Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности процессов роста и образования дитерпеновых стевиол-гликозидов в культурах стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности процессов роста и образования дитерпеновых стевиол-гликозидов в культурах стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) IN VITRO"

* На правах рукописи

БОНДАРЕВ Николай Ильич

ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ РОСТА И ОБРАЗОВАНИЯ ДИТЕРПЕНОВЫХ СТЕВИОЛ-ГЛИКОЗИДОВ В КУЛЬТУРАХ СТЕВИИ (Stevia rebaudiana Bertoni) IN VITRO

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений имени К.А.Тимирязева РАН

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор A.M. Носов доктор сельско-хозяйственных наук, профессор A.B. Корниенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.А. Пасешниченко доктор биологических наук Н.В. Загоскина

Ведущее учреждение - Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина

РАН, Москва

Защита диссертации состоится "i С " 1998 г. в "

часов на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К. 053. 05. 14 при Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан "22" О/Ш^/^К 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, /

кандидат биологических наук ^¡^уС/^^ ^О.Т. Полесская

Актуальность работы. Дитерпеновые гликозиды - одна из важных >упп соединений специализированного обмена растений. В настоящее >емя некоторые из них находят широкое практическое применение, как шример дитерпеновые гликозиды, обнаруженные в листьях стевии (Sievia baudiana Bertoni) - эндемика Парагвая, принадлежащего к семейству южноцветных. Стевиол-гликозиды обладают высокой подслащивающей юсобностью (в 300 раз слаще сахарозы при 0.4% содержании в растворе) Linghorn and Soejarto, 1986]. Они не токсичны, низкокалорийны и тактически не усваиваются организмом человека [Tateo et al., 1990; yakhovkin et al, 1993]. Эти свойства делают их чрезвычайно фспективными для использования в качестве заменителя сахара для одей, страдающих от заболеваний, связанных с нарушением углеводного эмена. Особенно ценными гликозиды оказались при использовании их -табетиками, так как их употребление препятствует развитию шергликемических состояний и существенно снижает дозы инсулина, роме того, гликозиды стевии перспективны для широкой замены меводов в пищевой промышленности.

Известно, что культуры растений in vitro используют в фундаментальных ¡следованиях в качестве моделей для изучения различных аспектов горичного метаболизма. Поэтому создание экспериментальных дологических систем для исследования закономерностей биосинтеза атерпеновых гликозидов представляет несомненный научный интерес, нализ культур клеток и тканей, а также стерильных и интактных растений озволит изучить особенности образования стевиол-гликозидов в ультурах стевии in vitro в сравнительном аспекте, на разных стадиях ифференциации ткани и развития растений.

Получение и изучение культур стевии in vitro актуально также с целью х практического использования в качестве альтернативных источников олучения натуральных подсластителей. Этот аспект особенно важен в зязи с трудностью размножения стевии семенами и высокими ребованиями к условиям культивирования, что ограничивает эзможности выращивания на плантациях.

Цель исследования - изучение особенностей роста и образования гевиол-гликозидов в культурах клеток и растениях стевии in vivo и in vitro, сравнительном аспекте.

Задачи исследования:

- получение каллусных и суспензионных культур стевии различног генотипического и эпигенетического происхождения и их морфе физиологическая характеристика;

- изучение особенностей каллусогенеза и роста полученных культур;

- определение состава и количественного содержания стевио; гликозидов у различных клонов интактных растений, растений in vitro полученных культур клеток;

- изучение влияния факторов и условий культивирования (углеводно и минеральное питание, регуляторы роста, температура, свет) на процесс! роста и образования стевиол-гликозидов в культурах клеток и растения стевии in vitro.

Научная новизна работы. Получен ряд каллусных и суспензионны культур Stevia rebaudiana Bertoni различного генотипического i эпигенетического происхождения и показано наличие у них штаммово] специфичности. Создана коллекция каллусных культур стевии.

Впервые достаточно полно изучен качественный состав и количес твенное содержание стевиол-гликозидов в культурах стевии in vitro \ проведен сравнительный анализ их образования на разных стадия: дифференциации объектов: интактные растения - растения in vitro дедифференцированные каллусные и суспензионные культуры морфогенный каллус - регенерированные in vitro побеги.

Установлено, что качественный состав СГ у растений in vitre идентичен их спектру интактных растений. Выявлена прямая зависимости содержания стевиол-гликозидов, при культивировании in vitro, от степени развития растений.

Показано, что дедифференцированные культуры клеток содержат минорные количества СГ, а их состав беднее по сравнению с донорными растениями. При образовании морфогенных структур и формировании побегов процессы образования и накопления гликозидов восстанавливаются. Не выявлено корреляции между количественным содержанием СГ в различных органах донорных растений и полученных культурах клеток.

Изучено влияние факторов культивирования (углеводное и минеральное питание, регуляторы роста, температурные режимы, условия освещения) на рост культур стевии in vitro и содержание стевиол-гликозидов.

оказана возможность физиологической регуляции накопления СГ в 'льтуре растений стевии in vitro.

Практическая значимость. Результаты исследований существенно шолняют представления о закономерностях роста и образования ггерпеновых гликозидов в культивируемых клетках и растениях стевии, ^обходимые для практического использования этих культур.

Полученные штаммы культур клеток могут быть использованы в пьнейшей работе с целью изучения регуляции образования СГ и элучения более продуктивных клеточных культур.

Наибольший практический выход на настоящем этапе имеют данные, э физиологической регуляции роста растений и накопления в их органах гевиол-гликозидов при выращивании в условиях биореактора (роллерная ггановка). Крупномасштабное выращивание свободных от болезней астений стевии в биореакторах перспективно для ее массового тонального размножения. Помимо этого, в определенных случаях, оно ожег служить альтернативой получению растительного сырья на пантациях.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и редставлены на: ежегодных семинарах Отдела биологии клетки и иотехнологии ИФР РАН; Международной научно-практической онференции "Повышение эффективности агропромышленного роизводства в условиях современных форм хозяйствования" (Воронеж, 995); II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения перспективы их практического использования" (Пущино, 1997); IV 1еждународной конференции "Регуляторы роста и развития растений" Москва, 1997); VII Международной конференции "Биология клеток астений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997); немирных конгрессах по биологии in vitro (Washington, 1997; Las Vegas, 998, США).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из вве-ения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и бсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертационная работа изложена на ^^ страницах машинописного ексга, содержит,^рисунков,¿^таблицы. Список цитируемой литературы ключает^^наименований, из которых /^зарубежные.

Принятые сокращения и обозначения:

Среда МС - среда Мурасиге и Скуга [Murashige, Skoog, 1962]); 2,4-Д - 2,< дихлорфеноксиуксусная кислота; НУК - а-нафтилуксусная кислота; БАП 6-бензиламинопурин; К - кинетин (6-фурфуриламинопурин); ГК гибберелловая кислота; ДГ (СГ) - дитерпеновые стевиол-гликозиды; М сухая масса клеток, г/л; Мс - сырая масса клеток, г/л; S - концентраци сахарозы в среде, г/л; Y - экономический коэффициент по сахарозе; П продуктивность клеток по биомассе, г/л в сут.; С - содержание СГ; 1м индекс роста по сухой биомассе; ТСХ - тонкослойная хроматография ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили интактные растения, растения in vitro а также каллусные и суспензионные культуры Stevia rebaudiana. Интактньк растения стевии были выращены на опытных участках ВНИИ сахарно? свеклы и сахара (Рамонь Воронежской обл.). В работе использовали ' клонов (образцов) растений с условными номерами: 0 (получен вс ВНИИСС), 2,3,4,5 (привезены из Парагвая в 1991 г.). Стерильные растения стевии получены в Отделе биотехнологии ВНИИСС. Для введения их в культуру in vitro были использованы меристемы и молодые побеги интактных растений.

Каллусообразование инициировали из различных частей стерильных растений. В качестве эксплантов использовали фрагменты стебля (с) и листовые пластинки (л), а также в отдельных случаях черешки листьев (ч). Культивирование проводили на среде МС, дополненной регуляторами роста: НУК, 2,4-Д, БАП, К (0,025 - 4,0 мг/л) в различных комбинациях.

Выращивание каллусных и суспензионных культур проводили на стандартной среде МС, содержащей НУК - 1.0 мг/л и 6-БАП - 0.5 мг/л. Каллусную ткань культивировали на агаризованной среде. Масса транспланта - 25-40 мг, продолжительность выращивания - 5 недель.

Суспензионную культуру выращивали на качалке (100 об/мин) в литровых колбах, содержащих 100 мл жидкой среды, а также в стеклянном барботажном ферментере с рабочим объемом 800 мл (расход воздуха на барботаж - 0,2-1,2 л/мин). Объем инокулюма - 1/10 от объема среды. Культивирование проводили в темноте, при температуре 25+1 °С.

Изучение особенностей роста культур in vitro.

Сырую и сухую биомассу, плотность клеток, их жизнеспособность и азмер определяли по стандартным методикам [Калинин и др., 1980; аушева, 1988; Диксон, 1989].

Содержание Сахаров в среде определяли фенол-сернокислотным етодом [Методы общей бактериологии. Т. 2., 1984].

Ростовые параметры ц, Т, Y, П рассчитывали по формулам, риведенным в монографии Перта [Перт, 1978].

Выращивание растений in vitro проводили в пробирках и на эллерном аппарате, используя специально изготовленные культуральные )суды цилиндрической формы емкостью 300 мл (длина 215 мм, диаметр 5+2 мм), прототипом которых является сосуд биореактора роллерного ша [McCown, Joyce, 1991]. Сосуды закреплены перпендикулярно дискам, осаженным на металлическую полуось, наклоненную к горизонту под ~лом 3°. Скорость вращения дисков - 4 об./мин.

При выращивании в условиях светокультуры, освещенность в камере >ставляла 1000-2000 лк, фотопериод - 16 часов.

В течение опыта регистрировали следующие морфологические граметры растений: число и длину побегов, число пар листьев на побегах, тело и длину корней, сырую и сухую массу растений.

Каждый опыт проводили 3-4 раза с 10-15 кратной повторностью. олученные результаты обрабатывали статистически. Достоверность раз-1чий оценивали по критерию Стьюдента (при Р=0,05). На рисунках d и в едены средние арифметические и их стандартные ошибки. При изуче-ш значимости основных групп веществ питательной среды для роста 1еток стевии использовали метод факторного анализа, с последующей атистической обработкой [Максимов, 1980; Максимов и Семенова; 1991].

Экстракция и очистка стевиол-гликозидов.

Лиофильно высушенную и растертую в порошок биомассу клеток жещали в центрифужные пробирки и дважды экстрагировали 50% гганолом в течение 3 часов и 1 часа на магнитной мешалке. Каждую )рцию центрифугировали, после чего объединенные надосадочные здкости каждого образца упаривали досуха на роторном испарителе при мпературе 45-50 °С. Для очистки образцов использовали полипропиле-)вые Sep-Pak патроны (пластиковые микроколонки) размером 9X20 мм, полненные обращеннофазовым сорбентом (1 мл) Separan TMSGXC-18, 60 ш ("Tessek LTD", Чехия). Стандарты СГ были получены из института >ганической и физической химии КНЦ РАН, Казань.

Анализ СГ методом ТСХ-денситометрии.

Стандарты СГ и экстракты образцов наносили на стеклянные пластины с кизельгелем 60 F254 (Merck, Германия, 4*10, 0.2 мм толщиной) или силикагелем (Эстония, 20*10, 0.13 мм). Для разделения веществ использовали несколько различных систем растворителей. Наиболее хорошее отделение СГ друг от друга и от сопутствующих Сахаров, было достигнуто в системе : хлороформ : изопропанол : уксусная кислота : вода (20:20:5:5). После разделения, хроматограммы высушивали на воздухе, опрыскивали раствором анисового альдегида или тимола в 95% этаноле [Кирхнер, 1981] с добавлением серной кислоты и сушили в термостате при 110 °С в течение 10 минут до появления пятен. Количественное определение пяти СГ (стевиозида, ребаудиозидов А, В и С) проводили путем денситометрии пластинок на приборе Chromatogramm Densitometr CD 50, Desaga, Япония - Германия.

Анализ СГ методом ВЭЖХ.

Определение СГ проводили на приборе фирмы LKB-Produkter АВ, Bromma, Швеция. Детектирование - UV-210 нм, объем калибровочной петли - 10 мкл. В работе использовали стальную колонку Ultro Рас column TSK-OH-120, 4,6 х 250 мм, с размером частиц 5 мкм. Разделение проводили в системе растворителей ацетонитрил:вода (85:15) при скорости потока 0.5 мл/мин. Количественные расчеты анализируемых СГ (стевиозида и ребаудиозидов А и С) проводили методом абсолютной калибровки.

В таблицах и на рисунках содержание стевиозида, ребаудиозидов А и С приведено по данным ВЭЖХ, содержание ребаудиозида В и стевиолбиозида - по данным ТСХ-денситометрии. Ошибки средних (показатели точности опыта), с учетом экстракции и очистки, для ВЭЖХ, не превышали 5%, для ТСХ-денситометрии -10%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение каллусных и суспензионных культур и их морфо-физиологическая характеристика

1. Влияние экзогенных фитогормонов и природы экспланта на каллусогенез и рост первичного каллуса.

Для индукции каллусогенеза были выбраны несколько комбинаций ауксинов и цитокининов: 2,4-Д/БАП; 2,4-Д/К; НУК/БАП и НУК/К. На среде, не содержащей регуляторов роста, каллусогенез отсутствовал как у

истовых, так и у стеблевых эксплантов. Но на средах, содержащих 0.1 мг/л более ауксина (НУК или 2,4-Д) и 0.05 мг/л и более цитокинина (БАП или С) наблюдали 100% каллусогенез у обоих типов эксплантов.

При уменьшении концентрации ауксина (2,4-Д) до 0.05 мг/л отмечали нижение процента каллусогенеза у обоих типов эксплантов до 80-90%.

Во всех вариантах на листовых пластинках масса каллуса была в 2-3 аза больше, чем на фрагментах стебля (рис. 1.).

Комбинации НУК и БАП оказались наиболее удачными для бразования первичного каллуса у обоих типов эксплантов. )птимальными были концентрации: НУК - 2 мг/л для листовых и 4 мг/л ля стеблевых эксплантов; БАП - 2 мг/л и 1 мг/л, соответственно. )стальные комбинации ауксин/цитокинин, по степени снижения роста аллуса на'листовых эксплантах, можно было расположить в следующий яд: НУК/К, 2,4-Д/БАП и 2,4-Д/К. Для роста каллуса на стеблевых ксплантах эффективность перечисленных комбинаций снижалась в ледующем ряду: 2,4-Д/БАП, 2,4-Д/К и НУК/К.

2. Морфогенез в культуре эксплантов и каллусной культуре.

Каллусообразование сопровождалось стеблевым и корневым рганогенезом. При добавлении НУК (0.1-1.0 мг/л) и БАП (0.05-0.5 мг/л) аблюдали побегообразование как у листовых, так и у стеблевых ксплантов; при более высоких их концентрациях формирование побегов е происходило. При добавлении в среду НУК и К, побегообразование тмечали только у листовых эксплантов и в более узком интервале онцентраций: НУК - 0.2-1.0 мг/л, кинетин - 0.1-0.2. Формирования корней этих условиях не происходило. На среде с 2.4-Д в концентрации 0.2-1.0 [г/л как в комбинациях с БАП, так и с кинетином, признаков органогенеза :е было выявлено, наблюдали лишь образование каллуса. Органогенез тмечен при использовании более низких концентраций 2.4-Д - 0.05-0.1 [г/л. При этом у листовых эксплантов происходило образование только орней, а у стеблевых - как корней, так и побегов. По-видимому 2.4-Д, при одержании в среде 0.2 мг/л и выше, полностью подавляла органогенез.

Комбинация НУК/БАП оставалась столь же эффективной для индукции обегообразования у каллуса. Оптимальными были концентрации: НУК -,05 мг/л, БАП - 2,0 мг/л. В этих условиях отмечено лишь образование обегов. Формирование корней вероятно было блокировано высоким одержанием в среде цитокининов (БАП или К).

OI

Морфо-физиологические характеристики каллусных и суспензионна культур клеток стевии различного происхождения.

Каллусные культуры. Генотип и тип экспланта оказывали ;ущественное влияние на морфо-физиологические характеристики толученных каллусных культур (табл. 1.).

Таблица 1

Характеристики каллусных культур стевии различного происхождения

№ клона Тип Название Консистен- Оводнен- Цвет

растения экспланта штамма* ция ность

0 лист 0л рыхлый оводнен. св.-желтый

стебель Ос рыхлый оводнен. св.-желтый

2 лист 2л гетероген. неоводнен. темно-желт.

стебель 2с рыхлый оводненный желтый

3 лист Зл гетероген. неоводнен. желтый

стебель Зс рыхлый оводненный св-желтый

4 лист 4л гетероген. неоводнен. желтый

стебель 4с рыхлый оводненный св-желтый

5 лист 5л плотный неоводнен. желтый

стебель 5с гетероген. оводненный желтый

* цифра - номер исходного клона растения, л - лист, с - стебель.

При исследовании роста культур в цикле выращивания было шявлено, что каллусные ткани различного происхождения сарактеризовались разной продуктивностью по биомассе.

Самые высокие параметры роста отмечены у каллусной ткани, юлученной из листовых пластинок растений клона 0. Интенсивный и ггабильный рост наблюдали также у штаммов, полученных из растений слона 3, а также у штамма 5л. Культуры, полученные из стеблей и шстовых пластинок 2 и 4 клонов, отличались менее стабильными гоказателями роста.

Суспензионные культуры. При переходе с поверхностного сультивирования к глубинному, отличия, касающиеся роста в цикле ;ультивирования культур различного происхождения, сохранялись. Наиболее интенсивное накопление биомассы наблюдали у штамма 0л. У итаммов Зс и Зл увеличение биомассы происходило несколько медленнее, фнчем параметры роста были сходными. Самый медленный рост отмечен > культуры 5л (цикл роста составлял 33-34 сутки). Достоверные различия по траметрам роста наблюдали лишь у культур, полученных из различных :лонов (образцов) растений. Интересно отметить, что накопление как :ырой, так и сухой биомассы коррелировало с размером клеток. Так у лтамма 5л диаметр клеток на протяжении всего цикла роста был

наименьшим (Dep.=41,7+ 1,3 мкм), а у штамма Ол - наибольшим (Dcp.= 57,3+1,9 мкм). У культур Зс и Зл диаметр клеток был одинаков: 49,6+1,4 и 49,5+1,2 мкм, соответственно.

Состав и содержание СГ в растениях и культурах клеток стевии Следующая задача заключалась в оценке способности культур in vitro к синтезу СГ. Необходимо было сравнить их метаболитичекие профили на разных участках системы: интактное растение —> растение in vitro

t 4-

морфогенный каллус дедифференцированные клетки

(каллусные и суспензионные культуры) 1. Состав и содержание стевиол-гликозидов в интактных и культивируемых in vitro растениях стевии.

Интактные растения. В экстрактах листьев и стеблей интактных растений стевии (0, 3 и 5 клонов) были обнаружены стевиозид и ребаудиозиды А, С и В (табл. 2). В стеблях содержание СГ было в несколько раз ниже, что хорошо согласуется с литературными данными. Стевиолбиозид в растениях перечисленных образцов не содержался. Качественный состав СГ в растениях всех исследованных образцов был одинаков.

Таблица 2

Содержание стевиол-гликозидов* в листьях и стеблях интактных

растений стевии различных образцов (мг/г сухой массы)

№. об- Орган Стеви- Ребау- Ребауди- Реба- Стеви- Суммар-

разца раст-я озид диозид озид С удиозид олбио- ное содер-

раст-я А В зид жание СГ

0 лист 24,9 12,0 4,6 2,2 0 43,7

0 стебель 4,5 2,6 0,4 1,0 0 8,5

3 лист 21,6 9,5 3,2 1,1 0 35,4

5 лист 30,2 0,4 0,2 5,4 0 36,2

*В этой и последущих таблицах, ошибки средних (показатели точности опыта), с учетом экстракции и очистки, для стевиозида и ребаудиозидов А и С, не превышали 5% (ВЭЖХ), для ребаудиозида В -10% (ТСХ).

Однако суммарное содержание гликозидов в листьях и соотношение их друг к другу было различным. Наибольшее количество СГ обнаружено в листьях клона 0. Остальные 2 образца по общему содержанию стевиол-гликозидов не отличались. Основным гликозидом во всех 3-х образцах являлся стевиозид и его содержание было примерно равным, в то время как содержание ребаудиозидов А и С сильно различалось. Так, если в листьях 0 и 3 образцов их содержание составляло более 30% от суммы СГ, то в листьях 5 образца - всего около 2%.

Растения этих образцов отличались и по ростовым характеристикам. Сухая масса растений клона 0 была несколько выше. Положительная корреляция между массой растений и содержанием СГ согласуется с данными, полученными Metivier and Viana [Metivier and Viana, 1979].

Растения in vitro. В листьях пробирочных растений содержание СГ было ниже в 5-6 раз, а в стеблях - в 3 раза, по сравнению с аналогичными органами интактных растений (табл. 3.). Качественный состав гликозидов был сходным. При длительном культивировании в этих условиях (около 5 лет), достоверного снижения содержания СГ не происходило.

Таблица 3

Содержание стевиол-гликозидов в листьях и стеблях растений

различных образцов, культивируемых in vitro (мг/г сухой массы)

№ об- Орган Стеви- Ребауди- Ребауди- Ребауди- Стевиол- Сумма

разца раст-я озид озид А озид С озид В биозид СГ

2 месяца культивирования in vitro

0 лист 3,4 1,0 1,6 0,9 0 6,9

0 стебель 1,7 0,4 0,4 0,3 0 2,8

3 лист 4,6 1,8 0,6 0,3 0 7,3

3 стебель 1,2 0,4 0,2 0,1 0 1,9

5 лет культивирования in vitro

0 лист 3,3 1,9 0,7 0,2 0 6,1

0 стебель 0,8 0,6 0,1 0 0 1,5

2. Анализ СГ в культуре клеток.

Каллусные культуры. В штаммах, полученных из различных эксплантов растений клона 0, в течение первых месяцев выращивания отмечали присутствие минорных количеств стевиолбиозида, ребаудиозида В и стевиозида. В остальных культурах эти соединения содержались в следовых количествах, либо вообще отсутствовали. Ребаудиозидов А и С в каллусе не обнаружено.

При проведении анализа (ВЭЖХ И ТСХ-денситометрии) каллусных культур через 1,5 года субкультивирований, в большинстве штаммов присутствия стевиол-гликозидов обнаружено не было. Лишь в одном из штаммов были найдены следовые количества ребаудиозида В.

Таким образом, при длительном выращивании (более 2 лет), каллусные культуры практически потеряли способность к синтезу даже незначительных количеств СГ.

Суспензионные культуры. С помощью ВЭЖХ'и ТСХ-денситометрии были проанализированы 4 длительно выращиваемые (около 2 лет) суспензионные культуры: Ол, Зл, Зс и 5л в 3-4-х точках цикла роста. В этих же точках был проведен анализ культуральной жидкости, на предмет

возможности выделения в нее СГ. В среде не обнаружено глнкозидов. На рис. 2. показана динамика содержания СГ в суспензионной культуре Зс. Максимальное их содержание было обнаружено на 14есутки выращивания, то есть в конце экспоненциальной фазы роста. Дальнейшего накопления СГ в культивируемых клетках (рис. 2.) не происходило и уже на 17-е сутки их содержание было ниже в 4 раза. По всей видимости, образующиеся СГ метаболизировались. Этой точки зрения придерживается и 81:пес1пег с коллегами (Э1пеёпег й а1, 19.91Ь).

М, г/л С, мкг/гМ Результаты анализа других

культур представлены в табл. 4. В этих образцах проанализированные СГ (стевиозид, ребаудн-озиды А и С) присутствовали в минорных количествах (не более 15 мкг/г сухой массы). Основным СГ в этих культурах был стевиозид. Ребаудиозид А содержался не во всех штаммах и в значительно меньшем количестве.

12

Сутки МПС

Рис. 2. Динамика роста суспензионной культуры стевии и содержания в клетках СГ в цикле выращивания (штамм Зс).

Ребаудиозид В отмечен в штамме Зс на 14е сутки культивирования, в следовом количестве. Стевиолбиозид в длительно выращиваемых культурах присутствовал также в следовых количествах, хотя в первые месяцы культивирования его содержание было выше. Ребаудиозид С не был обнаружен в клетках. Корреляции, между содержанием СГ в органах донорных растений и полученных культурах клеток, обнаружено не было.

Таким образом, в полученных культурах клеток, по сравнению как с интактными, так и культивируемыми in vitro донорными растениями, количественное содержание СГ резко снижается (в среднем примерно на 23 порядка). При этом обедняется спектр синтезируемых СГ. При переходе с поверхностного культивирования к глубинному происходит интенсификация образования и накопления вторичных соединений (СГ)-

Таблица 4

Содержание стевиол-гликозидов* в суспензионных культурах стевии различного происхождения на 14-е сутки выращивания (мкг/г сухой массы)

Штамм Стевн- Ребауди- Ребауди- Суммарное М, с,

озид озид А озид С содержание СГ г/л мкг/л

Ол 15 следы 0 15 7,6 114

Зл 10 5 0 15 5,7 85,5

Зс 103 12 0 115 7,1 816,5

5л 0 • 0 • 0 0 2,1 0

* приведено содержание 3-х основные СГ (по данным ВЭЖХ). Подобные результаты были получены при выращивании клеток диоскореи дельтовидной (стероидные гликозиды) [Носов, 1992] и левзеи :афлоровидной (экдистероиды) [Орлова, 1993]. Вероятно это обусловлено изменениями условий культивирования, в результате чего меняется как пруктурная организация клеток, так и снабжение их кислородом и питательными веществами.

Индекс роста (Мс)

Возможность регуляции процессов роста и образования СГ в культурах клеток стевии посредством влияния факторов культивирования

1. Влияние факторов культивирования на рост культур клеток стевии Влияние углеродного питания. Каллусная культура стевии по-разному реагировала на различные источники углерода. Ткань погибала на среде с галактозой, арабинозой и рафинозой, сохраняла жизнеспособность, но практически не росла на среде с рамнозой и сорбитом (рис. 3.).

Незначительный рост ткани наблюдали на среде с мальтозой (1мс=2.6). На среде с фруктозой 1мс достигал 51, на среде с глюкозой - 52 и самые высокие индексы роста были отмечены на средах с сахарозой и пищевым сахаром (61 и 63). Таким образом, каллусная культура стевии, как и большинство культур клеток растений, способна усваивать, помимо сахарозы, фруктозу и глюкозу.

И мальтоз а □ фруктоза ЕЗгшокоза □ сахар Исахароза

Рис. 3. Рост каллусной культуры стевии на средах с различными источниками углерода (на графике приведены данные при 3% концентрации углеводов в среде).

Однако, из других исследованных углеводов, никакое другое соединение ш могло обеспечить нормальный рост, хотя некоторые из них могут успешнс использоваться культурами отдельных видов растений [Холодова, 1981].

Концентрация сахарозы была основным, из исследуемых, фактором лимитирующим дальнейшее накопление биомассы клеток стевии. После ее исчерпания в среде, сразу прекращалось увеличение сырой и сухой массь клеток и начиналась фаза деградации (рис. 4.). Повышение содержат« сахарозы с 2% до 5%, пропорционально увеличивало сухую массу клепок без изменения скорости роста (0.5-0.7 г/л х сут.), за счет удлинения период; роста. Утилизация сахарозы коррелировала с накоплением биомассы Максимум поглощения отмечен в ранней экспоненциальной фазе роста. Е дальнейшем ее потребление происходило с одинаковой скоростью.

Б, г/л

М, г/л

Экономический коэффициент пс сахарозе, при увеличении ее со-14 держания в среде, практически не _ „ изменялся и составлял около 0.3.

10 Рис. 4. Динамика роста суспензионной культуры стевии и утилизация Сахаров при различной концентрации сахарозы в среде.

Влияние

концентрации

0 2 4 6 8 10

—М(2%) -*-5(2%)

14 20 Сутки М(3%) -*-М(4%) ¡5(3%) -Б(4%)

30 34

-М(5%) -8(5%)

минеральных солей. Повышение содержания минеральных солей МС с 1/2 нормы до 2 норм приводило к некоторому увеличению как скорости роста, так и плотности биомассы. Цикл роста, соответственно, был короче. Продуктивность по М, при увеличении содержания солей с 1/2 нормы до 1, и с 1 нормы до 2, повышалась на 10-20%. Увеличение продуктивности клеток по биомассе вероятно связано с нелимитированным поступлением минеральных веществ, в первую очередь азота и фосфата [Носов, 1992; Ануфриева, 1997].

Влияние регуляторов роста. На среде, не содержащей регуляторов, каллусная культура не росла, как и на среде с одними цитокининами (БАП и К). Но на среде с ауксинами (2.4-Д и НУК) отмечали рост ткани. Следовательно данную культуру, как и большинство других [Гамбург,

90, с. 133], следует отнести к ауксинзависимой. При сочетании ауксинов цитокининов наблюдали значительное увеличение роста.

НУК была более эффективным ауксином для роста клеток стевии, чем 4-Д, что было отмечено и для других культур тканей двудольных [стений [Kamimura, Akutsu, 1976; Scragg et al., ¡986; Fidgeon, Wilson, 1987]. овышение содержания цитокининов менее существенно сказывалось на >стовых параметрах культуры. Однако сочетание НУК и БАП было 'раздо эффективнее для роста каллусной культуры, так же как и для ¡разования первичного каллуса, чем комбинации НУК и кинетина. Максимальные ростовые показатели отмечены при аналогичной щцентрации НУК и БАП - по 2 мг/л.

Добавление в среду 1-5 мг/л гибберелловой кислоты (ГК) в 2-3 раза ■еличивало сырую массу каллусной ткани. Увеличение сухой массы было значительным. Повышение сырой массы происходило за счет роста [еток растяжением и их оводнения. Это предположение было подтвер-цено в опыте с суспензионной культурой. При добавлении 1 мг/л ГК в |еду с 1,0 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП, средний диаметр клеток через 2 ¡дели культивирования составлял 63,0 мкм, а в среде без ГК - 47,5мкм.

Влияние температурных режимов и условий освещения. Как видно из зедставленных данных (рис. 5.), наиболее благоприятный для роста шлусной культуры стевии температурный режим - 25+1 °С.

Индекс роста (Мс)_ Понижение температуры на 4°С

приводило к резкому снижению роста ткани (примерно в 6-7 раз). При увеличении температуры на 4 °С рост ткани снижался не столь значительно (на 20-30%). Резкая отрицательная реакция клеток при понижении температуры закономерна, так как сте-вия - субтропическое растение.

Рис. 5. Влияние различных температурных режимов и условий освещения на рост каллусной культуры стевии.

21 °С, теми. 25 °С, теми. 25 °С, св. 29 °С,темн.

□штамм 0с Ищтамм 0ч

шяется среднесуточная температура

В течение периода вегетации, для развития растений, оптимальной 23-30 °С. При её понижении до

13-15 °С рост растений значительно замедляется [Sumida, 1980].

Влияние освещения на рост каллуса было неоднозначным: у одни штаммов наблюдали значительное увеличение роста, в то время как других отличий по ростовым параметрам не обнаружено (рис. 5).

Влияние факторов культивирования на содержание СГ. Воздействие! всех вышеперечисленных факторов культивирования не удалось сущес твенно повысить содержание СГ в культуре клеток. Это говорит о том, чт эти факторы не способны индуцировать их биосинтез. При воздействи: света (белый, красный, синий) наблюдали позеленение каллуса. При прос мотре под микроскопом отмечено присутствие множества хлоропластоЕ Однако накопления СГ в миксотрофной ткани не происходило.

В то же время при дифференциации каллусной ткани, то есть npi образовании морфогенных структур и формировании побегов происходило восстановление процессов биосинтеза и накопления СГ. Так в морфогенном каллусе (штамм 0л), их содержание было в 4-5 раз выше чем в суспензионной культуре, а в побегах, срезанных с этого каллуса - в 3' раз, что составило более трети от количества гликозидов, присутствующю в стеблях донорных пробирочных растений (табл. 5.). Следует отметить что накопление СГ в растениях стевии in vitro, происходило независимо от наличия у них корневой системы. Так, при побегообразовании у каллусной ткани формирования корней не наблюдали, однако при этом отмечали образование и накопление гликозидов (табл. 5).

Таблица 5

Содержание стевиол-гликозидов* в культурах in vitro на разных стадиях дифференциации клеток (мкг/г сухой массы)

Культура Стевиозид Ребаудио- Ребаудио- Суммарное со-

зид А зид С держание СГ

Пробирочные рас-

тения (образец 0), 3300 1900 700 5900

листья/стебли 800 600 100 1500

Каллус 0л 0 0 0 0

Суспензионная

культура 0л 15 следы 0 15

Морфогенный

каллус 0л 60 23 0 83

Побеги морфоген-

ного каллуса 0л 387 112 53 552

* представлены данные 3-х основных СГ (по данным ВЭЖХ) У пробирочных растений содержание СГ также не зависело от наличия корней.

Таким образом, предположение Свэнсона [Swanson et al, 1992] о необходимости наличия корней у побегов in vitro для образования СГ, не эыло подтверждено в наших исследованиях.

Если исходить из предположения о защитных функциях СГ в растениях [Metivier, Viana, 1979], то соответственно они синтезируются клетками для решения организменных задач и под контролем организма [Носов, 1991]. В культуре клеток происходит выход из под организменного контроля и утрачивается способность к биосинтезу этих соединений, если они не способствуют увеличению интенсивности пролиферации клеток, что происходит вероятно чрезвычайно редко [Носов, 1992; 1994].

Регуляция развития растений стевин и накопления СГ при культивировании их в биореакторах

1. Рост растений стевии и содержание в их органах СГ при выращивании на роллерном аппарате и в пробирках

Сравнительный анализ развития микрочеренков стевии показал преимущество аппаратного режима (культивирование на роллерной установке) перед традиционным выращиванием в условиях стационара (в пробирках, на агаризованной среде). Такие ростовые показатели растений, как сырая и сухая масса, длина побегов, были в 1,5-2 раза выше при культивировании на роллерном аппарате, чем в пробирках. Корневая система, напротив, была лучше развита у пробирочных растений (табл. 6.).

Таблица 6

Влияние способа культивирования in vitro на развитие растений стевии * и

содержание в их органах стевиол-гликозидов

Способ Число Длина Число Число Длина Сырая Сухая Содер-

культи- побе- побе- пар кор- кор- масса, масса, жание

виро- гов, гов, листьев, ней, ней, мг мг** сг,

вания ШТ мм шт шт мм мг/г М

в про- 1,8± 125,5+ 9,7+ 4,4+ 132,3+ 145,6+ 16,2; g ]***

бирках 0,1 0,6 0,5 0,3 10,3 21,6 8,9 1,5

на рол- 2,0+ 184,4+ 9,8+ з,1± 39,5± 292,9+ 22,5 10.7

лере 0,0 19,9 0,5 0,4 9,1 48,7 12,3 2,1

* приведены средние данные в пересчете на одно растение;

** 1-я цифра - средняя М целого растения; 2-я цифра - средняя М листьев

(возраст растений-5 педель);

*** в числителе - содержание СГ в листьях, в знаменателе- в стеблях.

Вероятно, это связано с различной степенью аэрации побегов при этих двух способах культивирования. В роллерных сосудах питательная среда контактирует практически со всей внутренней поверхностью сосудов, то есть максимально увеличивается поверхность соприкосновения среды с воздухом и ее насыщение кислородом. Экспланты же за счет адгезии прилипают к стенкам сосудов и при вращении дисков увлажняются средой лишь периодически, что дает возможность оптимального контакта как с воздухом, так и со средой.

Содержание СГ в листьях и стеблях растений, при культивировании на роллере не снижалось, а наоборот, было выше (в 1.8 раза в листьях и в 1.4 раза в стеблях) по сравнению с пробирочными растениями. Уровень накопления СГ, по-видимому, находится в прямой зависимости от степени развития растений.

2. Влияние факторов культивирования на развитие растений и накопление стевиол-гликозидов

Влияние углеродного питания. Углеродное питание оказывало существенное влияние на рост и развитие растений стевии in vitro. При использовании сахарозы (3%), сухая масса растений была на 15-20% выше, чем на средах с такими же концентрациями глюкозы и фруктозы, которые по этому параметру практически не отличались (табл. 7.).

Таблица 7

Влияние углеродного питания на рост и развитие растений стевии *,

выращиваемых на роллерной установке (возраст растений- 5 недель)

Источник углерода Число побегов, шт Длина побегов, мм Число пар листьев, шт Число корней, шт Длина корней, мм Сырая масса, мг Сухая масса, мг**

фруктоза, 3% 1,9± 0,1 244,0± 20,7 11,0+0,6 4,9+0,6 54,8+ 8,2 292,0+ 74,5 21,0; 10,5

глюкоза, 3% 2,2+ 0,3 262,2± 24,3 10,5+0,9 5,1+0,7 76,7+ ' 16,3 282,2± 63,1 20,6; 10,2

сахароза, 1% 1,9+ од 148,3+ 12,7 8,2+0,5 1,7+0,2 6,7+ 2,3 235,3+ 30,0 8,5; 4,0

сахароза, 2% 1,6+ 0,2 189,1± 22,7 8,4+0,8 2,6+0,4 25,3+ 4,4 246,4± 49,4 14,7; 9,0

сахароза, 3% 2,0+ 0,0 184,4+ 19,9 9,8+0,5 3,1+0,4 39,5+ 9,1 292,9+ 48,7 22,5; 12,3

сахароза, 5% 2,3+ 0,3 190,9+ 19,7 11,0+1,1 4,3+0,9 67,8± 16,6 306,4+ 62,3 28,9; 14,6

* ** пояснения те oice, что и для табл.6.

ти данные фактически полностью соответсвуют результатам, полученным опытах с каллусной культурой. Следует однако отметить некоторые собенности развития растений стевии при культивировании на средах с азличными сахарами. Так, корневая система (как число, так и длина орней) была сильнее развита (примерно на 40-60%) у растений, ыращиваемых на среде с фруктозой и особенно с глюкозой, чем на среде с ахарозой. Аналогичная закономерность отмечена при сравнении длины обегов. Однако удлинение побегов в вариантах с использованием глюкозы фруктозы, происходило за счет растяжения междоузлий. Число пар истьев в этих вариантах достоверно не отличалось. Число побегов не звисело от использования источника углерода.

Культивирование на средах с различными источниками углерода казывало значительное влияние на накопление СГ в листьях растений ¡п иго (табл. 8).

Таблица 8

'лияние углеродного питания па содержание стевиол-гликозидов в листьях

растений стевии*, выращиваемых на роллере (мг/г сухой массы)

Источник тлерода Стеви-озид Ребауди-озид А Ребауди-озид С Ребауди-озид В Стевиол-биозид Суммарное содержание

фруктоза, 1% 3,3 1,2 0,5 0,1 0 5,1

'люкоза, ¡% 3,5 1,4 0,6 0,2 0 5,7

:ахароза, s% 6,4 2,5 1,2 0,6 0 10,7

:ахароза, >% 4,4 1,5 0,6 0,3 0 6,8

Наиболее высокое содержание СГ наблюдали при использовании лхарозы. При выращивании на средах с глюкозой и фруктозой роисходило значительное снижение содержания гликозидов в 1,9 и 2,1 аза, соответственно. Эти данные согласуются с результатами, полученны-[и для культур клеток других растений. Так, сахароза была предпоч-ительнее для образования бетацианинов в клетках Phytolacca americana Sakuta, 1987], антрахинонов и флавоноидов в клетках Cassia didymobotrya 3otta, 1989], антоцианов в клетках Ajuga reptans [Callebaut, 1990].

При повышении концентрации сахарозы с 2% до 3% и с 3% до 5%, сухая tacca растений также, как и биомасса клеток в опытах с каллусными и успензионными культурами, увеличивалась: с 1% до 2% - на 73%, с 2% до % - на 57% и с 3% до 5% - на 25% (табл. 7). Повышение содержания

сахарозы в среде способствовало увеличению пар листьев, общая длин побегов при этом оставалась неизменной. Увеличение концентраци сахарозы оказывало существенное влияние на развитие корневой системь Так, на среде с 5% сахарозой число корней было выше в 2,5 раза, а их длин увеличивалась на порядок, по сравнению с 1% сахарозой.

С повышением концентрации сахарозы с 3% до 5% происходило не которое снижение общего содержания СГ в листьях растений (табл. 8.). Н< так как при этом отмечали увеличение биомассы, как всего растения, так 1 его листьев, то в целом продуктивность по СГ для этих вариантов был: примерно на одинаковом уровне.

Влияние концентрации минеральных солей. Повышение концентрацш минеральных солей МС, с 1 нормы до 2 норм, приводило к значительном] увеличению ростовых параметров культивируемых растений: длины побе гов, длины и количества корней, числа пар листьев и, соответственно сырой и сухой массы (табл. 9.). Так, отмечено увеличение длины побегов £ 1,5 раза, длины корней на одну треть, а их числа примерно на 40%.

Таблица 9

Влияние содержания минеральных солей МС на рост и развитие растений стевии*, выращиваемых на роллере

Содержание солей МС Число побегов, шт Длина побегов, мм Число пар листьев, шт Число корней, шт Длина корней, мм Сырая масса, мг Сухая масса, мг**

1 норма МС 2,0+ 0,0 184,4+ 19,9 9,8+ 0,5 3,1±0,4 39,5+ 9,1 292,9+ 48,7 22,5 12,3

2 нормы МС 2,0+ 0,0 219,2+ 12,7 17,2+ 0,7 4,3+ 0,7 52,6± 17,9 468,0± 46,3 26,0; 16,5

* ** пояснения те же, что и для табл. 6.

Наблюдали - также увеличение числа пар листьев примерно на 75%, общей сырой массы на 60%, а сухой массы листьев более, чем на 30%.

Однако на фоне увеличения показателей роста, при повышении концентрации минеральных солей МС до 2 норм, отмечали резкое (примерно на порядок) снижение содержания СГ в листьях (табл. 10.). Это связано, по-видимиму, с влиянием фосфата, так как из данных литературы хорошо известно негативное влияние повышенных концентраций фосфора на биосинтез многих вторичных веществ в культуре клеток растений [Knobioch, Berlin, 1981; Tumova, 1989; Tamura, 1994].

Таблица 10

влияние концентрации минеральных солей MC па содержание СГ в листьях

астений стевии, выращиваемых на роллерной установке (мг/г сухой массы)

Содержание :олей MC Стеви-озид Ребауди-озид А Ребауди-озид С Ребауди-озид В Стевиол-биозид Суммарное со держ-е СГ

1 норма MC 6,4 2,5 1,2 0,6 0 10,7

2 нормы MC 0,7 0,3 0,1 следы 0 1,1

Влияние регуляторов роста. Добавление в среду регуляторов роста [риводило к существенным изменениям в морфологии растений . Так, при убавлении БАП-0.1 мг/л или БАП+НУК по 0.1 мг/л, происходило величение числа побегов (в варианте с НУК и БАП в 1,5 раза), по равнению с безгормональной средой. При дальнейшем повышении юнцентрации БАП (0,3 мг/л) и НУК (0,5 мг/л) увеличения числа побегов не [роисходило. НУК никакого существенного влияния на формирование :орней не оказывала, в отличие от БАП, при добавлении и увеличения :онцентрации которого происходило резкое ингибирование развития :орневой системы. Так, в варианте с 0,1 мг/л БАП длина корней была на горядок меньше, чем в контроле, а на среде с 0,3 мг/л - на два порядка. При убавлении БАП, а также НУК, происходило заметное снижение сухой taccu по сравнению с безгормональной средой. При культивировании на :реде с ГК (1.0 мг/л) отмечено удлинение побегов и корней (на 20-30%) за :чет вытягивания междоузлий. При этом сырая масса растений 'величивалась на 60%, а сухая - на 15%, за счет роста стеблей.

Таким образом, показана возможность регуляции развития растений ггевии и накопления в них СГ, посредством влияния факторов ;ультивирования (углеводное и минеральное питание, фитогормоны), при ¡ыращивании in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили выявить ряд особенностей образования и накопления СГ в культурах клеток и растениях стевии in •itro, на разных стадиях дифференциации ткани. Обобщенные результаты 1тих исследований можно представить в виде следующего рисунка (рис. 6).

Содержание СГ, мг/г сухой массы

У пробирочных ювенильны 0,7 растений содержание СГ снижаете в 5-7 раз по сравнению с хорош 0,6 развитыми интактным:

^^ растениями. Но, при оптимизацш условий выращивани

-04 (культивирование на роллере развитие растений значительш -0,3 улучшается, что проявляется ) увеличении содержания СГ, то ест] 0,2 наблюдается прямая зависимосп уровня накопления СГ от степеш развития растений.

0,1

Ь0

ЕЗПробнрочн. раст-е Каллус

Рис. 6. Содержание дитерпеновъо СГ в листьях растений г

РИггакшое расг-е □ Рсшерное расг-е

Ш Суспензия ИМорфогеиный каллус полученных культурах клеток.

И ГЬбеги морфоген. каллуса

У полученных каллусных культур гликозиды практически не содержатся, но при глубинном культивировании клеток процессы образования и накопления СГ несколько интенсифицируются, что характерно и для синтеза некоторых других соединений, в частности стероидных сапонинов и экдистероидов [Носов, 1992; Орлова, 1993]. Однако изменение условий культивирования не стимулирует существенно биосинтез и накопление СГ. Восстановление этих процессов происходит лишь при образовании морфогенных структур и формировании побегов.

Положительной корреляции между продуктивностью штамма по биомассе и СГ в культуре клеток не выявлено. Подобной зависимости не обнаружено и между количественным содержанием гликозидов в различных органах донорных растений и полученных культурах клеток.

Все вышеприведенные факты могут свидетельствовать о накоплении СГ в специализированных клетках или клеточных структурах.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены оптимальные условия каллусогенеза и роста первичного каллуса у различных эксплантов растений стевии. Лучшим типом экспланта являются листовые пластинки. Наиболее благоприятным

ючетанием ауксина и цитокинина для роста первичного каллуса, как на тстовых, так и на стеблевых эксплантах, была комбинация НУК и БАП.

2. Определены морфо-физиологические характеристики каллусных и ;успензионных культур стевии. Выявлены различия по этим признакам у сультур клеток различного генотипического и эпигенетического троисхождения. Показано, что ростовые характеристики культур клеток эпределяются в большей степени условиями выращивания, затем ~енотипом донорного растения и в наименьшей мере зависят от шигенетических особенностей эксплантов.

3. Проанализирован качественный состав и количественное удержание стевиол-гликозидов у разных образцов интактных и сультивируемых in vitro растений стевии и выявлены различия как по :уммарному их содержанию, так и по соотношению отдельных веществ во фракции. Качественный состав гликозидов в растениях всех исследованных -енотипов одинаков. Основными стевиол-гликозидами являются стевиозид, i также, в некоторых клонах растений, ребаудиозид А. Содержание >ебаудиозидов С и В значительно ниже. Стевиолбиозид в исследованных >бразцах не обнаружен. У растений in vitro содержание СГ ниже примерно ! 5-6 раз, но при длительном культивировании в этих условиях (около 5 [ет) существенного снижения их содержания не происходит.

4. Определен качественный состав стевиол-гликозидов в каллусных и успензионных культурах клеток различного генотипического и пигенетического происхождния. Показано, что состав гликозидов в :ультурах клеток более беден по сравнению со спектром этих соединений в ¡онорных растениях. Установлено, что в биомассе культивируемых клеток тевиол-гликозиды присутствуют в минорных количествах, причем их одержание в течение цикла роста сильно изменяется. Не выявлено орреляции между количественным содержанием гликозидов в различных рганах донорных растений и полученных культурах клеток.

5. Изучено влияние условий и факторов культивирования температурные режимы, условия освещениия, углеводное и минеральное итание, регуляторы роста) с целью выяснения возможности регуляции оста культур клеток и образования в них стевиол-гликозидов. Остановлено, что вышеперечисленные факторы могут существенно влиять а накопление биомассы, но не оказывают значимого влияния на

содержание гликозидов. Биосинтез этих метаболитов восстанавливаете! лишь при образовании морфогенных структур и формировании побегов.

6. Исследованы особенности выращивания стерильных растений i условиях биореактора и изучено влияние факторов культивированш (регуляторы роста, углеводное и минеральное питание) на их рост v равитие, а также содержание в листьях стевиол-гликозидов. Выявленс преимущество культивирования растений на роллере по сравнению с выращиванием в пробирках. Показана возможность регуляции развития растений, накопления ими биомассы и стевиол-гликозидов посредством влияния изученных факторов.

Автор искренне признателен научному сотруднику ИФР РАН, кандидату фармацевтических наук Решетняк Оксане Владимировне, за помощь при проведении хроматографического анализа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бондарев Н.И Оптимизация каллусогенеза и роста в культуре клеток Stevia rebaudiana Bertoni. // Тез. докл. Междунар. научно-практич. конф. "Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования", Воронеж: ВГАУ. 1995. С. 7-8.

2. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко A.B. Влияние фиторегуляторов на рост каллусной ткани стевии (Stevia rebaudiana Bertoni). // Регуляторы роста и развития растений. Тез. докл. IV Междунар. конф. (24-26 июня 1997 г.), М.: РАСХН. 1997. С. 286.

3. Бондарев Н.И., Решетняк О.В., Носов A.M. Анализ дитерпеновых гликозидов в культуре клеток стевии (Stevia rebaudiana Bertoni). // Материалы II Международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". (16-20 июня 1997 г.), Пущино, 1997. Т. 2. С. 29-30.

4. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко A.B. Влияние трофических факторов на рост клеток стевии {Stevia rebaudiana Bertoni) при глубинном культивировании. Там же, Т. 3. С. 154-155.

5. Bondarev N.I., Reshetnyak O.V. and Nosov A.M. Diterpenoid Glycosides Biosynthesis in Stevia rebaudiana Bertoni Tissue Culture. In: "Hot Topics. Addendum Booklet". World Congress on In Vitro Biology, 1997. Defining Cellular Mechanisms in Vitro. Washington. DC. USA. June 14-18. 1997. P. 15.

6. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Сравнение ростовых фаметров суспензионной культуры клеток стевии при выращивании в шбах и ферментере. // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и ,хранение генофонда. Тез. докл. VII Междунар. конф. (25-28 ноября 1997

). Москва. 1997. С. 196.

7. Бондарев Н. И., Носов А. М„ Корниенко А. В. Влияние факторов /льтивирования на рост и продуктивность каллусной и суспензионной /льтур клеток стевии. // Биотехнология. 1997. № 7-8. С. 30-37.

8. Бондарев Н.И., Носов A.M., Корниенко А.В. Влияние экзогенных егуляторов роста на каллусогенез и рост культур клеток Stevia rebaudiana

ertoni. // Физиол. раст. 1998. Т. 45. № 6. С. 888-892.

9 Bondarev N.I. and Nosov A.M. Trophic and Hormonal Factors Influence n Stevia rebaudiana Bertoni Shoots Growth in the Roller Bioreactor. // .bstr 1998 Congress on In Vitro Biology, May 30-June 3, 1998, Las Vegas, IV, USA. In J.: In Vitro Cellular & Develop. Biol. 1998. V. 34. N 3 (II). P. 77.

Гарнитура Times. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Уч.-изд. л 1,0 Усл. печ. л 1,5. Тираж ЮОэкз.

"Биоинформсервис", 117984, Москва, ул. Вавилова 32. Отпечатано с готового оригинал-макета.