Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности криоконсервирования биологических объектов с применением больших скоростей охлаждения

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности криоконсервирования биологических объектов с применением больших скоростей охлаждения"

АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ИНСТИТУТ ПР0БЛЕГ1 КРИОБИОЛОГИИ Я КРИОПЕДИЦИНЫ

На правах рукописи УДК 57.и43:э7

ГнЯЬЧЕНКО Сергей Евгеньевич

ОСОБЕННОСТИ К Р И и К О Н С Е Р В Н Р С 3 А Н И Я БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ С ПРИМЕНЕНИЕ?! БОЛЬУИХ СКОРОСТЕЙ ОХЛАЖДЕНИЯ

03.00.22 - криобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 1990

Работа выполнена в Институте проблей криобиологии и крионедицины АН УССР

Научный руководитель: академик нН УССР В.И,Гриленко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

H.И•УраГО

доктор Физико-математических наук

I.П.Благой

Еедуцая организация: Институт Физики АН УССР, Киев

Зацита состоится ' /¿Г * 1990 года в

/ -30

" /I " часов на заседании специализированного совета 1 016.60.01 при институте проблей криобиологии и крионедицины АН УССР (310015, Харьков - 15, ул. Переяславская, 23)

С диссертацией ножно ознакомиться в библиотке Института проблей криобиологии и крионедицины АН УССР

Автореферат разослан " А/ "Уга^Лл/ 1990 г.

7

Ученый секретарь специализированного

совета, доктор медицинских наук А.Н.Гольцев

Актуальность Работы. В настояаег вренд накоплен сборный массив научной икФориацка, посБяьенкса влияние скоростей ох-лашдгния, отогрева и криоп?отекто?ов ка сохранность биологического материала после декснсерБирования, Однако следует откатить, что если при охлаждении криоконсервируеиух объектов с нал»ни и средними скоростяни охлаждения влияние перечисленных быьг ¿акторсз изучено достаточно хороыо, то влияний болыдх скоростей охлаждения посвящено значительно кеньые работ.

Тем не ненее, б специальной литературе имеется мнение о том, что сверхбыстрое охлаждение должно приводить к высокой сохранности, „„биологических объектов (Яагуйап, ШЗ; нссхеппе, 1?73).

В настоящей работе представлены данные о способах достижения сверхвысоких скоростей охлаждения и влияния зтих режинсв на сохранность различных биологических объектов. в качестве криопротектсров использовались глицерин, сахароза, полизтиле-локсмд о ь..и 1203 (П30-1500) и полигинилпирролидон с н.н. (125С01. Такой еы5о? криопротектсров обусловлен их ыирокип прииенениен в криобиологии.

Из криобиологических объектов исследовались клеточные суспензии: эритроциты человека, гепатоадта крысы, ижроорга-низны - и ткани; кожа кролей и анниотическая оболочка человека.

Такой Ейбс? объектов позволил провести сравнительный анализ влияния сверхвысоких скоростей охлаждения на различные классы биологических объектов.

Цель исследования. Цель» настоящей работы явилось; П Разработать доступные методы получения высоких скоростей охлаждения. 2) исследовать влияние высоких скоростей охлаждения на сохранность различных биологических объектов. 3!определить эффективность различных криопротектсрсз при замораживании биообъектов с пснозьз разработанных петодсв и ков охлаждения,

Задачи исследован;«. Конкретными задачами исследования были следумие:

1. выяснять возможность управления интенсивность» теплоотдачи ,1 скорость» охлаждения образца при использовании для зтих целей твердых теплопрсвздннков и разработать на их основе устройство для заисраживания биологических объектов.

2.Изучить влияние СБерхвыгкш скоростей на сохранность биологических cobektss: клетсчкык суспензий и тканей.

3. Определить боз.-шхный механизм кризпоёревдкил клеток при этих скоростях охлаядекия.

4. Вменить з$$ЕКТИБпиСТЬ криопротектсрев при больших скоростях охлаадекия а зависимости от их природу и концентрации.

Научная новизна. В результата проведенной работы показана возможность управления интенсивностью теплоотдачи и скорость» ОХЛйЖДеНИЯ, ИСПОЛЬЗУЯ Е КВЧеСТЕе ТВЕРДЫХ ТеПЛОПрОЕОДНИКОЕ порошки металлов, их сплавы и снеси* показано, что метод, основанный на занорахнванип биологических образцов о помоцьй ох-лахдёккьк до температуры никого азота кадках блоков о исполь-зованиЕИ теплоизолпруйцих прокладок различной толокна, является пврспсктнвпын б плана разработок новых СПрОССбОВ крнокон-сервирования биологических объектов, так как позволяет изменять скорость охлаждения е „ирскси диапазоне.

Епервые показано наличие второго максимума «йзнгспособнзстя биологических объектов, который лежит в области ёзльшх скоростей охлаждения. Показано, что разработанные приёмы дают возможность осуществлять крисноноарвирование тканей и микрорганизнов Без криопротектора, а клеточных суспензий с незначительным или умеренный содержанием криопротек-тора.

Экспериментально установлено) что основный пзгрггдакмн фактором при замораживании биологических объектов с бгйвмш скоростями охлаждения может Суть быстро псвы;»5ыцвлсл концентрация солеи во внеклеточной среде, нарушение оспотитссксго равновесия вне и внутри клетки и, как следствие, повреждение плазматической мембраны.

Установлено, что при максимальной скорости охлаждения только сахароза в концентрациях 5I и 10* сказывала некоторый защитный з$*ект при занораживании зритроцитсв. При более низких скоростях охлаждения наиболее з*$£ктибной сказалась концентрация ¡Олдля всех исследованных криопротекторов. Увеличение или уненьуение их концентрации приводило к росту гемолиза.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение работы состоит в тем, что зкепериментрально показано наличие второго максимума сохранности биологических

объектов б области бояыаих скоростей охлаждения. Установлено также, что сдной из ссксвкых причин поЕРёхдек«« клеток при быстрой запрашивании нигт быть быстро повыуайцаяся концентрация солей ао внеклеточной среде, нарушение осмотического равновесия вне внутри клетки и, как следствие, повреждение плазматической мембраны.

Показана также зФ;ективность разработанных катодов и устройств, испсльзоавнкых для заасрахкгакйл биологических объЕк-—" с больанин скоростями охлаждения с цель» их криоксьсерзи-

н«3 ко£п.

Полученные результаты указывай! на перспективность дальнейшей разработки способов низкотемпературного консервирования биологичЕсккх объектов с использованном больших скоростей охлаждения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Применение в качестве твердых теплопроводников порошков металлов, окислов металлоЕ и их смесей, а такаг метод, заклйчавлийоя в загарашакиа образцов с понося медных блоков и теплоизолирующих прокладок различной толцины позволяли изменять интенсивносто теплоотдачи и скорость охлаждения.

2. Сохранность биолсгических объектов имеет второй максимум в области больших скоростей охлаждения.

3. Разработанные устройства и методические подходы позво-ляйт осуществлять криоксноерзирсзаниг тканей и микроорганизмов без криспротЕкторов, а клеточные суспензии с пониженным их содержанием. При зтсн показатели л-шгспособнссти отогрета* биологических образцов близки к показателям, характерный для на-

тивного материала.

Апробация работы, "атериалы работы доложены и обсуадены на междунеродной ко;-еренции "Достижения и перспекитвы развития криобиологии и крисмедицины" Харьков, 19ВБ) и на Г»'-й Рвспу-бликанской научной конференции "Патогенез и лечение термических поражений и их последствий у детей" (Харьков, 1932«-).

иуолика^ия материалов исследовании, но результатам исследований опубликовано 5 работ, в том числе два изобретения. На

Л

одно кз них получен патент СУй и получена приоритетные оправки из других стран патентований (Великобритания, Франция, ?РГ,

япония).

Структура и обьеи работу. Данное исследование выполнено е сапках обяеоойзксй научно-технической программы 0.69.14 Разработать и внедрить в различные отрасли народного хозяйства методы, технические средства и новые технологические процессы холодовего воздействий на биологические обьекты". диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания пате-риалоз и методов, пяти глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, вые: . 'здер*ит 2и рисунков и 24 таблицы. Список

работе использовались эритроциты человека,выделенные из

ненте использовалась коза кралей и акннотическая оболочка человека, получаемая из роддома 1-й Городской больницы.

Уровень гемолиза эритроцитов определялся сг«к7ро»гтккт-рически при цййне волны 543ни и рассчитывался в процентах пс стпсы^ми^ к ¿С-и/»~иу гемолизу, вызванному добавлением у,¿/.-него тритона - Ш0.

*1л» сН«г(йПиСТЬ 1 Риопл ПсрсКнСлал Пр йЦЕС^йБ и Уй7й»'Ннойй7Ь ОиОЛйГИ^сиКиХ СироЗциБ К ПсрсКийпС.-»/ йК?«и/1спИ» С П Р с Д с Л Я Л а й Ь Хс&мЛйНнлсйцсН7лй«} Ис7£Дйп. ¿НД^нРйБалНал ХспИЛйНИНсйцспуьл " ' ■" 'БёЛ&й'о Дй^аоЛепнсИ К Сир аЗ'ДУ и/«~Нйн ПсрсКИйИ БйДйрйДа» пн~

ПЛпТУДа^п^йвсIйыУИпо СосЧ£пИп^£е^аАйЛсСЬ 5 и7пйыХ7 с ЛЬ НЬГХ сДы НгыаХ \woucnKu Г«п* и ДР»} «

»'¡пТспинБпййТЬ ДиХап^Я й'Сграйцйв иирсДсЛЛЛаСв Пй СКйрйСТН ПиТрсоЛспил Кк«СЛириДа Б З&КР «70»! Я чспКё и пипС^Ьг« С7йлДаР Г пи Г и ПЛвТ»пйаиГй ЗЛегоримв» гсЗ'/Ле7в«а БьРаАаЛ*»йи с ппйЛЬ й / Инп« ¿«Г Ъснъа ннн Б£йа 7г;дПг)> ийХРоллйи»Ь ¿»>л^й7>НсиК0И й^йЛйт»\>» йПр с ~ Дёллмн Пй с с Прйтлйи7н н Г|рйлйЦаспйй7*» ДЛЯ аЛои'ц 11нла ■ ^

1\ипДсл7риц»«Й иПр сДЗЛЯЛййЬ Пй лй* рИ I I тг13г!сй"

ийййОпйй 1Ь Гсн&7йцнIСй СГ|рсДс/4лЛайЬ Пй млТЕНСьапййТ^ ЗпДСГЁН""

пй» и Ди.-чалпл И Пй Кйд •+ тг1цг|£п} У й7г1г!УЛЯцИЛ ^ ДьХаНЛл ^С^ • 4 ПГ,П п£7рнЛ Б Г\СНцёл7рйЦПЛЯ ¿¡тйЛь »» (ЛуКЬл лйой /1«Д«)А7и2г)

AKÍ3HcGr»üGGOhCG7o г.илг1 ПииЛ с ¿y TuTpdriCn/iaH i ВцнП йЦспмоаЛп ПУТЕЙ G Г» Р Е Д Е Л Е п И S л И Н 7 с Г р а Л b n G Г ü КиЛйЧсОТЕсппиГО Крк'пЕрИл Трап" СПЛапТац^н КилИ vvanMGiiXpGKmi и»И» И Др • , i 1 / i Г ¡ •

ибЬёКТЫ Б КйНТенпсРаХ ¿13

ЬпНйЕзай $ольп{ ТиЛ^иной 0,03;ш.

иОЛЬшнс GKGpuGTH ^ОлЛслДсНИл рсаЛИЗСоиоаЛИ НЕСКйЛЬКИПИ йПиСйЬаИн* licpsbm GuGGúo ~ ПиГРУлспИЕ KGHTEHHEpGo Б ЖИДКИн e3g7t óTüPGH GHGGGü ~ 37g ЗаИСРаАПоапИс С ПиИицой ^СТ^йИСТБа

¿ля зоп:-рали5анил СнОлйгичЕСкпх ииьактав (заявка »N38/5501, ííg-ЛОлИТЕЛЬКиб РЕЫсНИс 07 1?.03.07г). 'эСТРСЙСТой ПРсДСТаБЛлеТ »3

С с о л с V i К G С 7 s j G О Д Е Р % a 4 У w П G Р G ш К И И Е 7 Е Л Л G Б G Р аЗЛ И -i Н и i-i и 7 с П Л u ~ тНЗНЧсСКнНН X а ? с К 7 с Р И G 7 И К с М И i 7с П Л G с KKuG 7 о ¿i 7 Е fi Л G ПР G Б ü Д ~

HGG7b), предварительно ихл¿мдсппйе до температуры *и£когй ззр-

7a■ i¡ийЛс GaiiCP атнЕьНПл KGHTcíihcp ПЕРспиСИЛИ Б &ИДКИИ ¿307*

2 третьей случае образцы запара*ивали g Гш^&аьа бл^кив из

3 Л с К 7 р G Л И7И Ч с G К G Й НЕДИ, йХЛаЖДсККЫХ Б ККДКйН fl3ü7S. CKGpCG7b ÜX~

лаэдания регулировали ?70?уллас7сва;ап прск-ладкаш различие*! толщину Ксдду олакапи и контейнеров. ЦьтРизсй натерьал сьраоа-

Скорость охлаждения при различных способах быстрого заиоражиЕания, Б работе ны рассматривали процесс занораживания биологи-чеокого патериала в плоской иеталлическои контейнере, игновен-но приведенной в териический контакт с твердый теплопроводни-кон, охлажденный до температуры жидкого азота.

Полный патепатический анализ процесса завораживания очень сложен» позтсиу ьыли введены некоторые упрощения в рассматриваемый процесс. В связи с тен, что толцина контейнера намного Кснысг остальных разнерав, анализ проводился для одноиерного случал, а длину твердого проводника считали бесконечной. Начальную температуру образца считали равной текпературе кристаллизации, ¿лизинга стгкок контейнера, считая их тодцпну значительно кгньые толцины заиораживаепого натериала, а теплопрс-зсднссть и теплоемкость натерпала контейнера соответственно значительно бсльые и значительно кгкыьг, чей ссответотгук^ие характеристики образца. Для иатепатичеокоп простота тепловн-кссть и теплопроводнеоть твердого теплопроводника и образца

считали нг зависящими от тенпгратуры.

В такой система уравнение, 6«pa»as%ee скорость охлаждения на îpoHTe кристаллизации и толщины заморожЕнного слоя в лкбой

Г нт Еренени дано Еолдои 119й5).

Y Рис.1. Скорость охлаждения на

ÎPOHTe кристаллизации при использовании в качестве твердого теплопроводника материалов с различной тепловой инерцией. 7

^^^^ 2. ~п - iÖn-i.iJvO v ^wTtuBK 'УК

"ТГТлЗ TÎJÛ0 н - тепловая инерция твердого Т с П Л С П р О Б С Д Hr¡ Ka « Как видно из рис.1, мы исжгм получить максимальную скорость охлаждения, используя в качестве твердого теплопроводнина чисту« медь iH.T.ax соответствует меди), и изменить скорость охлаждения изразца, выбирая твердые теплопроводникн шороаки) с соответстгукцимг! значениями т е п л о í и з и ч е с к их х а р а к т е р и с т и к «

Еце одним способом управления скоростьк охлаждения является использование в качестве теплопроводника блоков из металлов с большой тепловой инерцией (например, меди) и теплоизолируй,¡х прокладок различной толщина, ría использозали оба способа управления скоростью охлаждения при заиораживании. Первый способ удобен при крисконсарснрозанпп биологических объектов, не переносящих механических воздействий, второй -при крисксноЕрвирсваний объектов, ииейцих значителануй плоцадь и ьг боящихся мЕханичЕсксго ЕОЗДЕйстЕНя (например, кожа!.

Таким обр ¿30«! J ЛуТЕг! i í а Т £ i 'i о Т > ¡ Ч £ 3 К С Г С ün¿í"Ífi3¿ sí Ы ЛОКаЗаЛн БСЗЬй&НЗСТЬ УЛРаоЛсНИЛ OKOpDOTbtó ОХЛвХДсНИл ОёраЗЦа. C'ÄHwSpg-

иеннг о ъ]ш\ были измарсны ско^оохи охлаждения контейнера с

nci'iüivcnriwri Un'/Tpb Ttpuûi lapön. 1 ¿КОЙ Не ХОД нЗ»чср£НпЯ Не ПС за о-Л Я с Т ПОЛУЧАТЬ üOüö/TivTnbS рсЗуЛЬТаТи J НО ДаиТ 5G3í'¡uftHwGTb ПОЛ У" ЧИТЬ у ТНСОнТс ЛсНьс? есЛиЧмН«$ /%¿P¿K7 сР*;ЗУЙ4ИС ЁСЛсе Vm,i К с Не с точно Д/iHâi»«ку процеооа схлаждЕния п?я з a ¡ í -3 Р а » i a а и f i ? s различны ■*

1Л1 ЗПОСС^й! tit И ПОЗБС Л 7i £ Т ОЦЕНИТЬ Ил £ Cr d ь л к:Т t Л о НО ii а 0 Пег-. « с • рсЗуЛйтатс-i прн^сДспй» ¿ таблицах 1 i¡ ¿i

i ü

Скорость охландгния при занораиоанпи с гавдьв пороака и дуралапипггых олокаа.

Таблица 1.

^ < • G С G Ь 3 ¿ i-i wpd ¿ 'А с а H И л lH^Uj i. н Ь si Âypâ/iÂiù.hH-ЕЕУс СЛиКИ

V К w р С- С T s О л Л à а Д с h п Я К/ПмП W -J V V 'J V V ¡ i' V V i i V V V

Сксрость охлаждения при заиоражпаании с лопоць,;- педных блокса через теплоизолирующие прокладки из фторопласта различной толцину и пог?у»анигм а жидкий азот

uraco» заиоражизания

Голына' теплоизолятора i,„.:.¡;

ькорость ихлахданил ijuj j К/иин j i __i_i

v> üüii ü

IvÜÜ "■ diöO'"" Qlv^U

Я HA COÄPAH-

тшт in

занораж;-;£анк1е зрптроцитоб а пa?ôûr\ серии экспериментов проводили ПОГ р'у'лсписи б ЖИДКИЙ ¿201, О Ш-ЗДЫ* VCTpOHCTiä AAR заиорййизания ¿ПиЛОГИЧЕСКИХ ü5bcr;Tu3 И С ПОНО^Й ИсДКиХ оЛ0~ küb. Б табл.З прЕДст¿блены величины урсзня гемолиз* зритрс^-г

ТОБ j 38í'íüP'úa£HHkX раЗЛИлгШПП СПОСOu¿лИ > U KàHEGTsô КрИОПрОТсК"" ТОР Б мСПОЛЬЗиББЛип ГЛП^Ер^Н*

i'-.БК а к! ДНО ИЗ ТБоЛ « -j ПР И СКОРОСТИ ОлДалДспИп, ^ йнПЗКСП^ К ОПТЬнБЛЬЬСП^ ГЛИЦЕРИН 31тсКТИосл Б КОКЦЕТра^ИНХ ОТ О ДС iv ПрОЦЕлТОБ ■ з БЕЛП'т ЕпИЕ ЕГО КОНЦЕНТР Е1ЦНП ДО ¿:-Jñ БаЗиЗасТ 3âriE7~ НйП рССТ / РОБНЯ ГсИОппЗБ» s ЕлСЛИЗ Б 3 Т •_!á Ca jЧас пр ПоЛНй-.ЕЕТСя К

т

i

ГснйЛ^З^ Нс^Зй^мцсплил KpHGfipGTcKTGpGíi ЗрйТрицИТОБ, ССОТоаЛл» ifi,cn ü¡ , / tyj/¿«í\Ghü,ch7püLi*Í.ñ ГЛиЦс'Р«Наj päönüii lU¿ ОКаЗйЛйСЬ Hä" мООЛсё Зт$£КТийН0м 5 UhPüKGH Дм ¿fió 30'He ОКирООТсЙ GXfiâ*»c№tfi. При H&KG№4«TbnG3 GKGpGCTii GXf,ü№Htm ГАКЦбрнН ЗКаЗаЛСЗ ?£К7Ивпе4И Eu éCcX КОНцсНТрьцИлХ, За НОКЛы'тсНИсг! ДОойЛепО НИЗ"

кой концентрации 2,57., прь которой его Зенитный з4$ект s некоторой степени _г»?олБйлСл, так как Гсполиз^ нсзадаенп«*

ЗрКТрОЦИТОа ь 3TGH СЛуНас СКаЗаЛил РавНаИ ht * ^

iаС'Лгщс -u'i

¿ЕБКСПлООТв ГсиОЛ^За ЗрИТрОциТОй GT КОпЦсНТрацИ ГЛИЦсрк»па г« СКОрООТИ йХЛБлДспЙл»

КОлцсп » р ацг'кл и глицерина (X! Li-. бедные блоки

II Ш dlfâist -:r,rr rrspr-r;-Ji - v. Ш 'S rr^V-l, Ujl-i.j'.'f . J ru> n 711......

I - гёзуйвтат мОСШсРНй ОТЛИЧаеТСЯ ÛT ПРсДЫДУЧсГО. р< 0,05

Наибольший интерес предстаЕляет^обнаруженная зависимость гемолиза ст скорости охлаждения была выяз ЛВпВ ПРИ КОНЦВНТ рациях и с/*, при замораживании с зтиии концентрациями оыло установлено, что зависимость геполиза от скорости охлаждения Инёет.АВв иидйиуиа и два максимума.

>акнм образом, при использовании глицерина в концентрациях 2,5* и 55 обнаружено наличие двух минимумов на кривой уровня геиолиза в зависимости от скорости охлаждения. пс*но предположить, что в концентрации 1С5 глицерин сглахивает колебания уровня гемолиза.

При использовании в качестве криопротекторов ПВП-125С0 и П30-15С0 установлено елгдулцег, два иинипупа и два иаксинуиа уровня геиолиза эритроцитов на кале скоростей охлаждения наб-лйдалпсь нами только при использовании ьеП-12500 е концентрации 2,55 ПЗП Е кснцентрЕации 55 оказался эффективнее, чей ÍIju,

S

б СйАсс широкаи диапазоне высокий скоростей охлаждения. Виесте еден, при скоростях охландакия аыые чек »¡¡и погружен;;»-; в и г, в концентрациях х..с¿. и о/. проявил сеья пвлозу^ективныи криопротЕктсрсн. -Одна^й, при накскьальной скорости охлаждения в концентрации а¡¡¿у оказался оолее эффективный, чей ¡юи или глицерин. Повышение концентрации этих криопрстектороа до 20» вызывает увеличение уровня геиолиза, как и при использовании глицерина.

при использовании в качестве криопрстектсра сахарозы отпечен достаточно выраженный защитный з^ект при ее концентрации 5л и Юл и ьаксипалвной скорости охлаждения.

При запораживании эритроцитов о поноцьй недных блоков и теплопзслируйцпх прокладок различной толцины отпечены похожие зависиночти уровня геиолиза от скорости охлаждения и концентрации криспротектсра. Зтнечено, что зависимость геиолиза от скорости охлаждения а этом случае выражена очень сильно.

На рис.2 представлены значения светосуины хеиилжнесцен-цип эритроцитов, индуцированной 5Х-кой перекись» водорода.

При индуцировании хеиилкнинесценцпи эритроцитов перекись» водорода до запорвживания, как до введения криопротектора, так и после, свечение не регистрировалось, йз приведенных данных в;цно, что иаксипальная устойчивость к перекиснсиу скислени» наолкдается у клеток после замораживания их с глицерине;; в концентрации 102, и остается практически одинаковой во всем исследованном диапазона скоростей охлажден;-;?..

9

¡(sri видно из ?ис,2, устойчивость гшньран клеток к г,е?е-

киснспу окиолсы* такха инагт два каксииуиа на икале скоростей охлахданпл, что aspasaaTCS б минимуме амплитуды к сзетссуммы Х£нилк.ЧЙН£сцё»щйи. особенно сильно 3Tä ЗЗЕИСННООТЬ ЕЫрайЕНа

при низких концентрациях глицерине.

Исходя из изложенного ес,ше, можно сделать вывод о наличии двух диапазонов скоростей охлаждения, при которых плазматические мембраны зритроцитов повреждается менее всего. Зтс под-таеркдагтся минимальными показателями гемолиза зритроциитов и максимальной устойчивость^ к переписному окислений.

Для выяснения возможного мехапизма повреждения клеток пр.; Сольыих скоростях охлаждения мы проводили быстрое сиеыпвание зритроцитоз с растворами хлсристогс натрия различней концентрации. Зритроциты смеыивалн с растворами Sa»l как без криопро-тектора, так и с добавлением криопротектсрсв различной концентрации. В зтом случае £аотворы Na Л содержали криопротектор той же концентрации, медленное повышение концентрации хлористого натрия от v,i5 ¡.оль до 0,4 коль в среде с зритроцптами привело к гемолизу, равному 272. Б таблице 4 приведены величия«! уровня гемолиза а заеисимости от концентрации глицерина и хлористого натрия в среде.

Таблица 4.

Гемолиз зритроцитсв в зависимости от концентрации хлористого натрия и глицерина при быстром снашании

концёпТрацйГ--;—копцёнтрация Naoi ÍI7-"--

Ir'ii ja il а

I\ÜK ИЗ ТаСжпчёЦ j'pCöc'ns i ¿iiú¡\ri¿á Gsd>Í¿HT DT Кйпцсл"

Tp¿i4»jfi КрПОПрйТёг-.Тйра • t y ¿s, t w T с У с T йПрЕДсЛсЬЬйл сГй КиНцспТрС" и, H л, пр fi KüTúpüfi ypüöcnc ГснйнИЗа иИНПпаЛ cri» 2&сЛ*Гтстчё ПАИ yíicribüchfic' ci и г-.иицеп j рац»ч»{ Пр-К РиОТУ Гс»"»иЛн.^й j Т»с» ларсичТСр j¿DKiuHtiuuTn Уриьпл ГспОЛнЗ« D7 КОНцЕпТрйДИИ ТаКиИ »cj KùK и Пр ri ¿-biwTP'jíi 3üíi-jp¿ÁKc*üH»Uii «ЛЯ ДРУГИХ Kpi-iDnpûTcKTGPOô

10

получены те же зависимости. Этот Факт позволяет предположить, что при замораживании о большими скоростями охлаждения, как и при гипертоническом гемолизе, одним из ведущих Факторов повреждения плазматической мембраны является быстро увеличивай^а-яоя разность осмотических давлений вне и внутри клетки.

iToSti определите влияние больших сксростЕй охлаждения на Гспатйцпты, их замораживали с большими скоростями без криспро-тектора_и с 5£-нын раствором глицерина. Состояние плазматической мембраны определяли по исключений трипанового синего, скорости зндогенного дыхания и по коэффициенту,стимуляции дыхания су-'.цинатом 5 концентрациях 1 ¡¡моль и i0 нмоль. гЕзультаты представлены в табл.о. Как видно из таблицы о, процент прокрашенных клеток, завороженных без криспротектора, существенно

зависит от скорости охлаждения, ьинимун повреждения клеток наблйдаЕтся при замораживании их через теплоизолято? толциной 100 икн о поиоцьк медных блоков. Уменьшение скорости охлаждения, а ваг больше ее увеличение, приводило к росту количества погибших клеток. При защите клеток глицерином, количество погибших клеток уменьшалось, за искличением случаев, когда клетки замораживали с максимальной скорости;. Аналогичные результаты получены при изучении скорости зндогенного дыхания и коэффициента стимулирования дыхания сукцинатон.

Таким образом, можно сделеть вывод, что в области больших скоростей охлаждения существует скорость, при которой количет-се-с сохранившихся клеток максимально. Применение криопротекто-ров позволяет повысить сохранность клеток.

Слияние высоких скоростей охлаждения на сохранность тканей. Существуйте способы сохранения жизнеспособности кожи и ампИотичЕскси оболочки не удозлетс-оряйт потребности клиники а полноценном пластическом материале. При их хранении в гипстер-

мических^ УСЛОВИЯХ ОНИ СОХраНЯЙТ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ в ТЕЧЕНИЕ НЕ ч?ОЛЕЕ НЕДЕЛЬ, ä 0УцЕС7В>йЦИЕ МЕТОДЫ НИЗКСТЕИПЕРВТУРНОГО КипОсрВпрозаНгля ДОВОЛЬНО ТРУДОВИКИ и ТрЕОУшТ ДЛл СВОЕЙ рЕЕЛИ-

зации сложной аппаратуры.

а»я изучения влияния ^сльии.-ч скоростей охлаждения ни попользовали кожные лоскуты, взятые от кролем породы шиншилле» изучалась интенсивность зндогенного дыхания, уровень перекис-Hüx процессов в коке и ее устойчивость к индуцированному пере-

КИСКОМу окислений хемплйминесцентным методом, е текже определялся интегральный количественный критерий трансплантации кожи. Зги данные приседе,-,« в табл-i, 2,

ьОЛПЧёОТБО ПР CKP¿ia£HH&ÍX К Л с i OK, СКОрООТо ЗНДОГБлпСПи ДмХБННл ГёПйТОчПТОБ И КОЗ?-гИЦИсНТ СТИМУЛЯЦИИ ДиХапИЯ СУКцИНаТОп НБТрпЯ Б Заьн~ СПпООТИ ОТ КОлцсНТрБЦИП ГЛПцёрИНБ и СКОРОСТИ ОХЛалДёНИЯ•

i aviir'ii^s u»

?i ¿.у tac nun nurvawoic/to

¡чип i

i wn^nria i с tut un juji л i upa u'mn/

i's/'-J

ûc'3 КрПОПрОТёКТОрБ H npûKpàuicnrictX КЛсТОК 1 0 1U ПС úü 51 i Л Л, IV V

СКОРОСТЬ ЗпДСГёННОГО ^ У A а К A л H M ОЛЬ У г i п И H ИГ т с •-'< W h?. п п ¿jU n 1 i. } i

í\ 0 311 И цИслТ ОТ Hi í У Л л Ц И И •J J u i у 7

i ti it Г Л и ц £ Р И H Б ы npOKpäücHHßX КЛёТиК 17 70 95

wKOpOOTb ЗНДОГёпНОГО

ДйХБпПЯ КпОЛЬ !J И ПИН ИГ «ч03 +:*ПцПсНТ СТППУЛЛцИн Ï'É i,j H ' л YS iv

пл ПрИБсДЁНЬьХ ТаоЛИА БИДНОj ЧТО при ЗаНСрБАИЕаНпП ТКаНсП О oüjibLU-ifcH СКОРОСТЯМИ ОХЛБаДёНИЯ TäKiÜc нНёсТСЯ СКОРОСТЬj П?И КОТОРОЙ ПОБрсйДёННс ¡ТПНИПБЛЬНО» ^ ТаКнИ 0upá30ríj ПРИ ЗйИирвлИББНИИ КОлИ И анНПОТИЧёСКОИ О'оОЛОЧКП 0 L-ü/ibtaHitH СКОРОСТлНИ ОХЛБлДЕНИл БОЗИО-ьёН подбор ус~ л 05 И И КРНОгчОНСсРЕНРОББНИл сёЗ КРИОПрОТёКТОрОБj ПРИ КОТОРЫХ ПО" КиЗыТсЛН ЬИЗНсСПОСОйпОСТН ДсКОпСёрБИрОББпНиХ ТКаНсП OOTäiCTO.n ¿ЛПЗКИПИ К ПОКБЗаТёЛЯИ, ХБрвКТёрпьН ДЛЯ НаТИБНЫХ Oopô3J,Oo •

1йоЛИц,Б ü.

ОР с ЗОБ КОХИ j ЗБИОрО/всНпОИ L nútiu^c» ПСДП&А witOfiOß ЧсрёЗ ТсПЛОИЗОЛлТир. и J j h >) »

ji\vpüvib ennui u

hi 10 j i Ь \j* i tí fin Tib

i СЛцИНО ТЕПЛОиЗОЛЛТОра uiKil/

KOHTpwñb

-A,, J

vjiAÎ,Q: OjyS^y^Öl О

Ч V j Ù U /V j 'vü

'1Ô;Ô5

Таблица 7.

Интенсивность хенышиинеоцЕнции образцов кии (атн. ед.5 и показатели интегрального количественного критерия трансплантации кожи при замораживании с помочь» медных блоков через теплснзслятор.

изучаемый показатель контроль Толщина теплсизолятора.1мкгИ

. нтанная хемиякми-несценция 0 7,0*0,1 Я 7 ^ *. Т г «"< -г-, г. Т < ^ ) 0 и ( □ "V } *

йндуцирсзвннея лк-минесценция 4 С) ; 0-4. ; т ¿7,810,3 е.ч «-¿л г тл 1 + л г

13,3:1,0 12,8^1,01

1 - Значение дсстовернГне отличается от комтрслл,

ПРОЧНОСТЬ И ПрОНИцасПОСТЬ ДЛл ЕЛЬ^УМПНа аНННОТПЧЕО-Кип ОоОЛОЧКн ПОСЛЕ ЗаииРа&мБаНИл С раЗ^ИЧНаПИ ОКО" РССТлНЙ.

I и/щьла

:" ^'-- гг т тг'ггг'—'».т,—■тг" а у 1Iа нчг-.н/

¡.рОЧНОСТа ¡|

гч "'СП

1:рйпИЦаС~ ПОСТо

(\ип » р ил » ¿Л —-»"Г— □ V —г»?г- и V ———г^г."—

^¿.ч»—й г'* и 4 7 4 —и ♦ 7 4 4 >-■ -и *

.« * 7 4 41/-V? * * 4 1 4. —4 *

М,ии I иис^пи и I г|гПаС ( и.г1 и I г-.ип I г

и.чя« г ч'.'« VиI

¿ЛПЯлПЕ иОЛЫиПХ СКОр йСТ5»4 ОХ Л ¿¿ДЕНПл На СилраННООТЬ ПИНРООрГёНИЗКОБ« •иОХРаппОСТЬ НПКрООрГаНИЗПОз ПОСЛс КрИОКОНСЕРоИРОвйНИЛ За~ ьИСИТ ОТ ДЕИСТБИл 9аНТОрОо НИЗНОТспПсраТУРНОГи КСпСЕр&ПрСьа'" И VI л, 3 Л И л Кг Я И X па ДРУГИЕ 0 о & с К Т #; а Т 5 К Ж с ОТ У СЛОВ И И К У ЛЬТПВП" ^05алПЯ| уаЗя рОСТа. и Т»Д» ПЫ ОПРЕДЕЛЯЛИ ¿НЕСПОСОБНОСТЬ

ПОСЛЕ КрПОКОпСсрьПрОБзлПл о СРЕДЕ КVЛЬ" ТПЕПРОььНПЯ & ОТ ¿^ПОп ар НОИ *аЗс РОСТЕ иЕЗ КрНОПРОТЕКТСра» и

таалены данные по количеству жизнеспособных клеток после зано-рахавакия их е контейнерах погружением б жидкий азот и с по-иояь» охлажденных медных блоков с теплоизолируй*»!« прокладками различней толщины. При закорачивании с максимальной скорость« клетки отогревали как быстро !Б0), так и медленно {"01 на воздухе.

