Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1

Игнатьева, Анна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1"

на правах рукописи

Игнатьева Анна Викторовна

ОСОБЕННОСТИ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА, РАСПОЗНАВАЕМЫЕ АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ СОВРЕМЕННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА А ПОДТИПОВ Н5 И Н1

03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

м ОКТ 2012

Москва-2012

005053119

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор, академик

РАМН

Каверин Николай Вениаминович

Официальные оппоненты:

Заведующая лабораторией молекулярной биологии вирусов гриппа ФГБУ «Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» РАМН, д.б.н., Гамбарян Александра Сергеевна

Заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России, д.б.н., профессор, Народицкий Борис Савельевич

Ведущее Учреждение:

ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН

Защита диссертации состоится « 45 -лС/^ТЛЗрЛ 2012 г в J2 часов па заседании Диссертационного Совета Д 208.131.01. при ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Автореферат диссертации разослан «

Л. .» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е. И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одним из наиболее распространенных вирусов, патогенных для человека и животных, является вирус гриппа А. Он способен вызывать эпидемии и пандемии, сопровождающиеся высокой смертностью. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, имеет широкий круг хозяев. Вирус гриппа А быстро эволюционирует. Наиболее вариабельны поверхностные гликопротеины вириона, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), определяющие иммунный ответ. НА является мишенью для вируснейтрализующих антител, которые играют главную роль в защите от инфекции.

В настоящее время известны 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9) вируса гриппа А.

В человеческой популяции к настоящему времени циркулируют вирусы гриппа А, НА которых относятся к двум подтипам: Н1 и НЗ. Другие подтипы НА (Н2, Н4-Н16) в настоящее время не представлены в человеческой популяции. Поэтому люди не обладают иммунной защитой против вирусов подтипов Н4-Н16, а иммунитетом против вируса подтипа Н2 обладают лица старше 44 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Вирус гриппа А, резко отличающийся по антигенной специфичности от вирусов, циркулирующих в человеческой популяции, может рассматриваться как потенциальный источник гена гемагглютинина вирусов будущих пандемий.

В 1918 году появился вирус гриппа А подтипа H1N1, вызвавший опустошительную пандемию, получившую название «испанки» и унесший не менее 40 миллионов жизней. Вирус гриппа подтипа H1N1 циркулировал до 1957 года и сменился вирусом H2N2. С 1957г. по 1968г. циркулировал вирус H2N2, после 1968 г. - H3N2. В 1977 году снова стал циркулировать вирус гриппа А H1N1, но на этот раз вирус H3N2 не исчез, и эти вирусы циркулировали вместе, поочередно преобладая при сезонных эпидемиях и постепенно дрейфуя.

В начале апреля 2009 года поступило сообщение о вспышке гриппа в Мексике, которая была вызвана новым вирусом гриппа A(HlNl)pdm09, генетический состав которого ранее не регистрировали среди вирусов гриппа свиней и людей. Уже 11 июня в связи с устойчивой передачей вируса в нескольких странах мира ВОЗ объявила о 6-ой, самой высокой, фазе пандемии. Пандемический вирус гриппа A(HlNl)pdm09 появился на

фоне сезонной активности эпидемических штаммов и вытеснил их из циркуляции, став доминирующим.

Пандемический вирус возник в результате скрещивания двух вирусов гриппа свиней, классического североамериканского и европейского [Garten et al., 2009]. Новый вирус резко отличается по антигенным свойствам от циркулировавшего в предшествующие годы вируса гриппа А подтипа HI.

Из вирусов гриппа птиц особый интерес представляет вирус подтипа Н5. В 1997 году в Гонконге были отмечены заболевания человека в результате заражения высокопатогенным вирусом гриппа А птиц подтипа H5N1. С 2004 года в Китае, Камбодже, Вьетнаме, Индонезии, Турции, Египте, Нигерии, Пакистане и других странах зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью, вызванные данным вирусом. К настоящему времени суммарное количество подтвержденных случаев заболевания людей вирусом гриппа H5N1 насчитывает 602 человека, из которых 355 погибло. С 2005 года эпизоотии среди птиц, вызванные вирусом H5N1 отмечены в России, Украине и в Центральной Европе. Достоверные случаи передачи вируса от человека к человеку пока не описаны. В связи с отсутствием у людей антител к НА вирусов гриппа А подтипа Н5 и активной циркуляцией их в природе, вирусы этого подтипа обладают потенциалом пандемических агентов. Поэтому детальное исследование антигенных свойств НА подтипа Н5 и, в частности, изучение распределения участков, реагирующих с нейтрализующими антителами, является важной задачей.

После публикации трехмерной структуры НА подтипа Н5 по данным рентгеноструктурного анализа было проведено детальное антигенное картирование молекулы НА подтипа Н5 [Kaverin et al., 2002]. В 2007 году было проведено антигенное картирование трехмерной структуры молекулы НА высоко патогенного штамма вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) [Kaverin et al., 2007]. Данные об особенностях аигигенной структуры НА того варианта вируса H5N1, который вызвал вспышки в Европе и Африке (цинхайского варианта), в научной литературе отсутствовали.

Исследование антигенных эпитопов, распознаваемых нейтрализующими антителами, весьма актуально в связи с продолжающейся эволюцией вирусов гриппа А подтипа H5N1, появлением новых антигенных вариантов, и с возможностью в будущем антигенного дрейфа в случае заноса вируса гриппа А подтипа Н5 в человеческую популяцию с последующей постоянной циркуляцией в ней. Изучение антигенных свойств пандемического вируса 2009 года подтипа H1N1 имеет не меньшую значимость, так как

при циркуляции вирус претерпевает дрейф, который надо учитывать при вакцинопрофилактике.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выявить особенности антигенной структуры НА вируса гриппа А, распознаваемые антителами против современных вариантов вирусов подтипов Н5 и Н1, а также исследовать влияние мутаций, обеспечивающих резистентность к нейтрализующему действию антител, на взаимодействие НА с аналогами клеточных рецепторов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить эскейп-мутанты, резистентные к моноклональным антителам против современных вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н1, и определить их антигенную специфичность в перекрестных реакциях с моноклональными антителами;

2. Провести секвенирование генов НА всех полученных эскейп-мутантов с целью выявления аминокислотных замен в молекуле НА, определяющих их резистентность к моноклональным антителам;

3. Определить локализацию аминокислотных замен, обеспечивающих резистентность к моноклональным антителам, в трехмерной структуре молекулы НА подтипов Н5 и Н1.

4. Провести исследование влияния антигенно значимых аминокислотных замен эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов Н5 и Н1 на сродство к сиалосодержащим синтетическим аналогам природных рецепторов.

Научная новизна и практическое значение работы

В работе представлены результаты антигенного картирования молекулы НА вируса гриппа А подтипов Н5 и Н1, которые отражают ранее не выявленные аспекты антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5, а также характеризуют специфичность моноклональных антител, полученных к современным вариантам вирусов гриппа подтипов Н1 и Н5.

антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5 и об участках молекулы НА, которые определяют вариации антигенной специфичности в процессе эволюции. Полученные данные впервые описывают распределение антигенно значимых участков в трехмерной структуре молекулы НА, распознаваемых моноклонапьными антителами против вируса гриппа А подтипа H5N1 цинхайской группы.

В данной работе также проведено антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, штамм A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl. Были выявлены пять аминокислотных позиций в НА, распознаваемых вируснейтрализующими моноклонапьными антителами против пандемического вируса гриппа 2009 года подтипа H1N1, причем некоторые из них вызывали снижение сродства к сиапосодержащим аналогам клеточных рецепторов. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф пандемического вируса гриппа H1N1.

Работа имеет преимущественно теоретический характер, но полученные данные в будущем должны будут приниматься во внимание при решении практических проблем. В связи с продолжающейся эволюцией высокопатогенных вирусов гриппа А подтипа H5N1 и их выраженной патогенностью для человека, новые данные по картированию молекулы НА вируса гриппа подтипа Н5, а также сведения об участках НА, реагирующих с моноклонапьными антителами против наиболее распространенного цинхайского варианта вируса H5N1, будут важны для оценки характера эволюции высокопатогенного вируса гриппа H5N1. Данные об антигенных эпитопах НА вируса гриппа A(HlNl)pdm09 важны для оценки потенциала антигенного дрейфа в ходе будущей циркуляции новых вариантов вируса гриппа А подтипа HIN 1.

В ходе выполнения работы был впервые получен высокопродуктивный реассортантный штамм, содержащий гены НА и NA отечественного штамма пандемического вируса гриппа 2009 года. Штамм может найти применение для производства инактивированных и субъединичных вакцин (решение о выдаче патента от 03.05.2012, заявка на патент №2011129286/10 от 14.07.2011, Каверин Н.В., Руднева И.А., Тимофеева Т.А., Шилов A.A., Игнатьева A.B. «Реассортант ReM8 - вакцинный штамм вируса гриппа А подтипа H1N1»),

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антигенное картирование молекулы НА вируса гриппа А подтипа Н5 посредством селекции эскейп-мутантов с помощью антител против высокопатогенного вируса гриппа Н5Ы1, выделенного на территории России, позволяет уточнить и дополнить картину антигенной структуры НА подтипа Н5, а также выявляет область в молекуле НА, распознаваемую нейтрализующими антителами против вируса гриппа подтипа Н5Ы1 цинхайского варианта, распространившемуся в странах Европы и Африки.

2. Вируснейтрализующие моноклонапьные антитела к НА вируса АЛЭиск/Моуоз1Ыгзк/56/05 (Н5Ы1) распознают не выявленную ранее область в НА, которая определяет вариации антигенной специфичности в процессе эволюции.

3. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви АЛЭиск/Моуо51Ыг5к/56/05 (П5Ы1), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях НА подтипа Н5, подобных антигенному дрейфу, что указывает на роль выявленных антигенно значимых аминокислотных позиций при эволюции вируса.

4. Впервые проведенное антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, позволило идентифицировать 5 аминокислотных позиций, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами в НА вируса АЛ1У-Мозсо\у/01/09 (НШ1)з\у1. Полученные данные указывают на преимущественную роль ограниченного участка молекулы НА вируса гриппа 2009 года в пределах антигенных сайтов 5а и БЬ в индукции вирус-нейтрализующих антител.

5. Определение сродства НА эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов Н5Ы1 и НШ1 к сиалосодержащим синтетическим аналогам клеточных рецепторов выявило влияние аминокислотных замен в области НА, прилегающей к рецептор-связывающему карману.

6. Для НА подтипа Н1 выявлена корреляция изменений степени сродства к сиало-олигосахаридам с изменениями электростатического заряда при аминокислотных заменах, влияющих на взаимодействие НА с нейтрализующими антителами.

7. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов подтипа Н1 с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференции молодых ученых, Берлин, Германия, 2010 г, 30-й Ежегодной конференции Американского Общества Вирусологов, Миннеаполис, Миннесота, США, 2010 г.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития России 24 мая 2012 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 2 - в материалах международного конгресса и конференции.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана на 166 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, пяти разделов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация содержит 9 схем, 19 таблиц, 6 рисунков и 1 приложение. Список использованной литературы содержит 246 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Вирусы

Вариант вируса A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), адаптированный к мышам (сокращенно A/Mlrd/PA-MA), был получен ранее в лаборатории субвирусных структур [Smimov et al., 2000] ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Вирус A/Mallard/Pennsylvani а/10218/84 (H5N2) близок по антигенной специфичности к вирусу A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), но в отличие от него полностью авирулентен для птиц. Использованы также вирусы A/Ruddy Turnstone/244/91 (H5N2) (сокращенно A/RT/244/91), A/Duck/Primorie/2633/01 (H5N3) и рекомбинантный вирус A/VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1), содержащий гены НА и NA вирулентного вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) и остальные 6 генов вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (предоставлен доктором Р. Донисом, CDC, Атланта, США). Ген НА этого вируса модифицирован сайт-специфическим мутагенезом путем удаления полиосновного участка в

области сайта нарезания, после чего вирус перестал быть вирулентным для кур и хорьков, что позволяет его использовать для работы в обычных условиях.

Для получения высокопродуктивного штамма-реассортанта, содержащего гены НА и NA пандемического вируса 2009 года, были использованы штамм A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl, изолированный ранее в ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России, и высокопродуктивный реассортант Х-31 (H3N2), содержащий 6 генов внутренних и неструктурных белков вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), вариант Mount Sinai.

Вирусы A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl и X-31 (H3N2), были получены из Государственной коллекции штаммов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. В работе были также использованы вирусы: A/WSN/33 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), вариант Mount Sinai, A/FM/1/47 (H1N1), A/USSR/90/77 (H1N1), X-53A (H1N1) (реассортант вируса A/New Jersey/I 1/76 и A/Puerto Rico/8/34, имеющий гены НА и NA вируса A/New Jersey/11/76), A/Swine/Wisconsin/1/67 (H1N1), A/Turkey/Kansas/4880/80 (H1N1), A/Brisbane/59/07 (HIN1), полученные из Государственной коллекции штаммов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России.

Вирус накапливали в 10-дневных куриных эмбрионах. Зараженные куриные эмбрионы инкубировали в течение 48 часов при 37°С, после чего охлаждали в течение ночи при 4°С и собирали вируссодержащую аллантоисную жидкость.

