Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хозяйственно-биологические показатели представителей семейства Crassulaceae DC. (толстянковые), рода Sedum s.l.: S. spectabile, S. caucasicum, S. oppositifolium и S. lineare в условиях РСО-Алания

ВАК РФ 03.02.14, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Хозяйственно-биологические показатели представителей семейства Crassulaceae DC. (толстянковые), рода Sedum s.l.: S. spectabile, S. caucasicum, S. oppositifolium и S. lineare в условиях РСО-Алания"

На правах рукописи

Наниева Линда Ботазовна

Хозяйственно-биологические показатели представителей семейства Crassulaceae DC. (толстянковые), рода Sedum s.L: S. spectabile, S. caucasicum, S. oppositifotíum и S. lineare в условиях РСО-Алания

Специальность 03.02.14-биологические ресурсы

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ОКТ 2014

Владикавказ - 2014

\

005552848

Работа выполнена на кафедре биологической технологии ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры биологической технологии ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» Гревцова Светлана Алексеевна

заслуженный деятель науки РФ и РСО-Алания, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, директор НИИ биотехнологии, заведующий кафедрой биологической технологии ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет»

Цугкиев Борис георгиевнч

доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории декоративных культур центра генетики, селекции и интродукции садовых культур ГНУ «Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства». Сороколудова Ольга Анатольевна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела Гербарий Ботанического института РАН Бялт Вячеслав Вячеславович

Ботанический с ад-институт Дальневосточного отделения РАН

Защита диссертации состоится 30 октября 2014 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.023.04 при ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» по адресу: 362040, г. Владикавказ, ул. Кирова 37, Горский ГАУ, зал заседаний диссертационного совета.

Тел./факс: (8672) 53-99-26; E-mail: ggaubiores@mail.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» и на официальном сайте www.gorskigau.com

Текст объявления о защите диссертации и автореферат диссертации отправлены в Минобрнауки РФ по адресу: référât vak@mon.gov.ru 28 августа 2014 г.

Автореферат диссертации разослан «vS"" » сентября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Гревцова Светлана Алексеевна

Актуальность темы. Растительный мир РСО-Алания многообразен и имеет большое народнохозяйственное значение. Видовой состав растительности республики, с учетом зональной и высотной дифференциации, насчитывает более 2 тысяч представителей, многие из которых являются ценнейшими природными ресурсами. Почвенно-климатические условия и природно-гсографичсская среда PCO - Алания являются благоприятными для произрастания и возделывания широкой номенклатуры лекарственных растений.

Известно, что нетрадиционные культуры характеризуются высокой биологической пластичностью и адаптивностью, превосходно сочетают высокую продуктивность с высокой экологической устойчивостью, продуктивным долголетием, хорошими кормовыми достоинствами, устойчивым семеноводством. Повышенный интерес к интродукции новых и нетрадиционных культур вызван стремлением найти экономически более выгодные источники продовольственных, кормовых и технических ресурсов (Шевелуха, 1993; Абиева, 2006).

Интродукция новых перспективных растений может стать не только источником лекарственного сырья для фармацевтической промышленности, но и дополнительным источником увеличения производства дешевых, энергонасыщенных кормовых добавок, несущих в себе высокий биологический потенциал, включая лечебную практику (Тютюнников, Цугкиев, 1996).

Помимо традиционного метода сохранения генофонда лекарственных растений в качестве источника биологически активных веществ - интродукции, существует также иной перспективный метод - метод культивирования растительных клеток в условиях in vitro. Данный метод дает возможность получения экологически чистого сырья, независимо от климатических условий, круглый год (Плынская, 2009; Наниева, 2013).

Целью исследований явилось изучение хозяйственно-биологических свойств некоторых представителей семейства толстянковые (Crassulaceae DC.), родаSedurti s.I.

В задачи исследовании входило:

1. Дать фенологическую характеристику некоторых представителей семейства Crassulaceae DC, интродуцируемых в условиях РСО-Алания.

2. Разработать технологию возделывания и оценить перспективность интродукции в Sedum spectabile, S. caucasicwn, S. oppositifolium и S.lmeare в условиях РСО-Алания.

3. Изучить питательную ценность S. speciabile, S. caucasicum, S. oppositifolium и S. Lineare, выращиваемых в условиях РСО-Алания.

4. Изучить биохимический состав биомассы S. speclabile, S. caucasicum, S. oppositifolium tt S. lineare, выращиваемых в РСО-Алания.

5. Получить каллусные культуры S. oppositifolium, S. spectabüe, S. caucasicum и S. lineare в условиях in vitro.

6.Провести цитологический и биохимический анализ каллус пых клеток, а также идентификацию вторичных метаболитов.

Научная новизна исследований заключается в том, что впервые, в условиях РСО-Алания, в коллекционном питомнике НИИ биотехнологии Горского ГАУ проведена интродукция растений семейства Crassulaceae DC., рода Sedum s.I.: Sedum oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S.lmeare.

Установлены хозяйственно-биологические свойства и биохимический состав растений Sedum oppositifolium, S. speclabile, S. caucasicum и S. lineare, культивируемых в РСО-Алания.

Впервые в РСО-Алания получены каллусные культуры Sedum oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare, изучен биохимический состав получешшх каллусных культур и определено наличие в них вторичных метаболитов.

Практическая значимость работы заключается в разработке технологии возделывания очитков S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare в агроклиматических условиях РСО-Алания и получении вторичных метаболитов исследуемых интродуцентов in vitro.

Производству рекомендованы оптимальные приемы возделывания растений S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare в условиях РСО-Алания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фенологических наблюдений за растениями S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare.

2. Оценка успешности интродукции представителей семейства Crassulaceae DC. рода Sedum s.l. в условиях РСО-Алания.

3. Показатели питательной ценности растений семейства Crassulaceae DC. в условиях РСО-Алания.

4. Показатели биохимического состава S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare, выращиваемых в условиях РСО-Алания.

5. Характеристика каллусных культур, полученных от изучаемых очитков (in vitro) и результаты идентификации вторичных метаболитов.

Апробация работы. Результаты исследования доложены или представлены на: международной научно-производственной конференции «Новые направления в решении проблем АПК на основе современных ресурсосберегающих инновационных технологий» (Владикавказ, 2011); международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Горского ГАУ 26-27 ноября 2013 г. (Владикавказ, 2013); IV-Международной научно-практической конференциии «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2013-2014), на ежегодных научно-практических конференциях Горского ГАУ (2009 - 2014 г.г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка. Работа изложена на 149 страницах, включает 17 таблиц, 25 рисунков и 3 приложения. Список цитируемой литературы содержит 205 наименований, в том числе 31 на иностранных языках.

1. Обзор литературы

В главе приведен обзор из основных работ отечественных и зарубежных исследователей по тематике диссертационной работы. Из анализа использованной литературы следует, что до настоящего времени внедрена в культуру лишь незначительная часть существующих видов растений. Этот показатель по флоре высших растений достигает 1-2%. Авторы отмечают, что интродукция новых перспективных растений может стать не только источником лекарственного сырья для фармацевтической промышленности, но и дополнительным источником увеличения производства дешевых, энергонасыщенных кормовых добавок, несущих в себе высокий биологический потенциал, включая лечебную практику.

Приведены сведения, что многие представители семейства толстянковые (Crassulaceae ЕЮ.) известны как лекарственные растения, в том числе: Kalanchoe (каланхое) R. rosea (родиола розовая, или золотой корень), Sryophyllum (бриофиллум), Sedum acre (очиток едкий), Telephiwn maximum (очиток большой) и др. -

Ряд исследователей считает, что культивирование каллусной ткани лекарственных растений в условиях in vitro, представляет научный интерес, как источник получения различных биологически активных веществ

Таким образом, из анализа научной литературы следует, что представители семейства Crassulaceae DC. представляют значительный интерес в качестве лекарственного сырья, а также как продуценты биологически активных веществ in vitro.

1. Материал и методы исследования

Диссертационные исследования проводились в НИИ биотехнологии и на кафедре биотехнологий Горского государственного аграрного университета (предгорная зона РСО-Алания, восточная окраина г. Владикавказа, четвертый агроклиматический район).

В описании климатических условий за период выполнения диссертационного исследования использовались данные Северо-Осетинского центра по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (Госдоклад..., 2010,2011, 2012).

Средний температурный минимум зафиксирован в феврале месяце в 2011 году — 3,8°С, а среднемесячный температурный максимум был в августе 2010 года - 23,7°С. Наиболее дождливым месяем оказался июнь 2011 года - 225,7 мм.

В 2010-2012 гг. не зафиксировано каких-либо критических периодов, которые могли бы отразиться на качестве интродукционных исследований.

Исходным материалом для интродукции послужили очитки, полученные в виде живых растений из разных районов. Так, S. oppositifolium (очиток супротиволистный) привезен из Куртатинского ущелья РСО-Алания, S. caucasicum (очиток кавказский) - из Дигорского ущелья РСО-Алания, S. spectabile (очиток видный) - вид местной репродукции, использующийся ранее как декоративное растение, S. lineare (очиток линейный) - вид природной флоры Восточной Азии (Китай, Япония), привезенный из Абхазии, где одичал и встречается как заносное растение.

