Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности интеграции tet(M) детерминанты в геном M. hominis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сорока, Александр Евгеньевич

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Молликуты. Общая характеристика класса

1.2 Характеристика Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis

1.2.1 Ureaplasma urealyticum

1.2.2 Mycoplasma hominis

1.3 Антибактериальные препараты, используемые для лечения ^ микоплазмозов и известные механизмы защиты

1.3.1 Основные группы антибактериальных агентов, используемых при ^ j лечении микоплазмозов

1.3.2 Антибиотикорезистентность микоплазм

1.3.3 Транспорт

1.4 Конъюгативные транспозоны бактерий

2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы и вектора

2.2 Антибактериальные препараты

2.3 Культивирование E.coli, минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

2.4 Культивирование М.hominis Н

2.5 Культивирование U. urealyticum

2.6 Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)

2.7 Выделение в культуре клинических изолятов урогенитальных ^ микоплазм

2.8 Выделение ДНК M.hominis, U.urealyticum из клеточной культуры

2.9 Выделение ДНК M.hominis и U.urealyticum из клинических проб

2.10 Выделение ДНК M.hominis и E.coli из отдельных колоний

2.11 Рестрикция

2.12 Southern - гибридизация

2.13 Пульс-электрофорез

2.14 Проведение полимеразной цепной реакции и определение ^ нуклеотидной последовательности продуктов амплификации

2.15 Очистка ПЦР-продукта

2.16 Клонирование ПЦР-продукта

2.17 Определение нуклеотидной последовательности

2.18 RAPD-ПЦР

3. Результаты

3.1 Разработка и использование метода амплификации с произвольным ^ праймером (RAPD) для генотипирования микоплазм

3.2 Определение генетической гетерогенности клинических изолятов M.hominis, выявленной при наблюдении за пациентами с 52 рецидивирующими воспалительными заболеваниями УГТ

3.3 Характеристика процессов формирования резистентности микоплазм ^ и уреаплазм к тетрациклинам

3.4 Определение аллельного полиморфизма (мозаичности) tet(М) у ^ клинических изолятов M.hominis и U.urealyticum

3.5 Анализ вторичной структуры пептидов, кодируемых разичными ^ аллелями гена tet{М) M.hominis и U.urealyticum

3.6 Интеграция гена tet{М) в геном M.hominis и молекулярное ^ картирование конъюгативного транспозона Тп

4. Обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности интеграции tet(M) детерминанты в геном M. hominis"

Микоплазмы (Молликуты) - наиболее просто устроенные прокариотические микроорганизмы с размером генома от 540 до 2200 т.п.н., способные к самостоятельному делению. Геном Mycoplasma genitalium, одного из представителей класса Mollicutes — составляет 580070 п.н., что всего лишь в несколько раз больше генома крупных вирусов (1). Важными особенностями молликут являются их распространенность как паразитов многоклеточных организмов и видоспецифичность по отношению к макроорганизму-хозяину. Персистирование большинства видов микоплазм, в основном, происходит в организме хозяина (2). Микоплазмы при некоторых состояниях макроорганизма способны вызывать выраженные патологические изменения воспалительного характера, нередко осложненные аутоиммунными расстройствами (3). Известны эпидемические вспышки воспалительных инфекционных заболеваний, вызываемых микоплазмами, у сельскохозяйственных животных, птиц, растений, а также у человека (3). Наибольшее значение в клинике заболеваний человека имеют микоплазмозы с локализацией на слизистой респираторного и урогенитального трактов, которые характеризуются аутоиммунными осложнениями и хроническим течением (5, 6, 7). Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, колонизируя слизистые поверхности урогенитального тракта, ассоциированы с развитием сальпингитов, простатитов, уретритов, кольпитов, циститов (8, 9). Для лечения микоплазмозов применяют антибиотики широкого спектра действия. Это приводит к возрастанию уровня резистентности сопутствующей микрофлоры и длительному персистированию микоплазм с развитием осложнений (10, 11, 12). На сегодняшний день накоплен противоречивый материал об индивидуальной устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам. С одной стороны, группы препаратов тетрациклинового, фторхинолонового ряда и макролиды в опытах in vitro оказывают выраженное ингибирующее действие на клетки молликут, с другой -микоплазмы в ходе культивирования на искусственных питательных средах, содержащих антибиотики, быстро приобретают резистентность к различным антибиотикам (10). Применение этих антибактериальных агентов in vivo, в условиях персистирования микоплазм, часто оказывается малоэффективным (10, 11, 12). Кроме того, показано наличие высокой нестабильности их генома, обусловленной разными механизмами (13, 14, 15). Такие противоречивые экспериментальные и медицинские данные четко обозначают одно из приоритетных направлений исследований микоплазм - изучение фундаментальных, эпидемиологических и медицинских аспектов резистентности молликут к применяемым антибактериальным агентам.