Антитела

Для получения эскейп-мутантов были использованы монокпональные антитела (МКАТ) 3G9, 6F3, 4F11, 5F12, 6Е2 и 5G9 против НА вируса гриппа A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), выделенного в Новосибирской области в 2005 г, и МКАТ против НА вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl 1Е7, 3D9, 5F7, 6АЗ, ЗАЗ, 10G2, любезно предоставленные проф. А.А Кущ (лаборатория клеточной инженерии, ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России).

Использовали также МКАТ: ср46, ср55, ср58, ср79 против НА вируса A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2); 176/26, 364/1, 777/1 против НА вируса A/Chicken/PennsyIvania/8125/83 (H5N2); VN02, VN08, VN09, VN010, VN013, VN015, VN016 против НА вируса A/VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1). МКАТ были любезно предоставлены доктором Р.Г. Вебстером (Детская клиника Сент-Джуд, Мемфис, США) в виде асцитной жидкости мышей.

Для селекции реассортантов подтипа H1N1 использовали поликлональную сыворотку морской свинки против вируса Х-31 (H3N2).

Селекция эскейп-мутантов

Получение эскейп-мутантов вируса гриппа А проводили по методике Webster, Laver [Webster et al., 1980] с некоторыми модификациями. Аллантоисную жидкость, разведенную до концентрации инфекционного вируса 2х107 ЭИД50/МЛ, смешивали с МКАТ и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Смесью заражали 10-ти дневные куриные эмбрионы, с последующей инкубацией при 37°С в течении 48 часов. Отбирали варианты, устойчивые к данному МКАТ и проводили 5-6-ти кратное клонирование в куриных эмбрионах методом предельных разведений с целью получения однородной вирусной популяции.

Очистка и концентрация вирусов

Вируссодержащую аллантоисную жидкость после осветления центрифугированием на малой скорости (3000 об/мин, 15мин, 4 °С) наслаивали на 4 мл 20% сахарозы в буферном растворе (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl pH 7,2) и осаждали центрифугированием в роторе SW-27 при 22000 об/мин в течение 90 мин при 4°С. Вирус ресуспендировали в гомогенизаторе Даунса в том же буферном растворе в 1/64 исходного объема, снова осветляли центрифугированием на малой скорости (3500 об/мин, 8 мин, 4°С). Очищенный и сконцентрированный вирус титровали в РГА и хранили при -80°С.

Определение рецептор-связывающей активности очищенного вируса гриппа А

Рецептор-связывающая активность очищенного вируса гриппа А была определена методом ингибирования РГА с помощью сиало-олигосахаридов (1000-2000 кОа). Метод основан на ингибировании гемагглютинации за счет связывания гемагглютинина вируса с сиало-олигосахаридом [Matrosovich et all, 1990].

Для определения рецептор-связывающей активности вируса гриппа А были использованы следующие сиало-олигосахариды, предоставленные Л. В. Мочаповой (НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова, Россия), синтезированные в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, зав. лаб., Бовин Н.В:

Neu5Aca2-3Gal|ll-4GlcP-PAA (3'SL),

Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAcp-PAA (3'SLN),

Neu5Acot2-3 Gaip 1 -3 GlcNAc-PAA

(SiaLec),

Neu5Aca2-3Gaipi -3(Fucal -4)GlcNA-PAA (SiaLe3),

Neu5Aca2-3Gaip 1 -4(Fucal -3)GlcNAc -PAA (SiaLex),

Neu5Aca2-3 Gaip 1 -4(6-0-su)GlcN AcP-PAA (6-su-3' SLN),

Neu5Aca2-6Gaipi-4Glcp-PAA

(6'SL),

Neu5Aca2-6Gaipi-4GlcNAcp-PAA

(6'SLN),

Neu5Aca2-6Gaipi-4(6-0-su)GlcN AcP-PAA (6-su-6'SLN),

где Neu5Aca - N-5-ацетилнейраминовая кислота, Gal - галактоза, GlcNAc - N-ацетилглюкозамин, Fue - L- фукоза, PAA - полиакрштамидный носитель. Сиалогликокнъюгаты SiaLe" и SiaLe3 имеют фукозный заместитель в третьем звене и отличаются друг от друга типом связи между галактозой и последующим звеном (1-3) или (1-4). Олигосахаридная группировка присоединена к полиакриламидному полимеру.

В 96-луночных планшетах к последовательным двукратным разведениям сиало-олигосахаридов добавляли равные объемы аллантоисного вируса, разведенного до 46 ГАЕ в буферном растворе (0,15 М NaCl, 0,01 М Tris-HCl, рН 7,2) с добавлением 4мкМ ингибитора NA (2,3-дидегидро-2,4-дидезокси-4-амино-Г<-ацетил-0-нейраминовая кислота, Sigma, США) и инкубировали в течении 30 мин при 4°С, после чего добавляли такой же объем 0,5% суспензии куриных эритроцитов и инкубировали 4050 мин при 4°С. Реакцию оценивали по последнему разведению сиалогликоконъюгата, тормозящему агглютинацию эритроцитов, и сродство вируса к сиало-олигосахаридам выражали в мкМ сиаловой кислоты в этом разведении.

Твердофазный иммуноферментный анализ проводили в модификации Philpott et al. [1989] с некоторыми изменениями. В 96 луночный планшет сорбировали по 100 ГАЕ очищенного вируса при 4°С в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7.4 (NaCl 0,18 М, КС1 0,003 М, Na2HP04 0,01 М, КН2Р04 0,015 М) в течение 18 часов. Планшеты 3 раза отмывали ФСБ с 0,05% Твин-20, вносили БСА в концентрации 2,0% и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С для блокировки свободных участков поверхности лунок. Затем вносили смесь МКАТ в ФСБ с 1% БСА, инкубировали 2 ч при 37°С, промывали 3 раза ФСБ с 0,05% Твин-20 и инкубировали 1 час при 37°С с антимышиным козьим иммуноглобулином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Sigma Chemical Со, США) в рабочем разведении 1:2000 (ФСБ, 1% БСА). Для проявления реакции лунки промывали

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФНФА)

4 раза ФСБ с 0,05% Твин-20 и вносили по 100 мкл индикаторной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) («МДЛ», Россия). Реакцию останавливали 2М H2SO4 и определяли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Процент связывания МКАТ с вирусами рассчитывали по формуле A=100x(Bxv/Bpv)/(Bxw/Bpw), где А - процент связывания по отношению к вирусу дикого типа (100%), Bxv - связывание МКАТ с эскейп-мутантом, Bpv - связывание смеси МАКТ с эскейп-мутантом, Bxw - связывание МКАТ с вирусом дикого типа и Bpw - связывание смеси МКАТ с вирусом дикого типа.

Автоматическое секвенирование

Секвенирование было проведено д.б.н. A.A. Шиловым на базе лаборатории молекулярной генетики (зав. лаб. Прилипов Алексей Геннадьевич) ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Вирусная РНК была выделена из аллантоисной жидкости с помощью специального набора RNeasy minikit (QIAGEN). С полученными образцами была проведена ПЦР с обратной транскрипцией со специфическими праймерами к сегменту гена гемагглютинина. Образцы для секвенирования содержали 0,01-0,03 мкг ПЦР-продукта и 3,2 пкмоль специфического праймера. Каждый ПЦР-фрагмент прочитывался с помощью прямого (fovard) и обратного праймеров (revers), использовавшихся для ПЦР. Секвенирование осуществляли с использованием автоматического секвенатора DNA ABI Prism 3130 (Applied Boisysteras, Inc. [РЕ/ABI], Foster City, CA) и BigDye Terminator v3.1 kit.

Статистическая обработка результатов экспериментов

Статистическая обработка проводилась с использованием среднего квадратического отклонения и коэффициента Стьюдента.

Построение трехмерной модели НА

Построение трехмерной модели гемагглютинина проводилось с помощью программы PyMol 0.99с и данных о трехмерной структуре НА подтипа Н5 из Protein Data Bank (pdb файл 1JSM) и структуре НА подтипа Hl (pdb файл 3LZG, 3UBN).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Локализация и структура антигенных эпитонов, распознаваемых МКАТ к НА вируса гриппа подтипа H5N1

Для выявления антигенных эпитопов, распознаваемых МКАТ к

A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), необходимо было провести селекцию мутантов,

устойчивых к нейтрализующему действию того или другого МКАТ, охарактеризовать их в перекрестных реакциях с МКАТ и секвенировать мутантные гены НА. Но, прежде всего, необходимо было выбрать вирус, подходящий для получения набора эскейп-мутантов. Таким вирусом мог бы быть вирус A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), к которому были получены МКАТ, или какой-либо другой вирус подтипа Н5, реагирующий с данной панелью МКАТ. Использование вируса A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) в качестве вируса дикого типа для получения эскейп-мутантов было затруднено высокой патогенностью этого вируса, допускавшей работу только в специально оборудованных помещениях. Однако, это не было главным мотивом при выборе дикого типа. Важнее было получить возможность адекватного сопоставления данных картирования, полученных в ходе настоящей работы, с полученными ранее результатами определения локализации антигенных эпитопов в НА подтипа Н5 [Kaverin et al., 2002]. В работах, выполненных ранее в лаборатории физиологии вирусов, было проведено антигенное картирование молекулы НА адаптированного к мышам варианта вируса A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) (штамм A/Mlrd/PA-MA) [Kaverin et al., 2002] и НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) [Kaverin et al., 2007]. Данные РТГА разных вирусов подтипа Н5 с МКАТ к вирусу A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) показали, что вирус A/Mlrd/PA-MA реагирует со всей панелью МКАТ и может быть использован в качестве вируса дикого типа для селекции эскейп-мутантов.

1.1. Селекция эскейп-мутантов и их антигенная характеристика в перекрестной

РТГА с МКАТ

Для получения эскейп-мутантов, резистентных в отношении МКАТ к вирусу A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) был использован в качестве вируса дикого типа штамм A/Mlrd/PA-MA (H5N2). С помощью МКАТ 6F3, 4F11, 5F12, 6Е2, 5G9 были селекционированы четырнадцать мутантов. Каждым из МКАТ 6F3, 4F11, 5F12, 6Е2 было отобрано по два мутанта, и по три мутанта были селекционированы МКАТ 5G9 и 3G9. Полученные эскейп-мутанты были обозначены по тем МКАТ, которые были использованы для их селекции. Результаты перекрестной РТГА продемонстрировали особенности специфичности МКАТ, полученных к вирусу A/Duck/Novosibirsk/56/05 (табл. 1). Мутанты m4Fll(l) и m4Fll(4), отобранные с помощью МКАТ 4F11, были резистентны только к этому МКАТ.

Полученные данные позволили предполагать, что антигенные эпитопы, распознаваемые МКАТ 5F12, 6Е2 и МКАТ 6F3, 5G9, 3G9 частично перекрываются, причем МКАТ 5G9 и 3G9 распознают весьма обширный эпитоп.

Таблица 1. Перекрестная РТГА селекционированных эскейп-мутантов подтипа Н5 с МКАТ к A/Duck/Novosibirs k/56/05 (H5N1).

Вирусы MKAT

3G9 6F3 4F11 5F12 6E2 5G9

A/MIrd/PA-MA 1600 6400 51200 6400 6400 12800

m3G9(l) <200 3200 102400 400 400 200

m3G9(2) <200 <200 102400 <200 <200 200

m3G9(3) <200 6400 25600 400 400 400

m6F3(ll) 200 <200 102400 3200 3200 800

m6F3(15) <200 <200 102400 400 400 400

m4Fll(l) 6400 6400 <200 1600 1600 12800

m4Fll(4) 3200 3200 <200 3200 6400 12800

m5F12(5) 200 3200 102400 <200 <200 <200

m5F12(7) 200 3200 102400 <200 400 <200

m6E2(9) <200 3200 102400 <200 <200 <200

m6E2(10) <200 3200 102400 400 400 <200

m5G9(l) <200 <200 102400 <200 <200 <200

m5G9(4) <200 400 102400 <200 <200 <200

m5G9(5) <200 <200 102400 <200 <200 <200

1.2. Секвенировапие НА селекционированных эскейп-мутантов

Для выявления аминокислот, вовлеченных во взаимодействие с МКАТ к вирусу A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) и характеристики полученных эскейп-мутантов, было проведено секвенирование генов НА исходного вируса A/MIrd/PA-MA (H5N2) и эскейп-мутантов. Секвенировапие показало, что полученные эскейп-мутанты несут одну, две или три аминокислотные замены в составе субъединицы НА1, причем у некоторых мутантов присутствуют и замены в субъединице НА2 (табл. 2).

Аминокислотные замены у мутантов, резистентных к МКАТ 4F11, были расположены в позициях 145 и 143, то есть в области, соответствующей сайту А молекулы НА подтипа НЗ. Мутации у эскейп-мутантов, устойчивых к МКАТ 6F3, 5F12, 6Е2, 5G9, 3G9, сгруппированы в районе, соответствующем сайту В молекулы НА подтипа НЗ.

Два эскейп-мутанта, отобранные с помощью МКАТ 6F3, различались по аминокислотным заменам. Мутант m6F3(l 1) имеет одну замену S128Р, а мутант m6F3(15) имеет три замены, две из которых S128P, P185S соответствуют сайту В подтипа НЗ, а третья - K222N, расположена вблизи сайта D подтипа НЗ.

С помощью МКАТ 5F12 были отобраны два эскейп-мутанта, из которых m5F12(5) имеет замену I124L в субъединице НА1 и замену R76G в субъединице НА2, а m5F12(7) имеет замены R166G и М230Т в субъединице НА1, из которых антигенную значимость, вероятнее всего, имеет замена R166G, так как относится к антигенному сайту В подтипа НЗ. Данные перекрестной РТГА выявили различия между мутантами m5F12(5) и m5F12(7) (табл. 1). Поскольку эти МКАТ распознают разные эпитопы в сайте В, можно полагать, что антигенные различия между мутантами обусловлены разной локализацией аминокислотных замен в НА1.

С помощью МКАТ 3G9 были селекционированы три эскейп-мутанта, два из которых m3G9(l) и m3G9(3), имеют аминокислотную замену в позиции 166, а у эскейп-мутанта m3G9(2) были выявлены замены в НА1 субъединице Q122K и в НА2 субъединице L124F. Разная локализация аминокислотных замен в НА1 у этих мутантов позволяет объяснить антигенные различия между ними в перекрестной РТГА (табл. 1).

Проведенное секвенирование показало, что эпитопы, распознаваемые моноклональными антителами 3G9, 5F12, 6Е2 и 5G9, частично перекрываются. Аминокислотные замены в НА2 у мутантов m3G9(2), m4Fll(l), m5F12(5) и m5G9(4) не оказывали влияния на взаимодействие мутантов с МКАТ в РТГА (табл. 1).

Таблица 2. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутангов вируса A/MIrd/PA-MA (H5N2).

МКАТ к A/Duck/Novosibirsk 56/05 (H5N1) Эскейп-мутанты Замены в НА (нумерация НЗ) Замены в НА (нумерация 115)

3G9 m3G9(l) m3G9(2) m3G9(3) R166W Q122K, L124F(HA2) R166K R162W Q115К, L124F(HA2) R162K

6F3 m6F3(ll) m6F3(15) S128P S128P, P185S, K222N S123P S123P, P181S, K218I*

4F11 m4Fll(l) m4Fll(4) G143D, А198Т(НА2) S145P G139D, А198Т(НА2] S141P

5F12 m5F12(5) m5F12(7) I124L, R76G(HA2) R166G, М230Т I117L, R76G(HA2) R162G, М226Т

6Е2 m6E2(9) ш6Е2(10) K120I S126F Kl 131 S121F

5G9 m5G9(l) m5G9(4) m5G9(5) S125(a)I S126Y, Т156А(НА2) P125S S120I S121Y, Т156А(НА2) P118S

1.3. Картирование антигенных сайтов в трехмерной структуре НА нодтипа

Н5

Аминокислотные замены всех полученных эскейп-мутантов были нанесены на трехмерную структуру гемагглютинина подтипа Н5 [На et al., 2001] (рис. 1). Мутации, придающие вирусу резистентность к МКАТ 4F11, расположены в латеральной, выдающейся над поверхностью молекулы петле большой субъединицы НА1, сформированной аминокислотными остатками 140-145, что соответствует антигенному сайту А у подтипа НЗ. Мутации остальных эскейп-мутантов, отобранных с помощью МКАТ 3G9, 6F3, 5F12, 6Е2, 5G9, сгруппированы в разных областях полипептидной цепи (позиции 120, 122, 124-128, 166, 185), которые, однако, в трехмерной структуре НА сближены (рис. 1). Эти замены образуют достаточно протяженную область в сайте, аналогичном сайту В в молекуле НА подтипа НЗ.

У мутантов, селекционированных МКАТ 6F3, аминокислотные замены в позициях 128 и 185 расположены в сайте В, а позиция 222 находится на краю рецептор-связывающего кармане вблизи сайта D. Аминокислотный остаток в позиции 185 лишь в малой степени экспонирован на поверхности молекулы и поэтому его взаимодействовие с МКАТ маловероятно.

На рис.1 желтым цветом показаны замены, полученные ранее с помощью панели МКАТ против A/Chicken/Pennsylvania/1370/83 (H5N2), A/Chicken/Pennsylvania/8125/83 (H5N2), A/Turkey/Ontario/7732/66 (H5N9) [Kaverin et al., 2002]. На трехмерной структуре видно, что новые замены в сайте, аналогичном сайту В, расположены в другой области этого сайта.

Таким образом, аминокислотные позиции, распознаваемые МКАТ к НА штамма цинхайской ветви подтипа H5N1, локализованы преимущественно в участках молекулы НА, входящих в антигенные сайты, аналогичные сайтам А и В подтипа НЗ или примыкающих к ним. Однако выявленные нами антигенно значимые аминокислотные позиции в НА отличаются от выявленных ранее и существенно расширяют данные об антигенных эпитопах в молекуле НА подтипа Н5.

Рис. 1. Антигенные сайты гемагглютинина подтипа Н5 по суммарным данным об аминокислотных заменах в НА (вид с вершины глобулы).

Обозначения:

Синим цветом обозначены позиции замен, выявленных у эскейп-мутантов в данной работе. Розовым цветом обозначена позиция замены, совпадающая с ранее выявленной. Желтым цветом обозначены позиции замен, выявленных ранее. Цифрами обозначены позиции аминокислотных замен в нумерации НЗ.

2. Антигенное картирование молекулы НА пандемического вируса (Н11М1) 2009 года

2.1. Селекция и антигенная характеристика эскейп-мутантов

Для селекции эскейп-мутантов в качестве вируса дикого типа был выбран реассортант ЯеМ8, содержащий гены НА и ЫА вируса А/1ГУ-Мозсо\у/01/09 (НШ1)зш1 и обладающий большей урожайностью, чем вирус А/ПУ-Мозсо\¥/01/09 (НШ1)б\у1. Для получения реассортантов была использована методика Шульмана и Палези, с некоторыми модификациями [Яш^пеуа е! а1., 1993].

С помощью МКАТ к вирусу А/11У-Мозсо\у/01/09 (Н11Ч1)з\¥1 были получены 18 мутантов вируса ЫеМ8. По пять эскейп-мутантов были селекционированы с помощью МКАТ 309 и 1002, и по два мутанта с МКАТ 1Е7, ЗАЗ, 6АЗ, 5Р7 (табл. 4). Все эскейп-мутанты были протестированы в перекрестной РТГА (табл. 4) с панелью моноклональных антител, полученной против А/1ГУ-Мозсо\¥/01/09 (Н1Ы1)з\у1.

По данным перекрестной РТГА моноклональные антитела можно разделить на две группы по распознаваемым ими эпитопам: К первой группе принадлежат МКАТ 1Е7, ЗС9,

6АЗ, ЗАЗ, 5Г7, а ко второй - МКАТ 1СЮ2. Эскейп-мутанты, селекционированные МКАТ 1002, в перекрестной РТГА не реагируют только с тем МКАТ, с помощью которого были получены Эскейп-мутанты, отобранные МКАТ 1Е7, 309 и ЗАЗ, не реагировали с этими МКАТ, а также с МКАТ 6АЗ, тогда как мутанты, отобранные МКАТ 5Р7 и 6АЗ резистентны как к МКАТ 5Б7 и 6АЗ, так и к МКАТ 1Е7 и 309. Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКАТ 1Е7, ЗЭ9, ЗАЗ, 6АЗ и 5Р7, либо полностью, либо частично, перекрываются.

Таблица 4. РТГА эскейп-мутантов первого поколения с МКАТ к вирусу А/ІІУ-Мо5со«701/09 (НШ1)$\у1.

Вирусы МКАТ к A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl

1E7 3D9 5F7 6A3 3A3 10G2

ReM8 102400 102400 51200 102400 102400 51200

mlE7(3) <200 <200 25600 <200 <200 12800

mlE7(4) <200 <200 51200 <200 <200 51200

m3D9(9) 200 <200 51200 <200 <200 51200

m3D9(l) 200 <200 102400 <200 <200 51200

m3D9(4) 200 <200 102400 <200 <200 25600

ra3D9(5) 200 <200 51200 <200 <200 25600

m3D9(12) <200 <200 12800 <200 <200 12800

m3A3(3) 400 400 51200 400 400 25600

m3A3(5) 200 400 102400 200 200 51200

m5F7(10) 3200 400 400 400 25600 25600

m5F7(ll) 3200 400 400 400 25600 12800

m6A3(l) 3200 1600 400 400 51200 25600

m6A3(5) 3200 1600 800 400 51200 25600

mlOG2(2) 25600 12800 12800 12800 25600 <200

mlOG2(4) 51200 25600 25600 12800 51200 <200

mlOG2(6) 25600 12800 25600 51200 25600 <200

mlOG2(7) 51200 12800 25600 51200 25600 <200

mlOG2(12) 409600 102400 51200 204800 102400 <200

2.2. Секвеиированне НА эскейп-мутантов первого поколения

Для выявления аминокислот, вовлеченных во взаимодействие с МКАТ к А/ІІУ-Мо5со\у/01/09 (НШ1)з\у1 и характеристики полученных эскейп-мутантов, было проведено секвенирование генов НА исходного вируса 11еМ8 и селекционированных эскейп-мутантов. Секвенирование показало, что полученные эскейп-мутанты несут одну, две или три аминокислотные замены в составе субъединицы НА1.

Для антигенной структуры НА подтипа HI традиционно принята иная номенклатура антигенных сайтов, чем у подтипа НЗ. Антигенные сайты Sa и Sb в НА подипа HI [Catón et al., 1980] соответствуют разным участкам сайта В подтипа НЗ.

Аминокислотные замены в позициях 156, 158, 159 у мутантов (табл. 6), резистентных к МКАТ 5F7, 6АЗ, ЗАЗ, 1Е7, 3D9, относятся к антигенному сайту Sa подтипа HI, который соответствует части антигенного сайта В подтипа НЗ. Причем МКАТ 1Е7, 6АЗ, 3D9 распознают в РТГА позиции 156, 158, 159 (табл. 4), тогда как МКАТ ЗАЗ распознает позиции 156, 159, и только одну аминокислотную позицию 158 распознает МКАТ 5F7. Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКАТ 5F7, 6АЗ, 1Е7, 3D9, имеют разную степень протяженности и частично перекрываются, что подтверждает данные перекрестной РТГА.

Эскейп-мутант m3D9(12) имеет две аминокислотные замены, одна из которых K163N относится к антигенному сайту Sa в молекуле НА подтипа HI, а другая - Q192L относится к антигенному сайту Sb подтипа HI. Аминокислотная замена лизина на аспарагин в позиции 163 дает появление потенциального сайта гликозилирования. По данным РТГА невозможно точно определить какая из этих замен влияет на антигенность, а также утверждать, что МКАТ 3D9 перекрывает два антигенных сайта, как это было описано ранее для подтипа Н5 [Kaverin et al. 2007].

Под действием МКАТ 10G2, было отобрано пять одиночных эскейп-мутантов, три из которых имели одиночную замену в позиции 190, относящуюся к антигенному сайту Sb в молекуле НА подтипа HI. Мутант ml0G2(7) помимо той же замены D190N имел дополнительную замену S210N, а мутант ml0G2(12) имел другую замену в позиции 190, D190E, а также дополнительные замены G228E и К285М (табл. 6). Позиции 210,228 и 285 находятся вне антигенных сайтов молекулы НА подтипа HI, и как показывают данные перекрестной РТГА, не влияют на антигенность (табл. 4).

2.3. Селекция, антигенная характеристика и секвенирование эскейп-мутантов второго поколениия

Для расширения данных об антигенных эпитопах и аминокислотных заменах в молекуле НА подтипа HI, вовлеченных во взаимодействие с нейтрализующими МКАТ к вирусу A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl, пять мутантов первого поколения, m3D9(9), m5F7(10), m3A3(3), т6АЗ(5) и mlOG2(12), были использованы для селекции 11 эскейп-мутантов второго поколения.

Секвенирование генов НА мутантов второго поколения выявило новые аминокислотные замены в молекуле НА. Селекционированные с помощью МКАТ 5F7

эскейп-муганты второго m3A3(3)-5F7(28) и m3D9(9)-5F7(17) имели новые аминокислотные замены в позиции 129 (N129S и N129D соответственно). Таким образом, МКАТ 5F7 способно отбирать эскейп-мутанты с заменами не только в позиции 158, но и в позиции 129. Позиция 129 относится к сайту Sa в молекуле НА подтипа HI.

Мутанты первого и второго поколения были охарактеризованы в перекрестной ТФИФА со всей панелью МКАТ. В целом результаты перекрестной РТГА и ТФИФА совпадают. Лишь некоторые эскейп-мутанты, не реагируя в РТГА, сохраняли способность связывать МКАТ. Данные РТГА, ТФИФА и секвенирования позволяют выявить аминокислотные остатки, распознаваемые каждым МКАТ. МКАТ 1Е7, 6АЗ, 3D9 распознают в РТГА позиции 156, 158, 159,атакже 163 или 192 (табл. 5), тогда как МКАТ ЗАЗ распознает позиции 156, 159, 163 или 192, и МКАТ 5F7 - только позиции 158 и 129. Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКАТ 5F7, 6АЗ, 1Е7, 3D9, разной степени протяженности и частично перекрываются.

Таблица 5. Аминокислотные позиции, распознаваемые МКАТ к A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl.

МКАТ Аминокислотные позиции

3D9 156 158 159 (163 или 192)

5F7 129 158

6АЗ 156 158 159 (163 или 192)

ЗАЗ 156 159 (163 или 192)

1Е7 156 158 159 (163 или 192)

10G2 190

Позиции аминокислотных замен, селекционируемых определенным МКАТ обозначены полужирным курсивом. В скобках обозначены позиции, для выбора между которыми в отношении их антигенной значимости нет достаточных данных.

2.4. Локализация аминокислотных позиций, распознаваемых МКАТ к вирусу А(Н1Ш)рі1т09, в трехмерной структуре НА

Аминокислотные замены всех полученных эскейп-мутантов были нанесены на трехмерную структуру гемагглютинина подтипа НШ1, сделанную по данным рентгеноструктурного анализа вируса А/Са1ІГогпіа/04/09 НШ1 (рсіЬ файл - 3^) [Хи еі аі., 2010] (рис. 2).

Аминокислотные замены у мутантов, резистентных к МКАТ 5Р7, 6АЗ, ЗАЗ, 1Е7, расположены в верхушке глобулы субъединицы НА1 и относятся к антигенному сайту Ба подтипа Н1, что соответствует антигенному сайту В подтипа НЗ. У мутантов, резистентных к МКАТ 309, аминокислотные замены расположены в позициях 156, 163, что относится к антигенному сайту Ба подтипа Н1, и в позиции 192, которая расположена в антигеном сайте ЭЬ подтипа Н1. Не исключено, что МКАТ 309 способно перекрывать два антигенных сайта. Стоит также отметить появление в позиции 163 потенциального сайта гликозилирования, который может экранировать антигенные детерминанты.

МКАТ 1СЮ2 селекционирует эскейп-мутанты с аминокислотными заменами в позиции 190, которая расположена в а-спиральном участке верхушки глобулы молекулы НА и соответствует антигенному сайту вЬ подтипа Н1. У мутантов ш 1002(7) и т 1002( 12) помимо замены в позиции 190 присутствуют и дополнительные замены в позициях 210, 228, 285, которые находятся вне антигенных сайтов и не влияют антигенность. Позиции 190, 192 и 228 находятся непосредственно на краю рецептор-связывающего кармана, что может влиять на рецепторную специфичность эскейп-мутантов по отношению к вирусу дикого типа. Таким образом, выявленные аминокислотные замены в молекуле НА подтипа Н1 сформированы выступающими аминокислотными остатками на вершине глобулы НА в области, соответствующей сайту В подтипа НЗ, и могут прямо распознаваться иммунной системой.

Рис. 2. Антигенные сайты гемагглютинина подтипа Н1 по данным анализа эскейп-мутантов вируса А/ПУ-Мо8со\у/01/09 (НШ1)в\у1.

Примечание. Цветом обозначены антигенные сайты подтипа Н1. Аминокислотные позиции обозначены в нумерации НЗ. Аминокислотная позиции 2 ] 0 не показана на рисунке, так как не видна при данной проекции молекулы Н1.

Таблица 6. Аминокислотные замены в НА у эскейп-мутантов, селекционированных МКАТ против вируса Л/1 IV-Moscow/01/09 (HlNl)swl.

МКАТ Эскейп-мутанты Аминокислотные замены в нумерации НЗ Аминокислотные замены в нумерации 111

3D9 m3D9(l), m3D9(4), m3D9(5), m3D9(9), m3D9(12) К156Е K163N; Q192L К153Е K160N; Q189L

5F7 m5F7(10), m5F7(ll) G158E G155E

6АЗ m6A3(l), m6A3(5) G158E G155E

ЗАЗ m3A3(3), m3A3(5) N159D N156D

1Е7 mlE7(3), mlE7(4) N159D N156D

10G2 mlOG2(2), mlOG2(4), mlOG2(6) ralOG2(7) mlOG2(12) D190N D190N; S210N D190E; G228E; К285М D187N D187N;S207N D187E; G225E; К283М

3D9,5F7 m3D9(9)-5F7(14) K1S6E; G158E К153Е; G155E

m3D9(9)-5F7(17) К156Е; N129D К153Е; N125D

5F7, ЗАЗ m5F7(10)-3A3(l), m5F7-3A3(4) G1S8E; N159D G155E; N156D

5F7,10G2 m5F7(10)-10G2 G158E; D190N G155E; D187N

ЗАЗ, 5F7 m3A3(3)-5F7(28) N159D; N129S N156D; N125S

m3A3(3)-5F7(29) N159D; G158E N156D; G1S5E

ЗАЗ, 10G2 m3A3(3>10G2 N1S9D; D190N N1S6D; D187N

6 A3,10G2 m6A3(3)-10G2(3), m6A3(3)-10G2(4) G1S8E; D190E G155E; D187E

10G2, 6A3 ml0G2(12)-6A3(10) N159D; D190E; G228E; К285М N156D; DI87E; G225E; К283М

3. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов вирусов гриппа А подтипов 111 и Н5 с сиало-олнгосахаридами

У полученных эскейп-мутантов подтипов Н1 и Н5 были выявлены замены, расположенные в рецептор-связывающем кармане в позициях 185 и 222 (у Н5), 190, 192, 228 (у Н1), которые могут приводить к изменению рецепторной специфичности. Поэтому было уместным исследовать взаимодействие эскейп-мутантов с различными сиалосодержащими аналогами клеточных рецепторов.

3.1. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов подтипа 115

В таблице 7 приведены данные ингибирования гемагглютинации сиало-олигосахаридами с вирусом дикого типа A/Mlrd/PA-MA (H5N2) и эскейп-мугантами, где представлены цифры, которые соответствуют последнему разведению сиало-олигосахарида, тормозящему агглютинацию эритроцитов. Сродство вируса к сиало-олигосахаридам выражали в мкМ сиаловой кислоты (чем больше цифра, тем слабее связывание). Вирус дикого типа A/Mlrd/PA-MA (H5N2) показал приблизительно одинаково хорошее сродство к 3'SL, 3'SLN, 6-su-3'SLN, SiaLe0, и фактическое отсутствие взаимодействия с фукозилированными сиало-олигосахаридами SiaLe" и SiaLe" (табл. 7).

У эскейп-муганта m6F3(15) с заменами S128P, P185S, K222N наблюдалось изменение рецепторной специфичности, а именно увеличение сродства с SiaLe" и SiaLe", почти отсутствующего у вируса дикого типа. Так как мутант m6F3(ll) с заменой S128P не взаимодействовал с SiaLe" и SiaLe", а позиция 185 не находится на поверхности молекулы НА, то скорее всего за данное изменение рецепторной специфичности у мутанта m6F3(15) ответственна замена K222N, которая находится на краю рецептор-связывающего кармана и меняет электростатический заряд. Остальные аминокислотные замены, влияющие на взаимодействие с МКАТ, не оказывали у эскейп-мутантов вируса подтипа Н5 выраженного влияния на сродство к сиаловым рецепторам.

Таблица 7. Рецептор-связываюшая активность вируса дикого типа и его эскейп мутантов подтипа Н5 с сиало-олигосахаридами.

Вирусы Замены в НА (нумерация НЗ) Сиало-олигосахариды, мкМ сиаловой к-ты

З'вЬ З'БЫЧ б-зи-З'вШ 81а1ех вшЬе* вЫе'

А/М1г(1/РА-МА - 0,063 0,031 0,031 4 4 0,031

шЗС9(1) Я166'\¥ 0,063 0,125 0,125 4 4 0,063

шЗС9(2) 0122К 1124Р(НА2) 0,031 0,031 0,031 4 4 0,031

ш309(3) Я166К 0,031 0,031 0,031 4 >4 0,063

ш6ЕЗ(11) Б128Р 0,031 0,063 0,031 4 4 0,031

ш6ГЗ(15) Б128Р Р185Б К222К 0,063 0,125 0,063 0,063 0,125 0,063

ш4Г11(Х) 01430 А198Т(НА2) 0,125 0,063 0,063 4 >4 0,125

ш4П1(4) Б145Р 0,063 0,031 0,031 4 >4 0,063

т5П2(5) 1124Ь Я76С(НА2) 0,063 0,063 0,031 4 >4 0,063

т5Р12(7) 111660 М230Т 0,031 0,031 0,031 4 4 0,031

тбЕ2(9) К1201 0,063 0,031 0,063 4 4 0,063

т6Е2(10) Б126Р 0,063 0,031 0,031 4 >4 0,063

ш5С9(1) Б 125(а)1 0,063 0,031 0,063 1 4 0,031

ш5С9(4) 8126У Т156А(НА2) 0,125 0,031 0,063 1 4 0,063

т5С9(5) Р125Б 0,125 0,063 0,063 1 >4 0,063

3.2. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов подтипа Н1

Для определения рецепторной специфичности с синтезированными высокомолекулярными сиало-олигосахаридами (1000-2000к0а) были выбраны 6 эскейп-мутантов первого поколения и 8 эскейп-мутантов второго поколения с разными аминокислотными заменами в молекуле НА. В таблице 8 приведены данные ингибирования гемагглютинации сиало-олигосахаридами с вирусом дикого типа ЯеМ8 и эскейп-мугантами. Реакция ингибирования гемагглютинации сиало-олигосахаридами выявила, что вирус дикого типа КеМ8 обладает сродством к фукозилированным а-(2,3)-51аЬе" и 81аЬе" и к а-(2,6)- б-зи-б'ЗЬЫ сиалозидам, причем наиболее выражено сродство к 51аЬе\ У эскейп-мутантов первого и второго поколения с заменой К156Е наблюдается снижение сродства к 51аЬе" и 51аЬе", что коррелирует с появлением отрицательно заряженного аминокислотного остатка 156Е. Еще более существенно снижается сродство

к SiaLe* и SiaLe" у мутантов mlOG2(12), ml0G2(12)-6A3(10), что также коррелирует с появлением отрицательного заряда в позициях 190Е, 228Е и 159D.

Замены G158E и N159D у мутантов m5F7(10) и m3A3(3) расположены в трехмерной структуре НА вне рецептор-связывающего кармана, но появление отрицательного заряда в позициях 158 и 159 у мутантов вызывало уменьшение взаимодействия с SiaLe", SiaLe3 и резко ослабляло связывание с 6-su-6'SLN.

У мутанта mlOG2(6) с заменой D190N отмечается увеличение сродства к 3'SL, б-su-3'SLN и небольшое улучшение связывания с SiaLe", SiaLe" и 6-su-6'SLN по сравнению с диким типом. Появление у мутантов второго поколения m3A3(3)-10G2 и m5F7(10)-10G2 замены D190N восстанавливает сродство к 6-su-6'SLN, в то время как мутанты первого поколения тЗАЗ(З) и m5F7(10) не связываются с данным сиало-олигосахаридом. Так как позиция 190 находится в а-спиральном участке на краю рецептор-связывающего кармана, то аминокислотные замены, приводящие к уменьшению отрицательного заряда 190N, оказывают сильное влияние на связывание с сульфатированным б'-сиалиллактозамином.

Таким образом, снижение электростатического заряда в результате аминокислотных замен у эскейп-мутантов вируса H1N1, в отличие от вируса H5N1, ослабляло сродство к аналогам клеточных рецепторов.

4. Поиск аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов, среди циркулирующих изолятов H5N1 и II1N1

Для того чтобы узнать насколько вовлечены полученные при селекции эскейп-мутантов замены в НА1 в антигенный дрейф вирусов гриппа А был осуществлен скриниг аминокислотных последовательностей НА в Генбанке для штаммов, выделенных в разные годы.

4.1. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейн-мутантов подтипа HI, среди изолятов пандемического вируса подтипа H1N1

С помощью данных Генбанка было просмотрено 9019 аминокислотных последовательностей НА штаммов вирусов гриппа А подтипа H1N1, выделенных с 2009 по 2011 год (табл. 9). Только 163 штамма содержали те же аминокислотные замены, что были обнаружены у эскейп-мутантов, селекционированных МКАТ к вирусу A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl. Наиболее часто встречалась аминокислотная замена N129D, особенно в 2010-2011 годах, тогда как остальные замены быстро исчезли при циркуляции вирусов H1N1.

Таблица 8. Рецептор-связывающая активность вируса дикого типа подтипа Н1 и его эскейп-мутантов с сиало-олигосахаридами.

Вирусы Замены в НА (нумерация НЗ) Сиало-олигосахариды, мк.М сиаловой к-ты

3'SL 3'SLN 6-su-3'SLN Siale" SiaLe* Siale' 6'SL 6'SLN 6-su-6'SLN

ReM8 - 4 4 2 0,25 0,063 2 >4 >4 0,25

m3D9(9) К156Е 4 4 4 0,5 0,5 4 >4 >4 >4

m3D9(12) K.163N Q192L 4 4 4 0,5 0,125 4 >4 >4 4

m5F7(10) G158E 4 >4 4 0,5 0,25 >4 >4 >4 >4

m3A3(3) N159D 4 4 4 0,5 0,125 2 >4 >4 >4

mlOG2(6) D190N 0,5 4 0,5 0,125 0,031 1 4 >4 0,063

mlOG2(12) D190E G228E К285М 4 4 4 2 1 4 >4 >4 0,125

m3D9(9)-5F7(14) К.156Е G158E >4 >4 >4 1 0,5 4 >4 >4 >4

m3D9(9)-5F7(17) К156Е N129D 4 >4 >4 1 0,5 4 >4 >4 >4

m5F7(10)-10G2 G158E D190N 2 >4 4 0,25 0,125 >4 >4 >4 0,125

m3A3(3)-5F7(28) N159D N129S 4 4 4 0,5 0,25 4 >4 >4 >4

m3A3(3)-5F7(29) N159D G158E 4 4 4 0,5 0,5 4 >4 >4 >4

m3A3(3)-10G2 N159D D190N 2 >4 2 0,25 0,125 4 >4 >4 0,125

m6A3(5)-10G2(3) G158E D190E 4 4 1 0,063 0,063 2 >4 >4 1

ml0G2(12)-6A3(10) N159D D190E G228E К285М 4 4 2 2 1 4 >4 >4 >4

Таблица 9. Аминокислотные замены в НА у штаммов вируса гриппа А подтипа НШ1, выделенных в 2009-2011гг., идентичные тем, которые были обнаружены у эскейп-мутантов.

Год

Аминокислотные _

замены 2009 2010 2011

N129D 6 78 30

N129S 1 0 4

К156Е 11 3 1

G158E 15 1 1

N159D 3 1 3

D190N 5 0 0

4.2. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н5 среди изолятов подтипа H5N1, выделенных от птиц

У вируса гриппа А птиц подтипа Н5, в отличие от большинства вирусов гриппа птиц, отмечалось подобие антигенного дрейфа, что связывают с вакцинацией кур, проводившейся в некоторых странах Азии и Африки [Abdel-Moneim et al., 2011]. Поэтому представляет интерес наличие мутаций, обеспечивающих устойчивость к нейтрализующим антителам, у изолятов H5N1. С помощью данных Генбанка было просмотрено 3585 аминокислотных последовательностей НА штаммов вирусов гриппа А птиц подтипа H5N1, выделенных с 2003 по 2011 год (табл. 10).

Стоит отметить, что наиболее часто встречались замены по четырем аминокислотным позициям 128, 145, 166 и 185, в гораздо меньшем количестве встречались замены в позициях 122, 125, 126. Возможно, это обусловлено как преимущественной ролью антител, распознающих эти четыре позиции (128, 145, 166 и 185), в резистентности вакцинированных птиц к вирусу, так и негативным влиянием других замен на жизнеспособность вируса.

В работе были охарактеризованы антигенные участки гемагглютинина двух разных подтипов вируса гриппа А птиц H5N1 и человека H1N1. Полученные данные по характеристике эпитопов вируса гриппа птиц H5N1 позволяют уточнить и дополнить картину антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н5, а также выявляют в молекуле

гемагглютинина вируса H5N1 цинхайской ветви ту область, которая ответственна за индукцию вируснейтрализующих антител, и указывают на существенные изменения иммунодоминантной области гемагглютинина, распознаваемой антителами, в ходе эволюции вирусов подтипа Н5 при циркуляции в природе. Антигенное картирование гемагглютинина пандемического вируса гриппа А 2009 года, позволило идентифицировать аминокислотные позиции, распознаваемые вируснейтрализующими моноклональными антителами против штамма A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl, причем 4 аминокислотные замены вызывали снижение сродства к аналогам клеточных рецепторов. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мугантов с заменами в гемагглютинине подтипа HI природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Выводы

1. Впервые охарактеризованы антигенные эпитопы молекулы гемагглютинина вируса гриппа А, распознаваемые моноклональными антителами против высокопатогенного вируса подтипа H5N1, выделенного на территории России. Полученные результаты позволяют уточнить и дополнить картину антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н5, а также выявляют область в молекуле гемагглютинина, распознаваемую нейтрализующими антителами против вируса гриппа подтипа H5N1 цинхайского варианта, распространившемуся в странах Европы и Африки.

2. Аминокислотные замены в гемагглютинине эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях гемагглютинина у природных изолятов вирусов гриппа подтипа H5N1.

3. Селекция и характеристика 27 эскейп-мутантов позволила идентифицировать 5 аминокислотных позиций в гемагглютинине штамма A/IIV-Moscow/01/09 (HlNl)swl (129, 156, 158, 159, 190), распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами против пандемического вируса A(HlNl)pdm09.

4. Выявлено влияние антигенно значимых аминокислотных замен на сродство гемагглютинина эскейп-мутантов к сиалосодержащим аналогам клеточных рецепторов.

5. Для гемагглютинина подтипа HI выявлена корреляция изменений степени сродства к сиапогликополимерам с изменениями электростатического заряда в области гемагглютинина, прилегающей к рецептор-связывающему карману.

Аминокислотные замены в позициях 156, 158 и 159 у эскейп-мутантов вируса A(HlNl)pdm09, идентифицированные как ответственные за резистентность к моноклональным антителам, вызывали снижение сродства к аналогам клеточных рецепторов.

6. Аминокислотные замены, обнаруженные у эскейп-мутантов, встречаются среди штаммов вирусов гриппа A(HlNl)pdm09, выделенных с 2009 по 2011 год, крайне редко и не удерживаются в циркуляции, за исключением замены в позиции 129. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в гемагглютинине природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Rudneva I.A., Kushch А.А., Masalova O.V., Timofeeva T.A., Klimova R.R., Shilov A.A., Ignatieva A.V., Krylov P.S., Kaverin N.V. Antigenic epitopes in the hemagglutinin of Qinghai-type influenza H5N1 virus.// Viral Immunology. - 2010. - V. 23. - №2. - P. 181 -187.

2. Игнатьева A.B., Руднева И.А., Тимофеева T.A., Шилов А.А., Забережный А.Д., Алипер Т. И., Каверин Н.В., Львов Д.К. Высокопродуктивный вирус-реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу пандемического вируса гриппа A/Moscow/01/2009 (H1N1).// Вопросы вирусологии. - 2010. - Т. 56. - №4. - С. 9-14.

3. Timofeeva Т.А., Ignatieva A.V., Rudneva I.A., Shilov A.A., Kaverin N.V. Yields of virus reassortants containing the HA gene of pandemic influenza 2009 virus.// Acta Virologica. - 2012. - V. 56. - №2. - P. 149-151.

4. Rudneva I, Ignatieva A, Timofeeva T, Shilov A, Kushch A, Masalova O, Klimova R, Bovin N, Mochalova L, Kaverin N. Escape mutants of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus: Variations in antigenic specificity and receptor affinity of the hemagglutinin.// Virus Research. - 2012. - V. 166. - P. 61-67.

5. Kaverin N.V., Rudneva 1.А., Timofeeva T.A., Shilov A.A., Ignatieva A.V., Kushch A.A., Masalova O.V., Klimova R.R. Escape mutants of influenza A (H1N1) virus of the 2009 pandemic: variations in the antigenic specificity and receptor affinity of the hemagglutinin.// American Society for Virology, 30th Annual Meeting, Minneapolis, Minnesota -16-20 July 2011. - W3-5.

6. Ignatieva A.V. Reassortment procedure by crossing different Influenza A viruses.// Free University of Berlin. Young scientist workshop "Methods to study influenza virus". - 2023 September2011.-P. 21-22.

Благодарности.

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю доктору медицинских наук, профессору, академику РАМН, заведующему лабораторией физиологии вирусов Каверину Николаю Вениаминовичу за предоставление возможности проводить данные исследования, определение целей, всестороннюю помощь и внимание к проводимой работе. Искренне благодарю ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Рудневу Ирину Александровну за всестороннюю поддержку, понимание и терпение, всемерную помощь и непосредственное участие в работе. Благодарю ведущего научного сотрудника Шилова Александра Александровича и заведующего лабораторией молекулярной генетики Прилипова Алексея Геннадьевича за помощь в проведении секвенирования. Благодарю старшего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Тимофееву Татьяну Анатольевну, ведущего научного сотрудника лаборатории физиологии вирусов Варич Наталью Львовну и остальных сотрудников лаборатории физиологии вирусов за помощь и поддержку в ходе проведения научной работы. Благодарю заведующую лабораторией клеточной инженерии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития Кущ Аллу Александровну за предоставление монокпональных антител для выполнения работы. Выражаю глубокую признательность за консультации и помощь в освоении методик определения сродства гемагглютинина вируса гриппа А к сиапосодержащим рецепторным аналогам, а также предоставление реактивов, ведущего научного сотрудника НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова, Мочаловой Ларисе Витальевне, заведующему лабораторией углеводов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, доктору химических наук Бовину Николаю Владимировичу, а также заведующей лабораторией поисковых исследований НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов Гамбарян Александре Сергеевне.

Подписано в печать:

12.07.2012

Заказ № 7467 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Игнатьева, Анна Викторовна

Список сокращений.

Введение.

Актуальность темы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна и практическое значение работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

Часть 1. Обзор литературы.

Глава 1. Общая характеристика вируса гриппа А.

Глава 2. Характеристика генома вируса гриппа А.

2.1. РНК-сегменты 1,2,3.

2.2. РНК-сегмент 4.

2.3. РНК-сегмент 5.

2.4. РНК-сегмент 6.

2.5. РНК-сегмент 7.

2.6. РНК-сегмент 8.

Глава 3. Антигенная структура молекулы гемагглютинина (НА) вируса гриппа А

Глава 4. Антигенная вариабельность вируса гриппа А в природе.

4.1. Механизм антигенного дрейфа.

4.2. Реассортация как механизм антигенного шифта.

Глава 5. Влияние структурных изменений НА вируса гриппа А на его функциональные свойства.

Глава 6. Вирусы гриппа А подтипа Н5И1, вызывающие эпизоотию у птиц и спорадические случаи заболевания человека.

Часть 2 Собственные исследования.

Глава 1. Материалы и методы.

1.1 Вирусы.

1.2 Антитела.

1.3 Титрование инфекционности вирусов на куриных эмбрионах.

1.4 Реакция гемагглютинации (РГА).

1.5 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

1.6 Селекция эскейп-мутантов

1.7 Получение реассортантов методом скрещивания и селекции.

1.8 Очистка и концентрация вирусов.

1.9 Определение рецептор-связывающей активности вируса гриппа А.

1.10 Элюция вируса с куриных эритроцитов.

1.11 Иммунизация животных.

1.12 Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)

1.13 Количественное определение вирусных белков.

1.14 Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА).

1.15 Автоматическое секвенирование.

1.16. Статистическая обработка результатов.

1.17. Построение трехмерной модели НА.

Глава 2. Результаты.

2.1. Локализация и структура антигенных эпитопов НА, распознаваемых моноклональными антителами (МКАТ) к вирусу гриппа A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1).

2.1.1. РТГА со штаммами вируса гриппа подтипа Н5.

2.1.2. Предварительная характеристика панели МКАТ в перекрестной РТГА с ранее полученными эскейп-мутантами.

2.1.3. Селекция эскейп-мутантов МКАТ против вируса A/Duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) и их антигенная характеристика в перекрестной РТГА с МКАТ.

2.1.4. Характеристика эскейп-мутантов по данным РТГА с МКАТ против вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1).

2.1.5. Секвенирование НА селекционированных эскейп-мутантов.

2.1.6. Картирование антигенных сайтов в трехмерной структуре НА подтипа Н5.

2.2. Получение реассортантов, содержащих НА пандемического вируса гриппа (H1N1) 2009 года.

2.2.1. Получение и генотипирование реассортантов.

2.2.2. Определение уровня репродукции реассортантов и вирусов-родителей в куриных эмбрионах.

2.3. Антигенные эпитопы, распознаваемые МКАТ к НА пандемического вируса гриппа (H1N1) 2009 года.

2.3.1. Реакция МКАТ против вируса 2009 года с разными штаммами вируса гриппа подтипа HI.

2.3.2. Селекция и антигенная характеристика эскейп-мутантов.

2.3.3. Секвенирование НА эскейп-мутантов первого поколения.

2.3.4. Селекция и антигенная характеристика эскейп-мутантов второго поколения

2.3.5. Секвенирование НА эскейп-мутантов второго поколения.

2.3.6. Антигенная характеристика эскейп-мутантов первого и второго поколения подтипа Н1Ш посредством ТФИФА.

2.3.7. Локализация аминокислотных позиций, распознаваемых МКАТ к пандемическому вирусу 2009 г., в трехмерной структуре НА.

2.4 Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов вирусов гриппа А подтипов Н1 и Н5 с сиало-олигосахаридами.

2.4.1. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутанов подтипа Н5.

2.4.2. Определение рецептор-связывающей активности эскейп-мутантов подтипа Н1.

2.4.3. Элюция вируса дикого типа и мутантов с куриных эритроцитов.

2.5. Поиск аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов, среди циркулирующих изолятов Н5М1 иНШ1.

2.5.1. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н1, среди изолятов пандемического вируса подтипа Н1Ш.

2.5.2. Присутствие аминокислотных замен, выявленных у эскейп-мутантов подтипа Н5 среди изолятов подтипа ГОШ, выделенных от птиц.

Часть 3. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1"

Актуальность темы

В настоящее время известны 16 антигенных подтипов НА (HI-HI6) и 9 подтипов NA (N1-N9) вируса гриппа А.

В человеческой популяции к настоящему времени циркулируют вирусы гриппа А, НА которых относятся к двум подтипам: HI и НЗ. Другие подтипы НА (Н2, Н4-Н16) в настоящее время не представлены в человеческой популяции. Поэтому люди не обладают иммунной защитой против вирусов подтипов Н4-Н16, а иммунитетом против вируса подтипа Н2 обладают лица старше 44 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Вирус гриппа А, резко отличающийся по антигенной специфичности от вирусов, циркулирующих в человеческой популяции, может рассматриваться как потенциальный источник гена гемагглютинина вирусов будущих пандемий. [227].

В 1918 году появился вирус гриппа А подтипа H1N1, вызвавший опустошительную пандемию, получившую название «испанки» и унесший не менее 40 миллионов жизней. Вирус гриппа подтипа H1N1 циркулировал до 1957 года и сменился вирусом H2N2. С 1957г. по 1968г. циркулировал вирус H2N2, после 1968 г. - H3N2. В 1977 году снова стал циркулировать вирус гриппа A H1N1, но на этот раз вирус H3N2 не исчез, и эти вирусы циркулировали вместе, поочередно преобладая при сезонных эпидемиях и постепенно дрейфуя.

В начале апреля 2009 года поступило сообщение о вспышке гриппа в Мексике, которая была вызвана новым вирусом гриппа А(НШ1)рс1т09, генетический состав которого ранее не регистрировали среди вирусов гриппа свиней и людей [61,71]. Уже 11 июня в связи с устойчивой передачей вируса в нескольких странах мира ВОЗ объявила о 6-ой, самой высокой, фазе пандемии [71]. Пандемический вирус гриппа А (НШ1)рс1т09 появился на фоне сезонной активности эпидемических штаммов и вытеснил их из циркуляции, став доминирующим.

Пандемический вирус возник в результате скрещивания двух вирусов гриппа свиней, классического североамериканского и европейского [80, 120, 160, 198]. Новый вирус резко отличается по антигенным свойствам от циркулировавшего в предшествующие годы вируса гриппа А подтипа Н1.

Из вирусов гриппа птиц особый интерес представляет вирус подтипа Н5. В 1997 году в Гонконге были отмечены заболевания человека в результате заражения высокопатогенным вирусом гриппа А птиц подтипа Н5№. С 2004 года в Китае, Камбодже, Вьетнаме, Индонезии, Турции, Египте, Нигерии, Пакистане и других странах зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью, вызванные данным вирусом. К настоящему времени суммарное количество подтвержденных случаев заболевания людей вирусом гриппа Н5Ы1 насчитывает 602 человека, из которых 355 погибли. С 2005 года эпизоотии среди птиц, вызванные вирусом Н5Ш отмечены в России, Украине и в Центральной Европе. Достоверные случаи передачи вируса от человека к человеку пока не описаны. В связи с отсутствием у людей антител к НА вирусов гриппа А подтипа Н5 и активной циркуляцией их в природе, вирусы этого подтипа обладают потенциалом пандемических агентов. Поэтому детальное исследование антигенных свойств НА подтипа Н5 и, в частности, изучение распределения участков, реагирующих с нейтрализующими антителами, является важной задачей.

После публикации трехмерной структуры НА подтипа Н5 по данным рентгеноструктурного анализа [89], было проведено детальное антигенное картирование молекулы НА подтипа Н5 [110]. В 2007 году было проведено антигенное картирование трехмерной структуры молекулы НА высоко патогенного штамма вируса АЛ^еШатЛ203/04 (Н5Ы1) [108]. Данные об особенностях антигенной структуры НА того варианта вируса Н51чГ1, который вызвал вспышки в Европе и Африке (цинхайского варианта), в научной литературе отсутствовали.

Исследование антигенных эпитопов, распознаваемых нейтрализующими антителами, весьма актуально в связи с продолжающейся эволюцией вирусов гриппа А подтипа Н51Ч1, появлением новых антигенных вариантов, и с возможностью в будущем антигенного дрейфа в случае заноса вируса гриппа А подтипа Н5 в человеческую популяцию с последующей постоянной циркуляцией в ней. Изучение антигенных свойств пандемического вируса 2009 года подтипа НШ1 имеет не меньшую значимость, так как при циркуляции вирус претерпевает дрейф, который надо учитывать при вакцинопрофилактике.

Цель и задачи исследования

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить эскейп-мутанты, резистентные к моноклональным антителам против современных вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н1 и определить их антигенную специфичность в перекрестных реакциях с моноклональными антителами;

Научная новизна и практическое значение работы

Антигенное картирование посредством селекции и характеристики эскейп-мутантов с использованием моноклональных антител против распространенного в странах Африки и Европы цинхайского варианта высокопатогенного вируса подтипа Н5Ы1 до настоящего времени не было проведено. Данная работа расширяет представление об особенностях антигенной структуры молекулы НА подтипа Н5 и об участках молекулы НА, которые определяют вариации антигенной специфичности в процессе эволюции. Полученные данные впервые описывают распределение антигенно значимых участков в трехмерной структуре молекулы НА, распознаваемых моноклональными антителами против вируса гриппа А подтипа Н5ТЧ1 цинхайской группы.

В данной работе также проведено антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, штамм А/ПУ-Мо8сош/01/09 (НШ1)зш1. Были выявлены пять аминокислотных позиций в НА, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами против пандемического вируса гриппа 2009 года подтипа НШ1, причем некоторые из них вызывали снижение сродства к сиалосодержащим аналогам клеточных рецепторов. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в НА природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф пандемического вируса гриппа НШ1.

12 высокопатогенных вирусов гриппа А подтипа H5N1 и их выраженной патогенностью для человека, новые данные по картированию молекулы НА вируса гриппа подтипа Н5, а также сведения об участках НА, реагирующих с моноклональными антителами против наиболее распространенного цинхайского варианта вируса H5N1, будут важны для оценки характера эволюции высокопатогенного вируса гриппа H5N1. Данные об антигенных эпитопах НА вируса гриппа A(HlNl)pdm09 важны для оценки потенциала антигенного дрейфа в ходе будущей циркуляции новых вариантов вируса гриппа А подтипа H1N1.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Вируснейтрализующие моноклональные антитела к НА вируса АЛ1)искЛчГоуо8Ш1г8кУ56/05 (Н5Ш) распознают не выявленную ранее область в НА, которая определяет вариации антигенной специфичности в процессе эволюции.

3. Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви А/Оиск/]Моуо51Ыгзк/56/()5 (Н5Ш), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях НА подтипа Н5, подобных антигенному дрейфу, что указывает на роль выявленных антигенно значимых аминокислотных позиций при эволюции вируса.

4. Впервые проведенное антигенное картирование НА пандемического вируса гриппа А 2009 года, позволило идентифицировать 5 аминокислотных позиций, распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами в НА вируса А/ПУ-Мо8сош/01/09 (НШ1)з\у1. Полученные данные указывают на преимущественную роль ограниченного участка молекулы НА вируса гриппа 2009 года в пределах антигенных сайтов 8а и 8Ь в индукции вирус-нейтрализующих антител.

5. Определение сродства НА эскейп-мутантов вируса гриппа А подтипов Н5Ы1 и Н1Ш к сиалосодержащим синтетическим аналогам клеточных рецепторов выявило влияние аминокислотных замен в области НА, прилегающей к рецептор-связывающему карману.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Игнатьева, Анна Викторовна

Выводы

1. Впервые охарактеризованы антигенные эпитопы молекулы гемагглютинина вируса гриппа А, распознаваемые моноклональными антителами против высокопатогенного вируса подтипа Н51Ч1, выделенного на территории России. Полученные результаты позволяют уточнить и дополнить картину антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н5, а также выявляют область в молекуле гемагглютинина, распознаваемую нейтрализующими антителами против вируса гриппа подтипа Н5Ш цинхайского варианта, распространившегося в странах Европы и Африки.

2. Аминокислотные замены в гемагглютинине эскейп-мутантов, резистентных к моноклональным антителам против вируса цинхайской ветви АЛЭиск/Моуоз1Ыг8к/56/05 (Н5Ш), частично совпадают с аминокислотными заменами, выявленными при антигенных вариациях гемагглютинина у природных изолятов вирусов гриппа подтипа Н51\П.

3. Селекция и характеристика 27 эскейп-мутантов позволила идентифицировать 5 аминокислотных позиций в гемагглютинине штамма А/ПУ-Мо8со\у/01/09 (НШ1^1 (129, 156, 158, 159, 190), распознаваемых вируснейтрализующими моноклональными антителами против пандемического вируса А(Н1Ы1)рёш09.

5. Для гемагглютинина подтипа Н1 выявлена корреляция изменений степени сродства к сиалогликополимерам с изменениями электростатического заряда в области гемагглютинина, прилегающей к рецептор-связывающему карману. Аминокислотные замены в позициях 156, 158 и 159 у эскейп-мутантов вируса А(НШ1)рёш09, идентифицированные как ответственные за резистентность к моноклональным антителам, вызывали снижение сродства к аналогам клеточных рецепторов.

6. Аминокислотные замены, обнаруженные у эскейп-мутантов, встречаются среди штаммов вирусов гриппа А(Н1Ш)рс1т09, выделенных с 2009 по 2011 год, крайне редко и не удерживаются в циркуляции, за исключением замены в позиции 129. Сопоставление аминокислотных замен у эскейп-мутантов с заменами в гемагглютинине природных изолятов указывает на роль ослабления сродства к клеточным рецепторам как на фактор, ограничивающий антигенный дрейф.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Игнатьева, Анна Викторовна, Москва

1. Бессмертный B.C., Ткачева М.Н. Статистические методы в эпидемиологии // Гос. Издат. Мед. Лит. 1961. - 228 с.

2. Бэйли Н. Математика в биологии и в медицине // Москва. Мир. 1970. - 326 с.

3. Гамбарян A.C., Ямникова С.С., Львов Д.К., Робертсон Д.С., Вебстер Р.Г., Матросович М.Н. Сравнение рецепторной специфичности вирусов гриппа А, выделенных от уток, кур и человека // Молекулная биология. -2002. Т. 36. - С. 542-549.

4. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Оскеро Т.А., Колобухина Л.В., Слепушкин А.Н. Изменчивость и особенности распространения вируса гриппа А (H1N1) в период 1990-1998гг // Вопросы вирусологии. 2000. - Т. 5. - №3. -С. 18-22.

5. Кендал А.П., Кокс Н., Накаяма С., Накаяма К., Раймонд Л. Анализ антигенной структуры гемагглютинина вируса гриппа А/СССР/90/77 // Вопросы вирусологии. 1984. - Т. 29. - №3. - С. 282-286.

6. Львов Д. К. Грипп А: эпидемию можно предупредить // Животноводство России. 2005. - №9. - С. 6-8.

7. Патент RU №2412244 «Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl для разработки средств и методов биологической защиты» авторов Львова Д.К. и др.

8. Соколов Б.П., Руднева И.А. Изучение изменчивости белков вируса гриппа А // Вопросы вирусологии. 1981. - Т. 4. - С. 471-477.

9. Смирнов Ю.А., Липатов A.C., Окуно И., Гительман А.К. Общий антигенный эпитоп в гемагглютинине вирусов гриппа А (HI, Н2, Н5, Н6) // Вопросы вирусологии. 1999. - Т. 44. - С. 111-115.

10. Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии // Москва. Медгиз. 1964. - С.379.

11. Abdel-Moneim A.S., Afifi M.A., El-Kady M.F. Genetic drift evolution under vaccination pressure among H5N1 Egyptian isolates // Virology Journal. 2011. -V. 8.-P. 283-291.

12. Austin F.J., Kawaoka Y., Webster R.G. Molecular analysis of the hemagglutinin gene of an avian H1N1 influenza virus // Journal of General Virology. 1990. -V. 71. - P. 2471-2474.

13. Austin F.J., Webster R.G. Antigenic mapping of an avian HI influenza virus hemagglutinin and interrelationships of HI viruses from humans, pigs and birds // Journal of General Virology. 1986. - V. 67. - P. 983-992.

14. Baigent S.J., McCauley J.W. Glycosylation of hemagglutinin and stalk-lenght of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture // Virus Research. 2001. - V. 79. - P. 177-185.

15. Both G.W., Sleigh M.J. Conservation and variation in the hemagglutinins of Hong Kong subtype influenza viruses during antigenic drift // Journal of Virology. 1981. - V. 39. - P. 663-672.

16. Bouloy M. Plotch S.J., Krug R.M. Globin mRNAs are primers for the transcription of influenza viral RNA in vitro // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1978. - V. 75. - P. 48864890.

17. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

18. Brown C.C., Olander H.J., Senne D.A. A pathogenesis study of highly pathogenic avian influenza virus H5N2 in chickens, using immunohistochemistry // Journal of Comparative Pathology. 1992. - V. 107. -P. 341-348.

19. Capua I., Alexander D.J. Avian influenza and human health // Acta Tropica. -2002.-V. 83.-P. 1-6.

20. Castrucci M.R., Kawaoka Y. Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus // Journal of Virology. 1993. - V. 67. - P. 759-764.

21. Caton A.J., Browlee G.G., Yewdell J.W., Gerhard W. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (HI subtype) // Cell. 1982. - V. 31.-P. 417-427.

22. Chen, H., G. J. Smith, S. Y. Zhang, K. Qin, J. Wang, K. S. Li, R. G. Webster, J. S. Peiris, Y. Guan. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl // Nature. 2005. - V. 436. - P. 191-192.

23. Chowell G., Bertozzi S.M., Colchero M.A., Lopez-Gatell H., Alpuche-Aranda C. Hernandez M., Miller M.A. Severe respiratory disease concurrent with the circulation of H1N1 influenza // New England Journal of Medicine. 2009. -V. 361. - P. 67467-67469.

24. Claas E.C., de Jong J.C., van Beek R., Rimmelzwaan G.F., Osterhaus A.D. Human influenza virus A/HongKong/156/97 (H5N1) infection // Vaccine. -1998. -V. 16. P. 977-978.

25. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: enzyme and antigen // The Influenza Viruses. 1989. - P. 175-218.

26. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, andinhibitors // Protein Science. 1994. - V. 3. - P. 1687-1696.

27. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus // Journal of Virology. 1972. - V. 10. - P. 795-800.

28. Connor R.J., Kawaoka Y., Webster R.G., Paulson J.C. Receptor specificity in human, avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates // Virology. 1994. -V. 205.-P. 17-23.

29. Cox N.J., Bender C. The molecular epidemiology of influenza viruses // Virology. 1995. - V. 6. - P. 359-370.

30. Cox N.J., Fuller F., Kaverin N.V., Klenk H. D., Lamb R.A., Mahy B.W.J., McCauley L, Nakamura K, Palese P, Webster R. Orthomyxoviridae. In:xL

31. Taxonomy of Viruses. 7 Rep. of Intern. Comm. of Taxonomy of Viruses. (Ed. by M.H.V. Regenmortel, C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M. Lemon et.al.) // Ac. Press Harcourt Sci. and Techn. Co. 2000. - P. 585-597.

32. Das S.R., Puigbo P., Hensley S.E., Hurt D.E., Bennink J.R., Yewdell J.W. Glycosylation focuses sequence variation in the influenza A virus HI hemagglutinin globular domain // PLoS Pathogens. 2010. - V. 6. P. 1-13.

33. Dawood F.S., Jain S., Finelli L. et al. Emergence of a novel swine-origin influenza A(H1N1) virus in humans // New England Journal of Medicine. -2009. V. 360. - P. 2605-2615.

34. De Jong M.D, Hein T.T. Avian influenza A (H5N1) // Journal of Clinical Virology. 2006. - V. 35. - P. 2-13.

35. Dias A., Bouvier D., Crepin T., McCarthy A.A., Hart D.J., Baudin F., Cusack S., Ruigrok R.W. The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit // Nature. 2009. - V. 458. - P. 914-918.

36. Dowdle W.R. Influenza pandemic periodicity, virus recycling, and the art of risk assessment // Emerging infectious diseases. 2006. V. 12. - P. 34-39.

37. Eisen M.B., Sabesan S., Skehel J.J., Wiley D.C. Binding of the influenza A virus to cell-surface receptors: structures of five hemagglutinin-sialyloligosaccharide complexes determined by X-ray crystallography // Virology. 1997. - V. 232. -P. 19-31.

38. Els M.C., Air G.M., Murti K.G., Webster R.G., Laver W.G. An 18-amino acid deletion in an influenza neuraminidase // Virology. 1985. - V. 30. - P. 241-247.

39. Fields S., Winter G., Brownlee G.G. Structure of the neuraminidase gene in human influenza virus A/PR/8/34 // Nature. 1981. - V. 290. - P. 213-217.

40. Fleury D., Wharton S.A., Skehel J.J., Knossow M., Bizebard T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization // Nature Structural Biology. 1998. - V. 5. - P. 119-123.

41. Gambaryan A.S., Robertson J.S., Matrosovich M.N. Effects of egg-adaptation on the receptor-binding properties of human influenza A and B viruses // Virology. 1999. - V. 258. - P. 232-239.

42. Gambaryan A., Webster R., Matrosovich M. Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken // Archives of Virology. 2002. -V. 147. - P. 1197-1208.

43. Gitelman A.K., Kaverin N.V., Kharitonenkov I.G., Rudneva I.A., Zhdanov V.M. Antigenic changes in mouse-adapted influenza virus strains. // Lancet. 1983. -• V. l.-P. 1229.

44. Gitelman A.K., Kaverin N.V., Kharitonenkov I.G., Rudneva I.A., Zhdanov V.M. Changes in the antigenic specificity of influenza hemagglutinin in the course of adaptation to mice // Virology. 1984. - V. 134. - P. 230-232.

45. Gorman O.T., Bean W.J., Kawaoka Y., Webster R.G., Evolution of the nucleoprotein gene of influenza A virus // Journal of Virology. 1990. - V. 64. -P. 1487-1497.

46. Goto H., Kawaoka Y. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998. - V. 95. - P. 10224-10228.

47. Ha Y., Stevens D.J., Skehel J.J., Wiley D.C. H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes // EMBO Journal. 2002. - V. 21. - P. 865-875.

48. Hatta M., Gao P., Halfmann P., Kawaoka Y. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses // Science. 2001. - V. 293. - P. 18401842.

49. Hinshaw V.S., Bean W.J., Webster R.G., Sriram G. Genetic reassortment of influenza A viruses in the intestinal tract of ducks // Virology. 1980. - V. 102. -P. 412-419.

50. Hiti A.L., Davis A.R., Nayak D.P. Complete sequence analysis shows that the hemagglutinins of the HO and H2 subtypes of human influenza virus are closely related//Virology. 1981.-V. 111.-P. 113-124.

51. Holsinger L.J., Nichani D., Pinto L.H., Lamb R.A. Influenza A virus M2 ion channel protein, a structure-function analysis // Journal of Virology. 1994. - V. 68. - P. 1551-1563.

52. Horimoto T., Kawaoka Y. Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of hemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza A virus//Journal of Virology. 1994. -V. 68. - P. 3120-3128.

53. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses // Clinical Microbiology Reviews. 2001. - V. 14. - P. 129-149.

54. Ito T., Kida H., Yanagawa R. Antigenic analysis of H4 influenza virus isolates using monoclonal antibodies to defined antigenic sites on the hemagglutinin of A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 strain // Archives of Virology. 1985. - V. 145. -P. 251-259.

55. Jackson D.C., Nestorowicz A. Antigenic determinants of influenza virus hemagglutinin // Virology. 1985. - V. 145. - P. 72-83.

56. Jennings P.A., Finch J.T., Winter G., Robertson J.S. Does the higher order structure of the influenza virus ribonucleoprotein guide sequence rearrangements in influenza viral RNA? // Cell. 1983. - V. 34. - P. 619-627.

57. Joannis T., Lombin L.H., De Benedictis P., Cattoli G., Capua I. Confirmation of H5N1 avian influenza in Africa // Veterinary Record. 2006. - V. 158. P. 309310.

58. Katz J.M., Naeve C.W., Webster R.G. Host cell-mediated variation in H3N2 influenza viruses // Virology. 1987. - V. 156. - P. 386-395.

59. Katz J.M., Lu X., Tumpey T.M. et al. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice // Journal of Virology. 2000.- V. 74. - P. 10807-10810.

60. Katz J.M., Webster R.G. Amino acid sequence identity between the HA1 of influenza A (H3N2) viruses grown in mammalian and primary chick kidney cells // Journal of General Virology. 1992. - V. 73. - P. 1159-1165.

61. Kaverin N.V., Rudneva I.A., Smirnov Y.A., Finskaya N.N. Human-avian influenza virus reassortants: effect of reassortment pattern on multi-cycle reproduction in MDCK cells // Archives of Virology. 1988. - V. 103. - P. 117126.

62. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza 1 viruses in the 1957 and 1968 pandemics // Journal of Virology. 1989. - V. 63. - P. 4603-4608.

63. Kawaoka Y., Naeve C.W., Webster R.G. Is virulence of H5N2 influenza viruses in the chickens associated with loss of carbohydrate from the hemagglutinin? // Virology. 1984. - V. 139. - P. 303-316.

64. Kawaoka Y., Webster R.G., Interplay between carbohydrate in the stalk and the length of the connecting peptide determines the cleavability of influenza virus hemagglutinin // Journal of Virology. 1989. - V. 63. - P. 3296-3300.

65. Kawaoka Y., Webster R.G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1988 - V. 85.-P. 324-328.

66. Kawaoka Y., Yamnikova S., Chambers T.M., Lvov D.K., Webster R.G. Molecular characterization of a new hemagglutinin, subtype HI4, of influenza A virus // Virology. 1990. - V. 179. - P. 759-767.

67. Khatchikian D., Orlich M., Rott R. Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the hemagglutinin gene of an influenza virus // Virology. 1982. - V. 122. - P. 38-47.

68. Kida H., Brown L.E., Webster R.G. Biological activity of monoclonal antibodies to operationally defined antigenic regions on the hemagglutinin molecule of A/Seal/Massachusetts/1/80 (H7N7) influenza virus // Virology. -1982. -V. 122. P. 38-47.

69. Kingsford C., Nagarajan N., Salzberg S.L. 2009 Swine Origin Influenza A(H1N1) resembles previous influenza isolates. PLoS One. 2009, 4, 1-6.

70. Klenk H.D., Garten W. Host cell proteases controlling virus pathogenicity // Trends Microbiology. 1994. - V. 2. - P. 39-43.

71. Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Blodorn J. Activation of influenza A viruses by trypsin treatment // Virology. 1975. - V. 68. - P. 426-439.

72. Klenk H.D., Wagner R., Heuer D., Wolf T. Importance of hemagglutinin glycosylation for the biological function of influenza virus // Virus Research. -2002. V. 82. - P. 73-75

73. Knossow M., Daniels R.S., Douglas A.R., Shekel J.J., Wiley D.C. Three-dimensional structure of an antigenic mutant of the influenza virus hemoagglutinin // Nature. 1984. - V. 311. - P. 678-680.

74. Knossow M., Skehel J.J. Variation and infectivity neutralization in influenza // Immunology. 2006. - V. 119. - P. 1-7.150

75. Krug R.M. Priming of influenza viral RNA transcription by capped heterologous RNAs // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1981. - V. 93.-P. 125-149.

76. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

77. Lamb R.A. and, Krug R.M. Orthomyxoviridae / Fields Virology. Section 2, Specific Virus Families. // Eds B.N. Fields and D.M. Knipe, Lippincott, Williams, Wilkins. 2001. - P. 1091-1137.

78. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G., Markoff L.J. Amino acid sequence changes in antigenic variants of type A influenza virus N2 neuraminidase // Virology. 1982. - V. 122. - P. 450-460.

79. Lazarowitz S.G., Choppin P.W. Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide // Virology. 1975. - V. 68. - P. 440-454.

80. Lee J.-W. Avian influenza: assessing the pandemic threat // WHO/CDC.2005. -V. 29. P. 1-62.

81. Lipatov A.S., Govorkova E.A., Webby R.J., Ozaki H., Eiris M., Guan Y., Poon L., Webster R.G. Influenza: emergence and control // Journal of Virology. 2004. - V. 78. - P. 8951-8959.

82. Lu X., Tumpey T.M., Morken T., Zaki S.R., Cox N.J., Katz J.M. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from humans // Journal of Virology. 1999. - V. 73. - P. 59035911.

83. Martin J., Wharton S.A., Lin Y.P., Takemoto D.K., Skehel J.J., Wiley D.C., Steinhauer D.A. Studies of the binding properties of influenza hemagglutinin receptor-site mutants // Virology. 1998. - V. 241. - P. 101-111.

84. Massin P., Van der Vef S., Naffakh N. Residue 627 of PB2 is a determinant of cold sensitivity in RNA replication of avian influenza viruses // Journal of Virology. 2001. - V. 75. - P. 5398-5404.

85. Matrosovich M.N., Gambaryan A.S., Chumakov M.P. Influenza viruses differ in recognition of 4-O-acetyl substitution of sialic acid receptor determinant // Virology. 1992. - V. 188. - P. 854-858.

86. Matrosovich M., Miller-Podraza H., Teneberg S., Robertson J., Karlsson K.A. Influenza viruses display high-affinity binding to human polyglycosylceramides represented on a solid-phase assay surface // Virology. 1996. - V. 223. - P. 413416.

87. Matrosovich M.N., Mochalova L.V., Marinina V.P., Byramova N.E., Bovin N.V. Synthetic polymeric sialoside inhibitors of influenza virus receptor-binding activity // FEBS Letters. 1990. - V. 272. - P. 209-212.

88. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties // Journal of Virology. 1999. - V. 73. - p. 11461155.

89. Murti K.G., Webster R.G., Jones I.M., Localization of RNA polymerases on influenza viral ribonucleoproteins by immunogold labeling // Virology. 1988. -V. 164. - P. 562-566.

90. Murti K.G., Brown P.S., Bean W.J., Webster R.G. Composition of the helical internal components of influenza virus as revealed by immunogoldlabeling electron microscopy // Virology. 1992. - V. 186. - P. 294-299.

91. Naeve C.W., Hinshaw V.S., Webster R.G. Mutations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus // Journal of Virology. 1984. - V. 51. - P. 567-569.

92. Nermut M.V. Further investigation on the fine structure of influenza virus // Journal of General Vrology. 1972. - V. 17. - P. 317-331.

93. Neumann G., Hughes M.T., Kawaoka Y. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRMl //EMBO Journal. 2000. - V. 19. - P. 6751-6758.

94. Neumann G., Noda T., Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential ofswine origin H1N1 influenza virus // Nature. 2009. - V. 459. - P. 931-939.

95. O'Neill R.E., Talon J., Palese P. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins // EMBO Journal. 1998. -V. 17.-P. 288-296.

96. Palese P., Compans R.W. Inhibition of influenza virus replication in tissue culture by 2-deoxy-2,3-dehydro-N-trifluoroacetylneuraminic acid (FANA): mechanism of action // Journal of General Virology. 1976. - V. 33. - P. 159163.

97. Paulson J.C., Sadler J.E., Hill R.L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases // Journal of Biological Chemistry. 1979. - V. 254. - P. 21202124.

98. Peiris M., Yam W.C., Chan K.H., Ghose P., Shortridge K.F. Influenza A H9N2: aspects of laboratory diagnosis // Journal of Clinical Microbiology. -1999.-V. 37.-P. 3426-3427.

99. Peiris M., Yuen K.Y., Leung C.W., Chan K.H., Ip P.L, Lai R.W., Orr W.K., Shortridge K.F. Human infection with influenza H9N2 // Lancet. 1999. - V. 11. -P. 916-917.

100. Pekosz A., Newby C., Bose P.S., Lutz A. Sialic acid recognition is a key determinant of influenza A virus tropism in murine trachea epithelial cell cultures // Virology. 2009. - V. 386. - P. 61-67.

101. Philpott, M., Easterday, B.C., Hinshaw, V. Neutralizing epitopes of the H5 hemagglutinin from a virulent avian influenza virus and their relationships to pathogenicity // Journal of Virology. 1989. - V. 63. - P. 3453-3458.

102. Philpott M., Hioe C., Sheerar M., Hinshaw V.S. Hemagglutinin mutations related to attenuation and altered cell tropism of a virulent avian influenza A virus // Journal of Virology. 1990. - V. 64. - P. 2941-2947.

103. Porter A.G., Barber C., Carey N.H., Hallewell R.A., Threlfall G., Emtage J.S. Complete nucleotide sequence of an influenza virus hemagglutinin gene from cloned DNA // Nature. 1979. - V. 282. - P. 471-477.

104. Reading P.C., Morey L.S., Crouch E.C., Anders E.M. Collectin-mediated antiviral host defence of the lung: evidence from influenza virus infection of mice // Journal of Virology. 1997. - V. 71. - P. 8204-8212.

105. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints // American Journal of Hygiene. 1938. - V. 27. - P. 493-497.

106. Robertson J.S., Bootman J.S., Newman R. Change in the hemagglutinin of influenza A (H1N1) virus during egg adaptation // Journal of Cellular Biochemistry. 1985. - V. 59. - P. 270-277.

107. Robertson J.S., Bootman J.S., Newman R., Oxford J.S., Daniels R.S., Webster R.G., Schild G.C. Structural changes in the haemagglutinin which accompany egg adaptation of an influenza A(H1N1) virus // Virology. 1987. - V. 160. - P. 31-37.

108. Robertson J.S., Nicolson C., Major D., Robertson E.W., Wood J.M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses // Journal of General Virology. 1993. - V. 74.-P. 2047-2051.

109. Rogers G.N., Paulson J.C., Daniels R.S., Skehel J.J., Wilson I.A., Wiley D.C. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity // Nature. 1983. - V. 304. - P. 76-78.

110. Rogers G.N., Pritchett T.J., Lane J.L., Paulson J.C. Differential sensitivity of human, avian, and equine influenza A viruses to a glycoprotein inhibitor of infection: selection of receptor specific variants // Virology. 1983. - V. 131. -P. 394-408.

111. Rudneva I.A., Ilyushina N.A., Timofeeva T.A., Webster R.G., Kaverin N.V. Restoration of virulence of escape mutants of H5 and H9 influenza viruses by their readaptation to mice // Journal of General Virology. 2005. -V. 86.-P. 2831-2838.

112. Sahasrabudhe A., Blick T., McKimm-Breschkin J.L. Influenza variants resistant to GG167 with mutation in the hemagglutinin // Virology. 1996. - V. 246. - P. 748-752.

113. Russell R.J., Stevens D.J., Haire L.F., Gamblin S.J., Skehel J.J. Avian and human receptor binding by hemagglutinins of influenza A viruses // Glycoconjugate Journal. 2006. - V. 23. - P. 85-92.

114. Schreier E., Roeske H., Driesel G., Kunkel U., Petzold D.R., Berlinghoff R., Michel S. Complete nucleotide sequence of the neuraminidase gene of the human influenza virus A/Chile/1/83 (H1N1) // Archives of Virology. 1988. - V. 99. - P. 271-276.

115. Schulman J.L., Palese P.J. Selection and indentification of influenza virus recombinants of defined genetic composition // Journal of Virology. 1976. -V. 20. - P. 248-254.

116. Seo S.H., Hoffmann E., Webster R.G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses // Nature Medicine. 2002. - V. 8. - P. 950954.

117. Sha B., Luo M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml // Nature Structural Biology. 1997. - V. 4.1. P. 239-244.

118. Shapiro G.I., Krug R.M. Influenza virus RNA replication in vitro: synthesis of viral template RNAs and virion RNAs in the absence of an added primer // Journal of Virology. 1988. - V. 62. - P. 2285-2290.

119. Shen J., Ma J., Wang Q. Evolutionary trends of A(H1N1) influenza virus hemagglutinin since 1918 // PLoS One. 2009. - V. 4. - P. 1-10.

120. Shulze I.T. The structure of influenza virus. II. Model based on the morphology and composition of subviral particles // Virology. 1972. - V. 47. -P. 181-196.

121. Skehel J.J., Waterfield M.D. Studies on the primary structure of the influenza virus hemagglutinin // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1975. - V. 72. - P. 93-97.

122. Smirnov Y.A., Gitelman A.K., Govorkova E.A., Lipatov A.S., Kaverin N.V. Influenza H5 virus escape mutants: immune protection and antibody production in mice // Virus Research. 2004. - V. 99. - P. 205-208.

123. Smirnov Y.A., Lipatov A.S., Van Beek R., Gitelman A.K., Osterhaus A.D., Claas E.C. Characterization of adaptation of an avian influenza A (H5N2) virus to a mammalian host // Acta Virologica. 2000. - V. 44. - P. 1-8.

124. Steinhauser D.A., Holland J.J. Rapid evolution of RNA viruses // Annual Review of Microbiology. 1987. - V. 41. - P. 409-433.

125. Stevens, J., Corper, A.L., Basler, C.F., Taubenberger, J.K., Palese, P., Wilson, I.A. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus // Science. 2004. - V. 303. - P. 1866-1870.

126. Stevens J.O., Blixt T.M., Tumpey J.K., Taubenberger J.C., Paulson I.A., Wilson. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus // Science. 2006. - V. 312. - P. 404-410.

127. Strengell M., Ikonen, N., Ziegler, T., Julkunen, J. Minor changes in the hemagglutinin of influenza A(H1N1) 2009 virus alter its antigenic properties //PLoS One.-2011.-V. 6.-P. 1-13.

128. Suzuki Y. Gangliosides as influenza virus receptors. Variation of influenza viruses and their recognition of the receptor sialo-sugar chains // Progress in Lipid Research. 1994. - V. 33. - P. 429-457.

129. Suzuki Y. Avian and human influenza virus receptors and their distribution // Advances in Experimental Medicine and Biology. 2011. - V. 705. - P. 443452.

130. Taubenberger J.K., Reid A.H., Krafet A.E., Bijwaard K.E., Fanning T.G. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus // Science. -1997.-V. 275.-P. 1793-1796.

131. Taylor P.M., Askonas B.A. Influenza nucleoprotein-specific cytotoxic T-cell clones are protective in vivo // Immunology. 1986. - V. 58. - P. 417-420.

132. Thomas D.B., Patera A.C., Graham C.M., Smith C.A. Antibody-Mediated Immunity. In: K.G. Nicholson, R.G. Webster. Textbook of influenza // Blackwell Science. 1998. - P. 267-286.

133. Tokunaga H., Ushirogawa H., Ohuchi M. The pandemic (H1N1) 2009 influenza virus is resistant to mannose-binding lectin // Virology Journal. -2011. -V. 8. P. 50-58.

134. Trifonov V., Khiabanian H., Rabadan R. Geographic dependence, surveillance, and origins of the 2009 influenza A (H1N1) virus // New England Journal of Medicine. 2009. - V. 361. - P. 115-119.

135. Tsuchiya E., Sugawara K., Hongo S., Matsuzaki Y., Muraki Y., Li Z.N.,

136. Nakamura K. Antigenic structure of the haemagglutinin of human influenza A/H2N2 virus // Journal of General Virology. 2001. - V. 82. - P. 2475-2484.

137. Underwood P.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Receptor-binding characteristics of monoclonal antibody-selected antigenic variants of influenza virus // Journal of Virology. 1987. - V. 61. - P. 206-208.

138. Varghese J.N., McKimm-Breschkin J., Caldwell J.B., Kortt A.A., Colman P.M. The structure of the complex between influenza virus neuraminidase and sialic acid, the viral receptor // Proteins Structural Functional Genetics. 1992. -V. 14. - P. 327-332.

139. Varghese J.N., Colman P.M. Three-dimensional structure of the neuraminidase of influenza virus A/Tokyo/3/67 at 2.2 Á resolution // Journal of Molecular Biology. 1991. - V. 221. - P. 473-486.

140. Verhoeyen M., Fang R., Jou W.M., Devos R., Huylebroeck D., Saman E., Fiers W. Antigenic drift between the haemagglutinin of the Hong Kong influenza strains A/Aichi/2/68 and A/Victoria/3/75 // Nature. 1980. - V. 286. -P. 771-776.

141. Wagner R., Heuer D., Wolff T., Herwing A., Klenk H.D. N-glycans attached to the steam domain of hemagglutinin efficiently regulate influenza A virus replication // Journal of General Virology. 2002. - V. 83. - P. 601-609.

142. Wagner, R, Wolff, T., Herwig, A., Pleshka, S., Klenk, H.-D. Interdependence of hemagglutinin glycosylation and neuraminidase as regulators of influenza virus growth: a study by reverse genetics // Journal of Virology. 2000. - V. 74. - P. 6316-6323.

143. Watowich S.J., Skehel J.J., Wiley D.C. Crystal structures of influenza virus hemagglutinin in complex with high-affinity receptor analogs // Structure. -1994.-V. 2.-P. 719-731.

144. Webby R.J., Webster R.G. Emergence of influenza A viruses // Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. -2001.-V. 356. -P. 1818-1828.

145. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., Chambers T.M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses // Microbiological Reviews. -1992.-V. 56.-P. 152-179.

146. Weis W., Brown J.H., Cusack S., Paulson J.C., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid //Nature. 1988. - V. 333. - P. 426-431.

147. Wharton S.A., Weis W., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure, function and antigenicity of the hemagglutinin of influenza virus // The Influenza Viruses. -1989. P. 153-174.

148. White J., Matlin K., Helenius A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses // Journal of Cell Biology. 1981. - V. 89. - P. 674-679.

149. Wiley D.C., Shekel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus // Annual Review of Biochemistry. -1987.-V. 56. -P. 365-394.

150. Wiley D.C., Wilson I.A., and Skehel J.J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation // Nature. 1981. - V. 289. - P. 373-378.

151. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution // Nature. 1981. - V. 289. - P. 366-373.

152. Winter G., Fields S., Ratti G. The structure of two subgenomic RNAs from human influenza virus A/PR/8/34. Nucleic Acids Res., 1981, 9, 6907-6915.

153. Wrigley N.G., Skehel J.J., Charlwood P.A., Brand C.M. The size and shape of influenza virus neuraminidase // Virology. 1973. - V. 51. - P. 525-529.

154. Wrigley N.G., Brown E.B., Daniels R.S., Douglas A.R., Shekel J.J., Wiley D.C. Electrone microscopy of influenza hemagglutinin-monoclonal antibody complexes // Virology. 1973. - V. 131. - P. 308-314.

155. Wu W.L., Chen Y., Wang P, Song W., Lau S.Y., Rayner J.M., Smith G.J., Webster R.G., Peiris J.S., Lin T., Xia N., Guan Y., Chen H. Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007 // Journal of Virology. -2008. -V. 82. P. 798-1807.

156. Xu R., Ekiert D.C., Krause J.C., Hai R., Crowe J.E.Jr., Wilson I.A. Structural basis of preexisting immunity to the 2009 H1N1 pandemic influenza virus // Science. 2010. - V. 328. - P. 357-360.

157. Yuan P., Bartlam M., Lou Z., Chen S., Zhou J., He X., Lv Z., Ge R., Li X., Deng T., Fodor E., Rao Z., Liu Y. Crystal structure of an avian influenza polymerase PA(N) reveals an endonuclease active site // Nature. 2009. - V. 458.-P. 909-913.

158. Yang H., Carney P., Stevens J. Structure and receptor binding properties of a pandemic H1N1 virus hemagglutinin // Centers for Disease Control and Prevention. 2010.

159. Yasuda J., Nakada S., Kato A., Toyoda T., Ishihama A. Molecular assembly of influenza virus: association of the NS2 protein with virion matrix // Virology. 1993. - V. 196. - P. 249-255.

160. Ye Z.P., Baylor N.W., Wagner R.R. Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with antiidiotype antibodies and synthetic peptides // Journal of Virology. 1989. - V. 63.-P. 3586-3594.1. Благодарности.

Информация о работе

Игнатьева, Анна Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.02

Диссертация

Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Особенности антигенной структуры гемагглютинина, распознаваемые антителами против современных вирусов гриппа A подтипов H5 и H1 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы