Особенности аммонийного разобщения фотосинтетических реакций в тилакоидных мембранах хлоропластов

Васюхина, Лилия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности аммонийного разобщения фотосинтетических реакций в тилакоидных мембранах хлоропластов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности аммонийного разобщения фотосинтетических реакций в тилакоидных мембранах хлоропластов"

005001350

На правах рукописи

Васюхина Лилия Александровна

Особенности аммонийного разобщения фотосинтетических реакций в тилакоидных мембранах хлоропластов

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Пущино-2011

005001350

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РЛН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Опанасенко Вера Константиновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Кособрюхов Анатолий Александрович

кандидат биологических наук Агафонов Алексей Валентинович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

д Ь —7

«/С ' » ноября 2011 г. в '' час

Защита диссертации состоится «/¡С /» ноября 2011 г. в часов на заседании совета Д 002.066.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН

по адресу: 142290, г. Пущине Московской обл., ул. Институтская 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН г. Пущино

Автореферат разослан » октября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н.

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Фотосинтез - важнейший процесс, обеспечивающий существование биосферы Земли. Преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей стабильных продуктов световой стадии фотосинтеза - АТФ и НАДФН, происходит в тилакоидах хлоропластов растений и водорослей. Поглощение хлорофиллом квантов света обеспечивает энергией перенос электронов от воды к НАДФ вдоль цепи переносчиков двух фотосистем. Энергия тратится на образование НАДФН и формирование трансмембранного электрохимического потенциала Н+ (в основном — в виде градиента pH), который используется для синтеза АТФ.

В центре внимания биоэнергетиков находятся проблемы переноса электронов в реакционных центрах и комплексах фотосистем I и II, между фотосистемами и в цитохромном комплексе Ь(Д а также механизм работы АТФ-синтазного комплекса. В этих областях достигнуты высокие результаты.

При переходе от модельных систем к хлоропластом in vivo особое значение приобретают исследования процессов регуляции сопряжения переноса электронов и синтеза АТФ, которым, на наш взгляд, сейчас уделяется недостаточно внимания. Так, к настоящему времени найдено большое количество искусственных разобщителей сопряжения, но вопрос о том, возможно ли эндогенное разобщение фотосинтетических реакций в живой клетке до сих пор остается открытым. Анализ литературы показывает, что в качестве эндогенных разобщителей могут рассматриваться только аммоний и насыщенные свободные жирные кислоты (СЖК).

Аммоний обычно не считают эндогенным регулятором энергетического сопряжения в тилакоидах - он легко теряется в процессе выделения, т.к. нейтральная форма этого амина, аммиак, свободно диффундирует сквозь клеточные мембраны. Содержание аммония в цитоплазме нативной клетки долгое время считалось малым - несколько мкМ. Однако для поддержания активного синтеза аминокислот концентрация аммония в строме хлоропласта должна быть не менее 100 мкМ, поскольку аммоний является субстратом гшотамин сшгтетаз, ключевых ферментов метаболизма азота. Известно, что хлоропласта содержат до 60% глютамин синтетаз листа и значения Км (NH44) для этих синтетаз находятся в области 0,1 - 0,6 мМ [Пушкин и др., 1983; Husted et al., 2000; Hill et al., 2002]. Действительно, современные определения концентрация аммония в водной фазе апопласта и в ткани листа дают значения 0,5 - 1,0 мМ [Husted et al., 2000; Husted et al., 2000; Hill et al., 2002].

циях (1-5 мМ) действует как классический разобщитель, т.е. устраняет трансмембранный градиент рН. Механизмы этих эффектов неясны, но оба они, вероятно, связаны с изменением проводимости мембраны для аммония или Н+. Эти вопросы, насколько нам известно, до сих пор специально не исследовались. Неизвестны так же механизмы влияния СЖК на энергетическое сопряжение в хлоропластах. Показано, что насыщенные СЖК в низких концентрациях могут вызывать «десопряжение», т. е. ингибирование синтеза АТФ без снижения электрохимического градиента Н+ [Pick et al., 1987; Rottenberg, 1990]. Ненасыщенные СЖК такой способностью не обладают, но в высоких концентрациях они могут ннгибировать перенос электронов [Warden and Csatorday, 1987].

В митохондриях аммоний не вызывает разобщения, т.к. в этих органеллах электрохимический градиент Н~ существует, преимущественно, в виде электрического потенциала на внутренней мембране. Насыщенные даинноцепочечные СЖК в низких концентрациях (20 -40мкМ) вызывают «мягкое» разобщение энергетики митохондрий [Rottenberg, 1990]. При этом установлено, что анионы СЖК не способные проникать через мембрану, транспортируются белками: АДФ/АТФ транслокатором и целым семейством специальных разобщающих белков (UCP) [Andreyev etal., 1988; Skulachev, 1991; Skulachev, 1998; Sluse etal., 2006]. Утечка H+ прекращается, когда избыток СЖК катаболизируется в матриксе или окисляется переносчиками электронтрасиортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. Предполагается, что это разобщение играет центральную роль в защите органелл от активных форм кислорода, образующихся при торможении транспорта электронов по ЭТЦ в результате исчерпания АДФ [Skulachev, 1991; Skulachev, 1998].

Если эндогенное разобщение играет столь важную роль в энергетике митохондрий, то оно в каком-то виде может существовать и в хлоропластах живых фотосинтезирующих клеток. Наиболее вероятные участники такого разобщения - аммоний и СЖК, поскольку они являются субстратами и продуктами клеточного метаболизма. Эти метаболиты в клетке присутствуют одновременно, но содержание их в цитоплазме непостоянно и зависит от многих факторов, в том числе от света, температуры и возраста растений.

Цель исследования - изучение действия аммония на процессы трансформации энергии в условиях, близких к условиям в растительной клетке, т.е. при том же осмотическом давлении, солевом составе среды и в присутствие СЖК.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выяснение особенностей действия аммония в области его низких концентраций (до 0,5 мМ), стимулирующих синтез АТФ и характерных для стромы хлоропласта.

2. Выяснение механизма разобщения высокими концентрациями аммония (1-5 мМ).

3. Исследование совместного действия аммония и СЖК.

4. Поиск ингибиторов и стимуляторов аммонийного разобщения.

Научная новизна работы. Впервые выявлена двухфазность аммонийного эффекта для всех процессов, связанных с градиентом рН - синтеза АТФ, светошщуцированного поглощения Н+ и базального переноса электронов. Первая фаза наблюдается в области низких концентраций аммоиия (до 0,5 мМ), вторая фаза соответствует классическому разобщению (1-5 мМ). Обе фазы прослеживаются на концентрационных кривых других гидрофильных аминов. Показано, что для индукции каждой фазы необходимо взаимодействие катионов аминов с центрами, расположенными на люменалыюй стороне мембраны. Сродство аммония и катионов имидазола к центрам связывания оказалось высоким и практически одинаковым, в то время как сродство метиламмония было ниже в 8 -10 раз.

С помощью конфокальной микроскопии показано, что осмотические градиенты ионов, возникающие на тилакоидных мембранах при высоких концентрациях аминов, могут вызывать третью фазу разобщения - открытие неспецифических пор, проницаемых для больших молекул флуоресцентного красителя сульфородамина Б. Впервые продемонстрировано, что индукция всех фаз разобщения происходит без заметного набухания тилакоидов.

Найден синергизм действия аминов и пальмитиновой кислоты (ПК) при рН среды 7,8. При понижении рН среды до 6,5 синергичное действие аминов и ПК снижается, но при этом активируется разобщение пальмитиновой кислотой, отсутствующее при рН 7,8.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах регуляции процессов трансформации энергии в фотосинтези-рующей клетке, дают возможность поиска новых эндогенных ингибиторов и активаторов биоэнергетики хлоропластов. Они важны для разработки путей направленной регуляции фотосинтеза. Материалы диссертации могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биоэнергетике, биохимии и физиологии растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функция фотосистем» (Пущино, 2006); Международной конференции «Преобразование световой энергии в фотосинтезе» (Пущино, 2008); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2008,2009 и 20 П); на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009); на 11-ой, 12-ой и 13-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007,2008 и 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых российских журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 120 страницах, иллюстрирована 26 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 256 цитируемых литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили хлоропласты гороха класса «С» (тилакоидные системы), выделенные по стандартной методике [Оралаэепко й а1., 1985] и хлоропласты Ререгояпа сарега1а, полученные из тонких срезов молодых листьев. Концентрацию хлорофилла определяли по методу Арнона [Агпоп, 1949].

Светоиидуцированное поглощение протонов и скорость фотофосфорилироваиия определяли потенциометрическим методом. Скорость электронного транспорта измеряли с помощью рОг-электрода Кларка при использовании в качестве акцептора электронов метилвиологена, или потенциометрически, по выделению Н\ если акцептором электронов служил феррициа-нид.

Для исследования изменения объёма тилакоидной системы регистрировали распределения флуоресценции сульфородамина Б (8 К) и хлорофилла в хлоропласт ах, используя конфокальный микроскоп ЫсаТСБ ЭРЕ. В реакционных средах, содержавших БЯи хлоропласты, регистрировали флуоресценцию 811 и хлорофилла, возбуждавшуюся двумя лазерами с длинами волн 532 нм и 635 им. Интенсивность флуоресценции регистрировали в диапазоне 538 -590 нм для БЯ и 640 - 750 нм для хлорофилла 50 мкМ БЯ не влиял на функции хлоропластов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование действия аммония в сопоставлении с действием других аминов.

1.1. Два вида аммонийного разобщения.

Действие аммония на уровень ДН и скорость базального переноса электронов показано на рис. 1А. Низкие концентрации аммония (< 0,2 мМ) вызывают заметное ингибирование све-тоиндуцированного поглощения ионов водорода (рис. 1А, кривая 1), которое сопровождается стимуляцией базального переноса электронов в 1,5-2 раза (рис. 1А, кривая 2). Дальнейшая стимуляция электронного транспорта, вплоть до уровня, который наблюдался в присутствии 2мкМ грамицидина Д, происходила при высоких концентрациях амина (0,5 - 5 мМ). Во всех экспериментах изменения образования АН и скорости базального переноса электронов, соответствовали друг другу. При этом прослеживается двухфазность кривых, что свидетельствует о наличии двух частично перекрывающихся областей увеличения протонной проводимости мембран: ниже 0,2 мМ и выше 0,5 мМ N11(01.

O-WA 0,0

o-Uv—,, ' I 0,0 0,1

0,1

NH4CI, мМ

Рис. 1. Влияние аммония: А - на ДН (кривая /) и скорость базального переноса электронов (кривая 2) в средах с сахарозой; Б - на синтез АТФ в присутствии ОД М сахарозы (кривая /) и в среде без сахарозы (кривая 2).

Как видно на рис. 1Б (кривая I), низкие концентрации аммония стимулируют, а не ин-гибируют синтез АТФ с метилвиологеном, несмотря на индукцию утечки Н+. Предполагается, что синтез АТФ происходит с участием двух пулов АТФ-синтазных комплексов, первый из которых получает Н+ из люмена, а второй - из примембранных доменов [Nagle and Dilley 1986; Pick and Weiss 1988; Opanasenko et al., 1999]. Синтез АТФ с участием комплексов второго пула стимулируется из-за ускорения переноса электронов, в то время как фотофосфо-рилирование с участием комплексов, связанных с люменом, ингибируегся. Следовательно, происходит наложение двух процессов. Перенос Н+ по доменам примембранного слоя можно нарушить исключением сахарозы (Dilley et al., 1987), в результате чего ингибирование синтеза АТФ становится двухфазным (рис. 1Б, кривая 2). В средах без сахарозы уже низкие концентрации аммония ингибировали синтез АТФ в реакции с метилвиологеном (рис. 1Б, кривая 2).

Кривые аммонийного разобщения можно представить как сумму действия двух различных транспортных систем, которые активируются аммонием. Каждая кривая электронного транспорта (рис. 2А) может быть представлена в виде суммы постоянной величины (V0) и функций Хилла, соответствующих индукции трансмембранных утечек Н1" или катионов:

где: С - концентрация амина в среде; г - номер мембранного компонента, участвующего в разобщении; К, - условные константы диссоциации комплексов аммония с мембранным компонентом /; т - коэффициент кооперативное™ взаимодействия амина с мембранным компонентом ¡' (коэффициенты Хилла); Уг - максимальная скорость утечки, возникающей при взаимодействии амина с мембранным компонентом ;'.

(1)

X 800-1

¡С

5 „„

и. — 600-

к.

m со 400-

f.. ÏT

п.

<и 200-

оз

X со

и 0-

А ..-!

X я

-5 -4 -3

Log [NH4CI]

« X

Ь 100-

Log [NH4CI] "3

E—

-5 -4 -3 -2 Log INH4CI]

Рис. 2. Разложение экспериментальных кривых (символы) скорости электронного транспорта (А), синтеза АТФ в отсутствие сахарозы (Б) и ДН (В) по функциям Хилла (сплошные линии без символов).

У зависимостей АН и синтеза АТФ (в отсутствие сахарозы) от концентрации аммония нет постоянных составляющих (Уо= 0), но они, как и кривые скорости транспорта электронов, хорошо аппроксимируются суммой двух функций Хилла с га < 0 (рис. 2Б, 2В). Попытки представить экспериментальные кривые одной функцией приводят к увеличению среднеквадратичной ошибки аппроксимации в 10- 100 раз. Однако кривая синтеза АТФ в среде с сахарозой требует введения третьей функции, соответствующей стимуляции синтеза АТФ низкими концентрациями аммония.

1.2. Фазы разобщения энергетики хлоротастов гидрофильными аминами.

Для того чтобы выяснить, способны ли другие амины, стимулирующие синтез АТФ, вызывать двухфазное разобщение, исследовали действие метиламина, который применяется как анатог аммония при изучении транспорта NH4+ через мембрану [Pick and Weiss 1988; iCosola and Bloom, 1994; Khademi and et al., 2004; Neuhäuser and at al., 2007; Javelle et al., 2008] и ими-дазола - ароматического амина.

На рис. ЗА, сопоставлено действие аммония, метиламина и имидазола на синтез АТР в реакций с метилвиологеном. Как видно, в низких концентрациях амины стимудировани фото-фосфорилирование при переносе электронов по полной цепи. Максимальные значения синтеза АТФ достигались в присутствии 0,2 мМ аммония (кривая 1 и рис. 1Б), 0,5 -1,0 мМ метиламина (кривая 2) и 2,0 мМ имидазола (кривая 3). Метиламин и имидазол, так же как и аммоний, стимулировали скорость базального транспорта электронов (рис. ЗБ) как в низких, так и в высоких концентрациях, что указывает на снижение аминами трансмембранного градиента pH

Рис. 3. Действие аммония (кривая /), метиламина (кривая 2) и имидазола (кривая 3) на синтез АТФ при переносе электронов от воды к метилвиологену (А) и на скорость базального переноса электронов от воды к феррицианиду (Б)

при работе полной цепи. Данные рис. ЗБ показывают, что две фазы разобщения наиболее четко выражены на концентрационной кривой имидазола (кривая 3). В опытах с метиламином (кривая 2) в области высоких концентраций проявляется третья фаза.

Первая фаза стимуляции транспорта достигала своих максимальных значений при тех же концентрациях аминов, которые вызывали стимуляцию синтеза АТФ. Ограниченность стимуляции электронного транспорта в первой фазе свидетельствовала об ограничении скорости утечки Н+ в присутствии низких концентраций аминов. По эффективности разобщения в средах с рН 7,8 амины всегда располагались в последовательности: аммоний > метиламин > ими-дазол.

Поскольку в реакции разобщения могут участвовать разные мембранные компоненты, взаимодействующие с аминами, можно предположить, что их реакционные или регуляторные центры, связываясь с молекулами аминов, изменяют свои кинетические свойства. Поэтому многофазные зависимости можно рассматривать как сумму однофазных кривых, каждая из которых соответствует изменению состояния одного из мембранных компонентов и аппроксимируется функцией Хилла.

Подобно кривым аммонийного разобщения концентрационные кривые метиламина и имидазола, аналогичные показанным на рис. ЗБ, можно представить в виде суммы постоянной величины (У0 без аминов) и двух (имидазол) или трех (метиламин) функций Хилла (формула 1), соответствующих индукции трансмембранных утечек Н+ или катионов аминов из люмена. Предположим, что эти утечки происходят с участием гипотетических мембранных компонентов Т1.Т2 и ТЗ.

В табл. 1 приведены средние значения К, - К3, которые соответствуют концентрациям 50% насыщения аминами компонентов Т1, Т2 и ТЗ. Как видно из данных таблицы 1, разброс значений К1 и К2 для тилакоидов разных выделений не слишком велик и наименьший он у

Табл. 1. Средние значения ^-Кз, соответствующие концентрациям 50% насыщения аминами мембранных компонентов Т1-ТЗ. Каждая строка таблицы представляет собой результаты разложения 4-5 кривых, полученных на образцах разного выделения.

Рн амин К ,(мМ) К2 (мМ) К3 (мМ)

7,8 аммоний 0,07+0,02 1,1+0,1

метиламин 0,7 ± 0,3 2,0 ± 0,2 6,0 + 0,3

имидазол 0,8 ± 0,2 6,5 ± 0,3

6,5 аммоний 0,5 + 0,1 6,0 + 0,2

метиламин 5,1 +0,3

имидазол 0,6 + 0,1 5,5 + 0,3

аммония. Коэффициенты кооперативности составляли: nl 1,4 ± 0,2 для всех аминов; п2 2,6 ± 0,2 для аммония, 4,5 ± 0,5 для имидазола и метиламина. Значения Vi для всех аминов составляли 150 + 30, V2 были в пределах 300 - 400 для аммония, 250 - 350 для имидазола и 200 -250 мкэкв. ё в час на 1 мг Хл для метиламина.

Кривые аммония и имидазола хорошо аппроксимировались суммой двух функций, соответствующих активации мембранных компонентов Т1 и Т2, в то время как с метиламином требовалось введение третьей функции разложения, соответствующей взаимодействию аминов с компонентом ТЗ. Таким образом, трехкомпонентная модель системы разобщения аминами имеет право на существование и может рассматриваться как рабочая гипотеза при обсуждении последующих экспериментов.

С мембранными компонентами могут взаимодействовать как нейтральные (А), так и катионные (АН+) формы аминов. Вклад этих форм в общую концентрацию амина (С) зависит от значения рК амина и рН реакционной среды. Следовательно, при изменении рН среды концентрационные кривые аминов должны изменяться.

На рис. 4 показано действие аминов на перенос электронов при рН среды 6,5. Как видно, разобщение аминами действительно изменяется. Разобщающее действие аммония и метиламина резко уменьшается - фазы

2 4 6

Амины, мМ

Рис. 4. Действие аммония (кривая I),

метиламина (кривая 2) и имидазола

(кривая 3) на скорость базапьного

переноса электронов от воды к феррицианиду при рН 6,5.

стимуляции электронного транспорта этими аминами сдвигаются в область более высоких концентраций. Имидазол (кривая 3) становится столь же эффективным разобщителем, как аммоний (кривая /), а метиламин действует гораздо слабее других аминов (кривая 2).

Концентрации А и АН+ были рассчитаны по формулам (2) и (3) из работ [Rottenberg et al„ 1972; Rottenberg and Grunwald, 1972] в соответствии со значениями рН среды (рН0Ш) и рК аминов, в предположении, что количество амина, связанного с компонентами мембраны, много меньше общей концентрации амина (С), и форма А свободно диффундирует через мембрану.

Aout = С/( 1 + 10рК ~ рНо™') = Ai„ (2)

AH+out = C/(l + 10pHm"-pK> О)

k = AH+„ut/C, №

где k - доля катионов амина в его общей концентрации С.