Полевые исследования проводились на экспериментальном участке НИИ биотехнологии Горского ГАУ. Площадь опытного участка составила 36 м2_ а учетная площадь но каждому виду - 9 м2 при четырехкратной повторности.

Агротехнические мероприятия в период вегетации растений очитков в год посадки, во второй и третий годы жизни включали: прополку, окучивание, срез стеблей, черенкование.

Закладку и проведение полевого опыта осуществляли методом «Латинский квадрат» 4x4 по БА. Доспехову (Методика полевого опыта, 1985; Методические указания по размещению полевых опытов и статистической обработке результатов исследований, 1968; Адиньяев, 2013).

Фенологические исследования проводили согласно «Методическим указаниям по селекции многолетних трав» (1985).

В год посева отмечали даты: посева, всходов и дружного появления, стеблевания (1), бутонизации (2), цветения (3), формирования (4) и созревания плодов (5), отмирания надземных органов растений.

Динамику роста растений в высоту определяли путем промеров от основания до верхушки стебля. На каждой делянке проводили 10 измерений.

Число листьев на растении определяли путем их подсчета, входящих в выборку, с последующим выведением среднего арифметического.

Площадь листового аппарата определяли методом высечек (Адиньяев, Абаев, 2013).

Чистую продуктивность фотосинтеза определяли расчетным путем (Адиньяев, Абаев,

2013).

Морфологию семян описывали по Г.Г. Гатаулиной (1995), А. Карпову (1959), С.Б. Гончаровой (2006).

Определение всхожести семян проводили по ГОСТ 12038-84.

Определение массы 1000 семян осуществляли по ГОСТ 13056.4-67.

Оценку успешности интродукции проводили по трехбалльной системе, предложенной P.A. Карписоновой и В.Н. Быловым (1978).

Химические исследования проводили с использованием средних проб зеленой массы растений, отобранных в соответствии с ГОСТ 23637-79.

В исследуемых образцах определяли: первоначальную влагу - методом высушивания но ГОСТ 27548-97; содержание «сырого» протеина - по Къельдалго, ГОСТ 13496.4-93; «сырого» жира - методом Соке лета, ГОСТ 13496.15-97; «сырой» клетчатки - по Геннебергу и Штоману, ГОСТ 52839-2007; «сырой» золы - методом сухого озоления, ГОСТ 26226-95;

БЭВ - расчетным методом; витамина С (аскорбиновой кислоты) - по ГОСТ 139698; бета-каротина - по ГОСТ 13496.17-95.

Аминокислотный состав определяли методом ионообменной хроматографии на автоматическом аминоанализаторе А-400-АА.

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов очитков проводили на квадрупольном хромато-масс-спектрографе фирмы «Agilent Technolog» 5860/5973 в химико-тксикологической лаборатории Северо-Осетинского республиканского наркологического диспансера Анализ проводили в режиме сканирования. Идентификацию осуществляли по сравнению масс-спектра вещества со стандартными спектрами библиотек ТОХЗ и NIST02.

Получение клеток и тканей растительных культур in vitro, суспензионное культивирование, в т.ч. стерилизацию .растительных эксплантов, а также цитологический анализ проводили согласно методикам Р.Г. Бутенко (1964; 1987; 1999)

3. Интродукция некоторых представителей семейства Crassulaceae DC. рода Sedum s.1. в условиях РСО-Алаиип 3.1. Фенологические исследования представителей семейства Crassulaceae DC.

Фенологические наблюдения дают материал о степени соответствия интродуцента новым условиям среды (Зайцев, 1983). Мы провели исследования о наступлении стадий вегетации очитков по фенодагам в 2010-2012 гг. Результаты наблюдений приведены на таблице 1.

Таблица 1 - Фенологические наблюдения за сезонным развитием представителей семейства Crassulaceae DC.

Виды растений Фенодаты

Начало появления всходов Полное появление всходов I Бутонизац ия Начало цветения Массовое цветение Конец цветения Начало созревания .плодов Массовое созревание плодов Диссемина ция 5 я 3 1Б О а? « «9

Очиток :упротиволистный [S. oppositifolium) 39.04 30.05 14.06 05.07 20.07 25.07 31.07 37.08 28.08

Очиток кавказский S caucasicum) 15.04 15.06 36.07 30.07 35.08 18.08 25.08 10.09 25.09

Очиток видный 'S. spectabile) 17.04 10.06 34.07 20.08 29.08 25.09 30.09 07.11 25.11 ■

Очиток линейный f£ lineare) 25.04 15.05 £6.05 30.05 34.06 11.06 15.06 20.06 05.07 -

Установлено, что все изучаемые нами виды очитков начинают вегетацию в апреле месяце. Стадия бутонизации у очитка супротиволистного (5. oppositifolium) начинается в июне месяце, у очитка кавказского (6'. caucasicum) и видного (S. spectabile) - в июле месяце, а у очитка линейного (S. lineare) - в мае месяце.

Нами также были определены основные морфометрические показатели очитков: длина стебля, количество листьев, площадь листового аппарата и подсчитана чистая продуктивность фотосинтеза всех интродуцируемых видов очитков в фазе цветения, которая является наиболее перспективной в плане практического использования очитков. Учетный период составил 31 сутки. Полученные данные приведены в таблице 2.

Результаты проведенных фенологических наблюдений и морфометрические параметры свидетельствуют о том, что S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare благополучно прошли все стадии развития в условиях РСО-Алания, что подтверждается повышением чистой продуктивности фотосинтеза растений.

Таблица 2 - Фенологические параметры растений в фазе цветения (п=10)

Вид расгекня Длина стебля, см Количество листьев, птт Площадь листового см» аппарата, Чистая продуктивность фотосинтеза, г/ьр/сугки

Год наблюдения

2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012 2010 2011 2012

Очиток видный (S. spectabile) 42,90 ±2,84 41,50 ±2,56 43,20 ±2,60 28,50 ±1,19 31,10 ±1,20 30.30 ±1,04 18,65 ±2,52 18,69 ±2,20 18,74 ±2,50 0,33 ±0,0002 0,35 ±0,0003 0,35 ±0,0003

Очиток кавказский (5. caucasicum) 31,20 ±2,24 31,60 ±2,20 31,90 ±2,18 14,30 ±0,80 14,10 ± 1,20 15,20 ±1,30 36,16 ±6,07 36,07 ±6,01 36,19 ±6,1 0,32 ±0,0006 0,34 ±0,0004 0,36 ± 0,0003

Очкгок супротиволистиый (S. oppositifolium) 10,50 ±0,74 11,20 ±0.69 10,80 ±0,77 10,40 ± 0.S9 10,70 ±0,77 10,60 ±0,83 1 22 ±0,16 1,21 ±0,13 1,22 ±0,17 0,65 ±0,0001 0,68 ±0,0001 0,71 ±0,0002

Очиток линейный (5. lineare) 20,40 ±3,40 21,30 ±3,00 20,90 ±2,30 40,60 ±2,77 37,80 ±2,50 40,90± 2,45 0,29 ±0,07 0,28 ±0,06 0,30 ±0,07 6,00 ±0,0010 6,50 ±0,0020 6,98 ± 0,0010

Результаты проведенных фенологических наблюдений и морфометрические параметры свидетельствуют о том, что S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare благополучно прошли все стадии развития в условиях РСО-Алания.

3.2. Морфология и семейная продуктивность очитков в лабораторных условиях. Морфология семян очитков, интродуцируемых в условиях РСО-Алания.По

данным ряда авторов (Гончарова, 1999, 2006; Аксенов 2001; Бялт и др., 2004; Бачаров и др., 2007; Прокопьев, 2008) семена представителей семейства Сган.Ыасеае ОС. очень мелкие, длиной 1мм и менее. Окраска кожуры может быть от светло - до темно-коричневого цвета. Масса 1000 семян составляет в среднем 0,02 г. Полученные нами данные при изучении морфологических показателей семян интродуцируемых в РСО-Алания очитков приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Морфологические показатели семян очитков в условиях ______РСО-Алания

Образец Очертание семян Форма семян Окраска ссмян Поверхность семян Масса 1000 семян, г

S. spectabile (очиток видный) заостренно-яйцевидная удлиненная коричневая ребристая 0,065

S. caucasicum (читок кавказский) заостренно-яйцевидная удлиненная коричневая ребристая 0,065

S.oppositifolium (очиток супротиволистиый) лопатоввдная конусная коричневая шероховатая 0,025

S. lineare (очиток линейный) опилковидная конусная коричневая шероховатая 0,025

Установлено (табл. 3), что очертание ссмян изучаемых видов очитков разнообразная при удлиненной или конусной форме; окраска семян всех видов коричневая при ребристой или шероховатой поверхности; масса 1000 г семян колеблется от 0,025 г (S.oppositifolium, S. Lineare) цо 0,065 (S. Spectabile, S. caucasicum). т.е.существенно выше литературных данных.

