С. 197-200.

28. Городнянская JI. М., Пучинина Т. Н., Воллосович А. Г. Гистохимическое исследовние культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. Раст. ресурсы. 1984. Т. 20: Вып. 2. С. 218-224.

29. Гудвин Т.В., Мерсер Э.И. Введение в биохимию растений. М.: «Мир». 1986. Т. 2. 312 с.

30. Гуриелидзе К.Г., Пасешниченко В.А., Васильева И.С. Обнаружение олигофуростанозидспецифической ß-глюкозидазы в листьях Dioscorea deltoidea. // Докл. АН СССР. 1986. Т. 286. № 3. С. 754-756.

31. Данилова М.Ф., Кашина Т.К. Фотопериодизм, развитие листа и диморфизм тилакоидов хлоропластов Perilla ocymoides // Физиол. раст. 1995. Т. 42. С. 14-22.

32. Данилова М.Ф., Кашина Т.К. Структурные основы актиноритмической регуляции цветения. СПб.: Наука, 1999. - 218 с.

33. Денисова Г.А. Терпеносодержащие структуры растений. JL: Наука. 1989. 141 с.

34. Дзюба O.Ol Стевия Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley Интродукция, морфология, биология, возделывание // Автреф. дис. канд. биол. наук С-Пб.: «ВНИИ им. Н.И. Вавилова». 1999. 15 с.

35. Долгих Ю.И. Генетическая изменчивость по признаку температурочувствительности в культуре клеток женьшеня. // Автореф. дис. канд. биол. наук. М.:Ин-т общей генетики АН СССР, 1986. 19 с.

36. Ермаков Е.И., Кочетов A.A. Рост и продуктивность стевии в регулируемых условиях в зависимости от фотопериода и интенсивности света // Докл. РАСХН, 1994, N 6. С. 7-8.

37. Ершов Ю.В. Метилэритритолфосфатный (немевалонатный) путь биосинтеза изопреноидов. // Успехи биол. химии, Т. 45. 2005. С. 307-354.

38. Журавлева Д.А., Галынкин В.А., Слепян Л.И. Исследование влияния элиситоров на штамм женьшеня // Тез. докл. VII Междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда", 25-28 ноября 1997 г., Москва. 1997. С. 32.

39. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Фенольные соединения каллусных культур чайного растения и возможность регуляции их образования. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука. 1986. С. 49-52.

40. Загоскина Н.В., Усик Т.У., Запрометов Н.М. Влияние длительности освещения на фенольный метаболизм* фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения.//Физиол. раст. 1990. Т. 37. N6. С. 1089-1095.

41. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения: некоторые аспекты образования полифенолов. // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука. 1991. С. 3235.

42. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. С. 37-50.

43. Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений: биосинтез, превращение и функции. Новые направления в физиологии растений. М.: Наука. 1985.

44. Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В. Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллюсной культуре чайного растения. Физиол. раст. 1986. т. 33. N2. С. 356-364.

45. Запрометов М.Н., Загоскина H.B. Еще об одном доказательстве участия хлоропластов в биосинтезе фенольных соединений // Физиол. раст. 1987. т. 34. N. 1. С. 165-172.

46. Казакова Е.А., Состав пигментов каллуса картофеля и регенерантов в онтогенезе, Бюл. ВИР. 1990. т. 204. С. 70-75.

47. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культурытканей в физиологии и биохимии растений. Киев. "Наукова думка". 1980. 488 с.

48. Карначук P.A., Головацкая И.Ф. Гормональный статус, рост и фотосинтез растений, выращенных на свету разного спектрального состава // Физиол. раст. 1998. Т. 45. С. 925-934.

49. Карначук P.A., Гвоздева Е.С., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Биотехнология и генная инженерия растений. Томск: Томский гос. ун-т; ИД «СКК-Пресс». 2006. 256 с.

50. Каухова И.Е., Воллосович А.Г., Цыганова В.А. Выбор питательной среды для глубинного культивирования тканей раувольфии змеиной. // Растит, ресурсы. 1981. Т. 17. Вып. 2. С. 217-224.

51. Кирьян И. Г., Мазин В. В. Получение каллусной культуры стевии. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования. Пущино. 1995. С. 548-549

52. Кислов Л: Д., Кузовкина И. Н. Вторичный метаболизм культуры тканей Boenninghausenia albiflora Reichb. // Культура клеток растений и биотехнология. Москва. Изд-во «Наука». 1986. С. 66-69.

53. Князьков И.Е., Лобанова Е.С., Носов A.M. // Физиология растений. 1994. Т. 41. № 6. С. 896-902.

54. Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук C.B., Комиссаренко А.Н. Антигрибковая активность некоторых природных флавоноидов, фуранохромонов, кумаринов и антрахинонов // Раст. ресурсы. 1991. Т. 27, Вып. 1'. С. 3-10.

55. Комиссаренко Н.Ф., Деркач А.И., Ковалев И.П., Бублик Н.П., Черменева Г.А., Котов А.Г., Зинченко В.В. Дитерпеновые гликозиды и фенилпропаноиды листьев Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae) // Раст. ресурсы. 1994. Т. 30 (1-2), с. 53-64.

56. Константинова H.A., Александрова И.В. Изменение pH среды в процессе роста суспензионной культуры Panax ginseng С. А. Меу. // Тезисы докладов III Всесоюз. конф. по культуре клеток растений. / Под ред. Бутенко Р.Г., Абовян, 1979, с. 30 31.

57. Корецкая Т. Ф., Запрометов M. Н. Культура тканей чайного растения (Camellia sinensis) как модель для изучения условий образования фенольных соединений // Физиология растений. 1975. Т. 22. С. 282-288.

58. Корнилова О.В., Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Стевия -продуцент низкокалорийных соединений заменителей сахара. / II Междунар. симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования». Пущино, 1997. Т. 2. С. 53-55.

59. Кузовкина И., Баумерт А., Кислов Л., Грегер Д., Смирнов A.M. Влияние триптофана на биосинтез акридиновых алкалоидов в культуре клеток Ruta graveolens L. Изв. АН СССР. Сер. биол. 1987. N. 1. С. 62-69.

60. Кутас E.H. Влияние интенсивности света на анатомическую структуру листа культур in vitro Vaccinium corymbosum. Тезисы докладов II конф. Белорусского общества физиологов растений. Минск. 1995. С. 21-22

61. Кутас E.H. Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной. Автореф. дис. .док. биол. наук, М. 1997. 34 с.

62. Ладыгин В.Г. Замыкающие клетки устьиц, пластиды и пыльцевые зерна диплоидных и татраплоидных гречих // Генетика. 1965. Т. 1. № 6. С. 127-131.

63. Ладыгин В.Г., Климов В. В., Шувалов В. А., Тагеева С. В. Характеристика реакционных центров в мутантах трех типов с неактивными фотосистемами. // Физиол. раст. 1976. Т. 23. С. 681-689.

64. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Влияние дефицита железа на состав хлорофилл-белковых комплексов и ультраструктуру хлоропластов гороха // Физиол. раст. 1993. Т. 40. С. 841-849.

65. Ладыгин В.Г. Структурно-функциональная организация фотосистем в хлоропластах Chlamydomonas reinhardtii II Физиол. раст. 1998. Т. 45. С. 741-762.

66. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А. Функциональная активность и структура хлоропластов листьев гороха в условиях корневой гипоксии и аноксии // Известия АН. Сер. биол. 1999. № 2. С. 168-174.

67. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Смолов А.П. Влияние аммония и нитрата питательной среды на ультраструктурную организацию и фотосинтез клеток каллуса Glycine max. L. // Цитология. 2003. Т. 45. № 4. С. 380-386.

68. Ладыгин В.Г. Участие пигмент-белковых комплексов фотосистем в формировании и пространственной ориентации тилакоидов в хлоропластах гороха. //Биол. мембраны. 2003. Т. 20. № 6. С. 451-463.

69. Лакин Г.Ф. Биометрия М: Высш. шк., 1990 -350 с.

70. Леман В.М. Культура растений при электрическом свете (светокультура растений). М.: «Колос», 1971.

71. Лобов В. П., Юртаева Н. М., Роль фитогормонов в регуляции каллусообразования Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni // Биология культивируемых клеток и биотехнология / Под ред. Бутенко Р. Г., Алматы, 1993. С. 182.

72. Ляховкин А.Г.,Лон Ч.Д.,Ань М.Ф. и др. Медовая трава {Stevia rebaudiana Bertoni) во Вьетнаме. Ханой. 1992.29 с.

73. Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии. М., Изд-во МГУ. 1980. 280 с.

74. Максимов В.Н., Семенова Е.В. Применение методов планирования многофакторного эксперимента при оптимизации состава питательной среды для накопления биомассы бактерий / Избранные задачи большого практикума по микробиологии. М.: МГУ, 1991, С. 4-28.

75. Максимов Г. Б., Гамбург К. 3., Акимова Г. П., Леонов Л. А. Влияние гиббереллина на рост каллусной ткани табака в суспендиальной культуре // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений / М.: Наука. 1970. С. 203-204.

76. Методы общей бактериологии. Т. 2. Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. 472 с.

77. Мошков Б.С. Актиноритмизм растений. М.: «Агропромиздат». 1987. 272 с.

78. Носов А.М., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток диоскореи дельтовидной // Культура клеток растений и биотехнология. М.: "Наука". 1986. С 76-79.

79. Носов А. М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука. 1991. С. 5-20.

80. Носов A.M. Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаноловых гликозидов. // Автореферат дис. д-ра биол. наук. М.: НИИ Биохиммашпроект, 1992, 44 с.

81. Носов А. М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиол. раст. 1994. Т. 41. N. 6. С. 873-878.

82. Носов A.M. Вторичный метаболизм. В сб.: Физиология растений, под ред. Ермакова И.П. М.: «Академия», 2005. С. 588-619.

83. Орлова И. В., Носов A.M., Лукша В.Г., Володин В.В. Синтез экдистероидов в растениях и культурах клеток Rhaponticum carthamoides Willd (Iljin) // Физиол. раст. 1994. Т. 41. N. 6. С. 907-912.

84. Орлова И. В. Регуляция процессов роста и биосинтеза экдистероидов в культуре клеток левзеи сафлоровидной. // Автореферат дис. канд. било. наук. М.: МГУ. 1993. 24 с.

85. Пасешниченко В.А. Регуляция биосинтеза терпеноидов и стероидов у растений и животных. // Успехи биологической химии. М.: Наука. 1985. Т. 26. С. 246-268.

86. Пасешниченко В.А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов: Итоги науки и техники. Сер. Биологич. химия. М.: ВИНИТИ, 1987. Т. 25. 196 с.

87. Пасешниченко В.А. Терпеноиды и стероиды в жизни растений. // Успехи биологической химии. М.: Наука. 1991. Т. 32. С. 197-220.

88. Пасешниченко В.А. Успехи в изучении физиологической активности терпеноидов и стероидов. // Биохимия. 1992. Т. 57. № 7. С. 986-1003.

89. Пасешниченко В.А. Регуляция терпеноидного биосинтеза в растениях и его связь с биосинтезом фенольных соединений. // Физиол. раст. 1995. Т. 42. № 5. С. 787-804.

90. Пасешниченко В.А. Новый альтернативный путь немевалонатный путь биосинтеза изопреноидов у эубактерий и растений. //Биохимия. 1998 Т. 63. Вып. 2. С. 171-182.

91. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений М: Агропромиздат, 1988 -271 с.

92. Пахлавуни И. К., Хайбуллина JI. А., Серебрякова В. Н. Каротиноиды и ультраструктурные особенности хлоропластов двух клеточных линий Mandragora turcomanica (Solanaceae) // Физиол. раст. 2000. Т. 47. С. 43-52.

93. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.:Мир, 1978, - 331 с.

94. Племенков В.В. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001.-376 с.

95. Рабинович С.А., Смирнов A.M. Алкалоиды каллусных тканей Papaver bracteatum.H Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986, С. 63-69.

96. Рабинович С. А., Кузовкина И. Н. Действие стрессовых факторов на биосинтез бензофенантридиновых алкалоидов в: культуре клеток мака прицветникового // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука. 1991. С. 20-25.

97. Ревина Т.А. Карначук Р.А., Тайлашева Т.Я. Динамика содержания экдистерона в надземной части Serratilla coronata L. и влияние на него, света разного спектрального состава // Раст. pee. 1986. Т. 22. С. 70-72. . ' . . .

98. Ржержабек Й., Горелова О. А. Влияние количества и формазота на рост клеток и накопление стероидных, соединений в суспензионной культуре Solanum laciniatum--A.it. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука. 1986. С. 70-76.

99. Сапко О. А., Мухамеджанов Б. Г., Кунаева Р. М. Образование фенольных соединений в культуре ткани верблюжьей; колючки (Alhagi kirgisorum). // Тез. докл. Междунар. конф. "Биология- культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск. 1988. С. 73.

100. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды: Пер. с англ. / Под ред., с предисл. и дополн. В. Г. Дебабова. М.: «Мир». 1987. 411 с.

101. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений. — Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 2000. — 664 с.

102. Семенова F.A. Электронно-плотное вещество в клетках мезофилла листа картофеля. // Физиол. раст. 1985. Т. 32 (3) С. 461-464.

103. Суханова М.А., Бондарев Н.И., Горяева О.В., Андреева С.Е., Носов A.M. Ультраструктурная характеристика клеток растений и каллусных культур Stevia rebaudiana в связи с синтезом стевиолгликозидов. //Биотехнология. 2007. №5. С. 51-59.

104. Тараканов И.Г., Цзюньхун Ван. Реакция растений горчицы сарептской на соотношение красного и дальнего красного света в спектре физиологической радиации // Известия ТСХА, 2007. Вып. 2. С. 94-98.

105. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. Пер. с англ. М: Мир, 1984. 512 с.

106. Холина А. Б., Журавлев Ю Н., Булгаков В. П., Ожигова И. Т., Елькин Ю. Н. Получение и характеристика каллусной культуры Thalictrum minus L. // Раст. ресурсы. 1991. Вып. 4. С. 81-86.

107. Холодова В.П. Рост и метаболизм углеводов в культуре ткани растений / Культура клеток растений. М.: Наука, 1981, С. 51-68.