как видно „з таблицы 9, ¿изнеспоообнссто Bifi ййиай ¡.¿г 1 ин> oitioao остается достаточно высокой при всех скоростях охлаждения. Однако можно отметить тенденций к повышений сохранности клеток при замораживании о га«р!«лькой исследованной скорость» {в жидком азоте! и при приближении скорости к максимальной, медленный отогрев снижает количество жизнеспособных клеток, что отметалось и другими авторами.

Таблица 7.

Влияние высоких скоростей охлаждения на жизнеспособность Bifidobacterium bifidua после криоконсераирования без криопротактора

ипосоь замораживания j Натив | ! 1 " т 1ОЛДНлВ iеПЛиИЗОЛИруйДс! о слоя !нкм1

1 _ __ uiijCi

количество клеток ; 10,51 | м- a3- ¡;i" ir !!»'г {¡Г

Photobactarii phosphoreus тага оказались устойчивыми к высоким скоростям охлаждения, 11 только при максимальной скорости охлаждения наьлгздалось снижение количества жизнеспосоо-ных клеток,

выводи

1. Использование в качестве твердых теплопроводннков порошков металлов, окислов металлов, их сплавов и смесей позволяет управлять скорость» охлаждения биологического материала при замораживании его о большими скоростями охлаждения,

2, истсд, сопсвзнный на замораживании биологических образцов с покоцьк охлажденных до танпаратуры жидкого азота медных блоков с использованием теплоизолируйцих прокладок различной толцины, позволяет разрабатывать способы криококсерБИРоаа-пия биологических обьектов, причем их жизнеспособность после отогрева остается близкой к жизнеспособности нативных образцов,

З.Окспериментально установлено, что при консервировании легочных суспензии существует оптимальная концентрация криоп-Для

ротактороБ. Для эритроцитов она равна 102. Увеличение или

уигкьйсНйв концентрации ведет к расту повреждения клеток.

4. Сохранность апологических объектов в зависимости от скорости охлаждения имеет второй максимум,который лежит а области осльыих скоростей охлаждения.

5. ЗкопЕринЕнтапьныи путей установлено, что одним из основных псвраждащих ¿актеров при замораживании биологических объектов с большими скоростяпи охлаждения пожат являться разность осмотических давлении вне и внутри клетки, возникала; из-за резкого роста концентрации солеи во внеклеточной^ среде, что происходит при иЫстрои вымораживании внеклеточной воды.

¿. мри замораживании гепатсцнтоз с помоцьй медных блоков с теплоизолирующими прокладками из ?тсрспласта толцпной 100 мки, их жизнеспособность остается достаточно высокой при заците их криопротекторон в низкой концентрации.

7.Показана возможность криоконсЕрвирования кожи и амнио-тическси оболочки без криопротектора с применением больших скоростей охлаждения. При этом показатели их сохранности остается на уровне, близком к показателям нативных образцов.

5.Bitidobacieriua bitidua и rhoiooacieriaa рПозргтзгецо сохраняйт жизнеспособность после крпоконсервированкя без криопротектора с использованием больыих скоростей охлаждения.

^ список раьот, опубликованных по теме диссертации.^

№ ^дд/Заягка

и vüíüuv'iíúi i-T. í -.uiiueM i Cí4Di"u¿ t-ciacnMc: >JI ¿U.^-J.úíl kuu"

аат. S.íi.Гриценко, В.?.Тарасов, О.Парацук, H.й.Лучко, t.H.Hêp'rililii.

2. Оценка жизнеспособности криококсергированных трансплантатов// Тез. докл. VI-й Республиканской научной конференции "Патогенез и лечение термических поражений и их последствий у ¿jeTeij". -Харьков, ivSS. -С.2v6-207. \Соавт. Б.П.Сандопнрский,

3.Криобиологические подходы к созданий покрытий для ран//Тез.докл.междунар.копуЕрепЦии "достижения и перспективы развития криобиологии и крионЕдицины,-Харьков,1583.-С.10? iîo-азт. S.ii.Hcaea, Н.й.Золкоза).

4.Способ консервирования кожп//Заявка N 4373534/15.Положительное |е^ение^от ¿0.Q6.B9 (соавт. З.и.Гриценко, Б.П.Сандоиирс-

sV'Pat'iÏ?3Î7?397*USA, F25B i?/00.Device for refrigeration and freezing of biological objects /V.I.Srischenko, V.F.Tarasov,

5.EjSalchcfifco, Yu.f, ParascF.uk, N.A.Luchko, E.K.Chernysh

* г

Í-J