Предположим, что для индукции утечек необходимо взаимодействие нейтральных форм аминов с компонентами мембраны. Поскольку концентрации А внутри и снаружи люмена одинаковы, их взаимодействие с компонентами мембраны не должно зависеть от градиента рН. Расчеты по формуле (2) показывают, что при снижении рН среды от 7,8 до 6,5, то есть на 1,3 ед„ содержание в среде нейтральных форм аммония (рК 9,25) и метиламина (рК 10,6) уменьшается примерно в 20 раз. Поэтому значения К, и К2 для этих аминов должны были бы увеличиваться в 20 раз. У имидазола (рК 6,9) концентрация А снижается в 3 раза, значит К, и К2 имидазола должны увеличиваться в 3 раза. Однако это не соответствует данным табл. 1. Значит, взаимодействие с мембраной нейтральных форм аминов не может быть причиной индукции утечек Т1 и Т2.

В табл. 2 приведены значения К1(АН+) = № и К2(АН+) = к'К2 для катионов аминов, рассчитанные по формулам (3), (4) и данным табл. 1. Представление данных в таком виде показывает, что аммоний и катионы имидазола вызывают разобщение при близких значениях Ккан+) и К2 (ан+) как при рН 7,8, так и при рН 6,5. Значит, различие действующих концентраций С этих аминов при рН 7,8 должно быть следствием того, что вклад катионов имидазола в общую концентрацию амина при рН среды 7,8 почти в 7 раз меньше, чем при рН 6,5 (последний столбец табл. 2). Напротив, значения КиАн+) и К2(АН+) Для метиламина, независимо от рН, были гораздо выше, чем для аммония и имидазола. Эти данные свидетельствуют о том, что индукция фаз разобщения должна быть обусловлена взаимодействием катионных форм аминов с компонентами мембраны, причем аммоний и ионы имидазола имеют практически одинаковое сродство к компонентам Т1 и Т2, в то время как сродство катионов метиламина к этим компонентам гораздо ниже, чем у катионов аммония и имидазола.

Табл. 2. Значения К](ан+) и К2 (ан+>, рассчитанные по данным таблицы 1 и значениям к, приведённым в последнем столбце таблицы для рН 7,8 и 6,5.

pH Катион амина К1 (АН+) (мМ) К 2 (АН+) (мМ) к = АН+/С

7,8 аммоний 0,07 1,05 0,965

метиламин 0,7 2,0 0,998

имидазол 0,09 0,71 0,111

6,5 аммоний 0,5 6,0 0,998

метиламин 5,1 - 0,9999

имидазол 0,43 4,0 0,714

Известно, что на мембранах освещенных тилакоидов образуется градиент концентрации катионов амина, равный по величине градиенту pH, и при снижении pH среды величина ЛрН тоже снижается [Rettenberg et al., 1972; Rottenberg and Grunwald, 1972; Walz et al„ 1974]. Значит, пропорционально уменьшается и трансмембранный градиент концентрации АН+ (AH^n/AH^ut). Амины с высокими значениями рК почти полностью протонированы при pH 6,5 и pH 7,8 (табл. 2), поэтому при одинаковых С снижение pH среды практически не изменяет содержание в ней AH+0Ut, но вызывает снижение АН+,П в люменах из-за уменьшения трансмембранного ДрН (формула 5).

АН+;„ = 10ЛрН AH+out (5)

Следовательно, сдвиг кривых разобщения этими аминами при снижении pH среды возможен только в том случае, если утечки индуцируются взаимодействием катионов аминов с компонентами Т1 и Т2 на люменальной стороне мембраны. У имидазола при снижении pH среды значения Ki и К: (табл. 1) не увеличивались, потому что снижение градиента pH (формула 5) сопровождалось повышением концентрации AH+„U1 (последний столбец табл.2).

Для исследования действия аминов на объём хлоропластов и проницаемость тилако-идных мембран для крупного аниона SR был применён метод конфокальной микроскопии. На рис. 5 сопоставлены фотографии флуоресценции тилакоидной системы хлоропластов в начале и в конце 5 мин освещения под микроскопом в присутствии аминов и SR, не проникающего сквозь липидный бислой. Только метиламин вызывал вход красителя в тилакоиды, хотя 2 мМ аммоний и 8 мМ имидазол тоже обеспечивали почти полное разобщение переноса электронов (рис. ЗБ). Если хлоропласта с 10 мМ метиламином предварительно освещали непрерывным светом в течение 1 мин, а затем переносили под микроскоп, разность флуоресценции между фоном и хлоропластом до и после освещения под микроскопом была ниже, чем в случае без предварительного освещения (строка 3). Следовательно, и в функциональных исследованиях в

А Б В

Рис. 5. Флуоресценция сульфородамина в начале (А) и в конце освещения (Б) в присутствии 2 мМ аммония (строка 1), 10 мМ метиламина (строки 2 и 3) или 8 мМ имидазола (строка 4). Строка 3 - образец 1 мин предварительно освещали в реакционной среде в присутствии 10 мМ метиламина и сульфородамина. Колонка (В) - флуоресценции хлорофилла в конце освещения.

присутствии метиламина в тилакоидах должны были открываться мембранные поры, проницаемые для анионов БЯ.

Судя по фотографиям флуоресценции хлорофилла (рис. 3, колонка В), разобщение высокими концентрациями аминов не вызывало заметного изменения размеров тилакоидной системы хлоропласта в средах с 0,2 М сахарозой. Общего набухания тилакоидов не было даже при входе в люмены в присутствии метиламина, создающего в люменах в 10 раз более вы-

■ * - и

5мкм □

V- : ■

сокое осмотическое давление, чем катионы аммония или имидазола. Это свидетельствует о том, что градиент осмотического давления приводит к открытию неспецифических мембранных пор, проницаемых не только для катионов аминов и анионов хлора, но и для более крупных молекул, в частности, для SR.

Итак, разобщение гидрофильными аминами можно представить как индукцию двух специфических трансмембранных каналов или переносчиков (Т1,Т2), активируемых разными концентрациями катионов аминов в люмене тилакоида, и поры ТЗ, индуцируемой градиентом

1.3. Разобщение энергетики хлоропластом липофильными аминами.

Как показано на рис. 6 липо-фильные амины тегракаин. дибукаин и 9-аминоакридин ингибируют синтез АТФ при переносе электронов по полной цепи (кривые I, 2, 3), и не способны стимулировать эту реакцию. Ингибируя синтез АТФ, липофильные амины не ускоряют базальный перенос электронов (кривые 1,2,3). Таким образом, тетракаин, дибукаин и 9-аминоакридин не активируют те виды утечек Н+ или катионов аминов, которые характерны для аммония, имидазола и метиламина.

2. Влияние СЖК и СССР на разобщение аминами

2.1. Синергизм действия аммония и пальмитиновой кислоты

Для исследования совместного действие на энергетику хлоропластов двух метаболитов -аммония и пальмитата, мы использовали 0,2 мМ NH4CI, поскольку эта концентрация амина стимулировала синтез АТФ и, как полагают, является оптимальной в строме хлоропластов [Пушкин и др., 1983; Hill etal., 2002; Husted etal., 2000]. Хлоропласта промывались и хранились в среде с бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Как видно на рис. 7, в отсутствие аммония пальмитиновая кислота при соотношении ПК/Хл = 1 ингибировала до 50% синтеза АТФ (кривая 1). Скорость базального транспорта электронов при концентрациях ПК ниже 40 мкМ не увеличивалась (кривая 3). Незначительное увеличение скорости иногда происходило при соотношении ПК/Хл > 1. Добавление в реакционную среду 0,2 мМ аммония усиливало ингибирование фотофосфорилирования паль-

осмотического давления на тилакоидной мембране.

Амины, мкМ

-о- Тетракаин; -о- Дибукаин; -А- 9-Аминоакрвдин

Рис. 6. Действие тетракаина, дибукаина и 9-аминоакридина на синтез АТФ (кривые /, 2, 3) и скорость базального переноса электронов (кривые 1,2.3).

митиновой кислтотй (кривая 2) и вызывало значительную стимуляцию базального переноса электронов в области 10 - 40 мкМ ПК (кривая 4). Из данных рис . 7 следует, что низкие концентрации аммония активируют разобщающее действие пальмитиновой кислоты.

Как показано на рис. 8, ПК, в свою очередь, существенно повышала эффективность аммонийного разобщения. 40 мкМ ПК снижала концентрации аммония, необходимые для ингибирования синтеза АТФ (рис. 8А, кривые 1,2). Полное разобщение базального переноса электронов в присутствии ПК достигалось при низких концентрациях аммония (рис. 8Б, кривые 1,2), характерных для первой фазы разобщения. Кривые ингибирования синтеза АТФ и стимуляции переноса электронов были однофазны. Можно предполагать, что пальмитиновая кислота существенно увеличивает утечку, индуцируемую аммонием, через мембранный компонент Т1.

Итак, совместное действие аммония и ПК имеет синергетический характер. Помимо пальмитиновой кислоты, синергизм с аммонием проявляли миристиновая и стеариновая кислоты.

В отличие от СЖК слабая жирная кислота - СССР (карбонилцианид-л<-хлорфенилгидразон), не являющаяся метаболитом в растительной клетке, не имела

Рис. 8. Пальмитиновая кислота, но не СССР, вызывает стимуляцию аммонийного разобщения: в несколько раз снижаются концентрации аммония, необходимые для А - 50% ингибирования синтеза АТР, Б - стимуляции базального переноса электронов. Кривые: 1 - контроль без добавок; 2 - +40 мкМ ПК; 3 - +2 мкМ СССР.

X и

20 40 60

Папьмитат, мкМ

Рис. 7. Действие пальмитиновой кислоты на синтез АТР (кривые 1,2) и скорость базального переноса электронов (кривые 3, 4) в средах без аммония (кривые 1,3) и в присутствии 0,2 мМ NH4C1 (кривые 2,4)

синергизма с аммонием. Как видно на рис. 8 (кривые 3) действие протонофора СССР и аммония были аддитивными.

2.2. Пальмитиновая кислота стимулирует разобщение, индуцируемое имидазолом и метиламином

Является ли синергическое действие СЖК и аммония особенностью этого амина или же метиламин и имидазол способны проявлять подобный эффект? Чтобы ответить на этот вопрос исследовалось действие гидрофильных аминов на энергетику хлоропластов в присутствии 40 мкМ ПК, то есть при концентрации пальмитата, оптимальной для проявления синергизма с аммонием.

На рис. 9 представлены данные для метиламина и имидазола. В отличие от аммония ускорение транспорта низкими концентрациями метиламина не увеличивалось в присутствии ПК. Однако при концентрациях метиламина выше 1 мМ эффект стимуляции пальмитатом проявлялся и достигал максимума при концентрациях 4-5 мМ (рис. 9А).

В присутствии имидазола (рис. 9Б) ПК стимулировала первую фазу разобщения амином и сдвигала вторую фазу в область более низких его концентраций. Вероятно, стимуляция действия имидазола и аммония пальмитиновой кислотой происходила, в основном, за счёт увеличения вклада утечки через мембранный комплекс Т1. В присутствии ПК значения величин К1 для аминов не изменялись, значит, пальмитиновая кислота не влияла на сродство компонента Т1 к катионам аминов. Скорее всего, ПК действовала на стромальную часть компонента Т1, активированного имидазолом или аммонием, но не метиламином. Напротив, значения К2 в присутствии ПК снижались, т. е. сродство компонента Т2 к аминам увеличивалось, что хорошо заметно для метиламина и имидазола (рис. 9). По-видимому, пальмитиновая кислота действовала на люменальную часть компонента Т2. Можно полагать,

Рис. 9. Действие 40 мкМ ПК на базальный перенос электронов в присутствии метиламина (А) и имидазола (Б). Кривые: 1 - контроль без добавок; 2 - + ПК.

что из-за высокой скорости транспорта в присутствии ПК и аминов градиент рН снижается, и осмотическое давление в люменах, вероятно, не достигает уровня, необходимого для индукции компонента ТЗ.

Таким образом, использование разных гидрофильных аминов позволило выявить различия в действии ПК на компоненты системы аммонийного разобщения.

2.3. Синергизм действия липофильных аминов с СССР и его отличие от синергизма гидрофгшьных аминов с пальмитатом

На рис. 10 показано действие тетракаина в присутствии ПК и СССР. Действие дибукаина и 9-аминоакридина принципиально не отличалось от действия тетракаина, кроме того, что оно наблюдалось при более низких концентрациях аминов. Как видно на рис. 10, СССР усиливал иигибирование синтеза АТФ тетракаипом (рис. 10А, кривые I, 3) и стимулировал базальный перенос электронов (рис. 10Б, кривые 1, 3) в области низких концентрациях тетракаина. Пальмитат (40 мкМ) оказывал весьма незначительное воздействие на разобщение, индуцируемое тетракаином (кривые 2). Таким образом, был показан синергизм в разобщающем действии липофильных аминов и СССР, но не пальмитата.

Следовательно, при совместном применении липофильных аминов и СССР возникает дополнительная утечка Н1" или катионов аминов, приводящая к диссипации градиента рН - в присутствии СССР липофильный амин приобретает свойства протонофора.

Можно предполагать, что в люмене между анионами СССР, которые диффундируют через мембрану внутрь тилакоида, и катионами липофильных аминов образуются нейтральные ионные пары. Возникает трансмембранный градиент концентрации этих пар, и они начинают выходить через тилакоидную мембрану в обратном направлении - в строму. На

О 50 100 150 200

'Гетракаин, мкМ

0 50 100 150 200

Тетракаин, мкМ

Рис. 10. Действие тетракаина на синтез АТФ (А) и скорость базального переноса электронов (Б). Кривые: I - контроль без добавок; 2 - +40 мкМ ПК; 5 - +2 мкМ

стромальной стороне мембраны ионная пара, распадаясь на анион СССР и катион амина, высвобождает Н+, а нейтральная форма амина возвращается в люмен. Этим и объясняется синергизм СССР с жирными катионами.

Синергизм действия гидрофильных аминов и ПК с позиции образования ионных пар объяснить невозможно по следующим причинам. Поскольку нейтральные формы СЖК (АН) и оснований (В) свободно пересекают мембрану, а их ионизированные молекулы не проникают сквозь липидный бислой, в условиях стационарного освещения на хлоропласта* образуется трансмембранный градиент ионов А- и ВН+ Концентрации ионных пар ВН+А_, пропорциональные произведению концентраций ионных форм внутри и снаружи тилакоида, должны быть одинаковы. Следовательно, трансмембранный градиент концентрации этих пар не возникает - нет и причины для диффузии их через мембрану. Это указывает на то, что синергизм между ПК и гидрофильными аминами, по-видимому, обусловлен участием белков или белка.

2.4. Особенности разобщения паяъмитатом при рН 6,5

На рис. 11 сопоставлены скорости базального переноса электронов, стимулированного аммонием, в средах с рН 6,5 без пальмитата (кривая /) и в присутствии 40 мкМ ПК (кривая 2). Как видно, с понижением рН среды синергизм аммония с ПК практически пропадает. Действия имидазола и метиламина аналогичны действию аммония в данных условиях. Оказалось, что в кислых средах ПК вызывает заметное ускорение транспорта в отсутствие аминов, но не стимулирует утечку через мембранные компоненты Т1 и Т2, индуцируемую аминами.

На рисунке 12 показано влияние ПК без аминов на скорость переноса электронов при разных рН среды. При рН 7,8 пальмитат практически не действовал, но при рН 6,5 он индуцировал ускорение базального переноса электронов, которое достигало максимального значения при концентрациях ПК 30 - 40 мкМ, т. е. при закислении среды пальмитат выступает как слабый разобщитель. Известно, что анионы СЖК не способны проникать сквозь бислой [Антонов и др., 1973; Цофина и Выгодина, 1988; ОиИспесЫ 1987; СиЙдаесЫ 1987; Ап<1гееу « аг., 1989]. На митохондриях было показано, что разобщение длинноцепочечными СЖК

ЩДмМ

Рис. 11. Действие аммония при рН 6,5.на скорость базального переноса электронов в средах без пальмитата (кривая /) и в присутствие 40 мкМ ПК (кривая 2)

опосредованно белками-переносчиками, к которым относиться АТФ/АДФ антипортер [Андреев и др., 1987, Andreyev et al., 1989; Schonfeld, 1990; Dedukhova et al., 1991; Skulachev, 1998; Skulachev, 1999; Мохова и Хайлова, 2005]. АТФ/АДФ транслоказа была обнаружена и на тилакоидной мембране хлоропластов [Spetea et al., 2004; Thuswaldner et al., 2007; Yin et al., 2010; Spelea and Schoeft 2010]. Вполне вероятно, что, СЖК-индуцированное разобщение при снижении рН обусловлено этим белком. Однако, карбоксиатрактилат, наиболее эффективный ингибитор АТФ/АДФ антипортера на митохондриях, но не на субмитохондриальных частицах [Андреев и др., 1987; Andreev et at., 1988; Andreev et at., 1989; Мохова и Хайлова, 2005], не подавлял разобщение ПК при рН 6,5 на тилакоидах. Полагают, что центры белка, с которыми связывается карбоксиатрактилат, располагаются на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. На субмитохондриальных частицах, как и на тилакоидных мембранах, эти центры обращены внутрь везикул и, т. к. карбоксиатрактилат не способен проникать сквозь бислой, то они для связывания не доступны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные настоящей работы показывают, что система аммонийного разобщения хлоропластов может быть представлена как набор из двух специфических переносчиков (Tl, Т2), активируемых повышением концентрации катионов аминов в люмене тилакоида, и поры (ТЗ), проницаемой для таких крупных молекул, как SR.

Система разобщения регулируется низкими концентрациями свободных жирных кислот, в частности, пальмитата. Механизмы действия ПК на переносчики, активируемые аминами, различны. Можно предполагать, что переносчик Т1 стимулируется связыванием анионов ПК на его строма!!ьном участке. Переносчик Т2 имеет более низкое сродство к аминам, чем Т1, но ПК увеличивает сродство Т2 к метиламину и имидазолу, действуя на люменальную часть Т2. Пора ТЗ индуцируется осмотическим градиентом и ингибируется ПК.

Исследования показали, что мягкое (эндогенное) разобщение с участием СЖК, характерное для митохондрий, в хлоропластах может осуществляться с участием переносчика Т1, активируемого аммонийными катионами. Скорее всего, переносчик Т1 служит для

Пальмитат, мкМ

Рис. 12. Действие пальмитата на скорость базального переноса электронов при рН 7,8 и 6,5.

Т1

Т2

Пора

н+

Люмен

№1+

ионы

Рис. 13. Предполагаемая схема разобщения в тилакоидах, активируемого повышением концентрации Ш*-катионов аммония, метиламина или имидазола.

оптимизации процессов энергетического сопряжения при работе полной ЭТЦ в присутствии аммония. Т1 активируется аммонием при концентрациях, характерных для стромы нативных хлоропласгов. Ограниченное снижение градиента рН, обеспечиваемое этим переносчиком в отсутствие ПК, сопровождается стимуляцией синтеза А'ГФ и переноса электронов. Т1 транспортирует скорее Н4", чем катионы аминов, т. к. максимальная скорость утечки через Т1 в отсутствие ПК явным образом не зависит от природы амина. Возможно Т1 - это АТФ/АДФ антипортер. В тилакоидной мембране находится определённое количество насыщенных СЖК, связанных с антипортером, которые невозможно удалить БСА. Выделенные хлоропласты не содержат аммония, так как он легко теряется во время выделения. Аммоний (0,2 - 0,4 мМ), добавленный в реакционную среду, связывается с люмена^ьной частью АТФ/АДФ антипортера и активируют его, увеличивая локальный электрический по тенциал - транслоказа начинает переносить анионы СЖК в люмен. Последующий перенос нейтральной молекулы СЖК в строму осуществляется без участия антипортера по механизму флип-флоп переходов (рис. 13). Добавление СЖК на фоне аммония стимулирует АТФ/АДФ антипортер, и приводит к усилению разобщения-таким образом, аммоний и СЖК действуют синергично.

Понижение рН среды, вероятно, вызывает протонирование тех же карбоксилов люмена, которые связывают аммоний, что способствует активации АТФ/АДФ антипортера.

Переносчик Т2 активируется более высокими концентрациями аммонийных катионов, чем Т1. Он предотвращает токсическое действие аммония при повышении его концентрации в строме. В сумме, Т1 и Т2 обеспечивают полное аммонийное разобщение хлоропласта« даже в отсутствие СЖК. Если амин имеет низкое сродство к Т2 или утечка через Т2 чем-то блокиро-

вала, осмотическое давление внутри тилакоида может быть выше, чем снаружи, что приведет к индукции пор. Сброс всех ионных градиентов через поры предотвращает набухание тила-коидов, из люмена при этом могут выходить небольшие полипептиды ФСН, пластоцианин и продукты пептидаз, осуществляющих деградацию и удаляющих прекурсоры белков, синтезированных в цитозоле.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что диссипация градиента рН на тилакоидных мембранах в присутствии аммония (или имидазола) обусловлена активацией двух видов утечки из люмена протонов или катионов амина.

2. На основании полученных результатов сделан вывод, что оба вида утечек активируются связыванием катионов аминов на люменальиой стороне мембраны. Аммоний и катионы имидазола имеют в 8 -10 раз большее сродство к центрам связывания с мембранным компонентом, активирующим первый вид утечки, чем катионы метиламина.

3. С помощью конфокальной микроскопии показано, что разобщение гидрофильными аминами в среде, содержащей сахарозу, не сопровождается заметным изменением объема ти-лакоидной системы хлоропласте» гороха

4. Впервые зарегистрировано в присутствии высоких концентраций метиламина образование неспецифических мембранных пор, проницаемых для ионов и флуоресцентного красителя сульфородамина Б, не проникающего сквозь липидный бислой.

5. Обнаружены новые явления - синергитические эффекты в разобщении фотосинтетических реакций: аммонием и пальмитиновой, стеариновой, миристиновой кислотами; имидазолом и, в меньшей степени, метиламином и пальмитиновой кислотой; липофильными аминами и протонофором СССР.

6. Показано, что пальмитиновая кислота стимулирует угечку первого вида, активированную аммонием или имидазолом, без изменения сродства мембранного компонента к этим аминам; и утечку второго вида за счет увеличения сродства мембранного компонента к метиламину и имидазолу. На основании полученных результатов предполагается, что в первом случае пальмитиновая кислота взаимодействует с центрами на стромальной стороне мембраны, а во втором - на люмснальной стороне. Снижая осмотическое давление в люмене, пальмитиновая кислота ингибирует образование мембранных пор.

7. Обнаружено, что при снижении рН среды десопряжение пальмигатом сменяется разобщением и пропадает синергизм действия аммония, имидазола и метиламина с пальмитиновой кислотой. Это дает возможность предположить участие АТФ/АДФ антипортера в разобщении низкими концентрациями аминов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи

I.0панасенко В.К., Васюхина Л А. (2009) Синергизм действия аммония и пальмитиновой кислоты в разобщении переноса электронов и синтеза АТФ. Биохимия 74, N» 6 791 -796.

2,Опанасенко В.К., Васюхина Л.А.. Найдов И. А. (2010) Два вида аммонийного разобщения в хлоропластах гороха. Биохимия, 75, № 6,887 - 895.

З.Опанасенко В.К., Васюхина Л.А. (2009) Индукция эндогенного разобщения в хлоропластах: синергизм действия аммонийных катионов и СЖК. Сборник статей Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», (Пущино), стр 684 -689.

4,Опанасенко В.К., Найдов И.А., Васюхина Л.А. (2011) Индукция неспецифических пор в талакоидных мембранах хлоропластов. Сборник статей Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», (Пущино), стр. 804 - 809.

Тезисы

5. Vera Opanasenko and Lilia Vasvukcina. (2006) The ion conductivity in PS 11 induced by the gradients of monovalent cations. International meeting «Photosynthesis in the post-genomic era: structure and Junction ofphotosystems» (Pushchino) p. 176.

6. Васюхина Л. А.. Опанасенко B.K. (2007) Ионная проводимость в комплексе с ФСП в хлоропластах. Тезисы докладов 11-ой международной Пущияской школы-конференг/ии молодых учёных" Биология-наука XXI века" (Пущино), стр. 6-7.

7. Опанасенко В.К, Васюхина Л.А. (2008) Активация аммонийного разобщения в хлоропластах. Тезисы докладов Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 224 - 226.

8. Vera Opanasenko, Lilia Vasvukhina. (2008) The regulation of ammonium uncoupling in chloroplast. International Conference «Light Energy Conversion in Photosynthesis» (Pushchino), p. 81.

9. Lilia Vasvukhina. Vera Opanasenko. (2008) Synergism in action of ammonium and palmitic in uncoupling of chloroplast thylakoids. International Conference «Light Energy Conversion in Photosynthesis» (Pushchino), p, 113.

10. Васюхина Л.А.. Опанасенко B.K. (2008) Синергизм в действии аминов и жирных кислот на разобщение электронного транспорта и синтеза АТФ. Тезисы докладов 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущиио), стр. 170.

II. Опанасенко В.К., Васюхина Л.А. (2009) Эндогенное разобщение в хлоропластах: синергизм действия аммонийных катионов и свободных жирных кислот. Тезисы докладов Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», посвященная 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева (Пущино), стр. 46 -47.

12. Васюхина Л.А.. Опанасенко В.К. (2009) Влияние гидрофильных аминов и свободных жирных кислот на энергетику хлоропластов. Тезисы докладов 13-ой Международной Пущинской школы- конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино), стр. 134-135.

Подписано в печать:

19.10.2011

Заказ № 6067 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wvvw.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васюхина, Лилия Александровна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературных данных.

2.1. Действие аммония на процессы трансформации энергии в тилакоидах.

2.1.1. «Классическое» разобщение электронного транспорта и синтеза АТФ.

2.1.2. Стимуляция синтеза АТФ аммонием и другими гидрофильными аминами.

2.2. Транспортные системы и транспортёры на тилакоидной мембране хлоропластов и аммонийные трансортёры.

2.2.1. Н*- канал в СБо АТФ-синтазы.

2.2.2. К+каналы/транспортёры.

2.2.3. Транспортные системы, переносящие белки.

2.2.4. Аммонийные танспортёры?.

2.3. Возможность симпорта аммония с анионами слабых кислот.

2.3.1. Разобщающее действие СЖК в хлоропластах и митохондриях.

2.3.2. Разобщающее действие СССР.

2.3.3. Разобщение с участием нейтральных пар, образованных липофильными анионами и катионами.

3. Объект и методы исследования.

3.1. Выделение тилакоидной системы хлоропластов из листьев гороха.

3.2. Исследование функций тилакоидной системы.

3.2.1. Определение скорости фотофосфорилирования.

3.2.2. Измерение реакций базального транспорта электронов.

3.2.3. Измерение величины светоиндуцированного поглощения протонов.

3.3. Исследование распределения флуоресценции сульфородамина Б в хл opon ластах с помощью конфокальной микроскопии.

3.4. Приготовление препаратов из хлоропластов Peperomia caperata для конфокальной микроскопии.

4. Результаты.

4.1. Исследование действия аммония в сопоставлении с действием других аминов.

4.1.1. Два вида аммгнийного разобщения.

4.1.2. Разобщение энергетики хлоропластов гидрофильными аминами.

4.1.3. Разобщение липофильными аминами.

4.2. Влияние СЖК и СССР на разобщение аминами.

4.2.1. Синергизм действия аммония и пальмитиновой кислоты.

4.2.2. Влияние СЖК с разной длиной углеводородной цепи на разобщение аммонием.

4.2.3. Пальмитиновая кислота стимулирует разобщение, индуцируемое имидазолом и метиламином.

4.2.4. Синергизм действия липофильных аминов и СССР и его отличие от синергизма гидрофильных аминов и пальмитат.

4.2.5. Особенности разобщения пальмитиновой кислотой при рН 6,5.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности аммонийного разобщения фотосинтетических реакций в тилакоидных мембранах хлоропластов"

Фотосинтез - важнейший процесс, обеспечивающий существование биосферы Земли. Преобразование энергии солнечного света в энергию химических связей стабильных продуктов световой стадии фотосинтеза - АТФ и НАДФН, происходит в тилакоидах хлоропластов растений и водорослей. Поглощение хлорофиллом квантов света обеспечивает энергией перенос электронов от воды к НАДФ вдоль цепи переносчиков двух фотосистем. Энергия тратится на образование НАДФН и формирование трансмембранного электрохимического потенциала Н+ (в основном - в виде градиента рН), который используется для синтеза АТФ.

В центре внимания биоэнергетиков находятся проблемы переноса электронов в реакционных центрах и комплексах фотосистем I и II, между фотосистемами и в цитохромном комплексе b(Jí, а также механизм работы АТФ-синтазного комплекса. В этих областях достигнуты высокие результаты.

При переходе от модельных систем к хлоропластам in vivo особое значение приобретают исследования регуляции сопряжения переноса электронов и синтеза АТФ, которым, на наш взгляд, сейчас уделяется недостаточно внимания. Так, к настоящему времени найдено большое количество искусственных разобщителей сопряжения, но вопрос о том, возможно ли эндогенное разобщение фотосинтетических реакций в живой клетке до сих пор остается открытым. Анализ литературы показывает, что в качестве эндогенных разобщителей могут рассматриваться только аммоний и насыщенные свободные жирные кислоты.

Аммоний обычно не считают эндогенным регулятором энергетического сопряжения в тилакоидах - он легко теряется в процессе выделения, так как нейтральная форма этого амина, аммиак, свободно диффундирует сквозь клеточные мембраны. Содержание аммония в цитоплазме нативной клетки долгое время считалось малым - несколько мкМ. Однако для поддержания активного синтеза аминокислот концентрация аммония в строме хлоропласта должна быть не менее 100 мкМ, поскольку аммоний является субстратом глютамин син-тетаз, ключевых ферментов метаболизма азота. Известно, что хлоро-пласты содержат до 60% глютамин синтетаз листа и значения Km(NH4+) для этих синтетаз находятся в области 0,1 - 0,6 мМ (Пушкин и др., 1983; Husted et al., 2000; Hill et al., 2002). Действительно, современные определения концентрации аммония в водной фазе апоп-ласта и в ткани листа дают значения 0,5 - 1,0 мМ (Husted et al., 2000; Husted et al., 2000; Hill et al., 2002).

В опытах на изолированных тилакоидах выявлены два эффекта аммония: в низких концентрациях (0,2 - 0,4 мМ) он стимулирует синтез АТФ, катализируемый переносом электронов от воды к акцепторам ФС1 (Giersch, 1981; Pick and Weiss, 1988), а в высоких концентрациях (5-10 мМ) действует как классический разобщитель, то есть устраняет трансмембранный градиент pH. Механизмы этих эффектов неясны, но оба они, вероятно, связаны с изменением проводимости мембраны для аммония или КГ. Эти вопросы, насколько нам известно, до сих пор специально не исследовались. Неизвестны так же механизмы влияния СЖК на энергетическое сопряжение в хлоропластах. Показано, что насыщенные СЖК в низких концентрациях могут вызывать «десопряжение», то есть ингибирование синтеза АТФ без снижения электрохимического градиента Yf (Pick and Weiss, 1988; Rottenberg, 1990). Ненасыщенные СЖК такой способностью не обладают, но в высоких концентрациях они могут ингибировать перенос электронов (Warden and Csatorday, 1987).

В митохондриях аммоний не вызывает разобщения, так как в этих органеллах электрохимический градиент существует, преимущественно, в виде электрического потенциала на внутренней мембране. Насыщенные длинноцепочечные СЖК в низких концентрациях (20 - 40 мкМ) вызывают «мягкое» разобщение энергетики митохондрий (Rottenberg, 1990). При этом установлено, что анионы СЖК не способные проникать через мембрану, транспортируются белками: АТФ/АДФ транслокатором и целым семейством разобщающих белков (UCP) (Andreyev etal., 1988; Skulachev, 1991; Skulachev, 1998; Sluse et al., 2006). Утечка H+ прекращается, когда избыток СЖК ка-таболизируется в матриксе или окисляется переносчиками ЭТЦ митохондрий. Предполагается, что это разобщение играет центральную роль в защите органелл от активных форм кислорода, образующихся при торможении транспорта электронов по ЭТЦ в результате исчерпания АДФ (Skulachev, 1991; Skulachev, 1998).

Целью настоящей работы было изучение действия аммония на процессы трансформации энергии в условиях, близких к условиям в растительной клетке, то есть при том же осмотическом давлении, солевом составе среды и в присутствие СЖК.

Были поставлены следующие задачи:

2. Выяснение механизма разобщения высокими концентрациями аммония (1-5 мМ).

3. Исследование совместного действия аммония и СЖК.

4. Поиск ингибиторов и стимуляторов аммонийного разобщения.

Научная новизна работы. Впервые выявлена двухфазность аммонийного разобщения для всех процессов, связанных с величиной градиента рН - синтеза АТФ, светоиндуцированного поглощения 1гГ и базального переноса электронов. Первая фаза наблюдается в области низких концентраций аммония (Кх 40 - 100 мкМ), вторая фаза соответствует классическому разобщению (К2 1-2 мМ). Обе фазы прослеживаются и на концентрационных кривых других гидрофильных аминов. Показано, что для индукции фаз необходимо связывание катионов аминов с центрами, расположенными на люменальной стороне мембраны. Сродство аммония и катионов имидазола к центрам связывания оказалось высоким и практически одинаковым, в то время как сродство метиламмония было ниже в 8 - 10 раз.

С помощью конфокальной микроскопии показано, что осмотические градиенты ионов, возникающие на мембранах при высоких концентрациях аминов, могут вызывать третью фазу разобщения - открытие неспецифических пор, проницаемых для больших молекул флуоресцентного красителя сульфородамина Б. Впервые продемонстрировано, что индукция всех фаз разобщения происходит без заметного набухания тилакоидов.

Найден синергизм действия аминов и пальмитиновой кислоты при рН среды 7,8. При понижении рН среды до 6,5 синергетичное действие аминов и ПК снижается, но при этом активируется разобщение пальмитиновой кислотой, отсутствующее при рН 7,8.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах регуляции процессов трансформации энергии в фотосинтезирующей клетке, дают возможность поиска новых эндогенных ингибиторов и активаторов биоэнергетики хлоропластов. Они важны для разработки путей направленной регуляции фотосинтеза. Материалы диссертации могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биоэнергетике, биохимии и физиологии растений.

2. Обзор литературы

Работа посвящена выяснению механизмов разобщения, индуцируемого аммонием, поэтому в обзоре литературы рассмотрены три вопроса:

• Действие аммония на процессы трансформации энергии в тилакои-дах.

• Возможность участия в аммонийном разобщении известных каналов тилакоидной мембраны и аммонийных транспортёров, показанных на плазматических мембранах и тонопласте.

• Действие жирных кислот на энергетику сопрягающих мембран митохондрий и хлоропластов; возможность разобщения с участием нейтральных пар между анионами жирных кислот и катионами аминов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Васюхина, Лилия Александровна

6. Выводы

1. Показано, что диссипация градиента рН на тилакоидных мембранах в присутствии аммония, имидазола и метиламина обусловлена активацией двух видов утечки из люмена протонов или катионов амина.

2. На основании полученных результатов сделан вывод, что оба вида утечек активируются связыванием катионов аминов на люменаль-ной стороне мембраны. Аммоний и катионы имидазола имеют в 8-10 раз большее сродство к центрам связывания с мембранным компонентом, активирующим первый вид утечки, чем катионы метиламина.

3. С помощью конфокальной микроскопии показано, что разобщение гидрофильными аминами в среде, содержащей сахарозу, не сопровождается заметным изменением объема тилакоидной системы хлоропластов гороха.

4. Впервые зарегистрировано в присутствии высоких концентраций метиламина образование неспецифических мембранных пор, проницаемых для ионов и флуоресцентного красителя сульфородами-на Б, не проникающего сквозь липидный бислой.

5. Обнаружены новые явления - синергетические эффекты в разобщении фотосинтетических реакций: аммонием и пальмитиновой, стеариновой, миристиновой кислотами; имидазолом и, в меньшей степени, метиламином и пальмитиновой кислотой; липофильными аминами и протонофором СССР.

6. Показано, что пальмитиновая кислота стимулирует утечку первого вида, активированную аммонием или имидазолом, без изменения сродства мембранного компонента к этим аминам; и утечку второго вида за счёт увеличения сродства мембранного компонента к метиламину и имидазолу. На основании полученных результатов предполагается, что в первом случае пальмитиновая кислота взаимодействует с центрами на стромальной стороне мембраны, а во втором - на люменальной стороне. Снижая осмотическое давление в люмене, пальмитиновая кислота ингибирует образование мембранных пор.

7. Обнаружено, что при снижении рН среды десопряжение пальмита-том сменяется разобщением и пропадает синергизм в действии аммония, имидазола, метиламина и пальмитиновой кислоты. Это даёт возможность предположить участие АДФ/АТФ антипортера в разобщении низкими концентрациями аминов.

5. Заключение

Данные настоящей работы показывают, что система аммонийного разобщения хлоропластов может быть представлена как набор из двух специфических переносчиков (Т1, Т2), активируемых повышением концентрации катионов аминов в люмене тилакоида, и поры (ТЗ), проницаемой для таких крупных молекул, как сульфородамин Б.

Система разобщения регулируется низкими концентрациями свободных жирных кислот, в частности, пальмитатом. Механизмы действия ПК на переносчики, активируемые аминами, различны. Можно предполагать, что переносчик Т1 стимулируется связыванием анионов ПК на его стромальном участке. Переносчик Т2 имеет более низкое сродство к аминам, чем Т1, но ПК увеличивает сродство Т2 к метиламину и имидазолу, действуя на люменальную часть Т2. Пора ТЗ индуцируется осмотическим градиентом и ингибируется ПК.

Исследования показали, что «мягкое» (эндогенное) разобщение с участием СЖК, характерное для митохондрий, в хлоропластах может осуществляться с участием переносчика Т1, активируемого аммонийными катионами. Скорее всего, переносчик Т1 служит для оптимизации процессов энергетического сопряжения при работе полной ЭТЦ в присутствии аммония. Т1 активируется аммонием при концентрациях, характерных для стромы нативных хлоропластов. Ограниченное снижение градиента рН, обеспечиваемое этим переносчиком в отсутствие ПК, сопровождается стимуляцией синтеза АТФ и переноса электронов. Т1 транспортирует скорее Н\ чем катионы аминов, так как максимальная скорость утечки через Т1 в отсутствие ПК явным образом не зависит от природы амина. Возможно Т1 - это АДФ/АТФ антипортер. В тилакоидной мембране находится определённое количество насыщенных СЖК, связанных с антипортером на его стромальной стороне, которые невозможно удалить БСА. Выделенные хлоропласты не содержат аммония, так как он легко теряется во время выделения. Аммоний (0,2 - 0,4 мМ), добавленный в реакционную среду, связывается с люменальной частью АДФ/АТФ антипортера и активируют его, увеличивая локальный электрический потенциал - транслоказа начинает переносить анионы СЖК в люмен. Последующий перенос нейтральной молекулы СЖК в строму осуществляется без участия антипортера по механизму флип-флоп переходов (рис. 26). Добавление СЖК на фоне аммония стимулирует АДФ/АТФ антипортер, и приводит к усилению разобщения - таким образом, аммоний и СЖК действуют синергично.

Понижение рН среды, вероятно, вызывает протонирование тех же карбоксилов люмена, которые связывают аммоний, что способствует активации АДФ/АТФ антипортера.

Переносчик Т2 активируется более высокими концентрациями

Рис. 26. Предполагаемая схема разобщения в тилакоидах, активируемого повышением концентрации катионов 1ЧН+ - аммония, метиламина или ими-дазола. 811 - сульфородамин Б.

Т1

Т2

Пора

Н+ аммонийных катионов, чем Т1. Он предотвращает токсичное действие аммония при повышении его концентрации в строме. В сумме, Т1 и Т2 обеспечивают полное аммонийное разобщение хлоропластов даже в отсутствие СЖК. Если амин имеет низкое сродство к Т2 или утечка через Т2 чем-то блокирована, осмотическое давление внутри тилакои-да может быть выше, чем снаружи, что приведет к индукции пор. Сброс всех ионных градиентов через поры предотвращает набухание тилакоидов, из люмена при этом могут выходить небольшие полипептиды ФСП, пластоцианин и продукты пептидаз, осуществляющих деградацию и удаляющих прекурсоры белков, синтезированных в цитозоле.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васюхина, Лилия Александровна, Пущино

1. Андреев A.A., Волков Н.И., Мохова E.H., Скулачёв В.П. (1987) Подавление карбоксиатрактилатом и аденозиндифосфатом разобщающего действия пальмитата на митохондриях скелетных мышц. Биол. Мембраны, 4, 474-478.

2. Антонов В.Ф., Владимиров Ю.А., Россель А.Н., Коркина Л.Г., Корепанова Е.А., Трухманова К.И. (1973) Влияние продуктов пе-рекисного окисления ненасыщенных жирных кислот на транспорт ионов через бислойные фосфолипидные мембраны. Биофизика, 18, 668-673.

3. Барский Е.Л., Губанова О.Н., Самуилов В.Д. (1991) Ингибирова-ние фотосинтетического переноса электронов в хлоропластах м-хлоркарбонилцианидфенилгидразоном. Биохимия, 56, 434-438.

4. Мохова E.H., Хайлова Л.С. (2005) Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот. Биохимия, 70, 197-201.

5. Опанасенко В.К., Губанова О.Н., Агафонов A.B. (1995а) Проблема измерения трнасмембранного градиента pH в присутствии ли-пофильных аминов. Биохимия, 60, 917-924.

6. Опанасенко В.К., Семёнова Г.А., Агафонов A.B. (1995b) Образование сетевидных мембранных структур при энергизации хлоро-пластов в присутствии локальных анестетиков. Биохимия, 60, 2053-2057.

7. Опанасенко В.К., Семёнова Г.А., Агафонов A.B., Губанова О.Н. (1996) Действие АрН-индикаторов нейтрального красного и 9-аминоакридина на ультроструктуру хлоропластов. Биохимия, 61, 1526-1532.

8. Опанасенко В.К., Васюхина JI.A. (2009) Синергизм действия аммония и пальмитиновой кислоты в разобщении переноса электронов и синтеза АТР на хлоропластах. Биохимия, 74, 719-796.

9. Опанасенко В.К., Васюхина JI.A., Найдов И.А. (2010) Два вида аммонйного разобщения в хлолрпластах гороха. Биохимия, 75, 887-895.

10. Пушкин A.B., Соловьёв H.A., Акентьев Н.П., Евстигнеева З.Г., Кретович B.JI. (1983) Кинетические характеристики глутамин-синтетазы хлоропластов листьев гороха. Биохимия, 48, 13001304.

11. Скулачев В.П. (1969) Аккумуляция энергии в клетке, 141-162. Москва «Наука».

12. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран, 564565. Москва «Наука».

13. Тихонов А.Н., Блюменфельд JI.A. (1985) Концентрация водородных ионов в субклеточных частицах: физический смысл и методы определения. Биофизика, 30, 527-537.

14. Цофина Л.М., Выгодина Т.В. (1988) Действие пальмитиновой кислоты на мембранный потенциал митохондрий и протеолипо-сом с цитохром с-оксидазой. Виол. Мембраны, 5, 156-161.

15. Abdel-Ghany S.E, Mtiller-Moule P., Niyogi K.K., Pilon M., Shikanai T. (2005) Two P-type ATPases are required for copper delivery in Arabidopsis thaliana chloroplasts. Plant Cell, 17, 1233-1251.

16. Abrahams J., Leslie A., Lutter R., Walker J. (1994) Structure at 2.8 A resolution of Fi-ATPase from bovine heart mitochondria. Nature, 370, 621-628.

17. Ahmed I., Krishnamoorthy G. (1990) Enhancement of transmembrane proton conductivity of protonophores by membrane-permeant cations. Biochim. Biophys. Acta, 1024, 298-306.

18. Aksimentiev A., Balabin I.A., Fillingame R.H., Schulten K. (2004) Insights into the molecular mechanism of rotation in the F0 sector of ATP synthase. Biophysical J., 86, 1332-1344.

19. Aldridge C., Cain P., Robinson C. (2009) Protein transport in organelles: Protein transport into and across the thylakoid membrane. FEBS Lett., 276, 1177-1186.

20. Allen S., Raven J.A. (1987) Intracellular pH regulation in Ricinus communis grown with ammonium or nitrate as N sources: the role of long-distance transport. J. Exp. Bot., 38, 580-596.

21. Allen G.J., Amtmann A., Sanders D. (1998) Calciumdependent and calcium-independent K+ mobilization channels in Vicia faba guard cell vacuoles. J. Exp. Bot., 49, 305-318.

22. Allnutt F.C.T., Ewy R., Renganathan M., Pan R.S., Dilley R.A. (1991) Nigericin and hexylamine effects on localized proton gradients in thy-lakoids. Biochim. Biophys. Acta, 1059, 28-36.

23. Anderson J.A., Huprikar S.S., Kochian L.V., Lucas W.J., Gaber R.F. (1992) Functional expression of a probable Arabidopsis thaliana potassium channel in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3736-3740.

24. Andreyev A.Yu., Bondareva T.O., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Volkov N.I. (1988) Carboxyatractylate inhibits the uncoupling effect of fatty acids. FEBS Lett., 226, 265-269.

25. Andreyev A.Yu., Bondareva T.O., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Tsofina L.M., Volkov N.I., Vygodina T.V. (1989) The ATP/ADP-antiporter is involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria. Eur. J. Biochem., 182, 585-592.

26. Angeles Martinez-Cordero M., Martinez V., Rubio F. (2005) High affinity K+ uptake in pepper plants. J. Exp. Botany, 56, 1553-1562.

27. Angevine C.M., Fillingame R.H. (2003) Aqueous access channels in subunit a of rotary ATP synthase. J. Biol. Chem., 278, 6066-6074.

28. Armengaud P., Breitling R., Amtmann A. (2004) The potassium-dependent transcriptome of Arabidopsis reveals a prominent role of jasmonic acid in nutrient signaling. Plant Physiol., 136, 2556-2576.

29. Armstrong C.M., Hille B. (1998) Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron, 20, 371-380.

30. Arnon D.J. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Poly-phenoloxidase in beta vulgaris. Plant Physiol., 24, 1-15.

31. Bakeeva L.E., Grinius L.L., Jasaitis A.A., Kuliene V.V., Levitsky D.O., Liberman E.A., Severina I.I., Skulachev V.P. (1970) Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IE Intact mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 216, 13-21.

32. Barstad A.W., Peyton D.H., Smejtek P. (1993) AHA-heterodimer of a class-2 uncoupler: pentachlorophenol. Biochim. Biophys. Acta, 1140, 262-270.

33. Bauerle C., Keegstra K. (1991) Full-length plastoeyanin precursor is translocated across isolated thylakoid membranes. J. Biol. Chem., 266, 5876-5883.

34. Beard W.A., Dilley R.A. (1988a) ATP formation onset lag and postillumination phosphorylation initiated with single-turnover flashes. I. An assay using luciferin-luciferase luminescence. J. Bioenerg. Biomembr., 20(1), 85-106.

35. Bernai M., Testillano P.S., Alfonso M., del Carmen Risueco M., Pi-corel R., Yruela I. (2007) Identification and subcellular localization of the soybean copper PIB-ATPase GmHMA8 transporter. J. Struct. Biol, 158, 46-58.

36. Berthomieu P., Conejero G., Nublat A., Brackenbury W.J., Lambert C. (2003) Functional analysis of AtHKTl in Arabidopsis showsthat Na+ recirculation by the phloem is crucial for salt tolerance. EMBOJ., 22, 2004-2014.

37. Bihler H., Eing C., Hebeisen S., Roller A., Czempinski K., Bertl A. (2005) TPK1 is a vacuolar ion channel different from the slow-vacuolar cation channel. Plant Physiol., 139, 417-424.

38. Blok M.C., De Gier J., van Deenen L.L.M. (1974) Some factors affecting the valinomycin-induced leak from liposomes. Biochim. Bio-phys. Acta, 367, 202-209.

39. Booij P.P., Roberts M.R., Vogelzang S.A., Kraayenhof R., de Boer A.H. (1999) 14-3-3 proteins double the number of outward-rectifying K+ channels available for activation in tomato cells. Plant J., 20, 673683.

40. Boss O., Muzzin P., Giacobino J.P. (1998) The uncoupling proteins: a review. Eur. J. Endocrin., 139, 1-9.

41. Brand M.D., Estevas T.C. (2005) Physiological functions of the mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3. Cell Metab., 2, 8593.

42. Cha A., Snyder G.E., Selvin P.R., Bezanilla F. (1999) Atomic scale movement of the voltage-sensing region in a potassium channel measured via spectroscopy. Nature, 402, 809-813.

43. Chanda B., Asamoah O.K., Blunck R., Roux B., Bezanilla F. (2005) Gating charge displacement in voltagegated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature, 436, 852-856.

44. Clayton R.K. (1980) Photosynthesis. Physical mechanisms and chemical patterns. Cambridge university press.

45. Cline K., Ettinger W.F., Theg S.M. (1992) Proteinspecific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. J. Biol. Chem., 267, 2688-2696.

46. Cline K., Henry R., Li C., Yuan J. (1993) Multiple pathways for protein transport into or across the thylakoid membrane. EMBO J, 12, 4105—4114.

47. Cline K., Mori H. (2001) Thylakoid delta pH-dependent precursor proteins bind to a cpTatC-Hcfl06 complex before Tha4-dependent transport. J. Cell. Biol., 154, 719-729.

48. Creighton A.M., Hulford A., Mant A., Robinson D., Robinson C. (1995) A monomeric, tightly folded stromal intermediate on the delta pH-dependent thylakoidal protein transport pathway. J. Biol. Chem., 270, 1663-1669.

49. Czempinski K., Zimmermann S., Ehrhardt T., Miiller-Rober B. (1997) New structure and function in plant K+ channels: KCOl, an outward rectifier with a steep Ca2+ dependency. EMBOJ., 16, 2565-2575.

