Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности иммунного ответа при зоонозном кожном лейшманиозе и методы его коррекции

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Особенности иммунного ответа при зоонозном кожном лейшманиозе и методы его коррекции"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОИ ПАРАЗИТОЛОГИИ И ТРОПИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ имени Е. И. МАРЦИНОВСКОГО

На правах рукописи

ФЕДЯИНОВА Инга Эрнестовна

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ЗООНОЗНОМ КОЖНОМ ЛЕЙШМАНИОЗЕ И МЕТОДЫ ЕГО КОРРЕКЦИИ

03.00.19 — паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1993

Работа выполнена в Институте медицинской паразитологиг и тропической медицины имени Е. И. Ызрциновского Госкомсанэпиднад-вора России.

Научные руководители: доктор медицинских наук

ШУЙКИНА. Э. Е.

кандидат медицинских наук БЕЛЯЕВ Д. Л.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

; профессор ОЗЕРЕЦКОБЗКАЯ Н.Н. | • член-корреспондент РАМН, профессор ГОТЕКАЕВ Е С. Ведушдя организация: Московская Медицинская Академия

имени И. 11 Сеченова

; Защита диссертации состоится "23" двкяйря 1993 г. в "10" часов на ааседании Специализированного совета Д 074.39.01 при Институте медицинской паразитологии -и тропической медицины км. Е. И. Ыарциновского по адресу: 119830, Шсква, Г-435, улица Малая Пироговская, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке; института. 'Автореферат разослан " " ноября' 1992 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета ФРОЛОВА А. А-

/ Тип. «Нефтяник» Зак.165.5 Тир. ,

Актуальность темы. Зоонозный кожный лейкмаккоз (ЗКЛ) - распространенное природно-очаговое заболевание, имеет большой удэдь-НЫЙ вес В краевой патологии государств Средней Аеии, э частнсссл, республики Узбекистан. Значительный приток неимунного населения з районы освоения целинных и залежных земель сопровождается массовыми вспышками кожного лейшманиоза, длительной потерей трудоспособности у значительной части больных, нередко большая! косметическими дефектами, что приводит к высокому психологическс-■ му и экономическому ушррбу (Сабитов Е.А., 1991). Из-за отсутствия средств местного лечения кожного лейшманиоза, достаточно эффективных при амбулаторном применении, население в очагах редко обратится аа медицинской помощью. Это вызывает необходимость поиска новых подходов к лечению инфекции с использованием данных о ведущей роли им>г/нодепресс ии и искажении иммунного отиета на возбудитель в патогенезе ЗКЛ (Нуйкина Э.Е. , I960; 1983).

3 настоящее время наиболее эффективным препаратом при лечении ЗКЛ является мономицин (Ш). Однако, трехразовое введение суточной дозы Ш, а такие ряд побочных эффектов ограничивает его амбулаторное применение, особенно при лечении детей (Белова И. II , 1962; М^равейская ЕС., 1962). Чтобы избежать токсическое действие препарата был разработан и внедрен в практику ряд ноеьк лекарственных форм Ш: мази с различным процентным содержанием дайствущэго начала, коллаген-мрномициновый комплекс (губка) "гэйшакоал" и др. Местное лечение позволило значительно сократить токсическое воздействие Ш на организм, однако, недостатком :шгода является его длительность, поэтому лечение ЗКЛ требует . дааьнайсэго соверпезстзования. В этой связи особое внимание мы 571?лаги кой5кЕащш специфической (¡¿астно.О и иммунотерапии оте-

чествэнным таунокорригирувшим препаратом - лейкинфероном (Л2) про;"" родства НШЭМ им. К Ф. Гамалеи (Кузнецов В. П., Беляев Д. Л , Еабаянц А. А. и др., 1981).

Л3> является комплексом цитокинов (белковых регуляторов клетки) первой фазы иммунного ответа с преобладанием активности ~ ин-терлейкина-1, фактора некроза опухолей, макрофаг- и лейкоцитинги-бирующих факторов и интерферона альфа. При бактериальных и других внутриклеточных инфекциях ЛФ повышает иммунное распознавание па- -раэита, стимулирует фагоцитарную функцию и иммунокоррекциш системы интерферона, изменяет ее функциналъное состояние, которое является одной из наиболее распространенных форм иммунодефицита (.Кузнецов Б.П. с соавт., 1989-1992).

ЬЬжно предположить, что разработка иммунотерапевтичеекого подхода к лечению данной инфекции позволит подробнее изучить спектр иммунных реакций, развивающихся под воздействием ЛФ при 8КЛ, а также подобрать наиболее аффективные'сочетания лекарственных препаратов.

Цель исследования: разработать .наименее токсичное, эффективное и доступное в амбулаторных (полевых) условиях комбинированное лечение ЗКЛ.

Основные задачи исследования; .

1. Изучить влияние ЛФ на течение и исход ЗКЛ у мышей, ошю-зиткых по чувствительности к L. major. '

2. Определить влияние Л® на фагоцитарную акпанасть и кид-линг 1_!газог макрофагами мышей. ;

3. Выяснить влияние Л5 на функционирование системы интерферона при экспериментальном ЗКЛ у дикий мышей, ошгазкткьа по чувствительности к делаазкоэу к ецокеть г качение продуцирования

цитокина сплекоцитами как возможного фактора, определяющего чувствительность шей к инфекции.

4. Изучить боэмоиность профилактического применения ЛФ при экспериментальном ЗКЛ.

5. Разработать комбинированный метод лечения ЗКЛ мокомициком и иммунокорректором и оценить его практические возможности.

Научная новизна. Впервые на модели экспериментальной инфекции L. major мышей СБА, относительно устойчивых к ЗКЛ и по характеру течения болезни наиболее близкой к инфекции у человека, выявлен высокий уровень продукции интерферона альфа спленсцитами, стабильный на протяжение всего курса комбинированного лечения Ш и ЛФ и после его окончания. Эффективность такого лечения ЗКЛ связана с восстановлением функции системы интерферона в организме.

Впервые на примере экспериментального ЗКЛ мьшей Swiss, предварительно получавсих ЛО, выявлено увеличение инкубационного периода и более легкое течение заболевания по сравнения с контролем, что свидетельствует о рациональности применеия иммукокоррек-торов для профилактики ЗКЛ.

Впервые комплексный отечественный иымунокорригирушций препарат ЛО был применен в комбинации с местной аппликацией Ш при лечении больных ЗИЛ с высоким эффектом.

Практическая ценность. Положительные экспериментальные данные о влиянии ЛФ на фагоцитоз и киллинг L. najor перитонеалъными фагоцитами иьшей, леченных Ш в комплексе с иммунокорректором, , высокой эффективности внутримышечного применения Л5> и местного применения Ш в терапии больных ЗКЛ указывают на целесообразность такого.комбинированного лечения данной инфекции. Это позволяет, помимо хорошего терапевтического эффекта, значительно сократить

курсовую дозу ММ, избегать его парентерального введения и, соответственно, снизить его токсическое дейстзие на организм больного.

Выявление профилактического действия ЛФ в отношении ЗКЛ мышей Swiss указывает на возможность применения иммунокорректоров (индукторов ЯФ) для профилактики ЗКЛ. '

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полетательные результаты комбинированного лечения (моно-мицик+лейккнферон) ЗКЛ связаны с удачным сочетанием паразитоцид-ного действия специфического антибиотика мономицина и иммунокор-ригиругнэго эффекта лейкинферона, который проявляется в стимуляции фагоцитарной функции и коррекции системы интерферона.

2. Система интерферона играет важную роль в• осуществлении Т-клеточкого иммунного ответа, основных функций мононуклеаров, формирования гракуломы при ЗКЛ. Недостаточность продукции интерферона или взаимодействия его с.другими активаторами клетки является ключевым дефектом в иммунном распознавании паразита, и . во многом определяет чувствительность мышей к L. rajor. •

Апробация- работы. Основные положения .диссертации были доложены на заседании Московского городского научного обшэства микробиологов, эпидемиологов и паразктол ••ов (январь 1992 г.). Апробация диссертации состоялась на заседании специализированного апро-бацконного совета ИШиТЫ им. Е. И. Марциновского (1 ивня 1993г).

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. " . ' -- V, "... -

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из ваеде-ния, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав, посвященных исследованиям in -vitro, in vivo, а также лечению

- б -

больных, ' общего обсуждения и заключения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами, 3 рисунками, 4 фотографиями и 5 микрофотографиями. Список литературы включает 60 работ отечественных и 132 зарубежных авторов.

СОДЕРЯАНИЕ РАБОТЫ Штернада и методы. Штамм возбудител.* ЗКЛ тип 4 (внсоковиру-лентньй).был выделен осенью 1990 г. от больного челевека и иден-' тифицирован как L. major в НИШЕ им. Л. И. Исаева и получен нами а 1990 г. В ходе выполнения настоящей работы культуру промастигот лейшманий поддерживали на двухфазной среде Э. Е. Щуйкиной (1S64), инкубировали при комнатной температуре. Пересев осуществляли каждые 20-22 дня. Для наблюдений in vitro применяли культуру паразитов в возрасте 5-7 дней, для заражения мьшей - 18-21 день.

Отбирая животных для эксперимента, их осматривали, обращали внимание на подвижность, аппетит, массу тела. В работе использовали самцов массой 18-25 г питомника "Столбовая'' АМН ССОР: - 430 мйшей СБА; - 300 мышей BALB/o; - 180 мышей BLC57/6. 60 самцов мышей Swiss массой 30-35 г взяты из вивария ИМЛиТМ им. Е. Я Мароновского. ' ' ' ,

Интахтных мышей СВА забивали, прикрепляли к парафиновой поверхности, обрабатывали волосяной покров на б] шшой части раствором иода со спиртом, затем кожу отпрепаровывали. в брюшную по-, лость вводили до 10 мл среды 199. Поверхность бршной стенки массировали стерильной стеклянной палочкой легким лоилачзгаанием в течение нескольких минут. Шлученный экссудат собирали шприцев яе, не повреждая кишчника. Обнчно удавалось собрать чуть ыеньсе

экссудата по объему (8-9 мл) от введенной среды, число клеток 2 - 'Ь5о

прилагалось к 1 млн з 1 ул. Ше манипуляции выполняли строго

стерильно в ламинарном боксе. В К2мере Гсряеаа подсчитывали моко-

6

циты. Рабочая концентрация клеток составляла 0,5x10 б 1 мл. Смыз разлизали в стерильные пробирки с покров:-::^я1 стеклами по 2 мл' и инкубировали при 37еС в течение 1-1,5 часов. Понле того, как клетки прикреплялись к поверхности покровного стек-ia, меняли среду на окончательный состав: среда 199 - S0£, эмбриональная телячья сыворотка инактивированкая - 202, глутаминовая кислота -3,3 мг/мл среды, пенициллина и стрептомицина по 100 Ед/мл. Культуру перитонеальных фагоцитов заражали через 18-24 часа после выделения клеток. Промастиготы L. major трехкратно отмывали в среде 199, каждый раз осаждая их центрифугированием (1Б00 об/мин в течение 20 ми:-:). Культуру заражали из рассчета 1-2 паразита на 1

моноритарный фагоцит, т.е. в пробирку вносили примерно 1 млн. naff

разотов на 0,5x10 моноцитарных клеток. ЛФ добавляли в концентрациях 45, 60 и 75 МЕ/мд. Результаты опыта ..-гистрировали на 1, 3, 5 и 7е сутки после заражения. Для этого покровные стекла с монослоем клеток вынимали из пробирок, отмывали от остатков питательной среды, погружая их в три смены раствора Хенкса или другого изотонического раствора, высушивали при комнатной температуре и фиксировали в метаноле, затем окрашивали по Романовскому-Гимза, обезвоживали (ксилол-ацетоновая батарея), заклшали в канадский бальзам. Црепараты микроскопировали при ув. об. ЮОх, определяя число и процент зараженных макрофагов и число лейлманий на одну клетку. Вое показатели определяли из расчета на 200 клеток.

Мьсей всех четырех испытуемых линий заражали в кожу спины, кеокслько отступя от корня хвоста, вводили не менее 1 млн. живых срсиастигот в 0,07-0,1 мл жидкой среды. Наличие паразитов в мазках

кэ краевых инфильтратов определяли по методике 0. И. Келлккой (1S67). Контрольные животные имели ту же степень поражения, что и опытные.

Лечение мьд:ей EALB/o, ELC57/6 к СВА было начато на 17 день после заражения, т. е. когда у животных сформировались кожные пора:',ения. Применял:* КМ (в/м инъекции водного раствора по О,Cl г/кг массы телз ежедневно в течение 15 дней) и Ш с Л2 (последний вводили в/м через день по 1000 LE три раза и четвертая инъекцхя через 72 часа). У каждой мьпии отмечали сроки появления бугорков (инфильтратов), язв, их размеры (по шкале О. К. Келлиной, 1S57), а также созревание грануляций, эпителкаацию и рубцевание. По окончании лечения определяли средние сроки появления эптелизации и рубцов у милей, по этим показателям судили об эффективности лечения.

Лечение больных ЭКЛ проводилось в эндемичных очагах (Республика Узбекистан, Каска-Дарьинская область) в сезоны 1930 и 1991 гг. За указанный период работы за помощью обратилось 18? больных, из них под постоянным наблюдением находился 141 человек, боль-еэтстзо обратилось к врачу через 0,5-2 месяца от начала заболевания. Паразитологического подтверждена больным с типичной клип-ческой картиной не проводили. Обследование больных кожным ле?лг.-л-кис?ом различалось в опросе и заполнении амбулаторной карты, осмотре, описании каждого обнаруженного поражения (язвы, бугорка) по соответствующей схеме с измерением размера, ^ля описания кожных поражений мы применяли схему описания язвы (Е^йчлна 3. Е., Хусейинова X X , 1976). в которую екличекы характерные признак лейданиоэных поражений, отобранные ка основании клинической практики и анализа литературы.

Больные с момента обращения или выявления . прлучали местное лечение з виде погкгок с УМ мазью или губкой "лейшмакодд", мазью с ЛО, а также различными комбинациями местного специфического лечения к мази, содержащей ЛФ. ЛФ в виде 2-6 в/м инъекций водного раствора по 10000 № с интервалом 3-4 суток применяли в комбинации с ¿01 мазькз или губкой. В целом лекарственные формы ЛФ применены для лечения 50 человек. Лечение проводили в сельских врачебных амбулаториях, фельдшерско-акушерских пунктах, а также по месту выявления больных - при подворных обходах и выездах на по-леЕые станы, иколы. Результаты контролировали через неделю после окончания лечения.

Опрэде^юю уровня Ш-л. в сусаенат сплеиоцитав мышей ВА1В/с я СБА. После срединного разреза брюаной полости у мыши извлекали селезенку, отделяли от связок, промывали в охлажденном физиологическом растворе. Затем, сделав 4-5 надрезов, помещали ее в гомогенизатор Поттера (с физ. раствором и гепаракном в концентрации 30-40 Ед/мл). Гомогс-низаци» проводили на ледяной бане. Полученную клеточную суспензии пропускали через капроновый фильтр и отмызади на холоду 2-3 раза в 199 среде с гепарином. Отмьлый осадок клеток

рагбазляяи. средой 199 с 10Х эмбриональной.телячьей сыворотки до б

концентрации 7x10 клеток/мл и добавляли вирус болезни Нью-Кастла, инкубировали в течение 24 часов при 37°С и определяли уровень ИЗы, в надосадочной жидкости суспензии спленоцитов по методике, описанной Е Д. Соловьевым и Т. А. Бектемировым (1981).

Лекарственные препараты на основе Ш, применявшиеся в работе включали мазь на вазелиново-ланолиновой основе с содержанием Ш от 2 до 5Х и губку (коллаген-мономициновый комплекс "лейпмз-колл"), имещую в своем составе 0,05 г хондроитинсульфата и Ш 0,3 г/г сухого остатка коллагена

В числе лекарственных препаратов на основе ЛФ мы применяли ЛФ для инъекций - комплексный препарат человеческого ИФч и цито-кинов, синтезированных культурой лейкоцитов донорской крови в ответ на вирусную индукцию с последуюшэй' инактивацией вируса и очисткой. Ампула содержит не менее 10000 Ш противовирусной активности человеческого ЙЗЫи МИФ; мазь с содержанием от 5 до 1000 МЕ/г, приготовленную на основе масла касторового или персикового. Оба препарата производят в НИИЗМ им.Н.Ф.Гамалеи (Кузнецов ЕЕ с соавт., 1981). :

Статистическая обработка данных, полученных в процессе исследований, проведена стандартными статистическими методами (Власов 2. В., 1988).

/ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Влияние лейкинферона на рост- и жизнедеятельность проызстигот L. major. ЛФ не влияет на жизнедеятельность промастигот лейшманий. Число паразитов, их морфология и подвижность при добавлении препарата в культуру не отличалась от таковых в контроле, поэтому в ходе дальнейших экспериментов in vitro мы учитывали результаты без поправок на прямое воздействие ЛФ на паразит. Наблюдения, впервые проведенные на промастигогах L. major, полностью совпали с результатами исследователей, работавших на вирусных и бактериальных моделях. Было показано, что бактериальный фактор, присутствующий в препаратах ИФ и, в . частности ЛФ, не. играет серьезной роли в механизме антибактериального действия. Он воздействует преимущественно на. грамположительные бактерии и в небольших дозах совершенно недостаточен для подавления других возбудителей.

Влияние лейкинферона ва активацию макрофагов я юшинг про-частигат L irejor. Результаты исследования способности ЛФ примиро-

зать :S к киллкнгу L. raj or подтвердила! взаимосвязь парзитарного

ккллзига с прэдсткму-ляцией Наиболее отчетливые данные получе-

е

ны при концентрации препарата 60 МБ/10 клеток (концентрации 45 и £

7о JS/10 клеток оказались менее эффективными).

Через 24 часа после заражения клеток лромастиготами L. major, оказалось, что в группе культур клеток, где ЛФ вводили за сутки (группа 1) или за 2 часа до заражения (группа 2), фагоцитарная активность вдвое превышала таковую в контроле (табл.1). Введение л:- в день заражения культуры клеток L. mjor (табл. 1, группа 2) достоверно повысило (р<0,001) их лейшманицидную активность не тольга по сравнению с контрольной группой, но и с группой 1. Фагоцитарные индексы в 1 и 2 группах существенно не отличались, но более, чем в два раза превышали этот показатель в контрольной группе.

В препаратах из культуры, где клетки инкубировали с ЛФ отмечалось около 95,6% "распластанных" клеток с отростками и отчетливыми ядрам! и включениями. В противоположность ИЗ 40Х паразитов были изменены (округлая форма, грубозернистая цитоплазма, разрушенные ядро и кинетопласт).

В препаратах из контрольной культуры клеток без добавления Ш крупные "распластанные" клетки составили менее половины (40%), оетальш..- имели вакуолизированную зернистую цитоплазму, разрушенную цитоплазмтическую мембрану. Лейшмании в таких препаратах крупные, с отчетливым ядром и кинетопластом. На первые сутки, после заражения клеток L. major мы сформировали еше одну опытную группу, введя ЛФ в культуру зараженных промастиготами фагоцитов (группа 4).

Таблица 1

Результаты исследования влияния лейкинферока на фагоцитоз и киллияг промэстигот Ь. таз'ог неиядуцирозаЕНКми'перитонеалзяьз,и макрофагам мышей СБА (концентрация препарата 60 МЕ/10 клеток)

NN 1 1 1 | Условия I ! Зараженные| !&.крофаги с 1 ¡Фагоцитарный

групп | эксперимента ] макрофаги, | убитыми | индекс*

! 1 г 1 % ! 1 паразиташхД 1

ЛО до заражения 1 сутки

1. ' за 24 часа 75,6 ± 3,2 16,3 + 1,5 3,1 ±0,5

2. ' за 2 часа 78,3 ± 2,1 39,2 ± 1,2 2,4 ± 0,9

3. Контроль 36,2 ± 1,5 3,6 ± 0,2 1,4 ± 0,2

3 сутки

1. - " - 88,6 £ 2,4 15,3 ± 2,2

2. " " - 40,2 ± 1,8 6,8 ± 1,0

3. Контроль 18,2 ±1,3 4,0 ± 1,4

4. Л<5 после заражения (через, 24 ч) 16,6 ± 1,1 4,9 ± 1,2

5 сутки

1. _ II _ 96,4 ± 2,6 '

2. . II _ 42,1 ± 1,8

з: Контроль 16,8 ± 1,7

4. _ II _ 29,0 ± 2,1

7 сутки :

Шкрофаги с живыми паразитами, %

1. _ « — 12,5 ± 0,8

2. — " — 25,8 2,6

3. Контроль 79,4 ± 2,8

4. _ 1» _ 60,2 ± 3,1

* Среднее число паразитов, содержащихся в одном Ш, -пщствовав-шеи в фагоцитозе.

На третьи сутки наших найлюденкТ мы обнаружили резкое снижение чис-1 паразитов в препаратах клеток, преинкубированных с Ш. Особенно отчетливо это наблюдалось в группе, где инкубацию проводили в течение 24 часов до заражения (табл.1, группа 1). Все показатели киллинга лейглманий в группе 1 с достоверностью (р<0,001) превышали таковые в контроле и в группах, где ЛФ вводили "в день заражения (группа 2) и через 24 часа после заражения (группа 4). Лейшманицидная активность во 2 группе была достоверно выше (р<0,01) по сравнеию с группами 3 и 4 . Введение же ЛФ через 24 часа после заражения культуры клеток L. major (группа 4) фактически не изменило число паразитов в макрофагах по сравнению с контролем.

К 5-7 суткам ЫФ, культивируемые в присутствии ЛФ были прак- . тически свободны от паразитов в случае длительной предстимуляции (группа 1, р<0,001). В случае введения препарата в культуру I® через 2 часа после заражения (группа 2) способность Ш к киллингу паразитов оказалась в 2,2 раза ниже (р<0,01), чем в 1 группе. Пот каэатели фагоцитоза в этих группах достоверно превышают таковые,в * группах 3 и 4. При введении препарата через 24 часа после заражения (группа 4) на 5-7 сутки отмечалась тенденция к снижению числа.1 паразитов только но сравнению с контролем (0,0б<р<0,1).

Влияние дейютферана .на течение ЗКЛ у иышзй BALB/c, BLD57/B, СБА. Введение одногоЛФ не только не улучшило процессов заживления, но обострило воспаление по сравнению с контрольными группами..;

Так, в группе мышей BALB/o после введения Ш отмечалось более активное проявление кожных поражений по сравнению с контролем: ухе к 4 неделе после заражения числю животных с язвами пре-вьсаюсзши £0 им, распадом тканей, обильным отделяемый достоверно .

; 1 '; _ ■•'..- Таблица 2

Влияние внутришазчного введения лейкинферона на течение и исход " экспериментального ЗИЛ у мышей EALB/o, BLG57/6, СВА.

Сроки наблю- ..... 4 недели 1 12 недель | 20 недель

дения после .

заражения 1

"о. :■ Животные с Погибшие Еивотные с | Гибель жи- Животные со

активными животные инфильтра- | вотных, специфическими

проявлени- % таыи, | % поражениями,

"*.. ' ■ ями ЗКЛ, X* X 1 | %

Линия п

мышей

BALB/o '180

опыт (ЛФ) : 95,6 ± 1,2 60,2 ± 1,2 100

контроль , .38,5. ±1,3 19,2 ± 2,5 71,2 + 3, 8

BLCS7/6 180 ■. - " . .

опьгг (ЛФ) 32,3 ± 1,6 90,2 ± 1,9 10,2 ± 1,8

контроль 4,6 ± 0,8 18,3 ± 1,7 2,1 ± 1,0

СВА 180

опыт (ЛФ) 33,1 ± 1,5 89,7 ± 2,5 6,2 ± 2,1

..онтроль 7,1 ± 0,2 20,2 ± 1,5 1,9 ± 0,9

* X вычисляли от, обшэгс числа животных.

превышало этот показатель в контроле (р<0,001), где у мышей яре-? • обладали круглые язвы диаметром 4-5 ш, покрытые плотной корочкой. Среди мышей BLCB7/6, получавших ЛФ в 8 раз (р<0,001) чаше ПО сравнению с контролем встречались животные с плотными инфильтратами размером 10-12 мм и ранним изъязвлением (табл. 2). Аналогичная ситуация наблюдалась и в случае введения ЛФ мышам СБА: к 4 неделе после заражения число животных с активными кожными проявлениями заболевания превышало таковое в контроле в 4 раза (р<0,001, табл.2). На 12 неделе наблюдений в опытной группе у мышей BALB/o наблюдалось истощение, поредение волосяного покрова, их гибель была в 3 раза выше, чем в контроле (р<0,01). В маг• ках-отпечатках печени, селезенки, костного мозга и краевого инфильтрата специфических поражений кожи животных опытной и экспериментальной групп обнаруживали большое количество лейшманий и бактериальной флоры различного характера, что свидетельствовало о генерализованной паразитарной и бактериальной инфекции. Течение ЗКЛ (12 неделя наблюдений) в опытных группах мышей BLC57/6 и СВА имело характер местного процесса (инфильтаты 10- 12 мм) с небольшими учасками распада тканей, что нетипично для этих устойчивых к L. major линий. В контроле"такие поражения встречались в 4,5 раза (р<0,01) режа, чем в опыте (табл. 2). К 20 неделе мы наблюдали 100% гибель мышей BALB/o в опытной группе. В опьггных и контрольных группах СВА и BLC57/6 гибели животных не отмечено (табл. 2). Нерассосавшиеся инфильтраты наблюдались в 5 раз чаще У мыше: BLC57/6 и 3 раза у мышей СВА опьпных групп по сравнению с контролем (р<0,001).

Профюакгигесюе действие лейктферова при ансперииентальвоь ЗКЛ швзей Striss. Ушм Sviss занимают промежуточное положение мех-

ду ВАЬВ/о и СБА по чувствительности к лейпманиозу, поэтому они представляли наибольший интерес для оценки профилактического действия ЛО. !&лпей заражали на следуюз^е сутки после четвертой инъекции ЛО. У животных, которые предварительно получали ЛФ, инкубационный период увеличился в 2 раза (р<0,01) по сравнению с контролем . В ходе дальнейших наблюдений отмечено более легкое течение заболевания в данной группе: в 2,4 раза реже у животных развивались инфильтраты более 12 мм в диаметре или изъязвления, чем в контроле (р<0,01).

Таблица 3

Результаты лечения мышей 8А1_В/с мономицином и его комбинацией с лейкинфероном

-1-1-1-

NN | Схема | п | Сроки' появления (дни)

групп| лечения| | грануляций |эпителиэации|рубцевания |рассасывания ||| | | | бугорков*

_I_1_I_I_I_I_

1. ММ 40 12,6 ±1,9 14,6+1,7 19,7 ± 4,5 13,2 ± 1,2

2. Ш + Л® 40 7,2 ±0,5' 8,9'±0,3 15,2 ±3,5 10,8 ±0,9

3. Контроль 40 генерализация инфекционного процесса, гибель

* Лечение начато на стадии бугорка

Влияние комбинированного лечения (лейкинферон + кюномицин) на течение ЗИЛ шюей ВАЬВ/с и СБА. Лечение начинали на 17 день после заражения. К этому моменту у 100% мышей ВАЬВ/с сформировались типичные кожные поражения (бугорки у 13%, язвы - у 87% животных)". Появление специфических кожных поражений отмечали у 92% мшей СЕА ( в т. ч. инфильтраты - 84%, язвы - 8%). В опытной груп-

пе 1 жоотным обеих линий в/м вводили водный раствор Ш по 0.01 г/кг в сутки в'течение 15 дней ежедневно. В группе 2 ММ вводили по этой же схеме и в/м инъекции водного раствора ЛФ по указанной схеме (стр.7 ). Группа 3 - зараженные животные, не получавшие.лечения (контроль). У мьшей BALB/o сочетание Ш с ЛФ (табл. 3, группа 2) приводило к укорочению сроков созревания грануляций у. развития эпителизацки по сравнению с группой 1, получавшей один только ML£ (0,05<р<0,1). Все леченные мьши остались живы В.отличие контрольных, животных, у которых инфекция поразила внутренние органы и привела к гибели всех мышей.

Цри лечении мьшей СБА отмечено достоверное сокращение (р<0,01) сроков выздоровления при применении ЛФ (рисунок 1). Рубцы в этой группе сформировались в 2 раза раньше, чем у животных, по-! лучавших один Ш (рисунок 1). В тех случаях, когда лечение с Щ было начато на стадии бугорка, у 1007. животных к 5 дню лечения наступало полное выздоровление, (рисунок 2), в случае же применения одного только 1(М бугорки исчезли к 5 дню лишь у. 1/3 животных (рисунок 2). Полное выздоровление (рубцевание, отсутствие паразитов в соскобах кожи в месте заражения и мазках-отпечатках) в случае комбинированного лечения Ш с ЛФ наступило в 2,5 раза быстрее (р<0,001) в эксперименте с мылами СБА, чем у BALB/c. По окончании лечения у мьшей обеих групп и у контрольных животных были ; приготовлены мазки-отпечатки внутренних органов, костного мозга и соскобоа кожи из места заражения (специфических поражений). У леченных мьшей паразиты не были обнаружены, у контрольных животных наблюдалась картина, аналогичная предыдущему опыту (стр.14) с сохранением возбудителя. У оставшихся мьшей из опытных групп рецидивы заболевания не былй выявлены в течение 4 месяцев наблюдения после окончания лечения. '' ' ■..-'

-11- рисунок I

¿инаая'яа сроков рубцевания у мыней СЗА при их локбкнирозанноч

лгчэнли. начетом на стадии язви

ТОО"

100 SO 80 70 f,о 50 40 :JQ 20 10

96.2

4?.1

30 3 pï

44.3

15.2

п

8в.в вЭ.З

1

I

ra I.

Р

щ

к I

I iií

I i

il

SM

I

I

i

I

kW p

iv.,1

JL

. зеченкэ «зномицико^

7. в 9

СП i ЕШЗ ;

10 11 1?

лгчем'.'.е мзкэмицико;!

Рисунок 2

Рассаг»«?.«!* 'угсгхоэ у »гглеП Z*A гг 5 гнеЯ .:»чен::л, начатого

на Сугсргэ

. . Í . V

Ч

—

>si\ Г

л»

I X

:ч/

йрС'ДТ^'Я сехэгенхи кьпей ОВА я BALB/c в про-

весе -ГЕ-уеж? их ыоьоьящщэы я eso комбинацией с ¿ейнхнфэроЕом. Ефф^кткакое лечение препарата;,ai КО-сС может способствовать восста-кзялс-кза системы КО в организме, фи этом первой восстанавливается система ИО-á, последней - В ходе настоящего исследования мы определял:! уровень продукции ИS-«t спленоцитами мьсзей обеих лпнззй до зараже.чз:я их L. major, в-различные сроки после заражения, в процессе лечо:-;з:я и по этз'.м показателям судили о функции систему КО на данных этапах исследования. До заражения мклей лейпманиями продукта КО-=б клетками селезенки мьлпей HALE/c и СБА была очень :-:з:зкой (<20 11), аналогичная ситуация наблюдалась и на 14 день после их заражения, т.е. в момент первых, проявлений специфических кожных поражений (рис. Ь,-. К 23 дни после зарачения в процессе раз взятия инфекции у мы=зей SALB^c продукция КО-л сохранялась на кз'.гком уровне (группа 3, рз:с. S), стандартная терапия iíM способствовала увеличению! лредукцз:к ИЭ-«с в 2 раза (группа 1), а прзо.гекек;:е двух инъекций ЛЭ - в 3,1 раза (группа 2, рис. 3) по сравнения с контролем- Однако, полного восстановления функции системы КО добиться не удалось. 2слз*. по скончании курса лечения (45 день) показатели уровня КО оставались в опытных группах 1 и 2 (рис. 3) на прежнем уровне (в группе 3 его уровень составлял <20 12), то уже через неделэ после окончания лечения показатели КО с из« или с ь е 2 раза е группе 1 и а 1,6 pas в группе 2 (рис. 3). У i^e?. СНА, получав г.'.х 1й! (рис. 3, группа 1) к 23 дню после заражения уровень К-З-ос был аналогичен тачоврму в группе i BALE/c с той разницей, .что и через недела после окончания лечения этот показатель оставался без изменений ( у BALB/c он в 2 раза пони-

вился). При лечении Ш с Ж (грулпа 2, рис. 3) наблюдались высокие -ровни продукции ИФ-оС- , стабильные на протяжение всего курса лечения и через неделю после его окончания, что в 2 раза превышало таковые показатели в группе 1 СБА и во всех группах ВАЬВ/о. Спленоциты животных контрольной группы 3 продуцировали достаточно высокие уровни ИФ-л в процессе разсития инфекции и пика ее проявлений с последующим снижением (в 2 раза по сравнению с группой 1) в период рассасывания инфильтратов и обратного развития инфекционного процесса на 52 день после заражения.

Лечение больных ЗКЛ тношащаом и его комбинацией с лейкин-фероноы. Лечение проводили Ш (мазь, губка) и ЛФ (мазь, инъекции). Лекарственные формы ЛФ применены для 50 человек. Из них: женщин - 29, мужчик - 21 человек; в том числе детей 3-4 лет - 2, 5-6 лет - 1, 7-14 лет - 6 человек, взрослых 15-19 лет' - 7, 20-29 дет - 12, 30-39 лет - 10, 40-49 лет - 11, 70 лет - 1 человек. С тяжелым течением заболевания (множественные язвы, обширные поражения, плотные инфильтраты, присоединение пиогенной флоры, бугорки обсеменения, выраженные лимфангиты и.лимфадениты) - 11 человек, с легким течением - 39 человек. Давность заболевания составила в среднем 1,2 ± 0,7 месяца.; Основной контингент - полеводы, хлопкоробы и члены их семей. Результаты лечения контролировали через неделю после окончания лечения. В процессе терапии побочных реакций на препараты мы не отмечали.;Результаты лечения больных ЗКЛ 1Ш и его комбинацией с ЛФ представлены в таблице 4. Введение ® в/и в комплексе с местным применением Ш (группы 1, 2) в 2,4 раза (р<0,001) сокрвтило сроки выздоровления (появление апителиза-ции и рубцевания) со сравнению с'одним местным применением различных лекарственных форы Ш (группы 3, 4). Особенно отчетливый

Таблица 4

Результаты лечения больных ЗКЛ мономицином и его, комбинацией о лейкинфероном

1 I ' I : !

NN | Схема лечения, | Число больных |' Сроки, дни •групп! форма препара-|(характер течения! эпителиза-1 рубцева-| тов | • ЗКЛ) | ции | ■ ния

._I_'._I___I_I_

1. ЛФ в/м + ММ мазь 11 9,1 ± 2,0 16,5 ± 1,8

(7 - тяжелое) 14,8 ± 1,3^ 19,2 ± 1,7 (4 - легкое) 6,0 ± 1,2 13,8 ± 1,6

2. ЛФ в/м + Ш губка 8 10,2 ± 2,5. 18,3 ± 1,9

(4 - тяжелое) 15,5 ± 2,1 20,6 ± 2,6 (4 - легкое) 7,2 ± 1,9 16,2 ± 2,0

3. ОД мазь 40

ЛФ мазь б более 45*

ЛФ мазь + ОД мазь 18

4. Ш губка 15 более 45 ОД губка + Ш мазь 35

ОД губка + ЛФ мазь 7

* Срок наблюдения

эффект наблюдался при легком течении заболевания (табл. 4, группы 1 и 2): периферическая и центральная зптелиэация у этих больных отмечалась в среднем к 8 дню после начала лечения, что в 2 раза ранызе (р<0,01), чем при лечении больных с тяжелым течением. Однако, полное выэдороэление при в/м введении ЛФ наступало у больных фактически одновременно, независимо от тяжести процесса. Местное применение только ЛФ в виде мази не дало выраженного положительного эффекта (группа 3). Высокую эффективность сочетанной терапии подтверждают результаты лечения больного Ii Г. с множественными обширными язвами, осложненными - эризепелоидом. На 7 день от качала лечения симптомы рожи исчезли (4 инъекции препарата), а к 1В дню при постоянном применении Ш губки и мази ,у него было отмечено полное выздоровление, включая отсутствие лимфангита и уменьшение явлений лимфаденита. Это свидетельствует о сбалансированности действия ЛФ как' HMMyHocrnMymTopaj - целесообразности его применения при лечении больных ЗКЛ и согласуется с данными . авторов об успешном использовании ЛФ в терапии некоторых кожных-и др. заболеваний (Кузнецов В. П. с соавт., 1992; Черкасов В. П. с соавт. , 1992). '

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ,' Изучение влияния ЛФ, комплексного препарата ИФ-Я- и цитокинов первой неспецифической фазы иммунного ответа, на течение, и исход ЗКЛ, продукцию ИФ-о<. в процессе лечения, подтвердили важную ,роль эндо- и экзогенных ЦК в иммунном ответе при: лейшманиоэе. Йрове-денные исследования показали, что Ш> не оказывает прямого антипаразитарного действия, на L. major, но влияет на активацию фагоцитоза и киллинг паразита посредством включения различных механизмов клеточной защиты. Применение одного ЛФ при ЗКЛ мышей, оппозитных

по чувствительности к L. major (PALS/o, BLC57/S, СЕА), не оказало -положительного эффекта на течение экспериментальной инфекции, более того - активировало воспаление. При комбинированном лечении (ЛЗ, Ш) экспериментального ЗКЛ отмечена отчетлива* тенденция к укорочении сроков выздоровления з случае мыаей SALS/o и их достоверное сокращение у мьшей СВА, а такяе в 100% случаев обратное развитие лейшманиозных поражений з раннем периоде инфекции, когда .лечение было начато на стадии бугорка. 'Успешное излечение мьпкй» СВА помимо исчезновения клинических проявлений заболевания приводило к отсутствии паразитов з зоне заражения и аысокой продукции VJht спленоцитами, стабильной на протяжение всего курса комбинированного лечения и после его окончания. Введение ЛФ с профилактической целью мышам Swiss до заражения их L. major значительно уд-линняет инкубацию и облегчает последующее течение заболевания, что указывает на перспективность применения иммуномодуляторов в профилактике ЗКЛ.

Результаты наши экспериментов не противоречат данным других исследований роли ЦК при ЗКЛ. Полученные данные в опытах in vitro и" на инбредных животных, оппоэитных по чувтвительности к ЗКЛ, представлявши своеобразную модель "вариантов тяжелого и легкого течения паразитоза у человека, послужила основой для применения Ю при лечении ЗКЛ людей.

■Эффект такого лечения оказался весьма обнадеживающим: применяя Ш нэстно я Л5 в/м нам удалось амбулаторно, в весьма сжатые eposes, не презшаиз» ■ таковш в случае в/м инъега., ¡й Ш, 'добиться полного выздоровления больных даке с тяжелыми осложненными формами заболевав. Эти дакннз свидетельствуют о перспективности раз-, рзботанного подхода к терапии ЗКЛ с применением иммуномодулятора

ЛФ и специфического Антибиотика И, что дает возможность коррекции -ефектов иммунного ответа на возбудитель, возникающих в процессе заболевания, и позволяет избежать осложнений от паренге-рального введения больших доз ММ. Комбинированное лечение удобно применять амбулаторно, т.к. общее число инъекция резко снижено: 2-6 по сравнению с 42, принятыми ранее, нет необходимости ежедневно контролировать больного, опасаясь лекарственной патологии, вследствие отсутствия побочного действия ЛФ в таких небольших дозах.

- 6

1. Лейкинферон в дозе 60 ЫЕ/10 клеток in vitro примирует пе-питонеальнь'в фагоциты мышей СБА к киллшгу - паразитов. Наиболее действенной была предстимуляция в течение 24 часов, что.выражалось в 100Х паразитоцидном эффекте на 5-7 сутки.

2. Введение одного лайкинферона обостряет некоторые проявления инфекции (воспаление, некроз) у восприимчивых к L.major BALB/o, равно как и у более устойчивых BLC57/6 и СБА. Введение препарата мышам Swiss до заражения их возбудителем ЗКЛ проело к достоверному увеличению инкубационного периода (р<0,01), развившиеся поражения были мене® выражены, чем в^коктроле.

3. Комбинированная ( (лейкинферон и мономнцие внутримышечно) терапия мышей СВА, начатая на стадии бугорка, приводила к подносу выздоровлению 10QZ животных к 5 дню лечения; введение одного ио-номицина способствовало рассасыванию поражений лига у 1/3 " мншй. Комбинированное лечение на стадии язвы у мышей СБА s 2 раза (р<0,01) сокрадало сроки выздоровления по сравнению с контролем и группой, получавшей один юношцкн. УттЩ BALB/o при номинированной терапии выявлена лишь тенденция (О,05<р<0,1) к укорочению периода излечения.

4. Комбинированное лечение мышей СЕЛ и ВАЬВ/о способствовало более активной продукции сггленоцитами по сравнению с контролем и стандартной терапией юномицином. По с.аэнчанш лечения /. чувствительных к ЗКЛ мышей ВАЬВ/с наблюдали снижение уровня ИФ*св отличие от такового у СВА.

5. При амбулаторном лечении больных ЗКЛ внутримышечное применение лейкинферона в комплексе с местным применением мономицина (губка, мазь) независимо от тяжести заболевания в 2,4 ;аза (р<0,01) сократило сроки выздоровления по сравнению с одним местным лечением различными лекарственными формами мономицина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Седяинова И. Э. Роль и лечебное применение иитерферонов при лейшманиоаах (обзор литературы) // Мэд. паразитол. - 1932. -N 6-6. - С. 56-61.

2. Сергиев В. П. , Щуйкина Э. Е., Кузнецов Е П. , Беляев Д Л. , (Седяинова И.Э. , Нэрбадаяов М. Т. , Сунцоа С. К Применение лейкинферона в лечении зоонозного кожного лейсманиоза. Лечение больных // №д. парззитол. - 1993. - Н 1. - С. 42-44.

3. Е^йкияа Э. Е. , Сергиев В. П. , Кузнецов Е П. , Беляев Д. Л. , Седяинова Я Э. Применение лейкинферон' а лечении зоонозного кожного лейшманиоза. Исследование на экспериментальной модели у мышей // Иэд. паразитол. - 1993. - Н 3. - С. 51-54.

Внедрение результатов исследований в практику. Результаты диссертационной .работы включены в "Инструкцию по применению лейкинферона для инъекций сухого" и внедрены в практику лечения ЗКЛ в Областном кожно-венероло лч-;- с ком дне пане е ре Капкадарьинской области с 1 сентября 1992 года.