В настоящее время для лечения микоплазменной инфекции используются синтетические препараты, действующие на широкий спектр микроорганизмов (16, 17, 18). Дозы препаратов и их длительное применение для воздействия на молликут приводят к развитию побочных эффектов, к числу которых необходимо, прежде всего, отнести системный и местный дисбиоз.

Отсюда следует, что изучение основных механизмов формирования резистентности микоплазм к антибактериальным агентам, применяемым для их эрадикации из организма, в частности - тетрациклинам, является актуальной задачей, подразумевающей фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Целью данной работы являлось комплексное изучение основных последствий переноса fef(M) - гена устойчивости к тетрациклинам - в составе конъюгативного транспозона в клинических тетрациклин-резистентных изолятах Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

Для достижения поставленной цели предполагалось решение следующих задач:

1. Разработка и использование метода амплификации с произвольным праймером (RAPD) для генотипирования микоплазм.

2. Изучение закономерностей формирования тетрациклин-зависимой резистентности в ходе лечения тетрациклинами больных с неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (состав вагинальной микрофлоры, концентрация tet{М) в вагинальном биоценозе).

3. Выявление tet(М) детерминанты в тетрациклин-устойчивых (Тсг) клинических изолятах M.hominis и U.urealyticum.

4. Изучение полиморфизма гена tet(M) в Тсг клинических изолятах M.hominis и U.urealyticum.

5. Молекулярное картирование транспозона Тп916, интегрированного в геном M.hominis.

6. Доказательство интеграции гена tet(M) в геном M.hominis.

Основные положения диссертации были представлены и доложены на всероссийских и международных конференциях: 3-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва,

2000), 11-th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Istanbul,

2001), 4-ая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2001), 5-я Пущинская конференция молодых ученых (Пущино, 2001), IV Международной конференции МАКМАХ "Антимикробная терапия" (Москва, 2001), V Международной конференции МАКМАХ "Антимикробная терапия" (Москва, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи: "Закономерности дрейфа tetM. детерминанты в урогенитальном микробиоценозе, содержащем микоплазмы, при действии антибактериального агента тетрациклинового ряда". А.Е. Тараскина, A.M.

Савичева, Т.А. Акопиан, А.Е. Сорока, К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002, Том 134, № 7, 69-72. "Аллельный полиморфизм TetM детерминанты в клинических изолятах Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, устойчивых к тетрациклинам". А. Е. Сорока, Т.А. Акопиан, А.Е. Тараскина, М.В. Байцур, A.M. Савичева, В.М. Говорун. Генетика, 2002, 11, 14631469. "Генетическая гетерогенность клинических изолятов М.hominis, выявленная при наблюдении за пациентами с рецидивирующими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта". А.Е. Сорока, К.Т. Момыналиев, А.Е. Тараскина, A.M. Савичева, В.М. Говорун. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, Том 132, № 7, 62-65.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сорока, Александр Евгеньевич

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан быстрый, воспроизводимый и эффективный метод молекулярного типирования штаммов M.hominis на основе ПЦР с произвольным праймером (RAPD). RAPD-анализ позволяет выявлять генетическую гетерогенность и проводить генотипирование клинических изолятов М. hominis.

2. При исследовании Тсг клинических изолятов микоплазм и уреаплазм, выделенных от больных, прошедших курс тетрациклиновой терапии, показано, что 10-25% клинических изолятов содержат в составе генома ген tet{М). Исследованы особенности переноса tet(М) детерминанты в урогенитальном биоценозе с участием микоплазм при действии агентов тетрациклинового ряда. Индивидуальная устойчивость к тетрациклину у Тсг tet{М) несущих клинических изолятов варьирует от 0,5 до 32 мкг/мл.

3. Обнаружен и охарактеризован видоспецифичный аллельный полиморфизм tet(М) детерминанты у Тсг клинических изолятов M.hominis и U.urealyticum. Структура гена tet(M) у клинических изолятов микоплазм и уреаплазм имеет оригинальную мозаичность и не похожа на структуры ни одного из ранее описанных аллелей этого гена.

4. Проведено молекулярное картирование транспозона Тп916 - переносчика гена tet(М), в Тсг клинических изолятах M.hominis, при этом в изолятах, несущих один тип аллеля tet(М), отсутствует 5'-концевая область Тп916 длиной 4448 п.н. Области ДНК, фланкирующие 5'- и З'-концы Тп916 не принадлежат геному M.hominis.

5. Продемонстрирована интеграция гена tet{М) в геном микоплазмы на примере tet(М) несущего Тсг изолята M.hominis. Результаты гибридизации свидетельствуют о встраивании одной копии конъюгативного транспозона TnPitf в геном M.hominis.

Вклад соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Научному руководителю - В.М. Говоруну, Т.А. Акопиан, К.Т. Момыналиеву, В.Н. Лазареву и всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместной работе и помощь при написании диссертации.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Новая мозаичность аллелей tet(М), изменения в структуре конъюгативного транспозона, обнаруженные у микоплазм, указывают на интенсивный микроэволюционный процесс, подстраивающий приобретенную детерминанту под работу с молекулярной машиной молликут. Микоплазмам приходится и утилизировать приобретенную ДНК транспозона, содержащего tet(М) - около 2% от всего генома, и "подстраивать" структуру синтезируемого TetM под рибосомальный профиль микоплазм, и обеспечивать жизнеспособность клетки на фоне происходящих молекулярных событий. Считается, что tet(М) детерминанта - основной ген, продукт которого обеспечивает выживаемость микоплазм в присутствии тетрациклинов. Но нельзя забывать и про другие факторы, которые способны влиять на устойчивость. Резистентность к тетрациклинам у микоплазм правильнее рассматривать, как продукт индуцированного адаптогеном перехода всего метаболизма клетки, где инактивация действия тетрациклинов на метаболизм микоплазм может происходить как за счет работы tet(М), так и по другим причинам. Изученные нами примеры новой мозаичности генов tet(M) являются свидетельствами перестроек в структуре приобретенной детерминанты, которые происходят уже после того, как фрагмент транспозона попадает внутрь микоплазменной клетки, а тогда можно говорить об интервале времени, когда детерминанта устойчивости уже приобретена, но эффекта от ее функционирования еще нет. Существует вероятность, что происходит не конъюгативный процесс с участием бактерий-соседей по биоценозу, а более сложная акцепция ДНК, которая модулируется воздействием антибиотиков и микроокружения, определяющего компетентность микоплазм, а также их способность переживать высокие концентрации тетрациклинов.

Описанная до настоящего времени устойчивость микоплазм к Тс, обусловленная приобретением tet(М) детерминанты в составе конъюгативного транспозона, является лишь этапом общей адаптации молликут, следующим за реакциями клетки по модификации проницаемости мембраны к препарату и подготовке клетки микоплазм к естественной трансформации экзогенной ДНК. Клинические наблюдения за персистирующими микоплазмами и уреаплазмами после применения тетрациклинов указывают на то, что количество Тс-устойчивых клинических изолятов микоплазм больше числа выделенных клинических штаммов, несущих tet(М) детерминанту.

В заключение следует сказать, что исследование резистентности молликут к тетрациклинам представляет большой интерес, как с клинической точки зрения, так и при изучении фундаментальных механизмов адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям, включая антибактериальные препараты.

Клинический аспект этой проблемы связан с тем, что препараты широкого спектра действия - тетрациклины, все чаще становятся безальтернативными препаратами антимикробного действия, применяемыми для лечения микоплазмозов.

Сегодня у клиницистов преобладают во многом ошибочные представления об излечивании микоплазмозов при использовании традиционных антибактериальных препаратов. При длительном наблюдении за пациентами в большинстве случаев можно обнаружить манифестацию инфекции, устойчивой к примененным антибактериальным агентам. Помимо того, что 10-25% всех клинических изолятов уреаплазм и микоплазм содержат tet{М) детерминанту и являются конститутивно резистентными к тетрациклинам, существует высокая вероятность того, что микоплазменные клетки в условиях персистирования в организме приобретут альтернативную устойчивость и обеспечат хронизацию инфекционного процесса. Поэтому в настоящее время наблюдается высокий процент осложнений при применении антибактериальной терапии, направленной на элиминацию микоплазм. Устойчивость молликут в силу перечисленных выше обстоятельств оказывается гораздо выше, чем резистентность других представителей микробного биоценоза. Вследствие этого применение антибактериальных агентов нередко заканчивается дисбиотическими расстройствами и грибковыми заболеваниями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сорока, Александр Евгеньевич, Москва

1. Razin S. 1992. Mycoplasma taxonomy and ecology, p. 3-22. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

2. Dybvig K., L.L. Voelker. 1996. Molecular biology of mycoplasmas. Annu. Rev. Microbiol. 50: 25-57.

3. Nocard, Roux. 1990. The microbe of pleuropneumonia. 1896. Rev Infect Dis. Mar-Apr; 12(2): 354-8.

4. Cassell G. H., W.A.J. Clyde, J.K. Davis. 1985. Mycoplasmal respiratory infections, p. 69-106. In S. Razin and M. F. Barile (ed.), The myco-plasmas, vol. IV. Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Or-lando, Fla.

5. Cassell G.H., K.B. Waits, H.L. Watson D.T. Crouse, R. Harasawa. 1993. Ureaplasma urealyticum: role in prematurity and disease in newborns. Clin. Microbiol. Rev. 6: 69-87.

6. Cole B.C., L.R. Washburn, D. Taylor-Robinson. 1985. Mycoplasma-induced arthritis, p. 107-160. In S. Razin and M. F. Barile (ed.), The mycoplasmas, vol. IV. Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Orlando, Fla.

7. Прозоровский C.B., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. 1995. Медицинская микоплазмология. Москва. Медицина. 288 с.

8. Чернова О.А. 1999. Биохимические и молекулярно-биологические аспекты персистенции микоплазм у человека. Успехи биологической химии. 39: 103-140.

9. Говорун В.М., Гущин А.Е., Ладыгина В.Г., Абрамычева Н.Ю, Тополь Ю.Ю. 1998. О формировании резистентности к фторхинолонам у M.hominis и A.laidlawii. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 3:16-19.

10. Гущин А.Е., Таганов К.Д., Тополь Ю.Ю., Говорун В.М. 1998. Использование метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК

11. SSCP) для выявления резистентности M.hominis к фторхинолонам. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 4: 37-39.