108. Цанава В.П., Сарджвеладзе Г.П., Харебава Л.Г. Исследование летучих соединений двулистника сладкого. // Субтропические культуры. 1989. N3. С. 72-77.

109. Шлык А.А. Метаболизм хлорофилла в зеленом растении. Минск: «Наука и техника» 1965. 396 с.

110. Шульгин И.А. Растение и солнце. Л.: Гидрометеоиздат, 1973.

111. Шульгин И.А. Лучистая энергия и энергетический баланс растений. М.: Альтекс, 2004.

112. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: «Мир». 1980.

113. Afolayan A. J. and Meyer J J. Morphology and ultrastructure of secreting and nonsecreting foliar trichomes of Helichrysum aureonitens (.Asteraceae). // Int. J. Plant Science. 1995. V. 156 (4). P. 481-487.

114. Ahmed M.C. and Dobberstein R.H. Stevia rebaudiana II. Highperformance liquid chromatographic separation and quantitation of stevioside, rebaudioside A and rebaudioside C. // J. Chromatogr. 1982. V. 236. P. 523-526.

115. Ahmed M.C. and Dobberstein R.H. Stevia rebaudiana III. Highperformance liquid chromatographic separation and quantitation ofrebaudioside B, D, and E, dulcoside A, and steviolbioside. // J. of Chromatography. 1982. V. 245. P. 373-376

116. Akita M., Shigeoka T., Koizumi Y. and Kawamura M. Mass propagation of shoots of Stevia rebaudiana using a large scale bioreactor // Plant Cell Repts. 1994. V. 13. P. 180-183.

117. Albertsson, P.A.A.: Quantitative model of the domain structure of the photosynthetic membrane. // Trends Plant Sci. 2001. V. 6. P. 349-354.

118. Alvarez M, Bazzote R.B.G., Cury R., Bottion L.M. Efeito do extrato aquoso da Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni sobre parametros bioquimieos de pessoas adultas normais. // Arg. Biol. Technol. 1981. V. 24(1). P. 77.

119. Alves L.M. and Ruddat M. The presence of gibberellin A20 in Stevia rebaudiana and its significance for the biological activity of steviol // Plant & Cell Physiol. 1979. V. 20. N 1. P. 123-130.

120. Anderson L.A., Hay C.A., Roberts M.F., Phillipson J.D. Studies on Ailanthus altissima cell suspension cultures. Precursor feedingof L-methylene-14C. tryptophan and L-tryptophan. // Plant Cell Rep. 1986. V. 5. N 5. P. 387390.f

121. Arigoni D., Sagner S., Latzel C.3 Eisenreich W., Bacher A. and M.H. Zenk. Terpenoid biosynthesis from 1-deoxy-D-xylulose in higher plants by intra molecular skeletel rearrangement. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 10600-10605.

122. Arnon D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts polyphenoloxidase in Beta vulgaris. // Plant. Physiol. 1949. V. 24. P. 1-15,

123. Ayabe S., Udagawa A., Furuya T. Stimulation chalcone syntase activity by yast extract in cultured Glycyrriza echinata cells and 5-deoxeflavanine formation by isolated protoplasts // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. N l.P. 35-38.

124. Bailey C.M., Nicholson H., Stafford A., Smart N.J. A model for the biosynthesis of indole alkaloids by cell suspensions of Catharanthus roseus G. Don Appl. Biochem. and biotechnol. 1986 V. 12. N 3. P. 215-227.

125. Banthorpe D.V. and Brown G.D. Two unepected coumarin derivatives from tissue cultures of Compositae species. // Phytochem. 1989. V. 28. N11. P. 3003-3007.

126. Banthorpe D.V., White J.J. Novel anthraquinones from undifferentiated cell cultures of Galium verum. II Phytochem. 1995. V. 38. N 1. P. 107-111.

127. Baumert A., Maier W., Schumann B., Oroger D. Increased accumulation of acridon alkaloids by cell suspension cultures of Ruta graveolens in response to elicitors. // J. Plant Phisiol. 1991. V. 139. N 2. P. 224-228.

128. Bearder J.R., MacMillan J., Wels C.M. and Phinney B.O. The metabolism of steviol to 13-hydroxylated ent-gibberellins and ent-kaurenes. // Phytochemistry. 1975. V. 14. P. 1741-1748.

129. Berglung T., Ohlsson A.B., Rydstrom J. Nicotinamide increases glutathione and anthocyanin in tissue culture of Catharanthus roseus. II J. of Plant Physiol. 1993. V. 141. N 5. P. 596-600.

130. Berlin J., Forche E., Wray V., Hammer J., Hosel W. Formation of benzophenanthridine alkaloids by suspension cultures of Escholtzia californica.il Z. Naturforsch., 1983, 38, P 346-353.

131. Bianco-Colomas J., Hugues M. Establishment and characterization of a betacyanin producing cell line of Amaranthus tricolor. Inductive effect of light and cytokinin. // J. of Plant Physiol. 1990. V. 136. N. 6. P. 734-739.

132. Bolwell G.P., Cramer C.L., Lamb C.J., Schuck W., Dixon R.A. L-Phenylalanine ammonia-lyase from Phaseolus vulgaris'. Modulation of the levels of active enzyme by trans-cinnamic acid // Planta. 1986. V. 169. N 1. P. 97-107.

133. Bondarev N.I., Sukhanova M.A., Reshetnyak O.V., Nosov A.M. Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana Bertoni and its dynamics during ontogenesis.// Biol. Plant. 2004. V. 47. № 2. P. 261-264.

134. Breuling M., Altermann A.W., Rienhard E. Cultivation of cell cultures of Berberis wilsonae in 20 1 airlift bioreactors. // Plant Cell Rep. 1985. N4. P. 220-223.

135. Callebaut-A., Hendrix G., Voest A.M., Motte J.C. Anthocyanins in cell cultures of Ajuga reptans. II Phytochem. 1990. V. 29. N 7. P. 2153-2158.

136. Castaneda J.L., Quintero A. Activity by light in Comprena globosa tissue culture. // Fyton. 1991. V. 52. N 2. P. 151-154.

137. Chi Bao Do, Cormoer, F. Effects of high ammonium concentrations on growth & anthocianin formation in grape (Vitis vinifera L.) cell suspension cultured in a production medium. I I Plant Cell and Organ Culture. 1991. V 27. N2. P. 169-174.

138. Conner A. Differential solasodine accumulation in photoautotrophic and heterotrophic tissue cultures of solanum. // Phytochemistry. 1987. 26.N 10. P. 2749-2750.

139. Courtois D., Guern J. Temperature response of Catharanthus roseus cells cultivated in liquid medium. // Plant Sci. Letters. 1980. V. 17. N 4. P. 473-482.

140. Cyunel E. Basella alba L.: in vitro culture and the production of betalains. // Med. and Aromat. Plants. 2. Berlin. 1989. P. 47-68.

141. Damsz, B., Mikulska E. Ontogenesis of photosynthetic membranes in the plastids of Cattleya sp. leaves grown in the light. // Biochem. and Physiol. Pflanzen. 1976. V. 169. № 3. P. 257.

142. Darise M., Kohda H., Mizutani K., Kasai R. and Tanaka O. Chemical constituents of flowers of Stevia rebaudiana Bertoni // Agric. Biol. Chem. 1983. V. 47. N 1. P. 133-135.

143. Datta S.K., Do Sibaprasad. Organ specific chemodifferentiation of cardenolides of Calotropis gigantea in vitro. U Beitr. Biol. Pflanz. 1986. 61. N 2. P. 315-319.

144. Deus-Neumann B., Zenk M.N. Instabilyty of indole alkaloid production in Catharanthus roseus cell suspension cultures. // Planta med. 1984. V. 50. N5. P. 421-431.

145. Dobberstein R.H. Ahmed M. S. United States Patent. 1982. N 4,361,697.

146. Dougall D.K., Weyrauch K.W.Growth and anthocyanin production by carrot suspension cultures grown under chemostat conditions with phosphate as the limiting nutrient. II Biotechnol Bioeng., 1980, V 22. P. 337-352.

147. Duke S.O. Plant terpenoids as pesticides. / In Keller R.F., Tu A.T., eds. Handbook of natural toxins. Toxicology of plant and fungal compounds. Dekker, New York. 1991. V. 6. P. 269-296.

148. Duke S.O., Paul R.N. Development and fine structure of the glandular trichomes of Artemisia annua L. // Int. J. Plant Science. 1993. V. 154. P. 107-118.

149. Duke S.O. Glandular trichomes a focal point of chemical and structural interactions. //Int. J. Plant Science. 1994. V. 155(6). P. 617-620.

150. Eisenrcich W., Menhard B. Hylands P.J., Zenk M.H. and Backer A. Studies on the biosynthesis of taxol: the taxane carbon skeleton is not of mevalonoid origin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 6431-6436.

151. Eisenreich W., Sagner S., Zenk M.H. and Bacher A. Monoterpenoid essential oils are not of mevalonate origin. // Tetrahedron Lett. 1997. V. 38. P. 3889-3892.

152. Endo T., Goodbodi A., Misava M. Alkaloid production in root and choot cultures of Catharanthus roseus. II Planta Med. 1987. V. 53. N 5. P. 479482.

153. Ferreira C. M. and Handro W. Some morphogenetic responses in leaf explants of Stevia rehaudiana cultured in vitro // Revta brasil. Bot. 1987. V. 10. P. 113-116.

154. Fidgeon C., Wilson G. Growth regulation of Gallium mollugo L. cell suspensions by a-naphtalene acetic acid // J. Exp. Bot. 1987. V. 38. N 194. P. 1491-1500.

155. Fiscer H., Romer A., Ulbrich B., Arens H. A new biscoumarin glucoside ester from Ruta chalepensis cell cultures.//Planta Med., 1988, V 54, N 5, P. 398-400.

156. Frischknecht P.M. Baumann T.W. Stress induced formation of purine alkaloids in plant tissue culture of Coffea arabica. Phytochemistry. 1985. V. 24. N 10. P. 2255-2257.

157. Fry S. C., Street H. E. Gibberellin-sensitive suspension cultures // Plant Physiol. 1980. V. 65. N 3. P. 472-477.

158. Fukui Hiroshi, Tani Masato, Tabata Mamoru. Induction of shikonin biosynthesis by endogenous polysaccharides in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures. // Plant Cell Rep. 1990. V. 9. N 2. P. 73-76.

159. Geuns J.M.C. Safety of stevia and stevioside. // Recent Res. Dev. Phytochem. 2000. V. 4. P. 75-88.

160. Geuns J.M.C., Buyse J., Vankeirsbilck A., Temme E.H.M. Metabolism of stevioside by healthy volunteers. // Exp. Biol. Med. 2007. V. 232. P. 164-173.

161. Godjy-Hernandez G., Loyola-Vargas V.M. Effect of fungal homogenate, enzyme ingibitors and osmotic stress on alkaloid content of Catharanthus roseus cell suspension cultures. // Plant Cell Rep. 1991. V. 10. N 10. P. 537-540.

162. Gregersen S., Jeppesen P.B., Hoist J.J., Hermansen K. Antihyperglycemic effects of stevioside in type 2 diabetic subjects. // Metab. Clin. Exp. 2004. V. 53. P. 73-76.

163. Handro W. and Ferreira C.M. Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni: Production of Natural Sweeteners // Med. and Aromat Plants. 1989. N 2. P. 468487.

164. Hara M., Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. Enhancement of berberine production by spermidine in Thalictrum minus cell suspension cultures. // Plant Cell Rep. 1991. V. 10. N 10. P. 494-497.

165. Hashimoto Y., Moriyasu M., Nakamura S., Ishiguro S. and Komuro M. High-performance liquid chromatographic deternination of stevia components on a hydrophylic packed column. // J. Chromatography. 1978. V. 161. P. 403-405.

166. Hayashi, T., Okamura, K., Kawasaki, M., Morita, N. Two chemotypes of Scoparia dulcis in Paraguay. // Phytochem. 1991. V. 30. P. 3617-3620.

167. Heble M.R., Narayanaswammi S., Chadha M.S. Tissue differentiation and plumbagin synthesis in variant cell strains of Plumbago zeylanica // Plant Sci. Let. 1974. V. 2. P. 405-409.

168. Hirose M., Yamakawa T., Kodama T., Komamine A. Accumulationof betacyanin in Phytolacca cells and anthocyanin in Vitis sp. cells in relation toicell division in suspension cultures. Plant and Cell Physiol. 1990. V. 31. N 2. P. 267-271.

169. Hohmann B. 1978. Botanisch-warenkudliche Diognostik von Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl., einer suPstoffliefernden Pflanze // Deutsche Lebensmittel-Rundschau. 74. № 8. 296-299.

170. Hsing Y.I., Su W.F., Chang W.C. Accumulation of stevioside and * rebaudioside A in callus cultures of Stevia rebadiana Bertoni. Bot. Bull Acad. Sin. 1983. V. 24. P. 115-119.

171. Ikuta A., Itokawa H. Berberine: production through plant (Thalictrum sp.) cell cultures. //Med. and Aromat. Plants. 2. 1988. P. 129-134.

172. Israel H.W., Steward F.C. The fine structure and development of plastids in cultured cells of Daucus carota. Ann. Bot. 1967. № 31. P. 1-18.

173. Iwamura J., Kinoshita R. and Hirao N. Hydrolysis of stevioside and determination of total stevioside with dual-wavelength TLC scanner. // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1980. V. 54. N 3. P. 195-200.

174. Iwamura J., Komai K. Diterpene glycosides as plant growth regulators. Kiki Univ., Jpn. Patent, 1983. 58-58806.

175. Jessup W. and Fowler M. W. Interrelationships between carbohydrate metabolism and nitrogen assimilation in cultured plant cells. // Planta. 1976. V.132. N 2. P. 119-129.

176. Kamimura S., Akutsu M. Cultural conditions on growth of the cell culture of Papaver bracteatumll Agr. Biol. Chem. 1976. V. 40. N 5. P. 899-906.

177. Kang K.H. and Lee E.W. Physio-ecological studies on stevia (Stevia rebaudiana Bertoni). // KJCS. V. 26. N 1. 1981. P. 69-89.

178. Karting T., Kummer-Fustinioni G., Heudel B. Der Einfluss des Alterns auf die Sekundarstoffbildung in Gewebekulturen aus Digitalis purpurea. // Planta med. 1983. V. 47. N 4. S. 247-248.

179. Kasahara H., Hanada A., Kuzuyama T., Takagi M., Kamiya Y. and Yamaguchi, S. Contribution of the mevalonate and methylerythritol phosphate pathways to the biosynthesis of gibberellins in Arabidopsis. //J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 45188-45194.

180. Kaul B., Stohs S.G., Staba E.J. Dioscorea tissue cultures. III. Influence of various factors on diosgenin production by Dioscorea deltoideacallus and suspension cultures. // Lloydia.- 1969.- V. 32.- N 3.- P. 347-352.

181. Kerr W.E., Mello M.L.S.,Bonadio E. Testes de acao mutagenica do esteviosideo da Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni. // Rev. Bras. Genet. 1983. V.l.P. 173-176.

182. Kim K.K., Sawa Y., and Shibata H. Hydroxylation of ent-Kaurenoic acid to steviol in Stevia rebaudiana Bertoni purification and partialcharacterization of the enzyme. // Arch. Bichem. Biophys. 1996a. V. 332. P. 223-230.

183. Kim K.K., Yamashita H., Sawa Y., and Shibata H. A high activity of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in chloroplasts of Stevia rebaudiana Bertoni. II Biosci. Biotech. Biochem. 1996b. V. 60. P. 685-686.

184. Kinghorn A.D., Soejarto D.D., Nanayakkara N.P.D., Compadre C.M., Makapugay H.C., Hovanec-Brown J.M., Medon P.J., Kamath S.K. A Phytochemical screening procedure glycosides in the genus Stevia //J. of Nat. Prod. 1984. V. 47. N. 3. P. 439-444.

185. Kinghorn A.D., Soejarto D.D. Sweetening agents of plant origin.// Critical Reviews in Plant Sciences, V. 4. N2. 1986. P.79-120.

186. Kirchner J.G., Thin-Layer Chromatography. M.: Mir. 1981. V. 1.

187. Kitada Y., Sasaki M., Yamazoe Y. and Nakazawa H. Simultaneousdetermination of stevioside, rebaudioside A and C and dulcoside A in foods by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatography. 1989. V. 474 . P. 447-451.

188. Kitaoka M., Nagashima H., Kamimura S. Accumulation of geranylgeraniol in cell suspension culture of Croton sublyratus Kurz (Euphorbiaceae). // Ann. Rept Sancyo Res. Lab. 1989. V. 41. P. 169-173.

189. Knobloch K.H., Berlin J. Influence of medium composition on the formation of secondary compounds in cell suspension cultures of Catharanthus roseus. H Naturforsch. 1980, V. 35. P. 555-556.

190. Knobloch K.H., Bast G., Berlin J. Medium and light indused formation of serpentine and anthocyanins in cell suspension cultures of Catharanthus roseus. II Phytochem., 1982. V 21. P. 591-594.

191. Knoss W., Reuter B. and Zapp J. Biosynthesis of the labdane diterpene marrubiin in Marubium vulgare via a non-mevalonate pathway. // Biochem. J. 1997. V. 326. P. 449-454.

192. Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. Effect of oxygen supply on berberine production in cell suspension cultures and immobilized cells of Thalictrum minus. II Plant Cell Rep. 1989. V. 8. N 4. P. 255-258.

193. Kochchi S., Kada T., Nishioka H., Yahagi T., Ishidato M., Tajima Y., Endo H., Yoshikawa K., Sugisawa T., Sasaki M. Annu report of cancer research. Ministry of Health and Welfare, Jpn., 1977. Pp. 773-774

194. Kohda, H., Kasai, R., Yamasaki, K., Murakami, K., Tanaka, O.: New sweet diterpene glucosides from Stevia rebaudiana Bertoni. // Phytochem. 1976. V. 15. P. 981-983.

195. Krajewska A., Szoke E., Botz L., Szarvas T. Effect of new synthetic regulators on biomass and alkaloid production by callus tissues of Lobelia inflata L. Acta Bot. hung. 1987. V. 33 N 3-4. P. 407-411

196. Kurosaki F., Tashiro N., Nishi A. Induction of chitinase and phenylalanine ammonia-lyase in cultured carrot cells trated with fungal mycelial walls // Plant Cell Physiol. 1986. V. 27. N 8. P. 1587-1591.

197. Laulhere J.P., Lescure A.M., Briat J.F. Purification and characterization of ferritins from maize, pea, and soya bean seeds. Distribution in various pea organs. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263.1. 21. P. 10289-10294.

198. Lee J., Park J., Choi B., Han J., Oh Sang L., Yamada Y. Studies on the callus culture of stevia as a new sweetening source and formation of stevioside. // Hanguk Sikp, um Kwahakhoe Chi Korean. 1982. V. 14. N 2. P. 179-183.

199. Lee C. W., Pak C. H. Hughes H. G. Tissue culture studies on Stevia rebaudiana as a sourse of new sweetener crop // 87-th Annual Meeting of theAmerican society for horticultural science, Tussep, Arizona, USA, .1990: V. 25(9). P. 1109.

200. Li H.C., Rice E.L., Rohrbaugh L.M. Wender S.H. Effects of abscisic acid on phenolic content and lignin: biosynthesis in tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1970. V. 23. N 5. P: 928-936.

201. Lichtenthaler, H. K., Schwender, J., Disch A. M. Rohmer, Biosynthesis of isoprenoids in higher plant chloroplast proceeds via' a mevalonate independet pathway. // FEBS Lett. 1997a. V. 400. P. 271.-274.

202. Lichtenthaler H.K., Rohmer M. and Schwender J. Two independent biochemical pathways for isopentenyl diphosphate and isoprenoid biosynthesis in higher plants. Physiol. Plant. 1997c. V. 101. P. 643-652.

203. Lichtenthaler H.K. The plants' l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway for biosynthesis of isoprenoids. // Fett/Lipid. 1998. V. 100. P. 128-13 8.

204. Lobreaux, S., Briat, J.F. Ferritin accumulation and degradation in different organs of pea (Pisum sativum) during development. // Biochem. J. 1991. V. 274. P. 601-606.

205. Lucchesini, M., Monteforti, G., Mensuali-Sodi, A., Serra, G.: Leaf ultrastructure, photosynthetic rate and growth of myrtle plantlets under different in vitro culture conditions. Biol. Plant. 2006. V. 50. P. 161-168.

206. Lyakhovkin A.G., Long T.D., Titov D.A., Anh M. P. Cultivation and utilization of stevia (Stevia rebaudiana Bertoni). Hanoi: Agricultural publishing house, 1993 . 44 p.

207. Marty F. Différenciation des plastes dans les laticiferes & Euphorbia characias L. // C.R. Acad. Sci. Paris. 1971. V. 272. N. 2. P. 223226.

208. Matsumoto J., Nishida K., Noguchi M., Tomani E. Some factors affecting the anthocuanin formation of populus cell in suspension cultures // Agric. Biol. Chem. 1973. V. 37. N 3. P. 561-567.

209. McCown B.H., Joyce P.J. Automated propagation of microtubers of potato. // Cell culture and somatic cell genetics of plants. San Diego New York - Boston - London - Sydney - Tokyo - Toronto, Academic press, 1991'. V. 8. P. 95-109.

210. Messner B., Boll M., Berndt J. L-Phenylalanine ammonialiase in suspension culture cells of spruse (Picea abies) induction by UV-light and fungal elicitor. // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1991. V. 27. N 3. P. 267274.

211. Metivier J. and Viana A.M. Determination of microgram quantities of stevioside from leaves of Stevia rebaudiana Bert, by two-dimensional thin layer chromatography. // J. Exp. Bot. 1979. V. 30. N 117. P. 805-810.

212. Metivier J. and Viana A.M. The effect of long and short day length upon the growth of whole plants and the level of soluble proteins, sugars and stevioside in leaves of Stevia rebaudiana Bert. // J. Exp. Bot. 1979. V. 30. N 119. P. 1211-1222.

213. Miguel O. Un nuevo hipoglicemiante oral. Rev. Med. Paraguay, 1966. 7:200-202.

214. Mitsuhashi H., Ueno J. and Sumita T. Studies on the cultivation of Stevia rebaudiana Bertoni. Determination of stevioside. // Yakugaku Zasshi. 1975. V. 95.N1.P. 127-130.

215. Miura Y., Hirata K., Kurana N. Isolation of vinblastin in callus culture with differentiated roots of Catharanthus roseus.ll Agr. & Biol Chem., 1987, V.51, P. 611-614.

216. Miyagawa H., Fujita Y., Fujioka N., Kohda H., Yamasaki K. Studies on the tissue culture of Stevia rebaudiana and its components // Shoyakugaku Zasshi. 1984. V. 38. P. 12-18.

217. Miyasaka H., Nasu M., Yamamoto T., Endo Y., Yoneda K. Regulation ferruginol and crytotanshinone biosynthesis in cell suspension cultures of Salvia miltiorrhiza. II Phytochemistry. 1986. V. 25. N 3. P. 637-640.

218. Mizukami H., Ogawa T., Ohashi H., Elis Brain E. Induction of rosmarinuic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures by jeast extract. // Plant Cell Rep. 1992. Y. 11. N 9. P. 480-483.

219. Morita Kagaku Kogio Co. Ltd.(ed) Stevia extracts as plant growth regulators. Jpn. Patent, 1982b. 57-206603.

220. Morris F. Regulation of product sinthesis in cell cultures of Catharanthus roseus. Effect of culture temperature. // Plant Cell Rep. 1986. V. 5. N 6. P. 427-429.

221. Mosettig E., Beglinger U., Dolder E., Lichte H., Quitt P., Waters J. The. absolute configuration of steviol and isosteviol// J. Am. Ghem Soc. 1963 Vol. 85, N15. P. 468-472.

222. Murashige T., Scoog F. A revised medium for rapid growth- and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962: V. 15 N 13 P.473-497.

223. Mustardy, L., Garab, G. Granum revisited: A three-dimensional model where things fall into place. // Trends Plant Sci. 2003. V. 8. P. 117-12?

224. Nabeta K., Kasai T. and Sugisawa H. Phytosterol from the callus ofStevia rehaudiana Bertoni.// Agr. Biol. Chem. 1976. V. 40. N 10. P: 2103-? 104

225. Nakagava; K., Fukui H., Tabata M. Hormonal regulation of berberine production in cell suspension: cultures of Thalictrum minus. //Plant Cell Rep. 1986. V. 5. N 1. P. 69-71. V

226. Nogues S., Allen D.J., Morison J.I.L. and Baker N.R. Ultraviolet-B Radiation Effects on Water Relations, Leaf Development, and Photosynthesis inDroughted Pea Plants//Plant Physiol. 1998. V. 117. P. 173-181.

227. Odnevall A., Bjork Lars. Differentiated tissue cultures of Panax ginseng and their response to varios carbon sources. Biochem. und Physiol. Pflanz. 1989. V. 185. N 5-6. P. 403-413.

228. Okada K., Kawaide H., Kuzuyama T., Seto H., Curtis I.S. and Kamiya Y. Antisense and chemical suppression of the nonmevalonate pathway affects ent-kaurene biosynthesis in Arabidopsis.// Planta. 2002. V. 215. P. 339344.

229. Okumura M., Fugita Y., Imamura M., Ayakawa K. Studies on the safety of stevioside with recassay and reversion test. Shokuhin Eiseigoku Zasshi. 1978. V. 19. P. 486-490.

230. Oprach E., Hartmann T., Witte L., Toppel G. Reinvestigation of the alkaloid composition of Atropa belladonna plants, root cultures and suspension cultures // Planta Med., 1986. V.52. N6. P. 513-514.

231. Oviedo C.A., Froneiani G., Moreno R., Maas L.C. Accion hipoglicemiante de la Stevia rebaudiana Bertoni (Kaa-he-e). // Exerp. Med. 1971. V. 209. P. 93.

232. Ozeki Yoshihiro, Komamine Atsushi. Effects of growth regulator's on the induction of anthcyanin synthesis in carrot suspension cultures. // Plant and Cell Physiol. 1986. 27. N 7. P., 1361-1368

233. Pavelka Karl-Heinz, Stockigt Joahim, Danieli Bruno. Epchroline -a new indole alkaloid isolated from plant cell cultures of Ochrosia elliptica Labill. // Plant Cell Reports. 1986. 5. N 2. P. 147-149.

234. Pezzuto J.M., Compadre C.M., Swanson S.M., Nanayakkara N.P.D. and Kinghorn A.D. Metabolically activated steviol, the aglycone of stevioside is mutagenic. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 2478-2482.

235. Porter J.W., Spurgeon S.L. Biosynthesis of Isoprenoid Compounds. 1981, NY.: John Wiley and Sons.

236. Rajendran L., Ravishankar G.A., Veenkataraman L.V., Phathiba K.R. Anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota as influenced by nutrient stress and osmoticum. // Biotechnol. Lett. 1992. V. 14. N 8. P. 707712.

237. Randi A.M., Felippe G.M. Efeito de temperatura, luze reguladores de crescimento na germinacao de Stevia rebaudiana Bert. I I Ciencia e cultura, V. 33. N3. Marco. 1981. P. 404-411.

238. Reiner T., Clauss H., Ardenne R. Anthocyanbildung in Gewebekulturen von Haplopappus gracilis in Licht Yerschiedener Quialitat // Naturwissenschaften. 1964. V. 51. N 1. P. 87-94.

239. Reynolds, E.C.: The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. // J. Cell Biol. 1963. V. 17. - P. 208-212.

240. Rohmer M.: The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plant. // Natur. Prod. Rep. 1999. V. 16. P. 565-574.

241. Rokem J.S., Goldberg I. Secondary metabolites from plant cell suspension cultures: methods for yield improvment // Advances in Biotechnological Processes 4. / Ed. Mizrahi A. and A.R. Liss, New York. 1985. P. 241 274.

242. Rolph C.E., Coad L.J. Phosphatidilcholine biosynthesis in celery cell suspension cultures with altered sterol compositions. // Physiol. Plantarum, 1991, V 83, N4, P. 605-610.

243. Rohmer M., Knani M., Simonin P., Sutter B. and Sahm H. Isoprenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for early steps leading to isopentenyl diphosphate. // Biochem. J. 1993. V. 295. P. 517-524.

244. Rose D., Martin S.M. Growth of suspension cultures of plant (Ipomoea sp.) cell at various temperatures. // Can. J. Bot. 1975. N 4. P. 315-325.

245. Ruddat M., Lang A. and Mosettig E. Gibberellin activity of steviol, a plant terpenoid. //Naturwissenschañen. 1963. V. 50. P. 23.

246. Sakamoto I., Kohda H., Murakami K., Tanaka O. Quantitative analysis of stevioside. // Yakugaku Zasshi. 1975. V. 95. P. 1507.

247. Sakuta Masaaki, Takagi Tsutomu, Komamine Atsushi. Growth related accumulation of betacyanin in suspension cultures of Phytolacca americana L. // J. Plant Physiol. 1986. 125. N 3-4. P. 337-343.

248. Sakuta Masaaki. Takagi Tsumotu. Komamine Atsushi. Effects of sucrose on betacyanin accumulation and growth in suspension cultures of Phytolacca americana. Physiol, plant. 1987. 71. N 4. P. 455-458.

249. Sakuta Masaaki, Takagi Tsutomu. Komamine Atsushi. Effect of nitrogen sourse on betacyanin accumulation and growth in suspension cultures of Phytolacca americana. I I Physiol. Plant. 1987. V. 71. N 4. P. 459-463.

250. Samejima M., Yamaguchi T., Fukurumi T., Yoshimoto T. Effect of phytohormones on accumulation of flavonols in callus cell of woody plants //Plant Tissue Cult./ Proc. V Congr. Plant Tissue Cell Cult. 1982. P. 353-354.

251. Sasson Albert. Impact of biotechnological progress on the economy of developing countries / Biotechnologies and development. 1988. P. 261-276.

252. Schrall R. and Becker H. Production von catechinen und oligomeran Proanthocyanidinen in callus 'und suspensionkulturen von Crataegus monogyna, C. oxyacanta und Ginkgo biloba // Planta med. 1977. V. 44. N 32. P. 297-307.

253. Schok Clinton C. Rebaudia's stevia: natural noncaloric sweeteners // Calif. Agric. 1982. V. 36. N 9-10. P. 4-5.

254. Scragg A. N., Morris P., Allan E. J. The effects of plant growth regulators on growth and alkaloid formation in Cinchona ledgeriana callus culture//J. Plant Physiol. 1986. V. 124. N 3/4. P.371-377.

255. Schmidt A.J., Lee J.M., An G. Media and environmental effect on phenolic production from tobacco cell cultures. // Biotechnol. and Bioeng. 1989. V. 33. N 11. P. 1437-1444.

256. Schripsema J., Veerporte R. Search for factor related to the Tabernaemontana diviricata. Planta med. 1992. V. 58. N 3. P. 245-249.

257. Schvartzman J.B., Krimer D.B., Moreno Azorero R. Cytological effects some medicinal plants used in the control of fertility. // Experientia. 1977. V. 33. P. 663-665.

258. Schwarz M., Arigoni D., Ginkgolide biosynthesis. In: Sir Barton, D.H.R., Nakanishi, K., Metu-Cohn, O. (Eds.). Comprehensive Natural Product Chemistry. 1999. Vol. 2. Pergamon, Oxford, pp. 367-399.

259. Schwender J. and Lichtenthaler H.K. Biosynthesis of lycopene in tomato fruits via the non-mevalonate isoprenoid pathway. In: Advances in Plant Lipid Research. Sanchez, Cerda-Olmedo and Martinez-Force, eds., 1998. P. 429-432.

260. Semenova G.A., Effect of urea and distilled water on the structure of the thylakoid system, J. Plant Physiol. 2001. V. 158. P. 1041-1050.

261. Semenova, G.A.: The thylakoid membrane in a wide pH range. J. Plant Physiol. 2002. V. 159. P. 613-625.

262. Sholichin M., Yamazaki K., Miyama R., Yahara S., Tanaka O. Labdane-type diterpenes from Stevia rebaudiana. II Phytochem. 1980. V. 19. P. 326-327.

263. Shu An-Fei, Pack Judith. Methabolism of 14C-codeine in cell cultures of Papaver somniferum. I I Phytochem. 1989. V. 28. N 7. P. 1879-1881.

264. Smith J.I., Smart N.J., Kurz W.G.W., Misawa M. Stimulation of indole alkaloid production in cell suspension cultures of Catharanthus roseus by abscisic Acid. // Planta med. 1987. V. 53. N 5. P. 470-474.

265. Spieler H., Alfermann W., Reinhard E. Biotransformation of |3-methyldigitoxin by cell cultures of Digitalis lanata in airlift and stirred tank reactors. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. V. 23. P. 1-4.

266. Staba E.J. Production of useful compounds from plant tissue cultures // Proc. V Intern. Congr. Plant tissue and cell cult. Tokyo. 1982. P. 25.

267. Staehelin L.Q. Chloroplast structure from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. // Photosynth. Res. 2003. V. 76. P. 185-196.

268. Stafford A., Moms P., Fowler M.W. Plant cell biotechnology: A perspective. //Enzyme Microb. Technolog. 1986, V. 8. P. 578-586.

269. Stetler D.A., Laetsch W.M. Chloroplast development in Nikotiana tabacum. Amer. J. Bot. 1969. V. 56. P. 260-270.

270. Steveninck M.E., Steveninck, R.F.M.: Plastids with densely staining thylakoid contents in Nymphoides indica. I. Plastid development. // Protoplasma. 1980a. V. 103. № 4. P. 333-342.

271. Steveninck M.E., Steveninck R.F.M.: Plastids with densely staining thylakoid contents in Nymphoides indica. II. Characterization of stainable substance. //Protoplasma. 1980b. V. 103. № 4. P. 343-360.

272. Steward F.C., Caplin S.M., Millar F.K. Investigation of growth and metabolism of plant cell. 1. New techniques for the investigation of metabolism, nutrition and growth in undifferentiated cells. // Ann. Bot. 1952. V. 16. P. 458477.

273. Striedner J., Czygan F.-G., Braunegg G. Contributions to the Biotechnological production of sweeteners from Stevia rebaudiana Bertoni. (I). //Acta Biotechnol. 1991a. V. 11. N 5. P. 495-499.

274. Striedner J., Gutjahr E., Czygan F.-G., Braunegg G. Contributions to the Biotechnological production of sweeteners from Stevia rebaudiana Bertoni. (II). //ActaBiotechnol. 1991b. V. 11. N 5. P. 501-504.

275. Sumida T. Studies on Stevia rebaudiana Bertoni as a new possibble спор for sweetening resource in Japan. // J. Central Agric. Exp. Stn. 1980. V. 31. P. 1-71.

276. Sumida Т. Выращивание культуры стевии и задачи на будущее //Agricult. and Horticult. Tokio. 1983. V. 58. N. 1.

277. Suprasanna P., Rao K.V., Reddy G.M. Effect of growth regulations on anthocyanin synthesis in maize endospems cultured in vitro // Biol. Plantarum. 1989. V. 31. N 3. P. 177-181.

278. Suzuki H., Ikeda Т., Matsumoto T. and Noguchi M. Isolation and identification of rutin from cultured cells of Stevia rebaudiana Bertoni. // Ацг. Biol. Chem. 1976. V. 40. N 4. P. 819-820.

279. Suzuki H., Kasai Т., Sumihara M., Sugisawa H. Influence oral administration of stevioside on levels of blood glucose and glycogen of intact rats. //NipponNogei Kagaku Kaichi. 1977. V. 51. P. 171-173.

280. Suzuki M., Nakagava K., Fukui H., Tabata M. Relationship of berberin producing capability between Thalictrum plants and their tissue cultures callus culture and suspension cell culture. // Plant Cell Rep., 1987. V.6.N6. P. 260-263.

281. Swanson S.M., Mahady G.B., Beecher C.W.W. Stevioside biosynthesis by callus, root, shoot and rooted-shoot cultures in vitro. // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1992. V. 28. P. 151-157.

282. Tabata M. Recent advances in the production of medical substances by plant cell cultures. // Plant tissue cultures and its biotechnological application. В.: Springer, 1977. P. 3-16.

283. Tamura Y., Nakamura S., Fukui H., and Tabata M., Comparison of Stevia plants grown from seeds, cuttings and srem-tip cultures for growth and sweet diterpene glucosides. // 1984. Plant Cell Rep. V. 3. P. 180-182.

284. Tamura H., Fujiwara M., Takahashi K., Sugisawa H. Regulation of the productivity of anthocyanins and rosmarinic acid from cultured cells of Perilla frutescence var crispa (Labiatae). // Techn. Bull. Fac. Agr. Kagawa Univ. 1994. 46. N 2. P. 135-140.

285. Tateo Fernando and al. Technological and toxicological problems connected with the formulation of low-calorie foods // Riv. Soc. Ital. Sci. aliment. 1990. V. 19. N 1-2. P. 13-23.

286. Tomas J., Camps F., Claveria E., Coll J., Mele E., Messeguer J.: Composition and location, of phytoecdysteroids in Ajuga reptans in vivo and in vitro cultures. //Phytochem. 1992. V. 31. P. 1585-1591.

287. Tomas, J., Camps, F., Coll, J., Mele, E., Messeguer, J.: Phytoecdysteroid production by Ajuga reptans tissue cultures. // Phytochem. 1993. V. 32. P. 317-324. .

288. Tsukasa M., Miei S. Effects of riboflavin and increased sucrose on anthocyanin production in suspended strawberry cell cultures. // Plant Sci. 1995. V. 110. N 1. P. 147-153.

289. Tumova L., Dusek J., Hubic J. Viiv Kultivachich podminek na rust tkanove kultury Ononis arvensis a na produkci flavonoidu. // Cs. farm. 1989. V. 38. N8. P. 371-375.

290. Valio I.F.M. and Rocha RlF. Effect of photoperiod on growth and flowering of Stevia rebaudiana Bertoni. // Japan J. Crop. Sci. 1977. V. 46. N 2. P. 243-248.

291. Veeresham C., Kokate C.K., Venkateswarlu V., Babu B. R. Influence of DL-dopa and L-tyrosine on bioproduction of capsaicin in callus cultures of Capsicum annuum L. // Indian J. Exp. Biol. 1994. V. 32. N 3.' P. 223-224.

292. Wada Y., Tamura T., Kodama T., Yamada T., Ushida Y. Callus cultures and morphogenesis of Stevia rebaudiana II Yukagaku. 1981. V. 30. P. 215-219.

293. Wagner G.J. Secreting glandular trichomes: more than just hairs. // Plant Physiol. 1991. V. 96. P. 675-679.

294. Waller G.R., Mangiafico S., Foster R.C. Lawrence J.R.H. Sterols of Delphinium ajacis; Production and metabolic relationships in whole plants and callus tissue.// PlantaMed., 1981. V. 42. N 4. p. 344-355.

295. Westcott R.J. and Henshaw G.G. Phenolic synthesis and phenylalanine ammonia-lyase activity in suspension cultures of Acer pseudoplatanus L. // Planta. 1976. V. 131. N 1. P. 67-73.

296. Wingard R.E., Brown U.P., Enderlin F.E., Dale J.A., Hale R.L. Seitz C.T. Intenstinal degradation and absorbtion of the glycoside sweeteners stevioside and rebaudioside A. //Experientia. 1985. V. 36. P. 519-520.

297. Wink M. Quinolizidine alkaloids: biochemistiy, methabolism, and function in plants & cell suspension cultures.//Planta Med., 1987, V 53 N 6. P. 509-514.

298. Wollenweber E., Schnepf E. Vergleichende Untersuchungen über die flafonoiden Exkrete von "Mehl"- und "Öl"-Drüsen bei Primeln und die Feinstruktur der Drüsenzellen. // Z. Pflanzenphysiol. 1970. V. 62. N. 3 S 6227.

299. Yabu M., Takase M., Toda K., Tanimoto K., Yasutake I., Iwamto Y. Studies on stevioside, natural sweetener. Effect on the growth of some oral microorganisms. Hiroshima Diagaku Shigaku Zasshi. 1977. V. 9. P. 12-17

300. Yamamoto O., Yamada Y. Production of reserpine and its optimisation in cultured Rauwolfia serpentina Benth. cells. // Plant Cell Rep 1986.V. 5.N1.P. 50-53.

301. Yamazaki T., Flores H.E. Examination of steviol glucosides production by hairy root and shoot cultures of Stevia rebaudiana. // J. Nat Prod. 1991. V. 54. N4. P: 986-992.

302. Yazaki K., Fukui H., Kikuma M., Tabata M. Regulation of shikonin production by glutamine in Lithospermum eiythrorhizon cell cultures //Plant Cell Rep. 1987. V. 6. N2. P. 131-134.

303. Yeoman M.M., Miedzybrodska M.B., Lindsey K., McLauchlan W.R. The synthetic potential of cultured plant cell. // Plant cell cultures: Resultes & perspectives. Amsterdam etc., Elsever, 1980. P 327-344.

304. Yodyingyuad V. and Bunyawong S. Effect of stevioside on growth and reproduction. // Human Reprod. 1991. V. 6. P. 158-165.

305. Yoshida S. Production of sweet glucosides in Stevia rebaudiana I. Simple determination of sweet glycosides in Stevia plant with a TLC-scanner and their accumulation patterns with plant growth. // Nippon Sakumotsu Gakkai Kiji. 1986. V. 55. P. 189-195.

306. Yu D., Hong W., Chen M., Wang D., Ultrastructural study of mesophyll cells during their dedifferentiation in Stevia rebaudiana. // Acta Bot. Sin. 1993. V. 35. P. 499-505.

307. Zaidan Lilian B.P., Dietrich Sonia M.C. and Felippe G.M. Effect of photoperiod on flowering and stevioside content in plants of Stevia rebaudiana Bertoni. I I Japanese Journal of Crop Science. 1980. V. 49. N 4. P. 569-574.

308. Zheng Guang-zhi, Wang Shi-lin, He Jing-bo. Submergence (Fermentation) culture of Anisodum acutangulus cells and identification of hyoscyamine and scopolamine in the cultured cells. // Acta bot. sin. 1986. V.28 N2. P.123-131.

309. Zhou R., Zhang Z. Organogenesis and pigmentation in cultures of Lithospermum erythrorhison // J. Herbs, Spices and Med. Plants. 1993. V. 1. N 3. P. 57-63.

Информация о работе

Бондарев, Николай Ильич
доктора биологических наук
Орел, 2011
ВАК 03.01.05

Диссертация

Дитерпеновые гликозиды в интактных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы