Особенности ионного обмена в клетках при циклоспорин-зависимой гипертонии

Афанасьева, Галина Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности ионного обмена в клетках при циклоспорин-зависимой гипертонии
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности ионного обмена в клетках при циклоспорин-зависимой гипертонии"

На правах рукописи^

АФАНАСЬЕВА ГАЛИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ОСОБЕННОСТИ ИОННОГО ОБМЕНА В КЛЕТКАХ ПРИ ЦИКЛОСПОРИН-ЗАВИСИМОЙ ГИПЕРТОНИИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории артериальной гипертензии института клинической кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научные руководители: доктор биологических наук

П.В.Авдонин

кандидат медицинских наук А.Ю.Постнов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

М.Ю.Меньшиков

кандидат биологических наук А.Я.Котц

Ведущая организация: Институт общей патологии

Академии медицинских наук РФ

Защита состоится 29 ноября 2000 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета К 074.22.02 в РКНПК МЗ РФ (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д. 15А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан 29 октября 2000 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета __

к-б.н. T~J Т.И.Венгерова

f уо.оьо'}

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Циклоспорин A (CsA) является одним из препаратов, предотвращающих отторжение органов при их трансплантации, и широко используется при послеоперационной терапии, а также при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний. Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что воздействие циклоспорина А на организм не ограничивается блокированием иммунного ответа, и сопровождается развитием таких серьезных побочных эффектов, как гипертония и нефротоксичность [Whiting et al„ 1981]. В качестве причин циклоспорин-зависимой гипертонии на разных этапах ее развития рассматривают нарушение функции почки [Luke, 1993], активацию симпатической нервной системы [Sander et al., 1996] и усиление сократимости сосудов [Banijamali et al., 1993; Bossaller et al., 1989; Curtis et al., 1986; Luke, 1993]. При этом основной причиной считается усиление вазоконстрикции, поскольку патологические изменения в почке возникают только при длительном приеме циклоспорина А и, главным образом, из-за сужения кровеносных сосудов почек.

Повышенную вазоконстрикцию объясняют способностью циклоспорина А усиливать рецепторзависимый подъем [Са24]цит в глздкомышечных клетках [Lo Russo et al., 1996] и ингибировать эндотелийзависимое расслзбление сосудов [Diederich et al., 1994]. Однако конкретные механизмы действия циклоспорина А на регуляцию [Са24]цит остаются предметом дискуссии. Не ясно, какие белки опосредуют эффект CsA. Кроме того, описанные в литературе данные по влиянию CsA на рецептозависимую регуляцию [Са2*]цит получены на клетках экспериментальных животных и предположение об аналогичном механизме воздействия CsA на клетки человека нуждается в экспериментальном подтверждении.

В литературе также очень мало данных о влиянии CsA на транспорт одновалентных катионов, в частности натрия, хотя известно, что нарушения работы систем, осуществляющих обмен натрия, играет значительную роль в патогенезе артериальных гипертензий различной этиологии.

В связи с этим актуальной задачей является выяснение конкретных механизмов воздействия циклоспорина А на клетки, приводящих к изменению параметров ионного обмена.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследовать биохимические механизмы, участвующие в поддержании высокого артериального давления при циклоспорин-зависимой гипертонии.

В работе были поставлены следующие задачи: 1.Определить, оказывает ли циклоспорин А действие на рецепторзависимый обмен кальция в гладкомышечных клетках аорты человека и оценить его влияние на рецепторы вазоконстрикгорных гормонов.

2.Выяснить, оказывает ли циклоспорин А действие на транспорт одновалентных катионов.

3. Используя параметры ионного обмена в качестве сравнительных характеристик, выявить возможные черты сходства и различия циклоспорин-зависимой и спонтанной гипертензии. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что циклоспорин А вызывает увеличение прироста [Са 2+]ц,т в ответ на ангиотензин II (АН) в гладкомышечных клетках аорты человека.

Установлено, что в основе данного эффекта циклоспорина А лежит увеличение плотности рецепторов ангиотензина II в ГМК без изменения их сродства к агонисту. Увеличение плотности рецепторов All под действием CsA ингибируется актиномицином D и может быть связано с их синтезом de novo.

В отличие от действия на иммунный ответ, влияние циклоспорина А на рецепторзависимый обмен кальция в гладкомышечных клетках не опосредуется циклофилинами. Впервые показано участие в этом процессе нерецепторных тирозиновых киназ семейства src и белков МАР-киназного каскада.

Действие циклоспорина А на рецепторзависимый обмен кальция не ограничивается только гладкомышечными клетками. После введения крысам циклоспорина А в тромбоцитах происходило изменение регуляции [Са 2*]um, аналогичное наблюдаемому в гладкомышечных клетках.

Воздействие циклоспорина А вызывает также нарушения работы систем, осуществляющих обмен натрия, в частности, увеличение скорости Ыа*/Н*-обмена в эритроцитах.

Изменения в характере обмена ионов кальция и натрия при циклоспорин-зависимой гипертонии аналогичны наблюдаемым при спонтанной гипертензии, которая отличается наиболее глубокими перестройками работы этих систем. При обеих формах гипертонии

практически в одинаковой степени увеличен подъем [Са 2*]чиг в ответ на тромбин в тромбоцитах и скорость Ыа*/ЬГ-обмена в эритроцитах.

В тоже время, несмотря на одинаковые изменения в характере обмена ионов кальция, при циклоспорин-зависимой гипертонии не наблюдается активации Са2*-зависимых К*-каналов. Повышение активности Са2*-зависимых К*-каналов наблюдается только при спонтанной гипертензии и, по-видимому, связано с происходящими при этом заболевании структурными изменениями цитоскелета клеток. Изменение активности Са2*-зависимых Ю-каналов при спонтанной гипертензии значимо коррелирует с изменением содержания белка в полосах спектрина и анкирина - основных белков, формирующих цитоскелет и определяющих его прикрепление к мембране, и с содержанием белка в полосе 4.9, связанного с актиновыми филаментами.

Результаты данной работы вносят вклад в развитие представлений о механизмах действия циклоспорина А на рецепторзависимый обмен кальция в клетках, а также указывают на возможность использования блокаторов ангиотензинового рецептора и кальциевых антагонистов для устранения побочных эффектов препарата.

Апробация работы. Результаты работы были преставлены на Международном симпозиуме "Артериальные гипертензии: патогенез, патогенетическая терапия, поражение органов" (Москва, 15-17 декабря 1997 г.), на Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино 21-25 сентября 1998 г.), на 10-й Международной конференции по изучению гипертонии (Гетеборг, 29 мая -3 июня 2000 г.)

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 247 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выделение и культивирование гладкомышечных клеток сосудов человека и крысы. Выделение гладкомышечных клеток (ГМК) аорты человека проводили по методу Орехова и соавт. [1983] из аутопсийного материала, полученного не позднее б часов после внезапной

смерти. Участок грудного отдела аорты освобождали от соединительной ткани, механически отделяли интиму и адвентицию, измельчали и инкубировали в течение 3 часов при 37°С в среде ДМЕМ, содержащей 0,2% коллагеназу, 0,05% эластазу и 1 % термоинактивированной сыворотки крови человека. Полученные клетки осаждали при 400 д 10 минут и высаживали с плотностью 3-5x104 клеток/см2 на чашки Петри, покрытые 0,2% желатином. Выделение ГМК из грудного отдела аорты крысы проводили по аналогичной методике, но в среду инкубации не добавляли термоинактивированную сыворотку. Культивирование ГМК человека проводили в среде ДМЕМ, содержащей 20 мМ НЕРЕБ, 1 мМ пируват натрия, 50 ед/мл пенициллин, 50 мг/мл стрептомицин, 2 мМ 1_-глутамин, 350 мг/л ЫаНС03, 20% инактивированной сыворотки крови человека в инкубаторе при 37°С и 5% С02. Культивирование ГМК крысы проводили в аналогичных условиях, но среда роста содержала вместо человеческой 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В экспериментах использовали клетки 7-11 пассажей. Идентификацию ГМК в культуре проводили при помощи окрашивания на специфический для гладкомышечных клеток актин. Чистота популяции ГМК в используемых для эксперимента пассажах составляла не менее 75%. Предобработка гладкомышечных клеток циклоспорином А. Для выявления эффектов СзА к клеткам после достижения ими конфлюэнтного состояния добавляли на 24 часа среду ДМЕМ без сыворотки, содержащую различные концентрации циклоспорина А. В контрольные образцы был добавлен равный объем этилового спирта, в котором растворяли СгА.

Выделение тромбоцитов проводилось по методу Авдонина и соавт. [1985]. Кровь смешивали в соотношении 6:1 с антикоагулянтом, содержавшим 85 мМ цитрата натрия, 66.6 мМ лимонной кислоты и 100 мМ О-глюкозы и центрифугировали при 190 д 15 минут. Из верхнего слоя, содержащего обогащенную тромбоцитами плазму, отбирали 2/3 объема и проводили осаждение при 650д в течение 10 минут. Осадок суспендировали в буфере 1 с рН 6,55, содержавшем дополнительно 0.1 мг/мл апиразы, 0.35% БСА, 50 и/мл гепарин (состав буфера 1 - 150 мМ №С1, 2.7 мМ КС1, 0.37 мМ МаН2Р04, 1 мМ МдС12,1 мМ СаС12, 5 мМ Э-глюкоза, 10 мМ НЕРЕЭ).

Выделение эритроцитов проводили по методу Локудина и соавт. [1989]. Гепаринизированную кровь центрифугировали при 2000 д 10 минут при 4°С, отбирали плазму и белые клетки, а эритроциты отмывали в буфере 3, содержавшем 75 мМ N801, 75

мМ KCI, 1 мМ MgCI2, 5 мМ D-глюкозы, 5 мМ NaH2P04/Na2HP04 рН 7,4, а затем дважды в буфере 4, содержавшем 150 мМ NaCI, 1 мМ KCI, 1 мМ MgCI2, 10 мМ D-глюкозы при +4°С. Осадок упакованных эритроцитов использовали для измерения мембранного потенциала и скорости Ма*/Н*-обмена.

Измерение концентрации внутриклеточного кальция проводили с помощью флуоресцентного зонда Fura-2. Для загрузки флуоресцентным зондом отмытые тромбоциты инкубировали в буфере 1, содержащем 5 мкМ Fura-2 АМ при 37°С 30 минут, затем осаждали и суспендировали в буфере 1 с рН 7.4. Определения концентрации внутриклеточного кальция проводили в том же буфере при рН 7.4.

Гладкомышечные клетки выращивали на покровных стеклах, предварительно покрытых 0,2% желатином. После преинкубации клеток с CsA или в контрольных условиях их инкубировали в ДМЕМ, содержащей 5 мкМ Fura-2 АМ в течение 50 минут при 37°С. Среда измерения содержала 150 мМ NaCI, 5 мМ KCI, 1 мМ MgCI2, 1.8 мМ CaCI2, 10 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES, рН 7.4. Все измерения проводили на двулучевом спекгрофлуориметре Shimadzu ( длина волн возбуждения - 340 нм и 380 нм, длина волн излучения Д.ет - 510 нм)

Определение скорости выхода 45Са2' из культивируемых гладкомышечных клеток проводилось по методу Lo Russo и соавт [1996]. (Слетки, выращенные на 24-х луночных плашках, дважды промывали физиологическим солевым раствором (ФСР), содержавшим 0,12мМ CaCI2 (состав ФСР 145 мМ NaCI, 1 мМ KCI, 1 мМ MgCI2, 10 мМ D-глюкозы, 5 мМ HEPES рН 7.4) и инкубировали в том же буфере, содержавшем 1 мкКи 45Са2+ на ячейку, в течение 15 минут при 37°С. Затем клетки 4 раза промывали охлажденным ФСР/1.2 мМ CaCI2. Выход из клеток 45Са2* инициировали добавлением прогретого до 37°С буфера ФСР/1.2 мМ CaCI2. На 3, 6 и 9 минуте супернатант переносили в сцинцилляционные флаконы и немедленно добавляли 0,5 мл свежего буфера ФСР/1.2 мМ CaCI2. Агонисты добавляли на 9 минуте, после чего на 11 минуте отбирали супернатант. Для определения содержания оставшегося меченого кальция в клетках их лизировали, добавляя в ячейку 50 мкл 0.25% раствора трипсина, содержавшего 1% EDTA, а затем 250 мкл 1% раствора SDS. Клеточный лизат также переносили во флаконы для сцинцилляционного счета. Выход 45Са2* в ответ на агонисты определяли в процентах по отношению к общему количеству 45Са2* ,

загруженного в клетки. Радиоактивность супернатанта и клеточного лизата определяли жидкостно-сцинцилляционным методом на счетчике Packard Tri Carb 4640. Связывание меченного 125I-AII. Клетки, культивируемые в 24-луночной плашке, дважды промывали ФСР/1.2 мМ CaCI2 при 20°С, затем добавляли ФСР/1.2 мМ CaCI2, содержавший различные концентрации немеченного All и меченный 1251-АМ, и инкубировали 20 минут при 20°С. Затем клетки 4 раза быстро промывали ледяным ФСР/1.2 мМ CaCI2, и добавляли по 200 мкл 1 М NaOH для разрушения клеток. Радиоактивность клеточного лизата определяли на счетчике Gamma Master, Pharmacia. Измерение мембранного потенциала

Измерение мембранного потенциала отмытых от плазмы тромбоцитов проводилось с помощью флуоресцентного потенциалчувствительного зонда dis-C3-(5) (1 мкМ) в среде, содержавшей 150 мМ NaCI, 2.7 мМ KCl, 1 мМ MgCI2, 1 мМ CaCI2, 5 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES pH 7.4 (Хе1< - 650 нм, Лет - 675 нм). Агонисты, кальциевый ионофор и другие эффекторы добавлялись после полного встраивания dis-C3-(5) в мембрану и достижения стабильного уровня флуоресценции. Величина мембранного потенциала определялась путем калибровки с калиевым ионофором валиномицином возрастающими концентрациями 1С* в среде. При измерении активности Са^-зависимых tC-каналов NaCI в среде измерения был заменен на хлорид М-метил-О-глутамина.

Кинетику изменения мембранного потенциала в эритроцитах регистрировали рН-метрически по методу Баскакова и соавт. [1989], где показано, что после добавления протонофора распределение протонов в эритроцитах отражает изменение мембранного потенциала. В качестве среды измерения использовали буфер 4. После установления постоянного значения pH, в среду добавляли 20 мкМ протонофора карбонил цианид м-хлорфенилгидразона и 25 мкМ CaCI2. Гиперполяризацию мембраны эритроцитов, по которой судили об активности Са-зависимых K-каналов, инициировали добавлением 0,5 мкМ кальциевого ионофора А23187. Расчет проводили по формуле: EM=RT/F(pH2-pH1), где рН(-рН до добавления А23187, рН2 - pH в точке максимальной гиперполяризации. Определение скорости NaVhT-обмена. Скорость NaVl-Г-обмена в эритроцитах определяли по методу Орлова и соавт. [1989] по начальной скорости ингибируемого амилоридом выхода протонов из эритроцитов в условиях блокирования анионного обменника. В качестве среды измерения использовали буфер 4. После установления постоянного значения pH, в среду

добавляли блокатор анионного транспорта DIDS до концентрации 250 мкМ и доводили рН соляной кислотой до 6.2. Затем среду быстро эащелачивали до рН 7.8 добавлением NaOH и регистрировали начальную скорость закисления. Измерение повторяли в присутствии 250 мкМ амилорида. Скорость №7Н*-обмена вычисляли как разность скоростей закисления среды в отсутствие и в присутствии амилорида.

