Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и накопление стевиол-гликозидов в растениях и культурах клеток стевии

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Марина Александровна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 .Ботаническая, морфологическая и анатомическая характеристика растения Stevia rebaudiana Bertoni.

1.1.1. Систематика, морфология, распространение.

1.1.2. Размножение и культивирование растений стевии.

1.1.3. Характеристика различных линии растений стевии.

1.1.4. Особенности анатомического строения стевии.

1.2. Соединения специализированного обмена стевии.

1.2.1. Состав и содержание стевиол-гликозидов и других веществ вторичного метаболизма.

1.2.2. Свойства стевиол-гликозидов и других вторичных метаболитов стевии.

1.2.3. Биосинтез стевиол-гликозидов.

1.2.4. Накопление стевиол-гликозидов в различных органах растения стевии.

1.3. Культуры клеток стевии и синтез клетками in vitro стевиол-гликозидов.

1.4. Характеристика ультраструктуры терпеноидсодержащих клеток растений.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Характеристика используемых в работе линий стевии.

2.2 Условия выращивания растений в теплице.

2.3. Получение и культивирование растений в культуре in vitro.

2.4. Получение и культивирование каллусных культур клеток стевии.

2.5. Определение плоидности растения S. rebaudiana.

2.6. Исследование структуры тканей и клеток интактных растений S. rebaudiana.

2.7. Определение содержания стевиол-гликозидов в культуре клеток и растениях Stevia rebaudiana Bertoni.

2.7.1. Экстракция и очистка образцов.

2.7.2. Анализ стевиол-гликозидов методом ТСХ-денситометрии.

2.7.3. Анализ СГ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Глава 3 Состав и содержание стевиол-гликозидов в растениях Stevia rebaudiana in vivo и in vitro

3.1. Определение плоидности используемых в работе линий Stevia rebaudiana.

3.2. Качественный и количественный состав стевиол гликозидов в разных линиях Stevia rebaudiana Bertoni.

3.3 Накопление стевиол-гликозидов в различных органах растения.

3.4. Качественный и количественный состав стевиол-гликозидов в листьях различных линий стевии.

3.4.1. Состав стевиол-гликозидов в растениях при разных условиях выращивания.

3.4.2. Зависимость качественного и количественного состава стевиол гликозидов от плоидности и происхождения линий стевии.

3.4.3. Зависимость качественного и количественного состава стевиол гликозидов в зависимости от возраста листа.

3.5. Изменения состава стевиол-гликозидов в процессе онтогенеза стевии.

Глава 4. Получение каллусных культур стевии и их морфофизиологическая и биосинтетическая характеристика

4.1 Получение различных линий каллусных культур стевии и их предварительная оценка.

4.2. Физиологические и цитоморфологические характеристики каллусных культур стевии.

4.2.1 Ростовые характеристики культур клеток в цикле культивирования.

4.2.2 Цитоморфологическая характеристика каллусных культур в процессе периодического культивирования.

4.2.3. Биосинтетическая характеристика каллусных культур.

Глава 5. Изучение структуры и ультраструктуры клеток листа стевии различных линий in vivo и in vitro

5.1. Исследование поверхности листьев стевии с использованием сканирующей микроскопии.

5.2. Структура и ультраструктура клеток листа стевии in vivo.

5.2.1.Особенности строения листьев верхнего яруса.

5.2.2.Особенности строения листьев нижнего яруса.

5.2.3 Особенности структурной организации листовой пластинки пробирочного растения стевии in vitro.

5.3. Сопоставление структуры и ультраструктуры клеток листовой пластинки растения стевии in vivo и in vitro.

5.4. Особенности ультраструктуры клеток каллусных линий при культивировании на свету и в темноте.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез и накопление стевиол-гликозидов в растениях и культурах клеток стевии"

Растения обладают огромными биосинтетическими возможностями. Группы природных соединений обширны и разнообразны, их традиционно принято разделять на первичные и вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты дифференциально распределены среди таксономических групп в пределах царства растений, эти соединения часто обладают специфичной биологической активностью. На сегодняшний день роль вторичных метаболитов в жизни растения является предметом дискуссии, однако, большинство исследователей склонны считать, что они выполняют экологические функции, в частности защитные.

Одним из важнейших классов вторичных метаболитов являются изопреноиды (терпеноиды). Известны moho-, ди-, три -, тетра-, и сесквитерпеноиды. При этом дитерпеноиды являются относительно малочисленной и недостаточно изученной группой изопреноидов. Большинство известных дитерпеноидов являются основным компонентом смол цветковых растений и живицы хвойных (смоляные кислоты). В то же время ряд дитерпеноидов имеют нетрадиционную структуру и обладают уникальной биологической активностью. Например, дитерпеноид таксол из коры тиса обладает мощной противоопухолевой активностью. В связи с этим особенно интересны сладкие дитерпеновые гликозиды - уникальные соединения, сладость которых превышает сладость сахара в 100-400 раз. Наиболее известным растением, содержащим подобные соединения, является Stevia rebaudiana Bertoni. Оно содержат стевиол гликозиды - сладкие тетрациклические дитерпеновые гликозиды, которые накапливаются в основном в листьях. К настоящему времени известно очень немного о закономерностях синтеза и локализации этих соединений в интактном растении, об изменении активности синтеза в онтогенезе, о влиянии на этот процесс различных факторов, в том числе генотипа растения.

Особый интерес проблема синтеза и накопления дитерпеноидов приобрела в последнее время, когда стало известно о двух независимых путях синтеза изопреноидов в растениях. Оказалось, что в отличие от животных, в растениях изопреноиды синтезируются как в цитоплазме, так и в пластидах. При этом ряд результатов указывает на то, что в цитоплазме синтезируются по мевалонатному пути главным образом moho-, сескви- и тритерпеноиды, тогда как в хлоропластах - ди- и тетратерпеноиды. Предшественником синтеза в этом случае является дезоксиксилулозо-6-фосфат. Следовательно, a priori можно предполагать важную роль пластид в синтезе дитерпеноидов, однако насколько это справедливо для соединений с необычной структурой и свойствами, к которым относятся стевиол-гликозиды, неясно.

Удобной моделью для изучения синтеза вторичных метаболитов являются культуры клеток высших растений. К настоящему времени сформулированы основные закономерности становления и развития этой экспериментально созданной биологической системы. Особый интерес представляет возможность получения миксо- и автотрофных культур клеток. Сопоставление вторичного метаболизма в гетеротрофных и миксотрофных культурах позволяет достаточно корректно изучать влияние света и степени развития пластид на синтез вторичных метаболитов, в частности дитерпеноидов.

И, наконец, еще одним подходом к изучению синтеза и локализации стевиол гликозидов является изучение ультраструктуры листьев интактных растений и клеток растений in vitro. Стоит отметить, что до сих пор электронно-микроскопического изучения ультраструктуры листьев и культур клеток стевии не проводили.

Таким образом, целью настоящей работы явилось изучение закономерностей синтеза и накопления, тетрациклических дитерпеновых гликозидов в интактных растениях и культурах клеток Stevia rebaudiana Bertoni при разных режимах культивирования.

В соответствии с целью исследования, были сформулированы следующие задачи: 7

1. Изучение синтеза и накопления дитерпеновых гликозидов в разных линиях (генотипах) растений 81еу1а геЬаисИапа.

2. Исследование распределения стевиол-гликозидов по ярусам листьев, органам и в онтогенезе интактных растений.

3. Получение культуры клеток 81еу1а геЬаисИапа из разных линий интактных растений и изучение их ростовых и биосинтетических характеристик в разных условиях.

4. Изучение ультраструктуры листьев интактных и пробирочных растений, а также каллусных культур клеток 81еу1а геЬаисИапа.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Суханова, Марина Александровна

Выводы.

1. Основными стевиол-гликозидами девяти изученных линий являются: стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид С. Количественное содержание стевиол-гликозидов зависит от способа культивирования растений и снижается в ряду: растения в открытом грунте (2.5 - 5.4%), растения в теплице (1.6-1.7%), растения in vitro (0.6 - 0.8%). Соотношение индивидуальных стевиол-гликозидов достаточно стабильно при любых способах выращивания растений, что может указывать на генетическую закрепленность этого признака. Не обнаружено корреляции между качественным и количественным составом стевиол-гликозидов и плоидностью растения.

2. Качественный состав стевиол-гликозидов одинаков во всех органах растения. Максимальное накопление этих соединений отмечено в листьях, минимальное - в корне (около 0,1%), в семенах их содержание составляет 0,3%, в стеблях и цветках - около 0,8%. Максимальное содержание стевиол-гликозидов в листьях стевии наблюдается в начале цветения.

3. Получены каллусные культуры различных линий стевии и изучены их ростовые характеристики при культивировании в темноте и на свету. Каллусы некоторых линий имеют характерные особенности кривой роста («ступенчатый» рост), причем эти особенности сохраняются при повторном получении культуры. Культивирование на свету изменяет ростовые характеристики каллусов, в частности увеличивается лаг-фаза ростовой кривой и удельная скорость роста в экспоненциальной фазе.

4. Выращиваемые в темноте гетеротрофные культуры клеток стевиол-гликозиды не содержат, причем это характерно как для длительно культивируемых каллусов (более 8 лет субкультивирования), так и для относительно «молодых» культур (2-3 года). Выращиваемые на свету миксотрофные линии 1 и К, содержат незначительные количества ребаудиозида А и ребаудиозида С.

5. При помощи сканирующей электронной микроскопии подтверждено присутствие трех типов трихом на поверхности листа стевии, они обнаружены на обеих сторонах листа. Количество трихом на верхней поверхности листа у пробирочных растений в среднем в 2 раза меньше, чем у интактных растений. Такое соотношение трихом коррелирует с содержанием стевиол-гликозидов в листьях интактных и пробирочных растений.

6. Ультраструктура клеток листовой пластинки и эпидермальных железистых структур имеет ряд особенностей, указывающих на активные биосинтетические процессы. Клетки содержат хлоропласты нетипичного строения (отсутствует наружная мембрана, ламеллы расширены, они накапливают электронно-плотные соединения и большое количество пластоглобул). Клетки миксотрофных каллусных культур так же содержат пластиды с электронно-плотными включениями, в отличие от гетеротрофных.

7. Сопоставление результатов по содержанию стевиол-гликозидов в растениях стевии in vivo и in vitro, миксотрофных каллусных культур с данными электронной микроскопии позволяет сделать предположение о связи синтеза стевиол-гликозидов с пластидной системой клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Марина Александровна, Москва

1. Анишин C.JI. Развитие зародышей стевии в естественных и искусственных условиях // Введение в культуру стевии источника низкокалорийного заменителя сахара Киев, 1990.- С.92-96.

2. Антонов В.И. Оптимальные сроки зеленого черенкования в условиях защищенного грунта // Введение в культуру стевии источника низкокалорийного заменителя сахара Киев, 1990.- С.44-49.

3. Бондарев Н. И. Особенности процессов роста и образования дитерпеновых стевиол-гликозидов в культурах стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro // Автореферат. M., 1998.

4. Бутенко Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.: "Наука", 1975, С. 1-50.

5. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука. 1986. С. 3-20.

6. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф., Коржневская Т.Г., Маркарова E.H. Биотехнология: Клеточная инженерия,- М., 1987.- С.3-30.

7. Васильев A.B. Функциональная морфология секреторных клеток растений. JL: Наука, 1977. 208 с.

8. Василькевич С.И., Адамчик Г.Г., Бедичевец Л.Г. Способы размножения сладкой травы стевии-натурального подсластителя // Генетическая инженерия и биотехнология: Тезисы докладов.- Минск, 1994,- С. 15.

9. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич A.B. Биотехнология. Биологические агенты, технология, аппаратура.- Рига, 1987.- С.82-90.

10. Гаейр Г. Электронная гистохимия. М.: Мир, 1974, 488 с.

11. Герег Ш. Количественный анализ стероидов. -М.: Мир, 1985, с. 130-145. 504с.

12. Гудвин Т., Мэрсер Э. Введение в биохимию растений. -М.: Мир, 1986. -2. -С. 130-145. 504с.

13. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. -М.: Мир, 1965. 378с.

14. Дзюба О.О. Stevia Rebaudiana (Bertoni) Hemsley Новый для России источник натурального сахарозаменителя // Растительные ресурсы. 1998. Т. 34, Вып. 2. С. 86-93.

15. Дзюба О.О. Стевия-Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsly. Интродукция, морфология, биология, возделывание: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -С-П., 1999.-15с.

16. Диксон P.A. Использование и поддержание каллусных и суспензионных культур клеток // Биотехнология растений: культура клеток.-М., 1989.-С.5-56.

17. Ермаков Е.И., Кочетов A.A. Рост и продуктивность стевии в регулируемых условиях в зависимости от фотопериода и интенсивности света // Докл. РАСХН, 1994, N 6. С. 7-8.

18. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Фенольные соединения каллусных культур чайного растения и возможность регуляции их образования. // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука. 1986. С. 49-52.

19. Загоскина Н.В., Усик Т.У., Запрометов Н.М. Влияние длительности освещения на фенольный метаболизм фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения. Физиол. раст. 1990. т. 37. N 6. С. 1089-1095.

20. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения: некоторые аспекты образования полифенолов. // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука. 1991. С. 3235.

21. Загоскина H. В., Федосеева В. Г., Запрометов M. Н. Уровень плоидности каллусных культур чайного растения и образование фенольных соединений // Физиология растений. 1997. Т. 44, № 6. С. 931-934.

22. Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В. Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллюсной культуре чайного растения. Физиол. раст. 1986. т. 33. N2. С. 356-364.

23. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В. Еще об одном доказательстве участия хлоропластов в биосинтезе фенольных соединений // Физиол. раст. 1987. т. 34. N. 1. С. 165-172.

24. Ильенко И.И. Микроклональное размножение стевии в культуре in vitro // Введение в культуру стевии- источника низкокалорийного заменителя сахара,- Киев, 1990.- С.74-79.

25. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1981. 1.- 616с.

26. Кирьян И. Г., Мазин В. В. Получение каллусной культуры стевии // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования. Пущино. 1995. С. 548-549

27. Кисилева Н.С., Шелухин Н.В. Атлас по анатомии растений. Под редакцией C.B. Калишевича. Минск, "Вышэйш. школа", 1969. 289с.

28. Комиссаренко Н.Ф., Деркач А.И., Ковалев И.П., Бублик Н.П., Черменева Г. А., Котов А.Г., Зинченко В.В. Дитерпеновые гликозиды и фенилпропаноиды листьев Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae) // Растительные ресурсы. 1994. T. 30 (1-2), с. 53-64.

29. Крутошникова А., Угер М. Природные и сладкие синтетические вещества.- М, 1988.- С.61-62.

30. Ксенз Л.И., Сичкор Л.А., Корчак В.В Действия удобрений на продуктивность стевии // Введение в культуру стевии- источника низкокалорийного заменителя сахара,- Киев, 1990.- С.58-62.

31. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука, 1976. 646с.

32. Лобов В. П., Юртаева H. М., Роль фитогормонов в регуляции каллусообразования Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni // Биология культивируемых клеток и биотехнология / Под ред. Бутенко Р. Г., Алматы, 1993, С. 182.

33. Ловкова М.Я. Биосинтез и метаболизм алкалоидов в растениях. М.: Наука, 1981.-167с.

34. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. -М.: Мир, 1979. -548с.

35. Луппа X. Основы гистохимии. -М.: Мир, 1980. -344с.

36. Ляховкин А.Г., Лон Ч.Д., Ань М.Ф. и др. Медовая трава (Stevia rebaudiana Bertoni) во Вьетнаме/ Ханой.- 1992.-29 с.

37. Мэнтелл П., Смит Г. Факторы культивирования, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культурах клеток и тканей растений. В кн. Биотехнология сельскохозяйственных растений. -М.: Агропромиздат, 1987. -С. 75-105, 302с.

38. Носов А. М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука. 1991. С. 5-20.

39. Носов А. М. Функция вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 6. С. 873-878.

40. Пасешниченко В.А. Регуляция биосинтеза терпеноидов и стероидов у растений и животных. // Успехи биологической химии. М.: Наука. 1985. Т. 26. С. 246-268.

41. Пасешниченко В.А. Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов: Итоги науки и техники. Сер. Биологич. химия. М.: ВИНИТИ, 1987. Т. 25. 196 с.

42. Пасешниченко В.А. Терпеноиды и стероиды в жизни растений. // Успехи биологической химии. М.: Наука. 1991. Т. 32. С. 197-220.

43. Пасешниченко В.А. Успехи в изучении физиологической активности терпеноидов и стероидов. // Биохимия. 1992. Т. 57. N0 7. С. 986-1003

44. Пасешниченко В.А. Регуляция терпеноидного биосинтеза в растениях и его связь с биосинтезом фенольных соединений. // Физиол. раст. 1995. Т. 42 N 5. С. 787-804.

45. Паушева 3. П. Практикум по физиологии растений. М., 1970. 225 с.

46. Решетников В.Н., Василькевич С.Н., Домбин Г.М. и др. Клональное размножение, каллусогенез и культура протопластов стевии: Тезисы докладов III съезда Всесоюзного общества физиологов растений.-С.Петербург, 1993.- С. 170-194.

47. Роговский С.В., Забигайло Э.Е. Применение регуляторов роста для стимуляции укоренения и роста травянистых растений стевии // Физиология и биохимия культурных растений.- 1993.- Т.25, №5.- С.514.

48. Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительная функция высших растений. М., Наука, 1989,214с.

49. Сухов Г.В. Результаты исследования биосинтеза живицы с помощью радиоактивного углерода/ Гидролизн. и лесохим. пром., 1956, № 4, С. 17.

50. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка: Пер. с англ. -М: Мир, 1984.-512 с.

51. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro. В кн. Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: ВО Агропромиздат, 1987, С. 118, 302с.

52. Холодова В.П. Рост и метаболизм углеводов в культуре ткани растений / Культура клеток растений. М.: Наука, 1981, С. 51-68.

53. Хэфтман Э. Биохимия стероидов. М.: Мир, 1972.

54. Цанава В.П., Сарджвеладзе Г.П., Харебава Л.Г. Исследование летучих соединений двулистника сладкого. // Субтропические культуры. 1989.- N 3.- С. 72-77.

55. Шафферт Е.Э., Чеботарь A.A., Новикова В.А. Морфо-анатомическая характеристика стевии (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl.) в связи с интродукцией на южном берегу Крыма 1992

56. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир 1980.

57. Эсау К. Анатомия растений. -М.: Мир, 1969. 564с.

58. Юртаева Н.М., Лобов В. П. Физиологическая и морфологическая характеристика каллюсов, полученных из различных форм Stevia rebaudiana Bertoni // Физиология и биохимия культ, растений. 1998. Т. 30, №3. С. 219-224.

59. Ahmed M.C. and Dobberstein R.H. Stevia rebaudiana II. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of stevioside, rebaudioside A and rebaudioside C. // J. of Chromatography. 1982. V. 236. P. 523-526.

60. Ahmed M.C. and Dobberstein R.H. Stevia rebaudiana III. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of rebaudioside B, D, and E, dulcoside A, and steviolbioside. //J. of Chromatography. 1982. V. 245. P. 373376

61. Akashy H., Yokoyama Y. Dried leaf extracts of Stevia. Toxicological tests. Shokuin Kogyo, 1975. 18:34-43.

62. Alvarez M, Bazzote R.B.G., Cury R., Bottion L.M. Efeito do extrato aquoso da Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni sobre parametros bioquimieos de pessoas adultas normais. Arg. Biol. Technol., 1981. 24(1):77

63. Alves L.M. The gibberellin-like substances of Stevia rebaudiana Bertoni. Univ. Chicago, Photoduplication Dep. Abstr. Inst. Bot., 1975. 36:3194.

64. Alves L.M., Ruddat M. The presence of gibberellin A2o in Stevia rebaudiana Bertoni and its significance for the biological activity of steviol. Plant Cell Physiol. 1979.20:123-130.

65. Amelunxen F. Elektronenmikroskopischen Untersuchungen an den Drusenschuppen von Mentapipirita. Planta medica, 1965, 13, 4 : 457-473.

66. Brandle Y.E., Starrartt A.N., Gijzen M. Heritability for Yield, Leaf: Stem Ratio and Steviosid Content Estimated from a Landrace Cultivar of Stevia rebaudiana. // Internet.- 1998.- http://res.agr.ca/1ond/pmre/faq/menu.html.

67. Brandle J. Stevia, Nature s natural low calorie sweetener. // Internet.- 2000.-http://res 2. agr. ca/london/pmre/faq/stevia.html

68. Bondarev N., Reshetnyak O., Nosov A. Pecularities of ditrepenoid steviol glycoside production in vitro cultures of Stevia rebaudiana Bertoni// Plant Science 161.2001. 155-163.

69. Cheng T.F., Chang W.H. Studies on the non-stevioside components of Stevia extracts. Ko Hsueh Fa Chan Yueh ICan, 1983. 11:96-108.

70. Compadre C.M., Hussain R.A., de Compadre R.L.L., Pezzuto J.M. and Kinghorn A.D. J. Agric. Food. Chem., 1987. 35, 273.

71. Crammer B. and Ikan R., Chem. Soc. Rev., 1977. 6, 431

72. Curtis J.D., Lersten N.R. Morphology, seasonal variation, and function of resin glands on buds and leaves of Populus deltoides. -Amer. J. Bot., 1974. 61, 8:835-845.

73. Darise M., Kohda H., Mizutani K., Kasai R., Tanaka O. Chemical constituents of flowers of Stevia rebaudiana Bertoni. Agric. Biol. Chem, 1983. 47:133-135.

74. Dell B., McComb A.J. Grandular hairs, resin production, and habitat of Newcastelia viscida. -Austral. J. Bot., 1975. 23, 3:373-390.

75. Dorfman R.I., Nec W.R. Anti-androgenic activity of dihidrosteviol. Endocrinology, 1960. 67:282-285.

76. Ferreira C. M. and Handro W. Some morphogenetic responses in leaf explants of Stevia rebaudiana cultured in vitro // Revta brasil. Bot. 1987. V. 10. P. 113116.

77. Filkuka J & Kleinwachter V (1981) Basic staining of cell nuclei. Purkyne University Brno, Medical Faculty, Brno

78. Fries N., Flodin K., Bjurman J., Parsby J. Influence of volatile aldehydes and terpenoids on the transpiration of wheat. -Naturwissenschaften, 1974. 61, 10:452-453.

79. Fujita S.I., Taka K., Fujita Y. Miscellaneous contributions to the essential oils from various territories. XLI. On the components of the essential oil of Stevia rebaudiana Bertoni. Yakugaka Zasshi, 1977. 97:692-694.

80. Handro W., Hell K.G., Kelbanij C.B. Tissue culture of Stevia rebaudiana, a surging plants // Planta Medica.- 1977.- №.82.- P. 115-117.

81. Handro W. and Ferreira C.M. Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni: Production of Natural Sweeteners // Med and Aromat Plants.-1989. N 2.- P. 468-487.

82. Heinrich G. Uber das ätherische Ol von Monarda fistulosa und den Einban von markiertem C02 in dessen Komponenten. Planta Med. 1973, 23, 3: 201-212.

83. Hohmann Berthold Botanisch-warenkudliche Diognostik von Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl., einer sußstoffliefernden Pflanze. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 1978. 74. Jahrg. Heft 8.

84. Hough L., Chem. Soc. Rev., 1985. 14, 375.

85. Hsing Y.I., Su W.F., Chang W.C. Accumulation of stevioside and rebaudioside A in callus cultures of Stevia rebadiana Bertoni. Bot. Bull Acad. Sin. 1983. V. 24. P. 115-119.

86. Ishii E.L., Bracht A. Stevia rebaudiana. Natural products and liver metabolism. 1. Effect of steviol and stevioside on glycolysis and gluconeogenesis in perfused rat liver. Arg. Biol. Tec., 1984. 27:170.

87. Iwamura J., Kinoshita R. and Hirao N. Hydrolysis of stevioside and determination of total stevioside with dual-wavelength TLC scanner. // Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1980. V. 54. N 3. P. 195-200.

88. Iwamura J., Komai K. Diterpene glycosides as plant growth regulators. Kiki Univ., Jpn. Patent, 1983. 58-58806

89. Okumura M., Fugita Y., Imamura M., Ayakawa K. Studies on the safety of stevioside with recassay and reversion test. Shokuhin Eiseigoku Zasshi. 1978. 19:486-490.

90. Kang K.H. and Lee E.W. Physio-ecological studies on stevia (Stevia rebaudiana Bertoni). KJCS. V. 26. N 1. 1981. P. 69-89.

91. Kasai R., Matsumoto K., Nie R.-L., Zhou J., Tanaka O. Chem. Pharm. Bull. Jpn., 1989. 36, 234.

92. Kelmer-Bracht A.M., Alvarez M., Bracht A. Effects of stevioside and its derivatives on rat liver mitochondria. Braz. J. Med. Biol. Res., 1984. 16:521.

93. Kelmer-Bracht A.M., Kemmelmeier F.S., Ishii E.L., Alvarez M., Bracht A. Effects of Stevia rebaudiana natural products on cellular and sub-cellular metabolism. Arg. Biol. Tec., 1985. 28:431-455.

94. Kemmelmeier F.S., Yamamoto N.S., Alvarez M., Bracht A. Physiologic effects of Stevia rebaudiana natural products: effect on glycolysis of erythroid cells. Braz. J. Med. Biol. Res., 1983. 16:520.

95. Kerr W.E., Mello M.L.S.,Bonadio E. Testes de acao mutagenica do esteviosideo da Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni., Rev. Bras. Genet., 1983. V.l, 1:173-176.

96. Kim J., Pezzuto J.M., Soejarto D.D., Lang F.A. and Kinghorn A.D. J. Nat. Prod., 1988. 51, 1166.

97. Kinghorn A.D., Soejarto D.D., Nanayakkara N.P.D., Compadre C.M., Makapugay H.C., Hovanec-Brown J.M., Medon P.J., Kamath S.K. A Phytochemical screening procedure glycosides in the genus Stevia //J. of Nat. Prod. 1984. V. 47, N. 3, P. 439-444.

98. Kinghorn A.D., Soejarto D.D. Curent status of stevioside as a sweetening agent for human use. In: Wagner H., Hikino H. Economic and medicinal plant research, 1985. Vol. 1. Academic Press, London, New York, pp. 1-52.

99. Kinghorn A.D., Soejarto D.D. Sweetening agents of plant origin.// Critical Reviews in Plant Sciences, V. 4. N 2. 1986. P.79-120.

100. Kitada Y., Sasaki M., Yamazoe Y. and Nakazawa H. Simultaneous determination of stevioside, rebaudioside A and C and dulcoside A in foods by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatography. 1989. V. 474 . P. 447-451.

101. Kitagawa I., Sakagami M., Hashiuchi F., Zhou J.,Yoshikawa M. and Ren J. Chem. Pharm. Bull. Jpn., 1989. 37, 51.

102. Kochchi S, Kada T., Nishioka H., Yahagi T., Ishidato M., Tajima Y., Endo H., Yoshikawa K., Sugisawa T., Sasaki M. Annu report of cancer research. Ministry of Health and Welfare, Jpn., 1977. Pp. 773-774

103. Koshiro Chujiro S.K.K. Stevia components as sweetening agents and antibiotics. Jpn. Patent, 1980. 55-92323.

104. Kullenberg B., Bergstrom G. Chemical communication between living organisms. Endeavour, 1975. 34, 122:59-66.

105. Kurahashi H., Yamagushi Y., Tszuki S., Maehashi H. Pharmacological studies of stevioside. Matsumoto Shigaku, 1982. 8:56-62.

106. Lee J.I, Park J.R, Choi B.S, Han J.S, Oh Sang L, Yamada Y. Studies on the callus culture of stevia as a new sweetening source and formation of stevioside. // Hanguk Sikp, um Kwahakhoe Chi Korean 1982. V. 14. N 2. P. 179-183.

107. Lee C. W, Pak C. H. Hughes H. G. Tissue culture studies on Stevia rebaudiana as a sourse of new sweetener crop // 87-th Annual Meeting of the American society for horticultural science, Tussep, Arizona, USA, 1990, 25(9), P. 1109.

108. Levin D.A. The role of trichomes in plant defense. Qart. Rev. Biol, 1973, 48, l,pt. 1: 3-15.

109. Lichtenthler H. K. The plants" 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway for biosinthesis of isoprenoids // Fett/Lipid 100, 1998, Nr. 4-5, S. 128-138.

110. Lipinski Von Ryman G.W, Huddart B.E, Chem. Ind, 1983, 483

111. Lyakhovkin A. G., Long T. D., Titov D A., Anh M. P. Cultivation and utilization of stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) // Hanoi Agricultural publishing house, 1993. 44 p.

112. Makapugay H.C., Nanayakkara N.P.D. and Kinghorn A.D. Improved highperformance liquid chromatographic separation of the Stevia rebaudiana sweet diterpene glicosides using linear gradient elution // Journal of Chromatography. 1984. V. 283. P. 390-395.

113. Mantell S.H., Smith H. Cultural factors that influence secondary metabolite accumulation in plant cell and tissue cultures. Plant Biotechnology, Eds.: Mantell S.H. and Smith H. 1983, Cambridge Univ. Press, P. 75-110.

114. Marty F. Differenciation des plastes dans les laticiferes dCEuphorbia characias L C.R. Acad. Sci. Paris, 1971, 272D, 2:223-226.

115. Matsumoto J., Nishida K., Noguchi M., Tomani E. Some factors affecting the anthocuanin formation of populus cell in suspension cultures // Agric. Biol. Chem. 1973. V. 37. N 3. P. 561-567.

116. Mazur R.H., Schlatter, and Goldkamp A.H. J. Am. Chem. Soc., 1969. 91, 2684.

117. Metivier J. and Viana A.M. Determination of microgram quantities of stevioside from leaves of Stevia rebaudiana Bert, by two-dimensional thin layer chromatography. //J. Exp. Bot. 1979. V. 30. N 117. P. 805-810.

118. Metivier J. and Viana A.M. The effect of long and short day length upon the growth of whole plants and the level of soluble proteins, sugars and stevioside in leaves of Stevia rebaudiana Bert. // J. Exp. Bot. 1979. V. 30. N 119. P. 12111222.

119. Mitsuhashi H., Ueno J. and Sumita T. Studies on the cultivation of Stevia rebaudiana Bertoni. Determination of stevioside. // Yakugaku Zasshi. 1975. V. 95. N l.P. 127-130.

120. Miguel O. Un nuevo hipoglicemiante oral. Rev. Med. Paraguay, 1966. 7:200-202.

121. Miyagawa H., Fujita Y., Fujioka N., Kohda H., Yamasaki K. Studies on the tissue culture of Stevia rebaudiana and its components // Shoyakugaku Zasshi. 1984. V. 38. P. 12-18/

122. Mori N., Sokanone M., Takeuchi M.Shimpo K., Tanabe T. Effect of stevioside on fertility in rats. Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 1981. 22:409-414.

123. Morita Kagaku Kogio Co. Ltd.(ed) Activation of a-amilase and promotion of a-amilase production. Jpn. Patent, 1982a. 57-206389.

124. Morita Kagaku Kogio Co. Ltd.(ed) Stevia extracts as plant growth regulators. Jpn. Patent, 1982b. 57-206603

125. Mosettig E., Beglinger U., Dolder E., Lichte H., Quitt P., Waters J. The absolute configuration of steviol and isosteviol// J. Am. Chem Soc. 1963. Vol. 85, N 15. P. 468-472.

126. Murashige T., Skug T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiology Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

127. Nabeta K., Kasai T. and Sugisawa H. Phytosterol from the callus of Stevia rebaudiana Bertoni. // Agr. Biol. Chem. 1976. V. 40. N 10. P. 2103-2104.

128. Nanayakkara N.P.D., Hussain R.A., Pezzuto J.M., Soejarto D.D. and Kinghorn A.D. J. Med. Chem., 1988. 31, 1250

129. Nosov AV, Smolenskaya IN & Nosova AL (1983) Cytophotometric study of DNA-Fuchsin complex in cultured mesophyll protoplasts of Nicotiana tabacum and Vicia faba. Biol. Plant. 25:173-179

130. Oviedo C.A., Froneiani G., Moreno R., Maas L.C. Accion hipoglicemiante de la Stevia rebaudiana Bertoni (Kaa-he-e). Exerp. Med., 1971. 209:93.

131. Patau K (1952) Absorption microphotometry of irregular-shaped objects. Chromosoma 5: 341-362

132. Pezzuto J.M., Compadre C.M., Swanson S.M., Nanayakkara N.P.D. and Kinghorn A.D. Metabolically activated steviol, the aglycone of stevioside is mutagenic. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 2478-2482.

133. Planas G.M., Kue J. Contraceptive properties of Stevia rebaudiana, Science, 1968. 162:1007.

134. Pomaret M.M.M., Lavieille R. Le principe a saveur surce du Kaa-he-e (Stevia rebaudiana Bertoni). IV. Quelques propertietes physiologiques due stevioside. Bull. Soc. Chem. Biol., 1931. 13:1248-1253.

135. Randi A.M., Felippe G.M. Efeito de temperatura, luze reguladores de crescimento na germinacao de Stevia rebaudiana Bert. // Ciencia e cultura, V. 33. N3. Marco. 1981. P. 404-411.

136. Ruddat M, Lang A, Mosettig E. Gibberellin activity of steviol, a plant terpenoid. Naturwissenschaften, 1963. 50:23.

137. Schok Clinton C. Rebaudia's stevia: natural noncaloric sweeteners // Calif. Agric. 1982. V. 36. N 9-10. P. 4-5.

138. Schvartzman J.B, Krimer D.B, Moreno Azorero R. Cytological effects some medicinal plants used in the control of fertility. Experientia, 1977. 33:663-665

139. Sholichin M, Yamazaki K, Miyama R, Yahara S, Tanaka O. Labdanetype diterpenes from Stevia rebaudiana. // Phytochem. 1980. V. 19. P. 326-327.

140. Sholichin M, Yamazaki K, Yahara S, Tanaka O. Labdane-type diterpenes from Stevia rebaudiana. Phytochemistry, 1980. 19:326-327.

141. Schnepf E. Uber den Feinbau von Oldrusen. 2. Die Drusenhaare in Calceolaria Bluten. Protoplasma, 1969, 67, 2-3 : 195-203.

142. Stafford A, Morris P, Fowler M.W. Plant Cell Biotechnology: A Perspective // Enzyme Microb. Technol. 1986. V. 8. P. 578.

143. Striedner J, Czygan F.-G, Braunegg G. Contributions to the Biotechnological production of sweeteners from Stevia rebaudiana Bertoni. (I). //Acta Biotechnol. 1991a. V. 11.N5.P. 495-499.

144. Striedner J, Gutjahr E, Czygan F.-G, Braunegg G. Contributions to the Biotechnological production of sweeteners from Stevia rebaudiana Bertoni. (II). //Acta Biotechnol. 1991b. V. 11. N 5. P. 501-504.

145. Sterner T.E. Inhibition of root- and butt-desay fungi by extractives of balsam fir root wood. can. J. Res, 1974. 4, 2:213-221.

146. Sumida T. Studies on Stevia rebaudiana Bertoni as a new possibble cnop for sweetening resource in Japan. // J. Central Agric. Exp. Stn. 1980. V. 31. P. 171.

147. Suzuki H, Ikeda T, Matsumoto T. and Noguchi M. Isolation and identification of rutin from cultured cells of Stevia rebaudiana Bertoni. // Agr. Biol. Chem. 1976. V. 40. N 4. P. 819-820.

148. Suzuki H., Kasai T., Sumihara M., Sugisawa H. Influence oral administration of stevioside on levels of blood glucose and glycogen of intact rats. Nippon Nogei Kagaku Kaichi, 1977. 51:171 -173.

149. Swanson Steven M., Mahady Gail B. & Beecher Christopher W.W. Stevioside biosynthesis by callus, root, shoot and rooted-shoot cultures in vitro // Plant Cell. Tissue and Organ Culture 28: 151-157. 1992

150. Takeuei N., Murase M, Ochi K. and Tobinaga S. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1976. 820

151. Tama Biochemical Co. Ltd. (ed) Safety of Stevia. Spec. Bull., 1981. Pp. 120.

152. Tateo F. and al. Texnological and toxicological problem connected with the formulation of low-calorie foods // Riv. Soc. Ital. Sci. Aliment. 1990. V. 19. № 1-2. P. 13-23.

153. Ueda M. Weffort R.M.M., Zubioll A., Bersani Amado C.A., Bazote R. Gaeti W.P., Alvarez M. Efeito do extrato aquoso da Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni sobre o teste de tolerancia a glucose em ratos normals adultos. Rev. Unimar, 1983. 5:111-115.

154. Uehara O.A, Utino V.N., Miyata I., Oliveira Filho R.M. Interacao do steviosideo com androgenos. II Seminario Brasileiro sobre Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni, 1982. XII:I.

155. Valio I.F.M. and Rocha R.F. Effect of photoperiod on growth and flowering of Stevia rebaudiana Bertoni. // Japan J. Crop. Sci. 1977. V. 46. N 2. P. 243248.

156. Vignalis P.V., Duee E.D., Vignalis P.M., Huert J. Effects of atractyligenin and its structural analogues on oxidative phosphorylation and on translocation of adenine nucleotides in mitochondria. Biochem. Biophys. Acta, 1966. 118:465-483.

157. Wingard R.E., Brown U.P., Enderlin F.E., Dale J.A., Hale R.L. Seitz C.T. Intenstinal degradation and absorbtion of the glycoside sweeteners stevioside and rebaudioside A. Experientia, 1985. 36:519-520.113

158. Yabu M., Takase M., Toda K., Tanimoto K., Yasutake I., Iwamto Y. Studies on stevioside, natural sweetener. Effect on the growth of some oral microorganisms. Hiroshima Diagaku Shigaku Zasshi, 1977. 9:12-17.

159. Yamazaki T., Flores H.E. Examination of steviol glucosides production by hairy root and shoot cultures of Stevia rebaudiana. // J. Nat. Prod. 1991. V. 54. N4. P. 986-992.

160. Yamamoto Kelmer-Bracht A.M., Kemmelmeier F.S., Ishii E.L., Alvarez M., Bracht A. Effects of steviol and its structural anlogs on glucose production and oxygen uptake in rate renal tubules. Experientia, 1985. 41:55-57.

161. Yoshida S. Production of sweet glucosides in Stevia rebaudiana I. Simple determination of sweet glycosides in Stevia plant with a TLC-scanner and their accumulation patterns with plant growth. // Nippon Sakumotsu Gakkai Kiji. 1986. V. 55. P. 189-195.

162. Zaidan Lilian B.P., Dietrich Sonia M.C. and Felippe G.M. Effect of photoperiod on flowering and stevioside content in plants of Stevia rebaudiana Bertoni. // Japanese Journal of Crop Science. 1980. V. 49. N 4. P. 569-574.