Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у молликут

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у молликут"

На правах рукописи

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

ГГо ОД 2 я т ?ю

Говорун Вадим Маркович

Молекулярные механизмы формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у молликут 03.00.04 - Биохимия 03.00.03-Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии и иммуногенетики ГО Физико-химической медицины МЗ РФ.

Научный консультант: академик РАМН, профессор Лопухин Ю.М. Официальные оппоненты:

- академик РАМН, профессор Егоров А.М.

- доктор биологических наук, профессор Борхсениус С.Н.

- доктор биологических наук Соколов Н.Н.

Ведущая организация: Онкологический научный центр РАМ им.Н.Н.Блохина

Защита состоится " 2000 г. в '' часов на заседай!

диссертационного совета (Д 001.10.01) при Институте биомедицинской химии РАМ по адресу: 119832 Москва, ул. Погодинская д.10.

Автореферат разослан "13 " мая 2000 г. с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук ^—^ ¿^рр В С. Былинкина

р^ь^. в о ¿"¿¿у.дзвмч,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Молликугы (микоплазмы) - наименьшие из известных микроорганизмов, способных к самостоятельному делению. Геном одного из представителей класса - Mycoplasma genitalium -всего в несколько раз больше генома крупных вирусов и составляет 580070 п.о. Характерной и очень важной особенностью молликут является их распространенность как паразитов многоклеточных организмов и видоспецифичность по отношению к макроорганизму-хозянну, в котором, в основном, и происходит персистирование большинства видов микоплазм [Razin, S., 1985; Razin, S.,Yogev, D.F., Noat, Y., 1998; Dibvig, K„ 1990; Dibvig, K., Voelker, L.L.,1996; Прозоровский C.B. с соавт., 1995].

Являясь «идеальными» паразитами, микоплазмы при некоторых состояниях макрооргапизма способны вызывать значительные патологические изменения воспалительного характера с формированием длительно персистирующей инфекции, нередко осложненной выраженными аутоиммунными расстройствами [Furr, P.M.,Taylor-Robinson, D.,1987, 1997]. Известны эпидемические вспышки воспалительных инфекционных заболеваний, обусловленных микоплазмами, у сельскохозяйственных животных, птиц, растений, а также у человека [Bove J.M., 1993]. Примером такого рода заболеваний у человека является так называемый «синдром Персидской войны», иоразшшшй контингент американских войск во время недавней войны в Заливе и побудивший дискуссию об использовании микоплазм в качестве бактериологического оружия [Чернова O.A., 1999]. Следует подчеркнуть, что в клинике заболевший человека наибольшую опасность представляют микоплазмозы с преимущественной локализацией в урогенитальном и респираторном трактах, характеризующиеся хроническим течением и аутоиммунными осложнениями. M.hominis и U.urealyticum, колонизируя слизистые поверхности

урогенитального тракта, ассоциированы с развитием сальпингитов, простатитов, уретритов, кольпитов, циститов и др. [Gouiet, М. et al., 1995; Horowitz, S. et al., 1995; Marschall, A.J. et al., 1995, Lo, S.C. et al, 1993].

Применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия для лечения микоплазмозов приводит к возрастанию уровня резистентности сопутствующей микрофлоры и длительному перснстированию микоплазм с развитием всевозможных осложнений [Cummngs, J. et al., 1990].

К настоящему времени в медицинской и научной литературе накоплен противоречивый материал об индивидуальной устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам. С одной стороны, группы препаратов тетрациклинового, фторхинолонового ряда и макролиды в опытах in vitro оказывают выраженное ингибирующее действие на клетки молликут, культивируемые на искусственных питательных средах, с другой — применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции микоплазм в организме-хозяине часто оказывается малоэффективным [Kenny, G.E. et al., 1994; Beber, €., 1997]. Кроме того, показано, что микоплазмы в ходе культивирования на искусственных питательных средах быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным агентам. Этот факт связывают с наличием высокой нестабильности генома вследствие частых событий реорганизации хромосомы по типу «вьпцепление-встраивание». Такие противоречивые экспериментальные и медицинские данные четко обозначают одно из приоритетных направлений исследований микоплазм - изучение фундаментальных, эпидемиологических и медицинских аспектов резистентности молликут к применяемым антибактериальным агентам.

Современный методический арсенал позволяет вынести на первый план исследования этой проблемы вопросы, связанные с механизмами формирования резистентности. Решение этих

задач приведет к пониманию интегральных биохимических особенностей молликут, предопределяющих их повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость и толерантность к факторам защиты организма-хозяина. Следует отметить, что выявление возможных изменений в геноме микоплазм под действием антибактериальных препаратов имеет не только фундаментальное значение. Речь идет и о более важных с точки зрения современной теоретической медицины фактах, которые могут быть положены в основу новых подходов по применению антибиотиков при лечении инфекций, обусловленных микроорганизмами с мембранной и внутриклеточной локализацией, к числу которых, безусловно, относятся и микоплазмы.

В настоящее время для лечения микоплазм енной инфекции используются синтетические препараты, действующие яа широкий спектр микроорганизмов. Дозы препаратов и m длительное применение дня воздействия на молликуты приводят к развитию побочны> эффектов, к числу которых необходимо прежде всего отнести системный и местный дисбиоз.

Одним из эффективных направлений борьбы с внутриклеточными бактериальным! агентами и вирусами является создание генно-инженерных конструкций с так называемым? «суицидными» генами, селективно экспрессируемыми либо в инфицированных клетка? организма-хозяина, либо в самом инфекционном бактериальном агенте с последующим егс разрушением и эффективным представлением антигенов иммунной системе. В последнее врем) изучается возможность применения ДНК-вакцин, позволяющих экспрессировать антигены i клетках макрорганизма. Уже появились первые сообщения о создании ДНК-вакцин протш микоплазм-паразитов сельскохозяйственных животных. Однако, вследствие высоко! гетерогенности и изменчивости антигенных структур молликут необходимой и актуально} является разработка методов генной инженерии и генотерапии, способных проводит)

селективную элиминацию микоплазм из организма-хозяина с одновременным увеличением иммунного ответа на существующие в данный момент варианты антигенных структур. Для решения этих проблем целесообразно использование генов амфифильных пептидов, обладающих выраженной гемолитической и бактерицидной активностью. Применение высокоочшценных препаратов этого ряда в практике ограничено вследствие их высокой гемолитической и токсической активности дш человека и животных и низкой селективности. Контролируемая направленная экспрессия таких пептидов в клетках-мишенях, напротив, может оказаться эффективным инструментом для лечения и защиты макроорганизма от микоплазм и хламидин. Первые работы в этой области уже появились.

Подводя итог вышесказанному, можно сделать вывод, что изучение основных механизмов формирования резистентности микоплазм к антибактериальным агентам, применяемым для их эрадинации из организма, и поиск принципиально новых подходов к лечению микоплазмозов и других инфекционных заболеваний, вызванных внутриклеточным персистированием микроорганизма в клетках хозяина, являются актуальными задачами, подразумевающими фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Целью данной работы являлось комплексное изучение основных закономерностей формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у урогенитальных микоплазм (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) и Acholeplasma laidlawii и разработка теоретических основ применения рекомбинантных генов амфипатических пептидов для возможной генотералии микоплазмозов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести клонирование и структурный анализ генов AJaidlawii РО-8В (gyrA, gyrB, parC, parE), продукты которых являются потенциальными мишевями для действия антибактериальных препаратов.

2. Получить в лабораторных условиях серию лабораторных мутантов M.hominis, A.laildawii, U.urealyticum, устойчивых к действию препаратов фторхинолонового и тетрациклинового ряда

3. Определить мутации в QRDR генов gyrA, gyrB, parC и ратЕ в клетках микоплазм.

4. Выявить закономерности формирования резистентности к фторхинолонам и тетрацик-линам у микоплазм, происходящего на уровне транспортных мембранных систем, и определить основные биохимические характеристики, обуславливающие образование устойчивых клеток в ходе применения антибактериальных агентов в условиях лабораторного культивирования.

5. Выявить закономерности переноса детерминанты устойчивости к тетрациклину tetM из микроорганизмов биоценоза влагалища в клетки урогенитальных микоплазм.

6. Охарактеризовать генетические вариации структуры гена tetM (мозаичность) у микоплазм.

7. Продемонстрировать принципиальную возможность использования рекомбинантных плазмид, содержащих экспрессирукяцую ген меллитина конструкцию, для подавления развития молликут в культуре клеток линии 293, HeLa, а также при культивировании микоплазм в лабораторных условиях.

Научная новизна работы

На момент начала выполнения работы наши представления о механизмах формирования устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам ограничивались микробиологической характеристикой отдельных резистентных клинических изолятов и скринингом

антибактериальных препаратов нового поколения т \itro. Исследуя молекулярные события, происходящие на уровне генов-мишеней для действия фторхинолонов и тетрациклинов, впервые удалось установить, что микоплазмы, несмотря на ограниченную информационную емкость генома, обладают выраженным адаптационным потенциалом, обеспечивающим развитие устойчивости к ангабакгериальным агентам на популяциошкж уровне. Так было установлено, что первым этапом адаптации микоплазм к использованным в работе антибактериальным агентам является ограничение накопления препарата вследствии увеличения микровязкости плазматической мембраны и встраивания экзогенных стеролов. При дальнейшем культивировании с повышающимися концентрациями антибиотиков происходит формирование мутаций в генах-мишенях, кодирующих топоизомеразу IV и ДНК-гиразу, либо захват конъюгативного транспозона Тп916, содержащего (е(М детерминанту, который, вероятно, осуществляется при помощи эукариотической клетки. На основании обширных клинических пролонгированных наблюдений за пациентами, инфицированными микоплазмами и уреаплазмами, и изучения феноменологии формирования устойчивости к Тс и ФХ в условиях лабораторного культивирования сделан вывод о низкой эффективности используемых препаратов и принципиальной необходимости поиска путей альтернативного лечепия микоплазмозов. В заключительной части работы при использовании рекомбинантных плазмид, содержащих ген амфилатического линейного пептида - меллигина, обладающего выраженной бактерицидной активностью, под контролем регулируемых промоторов, впервые продемонстрирована возможность удаления микоплазм как из инфицированных клеточных линий, так и из молликут, выращенных на жидкой питательной среде.

Практическая ценность полученных результатов

С целью эффективного мониторинга за микоплазменной инфекцией и сопутствующими инфекционными агентами в клинике разработаны, утверждены и внедрены в практику отечественного здравоохранения наборы реагентов для выявления мнкоплазм, уреаплазм, хламидий, вирусов герпес-группы, трихомонад, гарднерелл с использованием метода полимеразной цепной реакции ТУ-9398-405-17253567-96, ТУ-9398-410-17253567-97, ТУ-9398-408-17253567-97, ТУ-9398-409-17253567-97. Предложены методы быстрой идентификации устойчивости микоплазм к фторхинолонам и тетрациклинам. Разработаны методы идентификации биоваров и сероваров уреаплазм в клинических образцах, а также эффективные методы определения генетической вариабельности клинических изолятов микоплазм с использованием амплификации со случайными праймерами. Предложен новый метод трансформации клеток M.hominis элеетропорацией плазмидой р.\М120, содержащей ген tetM. Основные положения, выносимые на защиту

1. Лабораторные штаммы A.laidlaaii, M.hominis, U.urealyticum обладают закономерной способностью к формированию устойчивых к фторхинолонам и тетрациклинам мутантов при постепенном повышении концентрации антибактериальных агентов в среде культивирования.

2. Формирование устойчивости к фторхинолонам у микоплазм и ахолеплазм сопровождается появлением мутаций в генах топоизомераз II типа, причем первичной мишенью для мутагенеза является топоизомераза IV, а уже затем мутации обнаруживаются в QRDR ДНК-гиразы.

3. Изменениям в QRDR генов топоизомераз предшествуют метаболические перестройки плазматической мембраны, заключающиеся в накоплении стеролов, увеличении

микровязкости, а у ахолеплазм и в ингибировании синтеза каротиноидных пигментов. Эти изменения приводят к ограничению накопления антибактериальных агентов. При этом скорости активного выхода антибактериальных препаратов (эффлюкса) из клеток лабораторных штаммов ахолеплазм, микоплазм и мутантов не отличаются.

4. Обнаруженные в ходе клинической части исследования гены устойчивости к тетрациклинам ШЪА у микоплазм и уреаплазм обладают уникальной аллельной микрогетерогенностью (мозаичностью) по сравнению с описанными ранее другими генами этого семейства. Лабораторные эксперименты с переносом гена устойчивости к тетрациклину tetM в клетки микоплазм в присутствии эукариотических клеток указывают на возможность горизонтального переноса с участием клетки-хозяина.

5. Высокий уровень устойчивости к тетрациклинам у клинических изолятов микоплазм и уреаплазм связан с переносом tetM детерминанты и реализацией метаболических неспецифических механизмов устойчивости к тетрациклинам и фторхинолонам, обусловленных взаимодействием клетки-хозяина и микоплазмы.

6. Использование рекомбинантных плазмид, содержащих ген меллитина, для селективной экспрессии в микоплазмах и для регулируемой экспрессии в эукариотических клетках, инфицированных микоплазмами, приводит к эффективному удалению молликутов.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на итоговых конференциях НИИ ФХМ (1996, 1997, 1998, 1999 гг.), на 1-й, 2-й, 3-й Всероссийских научно-практических конференциях "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (1996,1998, 2000 гг.) в г.Сочи и Москве, на IV Международной конференции

IT+ME'98 (май-июнь 1998г.) в г. Гурзуфе, на международном конгрессе по резистентности к антимикробным препаратам; в Монте-Карло (октябрь 1999г.), на межлабораторном семинаре НИИ ФХМ, на международном симпозиуме «гепы-кандидаты здоровья животных» в Ростоке (август 1999г.)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 40 работ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты, их обсуждение и выводы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 50 рисунками; библиографический указатель включает 525 публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы и векторы

В работе использовали штамм M.hominis Н-34, любезно предоставленный профессором И.В. Раковской (НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Б.Ф. Гамалеи, Москва); штамм A.laidlawii PG-8B, клинические штаммы U.urealyticum, штамм Е. coli XL-blue, плазмидный вектор pGEM-T (Promega, USA); плазмидный вектор pUC19 (Fermentas, Москва); плазмиду рАМ 120, содержащую транспозон Тп 916, любезно предоставленную профессором Clewell (США); плазмидные векторы pRc/CMV («Invitrogen»); pBI-EGFP ("Clontech").

Антибактериальные препараты

В работе использовали антибактериальные препараты широкого спектра действия -ципрофлоксацин (Cfl) (Bayer, Leverkusen, Germany), офлоксацин (Ofl) (Hoechst, Germany), ломефлоксацин (Lfl) (Searle, France), тетрациклин, доксициклин (Sigma).

Культивирование E.coli, минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

Культивирование E.coli штамм XL-Blue и минипрепаративное выделение плазмидной ДНК проводили описанными методами [Мазин с соавт., 1990; Sambrook, J. et al., 1989].

Культивирование лшкоплазм

M.hominis Н-34, культивировали как описано (Говорун с соавт., 1998]. Отдельные колонии M.hominis получали, высевая клеточную культуру в разведениях 10"2,10'3, 10"4 на 1.2% агар (Difco), приготовленный на культуральной среде.

Acholeplasma laidlawii PG-8B выращивали на модифицированной среде Эдварда.

U.urealyticum выращивали на среде, содержащей Brain Heart Infusion 29.2г, бактотриптон 3.2г, дрожжевой экстракт 1г, хлорид натрия 1.3г. на 1л, 10об% лошадинной сыворотки, 1об% дрожжевого экстракта, 0,1 об% L-цистеина HCl, 1 мкг/мл амфотерицина В pH 6.2.

Культивирование проводили в течение 24-48 ч. при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5%С02.

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)

При определении МИК для клеток M.hominis, U.urealyticum и A.laidlawii исходную клеточную культуру пересевали в жидкую питательную среду с различными концентрациями препаратов - Cfl: 0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.75; 1.0; 1.5; 3.0; 5.0 мкг/мл; Lfl: с концентрацией 0.5; 1.0; 5.0; 10; 20мкг/мл; Oft 0.5; 1.0; 5.0; 10; 20мкг/мл; Тс: 0.25; 0.5; 0.75; 1.0; 1.5; 2.0; 4.0; 8.0; 12 мкг/мл. Минимальной ингибирующей концентрацией считали наименьшую концентрацию антибиотика, при которой не происходило изменения окраски индикатора.

Получение резистентных к фторхинолонам и тетрациклинам штаммов микоплазм

Для получения ципрофлоксацин- ломефлоксацин- и офлоксацин-резистентных клонов культуру микоплазмы, полученную из единичных колоний лабораторных штаммов, последовательно пересевали в жидкую питательную среду с возрастающей концентрацией антибактериальных агентов. Культивирование проводили в объеме 1 мл, внося 100 мкл инокулята в 900 мкл свежей среды, содержащей один из трех препаратов: Cfl, Ofl, Lfl в соответствующей концентрации. Начиная со значения МИК, клетки микоплазм и ахолеплазм пересевали в среду, содержащую Cfl в концентрации 1 мкг/мл. С каждым последующим пассажем концентрацию препарата увеличивали на 1 мкг/мл, пока она не достигала 10 мкг/мл. После этого клетки последовательно пересевали в среду с концентрациями СИ соответственно: 50, 100, 150, 200, 250, ЗООмкг/мл для культуры M.hominis и 15, 20, 50 мкг/мл для культуры A.laidlawii. Тот же алгоритм использовали при получении клеток M.hominis и A.laidlawii, резистентных к Ofl и Lfl. Аналогичную процедуру использовали при получении Тск-мутантов ахолеплазм, микоплазм и уреаплазм.

Культивирование адаптированных к фторхинолонам штаммов M.hominis при постоянных концентрациях антибиотиков

Культуры M.hominis, полученные при селекции в жидкой среде в присутствии ФХ, пересевали в среду, содержащую антибактериальный препарат в концентрации равной той, при которой эта культура была получена. В течение 5-пассажей концентрация препарата в культуральной среде не менялась.

Культивирование клинических изолятов M.honùnis, U.urealyticum Соскобы клеток го уретры или цервикального канала помещали в пробирки типа Eppendorf, содержащие 1 мл культуральной среды BJH дня выделения микоплазм или среды определенного состава, описанной в разделе, посвященном культивированию уреаплазм. Частицы эпителия осаждали центрифугированием при 2.500 об/мин в течение 3 мин. Супернатант переносили в другие пробирки и концентрировали микоплазмы центрифугированием при 16.000 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мкл культуральной среды, содержащей амфотерицин Б 1 мкг/мл и ампициллин 500 ед/мл, инкубировали в течение 24 ч. при 37°С и 25 мкл культуры пересевали в 200 мкл свежей среды.

Для дальнейшего культивирования и получения резистентных к ФХ, Тс клинических изолятов использовали приемы работы, описанные выше для лабораторного штамма М. hominis Н-34.

Выделение ДНК M.hominis, U.urealyticum, A.laidlawii из клеточной культуры

ДНК M.hominis, U.urealyticum, A.laidlawii выделяли, используя модифицированный метод [Boom, R. et al., 1990].

Выделение ДНК M.hominis, AAaidlawii и E.coli нз отдельных колоний

Отдельные колонии переносили в 50 мкл ТЕ-буфера, используя наконечник для микропипетки. Клетки разрушали, инкубируя при 95°С 5 мин., и 5 мкл полученного клеточного лизата использовали для проведения ПЦР.

Определение нуклеотидной последовательности QRDR gyrA M.hominis Н-34 Для определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена gyrA использовали данные GeneBank Nucleotide Seqúense Databases и проводили сравнительный анализ QRDR генов gyrA ряда микроорганизмов: S.aureus (D10489), N.gonorrhoeae (U08817), E.coli (Х06744), M.tuberculosis (L27512), R.prowazekii (U02931), К.pneumoniae (X16817), P.aeruginosa (L29417), M.pneumoniae (X53555), M.genitalium (U09251). Фланкирующие этот район консервативные области использовали для подбора вырождепных внешних праймеров MAD1 и MARI.

100 нг амплифицированного (режим амплификации и процедура очистки ампликонов описаны ниже) с помощью праймеров МАШ и MARI фрагмента ДНК M.hominis встраивали в pGEM-T вектор и трансформировали в E.coli, штамм XL Blue, согласно инструкции, прилагаемой к набору. Определение нуклеотидной последовательности клонированного ПЦР-фрагмента проводили с использованием "Sequenase Version 2.0 DNA Sequensing Kit" (USB).

После определения нуклеотидной последовательности этого фрагмента были выбраны внутренние специфические для M.hominis ираймеры MAD2 и MAR2, фланкирующие QRDR-регион. Эти праймеры были использованы для секвенирования QRDR gyrA.

Проведение полимеразной цепной реакции и определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации Условия амплификации, описанные ниже, были использованы для всех пар праймеров. ПЦР проводили в объеме 50 мкл в реакционной смеси, состоящей из 10 мМ Tris HCl, pH 8.3,50 мМ KCl, 2 мМ МцСЬ, 2.5 мкМ каждого дНТФ (Promega), 0.5 мкМ каждого праймера, 1Ед Год-полимеразы (Promega), 50 нг ДНК M.hominis, A.laidlawii или U.urealyticum. Режим реакции в программируемом термостате Gene Amp 2400 (Perkin Elmer) следующий: 94°C -5 сек, 50°C- 10 сек, 72°C -15 сек, количество циклов-30. После амплификации продукт идентифицировали в 2.5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.

Продукт амплификации в объеме 30 мкл очищали, используя "Wizard PCR Preps DNA Purification System" (Promega). Определение нуклеотидной последовательности ампликонов проводили, используя "fmol DNA Cycle Sequensing System" (Promega) согласно инструкциям, прилагаемым к наборам.

Анализ копформационного полиморфизма одпоцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) Для SSCP-анализа один из праймеров метили [у-Р33]-АТФ с использованием Т4-полинуклеотидкиназы (Promega). После проведения ПЦР 5 мкл продукта смешивали с 5 мкл денатурирующего раствора, содержащего 95 % формамида, 0.05 % бромфенола, 0.05 % ксиленцианола Пробы инкубировали при 943С, 2 мин.и охлаждали во льду 5 мин. Электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле (0.4 мм х 210 мм х 200 мм, акриламид/бисакриламид -37.5:1, 10% глицерин, 0.5х TBE) при 10°С 12 ч. при постоянном токе 20 мА, с использованием Macrophor sequensing system (Pharmacia LKB Biotechnology). Гель высушивали па стеклянной пластине и экспонировали с рентгеновской пленкой «Retina» в течение 12 ч.

Клонирование ПЦР-продукта Клонирование ПЦР-продукта в вектор pCR®, входящий в состав ТА Cloning® Kit (Invitrogen®, USA) проводили согласно инструкциям, прилагаемым фирмой-производителем с последующей трансформацией компетентных клеток E.coli.

Пульс-электрофорез

Пульс-электрофорез проводили на приборе CHEF-DR®III фирмы Bio-Rad (США). В зависимости от размера разделяемых молекул ДНК программа пульс-электрофореза отличалась временем пульса, напряжением, общим временем проведения пульс-электрофореза. По его окончании агарозный гель окрашивали бромистым этидием. Все манипуляции с биологическим материалом при подготовке образцов осуществляли согласно инструкциям фирмы-производителя.

RAPD-ПЦР

RAPD проводили в объеме 30 мкл в реакционной смеси, содержащей 66 мМ трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2S04, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл желатина, 0,1% Tweeti 20, 200 мкМ каждого дНТФ, 10 пмолей праймера МС7, 2 ед. Гяу-полимеразы (Fermentas), 50 нг ДНК М. hominis. Реакцию проводили в программируемом термостате Терцик МС-2 в режиме: 93°С - 10 сек, 36°С - 45 сек, 72°С - 90 сек, количество циклов - 35.

Разделение и идентификацию продуктов реакции осуществляли в 1,5% агарозном геле, в ТАЕ буфере (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ CHjCOONa, 5 мМ ЭДГА), который окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг^мл). Электрофорез проводили с маркером - GeneRuIIer™ 1 kb DNA Ladder, при 150 В в Sub-Gell GT Agarose Gel Electrophoresis Systems (BioRad). Результаты документировали с помощью видеосистемы Gel Doc 1000 и обрабатывали с помощью компьютерной программы Molecular Analyst Software (BioRad).

Типирование клинических изолятов U. urealyticum на биовары

Для типирования использовали описанную трехпраймерную систему [Безруков с соавт.,

1998].

Детекция серотипов 1,3 и 6.

Определение серотипов 1, 3 и 6 U. urealyticum проводили как описано ранее [Knox, C.L. et al., 1998].

Определение накопления и выведения бромистого этидия клетками M.hominis и

A.laiálawii

За накоплением и выбросом бромистого этидия клетками ахолеплазмы и микоплазмы следили по изменению флуоресценции. Бромистый этидий (0.5мкг/мл) вносили непосредственно в среду роста культуры клеток, находящейся в логарифмической фазе, после необходимой экспозиции клетки осаждали, ресуспендировали в буфере 50тМ Трис-HCl (pH 7.0) и измеряли увеличение флуоресценции этидия на спекгрофлуориметре Hitachi, MPF 4000 (Япония) при длинах волн: возбуждения 530 им и поглощения 600 нм. Для наблюдения выхода бромистого этидия суспензию клеток сначала выдерживали с бромистым этидием в течение часа, затем осаждали центрифугированием, осадок ресуспендировали в свежей среде культивирования. Об эффлюксе этидия судили по уменьшению флуоресценции осажденных клеток. Эффекты влияния резерпина (50мкг/мл), карбоншщианид-фенилгидразона (СССР) (0.2тМ), верапамила (0.1 тМ), валиномицина (1.25цМ) и моненсина (1рМ) на уровень накопления бромистого этидия определяли аналогично, добавляя их непосредственно в среду культивирования, при этом используемые концентрации были меньше, чем МИК этих веществ, определенных для A.laicOawii PG-8B и Mhominis Н-34.

Представленные экспериментальные данные являются усредненными по трем измерениям величинами, ошибка во всех случаях не превышала 5%.

Определение накопления [3Н]-ципрофлоксацина клетками M.hominis

Для определения накопления фторхинолонов в качестве субстрата был выбран ципрофлоксацин, третированный в реакции водородного обмена с удельной активностью 108имп/мин мкмоль. После инкубации клеток M.hominis в культуральной среде, содержащей [3Н]-Cfl клетки, отмывали от несдязавшейся метки в многоканальной системе MilliPore MainFold и считали радиоактивность в сцинцилляторе Брея на счепшке SL 30 Inntertechnique. Удельную активность рассчитывали как отношение числа ямп/мин на мг белка или мкг ДНК.

Трансфекция клеток линии HeLa с использованием Effectene Transfection Reagent

(QIAGEN)

За 24 ч до проведения трансфекцин клетки высевали на 24-х луночный планшет в количестве ~1-Зх104 кл/лунку. Клетки инкубировали при 37 °С и 5% С02. На момент грансфекции монослой клеток составлял 40-80%. Плазмидную ДНК (0.1-1мкг) растворяли в 50 мкл Binding Buffer (lOmM HEPES, 0.9% NaCl, pH 7.4), добавляли 3 мкл раствора Enchancer Reagent. После тщательного перемешивания смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре. В отдельной пробирке готовили смесь из 50 мкл Binding Buffer и 5 мкл Effectene Transfection Reagent. Растворы объединяли, тщательно перемешивали, суммарный раствор инкубировали 10-15 мин при комнатной температуре и добавляли к клеткам.

Выделение плазматических мембран клеток микоплазм Для выделения плазматических мембран использовали метод осмотического лизиса в комбинации с ультразвуковой обработкой суспензии клеток. После получения биомассы клетки переводили в дистиллированную воду и озвучивали при 44КГц в течение 3 сек. при мощности 20мЗТ. После озвучивания мембрапы отделяли от неразрушенных клеток дифференциальпым центрифугированием при 10.000g в течение Юмин. Фракцию плазматических мебран получали центрифугированием при 105.000g в течение 1 часа при +4°С.

Определение трансмембранного потенциала клеток A.laidlawii

Трансмембранный потенциал определяли с использованием флуоресцентного красителя-3,3'-дипропил-2,2'-тиодикарбоцианин иодит [DiSC3(5)] (Molecular Probes) по описанному методу, [Schummer, U., Schiefer, H., 1995].

Определение липидного состава плазматической мембраны микоплазм Определение изменений в липидном составе микоплазм проводили с использованием ТСХ и ВЭЖХ в описанных системах, [Говорун с соавт., 1998].

Электрофорез в ПААГ Электрофоретическое разделение белков плазматической мембраны проводили в системе Лэммли [Laemmli U.K., 1970]. После разделения белков в 10% ПААГ, окрашивали гели азотнокислым серебром или Кумасси G-250R [Sambrook J.,et al. 1989].

Определение микровязкости плазматической мебраны микоплазм Микровязкость плазматической мембраны определяли, используя метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). В качестве парамагнитного зонда применяли 5-доксилстеариновую кислоту (Sigma). Запись спектров ЭПР проводилась на радиоспектрометре JES-FE2XG (Jeol, Япония), оснащенном приставкой для термостатирования образцов. Условия записи спектров: микроволновая мощность - 10мВТ; частота ВЧ-модуляции - ЮОкГц; амплитуда ВЧ-модуляции -1 и 4 Гс; скорость сканирования 6,25 Гс/мин, постоянная времени фильтра -0,3с; температура образца -37°С. Из спектров ЭПР рассчитывали параметр упорядоченности S.

Получение клеточных линий, стабильна экспрессирующих трансактиваторные белки tTA

и rtTA

Клетки линии HeLa рассевали на 6-ти см чашки. К моменту трансфекции монослой составлял 80-85%. Трансфекцию плазмидами pTet-On и pTet-Off (Clontech) проводили с использованием Effectene Transfection Reagent (Qiagen) Через 48 ч.после трансфекции к клеткам добавляли селективную среду (lxDMEM, 400 мкг/мл G-418 (Gibco)). G-418-устойчивые клоны были отобраны и размножены [Santerre, R.F.et aL, 1991].

Получение поливалентных антител к препарату мембран М. hominis

Цикл иммунизации состоял из трех подкожных инъекций препаратами мембран M.hominis из расчета 1мг белка на одну инъекцию с добавлением в качестве адыованта 2% раствора алюмокалиевых квасцов. Вторую инъекцию проводили через 9 дней, третью - через 7 дней после второй. Реиммунизацию проводили без адыованта путем однократной подкожной инъекции 1 мг препарата с интервалами в полтора месяца. Забор крови осуществляли на 7-й и 12-й дни после введения антигенного материала из краевой вены уха в количестве 50-70 мл.

После отделения кровяного сгустка проводили истощение полученных кроличьих антисывороток средой для культивирования мнкоплазм (BHI, "Difco") под контролем иммуноэлектрофоретического анализа на полноту истощения (среда содержала лошадинную сыворотку). Поливалентные антитела к плазматическим мембранам микоплазм получали методом ионнообменной хроматографии на DEAE-Sephadex А-50 в 0.0175М фосфатном буфере, pH 6.3 с последующим двукратным переосаждением сульфатом аммония (1.35М) и диализом против дистиллированной воды с последующей лиофилизацией. Полученный лиофилизат представлял собой преимущественно фракцию IgG ["Иммунологические методы", Медицина, 1987].

Маркирование сыворотки FITC

Перед маркированием препарата сыворотки против мембран М hominis иммуноглобулины двукратно переосаждали сульфатом аммония, и осадок в течение ночи диализовали при 4 "С против физ.раствора. К диализованному препарату добавляли раствор 0.5М бикарбоната натрия, pH 9.5.

ИТС (Sigma) растворяли в карбонатном буфере (на 1 мг FITC - 2 мл буфера), добавляли к препарату сыворотки, конъюгирование проводили в течение 18 ч. в темноте при 4 °С при покачивании. После окончания конъюгирования избыток красителя удаляли гель-фильтрацией на колонке с Sephadex G-25.

Влияние экспрессии меллитина в линиях клеток HeLa/tTA и HeLa/rtTA на инфекцию

M.hominis

Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии

Клетки линий HeLa/tTA и HeLa/rtTA выращивали на покровных стеклах. Через 48 ч. после трансфекции и заражения ростовую среду сливали, клетки промывали 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали метанолом. После фиксации клетки промывали 1 раз PBS, добавляли 30 мкл сыворотки, конъюгированной с FITC (разведение сыворотки 1:16). Стекла с клетками инкубировали во влажной камере 15 мин при 37 °С при покачивании, промывали 1 раз PBS» подсушивали. Для микроскопии использовали микроскоп МБИ-15, длина волны возбуждения 485 нм.

Учет результатов с использованием плашечного флуориметра "AscenfLabsystems

Клетки линий HeLa/tTA и HeLa/rtTA выращивали в 24-х луночном планшете. Через 48 ч. после трансфекции и заражения ростовую среду сливали и клетки промывали 2 раза PBS. В

каждую лунку добавляли 170 мкл PBS и 30 мкл сыворотки, конъюгированной с FITC (разведение сыворотки 1:16). Клетки инкубировали во влажной камере 15 мин. при 37 °С при покачивании и осторожно переносили в 1,5 мл пробирку. К клеткам добавляли 600 мкл PBS. Суспензию клеток центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин при комнатной температуре. После удалепия супернатанта к осадку добавляли 600 мкл PBS, клетки ресуспендировали и центрифугировали при том же режиме. Клетки ресуспендировали в 200 мкл PBS и переносили в плашку для измерения. Измерение проводили при длине волны возбуждающего света 485нм и эмиссия 538 нм на плашечном флуориметре "Ascent".

Результаты исследований и их обсуждение Резистентность к фторхинолонам

На основании многочисленных экспериментальных данных современные представления, касающиеся резистентности бактерий к фторхинолонам, включают две группы механизмов: спонтанные мутации, возникающие в QRDR генов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, и изменение транспорта препаратов за счет снижения проницаемости клеточной мембраны и/или увеличения выброса препарата из клетки [Hooper, D.C., 1998; Saier, M.HJr. et al., 1998, Maxwell, A., 1992]. В нашей работе мы детально исследовали закономерности формирования мутаций в генах топоизомераз II типа и изменения в работе транспортных систем молликут.

Выбор алгоритма селекции явился одним из важных этапов работы. Описанные в литературе подходы к селекции микроорганизмов в присутствии антимикробного препарата можно представить двумя основными схемами. По одной схеме селекция резистентных клонов проводится на твердой питательной среде, содержащей антибиотик. Полученные при низких концентрациях препарата первичные мутанты используются в дальнейшем для получения новых более резистентных клонов. Таким образом, все полученные на последующих этапах селекции мутанты являются непосредственными потомками клеток, отобранных ранее. Такая схема отбора использовалась при получении фторхинолон-резистентных мутантов S.typhimurium [Reya, J. et al., 1995], S.aureus [Fenrero, L., et al., 1995; Dong, D. et al., 1999], M.smegmatis [Revel,V., et al., 1994],

M.hominis [Bebear, С. et al., 1998, Говорун B.M., с соавт., 1998], S.pneumoniae [Pan, P., et al., 1996], C.trachomatis [Dessus-Babus, S., et al., 1998], N.gonorrhoeae [Belland, RJ. et al., 1994]. Недостатком этого подхода является увеличение в геометрической прогрессии количества анализируемых клонов на каждом последующем этапе селекции. При этом общая картина формирования резистентности дробится на отдельные случаи.

По другой схеме селекции чувствительный штамм на первом этапе культивируют в жидкой среде, увеличивая концентрацию препарата при очередном пассаже. Генетический анализ проводят, получая отдельные клоны на твердой среде с соответствующей концентрацией антибиотика. Достоинством такой схемы является возможность оценивать интегральные характеристики культуры микоплазмы: динамику роста культуры, увеличение чувствительности к антибиотикам, изменения в соответствующих локусах генома в процессе формирования антибиотикорезистентности для всей популяции культивируемых клеток.

Результатом первого этапа наших микробиологических исследований явилось получение высокорезистентных штаммов M.hominis (МИК Cil - 250мкг/мл) и A.laidlawii (МИК Cfl -75мкг/мл) в процессе культивирования лабораторных штаммов Н-34 и PG-8B, соответственно, с возрастающими концентрациями Cfl и разработка алгоритма анализа изменений в QRDR генов-мишеней в процессе формирования резистентности. Параллельно были определены полные нуклеотидные последовательности генов субъединиц ДНК-гиразы и частично нуклеотидные последовательности QRDR-области и прилегающих к ним локусов субьеднниц топоизомеразы IV A.laidlawii PG-8B и фрагменты, содержащие QRDR субъединиц ДНК-гиразы M.hominis Н-34. (Accession numbers: AF167102, AF174426, Z98055). В дальнейшем это позволило анализировать порядок появления мутаций и определять их наличие одновременно в двух лабораторных объектах, принадлежащих к одному классу Mollicutes.

Был проведен анализ закономерностей появления мутаций в QRDR генов ДШС-гиразы и топоизомеразы IV при селекции лабораторного штамма Af. hominis Н-34 в присутствии трех препаратов фторхинолопового ряда: Cfl, Lfl и Ofl (См. табл.1). Следует подчеркнуть, что в отличие от препаратов тетрациклиновой группы, угнетающих метаболизм и действующих бактериостатически, фторхинолоны быстро приводят бактериальную клетку к гибели. При выборе препаратов мы ориентировались на обнаруженный для фторхинолонов так называемый "парадоксальный эффект". Суть его заключается в снижении бактерицидной активности препарата при его использовании в высоких дозах. С учетом этого мы выбрали Cfl, Lfl и Ofl, у которых, как известно, такой эффект отсутствует. В результате селекции были получены мутантные культуры, резистентные к широкому диапазону концентраций этих препаратов, и исследован спектр мутаций в QRDR генов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV.

Мутации, обнаруженные в нашей работе, а также опубликованные в литературе, представлены в табл.2. Из данных таблицы видно, что мутации у М.hominis и A.laidlawii затрагивают в основном "горячие точки" - аминокислоты в положениях 83, 84 и 87 в GyrA, (в РагС этим положениям соответствуют положения 91, 92, 95). Спектр этих мутаций совпадает с описанным в литературе для других микроорганизмов. Интересно отметить, что мутанты, полученные в нашей работе, имели мутации в основном в GyrA. В РагС мутации затрагивали исключительно Ser91. При этом спектр замен у мутантов лабораторного штамма Н-34 практически совпадал с таковым у клинических изолятов. С другой стороны, в работе Бебер с соавт. [ВеЪеаг, С. et al., 1998] описаны мутанты M.hominis, имеющие в РагС замены, аналогичные заменам в GyrA, найденным нами (табл.2).

Таблица1. Характеристика мутантов, полученных в результате селекции штамма M.hominis Н-34 в среде с увеличивающимися концентрациями Cfl, Lfl, Off (Wt-лабораторный

штамм Н-34).

Культура Антибак- Конц. № Аминокислотные замены

териальный мкг/мл пассажа

агент РагС ParE GyrA GyrB

MHCI Cfl 1 1 Wt Wt Wt Wt

МНС2 2 2 - - - -

мнсз 3 3 - - - -

МНС4 4 4 wt, Ser91—»fle - - -

МНС5 5 5 Ser91~»Ile - - -

МНС6 6 б Ser91—»Ue - - -

МНС7 7 7 Ser91—»De - - -

МНС8 g 8 Ser91~»lle - - -

МНС9 9 9 Ser91— lie - Ser84—»Pro -

МНС10 10 10 Ser91—»He - Ser84—»Pro -

МНС50 50 Л Ser91—lie - Ser84—»Pro, -

МНС100 100 12 Ser91—»Ile - GluS7—»Lys -

МНС 150 150 13 Ser91—»He - Glu87—»Lys -

МНС200 200 14 Ser91—»He - Glu87—»Lys -

МНС250 250 15 Ser91—»U3 - G!u87—»Lys GIuS7—»Lys -

MHL10 Lfl 10 1 Wt wt wi

МНС15 15 2 - - Wt -

MHL25 25 3 - - - -

MHL50 50 4 - - - -

MHL75 75 5 Ser91-»lle - - -

MHL100 100 6 Ser91—>Ile - - -

MHLI50 ISO 7 Ser91—>Ile - - -

MHL250 250 8 Ser91—*Ile - -

MHL400 400 9 Ser91—>Ile - Glu87—Ala Glu87—Ala -

МНОЮ Oil 10 1 Wt wt wt

МН015 15 2 - - Wt -

МН025 25 3 - - - -

МН050 50 4 - - - -

МН075 75 5 - - - -

MHO 100 lOO 6 - - - -

МН0150 150 7 ' Ser9J—>lle - - -

МН0250 250 8 Ser91—»lie - - -

МН0400 400 9 Ser91—Ue - - -

МН0500 500 10 Ser91—ille - - -

Нами обнаружены новые мутации, связанные с резистентностью M.hominis к ФХ: Ser84->Pro, Glu87->Ala в GyrA и Ser91->Tyr в РагС. Мутация Ser91 -»Туг в РагС уже была

описана для ФХ-резистепгньгх ппаммоп S.aureus [Ferrero, L., et al., 1995; Wang,Т. et al., 1998] и

S.pneumoniae [Takaba, H. et al., 1998], S.epidermidis [Li, Z. et al., 1998]. Мутация Ser84-»Pro в GyrA

Таблица 2. Мутации, выявленные в GyrA, GyrB, ParC, ParE Mycoplasma hominis, Acholeplasma laidlawii.

Штамм Мутации в

GyrA GjtB ParC ParE

Mhominis Н-34 Ser83—»Leu" Ser83—»Trp Ser84—»Pro Glu87—>Lvs Glu87—»Ala - Ser91—»Пе -

Mhominis PG21* Ser83—»Leu Ser83—>Гф Ser84—»Trp - AspSO—»Тут Arg84—»His Ser91—»fle Ser92—»Pro Glu95-»Lys Asp456—»Asn

Клинические изоляты Mhominis Ser83-»Leu Ser84—»Pro G!u87—»I.ys GIo87—»Ala - Ser91—»lle Ser91-»-Tyr

A.laidlawü PG-8B Ser83—»Ala Ser83—»Phe Asp91—»ASn - Ser91—»Leo -

* мутации описаны в работах [Bebear, С. et aL, 1997; Bebear, С. et al., 1998]; жирным шрифтом выделены мутации, обнаруженные в наших исследованиях и не описанные ранее в литературе.

описана у CflR мутантов S.aureus [Sreedharan, S. et al., 1990] и E.coli [Yoshida, H. et al., 1990]. Мутация Glu87—>Л1а в GyrA не известна для других микроорганизмов, однако, мутанты E.coli с Ala 87 в GyrA, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза, имели ФХК фенотип [Yonezawa, М. et al., 1995]. Полученные результаты позволили сделать вывод, что механизм резистентности к ФХ, сопряженный с аминокислотными заменами в структуре ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, у М. hominis, A.laildawii и других микроорганизмов аналогичен.

При проведении селекции было зафиксировано существование порога изменения чувствительности к препарату, для Cfl - 9-10 мкг/мл. Концентрацию Cfl до этого предела удавалось увеличить при очередном пассаже только на 1 мкг/мл. Увеличение концентрации на 2 мкг/мл вызывало гибель культуры. После получения культуры МНС10, резистентной к 10 мкг/мл, дальнейшее увеличение концентрации при последующих пассажах не было столь критичным и интервал между значениями концентраций достигал 30-50 мкг/мл. Максимальное значение МИК Cfl достигло 250 мкг/мл. При селекции культур, резистентных к Oil и Lfl, также было зафиксировано существование порога изменения чувствительности популяции клеток M.homimis к этим ФХ. Для обоих препаратов он находился в пределах 20-25 мкг/мл. Аналогичное явление было зарегистрировано и для клеток A.laidlawii, адаптирующихся к Cfl. До концентрации Cfl в среде, равной 5 мкг/мл, обязательным являлся шаг селекции в 1 мкг. После появления мутаций и в рагС и gyrA концентрация Cfl менялась на 2.5-5 мкг/шаг. В результате такой селекции были получены мутанты, устойчивые к концентрации Cfl -75 мкг/мл.

Исследуя закономерности появления мутаций, мы обратили внимание на то, что нуклеотидная замена в QRDR рагС Ser91—*11е у мутантов Mhominis и мутация в QRDR рагС Ser91—>Leu у мутантов A.laidlawii были обнаружены у культур, резистентных к 4 мкг/мл и 2мкг/мл Cfl, соответственно, но это не приводило к резкому увеличению резистентности к препарату. В то же время культуры, полученные на Oil с такой же заменой в QRDR рагС (MHOl 50-MHQ500), были высоко резистентны, в том числе и к Cfl. Если при селекции на Cfl изменение чувствительности к препарату совпало с появлением мутаций в GyrA (Ser83 —►Leu, либо Ser84—>Рго), то в случае Lfl и Ofl изменение порога чувствительности клеток Mhominis и A.laidlawii происходило до появления мутаций в РагС и GyrA. Для Lfl порог чувствительности наблюдался при концентрациях препарата 25 мкг/мл, а появление мутаций в РагС и в GyrA при

75 миг/мл и 250 мкг/мл, соответственно. Для Oil порог чувствительности также соответствовал концентрации препарата 25 мкг/мл, в то время как аминокислотная замена Ser91—»Ile в РагС была зарегистрирована в культурах, полученных на среде с Oil в концентрации 150 мкг/мл. В связи с этим возникал вопрос: чем еще отличались клетки с одинаковыми изменениями в QRDR генов топоизомераз и разным уровнем резистентности к ФХ? На наш взгляд, это отличие может быть связано с процессами адаптации микоплазм к антибиотикам, выходящими за рамки резистентности, обусловленной только изменениями структуры топоизомераз в результате точечных мутаций.

Результаты экспериментов по культивированию лабораторных штаммов Н-34 M.hominis и PG-8B AAaidlawii в присутствии ФХ показали, что формирование резистентности может предшествовать появлению мутаций в генах топоизомераз, т.к. мутации в генах топоизомераз регистрировали уже после того, как МИК ФХ увеличивал в десятки раз то сравнению с исходными чувствительными штаммами. При определенных коцентрациях ФХ резистентность к фторхинолонам может и не зависеть от точечных мутаций в QRDR генов субъединиц ДНК-гиразы и топоизомеразы IV (культура MHO 100). В связи с этим мы предположили, что у микоплазм могут существовать несколько так называемых формальных мишеней, изменения в которых вызывают резистентность к ФХ. ДНК-гираза и топоизомераза IV являются одними из таких мишеней.

Рядом авторов [Hallett, Р. 1991; Revel, V. et al., 1994; Bebear, С. at al., 1997; Bebear, С. et al., 1998] рассматривался вопрос, касающийся существования зависимости уровня резистентности к ФХ от конкретных мутаций в QRDR gyrA и рагС. Так называемая "сила" мутаций может определять каталитические свойства (Ki, Кт) очищенных до гомогенного состояния

топоизомераз в присутствия <£>Х. In vivo наличие других механизмов резистентности может искажать "силу" мутаций в генах топоизомераз.

Имеются публикации, в которых было показано, что при одинаковых изменениях в генах топоизомераз изоляты могут иметь разный уровень резистентности к фторхинолонам и, наоборот, изоляты с отличающимся профилем мутаций могут иметь одинаковые МИК препаратов. У Канематцу с соавт. [Kanematsu, Е. et al.,1998] среди клинических изолятов Enterococcus faecalis описаны изоляты с одинаковыми мутациями в РагС и GyrA, имевшие значительные отличия МИК. Ли и соавт. [Lee, Z. et al, 1998] также обнаружили клинические изоляты Staphylococcus epidermidis, одинаковые по типу мутаций в генах топоизомераз, но отличающиеся по чувствительности к некоторым фторхинолонам. Шмитц с соавт. [Scmitz, F.-J. et al., 1998] охарактеризовали 116 клинических изолятов Staphylococcus aureus, из которых 47 имели мутацию Ser83—»Leu в GyrA, при этом МИК Cfl у этих изолятов варьировала от 8 до 128 мкг/мл.

При работе с лабораторным штаммом Н-34 M.hominis мутанты, полученные нами при селекции на Cfl, имели замены Ser91—»-lie в РагС и Glu87-»Lys в GyrA и были резистентны к высоким концентрациям Cfl, Lfl, Ofl. А среди мутантов клинических изолятов 2х и 33 наименее резистентными к ФХ были как раз те, которые имели такие же мутации в соответствующих локусах. К тому же ТЛ^-мутант изолята 33 с этими мутациями, в отличие от мутантов лабораторного штамма Н-34, не имел перекрестную резистентность к Cfl и Ofl. Анализируя результаты селекции лабораторного штамма Н-34 с возрастающими и постоянными концентрациями Cfl, мы обнаружили, что закрепление мутаций в популяции клеток противоречит принципу селективного преимущества. Однако, если принять во внимание наличие дополнительных механизмов резистентности, то это противоречие снимается. Кроме того, существование нескольких мишеней и невозможность строго установить вклад каждой из них в

резистентность к ФХ позволяют рассматривать точечные мутации в локусах генов рагС и gyrA в качестве маркера процессов клеточной адаптации к этим препаратам у микоплазм.

Для M.hominis описана высокая генетическая гетерогенность, которая проявляется, как в точечных нуклеотидных и аминокислотных заменах [Christiansen,G. et al., 1987], так и в различных геномных перестройках, приводящих к значительным вариациям размеров геномов впутри одного вида [Lagenfoged, S.A. at al., 1992].

Культивирование клинических изолятов в присутствии ФХ позволило сделать несколько важных наблюдений. Во-первых, генетический полиморфизм свойственен и высококонсервативным локусам хромосомы M.hominis, к которым относятся QRDR генов рагС и gyrA. Значительные отличия наблюдаются при сравнении последовательностей QRDR рагС двух лабораторных штаммов: Н-34 и PG21 (табл.3). Сравпивая полученные результаты с данными других исследователей, следует отметить, что столь высокий полиморфизм QRDR gyrA и рагС у клинических изолятов микоплазм не известен для других микроорганизмов. Так например, из 344 исследованных в работе [Wang, T. et al.,1998] клинических изолятов S.avreus почти половина не имела мутаций в QRDR gyrA и рагС. Количество «молчащих» мутаций составляло не более 5 %. Большая часть мутаций (около 95% в РагС и 90 % в GyrA) затрагивала «горячие точки» -аминокислоты в положениях 83, 84 и 87 и была ассоциирована с резистентностью к CiL Во-вторых, в результате культивирования клинических изолятов в присутствии ФХ обнаруживались мутации, включая двойные, причем, исключительно в «горячих точках» генов рагС и gyrA. При этом дополнительных нейтральных мутаций в этих локусах обнаружено не было.

На этом основании мы можем говорить о разной природе мутаций, обеспечивающих аятибиотикорезистентность, и мутаций, лежащих в основе генетического полиморфизма.

Уровень спонтанных мутаций микроорганизма отражает баланс между числом возникающих в ДНК ошибок и числом исправленных.

Таблица 3. Вариабельность С?ЮЖ иугА и рагС ФХ-чувствительных клинических

изолятов М.Иопишэ.

М-ЬотЫв Нуклеотидные и аминокислотные вариации

вугА РагС

Штамм РО 21 -— —

Штамм Н34 11е82(АТС ->АТА), Рго87(ССТ ->ССА), А1а96(ССЛ -»СССО, Аяр123(ОАС —САТ)

Клинические гаоляты 3 »15106 (САС—>САТ} Бег] 06 (АСС—>АОТ)

5 НЫ06 (САС—>САТ] А1а96(ССА-*СС2)

15 а!у1 ю (сат-^ооА) А1аЮ1(ОСТ—КЗСО), Аьр122 (ОАТ-ЮЛС) А5р123(ОАС> —К}АТ), А1а125 (ОСС—ОСТ)

16 — Рго87 (ССТ—>ССА), А1а96 (ССА—КЗСО), А1а101 (ОСТ-ЮССу, А<;р123 (ОЛС-»САТ)

18 Рго101 (ССА->ССГ) А1а96 (ОСА—ССО)

22 Ш80(САТ-*САС), №¡106 (САС^САТ) А1а9б (ОСА—>ОСО)

23 С1у1 щсал-»««!), С1у1 ю(аат->асА), Аэр113(ОАТ~»ОАС) вегЮб (АОС-МСТ)

1415 — 5ег91(АОТ)—>А.?л(АДТ), А1а96 (ССА—>СС(3)

4003 01у114(00А-<ЗСТ), о1упо(сст-юал), АБр113(ОАТ—»вАС) А1а125 (ССС->ОСГ)

4129 Аэр 113 (САТ—»в АС) А1а96 (ССА-»ОСО),

Asp 123 (GAG—GAT), Ala 125 (GCC—>GCT)

6262 GlytlO (GGT—GGA) Ala96 (GCA—>GCG)

Ее — Aspl22 (GAT—»GAC), Aspl23(GAC—>GAT), Alal25 (GCC—»GCT)

2х I lis 106(СЛС—>САТ), Glyl 10(GGT—>GGA), Aspll3(GAT—GAC) —

33 Ser66(TCA—>TCG), His80(CAT—>CAC) Glyl 10(GGT—>GGA), Asp 113(GAT—>GAC) Asp 123 (GAC—>GAT)

Считается, что генетическая вариабельность микоплазм является результатом высокой частоты спонтанного мутагенеза вследствие несовершенства системы репарации и коррекции ошибок ДНК [Razin, S. et al., 1998]. В одной из работ, посвященных исследованию резистентности мутантов штамма M.hominis PG21, Бебер с соавт. определили, что частота спонтанных мутаций при селекции на Oil составляет 10"7 [Bebear, С. et al., 1997], в то время как для Cfl-резистеншых мутантов S. aureus частота спонтанных мутаций составляла 10"9 [Ferrero, L. et al., 1995]. Авторы предположили, что одной из причин относительно высокой частоты возникновения мутаций у микоплазм является отсутствие корректирующей 3'—>5' экзонузслеазной активности у ДНК-полимеразы Ш. Вполне возможно также, что полиморфизм отражает не столько высокий уровень спонтанного мутагенеза микоплазм, сколько существование на данный момент большого количества квазивидов. Использованный в работе алгоритм селекции с ФХ показал, что у клинических изолятов Mhominis наблюдаются индивидуальные особенности адаптации к этим препаратам. Большинство изолятов (80%) не способно культивироваться в присутствии ФХ. Ко всем трем антибиотикам хорошо

адаптировался изолят 6.1, который имел значения МЙК Cfl, Lfl и Ofl практически такие же, как и у лабораторного штамма Н-34. Изолят 33 хуже двух других адаптировался к ФХ.

Динамика роста культур, изменение чувствительности к антибактериальным препаратам в процессе селекции и спектр мутаций в QRDR gyrA и рагС у лабораторного штамма Н-34 и клинических изолятов 6.1,2х, 33 практически совпадали, на основании чего можно сделать вывод о том, что механизмы формирования резистентности клинических изолятов и лабораторного штамма М. hominis аналогичны.

Исследуя феномен формирования резистентности к ФХ у ахолеплазм, мы обнаружили, что, несмотря на аналогичные закономерности появления мутаций в «горячих точках» QRDR's gyrA и рагС, клетки вида Alaidlawii имеют ряд особенностей. Ахолеплазмы, содержащие в QRDR мутации, переставали культивироваться в присутствии ФХ. Этот феномен сопровождался постепенным блокированием синтеза основного пигмента плазматической мембраны -нейроспорина, накоплением в плазмалсммс бесцветных предшественников, холестерина, а также увеличением микровязкости мембраны. Эти наблюдения указывают на несовершенство адаптационного механизма, инактивирующего связывание ФХ с комплексом ДНК-топоизомераза II типа и четко демонстрируют необходимость дополнительных условий для «совершенной» адаптации микоплазм к воздействию антибактериальных агентов.

Участие транспортных систем в формировании устойчивости микоплазм Таким дополнительным условием являлось уменьшение накопления антибактериальных агентов ФХ-ряда клетками молликуг. Мы исследовали процесс накопления и выброса бромистого этидия из клеток M.hominis и A.laidlami, а также Накопления ципрофлоксацина -фторхинолонового антибактериального агента, имеющего наибольшую эффективность

подавления микоплазм. Микоплазмы и ахолеплазмы, устойчивые к действию ФХ, демонстрировали пониженную способность накапливать бромистый этидий и ФХ (рис. 1-3).

О 25 50 73 0 23 50 7S

Бремя, мин

Рис.1. Кинетика накопления (А) и выброса (Б) бромистого этидия клетками различных штаммов М.Иотт.

— дикий штамм Н-34;-----дапрофгоксацин-резистентный штамм МНС-50;-----

ципрофлоксацин-регастентньш штамм МН0200

Эти данные хорошо коррелировали с данными о перекрестной устойчивости микоплазм к ФХ и бромистому этидию (табл.4).

Таблица 4. Перекрестная устойчивость различных мутантов \i.homin\f; и Л.1шсПа\т к

ципрофлоксацину и бромистому этидию

Acholeplasma iaidlami Micoplasma hominis

PG-8B АС-0,25 АС-10 Н-34 МНО-200 МНС-50

Ципрофолксацин, мкг/мл оа 0,35 20 0,75 35 70

Бромистый этидий, мкг/мл 1 2 2,2 3,75 10 10

Характеризуя процессы накопления бромистого этидия, нам удалось показать, что у микоилазм, как и у большинства других микроорганизмов, транспорт бромистого этидия является энерго- и потенциалозависимым процессом, на который способно влиять большинство ионофоров и ингибиторов АТФазной активности плазматической мембраны. Проведенный нами иагибиторный анализ не выявил, однако, какой-либо специфичности при действии

О.б 0.5 0.4 —|

40 60 О 20 Время, мин.

40

Рнс.2. Кинетика накопления (А) и выброса (Б) бромистого этидия клетками различных штаммов АЛаШсти.

--дикий штамм РО-8В;--ципрофлоксацнн-резистентный штамм АС-0.25;---ципрофлоксацин-

резисгатшй иггамм АС-10.

использованных соединений. Так, применение стандартного ингибитора АВС-транспортеров, ответственных за эффлюкс соединений фторхинолонового ряда и бромистого этидия у Р.аеги^поза, Эмигег^ и др.,- резерпина показало, что данное соединение незначительно влияет

на увеличение накопления бромистого этидая, и его активность сопоставима с действием других ингибиторов (валиномицина, верапамила, моненсина, СССР и др.) (табл.5).

Таблица 5. Влияние ингибиторов транспорта на накопление бромистого этидия

клетками лабораторного штамма и мутантами АЛаШтт

Накопление этидия, мкг/мг белка (%)

РО-8В АС-0.25 АС-10

Стандартная среда 0.58 (100) 0.45 (100) 0.27 (100)

+ резерпин 0.73 (127) 0.55 (123) 0.43 (160)

+ СССР 0.92 (160) 0.67(150) 0.44 (163)

+ верапамил 0.73 (127) 0.55 (123) 0.43 (160)

+ валиномицин 0.65 (113) 0.49 (109) 0.29 (108)

+ моненсин 0.46 (80) 0.27(60) 0.22 (80)

В этой связи следует упоминуть о серии экспериментов по выявлению увеличения эффекта резистентности к ФХ клеток АЛаМам>Н в присутствии различных концентраций ЫаС1.

Время, мин

Рис.З. Кинетика накопления [3Н] ципрофлоксацина клетками различных штаммов

М./юотм«. — дикий штамм Н-34;-----ципрофлоксацин-резистентный штамм

МНС-50; — ципрофлоксацин-резистентный штамм МНО-200.

Как следует из данных, представленных на рис.4, культивирование ахолеплазм в гиперосмомолярной среде приводило к увеличению резистентности клеток к СП в 2-2.5 раза.

Таким образом, на этом этапе исследования мы зарегистрировали эффективную реакцию молликут, заключающуюся в ограничении накопления антибактериального агента ФХ-ряда или бромистого этидия за счет ограничения входа или снижения внутриклеточной растворимости

100

0 0.25 0.5 0.75 1.0 2.0 Концентрация ципрофлоксацина, мкг/мл

Рис.4. Действие ципрофлоксацина на рост дикого штамма Л.ШсИсмИ РО-8В при различных концентрациях ЫаС1 в среде инкубации.

ФХ, а не за счет активации процессов обратного транспорта Измеренные скорости выхода бромистого этидия из клеток мутантов и клеток дикого типа не отличались. Одна из гипотез, объясняющая снижение накопления ФХ и бромистого этидия, заключается в том, что в процессе воздействия на клетку этих соединений происходит модификация внутренней среды миколлазм и, как следствие, физико-химическое ограничение накопления. Следует отметить, что микоплазмы каким-то образом могут менять внутриклеточную растворимость адаптогенов, в том числе и антибактериальных агентов, оставаясь при этом жизнеспособными. В связи с этим необходимо упомянуть гот факт, что все охарактеризованные мутанты микоплазм, резистентные к ФХ, не отличались по своей устойчивости к другим антибактериальным препаратам от лабораторного штамма. Такая уникальная специфичность "настройки" делает наше

предположение о возможном регулировании адаптогенами внутреннего гомеостаза молдикут вполне правдоподобной гипотезой. Более того, проведя анализ устойчивости ФХК микоплазм и ахолеплазм к действию других антибактериальных агентов мы не обнаружили и перекрестной устойчивости (см. таблицу 6,7).

Таблица 6. Перекрестная чувствительность мутантов М.кот'тЬ, устойчивых к различным концентрациям фторхинолонов (3,9, 50, 200мкг/мл), к другим антибиотикам.

Антибиотик мкг/мл Н-34 мнс-з МНС-9 МНС-50 мно-зоо

Тетрациклин 1 1 1(0,5) 1 1

Эритромицин 50 60 50 75 50 Рост без

Канамицин 10 10 10 10 5 фторхино-

Доксициклии 0,1 0,1 0,05 0,1 0,1 лона

Карбомицин 0,1 0,1 0,15 0,1 0,15

Актиномиции 0,075 0,075 0,075 0,075 0,1

Доксорубицин 2,5 5 2,5 5 2,5

Эритромицин 50 75 75 75 75

Канамицин 10 10 10 10 5

Дохсициклин 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Рост на МИК

Карбомицин 0,1 0,1 0,1 0,15 0,25 фторхино-

Акгииомицин 0,075 0,15 0,15 0,15 0,2-0,3 лона

Доксорубицин 2,5 5 15 15 17

Пуромицин 1 2,5 2,5 5 1

Дауномицин 0,5 1 1 1 1

Этамицин 0,5 1 1,5 2,5 1

Рифамицнн S 40 40 40 40 40

Виамицин 20 20 20 20 20

Таблица 7. Перекрестная чувствительность мутантов А.ЫсЛан'И, устойчивых к различным концентрациям фторхинолонов и тетрациклина, к другим антибиотикам.

Антибиотик МИК, мкг/ш

Acholeplasma taidlawii

PG-8B АС-10 AC-7S ЛТ-10

Ципрофлоксацин 0.2 40 70 0.8

Тетрациклин 0.2 0.1 0.1 12

Хлортетрадиклин 2.0 2.0 2.0 25

Пуромицин 0.5 0.7 0.5 0.5

Этамицин 0.25 1.0 0.25 0.25

Хлорамфеникол 2.0 2.0 0.5 0.5

Рифамицин 2.0 2.0 0.5 0.5

Доксорубицин 2.5 2.5 0.5 0.5

АС10, АС75- мутанты, устойчивые к различным концентрациям Cfl,

АТ10-мутант, устойчивый к 10мкг/мл тетрациклина.

Этот замечательный на наш взгляд факт позволяет утверждать, что микоплазмы формируют устойчивость, включая какие-то не изученные до настоящего времени механизмы, ограничивающие накопление антибактериальных препаратов определенной группы. В параллельных экспериментах мы обнаружили, что мутанты ахолеплазм, полученные в результате селекции на среде с повышающейся концентрацией тетрациклина и способные расти в среде с 10 мкг/мл этого антибактериального агента, характеризуются ограничением накопления этого препарата. Если в случае ФХК" мутантов микоплазменные клетки были даже более чувствительны к присутствию тетрациклинов, то Тс11 микоплазмы показали повышенную устойчивость к ФХ. На основании этих экспериментальных данных мы заключили, что, по-видимому, у микоплазм имеют место две независимые схемы регуляции работы транспортных систем. Первая, «тетрациклиновая», обусловлена замедлением пролиферативной активности, накоплением в мембране холестерина и нейтральных липидов, и увеличением микровязкости мембраны. В этом случае на фоне замедления всех метаболических процессов происходит ограничение входа' токсического соединения. Такая схема регуляции приемлема в ситуациях, когда микоплазмы подвергаются воздействию препаратов, обладающих бактериостатическим действием. В случае, когда действуют препараты, имеющие, как и ФХ, бактерицидный эффект, реализуются иные схемы, механизмы которых пока не определены, но результатом реализации которых является ограничение входа ФХ внутрь клетки. Из приведенных данных следует, что ограничение накопления ФХ клетками микоплазм зависит от энергии, трансмембранного потенциала, жизнеспособности и пролиферативной активности клетки. Таким образом, мы исследовали два альтернативных адаптационных процесса, включающих системные метаболические перестройки у микоплазм, которые детерминируют формирование устойчивости.

С этой точки зрения примечательным является факт получения в условиях культивирования TcR микоплазм, уреаплазм и ахолеплазм, лишенных детерминанты устойчивости telM. Применив схему селекции микоплазм с повышающимися концентрациями антибактериальных агентов, мы получили резистентные культуры этих клеток таким же образом, как это описано для ФХ. Эти результаты продемонстрировали высокую генетическую и метаболическую пластичность молликут, позволяющую им приспосабливаться к различным неблагоприятным условиям. При этом, по нашему мнению, особый интерес представляют не конкретные физико-химические и гепетические механизмы, описанные ранее, а общий сетевой биохимический алгоритм, приводящий каждый раз к выживанию молликут и формированию тех или иных изменений в генетических локусах или сегментах метаболизма. На сегодняшний день, к сожалению, не существует адекватных методов исследования адаптационных механизмов на уровне ответа целой клетки. Именно в силу вышеупомянутых обстоятельств исследователи вынуждены концентрировать свои усилия на изменении биохимических показателей плазматической мембраны, катаболизма или анаболизма, перестройках генома. Такие подходы весьма схематичны. Микоплазмы - это системы, где достаточно сложно вычлеиитъ существенные или хорошо коррелируемые с результатом (способностью персистировать в новых условиях) признаки, так как молликуты слишком зависят от условий культивирования, имеют слабо выраженные на уровне генома механизмы генетической регуляции различных процессов и в то же время могут приспосабливаться к разньм неблагоприятным условиям за счет незначительных, на взгляд экспериментатора, изменений в метаболических реакциях. Сегодня представляется актуальным осознание ограниченности подхода, построенного только на изучении генетических маркеров и их изменений, при исследовании микоплазм. Напротив, постановка вопроса о детерминируемости ответа этих микроорганизмов на уровне метаболических реакций, а не

работы тех или иных генетических систем, становится все более и более очевидной. В силу вышесказанного при планировании следующих этапов развития этого направления необходимо уделять особое внимание подбору методов, позволяющих следить за изменениями в физиологии молликут на уровне всех функционирующих метаболических систем, вовлеченных в процессы адаптации. Нам представляется возможным уже сейчас применить современные протеомные и геномные подходы для выявления механизмов описанных здесь процессов.

Резистентность микоплазм к тетрациклинам, обусловленная te/M-детерминтой

До настоящего момента тетрациклины являются препаратами выбора при лечении микоплазмозов. Однако эпидемиологические исследования последних лет выявили неуклонное и повсеместное возрастание устойчивости клинических изолятов молликут к тетрациклину и его аналогам. До настоящего времени основным известным способом инактивации действия тетрацщслигов у молликут считалось преобретение этими клетками детерминанты устойчивости /е/М в составе конъюгативного транспозона Tn916 [Roberts, М.С., 1990]. По нашим данным, представленным в этой работе, tetM- ассоциированная устойчивость микоплазм колеблется от 10 до 22%, а у уреаплазм она достигает 25% (рис.6). При этом МИК тетрациклина, определенного для клинических изолятов, содержащих tetM, варьирует от 0.5 до 32 мкг/мл. Основной задачей нашего исследования являлось определение бактериального донора коиьюгативного транспозона и получение альтернативных Тск-мутаитов микоплазм, лишенных гена устойчивости, ассоциированного с Тп916. Для решения первой задачи мы наблюдали за формированием резистентности к тетрациклину у микоплазм и уреаплазм в ходе лечения тетрацикшшами пациентов с неспецифическими воспалительными заболеваниями и определяли наличие tetM детерминанты у сопутствующей бактериальной флоры. В ходе исследования мы пытались выявить основного бактериального донора коньюгативноло транспозона Тп916, в состав которого

входит /е/М детерминанта, обуславливающая устойчивость к тетрациклинам микоплазм. Для этих целей была проведена оценка мозаичности гена ШМ, обнаруженного в микоплазмах и уреаплазмах, на предмет выявления наиболее близких к описанным вариантам нуклеотидной структуры /е/М детерминанты других микроорганизмов [Oggioni М^ е1 а1 1996]. Мы обнаружили, что структура гена ШМ у клинических изолятов микоплазм и уреаплазм имеет оригинальную мозаичность и не похожа ни на один из описанных в литературе аллелей этого

59%

Рис,6. Распределение tetM детерминанты в клинических изолятах U. urealyticwn и М. hominis.

гена (рис.7). Во многих клинических изолятах M.hominis telM детерминанта обнаруживалась в составе отдельных фрагментов трансгозона. Аналогичная ситуация по наследованию /е/М детерминанты была описана ранее для Gardnerella vaginalis - естественного комеисала слизистой влагалища, участвующей в развитии бактериального вагиноза [Huang, R., et al., 1997]. Как уже упоминалось выше, в лабораторных условиях был продемонстрирован коньюгативный перенос

S. pneumoniae 7n1545 N. gonorrhoeae pOZIOOj S. pneumoniae Tn5251 U. urealyticum N. meningitidis pC>Z105 N. gonorrhoeae pOZIOI E faecalis Tn9f 6 S. aureus C. vaginalis M. hominis (7 U3on.) M. hominis (1 u3on.)

U. vreai.(3 U30H.) U. ureal.(1 uso/r.J

DHC

z_шим

200 I.

X

600 _L_

1000

JL

X

шшшшш

1400 1800

I I I

Piic.l Схематичное представление мозаичноети letM детерминанты у микоплазм и других видов Два аялеля с максимальной дивергенцией выделены черным (S. pneumoniae Тп1545) и бельш (S. aureus). Внизу длина гена в и.о.

транспозона из клеток E.faecalis в клетки M.hominis [Roberts, М.С., et al., 1987]. Было показано, что процесс переноса идет с низкой частотой 10"а-10"'° и сопровождается появлением колоний микоплазм, устойчивых к концентрации тетрациклина 2-4 мкг/мл. Проведя наблюдения за 30-тью пациентками, у которых изначально были обнаружена M.hominis с генотипом te/M~ и фенотипом Tcs, и микрофлора влагалища содержала достаточное количество различных бактерий, содержащих tetM детерминанту, мы убедились, что процесс формирования резистентности микоплазм к тетрациклинам происходит через 2-6 месяцев после проведенного антибактериального лечения, причем он не всегда сопровождается преобретением tetM детерминанты. Нам не удалось в ходе проведенных исследований обнаружить также какой-либо определенный вид микроорганизма, выступающего в роли донора транспозона для микоплазм. Таким образом, сегодня приходится констатировать, что механизмы, с помощью которых

микоплазмы приобретают te/M-ассоциированную устойчивость к тетрациклинам, изучены не в полной мере. Новая мозаичность аллелей te/M, обнаруженная у микотазм, подразумевает наличие интенсивного мжроэволюциониого процесса, "подстраивающего" вновь приобретенную детерминанту в составе транспозона под работу с молекулярной машиной момикут.

Основные проблемы, которые приходится "решать" микоплазмам, - утилизация большого фрагмента приобретенной ДНК транспозона, содержащего telM детерминанту- около 2% от всего генома, "подстраивание" структуры синтезируемого TetM под рибосомальный профиль микоплазм, обеспечение жизнеспособности клетки на фоне происходящих молекулярных событий. Здесь необходимо вновь вернуться к алгоритму исследований, которые проводятся в микоплазмологии в настоящее время. По логике большинства исследователей íetM детерминанта является основным геном, продукт которого обеспечивает выживаемость микоплазм в присутствии тетрациклинов. Аналогия в рассуждениях очевидна! Так происходит у большинства микроорганизмов. Но у микоплазм, особенно в условиях их естественной среды обитания, необходимо учитывать большое количество иных факторов, вюточая и интимный паразитизм, спосо6е!ых существенно модулировать устойчивость. Поэтому исследователям необходимо прежде всего ответить на вопрос: необходима ли tetM детерминанта для формирования устойчивости. В этом смысле приобретение tetM детерминанты можно рассматривать как аналог формирования точечных мутаций, ииактивирующих действие ФХ в QRDR's топоизомераз II типа Приобретенная структура гена в составе транспозона или его фрагмента может сразу и не оказывать влияния на выживаемость клеток к тетрациклинам, поскольку они уже устойчивы! Появление мутаций в QRDR's происходит при концентрациях ФХ в 10 и более раз превышающих МИК для лабораторных штаммов микоплазм и ахолеплазм. Вместе с тем, мы уже подробно рассмотрели процессы, которые протекают до возникновения мутаций и в значительной степени

предопределяют их. В случае рассмотрения устойчивости к тетрациклином исследователи почему-то отождествляют приобретение гена устойчивости и результат - формирование устойчивых к тетрациклинам клонов клеток [Ricc,L.B.,1998], Нам представляется актуальным рассматривать резистентность к тетрациклинам у микоплазм как продукт индуцированного адаптогеном перехода всего метаболизма клетки, где инактивация действия тетрациклинов на метаболизм микопл азм может происходить как за счет работы tetM, так и по иным причинам. Причем, по-видимому, эти иные причины, а точнее механизмы метаболической резистентности, реализуются всегда, являясь обязательными при формировании устойчивости и предваряя реализацию функциональной экпрессии tetM гена. В отяичие от мутаций в QRDR, происходящих вслед за ограничением накопления ФХ в большей части популяции молликут, культивирующихся без экзогенной ДНК, содержащей в своем составе telM детермиыату, микоплазмы формируют устойчивость, ограничивая накопление тетрациклинов и переходя в новое метаболическое состояние, толерантное к действию этих препаратов. Как и в случае с ФХ-устойчивостыо, данный вид резистентноста отображает принцип селективного подстраивания метаболизма этих микроорганизмов под действие определенного антибактериального агента. Иными словами, устойчивые к тетрациклинам клетки микоплазм не являются более резистентными к другим антибактериальным агентам. Изученные нами примеры новой мозаичности генов tetM являются свидетельствами перестроек в структуре приобретенной детерминанты, которые происходят уже после того, как транспозон или его фрагмент попадает внутрь микоплазменной клетки, и, следовательно, можно говорить об интервале времени, когда детерминанта устойчивости уже приобретена, но эффекта от ее функционирования нет. По аналогии с ФХ можно предположить, что приобретение tetM детерминаты в некоторых условиях - пролонгированного действия антибактериального агента, искусственно созданной компетентности клеток микоплазм -

является термодинамически более предпочтительным процессом, чем, например, поддержание специфического состояния плазматической мембраны и всего метаболизма. На основании приведенных рассуждений и полученных экспериментальных данных мы делаем вывод, что у микоплазм формирование устойчивости к тетрациклиновым антибактериальным агентам происходит поэтапно и включает в себя общий неспецифический, но строго "селективный" комплекс метаболических перестроек, увеличивающих выживаемость микоплазм при действии тетрациклинов, и последующее, если это возможно и необходимо, приобретение и микроэволюционирование детерминанты устойчивости экзогенного происхождения. Вероятнее всего речь идет не о конъюгативном процессе с участием бактерий-соседей по биоценозу, а о более сложной системе акцепции ДНК, модулированной воздействием антибактериальных агентов и микроокружения, определяющего компетентность микоплазм, а также их способность переживать высокие концепт-рации тетрациклинов.

Это обстоятельство побудило нас рассмотреть возможные альтернативные пути переноса детерминанты устойчивости в клетки микоплазм. Для этой цели мы смоделировали микоплазменную инфекцию в культуре клеток HeLa. Проводя трансфекцшо эукариотических клеток плазмидой рАМ120, содержащей транспозон Тп916, мы обнаружили, что микоплазмы, находящиеся в момент Са-трансфекции в культуре, приобретают резистентность и становятся носителями tetM детерминанты. Следует особо подчеркнуть, что до этого момента трансформировать клетки M.hominis плазмидой рАМ120 удавалось только при помощи электропорзции с высокими концентрациями плазмидной ДНК. Полученные экспериментальные данные позволяют констатировать, что горизонтальный перенос генетической информации (tetM детерминанты в составе конъюгативного траяспозона) в микоплазмы, паразитирующие на клетке-хозяине, происходит при непосредственном участии этой инфицированной клетки. При этом

следует обратить внимание на одно очень важное обстоятельство, иллюстрирующее общий ход наших рассуждений. Клетка-хозяин является очень мощным индуктором перестройки метаболизма молликут, предопределяющим увеличение естественной компетентности -интегрального показателя состояния плазматической мембраны. Зарегистрированная нами , естественная трансформация микоплазм плазмидой, содержащей транспозон, служит очень ' веским аргументом в доказательстве основного положения исследования: условия адаптации ; позволяют микоплазмам «подстроить» свой метаболизм для выработки специфических реакций, обуславливающих переход в новое состояние.

Таким образом наши представления об особенностях формирования резистентности микоплазм к тетрациклину и его аналогам заключаются прежде всего в том, что описанная до настоящего времени устойчивость микоплазм к Тс, обусловленная приобретением шЫ детерминанты в составе конъюгативного транспозона, является всего лишь этапом общей адаптации молликут к этим антибактериальным агентам, следующим за реакциями клетки по модификации проницаемости мембраны к препарату и подготовке клетки микоплазм к естественной трансформации экзогенной ДНК. Клинические наблюдения за персистирующими микоплазмами и уреаплазмами после применения тетрациклинов указывают на то, что количество Тс-устойчивых клинических изолягов микоплазм гораздо больше, чем число выделенных клинических штаммов, несущих ШМ детерминанту. Наши эксперименты по получению устойчивых к тетрациклину мутантов, не содержащих детерминанту устойчивости уреаллазм, ахолеплазм и микоплазм, ясно показывают, что несмотря на отсутствие первичной мишени, как в случае ФХ, молликуты адаптируются к тетрациклинам аналогично. При этом, приобретение ШМ - вопрос стратегии выживания, а не тактики формирования устойчивости. В

случае, когда ШМ недоступна, микоплазмы останавливают формирование резистентности и первом этапе, наиболее часто встречающемся и в живой природе.

Особенности формирования резистентности к ФХ в присутствии эукариотической

клетки

Получив обширный экспериментальный материал, касающийся приспособлени микоплазм к действию антибактериальных агентов ФХ и Тс-ряда в условиях лабораторног культивирования и при проведении клинических наблюдений, мы проанализировал феноменологию формирования устойчивости к ФХ в присутствии эукариотических клето! Оказалось, что устойчивость микоплазм к ФХ может увеличиваться в 10 и более раз лр предварительном инкубировании А.1тс11<тИ и М.ЪотМэ с клетками НеЬа. Эти эксперимент! были поставлены нами в двух вариантах. В одной серии микоплазмы и клетки НеЬ культивировали в среде Эдвардса или ВШ (среды, используемые для культивнроваик микоплазм), в другой - в среде для выращивания эукариотических культур. Нами был обнаружено, что преинкубация микоплазм с зукариотическими клетками делает молликуто более устойчивыми к действию ФХ. Суть этого феномена следует рассматривать в контекст объяснений, предложенных нами ранее. Молликуты, попадая в метаболическое поле клетки хозяина, начинают активно перестраивать свои метаболические потенции: транспорт, энергетик) липидный обмен. Это, в конечном счете, приводит к тому, что при совместном культивировании инфекции исследователь имеет иную микоплазменяую клетку, способную к ответам на действи антибактериальных препаратов ФХ-ряда и использующую метаболический потенциал клетки хозяина. Не случайно, что увеличение устойчивости к ФХ нам удалось наблюдать только поел совместного культивирования микоплазм с клетками НеЬа в течение суток. При одновременно! добавлении к микоплазмам ФХ и клеточной суспензии отличий в уровне резистентности мы н наблюдали. Сегодня нам представляется актуальным поставить вопрос о корректности метод

табораторного определения устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам на аскусственных питательных средах. Удаленный из своей естественной среды обитания клинический изолят микоплазм способен продемонстрировать лишь свою способность расти на искусственных питательных средах, подвергаясь воздействию антибактериальных агентов. При этом в организме хозяина может существовать глубокая связь между паразитом и клетками эпителия, надежно защищающая молликут от воздействия каких-либо препаратов. В силу вышесказанного определение устойчивости клинических изолятов микоплазм, по-видимому, целесообразно проводить в присутствии клетки-хозяина. В этом случае палитра естественной устойчивости молликут будет более разнообразной.

Гемотерапия микоплазменных инфекций На заключительном этапе работы мы изучили влияние линейного пептида меллитина, ген которого экспрессировали различными рекомбинантными векторами, на размножение микоплазм в культуре и в присутствии клеток эукариотического происхождения. Проведение этой части работы, являющейся, по существу, началом разработки новых подходов к лечению латентных инфекционных агентов, тесно ассоциированных с эукариотической клеткой ¡Ъаьагеу, ЧШ. & аI, 1999], было обусловлено пониманием того, что действие большинства известных антибактериальных препаратов неэффективно при лечении хронических микоплазменных инфекций вследствие очень тесной ассоциации паразита с метаболизмом хозяина. Тетрациклины и фторхинолоны, обладая разными механизмами действия и разной активностью по отношению к молликутам, тем не менее неспособны эффективно влиять на метаболизм микоплазм, который защищен реакциями клетки-хозяина. Поэтому основная идея, которая возникает при рассмотрении механизмов формирования устойчивости к антибактериальным агентам, заключается прежде всего в том, чтобы влиять на метаболизм микоплазм изнутри либо через

метаболизм клетки-хозяина. Для этих целей наиболее подходят линейные амфипатичесю пептиды, обладающие выраженным бактерицидным и цитотоксическим действием [НаЬегтап, 1 е1 а!., 1980].

Как известно, такие пептиды относят к древней иммунологической системе организм выполняющей неспецифические функции по контролю за биоценозом слизистой. В свот экспериментах мы выбрали меллитнн в силу ряда обстоятельств. Во-первых, меллитии I нуждается в постгрансляционной модификации для проявления бактерицидной и гемолитическс активности. Во-вторых, в молекуле меллитина имеется триптофан, что позволяет сдела; селективной экспрессию этого белка в молаткутах, используя вариации генетического кода этих микроорганизмов (у молликут ШЗА-кодирует триптофан, а не стоп-кодон). В-третьи меллитин - хорошо изученный пептид с выраженной бактерицидной активностью, прои которой до настоящего времени не описано устойчивости у прокариот.

В работе были использованы рекомбинантпые плазмиды, содержащие Тл916 (рнс.8), состав которого был включен ген меллитина под контролем тетрациклинового промотора, рекомбинантпые плазмиды под контролем СМУ-промотора (рис.9), содержали трансактиваторный элемент, позволяющий проводить регулируемую экспрессию гена меллитш в системе, где индуктором являются антибиотики тетрациклинового ряда.

EcoRI

npañMep A,

mel

3"

«-T

5"

ceses

nyp

r

mel

Y

¡npa

EcoRI

jiBnfpoBaHHt

---Kpn I

. CTOn-KDflOH

EcoR I npaíiMcp A,

EcoRI

-Kpn I

-CTOn-KDflOH

t—EcoUI Kpn I

jinrHpoBaHHe

EcoR I Kpnl

tetM iiindm

lac

OpOXOFOp

Amp'

EcoR I Kpnl

mel,

EcoRI Kpn I -ÍS pTetmel

tetM

Hindni

PMc.8.CxeMa co3;iaHH» MejumTHJi-3Kcnpcccnpyioiuero Beicropa Ha 0CH0Be npHpojiioro TpaHcn030Ha Tn916.

pGREEN-la

pRc/me!2

ЦШЭ pRc/GFP-fus-mel

MCS

pBI-EGFP

pBi/шеа

pTet-On(OR)

Рис.9, Схема рекомбинантных векторов, использованных в работе для регулируемой экспрессии меллитина в эукариотических клетках. PCMV- ранний промотор цитомегаловируса человека

PminCMV- двунаправленные минимальные промоторы цитомегаловируса человека

GFP- ген green fluorescent proteïn ("зеленый белок")

TRE- тетрациклин - зависимый элемент

SV40ori- точка начала репликации вируса SV40

Melittin- ген мелигина

Ро1у(А)- сигнал полиадеяилирования

MSC - полилинкер

(r)TetR- последовательность из тетрациклин-устойчивого оперона транспозона TnlO E.coli

AD - активаторный домен белка VP16 вируса простого герпеса

В первой серии экспериментов мы продемонстрировали цнтотоксическую активност меллитина при его экспрессии в клетках микопяазм. Интересно отметать, что активным оказалс не только сам пептид, но я химерная молекула, состоящая из меллитина и продукта гена lacZ. 1 экспериментах с клетками A.laidlawii после введения рекомбинантной плазмиды с гено! меллитина под контролем lac промотора было зарегистрировано падение количеств жизнеспособных клеток на 5-7 порядков по отношению к контролю (рисЛО). Поскольк эффективность электропорации не абсолютна, можно полагать, что испытанная гекетическа конструкция обладала выраженным бактерицидным эффектом. В экспериментах на культур

клеток М. hominis мы также наблюдали выраженный бактерицидный эффект при использовании плазмидного вектора, содержащего конъюгативный транспозон Тп916.

Бремя, ч

Рис.Ю« Кинетика размножения клеток A. laidlawii после трансформации ДНК рекомбинантных плазмид pmell (—) и рте12 (—). В качестве контроля использована ДНК плазмиды pUC19 (—).

В этом случае ген меллитина находился под контролем промотора гена tetM. Сконструировав рекомбинантную плазмиду, в состав которой входит Тп916, содержащий ген меллитина, мы получили возможность влиять на размножение микоплазм, используя их естественное свойство акцептировать упомянутый генетический элемент, возможно, с помощью эукариотической клетки-хозяина. По нашему мнению, доставка данного генетического элемента в микоплазму предопределена свойством этих микроорганизмов захватывать ДНК экзогенного происхождения в процессе адаптации к теграциклинам in vivo. В будущем такие конструкции можно будет доставлять при помощи естественных обитателей биоценоза, например таких, как Lactobacillus sp. Сконструированная нами генетическая конструкция будет активна, когда бактерии-акцепторы попадут в среду с терапевтическими концентрациями тетрациклина. В

случае трансформации микоплазм продукты экспрессии меллитина будут нарушать адаптационный цикл этих микроорганизмов и способствовать их удалению из организма-хозяина.

Несомненно интересной и альтернативной представлялась возможность влияния на мико плазменную инфекцию в клеточной культуре при регулируемом синтезе пептида в инфицированных клетках. Эффект элиминации микоплазм при наработке меллитина, по-видимому, был связан с влиянием пептида на плазматическую мембрану и нарушением тесной ассоциации клетки-паразита и клетки-хозяина Продолжение исследований в этом направлении будет фокусироваться на изучении закономерностей регулируемой экспрессии меллитина в эукариотаческой клетке и оптимизации условий доставки генно-инженерных конструкций г клетку, инфицированную микоплазмамя.

Подводя итог этому разделу работы, можно сделать вывод, что использование рекомбинантных плазмид, в состав которых входят гены пептидных антибиотиков может явиться основой для последующей разработки и применения векторов для генотсрапии микоплазмозо! или инфекционных заболеваний, имеющих схожую с миконлазмами физиологик персистирования в организме хозяина. Вместе с тем, мы сделали пока первые шаги в этой направлении. Представляется актуальной разработка рекомбинантных векторов, способны) экспрессировать ген меллитина как в клетках хозяина, так и в клетках микоплазм. Такая бинарна; конструкция при осуществлении адресной доставки к инфицированным клеткам организма можс быть эффективной не только в условиях эксперимента, но и в практической медицине.

В заключение следует сказать, что исследование резистентности молликут I фторхинолонам и тетрациклинам представляет большой интерес как с клинической точки зрения так и при изучении фундаментальных механизмов адаптации микроорганизмов I неблагоприятным условиям, включая антибактериальные препараты.

t »

Клинический аспект этой проблемы связан с тем, что препараты широкого спектра действия - фторхинолоны и тетрациклины - все чаще становятся безальтернативными препаратами антимикробного действия, применяемыми для лечения микоплазмозов, а точнее хронических воспалительных заболеваний, с которыми ассоциированы микоплазмы. Сегодня у клиницистов преобладают во многом ошибочные представления об излечивании микоплазмозов при использовании традиционных антибактериальных препаратов. При наблюдении пациентов через 3-6 месяцев в большинстве случаев наблюдается манифестация инфекции, устойчивой к примененным антибактериальным агентам. Помимо того, что 10-25% всех клинических изолятов уреаллазм и микоплазм содержат te/M детерминанту и являются конститутивно резистентными к тетрациклинам, существует высокая вероятность того, что микоплазменные клетки в условиях персистирования в организме приобретут альтернативную устойчивость и обусловят хронизацию инфекционного процесса. Реальные представления клиницистов о механизмах формирования устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам слишком схематичны и исключают вопросы, связанные с мембранным и внутриклеточным паразитизмом этих микроорганизмов. Поэтому в настоящее время наблюдается высокий процент осложнений при применении антибактериальной терапии, направленной на элиминацию микоплазм. Устойчивость молликут в силу перечисленных выше обстоятельств оказывается гораздо выше, чем резистентность других представителей микробного биоценоза. Вследствие этого применение антибактериальных агентов нередко заканчивается дисбиотическими расстройствами и грибковыми заболеваниями.

Фундаментальные аспекты нашего исследования сфокусированы на понимании основных закономерностей адаптационного процесса у молликут, автономно реплицирующихся живых систем с минимальным объемом генетической информации. Значительное уменьшение информационной емкости генома обуславливает редукцию всех систем метаболизма, включая

системы транспорта, транскрипции, трансляции, репликации, рекомбинации и репарации [Razia, S. et al., 1998]. Логично предположить, что результатом такой редукции должно стать ограничение адаптационных возможностей молликут. Выбрав в качестве экспериментальной модели селекцию в присутствии ФХ и Тс и проанализировав генетические изменения, происходящие в ходе формирования резистентности клеточной популяции, мы показали, что микоплазмы обладают высокой пластичностью метаболизма и легко приспосабливаются к действию бактерицидного антибиотика Модель адаптации микоплазм к антибактериальным агентам может быть рассмотрена как подход для изучения принципов организации клетки, способной автономно реплицироваться и эффективно настраиваться на новые условия существования.

Общее заключение

Представления о процессах, приводящих к формированию устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам, являются неотъемлемой частью наших знаний об адаптационных возможностях этих микроорганизмов. К сожалению, приходится констатировать, что микоплазмы до настоящего времени рассматривались только в кондиционированных условиях обитания - при культивировании в богатых питательных средах, содержащих сыворотку и другие специальные компоненты. Все существующие представления о механизмах адаптации этих микроорганизмов построены на экспериментальных данных, касающихся отличий между антигенными структурами у клинических изодятов в пределах одного вида, либо отличий в строении генома, обнаруженных при культивировании молликут в лаборатории и проведении экспериментов in vitro. Пресловутые генетическая нестабильность и гетерогенность микоплазм - группа феноменов, на самом деле отражающих статические отличия, а не динамические процессы, изменяющие геномную информацию и преобразующие метаболизм клетки в целом. Проявления

енетической нестабильности генома молликут, включая и генетические вариации антигенных трукгур, были зарегистрированы в результате либо очень специфических воздействий, таких, [апример, как применение моноклональных антител против определенных эпитопов ипервариабельных липопротеиновых антигенов, либо являются отличиями, обнаруженными у [риродных нзолятов. Попытки экспериментаторов получить аналогичные вариации генома в ¡абораторных условиях, как правило, заканчиваются неудачей. Во многом это обусловлено осокой зависимостью микоплазм от внешних источников энергии, витаминов, аминокислот и (ругих строительных компонентов, возможности синтезировать которые они (микоплазмы) гошились вследствие паразитического способа жизни. Исследователи пытаются воспроизвести [роцессы, которые приводят к адаптации микоплазм к меняющимся условиям существования по шисанному набору состояний, используя изученные механизмы для других микроорганизмов. Следуя этому алгоритму, необходимо быть предельно осторожным, так как прямая аналогия с гавестными адаптационными механизмами бактерий здесь вряд ли возможна!

Примером парадокса, возникающего при рассмотрении физиологии адаптирующихся ликоплазм, являются отличия, которые существуют в наших представлениях о микошшмах, как з чрезвычайно зависимых и «слабых» живых системах, нуждающихся во многих питательных компонентах для жизнедеятельности, и «результатах», которые мы получаем при воздействии на :шх токсинов, антибактериальных агентов, иммунокомпетентных клеток, специфических антител и др. Высокая пластичность, толерантность, способность быстро и эффективно на популяционном, а не на клеточном уровне продуцировать устойчивость к антибактериальным препаратам и токсинам вызывает недоумение по поводу существующих представлений и схем организации этой формы жизни. Таким образом постановка вопроса об адаптационных возможностях молликут требует прежде всего выработки адекватной модели изучения этих

процессов у микоплазм. Вряд ли целесообразно определять частоту мутагенеза в определенных генетических локусах, играющих у других микроорганизмов существенную или определяющую роль при формировании устойчивости, так как у микоплазм мутагенез является всего лишь признаком, подтверждающим процесс адаптации. Нам представляется оправданным рассматривать адаптивный мутагенез в генах-мишенях, ограничение транспорта антибактериального препарата или токсина или увеличенный экспорт (эффлюкс) определенных соединений из клетки как отдельные этапы скоординированного физиологического процесса, приводящего к биологическому выживанию большой части популяции микоплазм в условиях изменяющейся среды. По нашему мнению, имеет смысл говорить скорее об определяющей роли метаболизма в целом, а не структурных изменений в геноме или какой-то определенной части метаболических реакций, имеющих по замыслу конкретного исследователя определенное значение в адаптационном акте. На самом деле, адаптация микоплазм - это скоординированный переход всей биохимической сети (включая молекулу ДНК), ограниченной плазматической мембраной, из одного состояния в другое. Часто определяемые значения тех или иных параметров метаболизма отличаются в этих состояниях весьма незначительно, однако аддитивный эффект изменения всех параметров очень большой - микоплазма становито толерантной к действию адалтогена.

Вместе с тем представляется не совсем корректным рассматривать адаптационные способности молликут вне тех условий, к которым они приспособились в результате длительно} эволюции паразитизма. Изучая микоплазмы в их естественной среде обитания (клетка хозяина искусственно подобранная среда культивирования), мы наблюдаем очень высокие адаптационны! способности этих микроорганизмов по отношению к внешним воздействиям, включая I применение антимикробных препаратов. Выбранная нами модель - формирование устойчивости ]

антибактериальным препаратам бактериостатического и бакгериоцидного действия -1>торхинолонам и тетрацшслинам - позволила если не объяснить все существующие возможности, ¡апрограммировапныс в молликушх природой в результате длительной эволюции паразитизма, го по крайней мере обозначить основные пути исследования принципов, реализованных природой в этих "примитивных" формах жизни.

Проведенные нами исследования наглядно продемонстрировали высокую метаболическую пластичность мшоплазм, множественность ответа на адаптоген (антибактериальный препарат) и существенную роль клетки-хозяина в приспособляемости молликут к действию антибиотиков. Однако, мы смогли описать только некоторые механизмы, которые определяют устойчивость к антибактериальным агентам. Остальные исследования были направлены как раз на то, чтобы показать - микоплазмы реализуют формирование устойчивости так, как это предопределяют условия эксперимента или окружающей среды. Исходя из таких представлений, можно сделать вывод - к настоящему моменту не существует эффективных средств защиты от микоплазм и этот вопрос следует рассматривать более пристально.

Выводы

Культивирование лабораторных штаммов M.hominis Н-34 и A.laidlawii PG-8B на жидкой питательной среде с повышающимися концентрациями ФХ и Тс приводит к появлению высокорезистентных мутантов. Проводимая селекция обуславливает формирование устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам, перестраивая метаболический аппарат клетки и вызывая генетические изменения. Формирование резистентности к ФХ сопровождается появлением мутаций в генах мишенях ДНК-гиразе и топоизомеразе IV. Обнаружены новые мутации в QRDR gyrA M.hominis (Ser84-+Pro, G!u87~»Ala,) и A.laildawii (Ser83~> Ala, Ser83-~> Phe, Asp91-»Asn) и QRDR parC M.hominis (Ser91->Tyr) и A.laildawii (Ser91->Leu). В результате селекции получен мутант M.hominis, не имеющий изменений в QRDR, но устойчивый к высоким концентрациям всех трех использованных в работе ФХ.

.Показано, что формированию мутаций в генах-мишенях предшествует комплекс адаптивных метаболических реакций, приводящих к ограничению накопления ФХ. В ходе проведения селекции мутации у микоплазм были обнаружены при концентрациях ФХ в 10 раз превышающих МИК препаратов для лабораторных штаммов. Показано, что первичной мишенью является ген А-субъединицы топоизомеразы IV. В генах В-субъединиц ДНК-гиразы и тоюизомеразы IV у M.hominis и A.laidlawii мутаций не обнаружено.

Показано, что формирование резистентности у лабораторного штамма Н-34 и клинических изолятов М. hominis происходит аналогично и сопровождается улучшением их культивнрумости в лабораторных условиях. Показана высокая

генетическая вариабельность QRDR-области А-субъедшшцы ДНК-гиразы у клинических изолятов.

. Обнаружена и охарактеризована новая мозаичная структура tetM гена у клинических изолятов M.hominis и U.urealyticum. При исследовании клинических изолятов микоплазм и уреаплазм показано, что 10-22% клинических изолятов содержат в составе генома ген tetM. Индивидуальная устойчивость к тетрациклину у lelM* клинических изолятов варьирует от 0.5 до 32 мкг/мл.

. Впервые зарегистрировано возникновение устойчивости к тетрацшшинам у микоплазм при их культивировании в среде с повышающимися концентрациями антибактериального агента. Показано, что Тск-клетки, характеризуются ограничением накопления антибактериального агента вследствие модификации плазматической мембраны. При этом перекрестная устойчивость к антибактериальным агентам фторхинолонового ряда также возрастает.

Сконструированы и апробированы рекомбинантные плазмиды, содержащие ген амфипатаческого пептида меллитина с выраженными бактерицидными свойствами, позволяющие проводить селективную экспрессию меллитина в клетках M.hominis и A.laidlawii и регулируемую экспрессию в эукариотических клетках. Использование рекомбияантных плазмид приводит к гибели молликутов в культуре и элиминации микоплазм из инфицированных культур эукариотических клеток.

CHOBHblE НАУЧНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адаптация культуры Acholeplasma laidlawii к толуолу. Микробиология, 1989, 58, №5, 764768 (совместно с Мамбетисаевой Э.Т., Артюшиной JLA., Капитоновым А.Б.).

2. Изменение морфологии колоний клеток Acholeplasma laidlawii при адаптации культуры к мембранотропным агентам. Микробиология, 1989, 58, №6, 976-979 (совместно с Капитановым А.Б., Ладыгиной В.Г.).

3. Индукция гидроксилазной системы в клетках Acholeplasma laidlawii b-нафтофлавоном. Микробиология, 1990, 59, №2,241-244 (совместно с Капитановым А.Б., Ладыгиной В.Г.).

4. Зависимость изменения относительного содержания холестерина в плазматической мембране клеток растущей культуры Acholeplasma laidlawii от окисленности липидов сыворотки питательной среды. Биол.мембраны, 1990, 7, №5, 506-513 (совместно с Клебановым Г.И., Капитановым A.B., Аскаровой Э.А., Погода Т.В., Муханкиным А.И., Кулаковой С.Н., Теселкиным Ю.О.).

5. Изменение липидного состава плазматической мембраны клеток Acholeplasma laidlawii в ходе НАДН-оксидазной реакции. Биол. мембраны, 1990, 7, №6, 619-625 (совместно с Грибановым Г.А., Аскаровой Э.А., Капитановым А.Б., Артюшиной Л.А., Чагиной Н.С., Калимал И.М., Бондаревой Е.В.).

6. Структурно-функциональные перестройки плазматической мебраны клеток Acholeplasma laidlawii при адаптации к толуолу. Автореферат дисс. на соиск. учен. ст. канд. биол. наук. М., 1991. 24с.

7. Зависимость переноса холестерина из липосом в плазматические мембраны клеток Acholeplasma laidlawii от содержания в мембранах каротиноидов. Биол. мембраны, 1992, 9, №2, 640-645 (совместно с Капитановым А.Б.).

8. Липопротеинсвязывающая активность различных классов липидов клеток Acholeplasma laidlawii. Биол. мембраны, 1992, 9, №2,634-639 (совместно с Капитановым А.Б.).

9. Изменение липидного состава клеток Acholeplasma laidlawii под действием толуола. Микробиология, 1993, 62, 70-75 (совместно с Бондаревой Е.В.,Кулаковой С.Н., Капитановым А.Б.).

10. Express diagnostics of tuberculosis and differential diagnostics of M. hominis, U. urealyticum and Chlamidia spp. by samples of human and animals. Intern.Symp. "New Horizonts in Genes Amplification Technologies".California SF, July 8-10, 1994. Abstracts, 148-149 (with Naroditsky В., Denisova Т., Vladimirsky M,, Brodsky M.).

11. Роль холестерина и его эфиров в процессе адаптации клеток Acholeplasma laidlawii в течение латентной фазы развития культуры. Симпозиум по биохимии липидов. 3-6 октября 1994г., С.-Л. Тез.докл. (совместно с Волгиной Т.В., Малаховой М.В.).

12. Идентификация М. hominis, U. urealyticum и Ch. trachomatis методом полимеразной цепной реакции. Бюлл. эксперимент, биологии и медицины, 1995, №12, 606-609 (совместно с Бродским М.Ю., Халиловым Э.М., Ждановым A.B., Файзуллиным Л.З., Сухих Г.Т.).

13. Применение метода полимеразной цепной реакции для выявления Ch. trachomatis, U.urealyticum, M.hominis в акушерско-гинекологической практике. Информац. письмо МЗ РФ, М.,1995, 12с. (совместно с Бродским М.Ю., Халиловым Э.М., Сухих Г.Т., Файзуллиным Л.З., Ждановым A.B.).

14. Выявление Ch.trachomatis, M.hominis и U.urealyticum методом полимеразной цепной реакции при патологиях репродуктивной системы мужчин и женщин. Бюлл. эксперимент, биологии и медицины., 1996, 124, №5, 547- 550 (совместно с Ждановым A.B., Малининой Э.В.,

Бурменской О.В., Файзуллиным JI.3., Кулаковым В.И., Сухих Г.Т., Бродским М.Ю., Халиловым Э.М.).

15. Метод мультипраймерной ПЦР для одновременного обнаружения Ch. trachomatis, M.hominis и U.urealyticum в клинических образцах. Сб.статей 1 Всероссийской конференции "Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Методы лечения." 8-10 апреля 1996, Сочи, с. 7-13 (совместно с Бродским М.Ю., Ждановым A.B., Файзуллиным Л.З., Лопухиным Ю.М.).

16. Метод детекции детерминант устойчивости грамположительной микрофлоры человека ПЦР. Там же, с. 55-65 (совместно с Бродским М.Ю.).

17. О формировании резистентности к фторхинолонам у Mycoplsama hominis и Acholeplasma laidlawii. Мол.генетика, микробиология и вирусология, 1998, №3,16-19 (совместно с Гущиным А.Е., Ладыгиной В.Г., Абрамычевой Н.Ю., Тополь Ю.Ю.).

18. Структурные изменения в плазмалемме Acholeplasma laidlawii при действии тетрациклина. Материалы X Международной конф."Магн. резонанс в химии и биологии" Суздаль, 199& (совместно с Вахрушевой Т.В., Абрамычевой Н.Ю.).

19. Новые направления в ДИК- диагностике. Материалы 4 международн. конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии", Ялта-Гурзуф, 1998. С.197-199.

20. Резистентность микоплазм к фторхинолонам. Материалы 4 международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии", Ялта-Гурзуф, 1998. С. 220-223 (совместно с Гущиным А.Е., Тагановым К. Д.).

21. Резистентность микоплазм к тетрациклином. Материалы 4 международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии", Ялта-Гурзуф, 1998. С. 223-226 (совместно с Тополь Ю.Ю.).

22. Механизмы формирования антабиотикоустойчивости клинических штаммов микоплазм и методы их выявления. Материалы 2-Всероссийской Конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний", М.,1998. С.16-2С (совместно с Гущиным А.Е., Тополь Ю.Ю.).

23. Клиническое значение определения бвоваров U.urealyticum с использованием ПЦР-диагностики. Там же, с.31-34 (совместно с Безруковым В.М., Назаренко Е.Г., Дорониной EIL Екимовым А.Н., Файзуллиным Л.З., Сухих Г.Т.).

24. Использование метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагменте! ДНК (SSCP) для выявления резистентности Mycoplasma hominis к фторхинолонам Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1998, №4,37-40 (совместно с Гущины»

A.Е., Тагановым К.Д., Тополь Ю.Ю.).

25. Использование компьютерной морфоденситометрии в современной молекулярно диагностической практике. Вопросы мед. химии, 1998, т.44, №6, 527-536 (совместно с Когаю» Э.М., Жукоцким A.B., Момыналиевым К.Т., Потаповым И.А., Якубовой Н.И., Ялпаевь»

B.В.).

26. Роль мутаций в рагС и gyrA в формировании устойчивости Mycoplasma hominis i фторхинолонам. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1999, №4, 19~2¿ (совместно с Гущиным А.Е., Ладыгиной В.Г.).

27. Molecular diversity of U.urealyticum isolates from patients with cystitis. Congress "Resistanci to Antimicrobial Agents ", Monte Carlo, October 20-23, 1999. Abstracts, p.54 (with Ekimov A.N. Zagrebina O.S., Kisina V.l.).

5. The role of par С and gyr A in resistance to fluoroquinolones of mollicutes M. hominis and ¡.laidlawii. Congress "Resistance to Antimicrobial Agents", Monte Carlo, October 20-23, 1999. abstracts, p.59 (with Guschin A.Ye., Taganov K.D., Abramicheva N.Y.).

Антибиотикоустойчивость Mycoplasma hominis в клинической практике. Инфекции, ередаваемые половым путем, 1999, №2, 32-34 (совместно с Тараскиной A.M., Тополь Ю.Ю., "авичевой А.М.).

). Молекулярно-биологические методы выявления и идентификации инфекционных агентов. Циническая лабораторная аналитика, т.2. М.,Лабинформ-РАМЛД, 1999. С.301-322. '. Изменение свойств плазматической мембраны Acholeplasma laidlawii при действии етрациклина. Антибиотики и химиотерапия, 1999, 44, №2, 8-12 (совместно с Абрамычевой Г.Ю., Вахрушевой Т.В.).

!. Recombinant mellitin cytotoxic effects in the Acholeplasma laidlawii and Mycoplasma hominis ells. The international Symp."Candidate Genes for Animal Health" August 25- 27, 1999, Rostock. ibstacts.(with Bcvova M.R., AlexandrovaN.M).

t. Трансформация Mhominis плазмидой pAM120 с помощью электропорации. Генетика,

000, №3,109-114 (совместно с Александровой Н.М., Бевовой М.Р.).

к Использование метода полимеразной цепной реакции In Situ для выявления нутриклеточной локализации микоплазмы Mycoplasma hominis в культивируемых клетках Не а. Цитология, 2000, 42, №2, 202-208 (совместно с Момыиалиевым К.Т., Орловой В.Ф., {укоцким А.В., Коганом Э.М.).

1. Анализ генов, кодирующих ДНК- гиразу Acholeplasma laidlawii PG-8B. Молекулярная иология, 2000, №2, 292-299 (совместно с Тагановым К.Д., Гущиным А.Е., Акопиан Т.А., (парипой Н.Ю., Абрамычевой НЛО.).

I. Роль мутаций в А-субъединице топоизомеразы IV Acholeplasma laidlawii PG-8B в юрмировании резистентности к фторхинолонам. Мол.генетика, микробиология и ирусология, 2000, №2, 30-33 (совместно с Тагановым К.Д., Гущиным А.Е., Абрамычевой [.Ю.).

Участие транспортно-барьерных функций плазматической мембраны в развитии езистентности к фторхинолонам (ципрофлоксацину) у Acholeplasma laidlawii. Антибиотики химиотерапия, 2000, №5, 17-20 (совместно с Абрамычевой Н.Ю.).

Генная терапия хронических инфекционных заболеваний урогенитального тракта с спользованием цитотоксических пептидов (обзор). Вопросы биомед. химии, 2000 (в печати) :овместно с Лазаревым В.Н., Парфеновой Т.М., Александровой Н.М.).

Анализ QRDR gyrA и рагС клинических изолятов Mycoplasma hominis. Мол. генетика, икробиология и вирусология, 2000 (в печати) (совместно с Гущиным А.Е., Ладыгиной В.Г., !авичевой А.М., Тараскиной A.M.).

I. Цитотоксическая активность мелитина, экспрессируемого рекомбинантными векторами, в летках Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma hominis. Генетика, 2000 (в печати) (соместно с лександровой Н.М., Бевовой М.Р.).

Список сокращений

ФХ - фторхинолоны

Тс - тетрацшлины

Cil - ципрофлоксацин

Lfl - ломефлоксадин

Oil - офлоксацин

CflR - резистентный к Сй

LflR- резистентный к Lfl

ФХк-фторхинолонрезистентный клон

Тс-тетрациклин

Дс-доксициклин

Тск-тетрациклинрезистентный клон

GyrA - А-субъединица ДНК-гиразы

GyrB- В-субъединица ДНК-гиразы

РагС- А-субъединида топоизомеразы IV

РагЕ- В-субъединица топоизомеразы IV

ОРС-открытая рамка считывания

MDR- mul ti drug resistance

OflR - резистентный к Oil.

QRDR-Quinolone Reistance-Determining Region

регион, определяющий резистентность к фторхинолонам МИК - минимальная ингибирукяцая концентрация ПЦР - полимеразная цепная реакция т.п.о. - тысяч пар оснований УГТ- урогенитальный тракт ЭГ1Р- электронный парамагаитный резонанс

Гс-гаусс, единица измерения напряженности электромагнитного поля SSCP - {информационный полиморфизм одаоцепочечных фрагментов ДНК (single strand conformation polymorfism)

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Говорун, Вадим Маркович

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молликуты. Общая характеристика класса

1.2. Сравнительная геномика микоплазм

1.2.1. Сигнальные системы

1.2.2. Транспорт

1.2.3. Другие особенности и свойства геномов микоплазм

1.3. Механизмы изменчивости генома микоплазм

1.3.1. Антигенная изменчивость

1.3.2. Хромосомные перестановки 26 1.3.2.1 .Фрагменты структурных генов 34 1.3.2.2. Интегрированные вирусные последовательности 35 L3.2.3. IS-подобные элементы

1.3.3. Влияние внешних воздействий на изменчивость генома микоплазм

1.3.3.1. Трансформация микоплазм

1.3.3.2. Культивирование микоплазм

1.3.4. Биохимические особенности организации плазматической мембраны молликут

1.4. Краткая характеристика микроорганизмов, объектов hccj(едования

1.4.1. Ureaplasma urealyticum 42 1.4.1.1. Общая характеристика 42 1.4Д.2. Классификация U.urealyticum

1.4.1.3. Факторы вирулентности U. urealyticum

1.4.1.4. Эпидемиология и клиническое значение

1.4.1.5. Чувствительность U. urealyticum к антибактериальным агентам

1.4.2. Acholeplasma laidlawii

1.4.3. Mycoplasma, hominis

1.5. Антибактериальные препараты, используемые для лечения микоплазмозов и известные механизмы защиты

1.5.1. Основные группы антибактериальных агентов, используемых при лечении микоплазмозов

1.5.2. Антибиотикорезистентность микоплазм

1.5.3. Фторхинолоны - синтетические препараты - ингибиторы топоизомераз

1.6. Резистентность микроорганизмов к фторхинолонам

1.7. Универсальные механизмы резистентности бактерий

1.8. Генная терапия хронических инфекционных заболеваний урогенитального тракта с использованием цитотоксических пептидов

1.8.1. Современное состояние генной терапии микоплазменных инфекций

1.8.2. Цитотоксические пептиды

1.9. Общие замечания

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Определение нуклеотидных последовательностей генов-мишеней для действия ФХ

3.1.1. Определение нуклеотидной последовательности

QRDR-фрагмента гена gyrA у М. hominis Н

3.1.2. Определение нуклеотидной последовательности генов, кодирующих субъединицы ДНК-гиразы A. laidlawii.

3.1.3. Поиск фрагментов генов, кодирующих субъединицы топоизомеразы IV типа А.laidlawii, и определение их нуклеотидной последовательности

3.1.4. Разработка и использование метода амплификации с произвольным праймером (RAPD) для генотипирования микоплазм

3.1.5. Метод генотипирования клинических изолятов

Ureaplasma urealyticum биовара Parvo

3.1.6. Метод трансформации M.hominis плазмидойрАМ с использованием электропорации

3.2. Построение экспериментальной модели для изучения феноменологии адаптации (формирования резистентности) микоплазм к антибактериальным агентам в лабораторных условиях

3.2.1. Селекция лабораторного штамма M.hominis Н в присутствии ципрофлоксацина

3.2.2. Получение культур лабораторного штамма M.hominis Н-34, резистентных к ципрофлоксацину, офлоксацину и ломефлоксацину

3.2.3. Исследование перекрестной резистентности культур M.hominis к ФХ

3.2.4. Культивирование ципрофлоксацин-резистентных культур M.hominis при постоянных концентрациях препарата

3.2.5. Исследование QRDR геноврагС и gyrA клинических изолятов M.hominis

3.2.6. Культивирование клинических изолятов на ципрофлоксацине, офлоксацине и ломефлоксацине

3.2.7. Исследование генетической вариабельности клинических изолятов М. hominis

3.2.8. Особенности формирования ФХ-резистентных клонов у клеток A. laildawii

3.2.9. Биохимические особенности адаптации микоплазм к воздействию антибактериальных препаратов

3.3. Определение параметров накопления и вывода бромистого этидия и ципрофлоксацина у мутантов A.laidlawii и M.hominis, резистентных к разным концентрациям ФХ

3.3.1. Получение мутантов, устойчивых к бромистому этидию, и выявление перекрестной устойчивости этих мутантов к фторхинолонам

3.3.2. Накопление и выброс бромистого этидия

3.3.3. Влияние ингибиторов на процессы накопления и выброса бромистого этидия клетками M.hominis и A.laidlawii

3.4. Характеристика процессов формирования резистентности микоплазм и уреаплазм к тетрациклинам

3.4.1. Определение аллельного полиморфизма (мозаичности) tetM у клинических изолятов M.hominis и U.urealyticum

3.4.2. Особенности персистированя клинических изолятов U.urealyticum при применении тетрациклинов

3.4.3. Клиническая характеристика изолятов U.urealyticum

3.4.4. Результаты выявления tetM детерминанты среди клинических изолятов

3.4.5. Получение мутантов клеток молликут, устойчивых к тетрациклину

3.4.6. Устойчивость клеток M.hominis и A.laidlawii к ФХ в присутствии клеток HeLa 210 3.5. Применение рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген меллитина, для подавления размножения молликут

3.5.1. Цитотоксическая активность меллитина, экспрессируемого рекомбинантными векторами, в клетках

Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma hominis

3.5.1.1. Конструирование рекомбинантного вектора, экспрессирующего ген меллитина, на основе плазмиды pUC

3.5.1.2. Конструирование рекомбинантного вектора, экспрессирующего меллитин, на основе плазмиды рAM

3.5.2. Кинетика размножения клеток E.coli, содержащих рекомбинантные плазмиды pmel 1 и рте

3.5.3. Кинетика размножения клеток А. laidlawii после трансформации

ДНК рекомбинантных плазмид рте11ирше

3.5.4. Проверка цитотоксической активности рекомбинантного вектора рАМ120, экспрессирующего меллитин в клетках М. hominis

3.5.5. Экспрессия гена меллитина в клетках А. laidlawii и М. hominis

3.5.6. Система регулирования уровня экспрессии целевого гена в эукариотических клетках

3.5.7. Экспрессия меллитина в линии клеток, инфицированных М. hominis

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 230 ВЫВОДЫ 257 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

ФХ - фторхинолоны Тс - тетрациклин Дс - доксициклин Cfl - ципрофлоксацин Lfl - ломефлоксацин Ofl - офлоксацин CflR - резистентный к Cfl LflR - резистентный к Lfl OflR - резистентный к Ofl. резистентный к фторхинолонам TcR- резистентный к тетрациклинам GyrA - А-субъединица ДНК-гиразы GyrB - В-субъединица ДНК-гиразы РагС - А-субъединица топоизомеразы IV РагЕ - В-субъединица топоизомеразы IV ОРС - открытая рамка считывания

MDR - множественная лекарственная резистентность (multi drug resistance)

QRDR - регион отвечающий за формирование устойчивости к фторхинолонам (Quinolone Reistance-Determining Region)

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

ПЦР - полимеразная цепная реакция т.п.о. - тысяч пар оснований

УГТ- урогенитальный тракт

ЭПР- электронный парамагнитный резонанс

SSCP - конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов ДНК single strand conformation polymorfism) ori - точка начала репликации ИПТГ- изопропилтиогалактозид EtBr - бромистый этидий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у молликут"

Молликуты (микоплазмы) - наименьшие из известных микроорганизмов, способных к самостоятельному делению. Геном одного из представителей класса — Mycoplasma genitalium - всего в несколько раз больше генома крупных вирусов и составляет 580070 п.о. [130,330]. Характерными и очень важными особенностями молликут являются их распространенность как паразитов многоклеточных организмов и видоспецифичность по отношению к макроорганизму-хозяину, в котором, в основном, и происходит персистирование большинства видов мико плазм [21,22,23]. Являясь «идеальными» паразитами, микоплазмы при некоторых состояниях макрорганизма способны вызывать выраженные патологические изменения восцалительного характера с формированием длительно персистирующей инфекции, нередко осложненной выраженными аутоиммунными расстройствами [22]. Известны эпидемические вспышки воспалительных инфекционных заболеваний, обусловленных микоплазмами у сельскохозяйственных животных, птиц, растений, а также у человека [454,137]. Примером такого рода заболеваний у человека является так называемый «синдром Персидской войны», поразивший контингент американских войск во время недавней войны в Заливе и возобновивший дискуссию об использовании микоплазм в качестве бактериологического оружия [462]. Следует подчеркнуть, что в клинике заболеваний человека наибольшую опасность представляют микоплазмозы с преимущественной локализацией в урогенитальном и респираторном трактах, характеризующиеся хроническим течением и аутоиммунными осложнениями [50,76,77,92,181]. Mycoplasma hominis и Urealyticum.urealyticum, колонизируя слизистые поверхности урогенитального тракта, ассоциированы с развитием сальпингитов, простатитов, уретритов, кольпитов, циститов и др [355,462]. Применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия для лечения микоплазмозов приводит к возрастанию уровня резистентности сопутствующей микрофлоры и длительному персистированию микоплазм с развитием всевозможных осложнений [36,456,457]. К настоящему времени в медицинской и научной литературе накоплен противоречивый материал об индивидуальной устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам. С одной стороны, группы препаратов тетрациклинового, фторхинолонового ряда и макролиды в опытах in vitro оказывают выраженное ингибирующее действие на клетки молликут, культивируемые на искусственных питательных средах, с другой - применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции микоплазм в организме-хозяине часто оказывается малоэффективным [36,456,457]. Кроме того, показано, что микоплазмы в ходе культивирования на искусственных питательных средах быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным агентам [456]. Этот факт связывают с наличием высокой нестабильности генома вследствие частых событий реорганизации хромосомы по типу «выщепление-встраивание» [107,326,353,431,432]. Такие противоречивые экспериментальные и медицинские данные четко обозначают одно из приоритетных направлений исследований микоплазм - изучение фундаментальных, эпидемиологических и медицинских аспектов резистентности молликут к применяемым антибактериальным агентам.

Современный методический арсенал позволяет вынести на первый план исследования этой проблемы вопросы, связанные с механизмами формирования резистентности. Решение этих задач приведет к пониманию интегральных биохимических особенностей молликут, предопределяющих их повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость и толерантность к факторам защиты организма-хозяина и применяемым в настоящее время антибактериальным препаратам. Следует отметить, что выявление возможных изменений в геноме микоплазм под действием антибактериальных препаратов имеет не только фундаментальное значение. Речь идет и о более важных с точки зрения современной теоретической медицины фактах, которые могут быть положены в основу новых представлений о применении антибиотиков при лечении инфекций, обусловленных микроорганизмами с мембранной и внутриклеточной локализацией, к числу которых, безусловно, относятся и микоплазмы.

В настоящее время для лечения микоплазменной инфекции используются синтетические препараты, действующие на широкий спектр микроорганизмов [37,354,459,463]. Дозы препаратов и их длительное применение для воздействия на молликуты приводят к развитию побочных эффектов, к числу которых необходимо прежде всего отнести системный и местный дисбиоз.

Одним из эффективных направлений борьбы с внутриклеточными бактериальными агентами и вирусами является создание генно-инженерных конструкций с так называемыми «суицидными» генами, селективно экспрессируемыми в инфицированных клетках организма-хозяина либо в самом инфекционном бактериальном агенте с последующим его разрушением и эффективным представлением антигенов иммунологической системе. В последнее время изучается возможность применения ДНК-вакцин, позволяющих экспрессировать антигены в клетках макрорганизма. Уже появились первые сообщения о создании ДНК-вакцин против микоплазм-паразитов сельскохозяйственных животных [27,116,118,119]. Однако, вследствие высокой гетерогенности и изменчивости антигенных структур молликут представляется необходимым и актуальным разработка методов генной инженерии и генотерапии, способных проводить селективную элиминацию микоплазм из организма хозяина с одновременным увеличением иммунного ответа на существующие в данный момент варианты антигенных структур. Для этих целей представляется перспективным использование генов амфифильных пептидов, обладающих выраженной гемолитической и бактерицидной активностью [95,151,152,397]. Применение высокоочищенных препаратов этого ряда в практике ограничено вследствие высокой гемолитической и токсической активности для человека и животных и низкой селективности. Контролируемая направленная экспрессия таких пептидов в клетках мишени, напротив, может оказаться эффективным инструментом для лечения и протекции макроорганизма от микоплазм, хламидий.

Подводя итог вышесказанному, можно сделать вывод, что изучение основных механизмов формирования резистентности микоплазм к антибактериальным агентам, применяемым для их эрадикации из организма, и поиск принципиально новых подходов к лечению микоплазмозов и других инфекционных заболеваний, вызванных внутриклеточным персистированием молликут в клетках хозяина, являются актуальными задачами, подразумевающими фундаментальные и медицинские аспекты исследования.

Целью данной работы являлось комплексное изучение основных закономерностей формирования резистентности к тетрациклинам и фторхинолонам у урогенитальных микоплазм (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum) и Acholeplasma laidlawii и разработка теоретических основ применения рекомбинантных генов амфипатических пептидов для возможной генотерапии микоплазмозов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести клонирование и структурный анализ генов A.laidlawii PG-8B (gyrA, gyrB, parC parE), продукты которых являются потенциальными мишенями для действия антибактериальных препаратов.

2. Получить в лабораторных условиях серию лабораторных мутантов М. hominis, A.laildawii, U.urealiticum, устойчивых к действию препаратов фторхинолонового и тетрациклинового рада.

3. Определить мутации в QRDR генов gyrA, gyrB,parC и parE.

4. Выявить закономерности формирования резистентности к фторхинолонам и тетрациклинам у микоплазм, происходящего на уровне транспортных мембранных систем, и определить основные биохимические характеристики, обуславливающие образование устойчивых клеток в ходе применения антибактериальных агентов в условиях лабораторного культивирования.

5. Выявить закономерности переноса детерминанты устойчивости к тетрациклину tetM из микроорганизмов биоценоза влагалища в клетки урогенитальных микоплазм.

6. Охарактеризовать генетические вариации структуры гена tetM (мозаичность) у микоплазм.

7. Продемонстрировать принципиальную возможность использования рекомбинан-тных плазмид, содержащих экспрессирующую ген меллитина конструкцию, для подавления развития молликут в культуре клеток линий 293, HeLa, а также при культивировании микоплазм в лабораторных условиях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Говорун, Вадим Маркович

Выводы

1. Культивирование лабораторных штаммов M.hominis Н-34 и A.laidlawii PG-8B на жидкой питательной среде с повышающимися концентрациями ФХ и Тс приводит к появлению высокорезистентных мутантов. Проводимая селекция обуславливает формирование устойчивости микоплазм к антибактериальным агентам, перестраивая метаболический аппарат клетки и вызывая генетические изменения.

2. Формирование резистентности к ФХ сопровождается появлением мутаций в генах мишенях ДНК-гиразе и топоизомеразе IV. Обнаружены новые мутации в QRDR gyrA M.hominis (Ser84—»Pro, Glu87~>Ala,) и A.laildawii (Ser83-> Ala, Ser83-> Phe, Asp91->Asn) и QRDR parC M.hominis (Ser91->Tyr) и A.laildawii (Ser91->Leu). В результате селекции получен мутант M.hominis, не имеющий изменений в QRDR, но устойчивый к высоким концентрациям всех трех использованных в работе ФХ.

3. Показано, что формированию мутаций в генах-мишенях предшествует комплекс адаптивных метаболических реакций, приводящих к ограничению накопления ФХ. В ходе проведения селекции мутации у микоплазм были обнаружены при концентрациях ФХ, в 10 раз превышающих МИК препаратов для лабораторных штаммов. Показано, что первичной мишенью является ген А-субъединицы топоизомеразы IV. В генах В-субъединиц ДНК-гиразы и топоизомеразы IV у M.hominis и A.laidlawii мутаций не обнаружено.

4. Показано, что формирование резистентности к ФХ у лабораторного штамма Н-34 и клинических изолятов M.hominis происходит аналогично и сопровождается улучшением их культивирумости в лабораторных условиях. Показана высокая генетическая вариабельность QRDR-области А-субъединицы ДНК-гиразы у клинических изолятов.

5. Обнаружена и охарактеризована новая мозаичная структура tetM гена у клинических изолятов М.hominis и U.urealyticum. При исследовании клинических изолятов микоплазм и уреаплазм показано, что 10-22% клинических изолятов содержат в составе генома ген tetM. Индивидуальная устойчивость к тетрациклину у letMt клинических изолятов варьирует от 0.5 до 32 мкг/мл.

6. Впервые зарегистрировано возникновение устойчивости к тетрациклинам у микоплазм при их культивировании в среде с повышающимися концентрациями антибактериального агента. Показано, что TcR-клетки характеризуются ограничением накопления антибактериального агента вследствие модификации плазматической мембраны. При этом перекрестная устойчивость к антибактериальным агентам фторхинолонового ряда также возрастает.

7. Сконструированы и апробированы рекомбинантные плазмиды, содержащие ген амфипатического пептида меллитина с выраженными бактерицидными свойствами, позволяющие проводить селективную экспрессию меллитина в клетках М. hominis и A.laidlawii и регулируемую экспрессию в эукариотических- клетках. Использование рекомбинантных плазмид приводит к гибели молликут в культуре и элиминации микоплазм из инфицированных культур эукариотических клеток.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Говорун, Вадим Маркович, Москва

1. Abed Y. et all. 1995.Efficient discrimination of Mycobacterium tuberculosis strains by 16S-23S spacer region-based random amplified polymorphic analysis.• J. Clin. Microbiol. 33: 1418-1420.

2. Ahmad I. et al. 1995. Biophys. Acta. V. 1237. P.109-114.

3. Ahmed M., Lyass L., Markham P.N., Taylor S.S., Vazquez-Laslop N., Neyfakh A.A. 1995. Two highly similar multidrug transporters of Bacillus subiilis whose expression is differentially regulated. J. Bacteriol.; 177:3904-3910.

4. Ahmed,M., Borsch,C.M., Taylor,S.S., Vazquez-Laslop,N. and Neyfakh,A.A. 1994. A protein that activates expression of a multidrug efflux transporter upon binding the transporter substrates. J. Biol. Chem. 269 (45), 28506-28513

5. Ahmed,M., Lyass,L., Markham,P.N., Taylor,S.S., Vazquez-Laslop,N.and Neyfakh,A.A. 1995.Two highly similar multidrug transporters of Bacillus subtilis whose expression is differentially regulated. J. Bacteriol. 177 (14), 3904-3910

6. Akopyanz N. N. et all. 1992. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pilory detected by PCR-based RAPD fingerprinting. Nucleic Acids Res. 20: 5137-5142.

7. Alm,R.A., Ling,L.-S.L., Moir,D.T., King,B.L., Brown, E.D., Doig,P.C., Smith,D.R., Noonan,B., Guild,B.C., deJonge,B.L., Carmel,G., Tummino,P.J., Caruso,A., Uria-Nickelsen,M., Mills,D.M., Ives,C., Gibson,R., Merberg,D.,

8. Mills,S.D., Jiang,Q., Taylor,D.E., Vovis,G.F. and Trust,T.J. 1999. Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 397 (6715), 176-180

9. Amakasu,H., Suzuki,Y., Nishizawa,M. and Fukasawa,T. 1993. Isolation and characterization of SGE1: A yeast gene that partially suppresses gall 1 mutation in multiple copies. Genetics 134, 675-683

10. Andersson AS, Demel RA, Rilfors L, Lindblom G. 1998.Lipids in total extracts from Acholeplasma laidlawii A pack more closely than the individual lipids. Monolayers studied at the air-water interface. Biochim Biophys Acta. Feb 2;1369(1):94-102.

11. Andersson AS, Rilfors L, Bergqvist M, Persson S, Lindblom G. 1996. New aspects on membrane lipid regulation in Acholeplasma laidlawii A and phase equilibria of monoacyldiglucosyldiacylglycerol. Biochemistry. Aug 27;35(34):11119-30

12. Andersson AS, Rilfors L, Oradd G, Lindblom G. 1998.Total lipids with short and long acyl chains from Acholeplasma form nonlamellar phases. Biophys J. Dec;75(6):2877-87.

13. Andersson,S.G., Eriksson,A.S., Naslund,A.K., Andersen,M.S. and Kurland,C.G. 1996. The Rickettsia prowazekii genome: a random sequence analysis. Microb. Comp. Genomics 1 (4), 293-315

14. Andreev J, Borovsky Z, Rosenshine I, Rottem S. 1995. Invasion of HeLa cells by Mycoplasma penetrans and the induction of tyrosine phosphorylation of a 145-kDa host cell protein.FEMS Microbiol Lett. Oct 15;132(3):189-94.

15. Andrews SC. 1998. Iron storage in bacteria. Adv Microb Physiol.;40:281-351.

16. Athamna, A., R. Rosengarten, S. Levisohn, I. Kahane, and D. Yogev. 1997. Adherence of Mycoplasma gallisepticum involves variable surface mem-brane proteins. Infect. Immun. 65:2468-2471.

17. Bahner I.C., Zhou C., Yu X.J., Hao Q.L., J.C. Guatelli, Kohn D.B. 1993. Comparison of trans-dominant inhibitory mutant human immunodeficiency virus type 1 genes expressed by retroviral vectors in human T lymphocytes. J.Virol. V.67. P. 3199-3207.

18. Bak A.L., Christiansen C., Stenderup A. !970. Bacterial genome sizes determined by DNA renaturation studies. J.Gener.Microbiol. 64:377-380.

19. BaIas,D., Fernandez-Moreira,E. and De La Campa,A.G. 1998. Molecular characterization of the gene encoding the DNA gyrase A subunit of streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 180 (11), 2854-2861

20. Barile M. F., Crabowski M. W., Stephens E. B. et al. Mycoplasma hominis -tissue cell interactions: a review with new observations on phenotypic and genotypic properties. Sexually Trand. Dis., 10: 345-354

21. Barile, M. F., and S. Rottem. 1993. Mycoplasmas in cell culture, p. 155-189. In I. Kahane and A. Adoni (ed.), Rapid diagnosis of mycoplasmas. Plenum Press, New York, N.Y.

22. Barile, M. F., H. Yoshida, and H. Roth. 1991. Rheumatoid arthritis: new findings on the failure to isolate or detect mycoplasmas by multiple cultivation or serologic procedures and a review of the literature. Rev. Infect. Dis. 13:571-582.

23. Barile, M. F., M. W. Grabowski, K. Kapatais-Zoumbos, B. Brown, P.-C. Hu, . and D. Chandler. 1993. Experimentally induced Mycoplasma pneumoniaepneumonia in chimpanzees. Microb. Pathog. 15:243-253.

24. Barrell,B., Rajandream,M.A. and Walsh,S.V. 1995. Saccharomyces cerevisiae chromosome XIII sequencing project, Sanger Centre, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge. CB10 IRQ

25. Barrineau,P., Gilbert,P., Jackson,W.J., Jones,C.S., Summers,A.O. and Wisdom,S. 1984. The DNA sequence of the mercury resistance operon of the IncFII plasmid NR1. J. Mol. Appl. Genet. 2 (6), 601-619

26. Barroso, G., and J. Labare're. 1988. Chromosomal gene transfer in Spiroplasma citri. Science 241:959-961.

27. Barry, M. A., W. C. Lai, and S. A. Johnston. 1995. Protection against mycoplasma infection using expression-library immunization. Nature 377: 632635.

28. Baseggio, N., M. D. Glew, P. F. Markham, K. G. Whithear, and G. F. Browning. 1996. Size and genomic location of the pMGA multigene family of Mycoplasma gallisepticum. Microbiology 142:1429-1435.

29. Baseman, J. B., and J. G. Tully. 1997. Mycoplasmas: sophisticated, reemerging,and burdened by their notoriety. Emerging Infect. Dis. 3:21-32.

30. Baseman, J. B., M. Lange, N. L. Criscimagna, J. A. Giron, and C. A. Thomas. 1995. Interplay between mycoplasmas and host target cells. Microb.Pathog. 19:105-116.

31. Baseman, J. B., S. P. Reddy, and S. F. Dallo. 1996. Interplay between mycoplasma surface proteins, airway cells, and the protean manifestations of mycoplasma-mediated human infections. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:S137-S144.

32. BaskerviUe A, Wright CL, Meneely JD, Curran WL. 1972. The ultrastructure of Mycoplasms hyorhinis in broth culture. Res Vet Sci. Sep;13(5):497-9.

33. Bassam B. J., Caetono-Anolles G., Gresshoff P. M. 1993. DNA amplification fingerprinting of bacteria. Appl. Microbiol. Biotech., 1992, 38: 70-76.

34. Baumann L. 1989. Untersuchung der Fähigkeiten von Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis und sieben anderer Mycoplasma-Spezies zur Hamadsorption, Spermadsorption, Hamolyse und Perexidbildung. Ai-eh. Exp. Veterinarenmed. 43(5):789-800

35. Bebear C.M., Renaudin H., Charron A., Bove J.M., Bebear C., Renaudin J. 1998. Alteration in topoisomerase IV and DNA gyrase in quinolone-resistant mutants of Mycoplasma hominis obtained in vitro. Antimicrob. Agents Chemother. 42:2304-2311.

36. Bebear, C. M., J. M. Bove, C. Bebear, and J. Renaudin. 1997. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones.Antimicrob. Agents Chemother. 41:269-273

37. Bebear, C., B. de Barbeyrac, C. M. Bebear, H. Renaudin, and A. Allery. 1997. New development in diagnostic and treatment of mycoplasma infections in humans. Wien. Klin. Wochenschr. 109: 594 599.

38. Bebear, C.-M., P. Aullo, J.-M. Bove, and J. Renaudin. 1996. Spiroplasma citri virus SpVl: characterization of viral sequences present in the spiroplasmal host chromosome. Curr. Microbiol. 32:134-140.

39. Bechinger B. 1997. Structure and fonctions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin. J.Membr.Biol. V.156. P. 197-211.

40. Belland,R.J., Morrison,S.G., Ison,C. and Huang,W.M. 1994. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in analogous regions of gyrA and parC influoroquinolone-resistant isolates. Mol. Microbiol. 14 (2), 371-380

41. Bentorcha F, Clermont D, de Cespedes G, Horaud T. 1992. Natural occurrence of structures in oral streptococci and enterococci with DNA homology to Tn916. Jan Antimicrob Agents Chemother. 36(l):59-63.

42. Berg S, Wieslander A. 1997. Purification of a phosphatase which hydrolyzes phosphatidic acid, a key intermediate in glucolipid synthesis in Acholeplasma laidlawii A membranes. Biochim Biophys Acta. Dec 4;1330(2):225-32.

43. Berg,T., Firth,N., Apisiridej,S., Hettiaratchi,A., Leelaporn,A. and Skurray,R.A. 1998. Complete nucleotide sequence of pSK41: evolution of staphylococcal conjugative mult ¡resistance plasmids. J. Bacteriol. 180 (17), 43504359

44. Beven L. and Wroblewski H. 1997. Effect of natural amphipathic peptides on viability, membrane potential, cell shape and motility of mollicutes. Res. Microbiol. Institut Pasteur/Elsevier. V.148. P.163-175.

45. Beven L., Le Henaff M., Fontenelle C., Wroblewski H. 1996. Inhibition of Spiralin Processing by the Lipopeptide Antibiotic Globomycin. Current Microbiology. 33. 317-322.

46. Bevins C.L. and Zasloff M. 1990. Peptides from frog skin. Annu. Rev. Biochem. V.59. P.395.

47. Bhugra, B., and K. Dybvig. 1992. High-frequency rearrangements in the chromosome of Mycoplasma pulmonis correlate with phenotypic switching. Mol. Microbiol. 6:1149-1154.

48. Bhugra, B., and K. Dybvig. 1993. Identification and characterization of IS 1138, a transposable element from Mycoplasma pulmonis that belongs to the IS5 family. Mol. Microbiol. 7:577-584.

49. Bhugra, B., L. L. Voelker, N. Zou, H. Yu, and K. Dybvig. 1995. Mechanism of antigenic variation in Mycoplasma pulmonis: interwoven, site-specific DNA inversions. Mol. Microbiol. 18:703-714.

50. Biberfeld, G. 1985. Infection sequelae and autoimmune reactions in Mycoplasma pneumoniae infection, p. 293-311. In S. Razin and M. F. Bafile (ed.), The mycoplasmas, vol. IV. Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Orlando, Fla.

51. Bittman R. 1978. Sterol-polyene antibiotic complexation: probe of membrane structure. Lipids. 0ct;13(10):686-91.

52. Blanchard, A., S. Razin, G. E. Kenny, and M. F. Barile. 1988. Characterization of the Ureaplasma urealyticum urease. J. Bacteriol. 170:2629-2697.

53. Blattner, F. R., G. Plunkett III, C. A. Bloch, N. T. Perna, V. Burland, M.

54. Riley, J. CoIIado-Vides, J. D. Glasner, C. K. Rode, G. F. May hew, J. Gregor,

55. N. Wayne Davis, H. A. Kirkpatrick, M. A. Goeden, D. J. Rose, B. Mau, and Y. Shao. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277:1453-1462

56. Bolhuis,H., PoeIarends,G., van,Veen,H.W., Poolman,B., Driessen,A.J.M. and Konings,W.N. 1995. The lactococcal lmrP gene encodes a proton motive force-dependent drug transporter. J. Biol. Chem. 270, 26092-26098

57. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. Mar;28(3):495-503.

58. Bork, P., C. Ouzounis, G. Casari, R. Schneider, C. Sander, M. Dolan, W. Gilbert, and P. M. Gillevet. 1995. Exploring the Mycoplasma capricolum genome: a minimal cell reveals its physiology. Mol. Microbiol. 16:955-967.

59. Boris P., Greaves D. R. 1987. Programmed gene rearrangements altering gene expression. Science,, 235: 658-667.

60. Bove, J. M. 1993. Molecular features of mollicutes. Clin. Infect. Dis. 17(Suppl. 1):S10-S31.

61. Bove, J. M. 1997. Spiroplasmas: infectious agents of plants, arthropods and vertebrates. Wien. Klin. Wochenschr. 109:604-612.

62. Boyle,M.D., Hawlitzky,J., Raeder,R. and Podbielski,A. 1994. Analysis of genes encoding two unique type Ha immunoglobulin G-binding proteins expressed by a single group A streptococcal Isolate. Infect. Immun. 62 (4), 13361347

63. Boyle,M.D., Weber-Heynemann,J., Raeder,R. and Podbielski,A. 1995. Characterization of a gene coding for a type Ho bacterial IgG-binding protein. Mol. Immunol. 32 (9), 669-678

64. Brenwald N.P., Gill M.J., Wise R. 1998. Prevalence of a putative efflux mechanism among fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2032-2035.

65. Brown JT, Roberts MC. 1987. Cloning and characterization of tetM gene from a Ureaplasma urealyticum strain. Nov Antimicrob Agents Chemother. 31(11):1852-4.

66. Bunnell B.A. and Morgan R.A. 1998. Gene therapy for infectious diseases. Clin.Mic.Rev. V. 11. P.42-56

67. Burdett V. 1990. Nucleotide sequence of the tet(M) gene of Tn916. Oct 25 Nucleic Acids Res. 18(20):6137.

68. CabaIlero,J.L., Martinez,E., Malpartida,F. and Hopwood,D.A 1991. Organisation and functions of the actVA region of the actinorhodin biosynthetic gene cluster of Streptomyces coelicolor. Mol. Gen. Genet, 230 (3), 401 -412

69. Caetono-Anolles G. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers. PCR Methods Appl. 3: 85-94.

70. Calcutt MJ, Lavrrar JL, Wise KS. 1999. IS1630 of Mycoplasma fermentans, a novel IS30-type insertion element that targets and duplicates inverted repeats of variable length and sequence during insertion. Bacteriol. Dec;181(24):7597-607.

71. Cambau E., Sougakoff W., Jarlier V. 1994. Amplification and nucleotide sequence of the quinolone resistance-determining region in the gyrA gene of Mycobacteria. FEMS Microbiol.Lett 116: 49-54

72. Cancilla M. R. et all. 1992. Rapid genomic fingerprinting of Laclococcus lactis strains by arbitrarily primed polymerase chain reaction with 32P and fluorescent labels. Appl. Environ. Microbiol., 58: 1773-1775.

73. Cao, J., P. A. Kapke, and F. C. Minion. 1994. Transformation of Mycoplasma gallisepticum with Tn916,Tn4001, and integrative plasmid vectors. J. Bacteriol. 176:4459-4462.

74. Carle, P., F. Laigret, J. G. Tully, and J. M. Bove. 1995. Heterogeneity of genome sizes within the genus Spiroplasma. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:178- 181.

75. Cassell, G. H., K. B. Waits, H. L. Watson, D. T. Crouse, and R. Harasawa.1993. Ureaplasma urealyticum: role in prematurity and disease in newborns. Clin. Microbiol. Rev. 6:69-87.

76. Cassell, G. H., W. A. J. Clyde, and J. K. Davis. 1985. Mycoplasmal respiratory infections, p. 69-106. In S. Razin and M. F. Barile (ed.), The mycoplasmas, vol. IV. Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Or-lando, Fla.

77. Chandler D. K. F., Rasin S., Stephens E. B. et al. 1982. Genomic and phenotypic analysis of Mycoplasma pneumoniae strains. Infect. Immun., , 38: 604-609.

78. Chardin P. 1999. Rnd proteins: a new family of Rho-related proteins that interfere with the assembly of filamentous actin structures and cell adhesion. Prog Mol Subcell Biol.;22:39-50.

79. Charlton BR, et al. 1999. Complementary randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis patterns and primer sets to differentiate Mycoplasma gallisepticum strains. J Vet Diagn Invest., 11 (2): 158-61.

80. Chen C.-R., Malik M., Snyder M., Drilka K. 1996. DNA gyrase and topoisomerase IV on the bacterial chromosome: quinolone-indused DNA cleavage. J. Mol. Biol. 258: 627-637.

81. Christiansen C., Christiansen G., Rasmussen O. F. 1987. Heterogeneity of Mycoplasma hominis as detected by a probe for atp genes. Isr. J. Med. Sei. 23: 591-594.

82. Christiansen G. Et al. 1987. Genomic and gene variation in Mycoplasma hominis strains. Isr. J. Med. Sei., 23: 595-602.

83. Christiansen G., Freundt E.A., Black F.T. 1975. Genome size and deoxyribonucleic acid base composition of Thermoplasma acidophilum. Inter.J.Syst.Bact. 25:99-101.

84. Christiansen G., Mathiensen S. L., Nyvold C., Birkelund S. 1994. Analysis of a Mycoplasma hominis membrane protein, PI2". FEMS Microbiol. Lett., , 121: 121-127.

85. Cirillo VP, Razin S. 1973.Distribution of a phosphoenolypyruvate-dependent sugar phosphotransferase system in mycoplasms.J Bacteriol. Jan;l 13(l):212-7.

86. Citti, C., and K. S. Wise. 1995. Mycoplasma hyorhinis vlp gene transcription: critical role in phase variation and expression of surface lipoproteins. Mol. Microbiol. 18:649-660.

87. Claverys JP, Prudhomme M, Mortier-Barriere I, Martin B. 2000 .Adaptation to the environment: Streptococcus pneumoniae, a paradigm for recombination. mediated genetic plasticity? Mol Microbiol. Jan;35(2):251 -9.

88. Cohen S.P., Hooper D.C., Wolfson J.S., Souza K.S., McMurry L.M., Levy S.B. 1988. Endogenous active efflux of norfloxacin in susceptible Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 32(8): 1187-91.

89. Cole, B. C., L. R. Washburn, and D. Taylor-Robinson. 1985. Mycoplasma-induced arthritis, p. 107-160. In S. Razin and M. F. Barile (ed.), The mycoplasmas, vol. IV. Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Orlando, Fla.

90. Coque,J.J.R., Liras,P. and Martin,J. 1993. Genes for a beta-lactamase, a penicillin binding protein and a transmembrane protein are clustered with the cephamycin biosynthetic genes in Nocardia lactamdurans EMBO J. 12, 631-639

91. Cornut I., Thiaudiere E., Dufourcq J. //In: Protein folding. Epand R. (ed.). 1993. CRC Press. P.173-219.

92. Cove, M. E., Tingey A. P., and Maxwell A. 1997. DNA gyrase can cleave short DNA fragments in the presence ofquinolone drugs. Nucleic Acids Res. 25: 27162722.

93. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch JP. 1992. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature 358(6389):727-733.

94. Dantley KA, Dannelly HK, Burdett V. 1998. Binding interaction between Tet(M) and the ribosome: requirements for binding. Aug J Bacteriol. 180(16):4089-92.

95. Davis H.L., McCluskie M.J., Gerin J.L., Purcell R.H. 1996. DNA vaccine for hepatitis B: evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with other vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.93. P. 7213-7218.

96. De Silva, N.S., Quinn P.A. 1991. J. Clin. Microbiol. 29(7): 1498-503

97. DeSilva NS, Quinn PA. 1999. Characterization of phospholipase Al, A2, C activity in Ureaplasma urealyticum membranes. Mol Cell Biochem. Nov;201(l-2): 159-67.

98. Desomer,J., Vereecke,D., Crespi,M. and Van Montagu,M. 1992. The plasmid-encoded chloramphenicol-resistance protein of Rhodococcus fascians ishomologous to the transmembrane tetracycline efflux proteins. Mol. Microbiol. 6 (16), 2377-2385

99. Dimri,P.G. and Das,K.H. 1990. Cloning and sequence analysis of gyrA gene of Klebsiella pneumoniae. Nucleic Acids Res. 18, 151-156

100. DiRita, V. J., and J. J. Mekalanos. 1989. Genetic regulation of bacterial virulence. Annu. Rev. Genet. 23:455-482.

101. Dittrich,W., Betzler,M. and Schrempf,H. 1991. An amplifiable and deletable chloramphenicol-resistance determinant of Slreptomyces lividans 1326 encodes a putative transmembrane protein. Mol. Microbiol. 5, 2789-2797

102. Dong Y., Zhao X., Domagala J., Drlica K. 1999. Effect of fluoroquinolone concentration on selection of resistant mutants of Mycobacterium bovis BCG and Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 43(7): 1756-1758

103. Dramsi, S., P. Dehoux, and P. Cossart. 1993. Common features of grampositive bacterial proteins involved in cell recognition. Mol. Microbiol. 9:11191121.

104. Drlica K, Zhao X. 1997. DNA gyrase, topoisomerase IV, and the 4-quinolones. Microbiol Mol Biol Rev. Sep;61(3):377-92.

105. Duffy LB, Crabb D, Searcey K, Kempf MC. 2000. Comparative potency of gemifloxacin, new quinolones, macrolides, tetracycline and clindamycin against mycoplasma spp. J Antimicrob Chemother. Apr;45 Suppl 1:29.

106. Dybvig, K. 1990. Mycoplasmal genetics. Annu. Rev. Microbiol. 44:81-104.

107. Dybvig, K., and H. Yu. 1994. Regulation of a restriction and modification system via DNA inversion in Mycoplasma pulmonis. Mol. Microbiol. 12: 547-560.

108. Dybvig, K., and L. L. Voelker. 1996. Molecular biology of mycoplasmas. Annu. Rev. Microbiol. 50:25-57.

109. Elsbach P. and Weiss J. 1993. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI), a potent element in host-defense against gram-negative bacteria and lipopolysaccharide. Immunobiology. V.187. P.417-429.

110. Fagan, P. K., S. P. Djordjevic, J. Chin, G. J. Eamens, and M. J. Walker. 1997. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopneumoniae antigen (NrdF). Infect. Immun. 65:2502-2507.

111. Fardel O, Lecureur V, Guillouzo A. 1996. The P-glycoprotein multidrug transporter. Gen Pharmacol. Dec;27(8): 1283-91

112. Fernandez-Moreno,M.A., CabaIIero,J.L., Hopwood,D.A. and Malpartida,F. 1991. The act cluster contains regulatory and antibiotic export genes,direct targetsfor translational control by the bldA tRNA gene of Streptomyces Cell. 66, 769780

113. Ferrell, R. V., M. B. Heidari, K. S. Wise, and M. A. Mcintosh. 1989. A Mycoplasma genetic element resembling prokaryotic insertion sequences. Mol. Microbiol. 3:957-967.

114. Ferrero L., Cameron B., Crouzet J. 1995. Analisis of gyrA and grlA mutations in stepwise-selected ciprofloxacin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1554-1558.

115. Fitzgibbon,J.E., John,J.F., Delucia,J.L. and Dubin,D.T. 1998.Topoisomerase mutations in trovafloxacin-resistant staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 42 (8), 2122-2124

116. Flannagan SE, Zitzow LA, Su YA, Clewell DB. 1994. Nucleotide sequence of the 18-kb conjugative transposon Tn916 from Enterococcus faecalis. Nov Plasmid. 32(3):350-4.

117. Forsyth, M. H., and S. J. Geaiy. 1996. The repetitive element Rep MP 1 of Mycoplasma pneumoniae exists as a core element within a larger, variable repetitive mosaic. J. Bacleriol. 178:917-921.

118. Foster PL. 1999.Mechanisms of stationary phase mutation: a decade of adaptive mutation. Annu Rev Genet.;33:57-88

119. Foster PL. Are adaptive mutations due to a decline in mismatch repair?. The evidence is lacking.Mutat Res. 1999 Mar;436(2): 179-84.

120. Freer J.H. 1986. In: Natural Toxins. Harris J.B. (ed.). Clarendon Press. Oxford.

121. Frey, J., X. Cheng, P. Kuhnert, and J. Nicolet. 1995. Identification and characterization of IS1296 in Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC and presence in related mycoplasmas. Gene 160:95-100.

122. Fromm MF. 2000.P-glycoprotein: a defense mechanism limiting oral bioavailability and CNS accumulation of drugs. Int J Clin Pharmacol Ther. Feb;38(2):69-74.

123. Fukushima J, Inamoto T, Morihara K, Okuda K. 2000. Bacterial intercellular communication and environmental adaptation. Nippon Saikingaku Zasshi. Jan;55(l):37-43.

124. Fung-Tome J, Minassian B, Kolek B, Washo T, Huczko E, Bonner D. 2000. In vitro antibacterial spectrum of a new broad-spectrum 8-methoxy fluoroquinolone, gatifloxacin. J Antimicrob Chemother. Apr;45(4):437-46.

125. Gasparich, G. E., K. Hackett, C. Stamburski, J. Renaudin, and J. M. Bove. 1993. Optimization of methods for transfecting Spiroplasma citri strain R8A2 HP with the spiroplasma virus SpVl replicative form. Plasmid 29: 193-205.

126. Geary SJ, et al. Mycoplasma gallisepticum strain differentiation by arbitrary primer PCR (RAPD) fingerprinting. Mol Cell Probes., 1994, 8(4):311-6.

127. Ghosh A.S., Ahamed J., Chauhan K.K., Kundu M. 1998. Involvement of an efflux system in high-level fluoroquinolone resistance of Shigella dysenteriae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 242: 54-56.

128. Glaser, G., H. C. Hyman, and S. Razin. 1992. Ribosomes, p. 169-177. In J.Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas:molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

129. Glass,J.I., Lefkowitz,E.J., Glass,J.S., Heiner,C.R., Chen,E.Y. and Cassell,G.H. The complete sequence of Ureaplasma urealyticum: Alternate views of a minimal genome and sexually transmitted pathogen, unpublished

130. Microbiology, University of Alabama at Birmingham, BBRB 276/11, Birmingham, Alabama 35294-2170

131. Glew, M. D. 1997. Gene expression studies of pMGA, a surface protein of Mycoplasma gallisepticum Ph.D. thesis. The University of Melbourne, Melbourne, Australia.

132. Goldberg M, Pribyl T, Juhnke S, Nies DH. 1999. Energetics and topology of CzcA, a cation/proton antiporter of the resistance-nodulation-cell division protein family. J Biol Chem. Sep 10;274(37):26065-70.

133. Gotoh N, Kusumi T, Tsujimoto H, Wada T, Nishino T. 1999.Topological analysis of an RND family transporter, MexD of Pseudomonas aeruginosa. FEBS Lett. Sep 10;458(l):32-6.

134. Griffith J.K., Baker M.E., Rouch D.A., Page M.G., Skurray R.A., Paulsen I.T., Chater K.F., Baldwin S.A., Henderson P.J. 1992. Membrane transport proteins: implications of sequence comparisons. Curr. Opin. Cell. Biol. 4(4):684-695.

135. Griggs D. J., Gensenberg K., Piddock L. 1996. Mutation in gyrA gene of quinolone-resistant Salmonella serotypes isolated from human and animals. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 1009-1013.

136. Grinius L., Dreguniene G., Goldberg E.B., Liao C.H., Projan S.J. 1992. A staphylococcal multidrug resistance gene product is a member of a new protein family. Plasmid 27(2): 119-129.

137. Guilfoile,P.G. and Hutchinson,C.R 1992. Sequence and transcriptional analysis of the Streptomyces glaucescens tcmAR tetracenomycin C resistance and repressor gene loci. J. Bacteriol. 174 (11), 3651-3658

138. Habermann E., 1972. Bee and wasp venoms. Science. 177, 314.

139. Habermann E., 1980. Mellitin structure and activity. Natural Toxins Eaker D., and Wadstrom I., Eds Pergamon Press, New York 173.

140. Hahn TW, Mothershed EA, Waldo RH 3rd, Krause DC. 1999. Construction and analysis of a modified Tn4001 conferring chloramphenicol resistance in Mycoplasma pneumoniae. Plasmid. Mar;41(2): 120-4

141. Hall BG. 1998. Adaptive mutagenesis: a process that generates almost exclusively beneficial mutations. Genetica.; 102-103(1-6): 109-25

142. Hallett P, Maxwell A. 1991. Novel quinolone resistance mutations of the Escherichia coli DNA gyrase A protein: enzymatic analysis of the mutant proteins. Antimicrob. Agents Chemother. 35(2):335-40

143. Hannaford K, Todd DA, Jeffery H, John E, Blyth K, Gilbert GL. 1999. Role of ureaplasma urealyticum in lung disease of prematurity. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. Nov;81(3):F162-7.

144. Hannan PC, Woodnutt G. 2000. In vitro activity of gemifloxacin (SB 265805; LB20304a) against human mycoplasmas. J Antimicrob Chemother. Mar;45(3):367-9.

145. Hannania E.G., Kavanagh J., Hortobagyi G., Gilles R.E., Champlin R., Deisseroth, A.B. 1995. Recent advances in the application of gene therapy to human disease. Am. J. Med. V.99, P.537-552.

146. Hansen,L.M., McMurry,L.M., Levy,S.B. and Hirsh,D.C. 1993. A new tetracycline resistance determinant, Tet H, from Pasteurella multocida specifying active efflux of tetracycline. Antimicrob. Agents Chemother. 37 (12), 2699-2705

147. Harasawa, R., K. Asada, and I. Kato. 1995. A novel repetitive sequence from Mycoplasma hyopneumoniae. J. Vet. Med. Sci. 57:557-558.

148. Hattori M.,Sakaki Y. 1986. Dideoxy sequensing method using denaturated plasmid templates. AnaLBiochem. 152;232-238.

149. Hauksson JB, Lindblom G, Rilfors L. 1994. Structures of glucolipids from the membrane of Acholeplasma laidlawii strain A-EF22. II. Monoacylmonoglucosyldiacylglycerol. Biochim Biophys Acta. Dec 8;1215(3):341-5.

150. Herrera G., Aleixandra V., Urios A., Blanco M. 1993. Quinolone action in Escherichia coli cells carrying gyrA and gyrB mutations. FEMS Microbiol Lett 106(2): 187-91.

151. Heymann P, Ernst JF, Winkelmann G. 2000. A gene of the major facilitator superfamily encodes a transporter for enterobactin (Enblp) in Saccharomyces cerevisiae. Biometals. Mar;13(l):65-72.

152. Himmelreich, R., H. Hilbert, H. Plagens, E. Pirkl, B. C. Li, and R. Herrmann. 1996. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Nucleic Acids Res. 24:4420-4449.

153. Himmelreich, R., H. Plagens, H. Hilbert, B. Reiner, and R. Herrmann. 1997. Comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium. Nucleic Acids Res. 25:701-712

154. Hoiseth S. K., Moxon E. R., Silver R. P. 1986. Genes involved in Haemophilus influenzae type b capsule expression are part of an 18-kilobase tandem duplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 83:1106-1110.

155. Holliday SM, Faulds D. 1993. Miocamycin. A review of its antimicrobial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic potential. Drugs. 0ct;46(4):720~45.

156. Holliday SM, Faulds D. 1993.Therapeutic considerations for Ureaplasma urealyticum infections in neonates. Clin Infect Dis. Aug;17 Suppl 1:S208-14.

157. Hollingshead S. K., Fischetti V. A., Scott J. R. 1987. Size variation in group A streptococcal M protein is generated by homologous recombination between intragenic repeats. Molec. Gen. Genet.,, 207:196-203.

158. Hongo,E., Morimyo,M., Mita,K., Machida,!., Hama-Inaba,H., Tsuji,H., Ichimura,S. and Noda,Y. 1994.The methyl viologen-resistance-encoding gene smvAof Salmonella lyphimurium. Gene 148, 173-174

159. Hooper D.C. 1995. Quinolone mode of action. Drugs. 49 Suppl.: 10-15.

160. Hooper D.C. 1998. Bacterial topoisomerases, antitopoisomerases, and anti-topoisomerase resistance. Clin. Infect. Dis. 27Suppl.: S54- 63.

161. Hooper D.C., Wolfcon J.S., Bozza M.A., Ng E.Y. 1992. Genetics and reguletion of outer membrane protein expression by quinolone resistance loci nfxB, nfxC, and cfxB.

162. Hoshino K., Kitamura A., Morrissey K., Sato K., Kato J., Ikeda H. 1994. Comparison of inhibition of Escherichia coli topoisomerase IV by quinolones with DNA gyrase inhibition. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2623-2627.

163. Howard B.M., Pinney R.J., Smith J.T. 1993. Function of the SOS process in repair OF DNA damage indused by modern 4-quinolones. J. Pharm. Pharmacol. 45: 658-662.

164. Howard, C. J., and G. Taylor. 1985. Humoral and cell mediated immunity, p. 259-292. In S. Razin and M. F. Barile (ed.), The mycoplasmas, vol. IV.Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Orlando, Fla.

165. Hu, W. S., R. Y.-H. Wang, R.-S. Liou, J. W.-K. Shih, and S.-C. Lo. 1990. Identification of an insertion-sequence-like genetic element in the newly recognized human pathogen Mycoplasma incognitus. Gene 93:67-72.

166. Hu,P., Elliott,J., McCready,P., Skowronski,E., Games,J., Kobayashi,A., Brubaker,R.R. and Garcia,E. 1998. Structural organization of virulence-associated plasmids of Yersinia pesti. J. Bacteriol. 180 (19), 5192-5202

167. Huang R, Gascoyne-Binzi DM, Hawkey PM, Yu M, Heritage J, Eley A. 1997. Molecular evolution of the tet(M) gene in Gardnerella vaginalis. Oct J Antimicrob Chemother. 40(4):561-5.

168. Huang,H., Siehnel,R.J., Bellido,F., Rawling,E. and Hancock,R.E.W, 1992.Analysis of two gene regions involved in the expression of the imipenem-specific, outer membrane porin protein OprD of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Lett. 97,267-274

169. Hutchison CA, Peterson SN, Gill SR, Cline RT, White O, Fraser CM, Smith HO, Venter JC. 1999. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. ScienceDec 10;286(5447):2165-9.

170. Inamine, J. M., K.-C. Ho, S. Loechel, and P.-C. Hu. 1990. Evidence that UGA is read as a tryptophan codon by Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma genitalium, and Mycoplasma gallisepticum. J. Bacteriol. 172:504-506.

171. International Committee on Systematic Bacteriology—Subcommittee on the Taxonomy of Mollicutes. 1995. Revised minimum standards for description of new species of the class Mollicutes (Division Tenericutes). Int. J. Syst. Bacteriol. 45:605-612.

172. Ito H., Yoshida H., Bogaki-Shonai M., Niga H., Hattori H., Nakamura S.1994. Quinolone resistance mutations in the DNA gyrase gyrA and gyrB genes of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2014-2023.

173. James P.A., Reeves D.S. 1996. Bacterial resistance to cephalosporins as a function of outer membrane permiability and access to their target. J.Chemother. 8 Suppl.: 37-47.

174. Jensen L. T., Ladefoged S., Birkelund S., Christiansen G. 1995. Selection of Mycoplasma hominis PG21 deletion mutants by cultivation in the presence of monoclonal antibody 552. Infect. Immun.,, 63: 3336-3347.

175. Jensen, J. S., J. Blom, and K. Lind. 1994. Intracellular location of Mycoplasma genitalium in cultured Vero cells as demonstrated by electron mi-croscopy. Int. J. Exp. Pathol. 75:91-98.

176. Joiner MC, Lambin P, Marples B. 1999.Adaptive response and induced resistance.C R Acad Sei III. Feb-Mar; 322(2-3): 167-75

177. Jones DH, Winistorfer SC. 1993. A method for the amplification of unknown flanking DNA: targeted inverted repeat amplification. Biotechniques Nov; 15(5): 894-904

178. Jones DH, Winistorfer SC. Genome walking with 2- to 4-kb steps using panhandle PCR. PCR Methods Appl 1993 Feb;2(3): 197-203

179. Kaatz G.W., Seo S.M. 1997. Mechanisms of fluoroquinolone resistance in genetically related strains of Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 2733-2737.

180. Kaatz G.W., Seo S.M., Ruble C.A. 1993. Efflux-mediated fluoroquinolone resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 37: 10861094.

181. Kaatz GW, Seo SM, O'Brien L, Wahiduzzaman M, Foster TJ. 2000. Evidence for the existence of a multidrug efflux transporter distinct from NorA in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. May;44(5):1404

182. Kaatz,G.W., Seo,S.M. and Ruble,C.A. 1993. Efflux-Mediated Fluoroquinolone Resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 37, 10861094

183. Kahane, I., and A. Adoni (ed.). 1993. Rapid diagnosis of mycoplasmas. Plenum Press, New York, N.Y.

184. Kanematsu E., Degushi T., Yashida M. 1998. Alterations in the GyrA subunit of the DNA gyrase and ParC subunit of DNA topoisomerase IV associated with quinolone resistance in Enterococcus faecalis. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 433-435.

185. Kapitanov A.B., Ivanova V,F„ Ladygina V.G. 1990. Cholesterol accumulation in plasma membrane and changes of membrane enzyme activity of Acholeplasma laidlawii cells during culture ageing. Mech. Ageing Dev.; 55:161-169.

186. Kapke, P. A., K. L. Knudtson, and F. C. Minion. 1994. Transformation of Mollicutes with single-stranded Tn4001 DNA. Plasmid 32:85-88.

187. Karlsson OP, Rytomaa M, Dahlqvist A, Kinnunen PK, Wieslander A. 1996. Correlation between bilayer lipid dynamics and activity of the diglucosyldiacylglycerol synthase from Acholeplasma laidlawii membranes. Biochemistry. Aug 6;35(31):10094-102

188. Karlsson, O. P., A. Dahlqvist, S. Vikstrom, and A. Wieslander. 1997. Lipid dependence and basic kinetics of the purified 1,2-diacylglycerol 3-glucosyl-transferase from membranes of Acholeplasma laidlawii. J. Biol. Chem. 272: 929936.

189. Karlsson, O. P., M. Rytomaa, A. Dahlqvist, P. K. J. Kinnunen, and A.Wieslander. 1996. Correlation between bilayer lipid dynamics and activityof the diglucosyldiacylglycerol synthase from Acholeplasma laidlawii membranes. Biochemistry 35:10094-10102.

190. Kenny G.E., Cartwright F.D. 1994. Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Ureaplasma urealyticum to new glycylcyclines in comparison with those of older tetracyclines. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2628-2632.

191. Keppler D, Cui Y, Konig J, Leier I, Nies A. 1999. Export pumps for anionic conjugates encoded by MRP genes.Adv Enzyme Regul.;39:237-46.

192. Khodursky A.B., Zechiedrich E.L., Cozzarelli N.R. 1995. Topoisomerase IV is the target of quinolones in Escherichia coli. Proc.Natl. Acad. Sei. USA 92: 1180111805.

193. Kim,E. and Aoki,T. 1996. Sequence analysis of the florfenicol resistance gene encoded in the transferable R-plasmid of a fish pathogen, Pasteurella piscicida. Microbiol. Immunol. 40 (9), 665-669

194. King, K. W., and K. Dybvig. 1991. Plasmid transformation of Mycoplasma mycoides subspecies mycoides is promoted by high concentrations of polyethylene glycol. Plasmid 26:108-115.

195. King, K. W., and K. Dybvig. 1994. Transformation of Mycoplasma capricolum and examination of DNA restriction modification in M. capricolum and Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. Plasmid 31:308-311

196. Kini R.M. and Evans H.J. 1989. A common cytolytic region in myotoxins, hemolysins, cardiotoxins and antibacterial peptides. Int. J. Pept. Protein Res. V.34. P.277.

197. Kirchhoff, H. 1992. Motility, p. 289-306. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

198. Kkong F, James G, Ma Z, Gordon S, Bin W, Gilbert GL. 1999 .Phylogenetic analysis of Ureaplasma urealyticum--support for the establishment of a new species, Ureaplasma parvum.Int J Syst Bacteriol. Oct;49 Pi 4:1879-89

199. Klein I, Sarkadi B, Varadi A. 1999.An inventory of the human ABC proteins. Biochim Biophys Acta. Dec 6;1461(2):237-62.

200. Knox CL, Giffard P, Timms P. 1998.The phylogeny of Ureaplasma urealyticum based on the mba gene fragment. Int J Syst Bacteriol. Oct;48 Pt 4:1323-31.

201. Knox CL, Timms P. 1998.Comparison of PCR, nested PCR, and random amplified polymorphic DNA PCR for detection and typing of Ureaplasmaurealyticum in specimens from pregnant women. J Clin Microbiol. C)ct;36(10):3032-9.

202. Kokotovic B. Et al., Amplified-fragment length polymorphism fingerprinting of Mycoplasma species. J. Clin. Microbiol., 1999, 37: 3300-3307.

203. Kong F, Ma Z, James G, Gordon S, Gilbert GL. 2000. Species identification and subtyping of Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum using PCR-based assays. J Clin Microbiol. Mar;38(3):l 175-9

204. Kong F, Zhu X, Wang W, Zhou X, Gordon S, Gilbert GL. 1999. Comparative analysis and serovar-specific identification of multiple-banded antigen genes of Ureaplasma urealyticum biovar 1. J Clin Microbiol. Mar;37(3):538-43

205. Krause, D. C. 1996. Mycoplasma pneumoniae cytadherence: unravelling the tie that binds. Mol. Microbiol. 20:247-253.

206. Krejci,E., Gasnier,B., Botton,D., Isambert,M.F., Sagne,C., Gagnon,J., Massoulie,J. and Henry,J.P. 1993. Expression and regulation of the bovine vesicular monoamine transporter gene. FEBS Lett. 335,27-32

207. Krummenacher P, Narberhaus F. 2000. Two genes encoding a putative multidrug efflux pump of the RND/MFP family are cotranscribed with an rpoH gene inBradyrhizobiumjaponicum. Gene. Jan ll;241(2):247-54.

208. Krupka RM. 1999.Uncoupled active transport mechanisms accounting for low selectivity in multidrug carriers: P-glycoprotein and SMR antiporters. J Membr Biol. Nov 15;172(2):129-43.

209. Kupsch,E.M., Knepper,B., Kuroki,T., Heuer,I. and Meyer,T.F. Variable opacity (Opa) outer membrane proteins account for the cell tropisms displayed by Neisseria gonorrhoeae for human leukocytes and epithelial cells. EMBO J. 12 (2), 641-650 (1993)

210. Kuwano M, Toh S, Uchiumi T, Takano H, Kohno K, Wada M. 1999. Multidrug resistance-associated protein subfamily transporters and drug resistance. Anticancer Drug Des. Apr;14(2):123-31.

211. Ladefoged S. A. et al. 1995. A 135-KiIodalton Surface Antigen of Mycoplasma hominis Pg21 Contains Multiple Directly Repeated Sequences. Journal of Bacteriology,, 63,212-223.

212. Ladefoged S. A. et a I. 1996. Analysis of 0.5-Kilobase-Pair Repeats in the Mycoplasma hominis Imp Gene System and Identification of Gene Products. Journal of Bacteriology. 178, 2775-2784.

213. Ladefoged S.A., Christiansen G. 1998. Mycoplasma hominis exspresses two variants of a sell-surface protein, one a lipoprotein, and one not. Microbiology. 144: 761-770.

214. Ladefoged, S. A., and G. Christiansen. 1991. Analysis of the nucleotide sequence of the Mycoplasma hominis tuf gene and its flanking region. FEMS Microbiol. Lett. 79:133-140.

215. Ladefoged, S. A., and G. Christiansen. 1994. Sequencing analysis reveals a unique gene organization in the gyrB region of Mycoplasma hominis. J. Bacteriol. 176:5835-5842.

216. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4. nature (London). 227:203-221

217. Lai, W. C., M. Bennet, B. E. Gordon, and S. P. Pakes. 1994. Protection ofmice against experimental murine mycoplasmosis by a Mycoplasma pulmonis immunogen in lysogenized Escherichia coli. Vaccine 12:291-298.

218. Leblanc G, Le Grimellec C. 1979. Active K+ transport in Mycoplasms mycoides var. Capri. Relationships between K+ distribution, electrical potential and ATPase activity. Biochim Biophys Acta. Jun 13;554(1): 168-79.

219. Lewin C., Howard B., Smith J. 1991. Protein and RNA-synthesis independent bactericidal activity of cyprofloxacin tha involves the A subunit of DNA gyrase. J. Med. Microbiol. 34: 19-22.

220. Lieber A., He C.Y., Polyak S.J., Gretch D.R., Barr D., Kay M.A. 1996. Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocytes by adenovirus-mediated expression of ribozymes. J. Virol. V.70. P.8782-8791.

221. Ligon, J. V., and G. E. Kenny. 1991. Virulence of ureaplasmal urease for mice. Infect. Immun. 59:1170-1171.

222. Lindler,L.E., Piano,G.V., BurIand,V., Mayhew,G.F. and Blattner,F.R. 1998. Complete DNA sequence and detailed analysis of the Yersinia pestis KIM5 plasmid encoding murine toxin and capsular antigeninfect. Immun. 66 (12), 5731-5742

223. Linton C. J. et all. 1994. Rapid discrimination of Mycobacterium tuberculosis strains by random amplified polymorphic DNA analysis. J. Clin. Microbiol. 32: 2169-2174.

224. Liu J., Takiff H.E., Nikado H. 1996. Active efflux of fluoroquinolones in Mycobacterium smegmatis mediated by LfrA, a multidrug efflux pump. J.Bacteriol. 178: 3791-3795.

225. Liu,Y., Peter,D., Roghani,A., Schuldiner,S., Prive,G.G., Eisenberg,D., Brecha,N. and Edwards,R.H. 1992. A cDNA that suppresses MPP= toxicity encodes a vesicular amino transporter. Cell 70, 539-551

226. Lo, S.-C. 1992. Mycoplasmas in AIDS, p. 525-545. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

227. Lu S., Santoro J.S., Fuller D.H., Haynes J.R., Robinson H.L. 1995.Use of DNAs expressing HIV-1 Env and noninfectious HIV-1 particles to raise antibody responses in mice. Virology. V.209. P. 147-154.

228. Lucier T.S., Heitzman K., Liu S.K., Hu P.C., 1995. Transition mutations in the 23S rRNA of erythromycin-resistant isolates of Mycoplasma pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 2770-2773.

229. Lysnyansky, I., R. Rosengarten, and D. Yogev. 1996. Phenotypic switching of variable surface lipoproteins in Mycoplasma bovis involves high-frequency chromosomal rearrangements. J. Bacteriol. 178:5395-5401.

230. Ma,D., Cook,D.N., Alberti,M., Pon,N.G., Nikaido,H. and Hearst,J.E. 1993. Molecular cloning and characterization of acrA and acrE genes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 175 (19), 6299-6313

231. Macario AJ, Lange M, Ahring BK, De Macario EC. 1999. Stress genes and proteins in the archaea. Microbiol Mol Biol Rev. Dec;63(4):923-67, table of contents

232. MacGowan A. P. et all. 1993. Typing of Listeria spp. by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. J. Med. Microbiol. 38: 322-327.

233. Maniatis T., Fritch E.F, Sambrook J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. N.Y.

234. Maniloff, J. 1992. Phylogeny of mycoplasmas, p. 549-559. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

235. Maniloff, J. 1996. Mycoplasma phylogeny: correlation with molecular bio-logical and paleontological changes, p. 8. In Abstracts of the 8th IUMS International Congress of Bacteriology.

236. Maniloff, J., G. J. Kampo, and C. C. Dascher. 1994. Sequence analysis of a temperate phage: mycoplasma virus L2. Gene 141:1-8.

237. Maniloff, J., R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.). 1992. Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society forMicrobiology, Washington, D.C.

238. Mannion B.A., Weiss J., Elsbach P. 1990. Separation of sublethal and lethal effects of polymorphonuclear leukocytes on Escherichia coli. J. Clin. Investig. V.85. P.853-860.

239. Marger M.D., Saier M.H. Jr. 1993. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport. Trends Biochem. Sci. 18(l):13-20.

240. Marias A., Bove J.M., Dallo S.F., Baseman J.B., Renaudin J. 1993. Expression in Spiroplasma citri of an epitope carried on the G fragment of the cytadhesin PI gene from Mycoplasma pneumoniae. J. Bacteriol. V.175. P. 2783-2787.

241. Marmur J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J.Mol.Biol. 3:1139-1144.

242. Marshall, A. J., R. J. Miles, and L. Richards. 1995. The phagocytosis of mycoplasmas. J. Med. Microbiol. 43:239-250.

243. Maxwell A. 1992. The molecular basis of quinolones action. Antimicrob. Agents. Chemother. 30: 409-416.

244. Mazurier S. I. and Wernars K. 1992.Typing of Listeria strains by random amplification of polymorphic DNA. Res. Microbiol. 143: 499-505.

245. McCormack WM. 1993. Susceptibility of mycoplasmas to antimicrobial agents: clinical implications. Clin Infect DisAug;l7 Suppl 1 :S200-1.

246. McElhaney, R. N. 1993. Physical studies of lipid organization and dynamics in mycoplasma membranes. Subcell. Biochem. 20:53-108.

247. McMullen TP, Wong BC, Tham EL, Lewis RN, McElhaney RN. 1996.Differential scanning calorimetric study of the interaction of cholesterol with the major lipids of the Acholeplasma laidlawii B membrane. Biochemistry. Dec 24;35(51): 16789-98.

248. Meunier J. R., Grimont P. A. D. 1993. Factors affecting reproducibility of random amplified polymorphic DNA fingerprinting. Res. Microbiol. 144: 373379.

249. Miles, R. J. 1992. Catabolism in mollicutes. J. Gen. Microbiol. 138:1773-1783.

250. Moore R.A., Beckthold B., Wong S., Kureishi A., Bryan L.E. 1995. Nucleotide sequence of the gyrA gene and characterization of ciprofloxacin-resistant mutants of Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 39: 107-111.

251. Munoz,R., Bustamante,M. and De,Ia,Campa,A.G. 1995. Ser-127-to-Leu substitution on the DNA gyrase B subunit of Streptococcus pneumonaie is implicated in novobiocin resistance. J. Bacteriol. 177,4166-4170

252. Muto et al. 1984. Nucleic Acids Res., 12: 8209-17.

253. Myers L. E. et all. 1993. Genomic fingerprinting of Haemophilus somnus isolates by using a random amplified polymorphic DNA assay. J. Clin. Microbiol., ,31: 512-517.

254. Myers L. E., McQuny LJ, Hollinger FB. 1994. Dilution assay statistics. J.Clin.Microbiol. 32(3):732-9.

255. Myers W.F., Baca O.G., Wisseman C.L. 1980. Genome size of Rickettsia burnetii. J.Bacteriol. 144:460-461.

256. Nakanishi N., Yoshida S., Wakabe H., Inoue M., Yamagushi T., Mitsuhashi S. 1991. Mechanism of clinical resistance to fluoroquinolones in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 35: 2562-2567.

257. Nakano M., Deguchi T., Kawamura T., Yashida M. 1998. Mutation in the gyrA and parC genes in fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 41: 2289-2291.

258. Neal,R.J. and Chater,K.F. 1987. Nucleotide Sequence analysis reveals similarities between proteins determining methylenomycin A resistance in Streptomyces and tetracycline resistance in eubacteria. Gene 58 (2-3), 229-241

259. Neimark, H. C., and C. S. Lange. 1990. pulse-field electrophoresis indicates full-length mycoplasma chromosomes range widely in size. Nucleic Acids Res. 18:5443-5448.

260. Neyfakh A. A., Bidnenko V.E., Chen L.B. 1991. Efflux-mediated multidrug resistance in Bacillus subtilis: similarities and dissimilarities with the mammalian system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 88:4781-4785.

261. Neyfakh A.A., Borsch C.M., Kaatz G.W. 1993. Fluoroquinolone resistance protein NorA of Staphylococcus aureus is a multidrug efflux transporter. Antimicrob Agents Chemother. 37(1): 128-129.

262. Nelsness, F., Gass, R., J. Fisher D. Badesch, M. Zamora, A. Weinberg, H. Grover, J. G. Tully, and F. C. Fang. 1996. Donor-to-host transmission of Mycoplasma hominis in lung allograft recipients. Clin. Infect. Dis. 22:567-568.

263. Nies DH, Silver S. 1995. Ion efflux systems involved in bacterial metal . resistances. J Ind Microbiol. Feb;14(2): 186-99

264. Nightingale CH. . 2000. Moxifloxacin, a new antibiotic designed to treat community-acquired respiratory tract infections: a review of microbiologic and pharmacokinetic-pharmacodynamic characteristics. Pharmacotherapy. Mar;20(3): 245-56.

265. Nikado H. 1994. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux. Science. 264: 382-388.

266. Nikaido H., Saier M.H. Jr. 1992. Transport proteins in bacteria: common themes in their design. Science 258(5084):936-942.

267. Nobes CD, Lauritzen I, Mattei MG, Paris S, Hall A, Chardin P. 1998. A new member of the Rho family, Rndl, promotes disassembly of actin filament structures and loss of cell adhesion. J Cell Biol. Apr 6;141(1): 187-97.

268. Nocard, Roux. 1990. The microbe of pleuropneumonia. 1896. Rev Infect Dis. Mar-Apr;12(2):354-8.

269. Oggioni MR, Dowson CG, Smith JM, Prowedi R, Pozzi G. 1996. The tetracycline resistance gene tet(M) exhibits mosaic structure. May Plasmid. ,35(3): 156-63.

270. Ohki R., Murata M. 1997. bmr3, a third multidrug transporter gene of Bacillus subtilis. J. Bacteriol.; 179:1423-1427.

271. Ohshita Y., Hiramatsu K., Yokota T. 1990. A point mutation in norA gene is responsible for quinolone resistance in Staphylococcus aureus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 1028-1034.

272. Olson L. D., Shane S. W., Kapras A. A. et al. 1991. Monoclonal antibodies to surface antigens of pathogenic Mycoplasma hominis strain. Infect Immun. 59: 1683-1689.

273. Osawa, S., T. H. Jukes, K. Watanabe, and A. Muto. 1992. Recent evidence for evolution of the genetic code. Microbiol. Rev. 56:229-264.

274. Oskam,L., HiIlenga,D.J., Venema,G. and Bron,S. 1991. The large Bacillus plasmid pTB19 contains two integrated rolling-circle plasmids carryingmobilization functions. Plasmid 26 (1), 30-39

275. Ouzounis, C., G. Casari, A. Valencia, and C. Sander. 1996. Novelties from the complete genome of Mycoplasma genitalium. Mol. Microbiol. 20:895-900.

276. Pan X.S., Ambler J., Mehtar S., Fisher L.M. 1996. Involvement of topoisomerase IV and DNA gyrase as ciprofloxacin targets in Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 40(10):2321-2326.

277. Pan,X. and Fisher,M. 1996. Cloning and Characterization of the parC and parE Genes of Streptococcus pneumoniae Encoding DNA Topoisomerase IV: Role in Fluoroquinolone Resistance. J. Bacteriol. 178, 4060-4069

278. Pang,Y., Brown,B.A., Steingrube,V.A., Wallace,R.J.Jr. and Roberts,M.C. 1994. Tetracycline resistance determinants in Mycobacterium and Streptomyces species. Antimicrob. Agents Chemother. 38 (6), 1408-1412

279. Pao SS, Paulsen IT, Saier MH Jr. Major facilitator superfamily. 1998. Microbiol Mol Biol Rev. Mar;62(l):l-34.

280. Pari G.S., Field A.K., Smith J.A. Potent antiviral activity of an antisense oligonucleotide complementary to the intron-exon boundary of human cytomegalovirus genes UL36 and UL37. Antimicrob. Agents Chemother. 1995.1. V.39.P.1157-1161.

281. Parsons,Y., Hall,R.M. and Stokes,H.W. 1991. A new trimethoprim resistance gene, dhfrX, in the In7 integron of plasmid pDGOlOO. Antimicrob. Agents Chemother. 35 (11), 2436-2439

282. Paulsen IT., Beness AM., Saier MK Jr. 1997. Computer based analyses of the promoter constituents of transport system catalysing export of complex carbohydrates in bacteria. 143:2685-99.

283. Paulsen IT, Brown MH, Skurray RA. 1996.Proton-dependent multidrug efflux systems.Microbio 1 Rev. Dec;60(4):575-608.

284. Paulsen IT, Sliwinski MK, Saier MH Jr. 1998 Microbial genome analyses: global comparisons of transport capabilities based on phytogenies,bioenergetics and substrate specificities. J Mol Biol Apr 3;277(3):573-92.

285. Penner G. A. et al. 1993. Reproducibility of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis among laborotories. PCR Meth. Appl, 2: 341-345.

286. Perry,R.D., StraIey,S.C., Fetherston,J.D., Rose,D.J., Gregor,J. and Blattner,F.R. 1998. DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5Infect. Immun. 66 (10), 4611-4623

287. Poole,K., Heinrichs,D.E. and Neshat,§. 1993. Cloning and sequence analysis of an EnvCD homologue in Pseudomonas aeruginosa: regulation by iron and possible involvement in the secretion of the siderophore pyoverdine. Mol. Microbiol. 10 (3), 529-544

288. Potrawfke,T., Armengaud,J., Timmis,K.N. and Wittich,R.M. Purification and characterization of the new chlorocatechol 1,2-dioxygenase tetC of Pseudomonas chlororaphis RW71. Unpublished

289. Potts JM, Ward AM, Rackley RR. 2000. Association of chronic urinary symptoms in women and Ureaplasma urealyticum. Urology. Apr;55(4):486-9.

290. Pyle, L. E., L. N. Corcoran, B. G. Cocks, A. D. Bergemann, J. C. Whitley, and L. R. Finch. 1988. Pulsed-field electrophoresis indicates larger-than-expected sizes for mycoplasma genomes. Nucleic Acids Res. 16:6015-6025.

291. Rainey, P. B., E. R. Moxon, and I. P. Thompson. 1993. Intraclonal polymorphismin bacteria. Adv. Microb. Ecol. 13:263-300.

292. Rasin S., Tully J. G., Rose D. L., Barile M. F. 1983. "DNA clevage patterns as indicators of genetic heterogenity among strains of Acholeplasma and Mycoplasma species". J. Gen. Microbiol.,, 129: 1935-1944.

293. Rasmussen, O. F., M. H. Shirvan, H. Margalit, C. Christiansen, and S.Rottem. 1992. Nucleotide sequence, organization, and characterization of the atp genes and the encoded subunits of Mycoplasma gallisepticum AT-Pase. Biochem. J. 285:881-888.

294. Rawadi GA. Characterization of mycoplasmas by RAPD fingerprinting. Methods Mol Biol., 1998, 104:179-87. Review.

295. Razin S., Yogev DF., Naot Y. 1998. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microb.Mol.Biol.Rew. 64:1094-1156.

296. Razin, S. 1978. The mycoplasmas. Microbiol. Rev. 42:414-470.

297. Razin, S. 1985. Molecular biology and genetics of mycoplasmas (MolUcutes)Microbiol Rev. 49:419-455.

298. Razin, S. 1992. Mycoplasma taxonomy and ecology, p. 3-22. In J. Maniloff, R. N. McElhaney, L. R. Finch, and J. B. Baseman (ed.), Mycoplasmas:molecular biology and pathogenesis. American Society for Microbio logy, Washington, D.C.

299. Razin, S. 1992. Peculiar properties of mycoplasmas: the smallest self-replicating ' prokaryotes. FEMS Microbiol. Lett. 100:423-432.

300. Razin, S. 1993. Mycoplasma membranes as models in membrane research. Subcell. Biochem. 20:1-28. Plenum Press, New York, N.Y.

301. Razin, S., and E. Jacobs. 1992. Mycoplasma adhesion. J. Gen. Microbiol. 138:407-422.

302. Razin, S., and J. G. Tully (ed.). 1995. Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology, vol. I. Molecular characterization. Academic Press, Inc., San Diego, Calif

303. Razin, S., and M. F. Barile (ed.). 1985. The mycoplasmas, vol. 4. Mycoplasma pathogenicity. Academic Press, Inc., Orlando, Fla.

304. Reaney P. B., Moxon E. R., Thompson I. P. Intraclonal polymorphism in bacteria. Adv. Microb. Ecol., 1993, 13: 263-300.

305. Renaudin J., Marias A., Verdín E., Duret S., Foissac X., Laigret F., Razin A.1995. Integrative and free Spiroplasma citri oriC plasmids: expression of the Spiroplasma phoeniceum spiralin in Spiroplasma citri. J.Bacteriol. V.177. P.2870-2877.

306. Revel V., Cambau E., Jarlier V., Sougakoff W. 1994. Characterisation of mutations in Mycobacterium smegmatis involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 38:1991-1996.

307. Rhen M, Eriksson S, Pettersson S. 2000 Bacterial adaptation to host innate immunity responses.Curr Opin Microbiol. Feb;3(l):60-4.

308. Rilfors, L., A. Wieslander, and G. Lindblom. 1993. Regulation and physicochemical properties of the polar lipids in Acholeplasma laidlawii. Subcell. Biochem. 20:53-108.

309. Rinken R., Wackernagel W. 1992. Inhibition of the mxßCD-dependent activation of chi recombinational hot spots in SOS-indused cells of E.coli. J.Bacteriol. 174:1172-1178.

310. Roberts MC, Hillier SL, Hale J, Holmes KK, Kenny GE. 1986. Tetracycline resistance and tetM in pathogenic urogenital bacteria. Nov Antimicrob Agents Chemother. 30(5):810-2.

311. Roberts MC, Hillier SL. 1990. Genetic basis of tetracycline resistance in • urogenital bacteria. Feb Antimicrob Agents Chemother. 34(2):261-4.

312. Roberts MC, Koutsky LA, Holmes KK, LeBIanc DJ, Kenny GE. 1985. Tetracycline-resistant Mycoplasma hominis strains contain streptococcal tetM sequences. Jul Antimicrob Agents Chemother. 28(1): 141-3.

313. Roberts MC. 1990. Characterization of the Tet M determinants in urogenital and respiratory bacteria. Mar Antimicrob Agents Chemother. 34(3):476-8.

314. Roberts MC. 1997. Genetic mobility and distribution of tetracycline resistance determinants. Ciba Found Symp. 207:206-18; discussion 219-22.

315. Roberts, M. C., and G. E. Kenny. 1987. Conjugal transfer of transposon Tn97<5 from Streptococcus faecalis to Mycoplasma hominis. J. Bacteriol. 169:3836-3839.

316. Robertson JA, Stemke GW, Maclellan SG, Taylor DE. 1988. Characterization of tetracycline-resistant strains of Ureaplasma urealyticum. Mar; J Antimicrob Chemother. 21(3):319-32.

317. Robertson, B. D., and T. F. Meyer. 1992. Genetic variation in pathogenic bacteria. Trends Genet. 8:422-427.

318. Rottem S, Naot Y. 1998.Subversion and exploitation of host cells by ,mycoplasmas. Trends Microbiol. Nov;6(l l):436-40

319. Rottem S, Yogev D. 2000. Mycoplasma interaction with eukaryotic cells. Subcell Biochem. ;33:199-227.

320. Rottem, S., and I. Kahane (ed). 1993. Mycoplasma cell membranes. Subcell. Biochem. 20:1-314.

321. Rouch,D.A., Cram,D.S., DiBerardino,D., Littlejohn,T.G. and Skurray,R.A.1990. Efflux-mediated antiseptic resitance gene qacA from Staphylococcus aureus: common ancestry with tetracycline- and sugar-transport proteins. Mol. Microbiol. 4, 2051-2062

322. Ruifu Y, Minli Z, Guo Z, Wang X. 1997. Biovar diversity is reflected by variations of genes encoding urease of Ureaplasma urealyticum. Microbiol Immunol. ;41(8):625-7.

323. Ruland, K., R. Himmelreich, and R. Herrmann. 1994. Sequence divergence in the 0RF6 gene of Mycoplasma pneumoniae. J. Bacteriol. 176:5202-5209.

324. Saada A.B, Terespolski Y, Adoni A, Kahane I. 1991. Infect. Immun. 59(1):467-9

325. Saier M.H. Jr., Tarn R., Reizer A., Reizer J. 1994. Two novel families of bacterial membrane proteins concerned with nodulation, cell division and transport. Mol. Microbiol. 11(5):841-7

326. Saier MH Jr, Paulsen IT, Matin A. 1997. A bacterial model system for understanding multi-drug resistance. Microb Drug Resist. Winter;3(4):289-95.

327. Saier MH Jr. 2000.Families of transmembrane sugar transport proteins. Mol Microbiol. Feb;35(4):699-710.

328. Salman M, Rottem S. 1995. The cell membrane of Mycoplasma penetrans-, lipid composition and phospholipase Al activity. Biochim Biophys Acta. May4;1235(2):369-77.

329. Salman, M., M. Tarshis, and S. Rottem. 1992. Fusion-mediated transfer of plasmids into Spiroplasma floricola cells. J. Bacteriol. 174:4410-4415.

330. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequensing with chain-termination inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 74:5463-5467.

331. Santerre R.F., Walls J.D., Grinnel B.W., 1991. Use of vectors to confer resistance to antibiotics G-418 and hygromycin in stably transfected cell lines. Methods Mol. Biol. 7,245-256)

332. Sasnauskas,K., Jomantiene,R., Lebediene,E., Lebedys,J., Januska,A. and Janulaitis,A. 1992. Cloning and sequence analysis of a Candida maltosa gene which confers resistance to cycloheximide. Gene 116, 105-108

333. Schiefer H.G., Schummer U., Gerhardt U. 1979. Effect of cell membrane-active antimicrobial agents on membrane potential and viability of mycoplasmas. Current Microbiology. 3. 85-88

334. Schiefer H.G., Schummer U., Gerhardt U. Effect of cell membrane-active antimicrobial agents on membrane potential and viability of mycoplasmas. 1979. Current Microbiology. 3. 85-88

335. Schierwater B., Ender. 1993. Different thermostable DNA polymerases may amplify different RAPD products. Nucleic Acids Res. 21: 4647-4648.

336. Schulz G.E. 1993. Bacterial porins: structure and function. Curr. Opin. Cell. Biol. 5(4):701-707.

337. Schummer U., Schiefer H.G., Gerhardt U. 1979. Mycoplasma membrane potentials determined by potential-sensitive dyes. Current Microbiology. 2. 191194.

338. Seifert H. S., So M. 1988. Genetic mechanisms of bacterial antigenic variation. Microbiol Rev.,, 52: 327-336.

339. Shai Y. 1995. Molecular recognition between membrane-spanning polypeptides. Trends Biochem. Sei. V.20. P.460-464.

340. Shapiro JA. 1997.Genome organization, natural genetic engineering and adaptive mutation.Trends Genet. Mar;13(3):98-104.

341. Smith D.G, Russel W.C, Thirkell D. 1994. Adherence of Ureaplasma urealyticum to human epithelial eels. Microbiology. 140 (Pt 10):2893-8

342. Smith, D. G. E., W. C. Russell, W. J. Ingledew, and D. Thirkell. 1993. Hydrolysis of urea by Ureaplasma urealyticum generates a transmembrane potential with resultant ATP synthesis. J. Bacteriol. 175:3253-3258

343. Smith,D.R. Complete Genome Sequence Of Clostridium Acetobutylicum. unpublished Genome Therapeutics Corporation, 100 Beaver Street, Waltham, MA 02453, USA

344. Sow AI, Diallo Y, el Hadi AD, Samb A. 2000. In vitro sensitivity to antibiotics in 178 strains of genital mycoplasma isolated from gynecology consultants in Dakar. Bull Soc Pathol Exot. Feb;93(l):6-7.

345. Spooner, R.K, Russel W.C, Thirkell D. 1992. Characterisation of the immunoglobulin A proteinase of Ureaplasma urealyticum. Infect. Immun. 60(6):2544-6

346. Steinberg D. et al. 1997. Protegrin-1: a broad-spectrum, rapidly microbicidal peptide with in vivo activity. Antimicrob. Agents Chemother. V.41. P. 1738-1742.

347. Stephens E. B., Aulakh G. S., Rose D. L., Tully J. G., Barile M. F. 1983. Interspecies and intraspecies DNA homology among established species of Acholeplasma: a review. Yale J. Biol. Med.,, 56: 729-735

348. Su YA, He P, Clewell DB. 1992. Characterization of the tet(M) determinant of Tn916: evidence for regulation by transcription attenuation. Apr Antimicrob Agents Chemother. 36(4):769-78.

349. Su, C. J., S. F. Dallo, A. Chavoya, and J. B. Baseman. 1993. Possible origin of sequence divergence in the PI adhesin gene of Mycoplasma pneumoniae. Infect. Immun. 61:816-822.

350. Swanson J., Belland R. J., Kirsebom L.A. 1994. Neisserial surface variation: how and why? Curr. Opin. Genet. Dev. V.2. P. 805-811.

351. Tanaka M, Onodera Y, Uchida Y, Sato K, Hayakawa I. 1997. Inhibitory activities of quinolones against DNA gyrase and topoisomerase IV purified from Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 41(ll):2362-2366

352. Tanaka M., Otsuki M., Nishino T., Kobayashi I., Matsumoto T., Kamazawa J. 1996. Mutation in DNA gyrase of norfloxacin-resistance isolates of Neisseria gonorrhoeae. Genitourin. Med. 72: 295-295.

353. Tascon R.E., Colston M.J., Ragno S., Stavropolous E., Gregory D., Lowrie D.B. 1996. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nat. Med. V.2. P.888-892.

354. Tatusov,R.L., Mushegian,A.R., Bork,P., Brown,N.P., Hayes,W.S., Borodovsky,M., Rudd,K.E. and Koonin,E.V. 1996. Metabolism and evolutionof Haemophilus influenzae deduced from a whole-genome comparison with Escherichia coli. Curr. Biol. 6 (3), 279-291 0

355. Taylor-Robinson, D., H. A. Davies, P. Sarathchandra, and P. M. Furr. 1991. Intracellular location of mycoplasmas in cultured cells demonstrated by immunocytochemistry and electron microscopy. Int. J. Exp. Pathol. 72: 705-714.

356. Tercero,J.A., Lacalle,R.A. and Jimenez,A. 1993. The pur8 gene from the pur cluster of Streptomyces alboniger encodes a highly hydrophobic polypeptide which confers resistance to puromycin. Eur. J. Biochem. 218 (3), 963-971

357. Terwilliger, T.C. and Eisenberg, D., 1982. The structure of mellitin I and II,J.Biol.Chem.,257,6010,

358. Theiss P., Kapras A., Wise K. S. 1996. Antigenic topology of the P29 surface lipoprotein of Mycoplasma fermentans: differential display of epitopes results in high-frequency phase variation. Infect. Immun.,, 64: 1800-1809.

359. Theiss P., Kim M. F., Wise K. S. 1993. Differential protein expression and surface presentation generates high-frequency antugenic variation in Mycoplasma fermentans. Infect. Immun.,, 61: 5123-5128

360. Theiss P., Wise K. S. 1994. P29 and P78: structural and genetic analysis of two phase variant surface lipoproteins of M. fermentans. IOM Lett.,, 3: 561-562.

361. Theiss, P., and K. S. Wise. 1997. Localized frameshift mutation generates selective, high-frequency phase variation of a surface lipoprotein encoded by a mycoplasma ABC transporter operon. J. Bacteriol. 179:4013—4022.

362. Thirkell, D., A. D. Myles, B. L. Precious, J. S. Frost, J. C. Woodall, M. G. Burdon, and W. C. Russell. 1989. The urease of Ureaplasma urealyticum. J. Gen. Microbiol. 135:315-323.

363. Tomb JF. 1998. A panoramic view of bacterial transcription. Nat.Biotechnol. 16:23

364. Tovar,K., Ernst,A. and HilIen,W. 1988.Identification and nucleotide sequence of the class E tet regulatory elements and operator and inducer binding of the encoded purified Tet repressor. Mol. Gen. Genet. 215, 76-80

365. Tully, J. G., and S. Razin (ed.). 1996. Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology, vol. II. Diagnostic procedures. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

366. UHmann U, Schubert S, Krausse R. 1999. Comparative in-vitro activity of levofloxacin, other fluoroquinolones, doxycycline and erythromycin against Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis. J Antimicrob Chemother. Jun;43 Suppl C:33-6.

367. Ursi D., Ieven M., van Bever H., Quint W., Niesters H. G. M., Goossens H.

368. Typing of Mycoplasma pneumoniae by PCR-mediated DNA fingerprinting". J. Clin. Microbiol., 1994,32:2873=2875.

369. Van de Peer Y, De Wachter R. 1993.TREECON: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees. Comput Appl Biosci Apr;9(2): 177-82

370. Van,HuffeI,C., Dubois,E. and Messenguy,F. 1994. Cloning and sequencing of t Schizosaccharomyces pombe carl gene encoding arginase. Expression of thearginine anabolic and catabolic genes in response to arginine and related metabolites Yeast 10, 923-933

371. Varela,M.F. and Griffith,J.K. 1993. Nucleotide and deduced protein sequence of the class D tetracycline resistance determinant: Relationship to other antimicrobial transport proteins. Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1253-1258

372. Vilei EM, Nicolet J, Frey J. IS 1634, a novel insertion element creating long, variable-length direct repeats which is specific for Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small-colony type. J Bacteriol. 1999 Feb;181(4):1319-23.

373. Voelker LL, Dybvig K. 1998. Transposon mutagenesis. Methods Mol Biol.;104:235-8.

374. Voelker, L. L., and K. Dybvig. 1996. Gene transfer in Mycoplasma arthritidis:-transformation, conjugal transfer of Tn916, and evidence for a restriction system recognizing AGCT. J. Bacteriol. 178:6078-6081.

375. Wang EE, Matlow AG, Ohlsson A, Nelson SC. 1997 .Ureaplasma urealyticum infections in the perinatal period. Clin Perinatol. Mar;24(l):91-105.

376. Wang T., Tanaka M., Sato K. 1998. Detection of grlA and grlB mutations in 344 Staphylococcus aureus strains. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 236-240.

377. Waterston,R.H. Genome Sequencing Center, Washington University School of Medicine, 4444 Forest Park Parkway, St. Louis, MO 63108, USA Vmatl

378. Watson, H. L., K. Dybvig, D. K. Blalock, and G. H. Cassell. 1989. Subunit structure of the variable V-l antigen of Mycoplasma pulmonis. Infect. Im-mun. 57:1684-1690.

379. Weigel L., Steward C.D., Tenover F.C. 1998. gyrA mutations associated with fluoroquinolone resistance in eight species of Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2661-2667.

380. Whitcomb, R. F., and J. G. Tully (ed.). 1989. The mycoplasmas, vol. V. Spiroplasmas, acholeplasmas, and mycoplasmas of plants and arthropods. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

381. Wieslander A, Nordstrom S, Dahlqvist A, Rilfors L, Lindblom G. 1995. Membrane lipid composition and cell size of Acholeplasma laidlawii strain A are strongly influenced by lipid cyl chain length. Eur J Biochem. Feb 1;227(3):734-44.

382. Williamson, D. L., J. Renaudin, and J. M. Bove. 1991. Nucleotide sequence of the Spiroplasma citri fibril protein gene. J. Bacteriol. 173:4353—4362.

383. Winder D., Gunzburg W.H. Erfle V., Salmons B. 1998. Expression of . antimicrobial peptides has an antitumour effect in human cells. Biochem.

384. Biophys. Res. Commun. V.26. P. 608-12.

385. Wise, K. S. 1993. Adaptive surface variation in mycoplasmas. Trends Mi-crobiol. 1:59-63.

386. Woese, C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51:221-271.

387. Xu,J. and Bertrand,K.P. Nucleotide sequence of the acrEF operon from Escherichia coli. Unpublished (1992)

388. Yakushi T, Masuda K, Narita Si, Matsuyama Si, Tokuda H. 2000.A new ABC transporter mediating the detachment of lipid-modified proteins from membranes.Nat Cell Biol. Apr;2(4):212-8.

389. Ye,F., Renaudin,J., Bove,J.M. and Laigret,F. 1994. Cloning and sequencing of the replication origin (oriC) of the Spiroplasma citri chromosome and construction of autonomously replicating artificial plasmids. Curr. Microbiol. 29 (1), 23-29

390. Yogev, D., M. R. Watson, R. Rosengarten, J. Im, and K. S. Wise. 1995. Increased structural and combinatorial diversity in an extended family of genes encoding VIp surface proteins of Mycoplasma hyorhinis. J. Bacteriol. 177:56365643

391. Yoneyama H., Yamano Y., Nakae T. 1995. Role of porins in the antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa: construction of mutants with deletion in the multiple porin genes.

392. Yonezawa M., Takahata M., Banzawa N., Matsubara N., Watanabe Y., Narita H. 1995. Analysis of the NH2-terminal 87th amino acid of Escherichia coli GyrA in quinolone resistance. Microbiol. Immunol. 39:517-520.

393. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Nakamura S. 1990. Quinolone resistance- determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli.

394. Antimicrob. Agents Chemother. 34: 1271-1272.

395. Yoshida H., Bogaki M., Nakamura M., Yamanaka L.M., Nakamura S. 1991. Quinolone resistance- determining region in the DNA gyrase gyrB gene of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 35:1647-1650

396. Young J, Holland IB. 1999 .ABC transporters: bacterial exporters-revisited five years on. Biochim Biophys Acta. Dec 6;1461(2):177-200.

397. Zhang, Q., and K. S. Wise. 1996. Molecular basis of size and antigenic variation of a Mycoplasma hominis adhesin encoded by divergent vaa genes. Infect. Immun. 64:2737-2744.

398. Zhang, Q., and K. S. Wise. 1997. Localized reversible frameshift mutation in an adhesin gene confers a phase-variable adherence phenotype in mycoplasma. Mol. Microbiol. 25:859-869.

399. Zhao,J. and Aoki,T. 1992. Nucleotide sequence analysis of the class G tetracycline resistance determinant from Vibrio anguillarum. Microbiol. Immunol. 36(10), 1051-1060

400. Zharkikh AA, Rzhetsky AYu, Morosov PS, Sitnikova TL, Krushkal JS. 1991. VOSTORG: a package of microcomputer programs for sequence analysis and construction of phylogenetic trees. Gene May 30;101(2):251-4

401. Zheleznova EE, Markham P, Edgar R, Bibi E, Neyfakh AA, Brennan RG.2000.A structure-based mechanism for drug binding by multidrug transporters. Trends Biochem Sci. Feb;25(2):39-43

402. Zheng, J., and M. A. Mcintosh. 1995. Characterization of IS/227 from Mycoplasma hyorhinis: expression of its putative transposase in Escherichia coli incorporates a ribosomal frameshift mechanism. Mol. Microbiol. 16:669-685

403. Zhou C., Bahner I., Rossi J.J., Kohn D.B. 1996. Expression of hammerhead ribozymes by retroviral vectors to inhibit HIV-1 replication: comparison of RNA levels and viral inhibition. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. V.6. P. 17-24.

404. Zou, N., K. Park, and K. Dybvig. 1995. Mycoplasma virus PI has a linear, double-stranded DNA genome with inverted terminal repeats. Plasmid 33:41-49.

405. Борхсениус С. H. 1987. Микоплазмы как объект биотехнологии. Биотехнология, том №3, 338-342.

406. Борхсениус С.Н., Чернова О.А. 1989. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика. JI: Наука.

407. Говорун В.М., Бондарева Е.В., Кулакова С.Н., Капитанов А.Б. 1993. Изменение липидного состава клеток Acholeplasma laidlawii под действием толуола. Микробиология; 62:70-75.

408. Говорун В.М., Гущин А.Е., Ладыгина В.Г., Абрамычева Н.Ю, Тополь Ю.Ю. 1998. О формировании резистентности к фторхинолонам у М. hominis к A.laidlawii. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 3:16-19.

409. Клицунова Н.В., Быковский А.Ф., Смирнова Т.Д. и др.// Вестн. АМН ССР.-1976.-Ы6.-С.81-86.

410. Падейская E.H., Яковлев В.П. 1998. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. Логата, Москва.

411. Прозоровский C.B., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. 1995. Медицинская микоплазмология. Москва. Медицина. 288с.

412. Фримель Г. 1987. Иммунологические методы. М.: Медицина,, 472

413. Чернова O.A. 1999. Биохимические и молекулярнобиологические аспекты персистенции микоплазм у человека. Успехи биологической химии 39: 103140

414. Яковлев C.B. 1997. Клиническая химиотерапия бактериальных инфекций. Ньюадиамед-АО, Москва.