12. Bebear С.М., J.M. Bove, С. Bebear, J. Renaudin. 1997. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 269-273

13. Rainey P.B., E.R. Moxon, I.P. Thompson. 1993. Intraclonal polymorphism in bacteria. Adv. Microb. Ecol. 13: 263-300.

14. Wise K. S. 1993. Adaptive surface variation in mycoplasmas. Trends Microbiol. 1: 5963.

15. Wise K.S., D. Yogev, R. Rosengarten. 1992. Antigenic variation, p. 473-489. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

16. Падейская E.H., Яковлев В.П. 1998. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. Логата, Москва.

17. Яковлев С.В. 1997. Клиническая химиотерапия бактериальных инфекций. Ньюадиамед-АО, Москва.

18. Bebear С., В. de Barbeyrac, С.М. Bebear, Н. Renaudin, A. Allery. 1997. New development in diagnostic and treatment of mycoplasma infections in humans. Wien. Klin. Wochenschr. 109: 594 599.

19. Maniloff J. 1996. Mycoplasma phylogeny: correlation with molecular biological and paleontological changes, p. 8. In Abstracts of the 8th IUMS International Congress of Bacteriology.

20. Razin S., Yogev D.F., Naot Y. 1998. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microb. Mol. Biol. Rew. 64: 1094-1156.

21. Baseman J.B., J.G. Tully. 1997. Mycoplasmas: sophisticated, reemerging, and burdened by their notoriety. Emerging Infect. Dis. 3: 21-32.

22. Bove J. M. 1993. Molecular features of mollicutes. Clin. Infect. Dis. 17 (Suppl. 1): S10-S31.

23. Dybvig K. 1990. Mycoplasmal genetics. Annu. Rev. Microbiol. 44: 81-104.

24. Maniloff J., R.N. McElhaney, L.R. Finch, J.B. Baseman (ed.). 1992. Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

25. Razin S., J.G. Tully (ed.). 1995. Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology, vol. I. Molecular characterization. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

26. Rottem S., I.Kahane (ed). 1993. Mycoplasma cell membranes. Subcell. Biochem. 20: 1314.

27. Tully J.G., S. Razin (ed.). 1996. Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology, vol. II. Diagnostic procedures. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

28. Whitcomb R.F., J.G. Tully (ed.). 1989. The mycoplasmas, vol. V. Spiroplasmas, acholeplasmas, and mycoplasmas of plants and arthropods. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

29. Marshall A.J., R.J. Miles, L. Richards. 1995. The phagocytosis of mycoplasmas. J. Med. Microbiol. 43: 239-250.

30. Lo S.-C. 1992. Mycoplasmas in AIDS, p. 525-545. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

31. Jensen J.S., J. Blom, K. Lind. 1994. Intracellular location of Mycoplasma genitalium in cultured Vero cells as demonstrated by electron microscopy. Int. J. Exp. Pathol. 75: 9198.

32. Lo S.C., M.M. Hayes, H. Kotani, P.F. Pierce, D.J. Wear, P.B. Newton III, J.G. Tully, J.W. Shih. 1993. Adhesion onto and invasion intomammalian cells by Mycoplasma penetrans: a newly isolated mycoplasma from patients with AIDS. Mod. Pathol. 6: 276280.

33. Taylor-Robinson D., H.A. Davies, P. Sarathchandra, P.M. Furr. 1991. Intracellular location of mycoplasmas in cultured cells demonstrated by immunocytochemistiy and electron microscopy. Int. J. Exp. Pathol. 72: 705-714.

34. Kirchhoff H. 1992. Motility, p. 289-306. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

35. Williamson D.L., J. Renaudin, J.M. Bove. 1991. Nucleotide sequence of the Spiroplasma citri fibril protein gene. J. Bacteriol. 173: 4353-4362.

36. Baseman J.B., S.P. Reddy, S.F. Dallo. 1996. Interplay between mycoplasma surface proteins, airway cells, and the protean manifestations of mycoplasma-mediated human infections. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154: S137-S144.3738,39.40,41,42.43,44.