Экспериментальная модель циклоспорин-зависимой гипертонии. Для проведения эксперимента были взяты две группы крыс линии WKY в возрасте 11-12 недель. Животные группы №1 получали по 0.5 мл. оливкового масла в день. Животные группы №2 получали циклоспорин А, растворенный в 0.5 мл оливкового масла из рассчета 20 мг/кг в день 7 дней. Регистрация давления производилась на приборе "Мингограф" (Simpson, Япония) по появлению пульсации на хвостовой артерии крысы. О нефротоксических эффектах циклоспорина А судили по морфологическим изменениям, выявляемым при исследовании тонких срезов, окрашенных гематоксилином и эозином.

Получение F? гибридов крыс (SHRxWKY). Для скрещивания были взяты крысы линии со спонтанной гипертензией (SHR) с АД 170-190 mm Hg и нормотензивного контроля (WKY) с АД 110-130 mm Hg. Скрещивание проводилось по схеме (самец WKY х самка SHR). Две особи первого поколения (брат-сестра) определялись как родительская пара поколения F2. Потомство этих пар составило изучаемую популяцию F2.

Анализ спектра структурных белков мембраны эритроцитов. Эритроциты выделяли из 5 мл гепаринизированной крови (10 ед/мл гепарина) по методу Beutler с соавт. [1976]. Кровь центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут при 4°С, отбирали плазму и белые клетки, после чего эритроциты трижды отмывали в 5-кратном объеме буфера А (150 мМ NaCI, 5 мМ NaH2P04/Na2HP04 рН 8,0). Клетки разрушали осмотическим шоком в 20-кратном объеме буфера Б (10 мМ NaHjPCV^HPOj рН 8,0 и 1мМ PMSF). Мембраны осаждали при 30 000 g в течение 15 минут при +4°С, трижды промывали буфером Б и лиофилизировали. Электрофорез проводили по методу Laemmli [1970] с линейным градиентом концентрации акриламида 5-25%. Белки окрашивали Кумасси голубым R-250. Денситометрирование электрофореграмм проводили на денситометре Ultrascan XL при 570 нм. Статистическая обработка результатов. Данные по каждому разделу были получены в нескольких независимых экспериментах. Математическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ Excel 5.0 и Statistica. Результат выражали

как среднее значение + стандартная ошибка среднего. Достоверность различия между средними определялась по непарному t-критерию Стьюдента. Парные (г), множественные (R) и частные (г') коэффициенты корреляции вычислялись с помощью программы Multiple Regression в пакете программ Statistica.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. CsA увеличивает выход ,|5Са2> и подъем цитоплазматического кальция в ответ на ангиотензин И в культивируемых ГМК аорты человека. Исследования на экспериментальных животных показали, что одной из причин развития циклоспорин-зависимой гипертонии является способность циклоспорина А влиять на обмен [Са2+]цит в гладкомышечных клетках и усиливать за счет этого сократимость сосудов [Bossaller et al., 1989; Oriji, Keiser, 1998]. Однако конкретные механизмы действия циклоспорина А на регуляцию [Са2*]ц„т остаются предметом дискуссии. В ряде работ показано, что циклоспорин А может увеличивать ёмкость внутриклеточных кальциевых депо в гладкомышечных клетках крысы [Pfeilschifter, 1987; Rego et al., 1990; Meyer-Lehnert et al., 1997], однако поданным Lo Russo с соавт. [1997] циклоспорин А не влиял на емкость внутриклеточных кальциевых депо, но усиливал чувствительность гладкомышечных клеток к вазокостриеторным гормонам. Мы также получили культуру гладкомышечных клеток аорты крыс линии WKV и показали усиление кальциевого ответа на эндотелин-1 и аргинин-вазопрессин после преинкубации клеток с циклоспорином А (данные не приводятся). На базальный выход кальция циклоспорин А влияния не оказывал.

Эти результаты подтвеждапи точку зрения Lo Russo с соавт. [1996, 1997], однако оставалось не ясным, реализуется ли тот же механизм действия циклоспорина А в гладкомышечных клетках человека. В наших экспериментах преинкубация ГМК человека в течении 24 часов с 10~5М CsA приводила к значительному увеличению прироста [Са2*]цит на ангиотензин II, регистрируемого по флуоресценции капьцийчувствительного зонда Fura-2 (рис. 1а). При этом базальная концентрация кальция практически не изменялась. Аналогичные результаты были получены в экспериментах, где о содержании цитоплазматического кальция судили по выходу меченого 45Са2* в ответ на АН. Достоверное

100 150 200

Время (сек)

s =r го ш s

£ TO

л z

Q) С 0) н О

3.0" 2.52.01.5" 1.00.5 0

СЛ

а О

<Л

О S

< <

V) Ю

О О

s 5

А а.

т— со

v * i

i о

Рис. 1. а) Влияние циклоспорина А (10_5М) на подъем цитоплазматического кальция в ответ на 10 7М АН в ГМК аорты человека.

б) Влияние возрастающих концентраций циклоспорина А на выход 45Са2+ в ответ на 10 7М All в ГМК аорты человека. За единицу принята величина выхода кальция в клетках, не обработанных CsA.

Время преинкубации с CsA - 24 часа. * - р<0.05, ** - р<0.01 по сравнению с контролем.

увеличение чувствительности гладкомышечных клеток к ангиотензину II наблюдалось уже при концентрации CsA 107М (рис.1б). Выход кальция в ответ на тапсигаргин в клетках человека, обработанных CsA, не отличался от контроля. Кроме того, циклоспорин А не изменял общее количество 45Са2\ аккумулируемого клетками. Из полученных данных можно сделать вывод, что в ГМК человека механизм действия CsA подобен наблюдаемому в ГМК крысы, и CsA не влияет на содержание кальция во внутриклеточных кальциевых депо, усиливая чувствительность ГМК человека к вазоконстрикгорным гормонам.

Усиление кальциевого ответа в ГМК аорты человека сопровождается увеличением плотности рецепторов ангиотензина II. На следующем этапе нашей работы мы попытались выяснить причины усиления кальциевого ответа в исследуемых ГМК. Согласно литературным данным циклоспорин А может оказывать влияние на уровень экспрессии ряда белков, в том числе рецепторов вазоконстрикторных гормонов [lwa¡ et al., 1993; Lo Russo et al., 1996; Tufro-McReddie et al., 1993]. Мы исследовали влияние циклоспорина А на плотность рецепторов ангиотензина II, изучая изменение параметров связывания меченого [1251]АИ с культивируемыми гладкомышечными клетками аорты человека. После преинкубации с циклоспорином А связывание [1251]АН с клетками увеличивалось на 76+25%. Представление данных в координатах Скетчарда показывает, что при этом происходит увеличение количества связавшегося лиганда без изменения его сродства к рецептору (рис. 2). В,пШ увеличивалось от 11.9 fmol/mg белка в контроле до 21.1 fmol/mg белка после преинкубации с CsA. При этом KD достоверно не изменялась (1.4+0.2 пМ в контроле и 1.5+0.1 пМ после преинкубации с CsA.).

Результаты, полученные в экспериментах по связыванию меченого [1251]А11 не дают ответа на вопрос, влияет ли циклоспорин А на синтез рецепторов. Поэтому мы проверили, сохраняется ли эффект циклоспорина А в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина D (Act D). После преинкубации ГМК вместе с Ю^М актиномицина D и CsA в клетках не наблюдалось усиления кальциевого ответа на ангиотезин II и увеличения связывания [,251]А11 (рис.3). При этом аетиномицин D практически не влиял на выход кальция в ответ на ангиотензин II в контрольных пробах. Эти результаты позволяют предположить, что CsA увеличивает количество рецепторов ангиотензина II либо стимулируя синтез мРНК, либо влияя на ее стабильность. Результаты, полученные в экспериментах in vivo другими

I 15

§ 10-1

3 с

1 5

х га о к

5 °

р ст

• СвА

10 15 20 фмоль/мг

Рис.2. Данные по связыванию [1251]А II в координатах Скетчарда.

Н <

■

¡о" .

2 5

1 5 « £

т I

2 ■& о

к т О

1.6

1.2

0.8

0.4

ОТ

о <

(Л

о <

Рис.3. Устранение аетиномицином Б влияния циклоспорина А на связывание [1251]Апд II в ГМК аорты человека. Клетки преинкубировали в течение 24 часов в присутствии 10"6М СвА и Ю^М актиномицина О. " - р<0.01 по сравнению с контролем (СТ).

авторами, подтверждают полученные нами данные. Введение крысам циклоспорина А вызывало увеличение количества ATi рецепторов в сосудистой стенке [Iwai et all 1993]. In vitro в экспериментах на культуре гладкомышечных клеток крысы преинкубация с CsA приводила к увеличению плотности рецепторов вазопрессина, которое сопровождалось усилением подъема цитоплазматического кальция, выхода 45Са2* и увеличением образования инозитол-1,4,5-трифосфата в ответ на вазопрессин [Lo Russo et al., 1997].

Усиление кальциевого ответа не опосредуется циклофилинами. но подавляется ингибиторами МАР-киназного каскада. Мы также попытались выяснить, какие белки опосредуют эффект CsA на [Са2* ]тт ■ В первую очередь нас интересовало, участвуют ли в этом процессе циклофилины. Эти белки считаются внутриклеточными рецепторами CsA. Комплекс циклоспорин А-циклофилин подавляет экспрессию гена интерлейкина-2 в Т-лимфоцитах, ингибируя серин-треонин фосфатазу кальцинейрин и блокируя таким образом дефосфорилирование и активацию фактора транскрипции NF-AT [O'Keefe et al., 1992]. Чтобы проверить предположение о том, что усиление кальциевого ответа на ангиотензин II в ГМК аорты человека также опосредовано взаимодействием комплекса CsA-циклофилин, мы исследовали действие на выход кальция циклоспорина Н, который связывается с циклофилинами в 1000 раз слабее, чем CsA. Циклоспорин Н усиливал выход кальция из ГМК в ответ на ангиотензин II, хотя в меньшей степени, чем циклоспорин А. При этом он, так же как и циклоспорин А, не влиял на базальный выход кальция. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что эффект циклоспорина А на индуцируемый ангиотензином II выход кальция не опосредуется циклофилинами (рис.4).

По литературным данным регуляция синтеза рецепторов происходит при участии тирозиновых киназ семейства src и белков МАР-киназного каскада. Поэтому мы исследовали действие ингибиторов нерецепторных тирозиновых киназ семейства src и одного из звеньев МАР-киназного каскада на вызываемое циклоспорином А усиление кальциевого ответа клеток. В работе использовались ингибиторы нерецепторных тирозиновых киназ семейства src РР1 и генистейн и ингибитор протеинкиназы МЕК PD98059. Как видно из таблицы 1, блокирование нерецепторных тирозиновых киназ

CsA+ CsH+ CT CsA CsH All A,| ди

Рис.4. Сравнение действия CsA и CsH на индуцируемый ангиотензином II выход кальция из ГМК аорты человека. Клетки преинкубировали с 10"5М CsA или 10"5М CsH в течение 24 часов. Контрольные пробы преинкубирозали 24 часа с 0.1% ЕЮН. * - р<0.05.

семейства src и протеин киназы МЕК подавляло эффект циклоспорина А на клетки, не оказывая влияние на ответ клеток в контроле. Даидзеин, неактивный аналог генистейна, не подавлял эффект циклоспорина А. Эти результаты свидетельствуют, что действие циклоспорина А, вызывающее усиление выхода кальция в ответ вазоконстрикторные гормоны, осуществляется на стадиях, предшествующих МАР-киназному каскаду.

Таблица 1. Действие ингибиторов МАР-киназного каскада и нерецепторных тирозиновых киназ семейства src на выход 45Са2<" в ответ на аргинин-вазопрессин после преинкубации с CsA. За 10 0% принят выход кальция в контроле в ответ на A VP без добавления ингибиторов. Время преинкубации с 106М CsA в отсутствие или в присутствии ингибиторов -24 часа.

Контроль,% Циклоспорин А, %

Без ингибиторов 100 138+2

РР1 1 мкМ 107+6 142+9

РР1 10 мкМ 101+1 112+1 *

Генистейн 10 мкМ 106+3 130+8

Генистейн 30 мкМ 99+7 117+1 *

Генистейн 100 мкМ 92+2 95+4*

Даидзеин 100 мкМ 116+6 137+6

PD98059 20 мкМ 101+6 112+8*

S S

и (0 ш

го л

X ф

200

150

100

Поскольку эффект циклоспорина А не опосредуется циклофилинами, можно предположить, что усиление рецепторзависимого обмена кальция связано с действием какого-либо метаболита CsA или образующихся во время превращения этого вещества активных форм кислорода. Образование продуктов перекисного окисления продемонстрировано при добавлении CsA к гладкомышечным клеткам [Nguyen et al., 1999]. По имеющимся в литературе данным, основным ферментом, отвечающим за метаболизм циклоспорина А в клетках, является цитохром Р450 ЗА, поэтому мы исследовали влияние ингибитора цитохрома Р450 ЗА кетоконазола на эффект циклоспорина А. Преинкубация клеток в течение 24 часов с CsA в присутствии Ю'6 М кетоконазола вызывало частичное подавление эффекта циклоспорина А. Если в присутствии CsA выход кальция в ответ на AVP составлял 159+10% по сравнению с контролем, то в присутствии CsA и кетоконазола -126+8%.

Результаты наших экспериментов, а также ряд литературных данных дают основания предполагать, что существует независимый от цикпофилинов путь усиления кальциевого ответа под действием циклоспорина А. Впервые эта идея высказана в работе Goldberg [1989] при исследовании действия CsA на мезангиальные клетки, аналогичный вывод сделан в работе Lo Russo [1998]. В ней показано, что антагонист CsA, MeVal4CsA, который имеет более высокое сродство к циклофилину, но не ингибирует кальцинейрин, не только не вызывает усиления кальциевого ответа, но и не подавляет эффект циклоспорина А на клетки, что также свидетельствует в пользу гипотезы о независимом от циклофилинов пути действия CsA [Lo Russo et al., 1996].

Возможно, за активацию этого пути ответственны активные формы кислорода, образующиеся при разложении CsA. Из литературы известно, что вещества, генерирующие свободные радикалы, например доксорубицин и терт-бутил гидропероксид, способны вызывать усиление кальциевого ответа клеток [Olson, Mushlin, 1990; Ondrias et al., 1990], a витамин E, перехватчик свободных радикалов, ингибирует индуцируемое CsA усиление кальциевого ответа [Parra et al., 1998; Perez de Laema et al, 1997].

На наш взгляд, можно объединить результаты по действию на CsA-зависимый кальциевый ответ кетоконазола и ингибиторов МЕК и Src-киназ, и тогда один из возможных путей действия CsA на регуляцию кальция может выглядеть следующим образом. Свободные радикалы, образующиеся при разложении CsA, по литературным данным могут

активировать нерецепторные тирозиновые киназы семейства Src, и таким образом вызывать активацию белков МАР-киназного каскада [Lowe et al., 1998; Sabri et al., 1998]. При этом происходит стимуляция синтеза рецепторов и увеличение их количества, которое а конечном итоге приводит к увеличению прироста кальция в ответ на вазоконстрикторные гормоны.

Сравнение изменений ионного транспорта, наблюдаемых при циклоспорин-зависимой и спонтанной гипертензии. Из представленных выше результатов видно, что циклоспорин А способен вызывать изменения рецепторзависимой регуляции кальция в ГМК. По литературным данным, значительные изменения регуляции кальция являются характерным признаком одного из видов гипертонии - эссенциальной гипертонии человека и спонтанной гипертензии крыс (SHR), которая используется как модель эссенциальной гипертонии человека. Для спонтанной гипертензии также характерно значительное изменение других параметров ионного транспорта, в частности транспорта одновалентных катионов.

Мы сравнили изменения некоторых параметров ионного транспорта у крыс с циклоспорин-зависимой и спонтанной гипертензией. Для сравнения были выбраны индуцируемый тромбином подъем кальция в тромбоцитах, активность Са2*-зависимых IC-каналов в тромбоцитах и эритроцитах (регистрируемая гиперполяризация мембраны тромбоцитов и эритроцитов, судя по литературным данным, обусловлена их активацией) [Авдонин, Ткачук, 1984; Hu et al., 1991]) и скорость Ыа*/1-Г-обмена в эритроцитах. При этом мы хотели выяснить также следующие вопросы: 1) происходят пи при циклоспорин зависимой гипертонии изменения рецепторзависимой регуляции кальция в других типах клеток, в частности, в тромбоцитах; 2) изменяются ли Са-зависимые параметры ионного обмена; 3) влияет ли циклоспорин А на обмен одновалентных катионов.

Поскольку многие эффекты циклоспорина А проявляются только после длительной преинкубации с препаратом, мы определяли выбранные параметры ионного транспорта у крыс, получавших в течение 7 дней циклоспорин А в количестве 20 мг на кг веса животного в день. У всех животных, получавших CsA, на 7 день наблюдалось достоверное повышение артериального давления. Результаты сравнения изменений параметров ионного транспорта при циклоспорин-зависимой и спонтанной гипертензии представлены в таблице 2. Введение крысам циклоспорина А вызывало достоверное увеличение прироста [Са2*]цит в тромбоцитах в ответ на тромбин и увеличение скорости NaVl-Г-обмена в эритроцитах.

Интересно, что в случае циклоспорин-зависимой гипертонии, несмотря на усиление кальциевого ответа в тромбоцитах, активации Са2*-зависимых К*-каналов не наблюдалось.

Надо отметить, что кальциевый ответ в тромбоцитах при обеих формах гипертонии увеличен практически в одинаковой степени. Это объясняет сходство функциональных свойств тромбоцитов при обоих видах гипертонии, в частности, усиление агрегации и развитие тромбоэмболии [Grace et al., 1987; Naik et al., 1993]

Таблица 2. Сравнительная характеристика параметров ионного транспорта при спонтанной и циклоспорин-зависимой гипертонии. *- р<0.05 по сравнению с контролем.

Контроль Циклоспорин-зависимая гипертония Спонтанная гипертензия

Давление, мм Нд 127+3 141+3* 178+15*

Подъем кальция в тромбоцитах в ответ на тромбин (в % от контроля) 100+25 183+18 187+36

Гиперполяризация мембраны тромбоцитов в ответ на тромбин 0.5 и/мл (в % от контроля) 100+25 50+25 240+17 *

Гиперполяризация мембраны эритроцитов в ответ на А23187 0.5 мкМ (в % от контроля) 100+17 92+14 163+14*

Скорость №7Н*-обмена в эритроцитах (в % от контроля) 100+10 164+15* 176+12 *

№7Н*-обмен играет важную роль в патогенезе артериальных гипертензий различной этиологии, поскольку его активация ведет не только к увеличению реабсорбции натрия, но и к защелачиванию цитоплазмы клеток, в результате которой происходит стимуляция процессов пролиферации и развитие гипертрофии. Эритроцит является простейшей системой, на которой можно исследовать влияние различных препаратов на параметры Ма7Н*-обмена. Хотя наблюдаемое в нашей работе увеличение скорости Ыа'/Н'-обмена в эритроцитах крыс, получавших С&А, не позволяет сделать однозначных выводов о реализации такого же механизма в ГМК или в клетках почечного эпителия, однако показывает, что циклоспорин А может влиять на этот параметр.

Мы предполагали, что усиление кальциевого ответа при циклоспорин-зависимой гипертонии должно влиять на клеточные системы, работа которых зависит от концентрации цитоплазматического кальция. Выбранные для исследования Са2*-зависимые К*-канапы вносят основной вклад в процесс вазорелаксации после сокращения под действием вазоконстрикторных гормонов [Nelson et al., 1995]. Несмотря на практически одинаковое увеличение кальциевого ответа в тромбоцитах при обеих формах гипертонии, при циклоспорин-зависимой гипертонии активации Са2*-зависимых (Г-каналов не происходило, в то время как при спонтанной гипертензии наблюдалось значительное повышение их активности. Из таблицы 2 видно, что величина гиперполяризации плазматической мембраны в ответ на тромбин в тромбоцитах крыс SHR повышена более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Аналогичные результаты получены для Са2*-зависимых К*-каналов эритроцитов. Они дают основание предполагать, что активация Са2*-зависимых К*-каналов при спонтанной гипертензии вызвана причинами, не связанными с увеличением рецепторзависимого прироста кальция.

Таким образом, изменения в характере обмена ионов кальция и натрия при циклоспорин-зависимой гипертонии аналогичны наблюдаемым при спонтанной гипертензии. При обеих формах гипертонии практически в одинаковой степени увеличен подъем [Са в тромбоцитах в ответ на тромбин и скорость №7нГ-обмена в эритроцитах. Повышение активности Са2*-зависимых К*-каналов наблюдается только при спонтанной гипертензии и по-видимому вызвано причинами, не связанными с увеличением рецепторзависимого прироста кальция.

Характеристика Саг*-зависимых К'-каналов при спонтанной гипертензии.

Сравнение параметров ионного обмена при CsA-зависимой и спонтанной гипертензии показало, что увеличенная активность Са2*-зависимых «"'-каналов наблюдается только в клетках SHR. Мы попытались выяснить, что может быть причиной повышения активности этих каналов при спонтанной гипертензии.

На первом этапе нашей работы мы попытались более подробно исследовать Са2*-зависимые Ю-каналы в клетках крыс SHR. На основании результатов, полученных в предыдущем разделе, можно предположить, что увеличение гиперполяризации плазматической мембраны тромбоцитов SHR по сравнению с WKY не связано с изменениями в рецепторзависимой регуляции кальция. Косвенно это предположение

подтверждается результатами экспериментов на эритроцитах. Величина гиперполяризации мембраны эритроцитов вНР? в ответ на кальциевый ионофор А23187 (таблица 2), повышающий кальций нерецепторным путем, выше по сравнению с \Л/КУ. Для дополнительной проверки гипотезы мы исследовали действие веществ, повышающих кальций нерецепторным путем (кальциевого ионофора А23187 и ингибитора Са-АТФ-азы ретикулума ди-терт-бутилбензогидрохинона (ВНС!)) на мембранный потенциал тромбоцитов. В обоих случаях величина гиперполяризации в тромбоцитах крыс БНР? выше по сравнению с \Л/КУ (рис.5)

Рис.5. Гиперполяризация плазматической мембраны тромбоцитов крыс SHR и WKY в ответ на добавление в среду кальциевого ионофора А23187 (1СГ6М) и ингибитора Са-АТФ-азы эндоппазматического ретикулума BHQ (10"5М).

Результаты элекгрофизиологических экспериментов, выполненных на ГМК крыс SHR и WKY также подтверждают, что Са2*-зависимые К*-каналы активированы при спонтанной гипертензии, причем у них значительно повышена чувствительность к кальцию [England et al., 1993]. Предполагается, что повышенная активность Са2*-зависимых К*-каналов необходима, чтобы компенсировать увеличенные ответы клеток на вазоконстрикторные гормоны при спонтанной гипертензии.

Считается, что при спонтанной гипертензии значительный вклад в изменение активности систем ионного обмена вносит изменение окружения белков и структуры

цитоскелета. Например, разница в активности кальциевой АТФ-азы эритроцитов SHR по сравнению с контролем исчезает при очистке белка после солюбилизации мембраны [Покудин с соавт., 1986]. Такие же данные получены для Na'/Н* обмена в эритроцитах гипертензивных крыс миланской линии [Ferrary et al., 1992]. Показано, что мутация одного из белков цитоскелета, аддуцина, приводит к активации Na'-K'-АТФэзы [Manunta et al., 1998]. Мы также попытались выявить связь изменений цитоскелета и активности Са2*-зависимых К*-каналов при спонтанной гипертензии. В качестве параметра, характеризующего такие изменения, было использовано содержание белка в основных полосах, получаемых при SDS-электроферезе мембран эритроцитов. Ранее показано, что изменения в белковом спектре мембран эритроцитов адекватно отражают изменения мембранной структуры этих клеток при спонтанной гипертензии [Купреева с соавт., 1999].

Изучение характера связи между величиной Са-зависимой гиперполяризации эритроцитарной мембраны и изменениями спектра структурных белков мембраны эритроцитов проводилось у F2 гибридов крыс (SHRxWKY). У каждого животного мы определили содержание белка в основных полосах, получаемых при SDS-электрофорезе теней эритроцитов, - полосах спектрина, анкирина, полосах 3, 4.1, 4.2, 4.5, 4.9, полосах актина и тропомиозина, и методами линейного корреляционного анализа исследовали зависимость между этими параметрами и величиной гиперполяризации мембраны эритроцитов. Белки мембраны эритроцитов взаимодействуют между собой, образуя единую структуру, поддерживающую форму эритроцита и количества белка в отдельных ЭФ-полосах могут быть взаимосвязанными параметрами. Поэтому для анализа был использован метод множественной корреляции и определены множественный коэффициент корреляции (R) между величиной гиперполяризации и изменениями спектра структурных белков мембраны эритроцитов и частные коэффициенты корреляции (г) между ДЕ„ и содержанием белка в каждой полосе. Частные коэффициенты корреляции в данном случае предпочтительнее парных, поскольку они определяют характер связи двух параметров, учитывая наличие остальных.

Показано, что увеличение гиперполяризации мембраны эритроцитов значимо коррелирует с изменениями в спектре структурных белков мембраны. В таблице 3 приведено значение коэффициента множественой корреляции, полученное при описании зависимости методом линейной регрессии. Все частные коэффициенты корреляции,

полученные при анализе частных связей (ЛЕи - содержание белка в одной из ЭФ-полос спектра структурных белков мембраны эритроцитов) представлены в таблице 4. Анализ частных связей показал, что значимая корреляция выявляется между АЕ„ и содержанием белка в полосах спектрина и анкирина - основных белков, формирующих цитоскелет и определяющих его прикрепление к мембране, и с содержанием белка в полосе 4.9, связанного с актиновыми филаментами. Мы рассчитали множественный коэффициент корреляции, взяв в качестве предикторов только полосы 4.9, анкирин и спектрин, Его значение приведено в таблице 2. Корреляция в этом случае является значимой, в то время как. использование в качестве предикторов полос остальных белков не дает значимой корреляции с величиной ДЕ„

Таблица 3. Коэффициенты множественной корреляции между величиной гиперполяризации мембраны эритроцитов и содержанием белка в основных полосах, получаемых при ЭРв-электрофорезе теней эритроцитов. N=55

Линейная регрессия Все белки являются предикторами. Линейная регрессия Предикторы - спектрин анкирин, полоса 4.9 Линейная регрессия Предикторы - полосы 3, 4.1,4.2, 4.5, 4.9, 6, 8, актин, тропомиозин.

гибриды Р1=0,74 р<0.001 [4=0,52 р<0,0005 К=0.31 р<0.66

Таблица 4. Частные коэффициенты корреляции, полученные при анализе зависимости между величиной гиперполяризации мембраны эритроцитов и содержанием белка в каждой полосе, получаемой при электрофорезе теней эритроцитов методом линейной регрессии. N=55.

ДЕ„ Р

спектрин г' = -0,49 0,0002

анкирин г' = -0,38 0,006

Полоса 3 г' = 0,21 0,14

Полоса 4.1 г' = 0,0002 0,99

Паллидин г' = -0,07 0,59

Полоса 4.5 г' = -0,16 0,27

Полоса 4.9 г' = 0,35 0,01

Актин г' =-0,11 0,43

Полоса 6 г' = -0,24 0,08

Тропомиозин г' = 0,04 0,78

Полоса 8 г1 =-0,11 0,44

Основываясь на результатах корреляционного анализа можно сделать вывод, что изменения величины гиперполяризации мембраны эритроцитов могут быть вызваны

характерными для спонтанной гипертензии структурными перестройками цитоскелета клеток.

Совокупность всех приведенных в нашей работе, а также имеющихся в литературе данных по влияния CsA на параметры ионного обмена указывает, что циклоспорин-зависимая гипертония вызвана комплексными изменениями в клетках, которые не ограничиваются ГМК и позволяют охарактеризовать циклоспорин-зависимую гипертонию как системное заболевание. Наблюдаемые аналогии между циклоспорин-зависимой и спонтанной гипертензией также подтверждают этот вывод, хотя спонтанная гипертензия характеризуется более глубокими изменениями обмена одновалентных катионов, в том числе связанными с изменениями структурных характеристик цитоскелета клеток.

ВЫВОДЫ.

1. Циклоспорин А вызывает увеличение прироста [Са24]^ в ответ на ангиотензин II в гладкомышечных клетках аорты человека.

2. Усиление кальциевого ответа в ГМК человека сопровождается увеличением плотности рецепторов ангиотензина II без изменения их сродства к агонисту. Увеличение плотности рецепторов под действием CsA ингибируется актиномицином D и может быть связано с их синтезом de novo.

3. В отличие от действия на иммунный ответ, влияние циклоспорина А на рецепторзависимый обмен кальция не опосредуется циклофилинами. Показано участие в этом процессе нерецепторных тирозиновых киназ семейства src и белков МАР-киназного каскада.

4. Изменения в характере обмена ионов кальция и натрия при циклоспорин-зависимой гипертонии аналогичны наблюдаемым при спонтанной гипертензии. При обеих формах гипертонии практически в одинаковой степени увеличен рецепторзависимый подъем [Са 2*]ц„т в тромбоцитах и скорость NaVH'-обменэ в эритроцитах.

5. Повышение активности Са2*-зависимых К*-каналов наблюдается только при спонтанной гипертензии и коррелирует с изменениями спектра структурных белков мембраны эритроцитов. Значимая корреляционная связь выявляется с содержанием белка в полосах спектрина и анкирина - основных белков, формирующих цитоскелет и определяющих его прикрепление к мембране, и с содержанием белка в полосе 4.9, связанного с актиновыми филаментами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ■(.Афанасьева Г.В., Авдонин П.В. Повышенная активность Са-зависимых К-канапов в клетках крыс со спонтанной гипертензией. Кардиология, 1S99, N27, 28-32.

2.Avdonin P., Maire F., Afanasjeva G., Loktionova S., Lhotte P., Ruegg U. Cyclosporine A up-regulate angiotensin II receptors and calcium responses in human vascular smooth muscle cells. Kidney Int., 1999, 55:2407-2414.

3.Афанасьева Г.В., Покудин Н И., Постнов А.Ю. Наследование повышенной активности Са-зависимых К-каналов у гибридов крыс (SHRxWKY) второго поколения. Кардиология, 2000, №5, 78-82.

4. Авдонин П.В., Афанасьева Г.В., Захаров В.Ю. Повышенный ответ на агонисты Са-активируемых калиевых каналов в клетках крыс со слонтаннной гипертензией. Международный симпозиум "Артериальные гипертензии: патогенез, патогенетическая терапия, поражение органов" 15-17 декабря 1997 г. Стр.2.

5. Авдонин П.В., Афанасьева Г.В., Локтионова С.Л., Ruegg U.T. Усиленная экспрессия рецепторов ангиотензина - возможная причина вызываемой циклоспорином А артериальной гипертензии. Международный симпозиум "Артериальные гипертензии: патогенез, патогенетическая терапия, поражение органов" 15-17 декабря 1997 г.Стр.З.

6. Авдонин П.В., Афанасьева Г.В., Локтионова С.Л., Ruegg U.T., Циклоспорин А вызывает усиленную экспрессию рецепторов ангиотензина II в гладкомышечных клетках аорты человека. Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" Пущино 21-25 сентября 1998 г. Стр. 201.

7.Afanasjeva G., Bryantsev A., Loktionova S., Sokolova R., Bushueva Т., Avdonin P., Ruegg U. Cyclosporine A effect on Ca2' and monovalent cations current in platelets and red blood cells. Tenth European Meeting on Hypertension, May 29-June 3, Goteborg, Sweden. J Hypertens. 2000, v.18, Suppl. 2., p.S133.

8.Afanasjeva G.V., Pokudin N.I, Kupreeva A.Y., Postnov A.Y Analysis of Ca2*-dependent K*-channels properties in the cells of spontaneously hypertensive rats and F2 hybrids (SHRxWKY). Tenth European Meeting on Hypertension, Young Investigator Meeting. May 29 -June 3, Goteborg, Sweden. Abstr 28.

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж 100 экз. Заказ №89

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Афанасьева, Галина Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Основные механизмы поддержания высокого давления при артериальных гипертензиях различной этиологии.

1.1 .Классификация артериальных гипертензий по этиологии заболевания.

1.2.Общая характеристика систем регуляции артериального давления.

1.3.Почечно-объемный механизм.

1 АРенин-ангиотензин-альдостероновая система.

1.5. Роль повышенного периферического сосудистого сопротивления в патогенезе артериальной гипертензии.

2. Циклоспорин А как один из представителей класса препаратов-иммунодепрессантов. Взаимодействие циклоспорина А с различными биохимическими системами клетки.

2.1. Общая характеристика циклоспорина А.

2.2.Структура и пути метаболизма циклоспорина А.

2.3. Молекулярный механизм действия циклоспорина А как иммунодепрессанта. Аналоги циклоспорина А.

2.4. Иммунофилины: локализация в клетке и участие в подавлении иммунного ответа.

2.5. Другие функции иммунофилинов в клетке.

2.5.1. Иммунофилины как ферменты фолдинга.

2.5.2. Иммунофилины как стресс-белки.

2.5.3. Участие иммунофилинов в организации рецепторов и ионных каналов.

2.5.4.Иммунофилины в роли цитокинов.

2.6.Эффекты циклоспорина А, не связанные с подавлением иммунного ответа.

2.6.1.СзА-зависимая генерация свободных радикалов.

2.6.2.Влияние СэА на сократимость сосудов.

2.6.3.Влияние СэА на регуляцию внутриклеточного кальция.

2.6.4.Другие эффекты СэА, способные влиять на вазоконстрикцию.

2.6.5.Действие СэА на функцию почки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности ионного обмена в клетках при циклоспорин-зависимой гипертонии"

Циклоспорин A (CsA) является одним из препаратов, предотвращающих отторжение органов при их трансплантации, и широко используется при послеоперационной терапии, а также при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний, однако его применение ограничено из-за развивающейся при этом у многих пациентов артериальной гипертензии и нефротоксичности препарата [Whiting et ai., 1981].

Действие циклоспорина А как иммунодепрессанта основано на способности ингибировать синтез интерлейкина-2 в Т-лимфоцитах и подавлять таким образом их пролиферацию. При этом циклоспорин А обладает очень высокой селективностью, практически не действуя на пролиферацию других типов клеток. Высокая селективность, как предполагают, связана с тем, что фактор транскрипции NF-AT, активацию которого предотвращает циклоспорин А, экспрессируется только в лимфоцитах 2 [Clipstone et al., 1992; O'Keefe et al., 1992].

В то же время рецепторами циклоспорина А являются белки, которые широко представлены в разных типах клеток. Они названы циклофилинами из-за способности взаимодействовать с циклоспорином А, однако были известны еще до открытия препарата как пептидил-пролил цис-транс изомеразы (ротамазы), участвующие в процессах формирования трехмерной структуры вновь синтезированных белков [Scoenbrunner et al., 1991; Rinfret et al., 1994; Kern et al., 1994]. Циклоспорин А подавляет ротамазную активность циклофилинов, кроме того, комплекс CsA-циклофилин ингибирует активность серин-треонин фосфатазы кальцинейрина, также участвующего в регуляции многих клеточных процессов. Предполагают, что наличие большого количества белков-мишеней, на которые может действовать циклоспорин А, а также их широкая распространенность, приводит к развитию таких серьезных побочных эффектов, как гипертония и нефротоксичность.

Артериальная гипертония является одной из наиболее часто встречающихся форм патологии. Согласно статистическим данным, частота случаев гипертонии в общей популяции составляет 15-20%, поэтому изучению систем, участвующих в поддержании повышенного артериального давления, посвящено большое количество исследований. Считается, что наиболее значительную роль в развитии гипертонии играют изменения в почечно-объемном механизме регуляции АД, активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и усиление сократительной активности сосудов [Шустов и соавт, 1997]. Работы последних лет показали, что развитие патологического процесса при гипертонии сопровождается, прежде всего, изменениями в системах, регулирующих внутриклеточный кальций и натрий. Кальций играет ключевую роль в регуляции процессов сосудистой сократимости, а усиление реабсорбции натрия - одна из основных характеристик изменения работы почечно-объемного механизма и активации ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [Doris et al., 2000]. Показано, например, что при развитии эссенциальной гипертонии, на долю которой приходится большинство случаев повышения артериального давления, происходит увеличение содержания внутриклеточного кальция, причем не только в гладкомышечных клетках сосудов [Spieker et al., 1985; Sugiyama et al., 1986], но и в электроневозбудимых клетках (тромбоцитах, адипоцитах, эритроцитах) [Postnov, Orlov, 1984; Орлов с соавт., 1984]. При эссенциальной гипертонии увеличена также скорость Ма+/Н+-обмена, №+-К+-СГ-котранспорта, повышена активность натриевых каналов.

Одна из причин повышения давления при терапии CsA состоит в том, что, одновременно с подавлением функции Т-лимфоцитов он усиливает сокращение сосудов [Banijamali et al., 1993; Bossaller et al., 1989]. Исследования, проведенные на культуре гладкомышечных клеток аорты крысы показали, что СэА увеличивает вход Са2+ в ответ на вазоконстрикторные гормоны [1о Киэзо е1 а11,1996]. Однако остается не ясным, реализуется ли тот же механизм в гладкомышечных клетках человека, и чем может быть вызвано усиление кальциевого ответа. Остается также не исследованным вопрос о том, может ли циклоспорин А изменять системы ионного транспорта одновалентных катионов, вовлеченных в патогенез артериальной гипертензии.

Цель данной работы - исследовать биохимические механизмы участвующие в поддержании высокого артериального давления при циклоспорин-зависимой гипертонии.

При этом планировалось решить следующие задачи:

1. Определить, оказывает ли циклоспорин А действие на рецепторзависимый обмен кальция в гладкомышечных клетках аорты человека и оценить его влияние на рецепторы вазоконстрикторных гормонов.

2. Выяснить, оказывает ли циклоспорин А действие на транспорт одновалентных катионов.

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Афанасьева, Галина Вячеславовна

Выводы.

1. Циклоспорин А вызывает увеличение прироста [Са2+]цит в ответ на ангиотензин II в гладкомышечных клетках аорты человека.

4. Изменения в характере обмена ионов кальция и натрия при циклоспорин- -зависимой гипертонии аналогичны наблюдаемым при спонтанной гипертензии. При обеих формах гипертонии практически в одинаковой степени увеличен рецепторзависимый подъем [Са 2+]цит в тромбоцитах и скорость 1Ча+/Н+-обмена в эритроцитах.

5. Повышение активности Са2+-зависимых ^-каналов наблюдается только при спонтанной гипертензии и коррелирует с изменениями спектра структурных белков мембраны эритроцитов. Значимая корреляционная связь выявляется с содержанием белка в полосах спектрина и анкирина - основных белков, формирующих цитоскелет и определяющих его прикрепление к мембране, и с содержанием белка в полосе 4.9, связанного с актиновыми филаментами.

Заключение.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что воздействие циклоспорина А на организм не ограничивается блокированием иммунного ответа, и сопровождается развитием таких серьезных побочных эфффектов, как гипертония и нефротоксичность. Причинами циклоспорин-зависимой гипертонии на разных этапах ее развития считают нарушение функции почки[1ике, 1993], активацию симпатической нервной системы [Sander et al., 1996] и усиление сократимости сосудов[ВапуатаП et al., 1993; Bossaller et al., 1989; Curtis et al., "1986; Luke, 1993]. При этом основной считается усиление вазоконстрикции, поскольку патологические изменения в почке возникают при длительном приеме циклоспорина А в главным образом из-за сужения почечных сосудов. Повышенную вазоконстрикцию объясняют способностью циклоспорина А усиливать рецепторзависимый подъем [Са2+]цит в гладкомышечных клетках [Lo Russo et al.,

1996] и ингибировать эндотелийзависимое расслабление сосудов [0|ес1епсЬ е1 а1., 1994]. Однако конкретные механизмы действия циклоспорина А на регуляцию [Са2+]цит остаются предметом дискуссии. Не ясно, какие белки опосредуют эффект СбА. Кроме того, описанные в литературе данные по влиянию СбА на рецепторзависимую регуляцию [Са2+]цит получены на клетках экспериментальных животных и предположение о аналогичном механизме воздействия СбА на клетки человека нуждается в эксперименталтьном подтверждении. В литературе также очень мало данных о влиянии СбА на транспорт одновалентных катионов, однако значимая корреляция между концентрацией натрия и СбА в плазме крови [Реггег-Маг^пег et а1., 1999] позволяет предполагать, что изменение в характере обмена ионов натрия тоже может быть одной из причин развития циклоспорин-зависимой гипертонии. В нашей работе сделана попытка выяснить эти вопросы.

Материалы и методы. 1. Выделение и культивирование гладкомышечных клеток сосудов человека и крысы.

Выделение гладкомышечных клеток (ГМК) из аорты человека проводили по методу Орехова [ОгекИоу е1 а!., 1983] с некоторыми модификациями. Для выделения использовался аутопсийный материал, полученный не позднее 6 часов после внезапной смерти. Участок грудного отдела аорты освобождали от соединительной ткани, отмывали от крови, механически отделяли интиму и адвентицию, измельчали и инкубировали в течение 3 часов при 37°С в среде ДМЕМ, содержащей 0,2% коллагеназу, 0,05% эластазу и 1% термоинактивированной сыворотки крови человека. Полученные клетки осаждали при 400 д в течение 10 минут ишысаживали с плотностью 3-5x104 клеток/см2 на чашки Петри, покрытые 0,2% желатином.

Для выделения ГМК крысы использовали аналогичную методику. Для эксперимента использовали животных в возрасте 12-16 недель. Участок грудного отдела аорты крысы отмывали от крови, отделяли адвентицию, измельчали и инкубировали в течение 2 часов при 37°С в среде ДМЕМ, содержащей 0,2% коллагеназу, 0,05% эластазу. Полученные клетки осаждали при 400 д в течение 10 минут и высаживали с плотностью 3-5x104 клеток/см2 на чашки Петри, покрытые 0,2% желатином.

Культивирование ГМК человека проводили в среде ДМЕМ, содержащей -20 мМ НЕРЕБ, 1 мМ пируват натрия, 50 ед/мл пенициллин, 50 мг/мл стрептомицин, 2 мМ * Ьглутамин, 350 мг/л МаНСОз, 20% инактивированной сыворотки крови человека в инкубаторе (37°С, 5% С02). Смену среды культивирования проводили каждые 48 часов. После того, как культура достигала конфлюэнтного состояния, клетки использовали в эксперименте или пассировали с помощью раствора 0,05% трипсина-0,02% ЕДТА. В эксперименте использовали клетки 7-11 пассажей.

Культивирование ГМК крысы проводили в аналогичных условиях, только среда роста содержала вместо 20% инактивированной сыворотки крови человека, 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В эксперименте использовали клетки 7-11 пассажей.

Идентификацию ГМК в культуре проводили при помощи окрашивания на специфический для гладкомышечных клеток актин. Чистота популяции ГМК в используемых для эксперимента пассажах составляла 75%.

Инактивированную сыворотку человека получали из донорской крови. Кровь без антикоагулянта инкубировали при 37°С 30 минут до полного свертывания, затем центрифугировали при 2000 д 10 минут, отбирали плазму и инакгивировали ее 30 минут при 56°С. Инактивированную плазму фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 микрон и хранили в стерильной посуде при +4°С.

2. Предобработка клеток.

Для определения влияния циклоспорина А на подъем концентрации внутриклеточного кальция и скорость выхода меченого кальция, клетки после достижения ими конфлюэнтного состояния помещали на 24 часа в среду ДМЕМ без сыворотки, содержащую различные концентрации циклоспорина А. В контрольные образцы был добавлен равный объем этилового спирта, в котором растворяли СбА.

3.Выделение тромбоцитов.

Выделение тромбоцитов проводилось по методу Авдонина и соавт. [Авдонин и соавт. 1985]. Кровь смешивали в соотношении 1:6 с антикоагулянтом, содержавшим 85 мМ цитрата натрия, 66,6 мМ лимонной кислоты и 100 мМ глюкозы и центрифугировали при 190 д 15 минут. 2/3 верхнего неокрашенного слоя, содержащего обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП), собирали и осаждали при

650g в течение 10 минут. Осадок аккуратно суспендировали в буфере 1, содержавшем 150 мМ NaCI, 2.7 мМ KCI, 0.37 мМ NaH2P04, 1 мМ MgCI2,1 мМ CaCI2, 5 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES, 50 U/мл гепарин, 0.1 мг/мл апиразы, 0.35% свободного от жирных кислот бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 6.55, инкубировали на водяной бане при 37°С 15 минут, повторно осаждали при 650g в течение 10 минут и ресуспендировали в буфере 2, содержавшем 150 мМ NaCI, 2.7 мМ KCI, 0.37 мМ NaH2P04, 1 мМ MgCI2, 0,1 мМ CaCI2, 5 мМ D-глюкозу, 10 мМ HEPES, 0.1 мг/мл апиразы, 0.35% БСА Fatty acid free, рН 7.4. Полученную суспензию доводили буфером 2 до объема отобранной в начале выделения ОТП и использовали в эксперименте.

4. Измерение концентрации внутриклеточного кальция в тромбоцитах

Для определения концентрации внутриклеточного кальция использовали тромбоциты, предварительно загруженные кальцийчувствительным флуоресцентным зондом Fura-2. Для получения таких клеток в ОТП добавляли 1 мкМ Fura-2 AM и инкубировали на водяной бане при 37°С 30 минут. Далее выделение тромбоцитов проводили по приведенной выше методике. Измерение проводили в среде, содержащей 150 мМ NaCI, 2.7 мМ KCI, 0.37 мМ NaH2P04, 1 мМ MgCI2, 1 мМ CaCI2, 5 мМ D-глкжозы, 10 мМ HEPES рН 7.4 на спектрофлуориметре Shimadzu при длинах волн возбуждения 340 нм и 380 нм и эмиссии 510 нм [Grynkiewich et al., 1985]. Калибровку проводили, добавляя 50 мкМ дигитонина для достижения максимальной флюоресценции, и 10 мМ EGTA для достижения минимума флуоресценции. в ГМК

Для определения концентрации внутриклеточного кальция в ГМК, клетки выращивали на покровных стеклах размером 20x10 мм, предварительно покрытых 0,2% желатином. После достижения клетками конфлюэнтного состояния, среду роста заменяли на среду ДМЕМ без сыворотки. Через 20-24 часа ГМК промывали средой ДМЕМ и инкубировали в ДМЕМ, содержащей 5 мкМ Рига-2 АМ в течение 50 минут при 37°С. Затем покровные стекла с клетками еще раз промывали средой измерения, содержавшей 150 мМ ЫаС1, 5 мМ КС1, 1 мМ МдС12, 1.8 мМ СаС12,10 мМ Р-глюкозу, 10 мМ НЕРЕв, рН 7,4. Измерение проводили на спектрофлуориметре БЫтаски при длинах волн возбуждения 340 нм и 380 нм и эмиссии 510 нм. Максимум флюоресценции измеряли после добавления в среду 10 мкМ иономицина, а минимум - после добавления 10 мМ Е6ТА. б.Определение скорости выхода кальция из культивируемых гладкомышечных клеток.

Определение скорости выхода кальция из культивируемых гладкомышечных клеток проводилось по методу [1о РиБэо е! а1., 1996]. Для проведения эксперимента клетки высевали на 24-х луночные плайты. Для загрузки 45Са2+ их дважды промывали физиологическим солевым раствором (ФСР), содержавшим 0,12мМ СаС12 (состав ФСР: 145 мМ ЫаС1, 1 мМ КС1, 1 мМ МдС12, 10 мМ Р-глюкозы, 5 мМ НЕРЕБ рН 7.4) и инкубировали в ФСР, содержавшем 1 мкКи 45Са2+ на ячейку, 15 минут при 37°С. Затем клетки 4 раза быстро промывали ледяным ФСР/1.2 мМ СаС12. Выход кальция инициировали добавлением прогретого до 37°С буфера ФСР/1.2 мМ СаС12 (0,5 мл на ячейку). На 3, 6 и 9 минуте супернатант удаляли и немедленно добавляли 0,5 мл свежего буфера ФСР/1.2 мМ СаС12. Агонисты растворяли в ФСР и добавляли на 9 минуте. На 11 минуте супернатант удаляли и для определения содержания меченого кальция в клетках добавляли в ячейку 50 мкп 0.25% раствора трипсина, содержавшего 1% этилен-диамин-тетраацетата, а затем 250 мкп 1% раствора додецилсульфата натрия. Радиоактивность супернатанта и клеточного лизата определяли жидкостно-сцинцилляционным методом на счетчике Packard Tri i

Carb 4640. Типичная кривая, описывающая кинетику выхода кальция, проведена на рис. 6.

6.Связывание меченного 1251-АП.

Клетки, культивируемые на 24-луночном плайте, дважды промывали ФСР/1.2 мМ CaCI2 при 20°С, затем добавляли ФСР/1.2 мМ CaCI2, содержавший 1% БСА, различные концентрации немеченного All и меченный 1251-АП, и инкубировали 20 минут при 20°С. Затем клетки 4 раза быстро промывали охлажденным ФСР/1.2 мМ СаС12/БСА, тщательно удаляя буфер после каждой промывки. После этого в ячейки добавляли по 200 мкл 1 М NaOH для разрушения клеток. Радиоактивность образцов определяли на гамма-счетчике Gamma Master, Pharmacia.

7.Измерение содержания продуктов метаболизма циклоспорина А в культивируемых ГМК аорты крысы.

Клетки, достигшие кофлюэнтного состояния дважды промывали средой ДМЕМ без сыворотки, и помещали на 24 часа в среду ДМЕМ, содержащую [3H]CsA и 10"6М немеченного CsA. Затем клетки трижды отмывали охлажденной средой ДМЕМ, лизировали и разделяли компоненты низкомолекулярной фракции методом НPLC по методу [Kronbach et al., 1988]. Продукты метаболизма CsA идентифицировали по наличию радиоактивности в выходящих пиках. Результаты анализа содержания CsA и его метаболитов любезно предоставлены доктором N.Nguen (Швейцария)

8. Изучение сокращения изолированных сегментов аорты крысы.

Участок грудного отдела аорты крысы промывали в охлажденном раствор Кребса (120 мМ NaCI, 5 мМ KCl, 1.8 мМ CaCI2, 1.2 мМ MgS04, 25 мМ NaHC03, 1.2 мМ КН2Р04, 10 мМ D-глюкоза), разрезали на сегменты длинной 3 мм, затем помещали растянутые на двух стальных скрепках сегменты в раствор Кребса, аэрируемый 95% 02, 5% С02 при 37°С. Сегменты инкубировали в течение 1 часа до достижения постоянного натяжения, затем проверяли чувствительность, вызывая сокращение в ответ на 0.001 мкМ NA. NA полностью отмывали. Эксперимент начинали через 1520 минут после полной отмывки NA. Сегменты инкубировали с 10"5М циклоспорина А в течение 2 часов. В контрольные пробы добавляли равный объем этилового спирта. После окончания преинкубации снимали дозовую зависимость в ответ на NA или All.

9. Измерение мембранного потенциала в тромбоцитах

Измерение потенциала плазматической мембраны отмытых от плазмы тромбоцитов проводилось с помощью флуоресцентного потенциалчувствительного зонда dis-C3-(5) в среде, содержавшей 150 мМ NaCI, 2.7 мМ KCl, 1 мМ MgCI2, 1 мМ CaCI2, 5 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7.4. Длины волн возбуждения и излучения составляли 650 и 675 нм соответственно. Концентрация dis-C3-(5) составляла 1 мкМ. Агонисты, кальциевый ионофор и другие эффекторы добавлялись после полного встраивания dis-C3-(5) в плазматическую мембрану и достижения стабильного уровня флуоресценции. Величина мембранного потенциала определялась путем калибровки с калиевым ионофором валиномицином возрастающими концентрациями К* в среде. При измерении активности Са2+-зависимых 1^-каналов

NaCI в среде измерения был заменен на М-метил-О-глутамин. в гладкомышечных клетках

Определение мембранного потенциала в ГМК проводилось по методу, описанному в работе Neyion и соавт. [Neyion et al., 1994]. Для экспериментов по измерению мембранного потенциала клетки высевали на покровные стекла, предварительно покрытые 0,2% желатином и выращивали до достижения клетками конфлюэнтного состояния. За сутки до эксперимента их помещали в среду, лишенную сыворотки. В работе использовали клетки 5-10 пассажей. Измерение потенциала плазматической мембраны проводилось с помощью флуоресцентного потенциалчувствительного зонда бис-оксонола аналогично методике, использованной при работе с тромбоцитами. Длины волн возбуждения и флуоресценции составляли соответственно 540 нм и 580 нм. Рабочая концентрация бис-оксонола - 100 нМ. в эритроцитах

Эритроциты выделяли по методу, описанному в работе Покудина с соавт. [Покудин с соавт., 1989]. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в концентрации 10 ед/мл. Кровь центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут при 4°С, отбирали плазму и белые клетки, а эритроциты суспендировали в буфере, содержавшем 75 мМ NaCI, 75 мМ KCl, 1 мМ MgCI2, 5 мМ D-глюкозы, 5 мМ NaH2P04/Na2HP04, pH 7,4. Полученную суспензию снова центрифугировали при 2000 д в течение 10 минут при +4°С, а затем дважды отмывали в растворе, содержавшем 150 мМ NaCI, 1 мМ KCl, 1 мМ MgCI2, 10 мМ D-глюкозы. Осадок упакованных эритроцитов хранили при +4°С и использовали для измерения мембранного потенциала. Кинетику изменения мембранного потенциала регистрировали рН-метрически, по методу, описанному в работе Баскакова с соавт.

Баскаков с соавт., 1989], где показано, что после добавления протонофора распределение протонов в эритроцитах и внешней среде отражает изменение мембранного потенциала. В качестве среды измерения использовали раствор, в котором проводили последнюю отмывку. После установления постоянного значения рН, в среду, содержащую буфер и эритроциты, добавляли 20 мкМ протонофора карбонил цианид т-хлорфенилгидразона и 25 мкМ СаС1г. Гиперполяризацию плазматической мембраны эритроцитов инициировали добавлением 0,5 мкМ кальциевого ионофора А23187. По величине гиперполяризации плазматической мембраны эритроцитов судили об активности Са2+-зависимых ^-каналов в этих клетках. Расчет проводили по формуле: Ем=ВТ/Р(рН2-рН1), где рНт значение рН до добавления кальциевого ионофора, рН2 - значение рН в точке максимальной гиперполяризации плазматической мембраны эритроцитов.

Ю.Определение скорости Ыа+/Н+-обмена.

Скорость Ма+/Н+-обмена в эритроцитах измеряли по методу, описанному в работе Орлова с соавт. [Ог1оу а1., 1989] и определяли как начальную скорость амилоридингибируемого выхода протонов из эритроцитов в условиях блокирования анионного обменника. Эритроциты выделяли как описано в методике определения мембранного потенциала. Измерение проводили при 37°С. В качестве среды измерения использовали раствор, в котором проводили последнюю отмывку. После установления постоянного значения рН в среду добавляли блокатор анионного транспорта ОЮБ до конечной концентрации 250 мкМ, и доводили рН соляной кислотой до 6.2. Среду быстро защелачивали до рН 7.8 добавлением ЫаОН и регистрировали начальную скорость закисления. Повторяли измерение в тех же условиях, но с добавкой в среду измерения амилорида до конечной концентрации 250 мкМ. Скорость Ма+/Н+-обмена вычисляли как разность скоростей закисления среды в присутствии и отсутствии амилорида.

11. Экспериментальная модель циклоспорин-зависимой гипертонии.

Для проведения эксперимента были взяты две группы по 5 крыс линии WKY в возрасте 11-12 недель Первая группа служила контролем, и относящиеся к ней животные получали по 0.5 мл оливкового масла в день. Животные второй группы получали циклоспорин А, растворенный в 0.5 мл оливквого масла из рассчета 20 мг CsA на килограмм веса животного в день в течение 7 дней.

Регистрация давления производилась по появлению пульсации после пережатия хвостовой артерии крысы на приборе "Мингограф" (Simpson, Япония). Для определения частоты сердечных сокращений был использован метод прямой катетерной регистрации с помощью манометра СР-01, соединенного с системой -компьютерной регистрации показателей гемодинамики "Bioshell". Непрерывную запись сигнала осуществляли после адаптации животного к условиям эксперимента в течение 60 минут. Частоту сердечных сокращений рассчитывали после поударной обработки сигнала усреднением данных, полученных с непрерывного 20-мин участка кривой. Результаты измерения частоты сердечных сокращений любезно предоставлены Д. Зарецким и М. Зарецкой.

После окончания эксперимента животное усыпляли с помощью эфирного наркоза и брали кровь из бифуркации брюшной аорты для определения параметров ионного транспорта и почку для контроля нефротоксичности препарата. О нефротоксических эффектах циклоспорина А судили по морфологическим изменениям, выявляемым при исследовании тонких срезов, окрашенных гематоксилином-эозином. Результаты анализа любезно предоставлены с.н.с. отдела патологической анатомии д.м.н. Р.И.Соколовой. Параметры ионного транспорта определяли методами, описанными в предыдущих разделах.

12. Получение F2 гибридов крыс (SHRxWKY).

В качестве родительских особей для скрещивания были взяты животные линии со спонтанной гипертензией (SHR) с АД 170-190 mm Hg и нормотензивного контроля (WKY) с АД 110-130 mm Hg. Скрещивание проводилось по схеме (самец WKY х самка SHR). Две особи первого поколения (брат-сестра) определялись как родительская пара поколения F2. Потомство этих пар составило изучаемую популяцию F2. В качестве контрольной группы были взяты самцы и самки крыс линии со спонтанной гипертензией (SHR) и линии с нормальным давлением (WKY). Регистрацию артериального давления в исследуемой группе F2 гибридов проводили с помощью имплантированного в брюшную аорту катетера; соединенного с электроманометром СР-01, используя систему компьютерной регистрации параметров гемодинамики "Bioshell" . Результаты измерения артериального давления любезно предоставлены к.б.н. Д.Зарецким и М.Зарецкой.

13. Анализ спектра структурных белков мембраны эритроцитов у F2 гибридов крыс (SHRxWKY).

Эритроциты выделяли из 5 мл гепаринизированной крови по методу Beutler с соавт. [Beutler et al., 1976]. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в концентрации 10 ед/мл. Кровь центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут при +4°С, отбирали плазму и белые клетки, а эритроциты суспендировали в 5-кратном объеме буфера А, содержавшего 150 мМ NaCI, 5 мМ NaH2P04/Na2HP04 рН 8,0. Полученную суспензию снова центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут при +4°С, а затем дважды отмывали в 5-кратном объеме того же буфера. Эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке на колонке с HBSцеллюлозой и снова промывали в тех же условиях. Затем клетки разрушали осмотическим шоком в 20-кратном объеме буфера Б, содержавшего 10 мМ NaH2P04/Na2HP04 pH 8,0 и 1мМ PMSF. Мембраны осаждали при 30 ООО g в течение 15 минут при +4°С и трижды промывали буфером Б. Пробы лиофилизировали и хранили при -40°С. Электрофорез проводили по методу Laemmli [Laemmli, 1970] с линейным градиентом концентрации акриламида 5-25%. Белки окрашивали Кумасси голубым R-250. Денситометрирование электрофореграмм проводили на денситометре Ultrascan XL при 570 нм.

14.Статистическая обработка результатов.

Все данные были получены в нескольких независимых экспериментах. Математическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ Excell 5.0 и Statistica, для каждого параметра определялось среднее -значение (М) и стандартную ошибку среднего (m). Результат выражали как М+т. Достоверность различия между средними определялась по непарному t-критерию Стьюдента. Парные (г), множественные (R) и частные (г') коэффициенты корреляции вычислялись с помощью программы Multiple Regression в пакете программ Statistica.

15. Материалы.

В работе использовались эмбриональная бычья сыворотка, HEPES, L-глутамин, пируват натрия, пенициллин и стрептомицин фирмы HyClone; культуральная среда DMEM, бычий сывороточный альбумин, апираза, карбонил цианид m-хлорфенилгидразон, кальциевый ионофор А23187, дигитонин, генистейн, коллагеназа и эластаза, DIDS, амилорид - фирмы Sigma; Fura-2 AM, dis-C3-(5) и bis-oxonol - фирмы Molecular Probes; 125I-AII и 45Ca2+ - фирмы Amersham; PP1, диадзеин, PD98059, актиномицин D - фирмы Calbiochem; культуральный пластик - фирмы Costar. Циклоспорин А и циклоспорин H был любезно предоставлен профессором

Руегом (U. Ruegg).

Результаты.

1.Циклоспорин А вызывает подъем давления у крыс линии WKY.

На первом этапе нашей работы нам необходимо было убедиться, что мы работаем в рамках модели циклоспорин-зависимой гипертонии. По литературным данным прием циклоспорина А вызывает подъем артериального давления. В наших экспериментах пероральное введение циклоспорина А крысам линии WKY в количестве 20 мг на кг веса животного в день в течение 7 дней вызывало достоверное повышение артериального давления. В таблице 1 приведены значения систолического давления в контрольной группе (группа 1) и в группе животных, получавших циклоспорин А (группа 2), до начала эксперимента и на седьмой день введения препаратов. До начала эксперимента животные обеих групп достоверно не отличались по величине артериального давления, составлявшей 116+ 4 mm Hg и 121+ 6 mm Hg соответственно в группах 1 и 2. В группе №1, получавшей оливковое масло, не наблюдалось достоверных отличий по величине артериального давления до эксперимента и на седьмой день получения препарата. Во второй группе животных, получавших циклоспорин А, артериальное давление достоверно увеличивалось после семи дней приема препарата. До начала эксперимента среднее значение давления в группе №2 составляло 121+ 6 mm Hg, а на седьмой день - 141 + 6 mm Hg.

Частота сердечных сокращений также увеличивалась в результате приема циклоспорина А. На седьмой день эксперимента она составляла в контрольной группе - 335+22 уд/мин., а в группе, получавшей циклоспорин А - 415+19 уд/мин (таблица 1).

Циклоспорин А при длительном приеме вызывает повреждение почек, которое также может приводить к развитию гипертонии [Myers et al., 1988]. В нашем эксперименте нам важно было убедиться, что повышение давления у крыс не связано с нефротоксичностью препарата. Исследование тонких срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, показало, что в почках крыс, получавших циклоспорин А, отсутствуют морфологические проявления нефротоксичности препарата СэА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афанасьева, Галина Вячеславовна, Москва

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М.: Наука, 1994, 288 с.

2. Авдонин П.В., Меньшиков М.Ю., Орлов С.Н., Покудин Н.И., Ткачук В.А. Механизм увеличения Са2+ в цитоплазме тромбоцитов при действии фактора агрегации. Биохимия, 1985, 50:1241-1248.

3. Баскаков М.Б., Ситожевский А.В., Агнаев В.М., Покудин Н.И., Орлов С.Н., Медведев М.А. Высокоселективный хелатор кальция (квин-2) подавляет активацию кальцием К+-каналов. Биол. мембраны 1989, 6:167-186.

4. Бебихов Д.В., Никоненко Т.А., Постнов А.Ю., Постнов Ю.В. Динамическая мутация возможная геномная причина первичной артериальной гипертензии? // Кардиология, 1997, 37(4): 80-86.

5. Бритов А.Н., Кобаль A.M., Орлов С.Н., Покудин Н.И., Сапожков И.И., Гришенков Е.А. Скорость Na/Li противотранспорта эритроцитов и артериальная гипертония: данные популяционного исследования. Кардиология, 1991, № 8, стр. 54-58.

6. Данн М.Д. Почечные простагландины // Почечная эндокринология. Пер. с англ. М.:Медицина 1987, с.11-111.

7. Гулак П.В. // Кардиология 1987, 27(4):89-92.

8. Кушаковский М.С. Гипертоническая болезнь. СПб.: Сотис 1995.

9. Левина Л.И. Сердце при эндокринных заболеваниях. Л.: Медицина, 1989, 263 с.

10. Орлов С.Н., Гулак П.В., Карагодина З.В., Постнов Ю.В. Особенности структурного состояния мембраны эритроцитов крыс со спонтанной генетической гипертензией. Кардиология 1981, т. 21, с. 108-112.

11. Орлов С.Н., Покудин Н.И., Постнов Ю.В. Внутриклеточная концентрация свободного кальция: особенности, выявляемые при спонтанной гипертензии. // Кардиология, 1984, №10:93-98.

12. Петров В.И., Кротковский Г.С., Пальцев М.А. Вазоренальная гипертензия. М.: Медицина, 1984, 152 с.

13. Плиев Б.К., Гурвиц Б.Я. Структура и функции пептидилпролил-цис-транс-изомераз. Биохимия 1999, 64(7):883-898.

14. Покудин Н.И., Орлов С.Н., Постнов Ю.В. Са-насос и Са-АТФ-аза эритроцитов больных гипертонической болезнью: нарушения, выявляемые в мембранах с различным состоянием цитоскелета и в сольюбилизированной Са-АТФ-азе. // Кардиология 1986, 26(3):94-99.

15. Покудин Н.И., Орлов С.Н., Котелевцев Ю.В., Постнов Ю.В. Транспорт одновалентных катионов и кальция в эритроцитах крыс со спонтаннойгипертензией: исследование фракций, обогащенных молодыми и старыми клетками. // Кардиология 1989, 29:83-88.

16. Постнов Ю.В. Первичная гипертензия: клеточный ресетинг и переключение почки. // Кардиология 1993, №8: 7-15.

17. Постнов Ю.В. Почка при хронической артериальной гипертензии: переключение и роль почечной медуллы в его развитии. // Кардиология 1979, 19(12): 30-38.

18. Постнов Ю.В. Патология клеточных мембран и роль почки при гипертонической болезни. // Тер. Архив 1977, 49(10): 45-52.

19. Постнов Ю.В., Орлов С.Н., Покудин Н.И. Нарушение внутриклеточного распределения кальция в жировой ткани при гипертонической болезни. Кардиология, 1984, №10: 93-98.

20. Шулутко Б.И., Перов Ю.Л. Артериальная гипертензия. СПб., 1993, 304 с.

21. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. М., Мир, 1982.

22. Шустов С.Б., Баранов В.Л., Яковлев В.А., Карпов В.А. Артериальные гипертензии. СПб.: Специальная литература 1997, 320 с.

23. Шхвацабая И.К., Кравченко А.Н., Авдонин П.В., Меньшиков М.Ю., Некрасова A.A. Рецептор-зависимая регуляция концентрации ионов Са2+ в цитоплазме тромбоцитов больных гипертонической болезнью. Кардиология, 1988, 28(5):72-7.

24. Шхвацабая И.К., Чихладзе Н.М. Гиперальдостеронизм и артериальная гипертония: диагностика и лечение. М.: Медицина, 1984, 136 с.

25. Яковлев В.А., Шустов С. Б., Шалыгин Л. Д. Околосуточные колебания электролитов, сердечно-сосудистой и эндокринной систем при синдроме Кушинга и гипертонической болезни. // Пробл. Хронобиол. 1991, 2(1,2):26-41.

26. Ahmed, S.S. et al. Oxygen radical formation during cytochrome P450-catalyzed cyclosporine metabolism in rat and human liver microsomes at varying hydrogen ion concentrations. Mol. Cell. Biochem. 1995, 151: 131-140

27. Albers M.W., Williams R.T., Brown E.J., Tanaka A., Hall F.L., Schreiber S.L. FKBP-rapamicin inhibits a cyclin-dependent kinase activity and cyclin D1-cdk association in early G1 of osteosarcoma cell line. // J.Biol.Chem. 1993, 266:22825-22829.

28. Allain F, Durieux S, Denys A, Carpentier M, Spik G Cyclophilin B binding to platelets supports calcium-dependent adhesion to collagen.// Blood 1999 Aug 1;94(3):976-83.

29. Aperia A., Ibarra F., Swenson F.B., Kleee C., Greengard P. Calcineurin mediates alpha-adrenergic stimulation of Na+,K(+)-ATPase activity in renal tubule cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1992, 89(16):7394-7.

30. Arber S., Krause K-H., Caroni P. S-Cyclophilin is retained intracellular via a unique COOH-terminal sequence and colocalizes with the calcium storage protein calreticulin. //J. Cell. Biol. 1992, 116(1): 113-125.

31. Arriza J.L., Weinberger C., Cerelli G., Glaser T.M., Handelin B.L., Housman D.E. Cloning of human mineralcorticoid receptor complementary DNA: structural and functional kinship with the glucocorticoid receptor. // Science 1987, 237:286-275.

32. Afanasjeva G.V., Maksimova N.V., Postnov Y.V. The losartan action on the sodium and potasium current is not mediated by its receptor antagonist properties. Abstract 17th Scientific Meeting of the international Society of Hypertension 7-11 June 1998.

33. Baker E.K., Colley N.C., Zuker G.S. The cyclophilin homologue NinaA functions as a chaperone, forming a stable complex in vivo with its protein target rhodopsin. // EMBO J. 1994, 13:4886-4895

34. Banijamalli H.S., Keur M.H., Paul L.S., Keur H.E. excitation-constriction coupling in rat heart: influence of cyclosporin A. // Cardiovasc. Res. 1993, 27:1845-1854.

35. Bang H, Muller W, Hans M, Brune K, Swandulla D. Activation of Ca2+ signaling in neutrophils by the mast cell-released immunophilin FKBP12 // Proc Natl Acad Sci U S A 1995, 92(8):3435-8

36. Basu A.K., Chosh S., Mohanti P.K., Watlington C.O. Augmented arterial pressureresponses to cyclosporine in spontaneously hypertensive rats. Role of cytochrome P-450 3A. // Hypertension 1994, 24: 480-5.

37. Bennett DL, Cheek TR, Berridge MJ, De Smedt H, Parys JB, Missiaen L, Bootman MD. Expression and function of ryanodine receptors in nonexcitable cells. // J Biol Chem. 1996, 271 (11 ):6356-62.

38. Beutler E., West C., Blume R. Removal of leukocytes and platelets from whole blood. J. Lab. Clin. Med. 1976, 88:328-333.

39. Berk W.C., Vallega G., Muslin A.J., Gordon H.M., Canessa M. Spontaneously hypertensive rats vascular smooth muscle cells in culture exibit increased growth and Na+/H+ exchange. // J. Clin. Invest., 1989, 83, 822-829.

40. Bianchi G., Ferrary P., Trizio P., Ferrandi M., Torielli L., Barber B., Polli E. Red blood cells abnormalities and spontaneous hypertension in rats. Hypertens., 1985, 7:319325.

41. Bierer B.E., Somers P.K., Wandless T.J., Burakoff S.J., Scheiber S.L. Probing immunosupressant action with a nonnatural immunophilin ligand. // Science 1990, 250:556-559.

42. Bolotina V., Omelyanenko V., Heyes B., Ryan U., Bregestovski P. Variation of membrane holesterol alter the kinetics of C2+-dependent K+channels and membrane fluidity in vascular smooth muscle cells. Pfluegers Arch. 1989, v. 415, p. 262-268.

43. Boriskina G.M., Gulak P.V., Postnov Y.V. Phosphoinositide content in the erythrocyte membrane of rats with spontaneous and renal hypertension. // Experentia 1978, 34:744.

44. Boriskina G.M., Postnov Y.V. Binding of H3 dihydroalprenolol to beta adrenoreceptors in adipocytes of spontaneously hypertensive rats and essential hypertension // Experentia, 1982, 38:263-264.

45. Bose S., Weikl T., Bugl H., Buchner J. Chaperone function of hsp90-associated proteins. // Science 1996, 274:1715-1717

46. Bossaller C., Forstermann U., Hertel R., Olbricht C., Rescheke V., Fleck E. Cyclosporin A inhibits endothelium-dependent vasodilatation an vascular prostacyclin production. // Eur. J. Pharmacol. 1989, 165:165-169.

47. Braun W., Kallen J., Mikol V., Walkinshaw M.D. Three-dimensional structure and actions of immunosupressants and their immunophilins. // FASEB J. 1995, 9:63-72.

48. Breuder T., Hemenway C.S., Movva N.R., Cardenas M.E., Heitman J. Calcineurin is essential in cyclosporin A- and FK506-sensitive yeast strains. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1994, 91:5372-5376.

49. Brillantes AB, Ondrias K, Scott A, Kobrinsky E, Ondriasova E, Moschella MC, Jayaraman T, Landers M, Ehrlich BE, Marks AR. Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. // Cell. 1994, 77(4):513-23.

50. Bukoski R.D. Intracellular calcium metabolism in isolated resistance arteries and cultured vascular myocytes of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar-Kioto rats. J. Hypertens. 1990, 8:37-43.

51. Cameron AM, Steiner JP, Sabatini DM, Kaplin AI, Walensky LD, Snyder SH. Immunophilin FK506 binding protein associated with inositol 1,4,5-trisphosphatereceptor modulates calcium flux. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92(5): 1784-8.

52. Cardenas M-E., Zhu D., Heitman J. Molecular mechanisms of immunosupression by cyclosporine, FK506 and rapamicin. // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 1995, 4: 472477.

53. Chen YG, Liu F, Massague J Mechanism of TGFbeta receptor inhibition by FKBP12. // EMBO J 1997, 16(13):3866-76

54. Cho J.H., Musch M.W., DePaoly A.M., Bookstein C.M., Xie Y., Burant C.F. Glukokortikoid regulate Na+/H+ exchanger expression and activity in region and tissue specific manner. // Am J. Physiol. 1994, 267:C796-803.

55. Cirillo M., David-DufilhoM., Devynck M.A. Altered active sodium and calcium transport by heart sarcolemmal membranes from young spontaneously hypertensive rats: modulation by calmodulin. // J. Hypertens., 1984, 2(Suppk3): 485-487.

56. Clipstone N.A., Crabtree G.R. Identification of calcineurin as a key signaling enzyme in T-lymphocyte activation. II Nature 1992, 357:695-697.

57. Clozel M, Endothelin sensitivity and receptor binding in the aorta of spontaneously hypertensive rats. // J.Hypertens 1989 Nov;7(11):913-7.

58. Curtis J.J., Dubovski E., WhelchelJ.D., Luke RgG., Diethelm A.G. Jones P. Cyclosporin in therapeutic doses increases renal allograft vascular resistance. II Lancet 1986,477-479.

59. Dalh L., Heine M., Thompson K. Genetic influence of the kidneys on blood pressure: evidence from chronic renal homogafts in rats with opposite predisposition to hypertension. II Circ. Res. 1974, 34:94-101.

60. Davivson A., Schork N., Jaques B., Kelman A., Sutcliff R., Reid J. Blood pressure in genetically hypertensive rats: influence of sex chromosomes. Hypertens 1995, 26(3):452-450.

61. Davis E.S., Besker A., Heiman J., Hall M.N., Brennan M.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992,89:11169-11173.

62. Denys A, Allain F, Carpentier M, Spik G. Involvement of two classes of binding sites in the interactions of cyclophilin B with peripheral blood T-lymphocytes, Biochem J. 1998, 336 ( Pt 3):689-97.

63. Diederich D., Skopec J., Diederich A., Dai F-X. Cyclosporin produce endothelial dysfunction by increasing production of superoxide. // Hypertension 1994, 23(Pt2):957-961.

64. Diet F., Pratt R., Berry G., Momose M., Gibbon G., Dzau V. Increased accumulation of tissue ACEin human atherosclerotic coronary artery disease.// Circulation 1996, 94(11): 2756-2767.

65. DiJulio DH, Watson EL, Pessah IN, Jacobson KL, Ott SM, Buck ED, Singh JC. Ryanodine receptor type III (Ry3R) identification in mouse parotid acini. Properties and modulation of 3H.ryanodine-binding sites. // J Biol Chem. 1997, 272(25): 15687-96.

66. Doris P.A. Renal proximal tubule sodium transport and genetic mechanism of essential hypertension. // J. Hypertens. 2000, 18:509-519.

67. Duchatelle P., Ohara A., Ling B.N., Kemendy A.E., Kokko P.E., Mastumo P.S. Regulation of renal epithelial sodium channels. II Mol.Cell. Biol. 1992, 114: 27-34.

68. Duina A., Chang H-C., Marsh J., Lindquist S., Gaber R. A Cyclophili function in hsp90-dependent signal transduction. II Science 1996, 274:1713-1715.

69. Dunn M.J. Red blood cell calcium and magnesium: effects upon sodium and potassium transport and cellular morphology. Biochim Biophys Acta. 1974, 352(1 ):97-116.

70. Dzan V.J., Sasamura H., Hein L. Heterogeneity of angiotensin synthetic pathways and receptor subtypes: physiological and pharmacological implications. // J. Hypertens. 1993, 11:S13-S18.

71. Ely D.L., Turner M.E. Hypertension in Spontaneously hypertensive rats is linked to the Y chromosome. // Hypertens. 1990, 16:277-281.

72. Ely D.L., Daneshar H., Turner M.E., Johnson M.L., Salisbury R.L. The hypertensive Y chromosome elevates blood pressure in F11 normotensive rats. // Hypertens. 1993, 21:1071-1075.

73. Emmel E.A., Verweij C.L., Durand D., Higgins K.M., Lacy E., Crabtree G., Cyclocporin A specifically inhibits function of nuclear protein involved in T cell activation. // Science 1989,246:1617-1620.

74. England S.K., Wooldridge T.A., Stekiel W.J., Rusch N.J. Enhanced single channel K+-current in arterial membrane from genetically hypertensive rats. //Am. J. Physiol. 1993, v. 264, p. H1337-H1345.

75. Erne P., Bolli P., Burgisser E., Buhler F.R. Correlation of platelets calcium with blood pressure. Effect of antihypertensive therapy. // N. Engl. J. Med. 1984, 310:1084-1088.

76. Fernandez-Alfonso M., Martorana P., Licka P., van Even P., Trobisch D., Scholkens B.A., Paul M. Early induction of angiotensin l-converting enzyme in rat carotid artery after balloon injury. // Hypertens. 1997, 30(Pt.1): 272-277.

77. Feng JJ, Arendshorst WJ. Enhanced renal vasoconstriction induced by vasopressin in SHR is mediated by V1 receptors. // Am J Physiol 1996; 271(2 Pt 2):F304-13

78. Ferrer-Martinez A., Felipe A., Barselo P., Casado F., Ballarin J., Pastor-Anglada M. Lack of effect of clinical doses of cyclosporin A on erythrocyte Na+/K+-ATPase activity.

79. Clinical Science 1999 97, 283-290

80. Ferrari P., Torielli L., Salardi S., Rizzo A., Bianchi G. Na,K- cotransport in resealed ghosts from erythrocytes of the Milan hypertensive rats. // Biochim. Biophis. Acta 1992, 1111:111-119.

81. Ferrari P., Lovati E., Frey F.J. The role of the 113-hydroxysteroid dexydrogenase type 2 in human hypertension. // J.Hypertens. 2000, 18(3): 241-249.

82. Fraser R.R. Davies D.L., Connel J.M. Hormone and hypertension. // Clin. Endocrinol. .1989,31(6)701-746.

83. Fruman D.A., Klee C., Bierer B.E., Burakoff S.J. Cacineurin phosphatase activity in T-lymphocytes is inhibited by FK506 and cyclosporin A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89:3686-3690.

84. Fruman D.A., Burakoff S.J., Biere B.E. Immunophilins in protein folding and immunosupression. // FASEB J. 1994, 8:391-400.

85. Gende O.A. Chelerythrine inhibits Na+ H+ exchange in platelets of spontaneously hypertensive rats. // Hypertens., 1996, 28:1013-1017.

86. Goldberg H.J., Wong P.Y., Gole E.H., Levy G.A., Scorecki K.L. Dissociation between the immunosupressive activity of cyclosporine derivatives and their effects on intracellular calcium signaling in mesangial cells. //Transplantation 1989, 47:731-733.

87. Gomez-Sanchez G.E. Cushing's syndrome and hypertension. // Hypertension 1986, 8(3):258-264.

88. Grace AA, Barradas MA, Mikhailidis DP, Jeremy JY, Moorhead JF, Sweny P, Dandona P. Cyclosporine A enhances platelet aggregation. Kidney Int 1987, 32(6):889-95

89. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol. Chem., 1985, 260:3440-3450.

90. Guyton A.C. Blood pressure control; special role of kidney and body fluids. // Nature 1991, 252: 1813-1816.

91. Guyton A.C. Circulatory physiology III: arterial pressure and hypertension. Philadelphia, 1980.

92. Hadrava V., Trembly J., Hamet P. Abnormalities in growth characteristics of aortic smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rats. // Hypertens., 1989, 13:589597.

93. Halestrap AP, Connern CP, Griffiths EJ, Kerr PM. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects heartsfrom ischaemia/reperfusion injury. // Mol Cell Biochem. 1997, 174(1-2): 167-72.

94. Hamet P., Pausova Z., Adarichev V., Adaricheva K., Tremblay J. Hypertension: genes and environment. J Hypertens. 1998, 16(4):397-418.

95. Handchumaoher R.E., Harding M.W., Rice J., Drugge R.J. Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A. // Science 1984, 226:544-547.

96. Harding M.W., Handchumacher R.E., Speicher D.W. Isolation and amino acid sequence of cyclophilin. // J.Biol.Chem. 1986, 261:8547-8555.

97. Hiestand P.C. Cyclosporin A modulate the Ca2+ uptake of mitogen-stimulated lymphocytes. //Agents. Actions, 1988, 15:556-561.

98. Horisberger J.D., Rossier B.C. Aldosterone regulation of gene transcription leading to control of ion transport. // Hypertension 1992, 19:221-227.

99. Hsueh W.,A., Baxter J.D. Human prorenin. // Hypertension, 1991, 17:469-479.

100. Hu S.L., Kim H.S., Jeng A.Y. Dual action of endothelin-1 on the Ca-activated K+-channel in smooth muscle cells of porcine coronary artery. // Eur. J. Pharmacol. 1991, 194:31-36.

101. Huse M, Chen YG, Massague J, Kuriyan J. Crystal structure of the cytoplasmic domain of the type I TGF beta receptor in complex with FKBP12. Cell 1999, 96(3):425-36.

102. Husi H., Luyten M.A., Zurini M.G. Mapping of the immunophilin-immunosupressant site of interaction on calcineurin. // J.Biol. Chem. 1994, 269:14199-14204.

103. Inselmann, G. et al. Cyclosporin-A-induced lipid peroxidation in human liver microsomes and its influence on cytochrome P-450. Eur. J. Clin. Invest. 1991, 21: 461465

104. Ishikawa S, Kusaka I, Higashiyama M, Nagasaka S, Saito T, Honda K, Saito T Cellular signaling and proliferative action of AVP in mesangium of SHR: effect of low density lipoprotein. // Kidney Int 1996, 50(5): 1506-14.

105. Itoh H., Mukoyama M., Pratt R.E., Gibbons G.H., Dzau VJ. Multiple autocrine growth factors modulate vascular smooth muscle growth responce to angiotensin II. // J.Clin. Invest. 1993, 91:2268-2274.

106. Iwai J., Kanayama Y., Negoro N., Inoue T., Okamura M., Takeda T. Increased gene expression of angiotensin II type 1A receptor in aortic smooth muscle cells of cyclosporin A-induced hypertensive rats. // J. Hypertens. 1993, 11(Suppl.5):S122-S123.

107. Iwai J., Kanayama Y., Negoro N., Okamura M., Takeda T. Gene expression of endothelin receptors in aortic ceils from cyclosporin-induced hypertensive rats. II Clin. Exp. Pharmacol. Phisiol. 1995, 22:404-409.

108. Jeremy J.Y., Mikhailidis D.P., Dandona P. Adrenergic modulation of vascular prostacyclin (Pgl2) secretion. // Eur. J. Pharmacol. 1985, 114(1):33-40.

109. Jin Y.J., Burakoff S.J. The 25 kDa FK506-binding protein is localized in the nucleus and associated with casein kinase II and nucleolin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:7769-7773.

110. Julius S. Classification of hypertension. In Hypertension, New York: McGraw-Hill Book Company, 1977, p.9-13.

111. Kang P.M., Landan A.J., Eberhardt R.T., Frishmen W.H. Angiotensin II receptor antagonists: a new approach to blocade of the renin-angiotensin system. // Am. Heart J. 1994, 127:1388-1401.

112. Kanji V.K. et al. (1999) Vitamin E suppresses cyclosporine A-induced increase in the urinary excretion of arachidonic acid metabolites including F2-isoprostanes in the rat model. Transplant. Proc. 31, 1724-1728

113. Kemp G.J., Thompson C.H., Radda G.K. Proton efflux from rat skeletal muscle in vivo: changes in hypertension. // Clin. Sci. 1992, 82:489-491.

114. Kern D., Drakenberg T., Wikstrom M., Forsen S., Bang H., Fischer G. The cis/trans intraconversion of the calcium regulating gormone calcitonin is catalyzed by cyclopholin. // FEBS Lett. 1993, 323, 198-202.

115. Kern G., Kern D., Schmid F.X., Fischer G. Reassesment of putative chaperone function of prolyl-cis/trans isomerases. // FEBS Lett. 1994, 348:1145-1148.

116. Kister K, Krefting E., Spieker S., Zidek W., Rahn K.N. Increased Mg2+/Na+exchanger in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats. // J. Hypert. 1997, 15(Suppl4):156

117. Kladis A., Skiner S.L., Whitworth J.A. Characterization of angiotensin peptides in plasma of anephric man. // J Hypertens. 1991, 9: 265-274.

118. Kravtsov G.M., Orlov S.N., Pokudin N.I., Postnov Y.V. Calcium transport in synaptosome and subcellular membrane fraction of brain tissue in spontaneously hypertensive rats. // Clin. Sci. 1983, 65:127-135.

119. Kravtsov G.N., Orlov S.N., Postnov Y.V. Aggregation, membrane potential and cation transport in platelets of spontaneously hypertensive rats. II Pflugers. Arch. 1984, 402: 330-336.

120. Krege J.H., Moyer J S., Langenbach L.L., Peng L., Zhang S.H., Maeda N., Reddick

121. R.L., Smithies O. Angiotensin-converting enzyme gene and atherosclerosis. // Artherioscler. Thromb. Vacs Biol. 1997, 17:1245-1250.

122. Kremer S., Margolis B., Harper P., Skorecki K. Cyclosporin induced alteration in vasopressin signaling in the glomerular mesangial cell. // Clin. Invest. Med. 1989, 12(3):201-206.

123. Kunz J., Henriquez R., Schneider U., Deuter-Reinhard M., Movva N.R., Hall M.N. Target of rapamicin in yeast, TOR2, is an essential phosphatidylnositol kinase homologue required for G1 progression. // Cell 1993, 73:585-596.

124. Kuo S.J., Chung J., Fiorentino D.F., Flanagan W.M., Blenis J., Crabtree J.R. Rapamicin selectively inhibits interleukin-2 activation of p70 S6 kinase. // Nature 1992, 358: 70-73.

125. Kuro M., Hanaoka K., Hiroi Y., Noguchi T., Fujimori Y., Takevaki S., Hayasaka M., et all Salt-sensitive hypertension in transgenetic mice overexpressing Na-proton exchanger. // Circ Res. 1995, 76:148-153.

126. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature 1970, 227:680-681.

127. L'Azou B., Medina J., Frieauff W., Cordier A., Cambar J., Wolf A. In vitro model to sfudy mechanism involved in cyclosporin A-mediated glomerular contraction. Arch. Toxicol. 1999, 73(6):377-45

128. Li W., Handchumacher R.E. Specific interaction of the cyclophilin-cyclosporin complex with the B-subunit of calcineurin. // J.Biol. Chem. 1993, 268: 14040-14044.

129. Lifton R.P., Dluhy R., Powers M., Rich G.M., Cook S., Ulick S., Lalouel J-M. Achimaeric 11 (^-hydroxylase/aldosterone synthase gene causes glucocorticoid-remediable aldosteronism and human hypertension. // Nature 1992, 355(6357):262-265.

130. Lindpaintner K., Ganten D. The cardiac renin-angiotensin system. // Circ. Res. 1991, 68(4):905-921.

131. Little P.J., Weiberg P.L., Cragoe E.J., Bobik A. Dependence of Na+/H+ antiport activation in cultured rat aortic smooth muscle on calmodulin, calcium and ATP. // J. Biol. Chem. 1988, 263:16780-16786.

132. Liu J., Farmer J.D., Lane W.S., Friedman J., Weissman I., Schreiber S.L. Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. // Cell 1991,66:807-815.

133. Lo Russo A., Passaquin A.C., Andre P., Scutella M., Ruegg U.T. Effect of cyclosporine A and analogues on cytosolic calcium and vasoconstriction: Possible lack of relationship to immunosupressive activity. // Br. J. Pharmacol. 1996, 118:885-892.

134. Lowe GM, Hulley CE, Rhodes ES, Young AJ, Bilton RF. Free radical stimulation of tyrosine kinase and phosphatase activity in human peripheral blood mononuclear cells. // Biochem Biophys Res Commun 1998, 7;245(1): 17-22

135. Lo Russo A., Passaquin A.C., Ruegg U.T. Mechanism of enhansed vasoconstrictor hormone action in vascular smooth muscle cells by cyclosporin A. // Br. J. Pharmacol. 1997, 121:248-252.

136. Luchesi P.A., de Roux N., Berk B.C. Na+/H+ exchanger expression in vascular smooth muscle of spontaneously hypertensive rats. // Hypertens., 1994, 24:734-738.

137. Luke R.G. Essential hypertension: a renal disease? // Hypertension 1993, 21(3): 380390.

138. Luna E., Hitt A. Cytosckeleton-plasma membrane interaction. Science, 1992, 258:995-964.

139. Manunta P., Barlassina C., Bianchi G. Adducin in essenchial hypertension. // FEBS Lett. 1998, 430:41-44.

140. Mariller C, Allain F, Kouach M, Spik G. Evidence that human milk isolated cyclophilin -B corresponds to a truncated form. // Biochim Biophys Acta 1996, 1293(1):31-8

141. Meyer-Lehert H., Bokemeyer D., Friedrichs U., Backer A., Kramer H.J. Cellular mechanism of cyclosporin A-mediated side effects: role of endothelin. Kidney Int. 1997(Suppl), 61:S17-S31.

142. Meyer-Lehert H., Schrier R. Potential mechanism of cyclosporin A-induced contraction. // Hypertension 1989, 13:352-360.

143. Maurer G., Loosli H., Schreuer E., Keller B. Disposition of cyclosporine in several animal spicies and man. I. Structural elucidation of its metabolites. // Drug Methab. Dispos. 1984, 12:120-126.

144. Myers B.D., Sibley R., Newton L., Tomlanovich S.J., Boshkov C., Stinson E.,1.etscher J.A., Whitney D.J., Krashni d., Coplon N., Perloth M. The long-term course of cyclosporin-associated chronic nephropathy. Kidney Int. 1988, 33:590-600.

145. Meyer-Lehnert H., Bokemeyer D., Friedrich U., Backer A., Kramer H.J. Cellular mechanism of cyclosporin A associated side effect: role of endothelin. // Kidney Int. 1997, 52(Suppl.1): S27-S31.

146. Moreau P., d'Uscio L.V., Shau S., Takase H., Barton M., Luscher T.F. Angiotensin II increases tissue endothelin and induces vascular hypertrophy. // Circulation 1997, 96(5): 1593-1597.

147. Morice W.G., Brunn G.J., Wiederrecht G., Siekierka J.J., Abraham R.T. Rapamicin-induced inhibition of p34cdc2 kinase activation is associated with Gi/S-phase growth arrest in T-limphocytes. //J.Biol.Chem. 1993, 268:3734-3738.

148. Murasawa S, Matsubara H, Kizima K, Maruyama K, Mori Y, Inada M Glucocorticoids -regulate Via vasopressin receptor expression by increasing mRNA stability in vascular smooth muscle cells.// Hypertension 1995; 26(4):665-9

149. Naik UP, Markell M, Ehrlich YH, Kornecki E. Cyclosporine A enhances agonist-induced aggregation of human platelets by stimulating protein phosphorylation. // Cell Mol Biol Res 1993;39(3):257-64

150. Neylon C.B., Avdonin P.V., Dilley R.J., Larsen M.A., Tkachuk V.A., Bobik A. Different electrical responses to vasoactive agonists jn morphologically distinct smooth muscle cell types. II Circ. Res. 1994, 75:733-741.

151. Nicchita C.V., Kammoun M., Williamson J.R. Cyclosporin augments receptor-mediated cellular fluxes in isolated hepatocytes. // J. Biol. Chem. 1985, 260:1361313618.

152. Nigam S.K., Jin Y.J., Jin M.J., Bush K.T., Bierer B.E., Burakoff S.J. Localisation of FK506-binding protein, FKBP13, to lumen of the endoplasmic reticulum. // Biochem J. 1993,294:511-515.

153. Nishimura H., Hoffman S., Baltatu 0. Angiotensin I converting enzyme and chimase in cardoivascular tissues. // Kidney Int. 1996, 49:S18-S23.

154. Nussenblatt RB. Reduction of cyclosporine dosage with ketoconazole in a patient with birdshot retinochoroidopathy. // Am J Ophthalmol 1998, 126(5):742

155. Ochima T., Matsuura H., Kido K., Fujll H., Masaoka S., Kajijama G. Abnormalities in limphocytes sodium and free calcium in essential hypertension: relation to plasma renin activities. //J. Hypertens. 1986, 4(Suppl.6): S334-S336.

156. O'Keefe S.J., Tamura J., Kincaid R.L., Tocci M.J., O'Neil E.A. FK506 and CsA-sensitive activation of the interleukin-2 promoter by calcineurin. // Nature 1992, 357:692-694.

157. Olson RD, Mushlin PS Doxorubicin cardiotoxicity: analysis of prevailing hypotheses. //>ASEB. J. 1990; 4(13):3076-86

158. Ondrias K, Borgatta L, Kim DH, Ehrlich BE Biphasic effects of doxorubicin on the calcium release channel from sarcoplasmic reticulum of cardiac muscle. // Circ Res 1990, 67(5): 1167-74

159. Orekhov A.N., Kosykh V.A., Repin V.S., Smirnov V.N. Cell proliferation in normal andatherosclerotic human aorta. I. Flow cytofluorimetric determination of cellular deoxyribonucleic acid content. // Lab. Invest. 1983, 48:395-398.

160. Oriji G.K, Keiser H.R. Role of nitric oxide in cyclosporin A induced hypertension. // Hypertens. 1998, 32:849-855.

161. Orlov S.N., Pokudin N.I., Postnov Y.V. Calmodulin-dependent Ca2+ transport in erythrocytes of spontaneously hypertensive rats. // Pflugers Arch. 1983, 397: 54-56.

162. Orlov S.N., Pokudin N.I., Postnov Y.V. Calcium transport in erythrocytes of rats with spontaneous hypertension. // J. Hypertens. 1988, 6: 829-837.

163. Orlov S.N., Postnov I.Y., Pokudin N.I. Na+/H+-exchange and other ion transporting systems in erythrocytes of essential hypertensives and spontaneously hypertensive rats: a comparative analysis. //J. Hypertension 1989; 7:781-788.

164. Orlov S.N., Adragna N.C., Adarichev V.A., Hamet P. Genetic and biochemical determinants of abnormal monovalent cation transport in primary hypertension. // Am. J. Physiol. 1999, 276: C1-C26.

165. Oude P.A., Weernink, Rijksen C. Activation and translocation of c-src to the cytoskeleton by both platelet derived growth factor and epidermal growth factor. // J.Biol.Chem., 1995, v.270(5), p.2264-2267.

166. Park K.S., Kim T.K., Kim D.H. Cyclosporin A treatment alter characteristics of Ca2+-release channel in cardiac sarcoplasmic reticulum. // Am. J. Phisiol. 1999, 276:H865A1. H872. ' "

167. Petrisch C., Wos cholski R., Edelman H.M., Parcer P.J., Ballow L.M. Selective inhibition of p70S6 kinase activation by phosphatydylinositol 3-kinase inhibitors. Eur. J. Biochem. 1995,v. 230, p. 431-438.

168. Pfeilschifter J. Cyclosporin A augments vasoconstrictor-induced rise in intracellular free calcium in rat mesangial cells. // Biochem. Pharmacol. 1988, 37:4205-4210.

169. Pfeilschifter J., Ruegg (J.T. Cyclosporin A augments angiotensin ll-stimulated rise in intracellular free calcium in vascular smooth muscle cells. // Biochem. J. 1987, 248:833-887.

170. Postnov Y.V. An approach to the explanation of cell membrane alteration in primary hypertension. // Hypertension 1990, 15(3}:332-337.

171. Postnov Y.V., Gulak P.V., Orlov S.N. Evidence for altered phosphorilation of erythrocyte membrane skeleton in spontaneously hypertensive rats. // J. Hypertens.1986, 4(Suppl.6):S367-S369)*■

172. Postnov Y.V., Orlov S.N. Cell membrane alteration as a sourse of primary hypertension. J Hypertension 1984, 2:1-6.

173. Postnov Y.V., Orlov S.N., Shevchenko A.S., Adler A.M. Altered sodium permeability, calcium binding and Na-K-ATP-ase activity in the red blood cell membrane in essential hypertension.//Pflugers Arch. 1977, 371:263-269.

174. Postnov Y.V., Orlov S.N. Features of intracellular calcium distribution in the adipose tissue of spontaneously hypertensive rats (SHR). // Exsperentia, 1979, 35:1480-1481.

175. Postnov Y.V., Orlov S.N. Alteration of intracellular calcium distribution in the adipose tissue of human patients with essential hypertension . // Pflugers. Arch. 1980, 388: 8991.

176. Price E.R., Zydowsky L.D., Jin M., Baker C.H., McKeon F.D., Walsh C.T. Human cyclophilin B: a second cyclophilin gene encodes a peptidyl-prolyl isomerase with signal sequence. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1991, 88:1903-1907.

177. Puyo A.M., Levin G.M., Armando 1, Barontini M.B. Free and conjugated plasma catecholamines in pheochromacitoma patients with and without sustained hypertension //Acta Endocrinol. (Kbh) 1986, 113(1) :111-117.

178. Rahn K., Barenbrok M., Hausberg M. The sympatetic nervous system in the pathogenesis of hypertension. //J. Hypertens. 1999,17(Suppl 3):S11-S14.

179. Rapp J.P. A paradigm for identification of primary genetic causes of hyrertension in rats. Hypertens., 1983, v.5(2 Pt2), p. 1198-1203.

180. Rego A., Vargas R., Suarez K.R., Foegh M.L., Ramwell P.W. Mechanism of cyclosporin potentiation of vasoconstriction of the isolated rat mesenteric arterial bed: role of extracellular calcium. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1990, 254:799-808.

181. Resnik T.J. Tkachuk V.A., Erne P., Buhler F.R. Platelets membrane calmodulin-stimulated calcium-adenosine-thriphosphatase: altered activity in essentialhypertension.//Hypertens. 1986, 8:159-166

182. Rettig R, Ganten D, Lang RE, Unger T. The renin-angiotensin system in the central control of blood pressure // Eur Heart J 1987, 8 Suppl B: 129-32.

183. Roche S., Koegl M., Barone M.B.DNA-sintesis induced by some but not all growth factors requires src family protein tyrosine kinase. Mol. Cell. Biol. 1995, v. 15(2), p. 1102-9.

184. Rusch N.J., Hermsmeyer K. Calcium current are altered in the vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats. // Circ. Res., 1988, 63: 977-1002.

185. Sabri A, Byron KL, Samarel AM, Bell J, Lucchesi P. Hydrogen peroxide activates mitogen-activated protein kinases and Na+-H+ exchange in neonatal rat cardiac myocytes. Circ Res 1998, 82(10): 1053-62

186. Sanchez E.R. Hsp56: a novel heat shock protein associated with untransformed steroid receptor complexes. // J. Biol. Chem. 1990, 265, 22067-22070 *

187. Sander M., Lyson T., Thomas G., Victor R. Sympathetic neural mechanisms of cyclosporin-induced hypertension. //Am. J. Hypertens. 1996, 9: 121S-138S.

188. Sealey J.E., Rubbattu S. Prorenin and renin as separate mediators of tissue and circulating systems. //Am. J. Hypertens. 1989, 2:358-366.

189. Scoenbrunner E.R., Mayer S., Tropschug M., Fischer G., Takanashi G., Schmid F.X. Catalysis of protein folding by cyclophilins from different species. // J.Biol. Chem. 1991, 266:3630-3635.

190. Shalling P., Ficher H., Ganten D. Angiotensin and cell growth: a link to cardiovascular hypertrophy. // J. Hypertension 1991, 9: 397-419.

191. Sil P., Sen S. Angiotensin II and myocyte growth. // Hypertension 1997, 30(Pt1):209-216.

192. Sowers J.P. Dopaminergic control of circadian norepinephrin levels in patients with essential hypertension. // J. Clin. Endocrinol Metab. 1981, 53(6): 1133-1137.

193. Spieker C, Heck D., Zidek W., Vetter H. Ca2+ analysis in arteries of spontaneously hypertensive rats by proton induced x-Fay emission. // J. Hypertens. 1985, ^ 3(Suppl.3):S35-S55.

194. Steinmann B., Bruckner P., Superti-FurgaA. Cyclosporin A slows collagen triple-helix formation in vivo: indirect evidence for physiologic role of peptidil-prolyl cis-trans isomerase. // J.Biol.Chem. 1991, 266, 1299-1303.

195. Sturrock N.D., Lang C.C., Struthers A.D. Cyclosporin-induced hypertension precede renal dysfunction and sodium retention in man. // J. Hypertens. 1993,11:t209-1216.

196. Sykes K., Gething M.J., Sambrook J. Prolin isomerases function during heat shock. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:5853-5857.

197. Takeda Y., Miyamori I., Wu P., Yoneda T., Furukawa K., Takeda R. Effect of an endothelin receptor antagonist in rats with cyclosporin-induced hypertension. //

198. Hypertension, 1995, 26:932-936.

199. Tropschug M., Barthelmes I.B., Neupert W. Sensitivity to cyclosporin A is mediated by cyclophilin in Neurospora crassa and Saccharomyces cerevisiae. II Nature 1989, 342:953-955.

200. Tufro-McReddie A., Gomez R.A., NorlingL., Omar A.A., Moore L.C., Kaskel F. Efferct of CsA on the expression of renin and angiotensin type 1 receptor genes in the rat kidney. // Kidney International 1993, 43:615-622.

201. Tumlin, J. A. and Sands, J. M. (1993) Nephron segment-specific inhibition of Na+/K+-ATPase activity by cyclosporin A. Kidney Int. 43, 246-251171

202. Turner S.T., Sing S.F., Erythrocyte sodium transport and probability of having hypertension. // J. Hypertension 1996,14, 829-37.

203. Utara H., Healy В., Stewart R., Bumpus M., Husain A. Angionensin ll-forming pathway in normal and failing human hearts. // Circ. Res. 1990, 66(4):883-890.

204. Valius M., Karlauskas A. Phospholipase c-y1 and phosphotydylinositol 3-kinase are the known stream mediators of the PDGF receptors mitogenic signal. // Cell, 1993, v.73, 321-334.

205. Vickers A., Fischer V., Connors S., Fisher R., Baldeck J., Maurer G., Brendel K. Cyclosporin A metabolism in human liver, kidney, and intestine slices. Comparison to rat and dog slices and human cell lines. // Drug Methab. Dispos. 1992, 20(6):802-809.

206. Vincent M, Kaiser M., Orea V., Lodwick D., Samani N. Hypertension in spontaneouslyhypertensive rats and sex chromosomes. // Hypertens 1994, 23:161-166.

207. White P.C., Dupont J., New M.I., Lieberman E., Hochberg Z., Rosier A. A mutetion in CYP11B1 (Arg-448-His) associated with steroid 11 |3-hydrohylase deficiency in Jews of Maroccan origin // J. Clin. Invest. 1991, 87:1664-1667.

208. Whiting PH, Thomson AW, Blair JT, Simpson JG Experimental cyclosporin A nephrotoxicity. // Br J Exp Pathol 1982, 63(1 ):88-94

209. Yount G.L., Gall C.M., White J.D. Limbic seizures increase cyclophilin mRNA levels in rat hippocampus. Mol. Brain. Res. 1992, 14:139-142.

210. Zhang B.X., Zxao H., Muallem S. Ca2+-dependent kinase and phosphatase control inhositol 1,4,5-triphosphate-mediated Ca2+-release. Modolation by agonist stimulation. II J, biol. Chem. 1993, 268:10997-11001.

211. Zhong, Z. et al. Cyclosporin A increases hypoxia and free radical production in rat kidneys: prevention by dietary glycine. Am. J. Physiol. 1998 275: F595-604

212. Zhong, Z. et al. Dietary glycine and renal denervation prevents cyclosporin A-induced hydroxyl radical production in rat kidney. Mol. Pharmacol. 1999, 56: 455-463

213. Zhu Z., Tepel M., Neusser M., Zidek W. J. Mechanism of the action of angiotensin converting enzyme inhibitors on agonist induced Ca2+ influx. // Vase. Res, 1994, 31:265-270.

Информация о работе

Афанасьева, Галина Вячеславовна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Особенности ионного обмена в клетках при циклоспорин-зависимой гипертонии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы