Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности экспрессии факторов патогенности LISTERIA MONOCYTOGENES при различных условиях культивирования

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспрессии факторов патогенности LISTERIA MONOCYTOGENES при различных условиях культивирования"

„ XI^ f>.r- О

J U.u l^wO

На правах рукописи

ВАРФОЛОМЕЕВА Нина Александровна

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ LISTERIA MONOCYTOGENES ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛ ЬТИВИРОВ АНИЯ

03.00.07 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1998

Работа гыполнена в Научно-исследовательском Институте Эпидемиологии и микробиологии имен I почетного академика Н. Ф. Гамахеи РАМН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук И. С. Тартаковский.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Бондаренко В. М. Доктор биологических наук, профессор Бонченко М. Н.

Ведущее учреждение — Российская Академия последипломного образования МЗ РФ.

Защита диссертации состоится « г.

в . час. на заседании Диссертационного С(^вета К001.07.01 в Научно-исследовательском Институте Эпидемиологии и Микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Гамалеи.

//"' /У

Автореферат разослан « ^Р. » . . . .......1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета Доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

Актуальность темы

К концу XX века вследствие антропогенной трансформации внешней среды значительно изменилась структура инфекционных заболеваний человека. Особое значение приобрели возбудители оппортунистических инфекций, представляющие опасность для представителей групп риска (беременных, новорожденных), на фоне сопутствующих заболеваний, иммунодепрессантной терапии и др.

Listeria monocytogenes, широко распространенная в природе грам-положительная бактерия, представляет опасность именно для перечисленных категорий пациентов, вызывая аборты, сепсис, менингиты и менингоэнцефалиты. Однако за последние годы зарегистрировано несколько крупных вспышек листериоза среди взрослых здоровых людей. Заболевания были вызваны употреблением в пищу зараженных возбудителем продуктов питания. Возбудитель обычно бывает обнаружен в сыре, копченостях, т.е. продуктах, не требующих тепловой обработки, но предназначенных для длительного хранения в холодильнике при +4°С. При этой температуре листерии способны эффективно размножаться, что и приводит к заражению. В этой связи изучение биологии возбудителя листериоза приобрело особое значение.

Характерной особенностью листерий является способность эффективно размножаться внутри как непрофессиональных фагоцитов, таких как гепатоциты и эпителиальные клетки, так и профессионально фагоцитирующих клеток (Färber and Peterkin, 1991). Показано, что для успешного взаимодействия с клеткой-хозяином листерии необходим ряд секретируемых белковых продуктов: листериолизин О, фосфатидил-инозитол специфичная фосфолипаза С, лецитиназа, металлопротеаза и др. (Portnoy et al., 1992). Гены, кодирующие основные факторы патогенностй листерий локализованы в трех оперонах, для транскрипции которых необходим положительный регулятор PrfA (Positive regulator factor of listeriolysin (lysA) expression). Изучение

механизма, лежащего в основе координированного изменения уровня экспрессии факторов патогенности листерий и анализ его зависимости от внешних модулирующих условий представляется весьма актуальным для понимания патогенеза листериозной инфекции и общих принципов взаимодействия паразита и хозяина.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение особенностей экспрессии факторов патогенности Listeria monocytogenes при различных условиях культивирования. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать экспрессию факторов патогенности листерий в условиях их индукции активированным углем и температурой.

2. Получить коллекцию химически - индуцированных мутантиых штаммов с измененным уровнем экспрессии основных факторов патогенности L.monocytogenes.

3. Сравнить экспрессию факторов патогенности у штаммов дикого и мутантного типа L.monocytogenes в различных условиях культивирования. ч

4.Охарактеризовать с помощью электронной микроскопии ультраструктурную организацию штаммов листерий с измененным уровнем экспрессии факторов патогенности.

Научная новизна работы

1. Показано, что при добавлении в среду культивирования L. monocytogenes активированного угля происходит индукция экспрессии основных факторов патогенности.

2. Получена коллекция мутантных штаммов листерий, ги пер продуцирующих лецитиназу.

3. Получен мутантный штамм L.monocytogenes NG602, гиперпродуцирующий все основные факторы патогенности. Присутствие активированного угля не влияет на продукцию NG602 факторов вирулентности.

4. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение мутантного и родительского штаммов показало наличие структурно-• функциональной корреляции между структурной организацией и уровнем продукции фосфолипазы С. Увеличение продукции факторов патогенности коррелирует с появлением в цитоплазме электронно-оптически прозрачных полостей - зон продукции фосфолипазы С.

Практической значимостью работы является селекция штамма - гиперпродуцента основных факторов патогенности листерий, перспективного для получения диагностических препаратов.

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела Медицинской Микробиологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (25 июня 1997 года). Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (1996г., Пермь), на VII съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (1997г., Москва), на школе молодых ученых по молекулярной генетике (1997г., Бирмингем, Англия), на XXXIX симпозиуме гистохимического общества (1997 г., Йена, Германия).

Объем и структура диссертации . Работа выполнена на 124 страницах машинописного текста и иллюстрирована 18 рисунками и 3 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 126 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использован штамм Listeria monocytogenes

NCTC10527, любезно предоставленный Dr.W.Goebel,

Univ. Wurzburg, Germany и его производные, полученные в результате химического мутагенеза.

Микробиологические методы

Бактерии выращивали в течение 18 часов при на жидкой

или агаризованной среде Brain Heart Infusion (BHI) («Difco»); если было необходимо, добавляли активированный уголь (АУ) в концентрации 0,2%. Для исследования лецитиназной активности колоний в агаризованную среду BHI добавляли вытяжку желтка куриного яйца до концентрации 5 % (O'Learg and Weld, 1964). В некоторых экспериментах бактерии выращивали на среде Tryptose Soy Broth (TSB) (Difco) и среде Лури - Бертами (LB). Инкубацию проводили в течение 16-18 часов при 37°С или 42°С на шуттеле.

Лецитиназную активность определяли в культуральной жидкости, полученной после осаждения клеток ночной культуры центрифугированием. Культуральную жидкость титровали в 96-луночном планшете в буфере следующего состава: 20мМ Tris HCl, pH 7,4 - 150 mM NaCl, в качестве субстрата использовали вытяжку желтка куриного яйца. Инкубирование проводили при комнатной температуре в течение 18 часов. Результаты учитывали как последнее разведение, в котором наблюдалось помутнение вследствие преципитации продуктов реакции.

Гемолитическую активность определяли в культуральной жидкости , полученной после осаждения клеток ночной культуры центрифугированием. Культуральную жидкость откручивали в 96 -луночном планшете в физиологическом растворе с 5% - ным

содержанием эритроцитов барана. Результаты учитывали как последнее разведение, в котором наблюдалась агглютинация эритроцитов.

Биохимические методы.

Электрофорез белков в вертикальном геле осуществляли в системе I.aemml i (1970).

Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) и иммуноблотинг осуществляли как описано Маниатис и др. (1984). Иммуноблотинг проводился с моноспецифическими кроличьими антисыворотками к факторам патогенности листерий Lm58 (листернолизину) (Belyi et al.,1993) и фосфатиднлинозитол-специфичной фосфолипазе С (ФС) (Ермолаева и др., 1995), белку клеточной стенки Lm79/39 (Belyi et al., 1992), а также к цитолизину Legionella pneumophila (Belyi et al., 1 988), антисыворотка к которому взаимодействует с гомологичной металлопротеазой листерий. Затем мембрану обрабатывали антикроличьими антителами, меченными пероксидазой хрена (Bio-Rad, США). Реакцию проявляли раствором 4-хлорнафтола и перекиси водорода.

Биологические методы.

Использовали мышей линии Balb /с весом 18-20 грамм. Группы по 5 мышей заражали интраперитонеально 10-кратными разведениями культуры листерий, выращенных в среде BHI и смытых физ.раствором с чашки, дозами от 3 105 до 3 109 бактерий в 200 мкл физ.раствора. Зараженных мышей наблюдали в течение 14

дней. Статистическую обработку проводили по методике Reed L.J. and Muench H. (1938).

Электронно-микроскопическое изучение морфологии дикого и мутантного штамма. Исследование выполнено совместно с сотрудниками лаборатории оптико-физических методов исследования ст.н.с. к.м.н. Диденко Л.В. и ст.н.с. к.м.н. Константиновой Н.Д.

Для трансмиссионной электронно-микроскопической визуализации колонии бактерий фиксировали по методу lto -Kamovsky, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заключали в аралдит М. Для индикации первично-связанных антител использовали козьи антитела, коньюгированные с коллоидным золотом размером 5 нм (Polyscienses Europe GmBIl). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-111, окрашивали 1% уранил-ацетатом на 70% спирте и 10% цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе GEM-1008.

Генетические методы

Проведение мутагенеза ннтрозогуанндином и отбор хнмнчески-индуцированных мутантных штаммов с измененным уровнем экспрессии основных факторов вирулентности.

М-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидин (ИГ) является мощным мутагеном. НГ с высокой частотой индуцирует мутации при таких дозах, при которых жизнеспособность понижается незначительно. В эксперименте использовали 0,1М цитратный буфер, рН 5,5, клетки выращивали до экспоненциальной фазы, дважды промывали в 5 мл

нитратного буфера, суспендировали в 5 мл нитратного буфера и добавляли НГ до конечной концентрации 50 мкг/мл. Затем клетки инкубировали в течение 30 минут в водяной бане при 37°С. Через 30 минут клетки осаждали центрифугированием и промывали один раз в 5 мл фосфатного буфера, рН 7,0; чтобы удалить нитрозогуанидин, после этого клетки переносили в бульон и подращивали в течение ночи. Затем выросшие культуры высевали на чашки с лецитовителлином для отбора мутантных клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ условий культивирования, приводящих к увеличению продукции факторов патогенностн

На первом этапе работы нами было проведено изучение профиля белков культуральной жидкости и клеточной стенки L.monocytogenes, выращенных в жидкой среде BHI при разных температурах. При понижении температуры культивирования до 30°С наблюдалось значительное обеднение спектра белков по сравнению с картиной, наблюдаемой у 37°С - ной культуры. Выявить присутствие факторов патогенностн в реакции иммуноблотинга не удалось, что соответствует результатам, полученным другими группами исследователей. Напротив, при выращивании культуры в течение ночи при 42°С наблюдалось обогащение спектра клеточной стенки белками с молекулярными массами порядка 200, 90, 70, 60, 40 кДа.

Уровень продукции факторов патогенностн при выращивании на искусственных питательных средах зависит также от состава

среды. Так было показано, что при переносе бактерий из богатой среды BHI в минимальную среду наблюдается увеличение уровня транскрипции генов факторов патогенности (Socolovic Z. et al., 1993). Напротив при переносе в среду TSB наблюдается 12-32 кратное уменьшение уровня транскрипции листериолизина О и PI-PLC. Последний эффект был объяснен присутствием в среде TSB диссахарида целлобиозы (Park S.F. and Kroll R.G.,1992). Мы изучили влияние среды культивирования на состав белков клеточной стенки и уровень продукции секретируемых факторов патогенности. Эти эксперименты мы проводили при постоянной температуре 37°С. В белковом профиле клеток, выращенных в TSB, не было замечено отличий по сравнению с культурой, выращенной в Bill. В то же время в присутствии активированного угля в TSB наблюдалось уменьшение лецитиназной активности по сравнению с аналогичным!) условиями роста в BHI.

2. Влияние присутствия активированного угля в среде культивирования на экспрессию факторов патогенности.

Ранее было показано, что при обработке питательной среды хелатором железа Chelex-100, с последующим его удалением, увеличивается продукция листериолизина О (Gaillard et al.,1987). Нами были проведено изучение влияния активированного угля на продукцию основных факторов патогенности. Внесение в среду культивирования активированного угля в концентрации 0,1-0,2% приводило к заметному увеличению продукции всех изученных нами факторов патогенности. Так, лецитиназная активность,

которая к среде DIU не наблюдается, в присутствии АУ была обнаружена вплоть до 16-го разведения культуралыюй жидкости. В реакции иммуноблотинга было отмечено значительное увеличение мембрано-связанной и секретируемой форм листериолизина О. В присутствии активированного угля в культуралыюй жидкости появлялись P1-PLC и металлопротеаза. Кроме того, нами было установлено, что для появления эффекта необходимо присутствие ДУ в среде в процессе культивирования. Таким образом, мы установили, что эффект АУ имеет прннципально иной характер, чем эффект Chelex-100: АУ влияет на экспрессию генов всех факторов патогенностн, в то время как Chelex-100 преимущественно на продукцию листериолизина О, и второе, присутствие Chelex-100 во время инкубации не является необходимым условием для увеличения продукции листериолизина О, т.е. его эффект объясняется устранением компонентов среды (по всей видимости двухвалентных катионов, как предполагается в (Gaillard et al.,1987)), присутствие же АУ необходимо для проявления его эффекта, и, следовательно, эффект АУ не является следствием изменения среды культивирования.

Нами было показано, что присутствие АУ в среде культивирования приводит к значительному изменению спектра белков клеточной стенки к культуральной жидкости. При культивировании в присутствии АУ в спектре белков клеточной стенки наблюдается появление белковых полос с молекулярными массами порядка 90,60,40 и 35 кДа, а в спектре культуральной

жидкости - 60 и 35 кДа. Часть из них была охарактеризована нами в реакции иммуноблотинга, это оказались листериолизин О (58кДа), Р1-РЬС (34кДа), лецитиназа (29кда) и металлопротеаза (57кДа в непроцессированной и 40 кДа в процессированной). Другие белки еще нуждаются в характеристике. Также мы показали, что изменение белкового спектра носит избирательный характер и не связано с общим увеличением продукции белков клеточной стенки. Этот вывод мы основываем на том факте, что белок клеточной стенки Ьт 79/39, экспрессия которого не зависит от факторов патогенности, продуцируется в одинаковом количестве вне зависимости от присутствия или отсутствия АУ.

Мы исследовали эффект АУ в различных условиях. Культивирование листерий при 30°С устраняет эффект от присутствия АУ. Как уже отмечалось выше, в среде Т$В присутствие активированного угля приводит к увеличению продукции факторов патогенности, но лецитиназная активность наблюдается вплоть до 4-ого разведения культуральной жидкости, тогда как в среде ВН1 до16-ого. В данном случае трудно сделать определенное заключение, но, возможно, наблюдается некоторая интерференция между присутствием АУ и составом среды культивирования. В среде в присутствии АУ также наблюдались характерные изменения белкового профиля, в частности, увеличение уровня продукции листериолнзина О. Однако рост на этой среде в присутствии АУ был значительно замедлен. Таким образом, нами был установлен факт, что при росте на

искусственных питательных средах продукция факторов патогенности репрессируется, а присутствие ЛУ устраняет эту репрессию.

3. Химический мутагенез и отбор мндуцнровапных мутаитиых штаммов с измененным уровнем экспрессии основных факторов патогенности.

Для более глубокого исследования механизма регуляции факторов патогенности листерий мы решили получить мутантный штамм с нарушенной системой репрессии. Такой штамм при росте на искусственных питательных средах должен был характеризоваться дерепрессированным синтезом факторов патогенности.

С целью получения штамма, гиперпродуцируюшего факторы патогенности, мы провели мутагенез с помощью питрозогуанидина штамма Ь.топосу1о£,епе$ МСТС 10527 (серогруппа 4Ь). Этот штамм был отобран, т.к. он демонстрировал ярко выраженное увеличение уровня продукции основных факторов патогенности при выращивании в присутствии АУ, а также, поскольку серогруппа 4Ь наиболее часто является возбудителем массовых вспышек листериоза. В результате 8 независимых экспериментов по мутагенезу мы среди 56 тыс. клонов отобрали 124 клона, гиперпродуцпрующих лецитиназу. Колония дикого типа образует размытое пятно помутнения диаметром около 1 мм. Мы отбирали клоны с более четким и /или большим по размеру помутнению (рис.1).

Рис. 1 Лецитиназная активность штамма Listeria monocytogenes NCTC 10527 и его производных, выращенных на среде ВН1, содержащей 5% вытяжку из яичного желтка.

16 клонов с наибольшей лецитиназной активностью на твердых питательных средах (BHI-агар) были выращены в течение ночи в жидкой среде и был определен уровень их лецитиназной активности в реакции in vitro. Только у трех клонов наблюдалась лецитиназная активность в культуральной жидкости (рис.2).

Мы исследовали отобранные 16 мутантных штаммов в ПААГ-электрофорезе. Анализу были подвергнуты культуральная жидкость и белки клеточной стенки. В то время как большинство штаммов продемонстрировали гот же белковый профиль, что и родительский штамм, несколько имели отличия. Особенно резко выделялся штамм, обозначенный NG602. В белковом профиле его культуральной жидкости наблюдались полосы с молекулярными

массам» около 60 и 30-35 кДа, а в профиле клеточной стенки - 90, 60, 40, 35 и 30 кДа, которые отсутствовали в белковом профиле родительского штамма, выращенного в тех же условиях, а именно в

Сравнение лецитипазной активности

ИТ :

п[ о са

с углем ' без угля

штаммы

Рис.2

бульоне ВН1. Зато белковый профиль N0 601 очень напоминал профиль родительского штамма, выращенного в присутствии АУ.

4. Влияние температуры культивировании, компонентов питательной среды и присутствия активированного угля на продукцию факторов патогенностн ипамма N0602.

Мы изучили влияние АУ на полученные мутантные штаммы. У всех штаммов, за исключением N0602, белковый профиль в присутствии АУ менялся и становился схожим с профилем родительского штамма, выращенного в присутствии АУ. Только

N0602 и в присутствии и в отсутствии ЛУ демонстрировал один и тот же белковый профиль, во всех условиях сходный с профилем родительского штамма, выращенного в присутствии АУ. Дальнейшую работу мы проводили со штаммом N0602.

Лецитиназная активность у штамма N0602 наблюдалась до 16-ого разведения культуралыюй жидкости. Присутствие АУ в среде культивирования не увеличивало лецитиназной активности. Интересно, что родительский штамм, выращенный в присутствии АУ, демонстрировал тот же уровень лецитиназной активности. Мы решили оценить уровень продукции других факторов патогенности штаммом N0602 и сравнить его с уровнем родительского штамма, выращенного в присутствии и отсутствии АУ.

В реакции иммуноблотинга мы показали, что уровень продукции штаммом N0602 основных факторов патогенности: листериолизина О, Р1-РЬС и металлопротеазы значительно превышает уровень, демонстрируемый родительским штаммом. Так, например, в культуральной жидкости родительского штамма, выращенного при в среде ВН1, в реакции иммуноблотинга Р1-

РЬС и металлопротеаза не выявляются, а в культуральной жидкости N0602, выращенного в тех же условиях, они присутствуют в заметном количестве. Аналогично, значительно увеличено количество мембрано-связанной и секретируемой форм листериолизина О. Таким образом, нам удалось получить штамм, гнперпродуцирующин факторы патогенности.

94 67

(1)

I -

43 ;

зо : 20,1 -

3 4

•ч ?

I • '

-..-Л ! -' 1 I 1

04 67

43 30 20,1

(2)

12 3 4

С39

(3)

12 3 4

94 £ 67

43 ; 30 , 20,1 •

В

94 67

(1)

1 2

3 4

(2)

12 3 4

94 ■ 67 '

43 30 20,1

94

67

(3)

12 3 4

43 30

20.lL,

(4)

12 3 4

94 67

43 30 20,1

43 30 20,1

1'пс.З Результаты иммуноблопшга белков клеточной стенки и культуральноц жидкости, выделенных из /,ы<-тш пюносучихенеа штаммов КСТС10527 и N0602. Белки выделены из ночной культуры, разделены о 12,5% геле и окрашены Соотаь1е НпПаш Шие или перенесены на ншроцеллюлошую мембрану для иммуноблопшга. Маркеры молекулярные масс показаны слева. Линии 1,3: штамм дикого типа N0 ГС 10527. Линии 2,4: штамм КС602. Линии 1,2: рост при 37('С на среде 11111. Линии 3,4: рост при 37"С па среде Ш11 с добавлением акпшпрованною > тля.

1'пс.А: Белки клеточной степки (1) Белки, окрашенные СВВ. (2) Пробы, обработанные поликлоналышй кроличьей аишсьшоро1кой, специфичной к 1-1.0 (3) Пробы, обработанные иолпклоналыюй кроличьей апшсыворогкой, специфичной к мембранному белку !.рд 79/39. Рнс.В: Пробы культурны юн жидкое! и (!) Белки, окрашенные С11 В. (2) Пробы, обрабокшные поликлональнои кроличьей ангисыворогкой, специфичной к [Д.О. (3) 11робы, обработанные иолпклопалыюй кроличьей аншсывороткой, специфичной к 1Л-Р1.С (4) Пробы, обработанные поликлональнои кроличьей апшсывороткой, специфичной к мегаллопротеазе.

Сравнивая эффект АУ на родительский штамм мы пришли к заключению, что уровень продукции основных факторов патогенности мутантным штаммом NG602 соответствует уровню продукции этих факторов родительским штаммом, выращенном в присутствии АУ. В то же время на NG602 присутствие АУ не оказывает влияния (рис.3).

Наши дальнейшие исследования были посвящены изучению свойств полученного мутантного штамма NG602, гиперпродуцирующего факторы патогенности. Прежде всего мы проверили полученный штамм в API-тесте (Bio-Merieux, France) и убедились, что основные метаболические функции, характерные для родительского штамма сохранились и у мутантного. Аналогично, фаготипирование подтвердило, что данный штамм, так же как и родительский, принадлежит к серогруппе 4Ь. Затем мы определили скорость роста NG602. Она оказалась несколько сниженной по сравнению со скоростью роста родительского штамма (рис.4).

В качестве контроля синтеза белков клеточной стенки, не относящихся к факторам патогенности, мы оценили уровень продукции белка клеточной стенки Lm 79/39 в реакции иммуноблотинга. Его уровень у штамма NG602 не изменялся по сравнению с родительским. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что наблюдаемые изменения в

белковом профиле и уровне продукции факторов вирулентности специфичны именно для экспрессии факторов вирулентности.

Кроме того, так как известно, что гены, контролирующие синтез листериолизина О, Р1-РЬС, металлопротеазы, лецитиназы составляют три различные единицы транскрипции, то можно предположить, что мутация (мутации) затронула общий для них контролирующий механизм.

Кривые роста родительского штамма 1УСТС10527 и мутантного штамма МС602

Д5Т

ЦЩ|(ш(

Рис.4

Гак как вероятность одновременных мутаций в трех единицах транскрипции, приводящих к усилению экспрессии, исключительно мала.

Мы изучили свойства полученного нами мутантного штамма в разных условиях. Оказалось, что при температуре выращивания 30°С хотя уровень продукции факторов патогенности штаммом

18 . ...

N0602 несколько снижается, однако белковый профиль штамма не. изменяется. Снижение уровня продукции может быть объяснено уменьшением скорости роста при этой температуре. В то же время здесь наглядно проявляются отличия N0602 от родительского штамма: при 30°С у родительского штамма присутствие АУ не вызывает характерных изменений белкового профиля. При этой температуре, в отличие от 37°С, белковые профили N0602 и родительского штамма, выращенного в присутствии АУ, резко отличаются. Это говорит, по-видимому, о том, что N0602 конститутивно гиперпродуцирует факторы патогенности.

При 42°С профили родительского штамма и N0602 претерпевают аналогичные изменения. Однако уровень продукции факторов патогенности штаммом N0602 превышает уровень, показываемый родительским штаммом, выращенным без АУ, и приблизительно соответствует уровню родительского штамма, выращенного в присутствии АУ. Изменения белкового профиля при этой температуре, связаны, по-видимому, с изменениями в продукции белков, не связанных с вирулентностью.

Морфологические особенности штамма N0602.

Нашей следующей задачей было определение с помощью электронной микроскопии возможных морфологических изменений у микробных клеток листерий, характеризующихся дерепрессивным синтезом факторов патогенности.

Колонии мутантного штамма N0602 имели типичную морфологичскую картину: при окраске по Граму - мелкие грам-

положительные палочки, в препаратах располагались по одиночке или парами, часто под углом друг к другу в виде цифры V.

Колонии на среде Bill были незначительно меньше в размерах, чем у родительского штамма и рост на средах был медленнее. В то время как скорость роста жидкой культуры была почти одинаковой у обоих штаммов.

Ультраструктурное изучение штамма Listeria monocytogenes NG602, выращенного на среде без активированного угля, показало, что клетки по форме, размерам и толщине клеточной стенки были близки к таковым в культуре дикого типа, выращенного в присутствии угля. Цитоплазма клеток ы куль-уре штамма NG602, также как и у дикого штамма, выращенного в присутствии АУ, имела большую электронную плотность, а также большую толщину клеточной стенки по сравнению с клетками штамма NCTC 10527, выращенного на среде без АУ. При повышении уровня продукции факторов патогенности у штамма NG602 или штамма NCTC 10527 в присутствии АУ увеличивалось количество клеток в центральной части которых включения имели меньшую электронную плотность и большую светлую зону между ними и цитоплазмой. При этом увеличивалось количество клеток, свободных от включений, с прозрачными для электронов зонами. Анализ локализации фосфолипазы С в бактериальных клетках с помощью поликлональных кроличьих антител к фосфолипазе С и козьих антител, коныогированных с коллоидным золотом показал наличие структурно-функциональной корреляции между структурной

организацией и уровнем продукции фосфолипазы С. Увеличение продукции факторов патогенности коррелировало с появлением в цитоплазме электронно-оптически прозрачных полостей - зон продукции фосфолипазы С.

6. Оценка вирулентности штаммов

Для определения вирулентности штаммов листерий мы использовали модель внутрибргошинного заражения мышей. Заражая мышей различными дозами возбудителя, мы определили 1^50. Оказалось, что вирулентность штамма-гиперпродуцента факторов вирулентности практически не отличается от вирулентности родительского штамма. Если для родительского штамма Ь050 составила ю7,2710,4 КОЕ, то для мутантного штамма N0602 ЬБ50 составила Ю7,47±0'4 КОЕ. Таким образом, не смотря на значительное превышение уровня продукции факторов патогенности при выращивании на искусственных питательных средах, вирулентность мутантного штамма не превышает вирулентность родительского. Этому факту может быть дано следующее объяснение: при росте на искусственных питательных средах продукция факторов патогенности репрессируется. В процессе инфекции происходит индукция экспрессии факторов патогенности, уровень которой и определяет вирулентность штамма. У полученного нами мутантного штамма N0602 нарушена эта система репрессии и, следовательно, факторы патогенности экспрессируются конститутивно. Однако этот уровень не превышает максимальный уровень, индуцируемый родительским штаммом в

процессе инфекции, с чем, по-видимому, и связана их одинаковая вирулентность для лабораторных животных.

. Таким образом, полученные в работе результаты, имеют существенное значение для понимания механизма регуляции экспрессии факторов патогенности листерий, в частности, наиболее важным представляется последующий анализ взаимосвязи полученной мутации и утраты способности репрессировать продукцию факторов патогенности листерий на питательной среде и кофактор независимой конформацни PrfA-белка, принадлежащий к Crp-Fur семейству положительных регуляторов транскрипции. Полученный штамм NG602 может быть использован и в практических целях для препаративного выделения основных факторов патогенности листерий и создания на их основе диагностических препаратов. ВЫВОДЫ

1. Показано, что при культивировании L. monocytogenes на искусственных питательных средах экспрессия факторов патогенности может быть индуцирована добавлением в среду культивирования активированного угля.

2. С помощью химически-индуцированного мутагенеза получена коллекция мутаитных штаммов листерий, гипериродуцирующих лецитиназу.

3. Среди полученной коллекции штаммов отобран мутантный штамм, обозначенный NG602, с дерепрессирующим синтезом

• ■

основных факторов патогенности листсрий, независимым от присутствия в среде активированного угля.

4. Показано, что у мутантного штамма NG602, как и у родительского штамма, выращенного в присутствии активированного угля, одновременно с увеличением продукции секретируемых факторов патогенности изменяется профиль белков клеточной стенки. При этом значительно увеличивается количество мембрано-связанной формы листериолизина О, но, в то же время, не меняется уровень продукции белка клеточной стенки Lm 79/39, который не относится к факторам патогенности.

5. При сравнительном электронно-микроскопическом изучении мутантного и родительского штаммов установлено наличие структурно-функциональной корреляции между структурной организацией и уровнем продукции фосфолипазы С. Увеличение продукции факторов патогенности коррелирует с появлением в цитоплазме электронно-оптически прозрачных полостей - зон продукции фосфолипазы С.

Основные положения диссертационной работы отражены в научной статье и тезисах докладов:

1. Варфоломеева Н.А., Ермолаева С.А., Тартаковский И.С.

«Получение и характеристика мутантных штаммов Listeria monocytogenes, гиперпродуцирующих факторы патогенности» // Тезисы Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» -Пермь, 8-11 октября 1996г.