Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние криоконсервирования на сохранность и биологические свойств вируса инфекционного ринотрахеита

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние криоконсервирования на сохранность и биологические свойств вируса инфекционного ринотрахеита"

, Ь ии

1 Ь !!10Н 1993

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИ1УТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМВДНЦИШ

На правах рукописи -Уда 57.043: 578.81

СТЕГНИЙ Марина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ КРИОКОНСЕРВИГОВАНМ НА СОХРАННОСТЬ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИШЕКЦИОННОГО РШОТРАХЕИТА

03,00.22 - криобиология

Авторе ф. врат

диссертации на соисканиэ ученой степени кандидата биологических наук

Харьков - 1993

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицинн АН Украины

Научный руководитель - доктор медицинских наук,

профессор A.A. ЦУЦАЕВА

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

академик . УААН Г.А. КРАСНИКОВ ./г.Харьков/

доктор биологических наук, профессор В.И. ЛУГОВШ / г. Харьков /

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии и генетики АН Украины / т. Киев /

Защита состоится " > ~ " 1с ¡Ог С*' 1993 года в

часов

на заседании Специализированного совета Д 016.60.01 при Институте проблей криобиологии и криомедицинн АН Украины / 310015, г. Харьков, ул. Переяславская, 23 /.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан "/v " ■•' <■-_ 1993 года

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор медицинских наук

А.Н. ГОЛЬЦЕВ

- 3 -

ОЩ\Я ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОШ

Актуальность проблему. В настоящее вреыя научный и практический интерес к вирусам продолжает возрастать, так как они занимают значительный удельный вес в инфекционной патологии человека и животных. Учёные н практики постоянно сталкиваются с необходимостью создания надёжных методов долгосрочного гранения' вирусов без изменения их биологических свойств. Широкое проведение в нашей страна ваизднопро^мактики и вирусологических исследований ставит воп-/ рос не только о наличии в- Государственной коллекции вирусов стандартных шяашоэ - представителей различных групп вирусов, как вта-лонов', но и о создании запасов долгосрочно храншцихся в жизнеспособном состоянии вирусов для целей биотехнологии: производства противовирусных препаратов, антигенов и гиперимыунных сывороток / Селоанёва А.Ю., 1979 /.

Сохранение инфекционной активности и других биологических свойств вирусов необходимо я диагностической материале,- взятом от. инфицированного биологического объекта с целью выделения и идентификации инфекционного агента. Поскольку вирусы явится облигатнц-ми.внутриклеточными гэнетичесюши паразитами / Бунринская А.Г., йданов В.М.* 1991 /, возникает настоятельная необходимость изучения влияния криоконсервирования на. различные этапы внутриклеточного развития вируса с" целью создания оптимальных способоз его криоконсервирования в патологической материале.

. Шесте с теч, вирусшго частпци представляют интерес как модельные объекты для изучения, механизмов яриоповрег,дения и криозащиты биологических систем, так как представляют собой единственные, известные в настоящее вреия неклеточные форми кизни, паразитирующие на молекулярно-генетическоы аппарате живой клетки.'

Для сохранения вирусов применяют как методы консервирования

при положительных температурах / +2-4°С / / Никитин Е.Е., Звягин И.Б., 1971 /, так и в замороженном состоянии при умеренно низких температурах / от -20° до -80°С / / Харрис Р., 1956 ; ^¿(^ ,1975/, а также в лиофилизированноы состоянии / ¡¿U-tin 'У, 1963: /¿f^ ' lili -Jf.jr. , 1970; SiiidilíU 2. , 1970 /. Однако, перечисленные способы консервирования вируса имеют существеншэ недостатки, ограничивающие их применение. Продолжительность хранения отдельных групп вирусов даже при температурах близких к нулю /2-4°С / исчисляется несколькими днями. По данным литературы / Никитин Е.Е. и соавт., 1971 / ни один из стабилизирующих препаратов но обеспечивает 'надёжного консервирования вирусов на длительный срок пр-и положительной температуре.

При хранении вирусов в диапазоне температур от -20° до -80°С происходит значительное снижение юс инфекционной активности l/}itii<^~ ríiíC-П /'/'J. , 1966; ' ÍJ. , 1975 /. В случае, когда хране-

ние в данном диапазоне температур не приводит к значительному снижению инфекционной активности вирусов, восстановление их биологических свойств обеспечивается лишь после проведения ряда пассажей на животных или на клеточных культурах. Однако, »ги процессы трудоемки, недостаточно технологичны и связаны с опасностью контаьш-нации вирусов посторонней микрофлорой.

Применение лиофилизации ограничено Несколькими факторами. Прежде всего, замороженные суспензии некоторых' вирусов сохраняются . значительно лучше, чем лиофилизированные, где наблюдается снижение инфекционной активности на 2-3 / Фадеева JI.JI. и соавт., 1969/. В случае успешной лиофилизации- вируса, ампулы с лиофилизированным материалом с целью увеличения сроков хранения должны храниться при температуре не выше 4°с. Кроме того, при использовании метода лиофилизации существует опасность появления мутаций/ ¿tu ¡ Л. I . УиП /1' , 1975; Ñih'iflÜililf 1981 /.

Наиболее совершенным способом консервирования вирусов являет-

проблема замораживания вирусов до ультранизких температур далека от её окончательного решения. Известше работы по изучению влияния нрлоионсервирования на биологические свойства вирусов единичны и но лишены противоречий. В частности, единственным критерием, по которому оценивалась сохранность вирусов, был их инфекционный титр

Елесеев А.К., 1990 /. Являются малоизученными вопросы влияния скоростей замораживания на ультраструктуру и биологические свойства вирусов, воздействия ряда физико-химических факторов, сопровождающих процесс низкотемпературного консервирования,на инфекционную активность вирусных суспензий. Кроме того, отсутствуют сведения о влиянии криоконсерзирования вируса на биосинтетические процео-• си в сп5еме "вирус-клетка", не изучена возможность криокон-сервирования • вируса на разных стадиях его внутриклеточного развития, что имеет важное значение для успешного проведения исследований вируссодержащего диагностического материала.

Цель работы. Целью работы было изучение криоусгойчивости вируса инфекционного ринотрахеита в зависимости от степени его очистки, продолжительности хранения в условиях гипотермии, умеренно-низкой температуры и жидкого азота; исследование характера крио-повреждевдй вируса, определение ведущих факторов криоповрекдений, реализуемых на этапах низкотемпературного консервирования; разработка аффективных способов консервирования вируса и виру содержащего материала.

Задачи исследования: Дтя выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

/

- 6 -

1. • Выяснить возможность хранения вируса иш$екционного рннотрахе-_ ита в условиях гипотермии и умеренно-низкой температуры.

2. Исследовать влияние различных: режш.гав замораживания вируса до температура жидкого азота на его ультраструктуру, инфекционную активность, синтез белка и ДНК в системе "вирус-клетка", субмикро-' скопическую организацию клеток, инфицированных нативным к крио-консервированным вирусом.

3. Определить характер влияния основных физико-химических факторов низкотемпературного консервирования / гипй- и гипертонического, шока, температурного шока, гиперконцентрации хлорида натрия, изменения рЯ среды консервирования / на инфекционную активность вируса.

4. Изучить возможность криоконсервирования вируса на разных этапах его внутриклеточного развития.

Научная новизна. В ходе выполнения поставленных задач в работе впервые показано, что нриоусгоЛчивость вируса зависит от его исходного состояния, в частности, от степени очистки вирусных суспензий. Установлено, что сохранение ультраструктуры и инфекционной активности вируса зависит от применявшихся режимов замораживания. Впервые выявлено, что после криоконсервирования вируса по неоптимальным программам происходят такие изменения его ультраструктуры как: нарушение целостности липопротеидной оболочки, повреждение капсида или же полное разрушение вирусных частиц. На основании результатов изучения динамики цитопатичес-ких изменений в инфицированных клетках, их субмикроскопической организации впервые получены данные о том, что после криоконсервирования вируса как по опт шальным, так и неоптимальным программам, происходит запаздывание процесса, его репродукции, по сравнению с нативным; При атом,запаздывание репродукции криоконсер-вированного по оптимальным программа,« вируса не сопровождается.

- 7 -

снжхэнием уровня его инфекционной активности. Установлено, что заметное влияние на титр инфекционной активности вируса оказывают гиперконцентрации / 3-4 11 / хлорида натрия и изменение рН среда вапораяиванш в кислую сторону. Разработан способ криоконсерви-рования вируса с помощью оптимальных скоростей замораживания без добавления криопротекторов, позволяющий сохранять инфекционную активность индуса без изменения в течение длительного времени -двух с половиной лет /срок наблюдения / / Авт. свид. И655984/. Впервые показана возможность и разработан способ криоконсервирования вируса на этапах его внутриклеточного развития.

Теоретическая н практическая значимость работы; Теоретическое значение работы состоит в экспериментально установленном факте снижения инфекционной активности вируса, что связано с разрушением вирусных частиц, нарушением целостности их липопротеидной оболочки или капсида в. процессе криоконсервирования по неоптимальным программам. В результате изучения биосинтетических процессов в системах "нативный вирус-клетка", "криоконсервированшй вирус-клетка" показано, что повреждение вирусных частиц имеет место даже в случае применения оптимальных режимов замораживания вируса, но они не столь значительны, чтобы вызвать снижение инфекционной активности.

Практическое значение работы заключается в том, что разработанный способ криоконсервирования вируса инфекционного ринотра-хеита / Авт. свид. № 1655934: / позволяет использовать его в биотехнологии, медицине и ветеринарии^ с целью долгосрочной стабили-зацш! биологических свойств вирусов. Разработанный метод криоконсервирования вируса в чувствительной клеточной культуре на разных этапах его репродукции может быть использован для длительного сохранения вируссодеркащего диагностического материала.

' Работа выполнена в рамках исследований, проводимых в ИПКиК ЛН Украины. по планам НИ? / номер государственной регистрации 0 187.

0. 065&12, шифр теш 2.28.7.5 /.

Основные положения, выносимые на загдагу.

1. Криоустойчивость вируса инфекционного ринотрахеита зависит от его исходного состояния. Неочищенные вируссодержащие суспензии в основном более стабильны, чем вирус, подвергнутый частичной очистке.

2. Степень сохранения ультраструктурной организации и инфекционной активности вируса, состояние биосинтетических процессов в системе "вирус-клетка" зависит от применявшихся режимов его замораживания,

3. Среди комплекса физико-химических факторов, сопровождающих процесс низкотемпературного консервирования вируса существенное значение в возникновении криоповреждений, по-видимому, принадлежит гипер-'.

концентрации хлорида натрия и снижению рН среды консервирования. i

•

„Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых ИПКиК АН Украины "Холод в биологии и медицине" /Харьков, 1987, 1988 /; Всесоюзных рабочих совещаниях "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, млеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины" /Киев, 1987, 1990/; Республиканской конференции "Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблеш" / Харьков, 1990/; Республиканской конференции "Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии" /Кишинёв, 1990/; Международном симпозиуме "Вирусология, иммунология и общество" /Киев, 1991/; Международной ■ конференции "Успехи современной криобиологии" -/Харьков, 1992 /.

Публикации. .По результатам исследований опубликовано II научных работ, в том числе 2 авторских свидетельства на изобрете-

ния и одна монография.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 105 страницах Машинописного текста, включает 26 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, б глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, содержащего 207 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД ИССЛЕДОВАГМЙ.

Объектом исследований был вирус инфекционного ринотрахеита-лустуллёзного вульвовагинита крупного рогатого скота / ИРТ-1ШВ /, шташ "Молдавия", полученный из института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины /г. Харьков /. Вирус культивировали на перевиваемой клеточной линии почки теленка /ПТ /. Клетки культуры ПТ выращивали на среде 199 с добавлением ЮЙ инактивиро-ванной при температуре +56°С в течение 30 минут сыворотки крови крупного рогатого скота и гентамицина из расчета 100 мкг/мл. В ка-: честве поддеркивающей использовали среду 199. Заражение клеточной культуры осуществляли по общепринятой методике / З.Лярски, 1680 /. Определение инфекционной активности вируса проводили по цитопати-ческому действию / ЦПД / вируса па клеточную культуру. Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча / Анджапаридзе " О.Г. и соавт., 1962 /, стандартное отклонение титра - по формуле Пицци / З.Лярски, 1980 /. В качестве неочищенного использовали вирус, полученный после разрушения монослоя клеточной культурл. Частично очищенные вируссодеркащие суспензии получали путём предварительного осаждения клеточного детрита центрифугированием при 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут с последующей очисткой надосадочной фракции при 16000 оборотов в минуту в течение 1,5 часов / Адаме Р., 1983 /. Хранение вируса в условиях гипотермии и умеренно низкой температуры осуществляли в холодильни-

-10 - ,

ке ' соответственно при +4° и -5°С. Охлаждение вирусных суспензий осуществляли по следующим программам: I. Со скоростями 0,2; 0,4 ; 0,8° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот;

2. Со скоростью 2° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот;

3. Со скоростью 30-40° в минуту до -28°С , с остановкой при этой температуре в течение 15 минут и последующим погружением в жидкий азот ;

4. Быстрое, со скоростью 300-400° в минуту, погружение в жидкий азот /-196°С /. • Вирус в поддерживающей среде помещали в металлические контейнеры объемом Г и 10 мл и подвергали процедуре замораживания на установке программного замораживания биообъектов с электронным блоком управления, разработанной в С1С1Б и ОП ИПКиК АН Украины, которая позволяет реализовать широкий диапазон скоростей охлаждения с погрешностью не более - от заданных программой значений »того показателя / В.А. Красилышков, В.Г. Касьян, 1976 /. Размораживание осуществляли на водяной бане при температуре +40°С.

Исследование ультраструктуры вирусных частиц й субмикроскопической организации инфицированных клеток проводили с использованием электронного микроскопа ЗАВ - 1001 /Сумского завода влектроншх микроскопов / и электронного микоскопау/ //-100В фирмы/Япония/ методом ультратонких срезов. Подготовку препаратов для электронной микроскопии осуществляли по методу общепринятому в вирусологии / Л.П. Дьяконов и соавт., 1980 /. Электронно-микроскопические исследования проводились в отделе электронной минроскопии Института, вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР / г. Москва /ив Институте дерматологии и венерологии Минздрава Украины /г. Харьков/.

Изучение чувсввительности к гипотоническому шоку вируса ИРГ-Ш1В проводили путём быстрого добавления к 0,1 мл концентрированной

вируссодержащей суспензии 10 мл дистиллированной вода. После чего определяли инфекционный титр вируса. Контролен служили пробы быстро-разведенные в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия. При изучении чувствительности вируса к гипертоническому шоку к 0,1 мл его суспензии одномоментно добавляли по Ю мл растворов хлористого натрия с концентрацией 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 и 4,0 И или сахарозы с концентрацией 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 М. После чего определяли инфекционный титр вируса. Чувствительность вирусных частиц к повышенным концентрациям хлорида натрия или сахарозы определяли по его инфекционному титру после постепенного, в течение 20 минут добавления растворов в возроетающих от 0,5 до 4,0 N хлорида натрет и от 0,5 до 2,0 М сахарозы концентрациях. О чувствительности вируса К температурному шоку судили по его инфекционной активности после быстрого переноса 0,1 мл вирусной суспензии, находившейся при 37°С в 10 мл среды, охлажденной до +1°С. Определение чувствительности вируса к изменению рН среда консервирования проводилось путём добав-• ления к 0,1 мл вируссодержащей суспензии 10 мл среда 199 со следующими значениями рН: 7,0; 6,7; 6,0; 5,6; 4,7 и 3,5. Изменения рН достигали путём добавления в среду 199 соляной кислоты.

Изучение синтеза белка и ДНК в системе "вирус-клетка" проводили по интенсивности включения Н3 тимидина и С^ лейцина. Обра-боткупроб проводили по общепринятой методике / Д. Кеннел, 1970 /. Радиоактивность проб определяли в жидкостном сцинтиллнционноы счетчике ,91 / Франция /.

Изучение возможности криоконсервирования вируса в клеточной культуре па разных этапах его репродукции проводили следующим образом. Спустя 2; 6; 18 и 24 часа контакта вируса с клетками удаляли подчеркивающую среду с последующим определение!« в ней инфекционной активности вируса. Кроме того, перед снятием с поверхности культу-рального сосуда клеток ГГГ, вирус, находящийся в поддерживающей среда,

- 12 -

нейтрализовали специфической иммушой сывороткой- в течение двух часов. Посл.ед>та(ук) подготовку к криоконсервированш, замораживание и восстановление из замороженного состояния инфицированных вирусом клеточшх культур проводили по общепринятому для клеток методу / A.A. Цуцаева, 1983 /. О влиянии криоконрервирования инфицированной вирусом культуры клеток на отдельные зтапы его репродукции судили' по инфекционному титру, определявшемуся после полной деструкции клеточного монослоя.

Изучение влияния продолжительности хранения вируса НРГ-ИПВ в жидком азоте на сохранение его инфекционной активности проводили спустя 24 часа, 30 суток, 3; 6; 9; 12; 15; 18 месяцев и 2,5 лет. Стастистическую обработку полученных результатов иссдедований проводили по методу Стьюдента-Фишера / И.П. Ашмарин и соавт., 1975/.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВШЙ И ИХ ОБОТЦ^НИЕ.

. Собственные исследования показали, что хранение при +4°С частич- | поочищенных супензий вируса ИРТ-ШВ уже по истечении 7 суток ведот к снижению его инфекционной активности на ZÜJ , & через 25 суток iia 3 Üj по сравнению с контролем. Спустя 31 сутки хранения в условиях гипотермии вирус практически икактивируется. Значительно более устойчивым к условиям хранения при +4°С оказался неочищенный вирус ЙР1-Ш1Б, находившийся в культуральной жидкости Еместе с субклеточными компонентами. Лишь по истечении 31 суток хранения в данных условиях инфекционный титр вируса снизился на I ■((■ . Вероятно, субклеточное компоненты клеточного детрита при хранении в условиях гипотермии оказывают выраженное защитное действие на вирусные частицы. Изучение возможности хранения вируса при температуре -5°С показало, что по истечении 4-х месяцев вирус полностью теряет инфекционную активность.

Таким образом, со всей определенностью можно констатировать, что хранение вируса в условиях гипотермии и умеренно-низкой темпера-

- 13 -

туры не обеспечивает сохранение его инфекционной активности на длительное время. Поэтому ш полагали, что более аффективный способ консервирования■вирусных частиц, обеспечивающий максимальный уровень сохранения их биологических свойств, является криоконсер-вирование в условиях жидкого азота.

Проведенные исследоватш показали, что инфекционная активность вируса зависит от применявшихся режимов его замораживания /табл. I/. Из дагошх таблицы видно, что после замораживания как частично очищенных, так и неочищенных вируссодержащих суспензий со скоростями 0,2-0,4-0,8° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот, инфекционный титр вируса не изменяется по сравнению с таковым в контроле. Оказалось, что дашшз режимы замораживания являются оптимальными для вируса ИРГ-ЙПВ даже без добавления крио-цротективных веществ. Было установлено, что инфекционная активность частично очищенного вируса, крноконсервированного по быстрой двух-этапной программе с температурной остановкой при -28°С, а также ' путём прямого погружения в жидкий азот, снижается в одинаковой степени - на 2 . После нриоконсервирования неочищенного вируса по программе, предусматривающей охлаждение со скоростью 2° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот, индукционный титр снижается на 3 /'</ , в то время как очищенный ви- . рус при втом практически, инактивируется. Нами выявлено, что инфекционная активность неочищенного вируса, замороженного путём прямого погружения в яидкий азот, снижается в меньшей степени, чем инфекционная активность частично очищенного вируса. То есть, в данном случае при замораживании также, как и при гипотермическом хранении, неочищенный виуус более стабилен по сравнению с Еируссм, подвергнутым частичной очистке. Эти данные согласуются с результатами исследований, полученными 3. Лярски / 1980/, который показал, что клеточные янс'тракты обладают защитными свойствами при замора-

Таблица I.

ВЕШНИЕ Р2Ш0В ЗАНОРАШШШ НА ШОДОПИЕСКУТО АШЬЩ5ТЬ-ВИРУСА ¡ТГР-ШГВ

Поогозмма зэморааазаная Тдтп неочищенного васуса • Тато очащеннаго злоусэ . " -ф,ТОД50/мл^ _-ф'ЩДбО/мл ± ^ 'хДД50

через 24 часа через 48 часов через 24 часа через 48 часоз после' пнфацяро- после инфнци- посла пнфлди- посла днфидиро-взндя_тювзнля_ровандя_за ноя__

Натизный незамороженный вирус /контроль/ 3,32 + 0,22 5,32 + 0,22 2,32 + 0,22 4,32 + 0,22

От *5°С до -70°С со скоростью 0,2°/или. и последующее ПОГру-ганые з аадкай азот 2,32 + 0,22й 5,32 + 0,22 2,32+ 0,22 4,32 £ 0,22

0т+6°С до -70°С со скоростью 0,4 /мин .• и последующее погружение в хдаий азот 2,32 + 0,22х 5,32 + 0,22 2,32 + 0,22 4,32 £ 0,'22

От -=о° до -70°С со скоосстьз 0.,3и/м:щ. и последующее погружение 2 жидкий азот 2,32 0,22х 5,32 0,22 2,32 + 0,22 4,32+ 0,22

От т5° до -70°С со скоростью 2 °/жш. я последующае погружений в гадкий азот 1,32 -1- 0,22й • 2,15 + 0,24х

От +6° до -23°С со скоростью 30-40и з млн., со стабллнзаци-ей в течение 15 мян. л последующее погружение в жадкий • азот 1,32 £ 0,22х 3,32 £ 0,22® 1,32 + 0,22* ,2,32.£ 0,22*

Погружение материала з кздшй . азот • 1,32 £ 0,22х 4,32 £ 0,22х 1,32 + 0,22х 2,32 £ 0,22х

Ирцузчанде: ТЦД50 - стандартное отклонение татра. А Отличае от контроля достоверно.

ж Уровень значимости р4.0,,05 .

я = 4; - вирус инантивзруатся.

- 15 -

живании вирусных суспензий.

На основании нолучешшх результатов исследований нами разработан способ криоконсервирования вируса ИРГ-ИПВ / Авт. свид. № 1655984 /, позволяющий сохранить инфекционную активность вируса на исходном уровне в течение длительного времени.

сйектрошю-микроскопичоское изучение ультратонких срезов нативного и криоконсервированного вируса показало, что при его замораживании по неоптималыпм программам практически все вирионы имеют повреждения, степень которых"коррелирует со снижением титра инфекционной активности. На электронограммах вирусов, завороженных со скоростью 2° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот,.наблюдали как полное разрушение вирусных частиц, так и нарушения целостности их липопротеидной оболочки, повреждения капсидов. В результате повреждения оболочки и капсида из некоторых вирионов произошел, по-видимому, выход нуклеоида. Изучение ультраструктуры вируса, криоконсервированного' по программе, предусматривающей охлаждение со скоростью 30-40° в минуту до -28°С, со стабилизацией при этой температуре в течение 15 минут и последующее погружение в жидкий азот, показало, что вирусные частицы имеют повреждения липопротеидной оболочки.

Что касается вирусных част1!Ц с вшгедшм в результате повреждения липопротеидной оболочки и белкового капсида нуклеоидом, известно, что они не обладают иифекционностыо / А.К. Щубладзе, Т*М. Маевская» 1971 /. Роль оболочки в биологии вирусов, в том числе группы герпеса, остается до конца невыясненной. Важным механизмом адсорбции вируса является взаимодействие его рецепторов с комплементарными рецепторами клетки. По мнению В.Д. Соловьева и И.Г. Баландина /1973/ естественно ожидать, что разрушение рецепторов вируса приведёт к нарушению или прекращению адсорбции. Как сообщают На А.я«// В, Ц' /1989/, в проникновении вирусов

в клетку принимают участие лишь те вирусные частицы, которые имеют хорошо сохраненную оболочку в период адсорбции, в то время -как вирусные нуклеиновые кислсиы, нуклеспротеиды, вирионы с частично поврежденными оболочками не играют большой роли в инфекционном процессе.

Таким образом, очевидно, что разрушение оболочки вируса или её части в процессе криоконсервирования влечёт за собой нарушение процессов адсорбции и проникновения вируса в клетку, что в свою очередь приводит в последующем к снижению его инфекционного титра. Результаты проведенных исследований показывают, что снижение инфекционной активности вируса ИРГ-ИПВ после его криоконсервирования по неоптимальным программам происходит за счет разрушения вирусных частиц,- повреждения • кйпоида иди оболочки вирпонов.

При изучении биосинтеза белка и ДНК в системе "вирус-клетка" установлено, что инфицирование клеток натнвным или криоконсерви-рованнкм вирусом не приводит к значимым различиям в интенсивности синтеза ДНК и белка в период со 2-го до 18-го часа от начала инфицирования / рис. 1,2 /.

Значимые различия в уровне синтеза ДНК и белка наблюдаются к 24 часу с момента инфицирования клеток. При этом отмечается высокий уровень синтеза белка и ДНК в неинфицированной клеточной культуре. Это показатель естественного состояния клеточной популяции. По сравнен™ с неинфицированной клеточной культурой, к этому времени в клетках, инфицированных нативным рирусом, наблюдается значительное ентаение интенсивности синтеза ДНК и белка. При этом, цитопатическое действие вируса отмечается у 7555 кдеточного ыонослоя. Мы установили, что в результате выхода значительного количества вирионов из клеток к этому времени, о чём свидетельствуют проведенные электронно-микроскопические исследования процесса внутриклеточной репродукции вируса на данном бтапе, уровень биосин-

мш«| ^wrtij« Я1Ш > ити п"Чм ■ 41 utri ' I

mUTFUBfft КГГЛЮТО ют:ЯМ «WTA

«HTR.4 1КЛИ1 1 umtllM UEUI IK.MI 'crt r.t j*pt o« |х««!юннсго mrnniHi »rinon: |тг«тгп> :кгт* ' u-r'

Условные обозначения: -натишше неинфицированные клетки

----клетки, инфицированные криоконсервировапным вирусом

щ ь 11.1.. клетки, инфицированные нативпым ' вирусом

I - программа, предусматривающая криоконссрвирование вируса со скоростью 0,4° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот

II - программа, предусматршагэщая криоконсервиротанпо вируса со

скоростью 2° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот.

III - программа, предусматривающая криоконсзрвирование вируса со скоростью 30-40° в мин. до -28°С, с экспозицией при -той температуре в течение К мин. и последующим погружением в жидкий азот.

- 18 -

теза ДНК и белка резко снижается и выходит на плато. Интенсивность синтеза ДНК и белка в клеточной культура, инфицированной криоконсервированщм по оптимальной программе вирусом, к 24 часу от момента инфицирования ещё достаточно высок. В данном случае наблюдается запаздывание процесса репродукции криоконсервированнбго вируса по сравнению с натившш. При этом, цитопатическое действие • вируса отмечается у о (К клеточного монослоя. Ещё более значительное запаздывание - репродукция вируса, криоконсервировашого по программе, предусматривающей охлаждение.со скоростью 30-40° в минуту до -28°С, вкспозицию при этой температуре в течете 15 минут и последуя»^е погружение в жидкий азот. В атом случае цитопатичесаие изменения, вызванные вирусом а клеточной культуре, отмечаются в 25-30?» клеточного монослоя. Самое значительное запаздывание репродукции выявлено в клетках, -инфицированных вирусом, криоконсерви-рованным по программе, когда вирусные частицы замораживали со скоростью 2° в минуту до -70°С с последующим погружением в жидкий азот. При этом цитопатичеате изменения в клеточной культуре отмечали только у 10-1556 монослоя клеток. Факт запаздывания процесса репродукции криоконсервированного по самой неоптиыальной программе вируса подтверждается результатами электронно-микроскопических исследований, которые показали изменения субмйкроскопической организации клеток, характерные для ранней стадии вирусной инфекции. В частности, нами выявлено, что в данный период времени наблюдается формирование множества нуклеокапсидов вирусных частиц в зоне виропластов клеточного ядра, в то время,как в клетках, инфициро- ' ванных нативным вирусом, в основном закончился процесс формирования нуклеокапсидов в зоне виропластов, а сформировавшиеся вирусные частицы находятся в цитоплазме клетки или выходят с' поверхности цитоплазыатической мембраны.

Анализируя результаты изучения биосинтетичесиих процессов в

- 19 -

системах "нативннй вирус-клетка", "криоконсервированный вирус-клетка", можно прийти к выводу о том, что повреждения вирусных частиц происходят даже в случае применения оптимального режима криоконсервирования вируса, Однако, эти повреждения не столь значительны, как в.случае криоконсервирования вируса с использованием неоптимальных режимов замораживания и не внзызают сштения инфекционного титра.

При исследовании чувствительности вируса к действию физико-химических факторов, сопровождающих процесс низкотемпературного консервирования, оказалось, что он нечувствителен к изолированному воздействию таких '"(акторов, как температуршй, гипо- и гипертонический кок. Заметное влияние на титр инфекционной активности вируса оказывают гиперконцентрации / 3-4 М / хлорида натрия и изменение рН среды замораживания в кислую сторону. Так, после экспозиции вируса в растворах 3-4 И хлорида натрия по истечении 20 минут в условиях нормогермии, инфекционная активность его снижалась на I <у , а при икспозиции вируса в среде с рН 3,5 в течение 30 и 60 минут выявлено достоверное снижение титра в пределах I-1,17 .

Очевидно, что отрицательное влияние рассмотренных физико-химических факторов на инфекционную активность вируса проявляется при их комплексном воздействии в процессе криоконсервирования вирусных суспензий по неоптималышм программам. Среди комплекса физико-химических факторов, сопровождающих процесс криоконсервирования вируса', существенное значение в возникновении криоповреждешй, по-видимому, принадлежит гиперконцентрации хлорида натрия и снижению рН среды коне ервировашя.

Одной из актуальных проблем медицины и ветеринарии является сохранение вируссодергащего диагностического материала. Поскольку после взятия проб большинство вирусов быстро инактивируются в крови,

- 20 -

спинномозговой жидкости, моче, соскобах и смывах носоглотки, успех их выделения в основном зависит от быстроты исследований /А.Ф. Ка-, рышева, В.Н. Сюрин,- 1980; М.О. Биргер и соавт., 1982 /. Поскольку, возможность провести исследования взятого материала в ближайшие часы не всегда имеется, нами были проведены исследования по изуче- ; нию возможности криоконсервирования вируса в чувствительной клеточ- ■ ной культура на'разных ¡этапах его репродукции . Нами установлено, что криоконсервированная по истечении 2-х часов контакта с вирусом клеточная культура, после размораживания при последующем культивировании образует монослой спустя 24 часа. При этом наблюдается характерное для вируса ЖТ-Ш1В цитопаигческое действие на клеточ- > ную ьультуру. Инфицированная вирусом клеточная культура, подвергавшаяся криоконсервированию соответственно спустя 6 и 24 часа от начала контакта с вирусом, после размораживания не формировала монослоя клеток. Отмечались лишь отдельные участки клеточного роста, остальные клетки находились в культуральной жидкости.

Оценивая инфекционную активность вируса, криоконсервированного в клеточной культуре спустя 2, б и 24 часа от начала инфицирования клеток, следует отметить её снижение в пределах 0,8-1,0/^' по сравнению с контролем.

В случае увеличения посевной концентрации клеток от 8,25 х

с с

10 клеток в I мл до 2,0 х 10 клеток в I мл и инфицирующей дозы вируса, криоконсервированная по истечении 2-х и 18 часов контакта с вирусом, клеточная культура после размораживают при последующем её культивировании формировала сплошной монослой. При этом отмечали характерное для вируса ИРГ-ИПВ цитопаткческое действие на клеточную культуру. Следует также обратить внимание на тот факт, что инфекционная активноель вируса после его криоконсервирования в клеточной культуре по истечении 18 и 24 часов контакта с клетками, сохраняется на одинаковом с контролем уровне. В то же время, инфекционная

- 21 -

активность вируса, криоконсервирсванного спустя 2 часа контакта с ■ клетками, снижается на I.

Следовательно, в случае невозможности проведения исследований вируссодержащего диагностического материала в ближайшее время после взятия его проб, ми рекомендуем инфицирование исследуемым диагностическим материалом чувствительной клеточной культуры с последующим её крноконсервированием. При этом, продолжительность хранения вируса до 6 месяцев /врем наблюдения/ не влияет на его инфекционную активность и на характер цитопатического действия на клетки. Кроме того, мокно использовать инфицированные вирусом культуры клеток по истечении 2-х, 18 и 24 часов с момента их заражения для последующего криоконсервирования при производстве противовирусных препаратов.

В Ц В О Д Я.

1.Криоустойчивость вируса ИРТ-ИПВ зависит от.его исходного состояния. Неочищенные вируссодерпащие суспензии более стабильны, чем вирус, подвергнутый частичной очистке.

2. Степень сохранения ультраструктурной организации и инфекционной активности вируса, состояние биосинтетических . процессов в системе "вирус-клетка" зависит от применявшихся режимов его замораживания. На основании этого разработан оптимальный режим криоконсервирования вируса, обеспечивающий сохранение его инфекционной активности на исходном уровне. Это двухагапный режим, предусматривающий охлаждение до -70°С со скоростью 0,2-0,8° в минуту с последующим погружением в жидкий азот. / Автор, свид. КГ655984 /

3. Выявлено, что при криоконсервирования вируса по неоптимальным программам, происходят такие изменения его ультраструктуры,как нарушение целостности лилопротеидной оболочки и капсида, а также полное разрушение вирусных частиц.

4. На основании изучения динамики циголатичесяих изменении в

- 22 -

инфицированных клетках, их субмикроскопической организации, био-синтатических процессов в система "вирус-ллетва", установлено, что после криоконсервирования вируса происходит запаздывание его . репродукции по сравнению с нативным. При втоы, запаздывание репродукции криоконсервировашюго по оптимальной программе вируса не сопровождается снижением уровня его инфекционной активности.

5. При изучении влияния основных физико-химических-факторов, сопровождающих низкотемпературное консервирование, на инфекционную активность вируса показано, что вирус ИРГ-Ж1В устойчив к изолированному действию температурного, гипо- и гипертонического шока. Заметное влияние на титр инфекционной активности оказывают гиперконцен-

• грации /3-4 М / хлорида натрия и изменение рН среды консервирования в кислую сторону / рН = 3,5 /.

6. Разработан гффектившй способ криоконсервирования вируса в , чувствительной клеточной культуре на разных этапах его внутриклеточного развития - спустя 2; 18 и 24 часа от момента инфицирования клеток. Это двухвташюе охлаждение под защитой 10% димексида.

ВШДРЕНйЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОЕШЙ В ПРАКТИКУ.

I. Разработашшй способ криоконсервирования вируса ИРГ-ИПВ, вируссодержащего диагностического материала.используется в лаборатории вирусологии Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины /Справка подписана зам. директора по научной работе, доктором ветеринарных наук, членом-корреспондентом УААН П.П. Фукс 27.01.1993 года /.

2. Разработанные методические подходы по низкотемпературному консервированию вируса и вируссодеркащего материала используются на Харьковском предприятии по производству иммунобиологических и ле-карственшх препаратов / Справка подписана директором предприятия Ю.П. Теиировим, за!,и д1гректора по научной работе, доктором фарда-

- 23 -

цевтичзских паук Ю.М. Краснополышм и начальником вакцинного' цеха, кандидатом медицинских наук F.M. Сараевой 4.02.1993 года /.

3. Материалы научное исследований по низкотемпературному консервирование вирусов и вирус содержащего материала используются в . Харьковском медицинском институте.при чтении лекций студентам по курсу "Микробиология, вирусология и иммунологии" / Справка подписана проректором'по научной работе ХМЛ, академиком Н.Г. Сергиенхо и зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и ишунологии, профессором А.Я. Дыганенко I7.02.IS93 года /.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЯШОВШЮ ПО ТЕМЕ 'ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние криокопсервиронания на сохранность вирусных частиц.-

В сб.: "Теоретические и практические аспекты современной криобиологии". - Киев, "Каукова думка", 1989, с. 33-36.

2. Изучение условий хранения вируса ИРГ при низких температурах.-Тез. докл. конф. "Проблемы научного обеспечения животноводства в Молдавии",- Кишинёв, 1990, с.89-90 / Соавг.: A.A. Цуцаева /.

3. Сравнительное изучение условий хранения вирусов при гипотермии и умеренно низких температурах.- Тез. докл. Респ. конф. "Ветеринарная медицина: »кономические, социальные и зкологические проблемы".-Харьков, 1990, с. 50 / Соавг.: A.A. Цуцаева /.

4. Сравнительное изучение условий хранения вирусов при гипотермии и умеренно низких температурах лршленительно к решению задач производства экологически безопасных биопрепаратов. - /Там же, с.'264-265 / Соавт.: A.A. Цуцаева /.

5. Свойства вируса, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота после кри'оконсервирования.- Б сб.:"Вирусы и вирусные заболевания". Киев,."Здоров.я"» 1990 > в™. 18, с.75-76 / соавт.: A.A. Цуцаева, Т.Ф. Петренко, В.И. Орлов /.

6. А. С. СССР Ii? 1505020. Способ стимуляции репродукции вируса пара-

- 24 - '

гриппа / Соавт,: A.A. Дудаева, Т.Ф. Петренко, В.Г, Попов /.

7, А. о, СССР 11? 1655984. Способ консервирования вируса инфекционного ринограхаита / Соавт.: A.A. Цудаева, Т.Ф. Петренко /.

8. Холодовой стресс и биологические системы. - Под ред. A.A. Цуцае-вой. Киев, "Наукова думка", 1991, с. 7-29. / Соавт.: A.A. Цуцаева, D.E. МикулинскиЙ, И.П. Высеканцев и др. /,

9, Влияние криоконсервирования на внутриклеточную репродукцию вируса. - В сб.: Холодовой анабиоз,- Киев, "Науксва думка", 1991, с. 8-И.

10. Влияние криоконсервирования на сохранность и биологические свойства вируса,- Тез, докл. II-й Международной конф. "Успехи современной криобиологии",- Харьков, 1992, с. 168.

jj^ Problems of oryopreaarvetion of DNA and Rl-ii-coatairxing viruses. - International symposium "Virology1, imaunology and society., Kiev,1991, p.323-343-/ In coop. with"A.A. Tsytsaeva, t.P.ietren-ko /.