Энергия прорастания и всхожесть семян очитков в лабораторных условиях По результатам проведенных нами исследований следует отметить (табл. 4), что семена очитка видного и очитка кавказского обладают достаточно высокой лабораторной всхожестью (73% и 62%). Полученные проростки в дальнейшей работе были использованы нами для получения каллусной культуры. Семена очитка линейного и очитка супротиволистного не взошли, следовательно, семенное размножите этих видов очитков в условиях РСО-Алания невозможно.

Таблица 4- Всхожесть семян разных видов очитков в лабораторных условиях

Вид Начало прорастания семян, дней Длительность прорастания семян, дней Всхожесть семян, %

S. spectabile (очиток видный) На 3 день 10 62

S. caucasicum (читок кавказский) На 3 день 10 73

S. oppositifolium (очиток супротиволистный) - -

£ lineare (очиток линейный) - - -

3.3. Приемы возделывания представителей семейства Crassuíaceae DC рода Sedum s.l. в

условиях РСО-Алапня

В 2010-2012 гг. в коллекционном питомнике Горского ГАУ нами были интродуцированны очитки 5. oppositifolium, S. caucasicum, S. lineare, S. Spectabile и установлено, что представители семейства Crassuíaceae DC. крайне неприхотливы к условиям культивирования.

Исследуемые виды очитков или кустовые (S. spectabile, S. caucasicinn), или почвопокровные (S. oppositifolium, S. lineare) и предпочитают окультуренную почву. Посадку и размножение можно проводить весной (апрель) или осенью (октябрь-ноябрь) на грядки с хорошо разделанной почвой. Необходимым мероприятием является вспашка на глубину 20 см.

Для очитков видного и кавказского (S. Spectabile и S. caucasicum) размножение рекомендуется проводить черенкованием, или путем деления разросшегося куста на 4-5 частей. При пересадке в новую грядку полив обязателен в течение первых 2-3 дней, но не обильный. Черенкование рекомендуется проводить каждые 2-3 года, при необходимости -каждый год.

У почвопокровных очитков - супротиволистного и линейного (S. Oppositifolium и S. lineare) для размножения и пересадки срезают верхушки побегов и россыпью раскладывают на новый подготовленный участок, присыпают небольшим слоем земли и поливают 3-5 дней, но не обильно.

Нарастание вегетативной массы у всех шпродуцируемых очитков продолжается до августа-сентября месяца.

Ранней весной требуется «омоложение» для очитка видного и очитка кавказского, т.е. необходимо удаление старых, оставшихся с осени побегов, что стимулирует скорое отрастание новых «молодых» побегов.

У очитков линейного и супротиволистного семенное размножение в условиях РСО-Алалия проблематично, т.к. в лабораторных условиях всхожесть их семян была равна 0%. Однако вегетативное размножение является очень перспективным для этих видов в течение всего года

Все изучаемые нами виды очитков легко переносят прямой солнечный свет.

У очитка видного и очитка кавказского рекомендуется осенью срезать стебли до нижних листьев; на участке произрастания обязательны частые мероприятия по удалению сорной растительности и рыхлению почвы; очитки достаточно засухоустойчивы, поэтому поливы необходимо проводить только в сухую погоду (которая длится несколько дней) и при пересадках. В связи с морозоустойчивостью данных очитков, укрытия им на зиму не требуется.

Таким образом, все мероприятия по возделыванию очитков (S. oppositifolium, S. caucasicum, S. lineare, S. spectabile) не требуют больших физических и материальных затрат,

а умеренно-континентальный климат РСО-Алания является благоприятным для их выращивания.

3.4,Оценка перспективности интродукции очитков в условиях РСО-Ллания по хозяйственно-биологическим признакам

Оценку перспективности интродукции проводили по следующим признакам, которые наблюдали на протяжетш трехлетних исследований:

1 Способность к семенному размножению, включая всхожесть семян в лабораторных

условиях;

2) способность к вегетативному размножению;

3) общий вид растения в условиях интродукции;

4) устойчивость к болезням и вредителям;

5) засухо- и морозоустойчивость.

Оценку проводили по трехбалльной системе с использованием комплексной бальной шкалы, предложенной P.A. Карписоновой и В.Н. Быловым (1978). По сумме баллов судили о степени перспективности растении: 5-9 баллов - М - малоперспективное, 9-11 баллов - П -перспективное, 12-15 баллов - ОП - очень перспективное. Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Оценка перспективности и успешности интродукции очитков в коллекционном питомнике Горского ГАУ, балл (в среднем за 2010-2012 гг.)

Виды очитков Семенное размножение, всхожесть семян Вегетативное размножение Габитус в культуре Устойчивость к болезням и вредителям Зимо- и засухостойкость | Сумма баллов Перспективность в культуре

S. spectabile (очиток видный) 2 3 3 3 3 14 orí

S. caucasicum (читок кавказский) 2 3 2 2 3 13 ОП

S.oppositifoHum (очиток супротиволистный) 3 3 3 3 12 ОП

S. lineare (очиток линейный) - 3 3 3 3 12 ОП

Установлено (табл.5), что очитки S. oppositifolium, S. caucasicum, S. lineare, S. spectabile являются высокоперспективными растениями для возделывания в условиях РСО-Алания.

4. Питательная ценность растений семейства Crassulaceae ПС. в условиях РСО-Алания

Для определения питательной ценности растений необходимо изучение их химического состава. Основными являются показатели содержания в растениях «сырого» протеина, «сырой» клетчатки, «сырого» жира, зольных элементов, безазотистых экстрактивных веществ, вигамин С и [}-каротина и т.д.

Полученные нами показатели содержания питательных веществ в растениях S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare в фазе цветения приведены в таблице 6.

Таблица б - Содержание питательных веществ в растениях семейства Crassulaceae DC.

(2010-2012 гг.)

Название растения Сухое вещество, % «Сырой» протеин, % «Сырой» жир, % «Сырая» клетчатка, % «Сырая» зола, % БЭВ, % Витамин С, иг/% Р- каротин, мг/кг

S. spectabile (очиток видный) 9,42 ±0,329 9,06 ±0,08 6.39 ±0,102 16,88 ±0,209 28,30 ±0,201 39,37 ±0,26 8,80 ±0,09 2,00 ±0,009

S. caucasiciun (читок кавказский) 6,84 ±0,13 14,60 ±0,118 7,83 ±0,23 36,22 ±0,361 15,10 ±0,32 26,25 ±0,158 7,10 ±0,065 1,25 ±0,01

& oppositifolium (очиток супротаволистпый) 7,94 ±0,148 15,63 ±0,047 8,06 ±0,114 31,48 ±0,185 12,60 ±0,273 32,23 ±0,208 8,80 ±0,074 1,42 ±0,017

S. lineare (очиток линейный) 12,10 ±0,271 13,45 ±0,10 7,70 ±0,13 28,50 ±0,40 18,40 ±0,39 31,95 ±0,042 7,60 ±0,10 3,00 ±0,034

Из анализа данных таблицы б следует, что все исследуемые очитки имеют невысокое содержание сухих веществ, что характерно для класса суккулентов, особенностью которых является содержание большого количества влаги.

Было установлено, что наибольшее количество «сырого» протеина содержится в очитке супротиволистном - 15,63%. В очитках кавказском и линейном «сырого» протеина содержится значительпо меньше - 14,60% и 13,45% соответственно. Наименьшее количество «сырого» протеина содержится в очитке видном - 9,06%.

Содержание «сырого» жира во всех очитках довольно высокое - от 6,39 до 8,06% и колеблется по видам очитков незначительно, наибольшее его количество отмечено у очитка супротиволистного - 8,06%.

Наибольшее содержание «сырой» клетчатки установлено в очитке кавказском -36,22%, незначительно меньше в очитке супротиволистном и очитке линейном - 31,48% и 28,50%. Наименьшее количество «сырой» клетчатки выявлено в очитке видном - почти в два раза меньше, чем в очитке кавказском - 16,88%.

Содержание «сырой» золы в разных очитках колебалось в значительных пределах. Так, в очитке видном содержание «сырой» золы составило 28,30%, в очитке кавказском -15,10%, в очитке супротиволистном - 12,60%, а в очитке лилейном - 18,40%.

Процентное содержание безазотистых экстрактивных веществ во всех образцах достаточно велико. В очитке видном содержание БЭВ равно 39,37%, в очитке кавказском -26,25%, в очитке супротиволистном - 32,23%, а в очитке линейном - 31,95%.

Определение аскорбиновой кислоты и (3-каротина, позволяет оценить антиоксидантную способность исследуемых очитков. Содержание витамина С в очитке видном и очитке супротиволистном соствило 8,80 мг%, а р-каротина - 2,00 мг/кг и 1,42 мг/кг, содержание аскорбиновой кислоты в очитке кавказском и очитке линейном составило 7,10 мг% и 7,60 мг%, а р-каротина - 1,25 мг/кг и 3,00 мг/кг соответственно, что позволяет использовать данные растения в качестве витаминной кормовой добавки в рацион животных.

Для полноты питательной ценности исследуемых интродуцентов мы определяли в них содержание таких ценных питательных веществ, как аминокислоты. Источником незаменимых аминокислот, которые не может вырабатывать животный организм самостоятельно, являются растения. Следовательно, аминокислотный состав исследуемых очитков является важным показателем их питательности.

Данные таблицы 7 свидетельствуют, что в очитках содержится 16 аминокислот, из которых валин, треонин, метионин, лизин, лейцин, изолейцин, гистидин и фенилалании являются незаменимыми. При этом во всех исследуемых очитках присутствуют все перечисленные незаменимые аминокислоты.

Таблица 7 - Аминокислотный состав растений семейства Crassulaceae DC. в условиях РСО-

Алания

Вид растения Аминокислоты, % от СВ

Аспарагиновая кислота (Asp) g a¡ о и А. И tí w ¥ 8- о Глютамииова кислота (Glu) Пролнн (Pro) О в Ü? 5, Алании (Ala) Валпн (Val) Метношга (Met) .'зГ X К ё и R 3 к Лейцин (Leu) Тирозин (Туг) 1 § (0 es 5 'w © Гистидкн (His) Лизин (Lys) Аргинин (Arg)

Очиток видный (S. spectabile) 0,24 0,13 0,12 0.37 0,13 0,15 0,15 0,12 0.02 0,12 0,21 0,05 0,11 0,11 0,10 0,11

Очиток линейный {S. lineare) 0.34 0,18 0,15 0,52 0,18 0,21 0.20 0,18 0,03 0.17 0,28 0,08 0,14 0,12 0,13 0,22

Очиток супротиволистный (S. oppositifolium) 0,69 0,29 0,26 1,05 0,24 0,39 0,33 0,28 0,04 0,26 0,45 0,15 0,25 0,19 0,26 0,42

Очиток кавказский (Si caucasicum) 032 0,17 0.16 0,61 0,11 0,20 0,18 0,16 0,02 0,16 0,25 0,06 0,14 0,13 0,13 0,20

Анализируя аминокислотный состав очитков (табл. 7), следует отметить, что исследуемые аминокислоты обнаружены во всех очитках. Однако необходимо указать, что очиток супротиволистный содержит наибольшее количество незаменимых аминокислот -2,02% от СВ. В очитке видном содержание незаменимых аминокислот составило 0,92% от СВ; в очитке линейном - 1,23%, а в очитке кавказском - 1,16% .

Наиболее богатым аминокислотным составом обладает очиток супротиволистный, суммарное количество аминокислот в сухом веществе которого равно 5,55%. Наименьшее количество аминокислот содержится в очитке видном - 2,24%.

5. Биохимический состап очитков, ннтродуциронанных в РСО-Алания (in vivo)

Хроматографическин анализ и идентификация биологически активных веществ.

Растения вырабатывают значительное количество сложных химических соединений, не образующихся в животном организме. Лечебное действие многих видов лекарственных растений, применяющихся в медицине, связано с наличием в них различных биологически активных веществ, которые при поступлении в организм проявляют физиологически активные свойства и оказывают лечебное действие (Георгиевский, 1990; Пасешниченко, 2001).

С целью более полного изучения химического состава исследуемых очитков, а также изучения наличия биологически активных веществ и их количественного содержания в процентах от общего числа обнаруженных компонентов мы провели анализ и идентификацию веществ хромато-масс-спекгрометричесиким методом.

Учитывая избирательную растворимость биологически активных веществ, пробами для введения в хромато-масс-спектрограф послужили вытяжки всех исследуемых очитков в трех растворителях (1:10): этаноле (96%), метаноле и хлороформе.

В таблице 8 представлены результаты хромато-масс-спектрометрического анализа очитка видного (5. spectabile). В хлороформной вытяжке (X) было обнаружено 15 компонентов; в этанолыюй (Э) - 22 компонента; в (М) метанолыюй -23 компонента.

При идентификации хромато-масс-спектров биологически активных веществ, содержащихся в очитке видном (S. spectabile), в % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК), были обнаружены такие классы биологически активных веществ, как:

насыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты (НЖК, ПНЖК), фитостеролы и стероидные соединения, терпеновые соединения, воскообразующие вещества, высшие спирты и другие соединения. В комплексе большинство веществ являются составляющими компонентами эфирного масла, воска и жирного масла.

Таблица 8 - Основные биологически активные вещества, содержащиеся в очитке видном, идентифицированные с помощью хроматографии масс-спектрометрии, % от общего числа _ обнаруженных компонентов (ОЧОК)

Систематическое название (ШРАС) Тривиальное название Растворитель

Хлороформ Метанол Этанол

% от общей числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 15) % от общегс числа обнаруженных компонентов (ОЧОК =23) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 22)

Тетрадекановая кислота Миристиновая кислота 1,73 0,47 -

Гексадекановая кислота Пальмитиновая кислота - 3,93 12,35

9,12,15- октадекатриеновая кислота а-линоленовая кислота 4,35 - -

9,12- октадекадиеновая кислота Линолевая кислота - - 1,93

Кампестерол Кампестерол 3,66 - 3,64

Бета-, гамма-ситостерол Ситостерол 28,07 - 20,60

Фитол Фитол 1,59 - _

Лупенон Лупенон - _ 7,72

Альфа-, бета-, гамма-токоферол Токоферол, витамин Е - 25,37 18,69

Холестан 8,01 _

Нонакозал - 5,06

Триаконтан 6,20 - -

Гептакозан 6,24 _

2-метокси-4-винилфенол Пара- винилгваякол - 0,67 -

Октадекагидро-2Н-пицен-3-он - - 6,02

7,11,16- тетраметилгекса-2,6,10,14-тетраен-1 -ол 3,68 - -

Е-8-метил-7-додецен-1-ол ацетат - 17,78 -

2-этил-5-изопнтил-тиофен - - 22,93

Не . идентифицированные вещества 36,47 51,78 1,06

Следует отметить, что превалирующими биологически активными веществами, входящими в состав очитка видного, относительно общего числа обнаруженных компонентов, в (Х)-вытяжке (ОЧОК=15) являются: ситостерол - 25,37% от ОЧОК; в (М)-вьггяжке (ОЧОК=23) - токоферол - 28,07% от ОЧОК, Е-8-метил-7-додецен-1-ол ацетат в количестве 17,78% от ОЧОК; в (Э)-вытяжке (ОЧОК=22) - пальмитиновая кислота - 12,35% ОЧОК, ситостерол -20,60% ОЧОК, токоферол -18,69% ОЧОК.

Таким образом, согласно биохимическому составу очитка видного следует, что данный растительный ресурс имеет большой энергетический запас по содержанию жирных кислот; обладает антиоксидантной активностью, благодаря присутствию витамина Е, полиненасыщенных жирных кислот, фитостеродов и других сопутствующих веществ; обладает самозащитными функциями, благодаря большому содержанию воскообразующих веществ. Также можно судить о его терапевтической активности но присутствию терпеновых соединений, фитостеролов, стероида и специфических физиологически активных веществ (октадекагидро-2Н-пицен-3-он, 2-этил-5-изопнтил-тиофен, Е-8-метил-7-додецен-1-ол ацетат, 7,11,16-тетраметилгекса-2,6,10,14-тетраен-1-ол, пара-винилгваякол).

В таблице 9 представлен биохимический состав очитка кавказского (5. саисайсит) в % от общего числа обнаруженных компонентов: в (X) обнаружено 18 компонентов, в (М) ОЧОК=75, в (Э) ОЧОК=Ю8 компонентов.

Как показано, очиток кавказский содержит комплекс насыщенных и ненасыщенных жирных кислот: миристиновая кислота, пальмитиновая, стеариновая, арахиновая, маргариновая кислота, ундецилстая кислота, линолевая кислота.

Из фитостеролов в очитке кавказском были идентифицированы: ситостерол и кампестерол.

Следует отметить, что превалирующими биологически активными веществами, входящими в состав очитка кавказского относительно общего числа обнаруженных компонентов в (Х)-выгяжке (ОЧОК=18) являются: пальмитиновая кислота - 22,67% от ОЧОК, линолевая кислота - 19,39% от ОЧОК, сквален - 14,6% от ОЧОК; в (Э)-вытяжке (ОЧОК=Ю8): ситостерол - 25,37% от ОЧОК, линолевая кислота - 22,83% от ОЧОК, пальмитиновая кислота - 16,29% от ОЧОК, циклоурсан-3-он - 14,37% от ОЧОК; в (М)-вьггяжке (ОЧОК=75): линолевая кислота - 29,66% от ОЧОК, токоферол - 7,89% от ОЧОК, фитол - 7,75% от ОЧОК.

Таким образом, биохимический состав очитка кавказского богат различными классами биологически активных веществ (жирные кислоты, тритерпеноиды, фитостеролы, витамины, воскообразующие вещества и другие физиологически активные вещества). Тем самым данный представитель семейства толстянковые обладает антиоксидантной и биологической активностью.

Таблица 9 — Основные биологически активные вещества, содержащиеся в очитке кавказском __(£ саисаз1сит)_

Систематическое название (IUPAC) Тривиальное название Растворитель

Хлороформ Метанол Этанол

% от общего числа обнаруженных компонентов СОЧОК = 18 ) Уо от общего тесла обнаруженных компонентов СОЧОК = 75) Уо от общего •шсла обнаруженных компонентов СОЧОК = 108)

Тетрадекановая кислота Миристино вая кислота 5,50 5,72 3,00

Гексадекановая кислота Паль мтгг иловая кислота 22.67 7,02 6,93

Октадекановая кислота Стеариновая кислота 0,94 1*91

Гептадекановая кислота Маргариновая кислота -• 7,73 0,34

Эйкозановая кислота Арахиновая кислота - 0,95 -

Ундекановая кислота Ундециловая кислота - V . 1,41

9,12-октадекадиеновая кислота Линолевая кислота 19,39 29,66 5,82

Бета-, гамма-сигостерол Ситостерол - 19,58

Кампестерол Кампестерол - - 7,18

а-амирин - - 4,62

Циклоурсан-З-он - - 5,73

2,6,10,15,19,23 -гексаметил- 2,6,10,14,18,22- тетракозагексаен Сквален 14,60 - -

2,10-диметил-9-ундецеиаль 3,55 - 3,56 ,

Бензальдегид Сиреневый альдегид - 0,98 0,16

2-додецен-1-ил Сукциновый ангидрид - 0,87

4-гидрокси-З-метоксибегоальдегид Ванилин ' - - 1,05 -

9,12-октадекадиен-1 -ол Линолевый спирт ' - ■ • 4,98

9,12,15-октадекатриен-1 -ол Линолениловый спирт 4,38 2,74

Геранилгераниол Геранилгераниол - - 1,38

Фигол Фитол 7,75 3,19

Альфа-, бета-, гамма-токоферол Токоферол 7,75 7,89 2,47

2-метокси-4-винил фенол пара-винилгваякол - 2,23 0,53

2,3-дигидробегоофуран Кумаран - 2,21 -

Эйкозан Дидецил 2,90 - -

17-пентатриаконтин Пентатриаконтин - 0,73 -

Цшслододецин - 0,67 ■ -

Не идентифицированные вещества 23,62 15,10 28,58

В таблице 10 представлен биохимический состав очитка супротиволистного (Э. орроБ^оПитХ в % от общего числа обнаруженных компонентов: в (Х)-вытяжке обнаружено 48 компонентов, в (М) вытяжке ОЧОК=35, а в (Э) вытяжке ОЧОК=15.

Следует отметить, что превалирующими биологически активными веществами, входящими в состав очитка супротиволистного, относительно общего числа обнаруженных компонентов в (X)-вытяжке (ОЧОК=48) являются: 12-олеанен-З-ил ацетат - 39,71% от ОЧОК, 3-оксо-урс-12-ен-24-новой кислоты метиловый эфир - 22,40% от ОЧОК и лупеол ацетат - 11,58% от ОЧОК; в (М)-вытяжке (ОЧОК=35): 12-олеанен-З-ил ацетат - 13,38% от ОЧОК, 3-оксо-урс-12-ен-24-новой кислоты метиловый эфир - 5,64% от ОЧОК; в (Э)-вытяжке (ОЧОК=15): пальмитиновая кислота - 15,26% от ОЧОК, линолсвая кислота -15,26% от ОЧОК, токоферол - 24,46% от ОЧОК.

Таблица 10 - Основные биологически активные вещества, содержащиеся в очитке ___супротиволистном___

Систематическое название (ШРАС) Тривиальное название Растворитель

Хлороформ Метанол Этанол

% от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК= 48) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 35 ) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК =15)

Тетрадекановая кислота Миристиновая кислота 0,13 0,29 2,43

Гексадекановая кислота Пальмитино вая кислота 1,06 2,95 15,21

Тридекановая кислота Тридециловая кислота - 1,86 -

Эйкозановая кислота Арахиновая кислота - - 2,86

9,12-октадекадиеновая кислота Линолевая кислота 0,71 3,27 15,26

7,10,13-гексадекатриеновой кислоты метиловый эфир - - 7,05

Лупеол ацетат 11,58 - -

12-Олеанен-З-ил ацетат 39,71 13,38 6,22

(3-амирин - 1,98 -

З-оксо-урс-12-ен-24- новой кислоты метиловый эфир 22,40 5,64 -

а-амирин 2,73 - -

2,6,10,15,19,23-гексаметил- 2,6,10,14,18,22- тетракозатексаен Сквален - - 4,02

Фигол Фигол 0,22 0,33 3,57

Сти™астан-3,5-диен Стигмастан - - 8,17

Бета-, гамма-ситостерол Ситостерол 1,79 -

Кампестерол Кампестерол 0,60 - -

Альфа-токоферол Токоферол 9,63 24,46

2-метокси-4-винил фенол пара-винилгваякол - 0,62 - .

Не идентифицированные вещества 11,23 67,89 10,75

Исходя из биохимического состава очитка супротиволистного можно сделать вывод, что, данное растение является ценным источником биологически активных : веществ различных классов, которые, проявляя свою физиологическую активность, оказывают терапевтический эффект.

В таблице 11 представлен биохимический состав очитка линейного (S. lineare) в % от общего числа обнаруженных компонентов: в (X) - вытяжке обнаружено 62 компонента, в (М) ОЧОК=54, в (Э) ОЧОК=87 компонентов.

Таблица 11 - Основные биологически активные вещества, содержащиеся в очитке линейном

Систематическое название (ГОРАС) Тривиальное название Растворитель

Хтороформ Метанол Этанол

% от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК= 62) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 54 ) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 87)

Тетрадекановая кислота Миристиновая кислота 0,27 - 0,05

Гексадекановая кислота Пальмитиновая кислота 5,19 0,37 0,30

Триде га новая кислота Тридециловая кислота - 3,09 -

Эйкозановая кислота Арахиновая кислота - 0,22 -

9,12-октадекадиеновая кислота Линолевая кислота 2,97 2,24 0,34

Циклоурсан-З-ол ацеат 19,05 - -

12-олеанен-З-ил ацетат 44,88 - 1,96

Олеан-12-ен Олеанен - 3,17 3,57

Лупеол Лупеол 2,84 - 0,32

Р-амирин 0.78 - -

Лул-20(29>ен-3-он Лупенон - - 12,65

24-метилен-9,19-диклонаностан-З-ол Метиленциклоартен ол 4,44 - -

1-метил-4- изопропенилцихлогексен -1 Лимонен - 0,27 -

3,7,11-триметилдодека-2,б,10-триен-1 -ол Фарнезол 1,71 - -

Фитол Фитол 0,51 0,47 -

Ланоотерол Ланостерол - - 1,39

Бета-, гамма-сгтэстерол Ситостерол - 22,45 2,13

Кампестерол Кампестерол - 3,53 2,92

Альфа-то ко ферол Токоферол 1,32 14,75 9,85

Пиридин-З-карбоксаыид Никотинамнд, витамин РР 0,25 - -

2-метоксн-4-винилфенол Пара-винилгваякол - 0,51 -

Этил-1-метил-3- пипеколинат (пиперидянкарбоксилат) 5,98 - -

1-метил-2-шгаерцдинметанол - 18,30 -

Индено [ 2,1 -Ь]хро мин - 1,62 -

Не идентифицированные вещества 9,81 29,48 64,52

Следует отметить (табл.11), что превалирующими биологически активными веществами, входящими в состав очитка линейного, относительно общего числа обнаруженных компонентов в (Х)-вьггяжке (ОЧОКУ62), являются: 12-олеанен-З-ил ацетат -44,88% от ОЧОК, циклоурсан-3-ол ацетат - 19,05% от ОЧОК; в (М>выгяжке (ОЧОК=54): ситостерол - 22,45% от ОЧОК, токоферол - 14,75% от ОЧОК, 1-метил-2-пиперидинметанол - 18,30% от ОЧОК; в (Э)-вытяжке (ОЧОК=87): лупеноп - 12,65% от ОЧОК, токоферол -9,85% от ОЧОК.

Очиток линейный, так же, как и вышеописанные образцы, является источником биологически активных веществ, различной природы и физиологического действия.

В результате хроматографического анализа исследуемых очитков выявлено, что биохимический состав очитков, интродуцируемых в РСО-Алания, богат биологически активными веществами, которые являются составляющими компонентами эфирных масел, жирных масел и воска, антиоксидантами, энергетическим источниками, фитонцидами и обладающими различными фармакологическими свойствами (здаптогениым, иммуноповышающим, противовоспалительным, противоопухолевым и др.).

Таким образом, исследуемые очитки являются ценными источниками биологически активных веществ широкого спектра действия. Данные исследования позволяют раскрыть биоресурсный потенциал исследуемых очитков и рекомендовать их в качестве высококачественной, полезной и лечебной кормовой добавки в рацион животных, а также ценной сырьевой базой растительного происхождения для фармакологической промышленности.

s.L

Хозяйственная ценность представителей семейства СгаязиЬкеае ПС, рода Ха!шп

Существенным признаком, характеризующим хозяйственную ценность любой растительной культуры является, выход питательных веществ с 1 га, занятой под данной культурой. Учитывая, что за 1 год средняя урожайность зеленой биомассы очитка кавказского на опытном участке НИИ биотехнологии Горского ГАУ составила 136,0 ц/га, то нами подсчитано, что выход сухого вещества очитка кавказского с 1 га составил 9,3 ц/га; биомасса очитка супротиволистного составила 78,4 ц/га, в которой содержится 6,1 ц/га сухого вещества; средний выход биомассы культуры очитка видного с 1 га составил 148,0 ц/га, а выход СВ - 13,9 ц/га соответственно; у очитка линейного средний выход биомассы с 1 га равен 71,2 ц/га, а выход сухого вещества - 8,6 ц/га (табл. 12).

Показатель Очиток кавказский Очиток суиротиволистный Очиток видный Очиток линейный

Биомасса 136,0 78,4 148,0 71,2

Сухое вещество 9,3 6,1 13,9 8,6

78,4 ц, 148,0 ц и 71,2 ц высокопитательной и полезной биомассы, или 9,3; 6,1; 13,9 и 8,6 ц/га сухого вещества соответственно. Эту биомассу можно широко использовать в качестве ценной кормовой добавки в рацион сельскохозяйственных животных.

6. Получение каллусной культуры очитков S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare в условиях in vitro и цитологический анализ

Целью получения растительных культур in vitro исследуемых очитков S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare в условиях in vitro послужило:

С получение экологически чистой биомассы;

г синтез новых веществ (вторичных метаболитов), не содержащихся в интактном растении;

С сохранение генофонда лекарственных растений;

г определение биоресурсного потенциала исследуемых растений в условиях интродукции.

Эксплантами для каллусогенеза послужили проростки, полученные при определении всхожести семян очитка видного и очитка кавказского, листочки взрослого растения очитка супротиволистного (S. oppositifolium) и очитка линейного (5. lineare).

Питательной средой была подобрана модифицированная среда Мурасиге-Скуга (MS) (табл. 13).

Таблица 13 - Состав модифицированной питательной среды МБ для культивирования _каллусных культур очитков_. _

Компоненты Количество, мг/л

1 Макро-соли (по Мурасиге-Скугу) 50

2 Микро-соли (по Мурасиге-Скугу)

3 Пиридоксин 1

4 Тиамин 1

5 Аскорбиновая кислота

6 Феруловая кислота 1

7 Индолилуксусная кислота -

8 Кинетин

9 Ге-хелат 5

10 Сахароза 20000

11 Агар-агар 7000

рН - 5,8

Стерилизацию питательной среды MS проводили автоклавированием при 1 атм, в течение 20 минут.

Стерилизацию исходного материала проводили раствором гипохлорида натрия (10%) в течение 20 минут, затем тщательно промывали 4 раза стерильной водой. Колбы и пробирки с питательными средами закрывали ватно-марлиевыми пробками, обернули в оберточную бумагу и автоклавировали при давлении 1 атм в течение 20 минут.

Для того чтобы вызвать каллусогенез, стерильные листочки взрослого растения искусственно травмировали. На предметном стекле листочки повреждали иголкой по направлению жилок. Затем подготовленные стерильные проростки-и листочки помещали в пробирки со средой MS. Первое культивирование проводили в пробирках объемом 20 мл с ватно-марлиевыми пробками.

Все манипуляции проводили в стерильном боксе.

Условия культивирования были следующие: выращивание каллусов проводили на свету, длительность светового периода 10-11 часов в сутки; при температуре 20-25°С, влажности 70%.

Каллусная культура очитка линейного имеет слегка желтоватый, почти бесцветный окрас. Цвет каллуса очитка ввдного желтый, однако, насыщенность окраски меняется с возрастом каллуса. В начале роста молодой каллус слегка желтый, по«™ белый, по мере старения каллуса окраска приобретает более насыщенный желтый цвет. Такие же переходы окраски были у каллусов очитка кавказского. Определенными свойствами обладает каллус очитка супротиволистного. На первой стадии выращивания каллус в процессе роста пигментировал и приобрел красный оттенок, который при последующих пассированиях сохранился.

Полученные каллусные культуры in vitro мы микроскопировали и провели цитологический анализ. Окрашивание препаратов проводили ацегокармииом.

Проводя цитологический анализ куллусньгх культур очитков мы вьивили, что наиболее плотный каллус получается у очитка видного. Следжователыю, его культура перспективна для выращивания каллуса на твердой питательной среде. Под микроскопом клетки каллусной культуры очитка видного представляют собой меристематические скопления прозенхимных трахеиподобных клеток

По структуре каллус очитка кавказского более рыхлый. Клетки паренхимного типа имеют более крупные размерь^ также присутствуют групповые- скопления меристематических клеток.

Каллусная культура очитка супротиволистного имеет рыхлую консистенцию. Это хорошо видно и на клеточном уровне под микроскопом. Хорошо заметны свободно располагающиеся паренхимные и прозенхимные клетки. Таким образом, каллусная культура

очитка супротиволистного (5. oppositifolium) представляет интерес для суспензионного получения культуры клеток.

Каллусная культура очитка линейного имеет рыхлую консистенцию. Каллусиые паренхимные клетки меристематического типа - очень мелкие, располагающиеся свободно или небольшими скоплениями.

Таким образом, получены стабильно растущие каллусные культуры очитков: S. oppositifolium, S. caucasiciim, S. lineare и S. spectabile; подобранна модифицированная питательная среда - Мурасиге-Скуга; проведен цитологический анализ каллусных культур; выбраны перспективные культуры для дальнейшей работы. Для культивирования на твердой питательной среде была выбрана каллусная культура очитка видного (S. spectabile), а для суспензионного культивирования была отобрана каллусная культура очитка супротиволистного (S. oppositifolium).

Каллусная культура очитка вндного (S. spectabile), культивируемого на агаризованпой среде и ее хроматографический анализ. Для изучения биохимического состава полученной каллусной биомассы очитка видного провели хроматографический анализ этанольной (96°), хлороформной и метанольной вьггяжек (1:10) сухого каллуса. Условия работы хромато-масс-спектрографа и идентификация веществ аналогичные, как и при анализе очитков в условиях in vivo.

В таблице 14 представлены идентифицированные вещества в каллусной культуре очитка видного (S. spectabile) in vitro.

В каллусной культуре обнаружены насыщенные жирные кислоты - миристиновая и пальмитиновая, а также полиненасыщенная жирная кислота - линолевая. Эти же кислоты были идентифицированы и в растении in vivo. Также в каллусной культуре очитка видного было идентифицировано производное циклопентанпергидрофенантрена в виде соединения 17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекашдро-1Н-

циклопента-(а)-фенантрен-3-ола в количестве 1,43% от общего числа обнаруженных компонентов.

Во всех трех вытяжках были обнаружены одни и те же вещества. Из идентифицированных веществ в каллусе S. spectabile, основным классом были жирные кислоты (табл. 14).

Таблица 14 - Идентификация веществ каллусной культуры очитка видного (S. spectabile)

Систематическое название (IUPАС) Тривиальное название Растворитель

Хлороформ Этанол Метанол

% от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 15) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 22) % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК = 23)

Тетрадекановая кислота Миристиновая кислота 1,76 0,51 0,65

Гексадекановая кислота Пальмитиновая кислота 17,25 22,05 22,53

9,12-октадекадиеновая кислота Линолевая кислота 61,92 56,63 51,27

17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,1 5,16,17-тетрадекагидро-1 Н-циклопепта-(а)-фенантреп-3-ол 1,43

Не идентифицированные вещества 17,64 20,81 25,55

Таким образом, в исследуемой культуре (S. spectabile) в трех растворителях в большей процентной доле от общего числа обнаруженных компонентов идентифицировались линолевая и пальмитиновая кислоты. Культура in vitro так же, как и интактное растение S. spectabile синтезирует эти вещества .

Суспензионное культивирование каллусных клеток S. oppositifolium. Вторичный метаболизм.Суспензионное культивирование осуществляли в стеклянных сосудах объемом 200 и 400 мл, закрытых ватно-марлиевыми пробками и фольгой с жидкой, стерильной модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга того же состава (табл. 13), что и для культивирования, которое мы проводили в пробирках и чашках Петри. Для инициации культуры взяли 2 г каллусной ткани из пробирок. Необходимым условием для суспензионного культивирования является аэрация и перемешивание. В связи с этим, объем емкости для культивирования заполнили на 1/3, а перемешивание осуществлялось с помощью элетромагнитной мешалки. Время культивирования составило 14 дней.

Суспензионная каллусная культура очитка супротиволистного представляет собой свободно располагающиеся и делящиеся паренхимные [слетки.

Методом Плейтинга мы произвели высев суспензии на агаризованную питательную среду в чашки Петри (по Сорокиной и др., 2002). Следующие пассажи полученной культуры производили в пробирки и в чашки Петри.

Существует зависимость синтеза в растительных клетках вторичных метаболитов внутренней и внешней секреции, как in vivo, так и in vitro, от сезонного времени. В связи с этим, суспензионное культивирование проводили в весеннее и летнее время.

Во время весеннего культивирования мы наблюдали внешние изменения культуральной среды. В процессе культивирования среда становилось все гуще, а на стенках сосуда образовывались капли жира. Взяв пробу из культуральной суспензии, мы обнаружили, что она стала маслянистой и приобрела специфический запах. В конце культивирования (14 день) дали суспензии отстояться 30 минут, затем взяли 100 мл с верхней фракции и выпарили культуральную жидкость на водяной бане. В процессе выпаривания специфический запах чувствовался сильнее. После выпаривания жидкость уменьшилась в объеме незначительно, всего лишь на 2%.

В летнее время суспензионного культивирования подобных изменений физического состояния культуральной жидкости не наблюдалось.

В конце культивирования мы процентрифугуровали культуральную суспензию и получили культуру суспензионных клеток очитка супротиволистного (S. oppositifolhm).

Для исследования вторичных метаболитов мы провели хроматографический анализ и идентификацию составляющих веществ, содержащихся в:

- культуральной суспензии S. oppositifolium без выпаривания весеннего пассажа;

- маслянистой основы культуральной жидкости, оставшейся после выпаривания (весеннего пассажа);

- культуральной суспензии S. oppositifolium летнего пассажа;

- культуры клеток S. oppositifolium летнего пассажа.

Идентификация вторичных метаболитов весеннего и летнего суспензионного пассажа культуры S. oppositifolium

Идентификация вторичных метаболитов весеннего суспензионного пассажа культуры очитка супротиволистного (S. oppositifolium). Растения очень экономно расходуют вещества и энергию. В отличие от животных, они не выделяют продуктов распада. Выделяемый ими углекислый газ вновь используется в процессе фотосинтеза. Правда, многие растения имеют выделительные ткани (а не выделительную систему), но они больше похожи на запасающие или секреторные ткани. Если растения выделяют наружу какие-либо вещества, то это связано главным образом с привлечением насекомых-опылителей, с распространением семян или защитой от вредителей (Биохимия растений, 2004 г).

Хроматографический анализ суспензии проводили с целью обнаружения продуктов вторичного метаболизма внешней секреции (экзометаболитов) каллусных клеток 5. орройИ/Ышт, т.е. метаболитов, выделенных в среду. Для этого использовали культуральную суспензию Б. оррозШМшп (весеннего пассажа) и маслянистую основу культуральной жидкости, оставшейся после выпаривания, раствереиных в хлороформе.

При хроматографическом анализе и идентификации веществ, находящихся в суспензии очитка супротиволистного (5. оррозиЦЬИит) (табл. 15), были обнаружены жирные кислоты: НЖК - пальмитиновая кислота (1,28% от ОЧОК) и ПНЖК - линолевая кислота (10,10% от ОЧОК). Однако в выпаренной суспензионной жидкости (верхней фракции) данных веществ обнаружено не было.

Таблица 15 - Идентификация веществ суспензионной культуральной жидкости очитка __супротиволистного весеннего пассажа (5. орроэШ/оНит)_

Систематическое название (ШРАС) Тривиальное название Суспензия в.оррозМГоПщп, % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК=47) Суспензия З.оррозййЫшт, выпаренная, % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК=49)

Гексадекановая кислота Пальмитиновая килота 1,28 -

9,12-окгадекадиеновая кислота Линолевая кислота 10,10 -

2,4-декадиеналь Каприновый альдегид 8,53 14,38

Аллетрин Аллетриц 29,22 33,10

17-(1,5-диметилгексил>-10,13-диметил- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро- 1Н-циклопента-(а)-фенангрен-3 -ол 3,20

Тиофен-2-карбоксальдегид Компонент эфирных масел 3,00 -

Не идентифицированные вещества 47,87 49,32

После идентификации веществ, содержащихся в суспензионной культуральной жидкости до и после выпаривая, стало ясно, что придавало специфический запах в процессе выпаривания, а также маслянистую структуру культуральной жидкости. Каприновый альдегид - 2,4-декадиепалъ, так называемый жирный альдегид, был идентифицирован в суспензии до и после выпаривания (ОЧОК 8,53% до выпаривания и 14,38% после выпаривания верхней фракции). Этот альдегид присутствует в эфирных маслах аира, дикой фиалки, эхинацси пурпурной, апельсина и др.

При идентификации хромато-масс-спектров веществ исследуемых суспензий было обнаружено также вещество, которое имело вероятность совпадения в 53% с библиотечными данными масс-спектра. По биологическим свойствам аллетрин относится к инсектицидам. Содержание его в суспензии - 29,22% от ОЧОК, в выпаренной суспензии - 33,1% от ОЧОК. По физическим свойствам аллетрин представляют собой вязкую, маслянистую жидкость, что объясняет изменение (агрегированности) суспензионной среды во время культивирования.

Учитывая, что исследуемые нами очитки являются воскообразующими растениями, т.е. покрываясь воском они защищают себя от вредителей, от неблагоприятных погодных условий, засухи, можно предположить, что если в весеннее время года очиток

супротиволистный в естественных условиях вырабатывает защитный слой растительной ткани, который служит барьером в течение всего года, в суспензионной каллусной культуре in vitro растительные клетки очитка супротиволистного сохраняют функцию готовности к жизненному циклу в весеннее время года, синтезируют защитные вещества и секретируют их в среду. Эти вещества являются продуктами вторичного метаболизма внешней секреции.

Таким образом, каллусная культура очитка супротиволистного при суспензионном культивировании в весеннее время является продуцентом вторичных метаболитов внешней секреции: аллетрина и ненасыщенного альдегида 2,4-декадиеналя.

Идентификация вторичных метаболитов летнего суспензионного пассажа культуры очитка суиротиполистного («У. oppositifolium).В процессе суспензионного культивирования каллусной культуры очитка супротиволистного (S. oppositifolium) в летнее время изменения физического состояния среды не происходило. Хроматографический анализ суспензии проводили с той же целью - обнаружения продуктов вторичного метаболизма - экзрметаболитов. Результаты исследований приведены в таблице 16. Таблица 16 - Идентификация веществ, содержащихся в суспензии (S. oppositifolium) летнего

пассажа

Систематическое название (IUPAC) Тривиальное название % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК= 13)

Пентоксифиллин Пентоксифиллин 21,03

1,2-бензединкарбоновой кислоты, MOHO (2-этилгексил) эфир Фталевой кислоты эфир 45,27

2,6,10.15,19,23-гексаметил- 2,6,10,14,18,22- тетракозагексаен Сквален 19,41

Не идентифицированные вещества 14,29

Установлено, что в суспензии летнего пассажа экзометаболитами являются: пентоксифиллин, эфир фталевой кислоты и сквален, причем в больших количествах.

Для определения эндометаболитов суспензионной каллусной культуры очитка супротиволистного суспензию процентрифутировали, чтобы получить клеточную культуру. Полученный осадок каллусных клеток высушили при 70°С и проэкстрагировали этиловым спиртом (96%). Идентификацию веществ проводили хроматографическим методом, путем сравнения с библиотечными масс-спектрами данных веществ,

В таблице 17 показаны результаты идентификации веществ, содержащихся в суспензиошюй каллусной культуре очитка супротиволистного (in vitro).

В культуре S: oppositifolium in vitro жирных кислот было идентифицировано от ОЧОК: миристиновой кислоты - 0,31%, пальмитиновой кислоты - 1,86%, стеариновой кислоты -3,65%. Ретиноевая кислота (витамин А-уксусная кислота) идентифицировалась в количестве 3,72% от ОЧОК. Также в каллусе содержались вещества, которые относятся к специфическим компонентам эфирных масел: метиловый эфир анисовой (фенолкарбоновой) кислоты - 1,94% от ОЧОК, кетон, относящийся к терпеноидам - (Z)-2-(2-6yrenM)-4-гидрокси-3-метил-2-циклопентен-1-он в количестве 3,98%, дитерпеноид - изостевиол -3,51%, а также терпеноид - лонпшинокарвон в количестве 3,95 так же в % от ОЧОК. Из алкалоидов, в составе каллусной культуры очитка супротиволистного присутствовало производное пурина - теобромин, содержание которого составило 16,62% от ОЧОК. Небольшое количество холестерола (2,5% от ОЧОК) также было идентифицировано в суспензиошюй культуре.

Таблица 17 - Идентификация веществ, содержащихся в суспензионной каллусной культуре _очитка супротиволистного (5. оррояН/оИит) _

Систематическое название (ШРАС) Тривиальное название S. oppositifolium in vitro, % от общего числа обнаруженных компонентов (ОЧОК=81 компонентов)

Тетрадекановая кислота Миристиновая кислота 0,31

Окгадекаиовая кислота Стеариновая кислота 3,65

Гексадекановая кислота Пальмитиновая кислота 1,86

Ретиноевая кислота Витамин А-уксусная кислота 3,72

3-метоксибензойной кислоты метиловый эфир Метиловый эфир анисовой кислоты 1,94

(2)-2-(2-бу1епил)-4-гидрокси-3-метил-2-Циклопентен-1 -он 3,98

Изостевиол Изостевиол 3,51

Лонгипинокарвон Лонгипинокарвон 3,95

3,7-дигидро-1,3-диметил-1Н-пурин-2,6-дион) Теобромин 16,62

17-( 1,5-диметилгексил)-10,13-диметил- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,1 7-тетрадекагидро-1Н- циклопенга-(а)-фенантрен-3-ол 2,50

Не идентифицированные вещества 57,96

Из анализа данных, приведенных в таблице 17 видно, что большинство веществ являются новообразованными, т.е. не содержащимися в интактном растении in vivo. Соответственно, эти вещества являются эндометаболитами, синтезируемыми очитком супротиволистным в условиях in vitro.

Таким образом, установлено, что разные виды очитков успешно интродуцируются в РСО-Алания. Каллусная культура очитка супротиволистного является продуцентом специфических биологически активных веществ экзометаболитов: пентоксифиллина, сквалена и эфира фталсвой кислоты, а также эндометаболитов: ретиноевой кислоты, метилового эфира анисовой кислоты, изостевиола, лонгипинокарвона, (2)-2-(2-бутенил)-4-гидрокси-3-метил-2-циклопентен-1 -она, теобромина, 17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-теградекагидро-1Н-циклопента-(а)-фенантрен-3-ол.

Выводы

1 .В агроклиматических условиях РСО-Алания Seditm oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare проходят все фазы развития. В результате фенологических и интродукционных исследований растений семейства Crassulaceae DC.: Sediim oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare установлено, что наиболее продуктивной является фаза цветения, т.к. в данный период отмечается наибольший выход полноценной зеленой биомассы перечисленных растений.

2. Выявлено, что самой высокой чистой продуктивностью фотосинтеза в условиях PCO-Алания обладает S. lineare - 6,98 г/м2/сутки.

3. Установлено, что масса 1000 семян S. spectabile и S. caucasicum равна по 0,065 г, а у S. lineare и S. oppositifolium - 0,025 г. Размножение очитков в условиях интродукции рекомендуется: для очитка видного и очитка кавказского - семенное и вегетативное (в том

числе черенкование); для очитка супротиволистного и очитка линейного - только вегетативно.

4. Оценка успешности интродукции в РСО-Алания S. spectabile составила 14 баллов, S. caucasicum - 13 баллов, 5. oppósitifolium и S. lineare -12 баллов, что позволяет считать их перспективными растениями для культивирования в условиях РСО-Алания.

5. Наибольшим содержанием протеина и жира отличается очиток супротиволисчный (5. oppositifolium) - 15,63% и 8,06% соответственно; клетчатки - очиток кавказский (S. caucasicum) - 36,22%; а наименьшим - очиток видный (S. spectabile) - 16,88%. Содержание безазотистых экстрактивных веществ наиболее высоким - 39,37% является в зеленой массе S. spectabile. Наибольшее суммарное количество аминокислот (5,55% от СВ) установлено в зеленой массе 5. oppositifolium.

6. Урожайность зеленой массы очитка видного (S. spectabile) в условиях РСО-Алания достигает 148,0 ц/га, в том числе 13,9 ц сухого вещества; для очитка кавказского (S. caucasicum) эти показатели составили 136,0 и 9,3 ц; урожайность зеленой массы очитка супротиволистного (S. oppositifolium) равна 78,4 ц/га, в которых содержится 6,1 ц сухого вещества; наименьшей урожайностью отличился очиток линейный (S. lineare) - 71,2 ц/га, в том числе 8,6 ц сухого вещества.

7. При идентификации биологически активных веществ в надземной части исследуемых очитков в фазе цветения обнаружены:

- очитка видного (S. spectabile) - насыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты, фитостеролы и стероидные соединения, терпеновые соединения, воскоо бракующие вещества, высшие спирты;

- очитка кавказского (S. caucasicum) - жирные кислоты, тритерпеноиды, фитостеролы, витамины, воскообразующие вещества и другие физиологически активные вещества;

- очитка супротиволистного (S. oppositifolium) - жирные кислоты, терпеновые соединен™, фитостеролы, фенолыюе соединение;

- очитка линейного (S. lineare) - жирные кислоты, терпеновые соединения, фитостеролы, алкалоиды и др.

Установлено, что все изученные виды очитков содержат пальмитиновую, миристиновую и линолевую кислоты, токоферол, ситостерол, кампестерол, фитол, пара-винилгваякол (2-метокси-4-винилфенол).

8. В условиях in vitro получены каллусные культуры S. oppositifolium, S. spectabile, S. caucasicum и S. lineare, период выращивания которых составил 21-25 дней. Для суспензионного культивирования был выбран каллус S. oppositifolium, а для культивирования на плотной питательной среде - S. spectabile. Выявлено, что каллусная культура S. oppositifolium in vitro синтезирует вторичные метаболиты в зависимости сезонного времени года. Суспензионная культура S. oppositifolium является продуцентом экзометаболитов и эндометаболитов.

Практические рекомендации

Учитывая бимохимический состав представителей семейства Crassulaceae DC., рода Sedum s.l.: S. oppositifolium, S. caucasicum, S. lineare, S. Spectabile целесообразно их использование в медицинской и ветеринарной практике для лечебно-профилактического питания, а также в фармации с целью производства лекарственных препаратов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрпауки РФ:

1. Гревцова, С.А. Очиток лекарственный как ценная кормовая добавка к кормовым рационам / С.А. Гревцова, Л.Б. Наниева // Научно-теоретический журнал «Известия» Горского ГАУ. - Т. 47. - 4.1. Владикавказ, 2010. - С. 160-161.

2. Наниева Л.Б. Получение и цитологический анализ каллусной культуры очитков in vitro / Л.Б. Наниева. «Аграрный вестник Урала». - №10 (160). - Екатеринбург 2013 - С 15-18.

3. Наниева, Л.Б. Качественный и количественный аминокислотный состав некоторых представителей семейства Crassulaceae DC., интродуцируемых в условиях РСО-Алания / Л.Б. Наниева, С.А Гревцова // Научно-теоретический журнал «Известия» Горского ГАУ. - Т. 50. - Ч. 3. Владикавказ, 2013. - С. 321-324.

4. Гревцова, С.А. Суспензионное культивирование каллусных клеток S. oppositifolium / CA. Гревцова, Л.Б. Наниева // Научно-теоретический журнал «Известия» ФГБОУ ВПО Горского ГАУ. - Т. 50. - Ч. 4. - Владикавказ, 2013. - С. 272-274.

в других гаданиях:

5. Гревцова, С.А. Фенологические особенности некоторых представителей семейства толстянковых в условиях РСО-Алания / CA. Гревцова, Л.Б. Наниева // Материалы международной научно-производственной конференции «Новые направления в решении проблем АПК на основе современных ресурсосберегающих инновационных технологий». -Ч. 2. - Владикавказ, 2011. - С. 83-85.

6. Гревцова, С.А. Характеристика сезонных особенностей некоторых представителей семейства Crassulaceae DC. / С.А. Гревцова, Л.Б. Наниева // «Вестник научных трудов молодых ученых». ФГБОУ ВПО ГГАУ. - В. 49. - Владикавказ, 2012 - С 69-71.

7. Гревцова, С.А. Антимикробная активность очитка линейного и очитка видного / С .А. Гревцова, Л.Б. Наниева // IV-Междушродная научно-практическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». - Ч. 2. - Владикавказ 2013 - С 5-7.

8. Гревцова, С.А. Получение и цитологический анализ каллусной культуры, полученной из очитка / С.А. Гревцова, Л.Б. Наниева // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 95-летаю Горского ГАУ 26-27 ноября 2013 г. -Владикавказ, 2013.-С. 178-180.

9. Наниева, Л.Б. Антиоксидантная активность некоторых представителей семейства Crassulaceae DC. в условиях РСО-Алания / Л.Б. Наниева. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Горского ГАУ 26-27 ноября 2013 г. - Владикавказ, 2013. - С. 169-171.

10. Наниева, Л.Б. Морфологические признаки семян некоторых представителей семейства толстянковые / Л.Б. Наниева, CA. Гревцова // «Вестник научных трудов молодых ученых». ФГБОУ ВПО ГГАУ. - В. 50. - Владикавказ, 2013. - С. 49-51.

11. Гревцова, С.А. Хозяйственно-биологические показатели Sedum spectabile в условиях РСО-Алания / С.А Гревцова, Л.Б. Наниева // V-Международная научно-практическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки». -Владикавказ, 2014. - С. 339-344.