50. Czempinski K., Gaedeke N., Zimmermann S., Miiller-Rober B. (1999) Molecular mechanisms and regulation of plant ion channels. J. Exp. Bot., 50, 955-966.

51. Czempinski K., Frachisse J.M., Maurel C., Barbier-Brygoo H., Miieller-Roeber B. (2002) Vacuolar membrane localization of the Arabidopsis 'two-pore' K+ channel KCOl. Plant J., 29, 809-820.

52. Dabadie P., Bendriss P., Erny P., Mazat J.-P. (1987) Uncoupling effects of local anesthetics on rat liver mitochondria. FEBS Lett., 226, 77-82.

53. Dabney-Smith C., Mori H., Cline K. (2006) Oligomers of Tha4 organize at the thylakoid Tat translocase during protein transport. J. Biol. Chem., 281, 5476-5483.

54. De Angeli A., Monachello D., Ephritikhine G., Frachisse J.M., Thomine S., Gambale F., Barbier-Brygoo H. (2009) CLC-mediated anion transport in plant cells. Philos. Trans. R. Soc. Lond, B, Biol. ScL, 364, 195-201.

55. De Benedetti E., Garlaschi F.M. (1977) On the estimation of proton gradient and osmotic volume in chloroplast membranes. J. Bioenerg. Biomembr., 9, 195-201.

56. Dedukhova V.J., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Starkov A.A., Ar-rigoni-Martelli E., Bobyleva V.A. (1991) Uncoupling effect of fatty acids on heart muscle mitochondria and submitochondrial particles. FEBS Lett., 295, 51-54.

57. Diehl A.M., Hoek J.B. (1999) Mitochondrial uncoupling: role of uncoupling protein anion carriers and relationship to thermogenesis andweight control "The benefits of losing controF. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 493-506.

58. De Kiewiet D.Y., Hall D.O., Jenner E.L. (1965) Effect of carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone on the photochemical reactions of isolated chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 109, 284-292.

59. De Kouchkovsky Y., Haraux F., Sigalat C.A. (1984) Microchemios-motic interpretation of energy-dependent processes in biomembranes based on the photosynthetic behavior of thylacoids. Bioelectrochemis-try and Bioenergetics, 13, 143-162.

60. Dilley R.A., Theg S.M., Beard W.A. (1987) Membrane-proton interactions in chloroplast bioenergetics: localized proton domains. Ann. Rev. Plant Physiol., 38, 347-389.

61. Dilley R.A. (2004) On why thylakoids energize ATF formation using either delocalized or localized proton gradient a Ca mediated role in thylakoid. Photosynth. Res., 80, 245-263.

62. Dmitriev O., Jones P.C., Fillingame R.H. (1999) Structure of the subunit c oligomer in the FiF0 ATP synthase: model derived from solution structure of the monomer and cross-linking in the native enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7785-7790.

63. Enz C., Steinkamp T., Wagner R. (1993) Ion channels in the thylakoid membrane (a patch clamp study). Biochim. Biophys. Acta, 1143, 6776.

64. Ettinger W.F., Clear A.M., Fanning K.J., Lou Peck M. (1999) Identification of Ca2+/H+ antiporter in plant chloroplast thylakoid membrane. Plant Physiol., 119, 1379-1385.

65. Fang Z., Mi F., Berkowitz G.A. (1995) Molecular and physiological analysis of a thylakoid K+ channel protein. Plant Physiol., 108, 17251734.

66. Fillingame R.H., Jiang W., Dmitriev O.Y. (2000) The oligomeric subunit c rotor in the F0 sector of ATP synthase: unresolved questions in our understanding of function. J. Bioener. Biomem., 32, 433—439.

67. Fillingame R.H., Angevine C.M., Dmitriev O.Y. (2002) Coupling proton movements to c-ring rotation in FiF0 ATP synthase: aqueous access channels and helix rotations at the a-c interface. Biochim. Bio-phys. Acta., 1555, 29-36.

68. Finnemann J., Schjoerring J.K. (1999) Translocation of NH/ in oilseed rape plants in relation to glutamine synthetase isogene expression and activity. Physiol. Plantarum, 105, 469-477.

69. Foster M., McLaughlin S. (1974) Complex between uncouplers of oxidative phosphorylation. J. Membr. Biol., 17, 155-180.

70. Fukuda A., Nakamura A., Tagiri A., Tanaka H., Miyao A., Hirochika H., Tanaka Y. (2004) Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter from rice. Plant Cell Physiol., 45, 146-159.

71. Garlid K.D., Nakashima R.A. (1983) Studies on the mechanism of uncoupling by amine local anesthetics. J. Biol. Chem., 258, 7974-7980.

72. Garlid K.D., Jaburek M., Jezek P. (1998) The mechanism of proton transport mediated by mitochondrial uncoupling proteins. FEBS Lett., 438, 10-14.

73. Garlid K.D., Jaburek M., Jezek P., Varecha M. (2000) How do uncoupling proteins uncouple? Biochim. Biophys. Acta, 1459, 383-389.

74. Giersch C. (1981) Stimulation of photophosphorylation by low concentrations of uncoupling amines. Biochem. Biophys. Res. Com., 100(2), 666-674.

75. Giersch C. (1982) Photophosphorylation by chloroplasts: effects of low concentrations of ammonia and methylamine. Z Naturforsch., 37, 242-250.

76. Gierth M., Mâser P., Schroeder J.I. (2005) The potassium transporter AtHAK5 functions in K+ deprivation-induced high affinity K+ uptake and AKT1 K+ channel contribution to K+ uptake kinetics in Arabidop-sis roots. Plant Physiol., 137, 1105-1114.

77. Gierth M., Mâser P. (2007) Potassium transporters in plants Involvement in K+ acquisition, redistribution and homeostasis. FEBS Lett., 581, 2348-2356.

78. Girvin M.E., Rastogi V.K., Abildgaard F., Markley J.L, Fillingame R.H. (1998) Solution structure of the transmembrane H^-transporting subunit c of the FiF0 ATP synthase. Biochemistry, 37, 8817-8824.

79. Gong J.M., Waner D.A., Horie T., Li S.L., Horie R. (2004) Microar-ray based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101, 15404-15409.

80. Good N.E. (1960) Activation of the Hill reaction by amines. Biochim. Biophys. Acta, 40, 502-517.

81. Groth G. (2000) Molecular models of structural arrangement of sub-units and mechanism of proton translocation in the membrane domain. Biochim. Biophys. Acta., 1458, 417-427.

82. Gutknecht J. (1987a) Proton conductance trough phospholipid bilay-ers: water wires or weak acids? J. Bioenerg. Biomembr., 19, 427-442.

83. Gutknecht J. (1987b) Proton/hydroxide conductance trough phospholipid membranes: effect of phytonic acid. Biochim. Biophys. Acta, 898, 97-108.

84. Halpin C., Elderfield P.D., James H.E., Zimmermann R., Dunbar B., Robinson C. (1989) The reaction specificities of the thylakoidal processing peptidase and Escherichia coli leader peptidase are identical. EMBOJ., 8, 3917-3921.

85. Hanssum B., Renger G., Weiss W. (1985) On the mechanism of ADRY agent interaction with Photosystem II donor side. Biochim. Bi-ophys. Acta, 806, 210-220.

86. Haraux F. (1985) Localized or delocalized protons and ATP synthesis in biomembranes. Physiol. Veg., 23 (4), 397-410.

87. Hill W.P., Raven J.A., Sutton M.A. (2002) Leaf age-related differences in apoplastic NH4+ concentration, Ph and the NH3 compensation poin for a wild perennial. J. Exp. Bot., 53, 277-286.

88. Hind G., Jagendorf A.T. (1965) Effect of uncouplers on the conformational and high energy states of chloroplasts. J. Biol. Chem., 240, 3202-3209.

89. Hinnach S.C., Wagner R. (1998) Thylakoid membranes contain a high-conductance channel. Eur. J. Biochem., 253, 606-613.

90. Hirsch R.E., Lewis B.D., Spalding E.P., Sussman M.R. (1998) A role for the AKT1 potassium channel in plant nutrition. Science, 280, 918— 921.

91. Homann P.H. (1971) Action of carbonylcyanide-m-chlorophenylhyd-razone on electron transport and fluorescence of isolated chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 245, 129-143.

92. Hong Y.Q., Junge W. (1983) Localized or delocalized protons in pho-tophosphorylation? On the accessibility of the thylakoid lumen for ions and buffers. Biochim. Biophys. Acta, 722, 197-208.

93. Horie T., Horie R, Chan W.Y., Leung H.Y., Schroeder J.I. (2006) Calcium regulation of sodium hypersensitivities of sos3 and athktl mutants. Plant Cell Physiol., 47, 622-633.

94. Howitt S.M., Udvardi M.K. (2000) Structure, function and regulation of ammonium transporters in plants. Biochim. Biophys. Acta, 1465, 152-170.

95. Huang C.H., Peng J. (2005) Evolutionary conservation and diversification of Rh family genes and protein. Proc. Natl. Acad. USA, 102, 15512-15517.

96. Husted S., Hebbern C.A., Mattsson M., Schjoerring J.K. (2000) A critical experimental evaluation of methods for determination of NH/ in plant tissue, xylem sap and apoplastic fluid. Physiol. Plantarum, 109(2), 167-179.

97. Hynds P.J., Robinson D., Robinson C. (1998) The SEC independent twin-arginine translocation system can transport both tightly folded and malfolded proteins across the thylakoid membrane. J. Biol. Chem., 273, 34868-34874.

98. Itoh M., Yamashita K., Nishi T., Konishi K, Shibata K. (1969) The site of manganese function in photosynthetic electron transport system. Biochim. Biophys. Acta, 180, 509-519.

99. Izawa S., Good N.E. (1966a) Effect of salts and electron transport on the conformation of isolated chloroplasts. I. Light-scattering and volume changes. Plant Physiol., 41, 533-543.

100. Izawa S., Good N.E. (1966b) The effect of salts and electron transport on the conformation of chloroplasts. II. Electron microscopy. Plant Physiol., 41, 544-552.

101. Jabürek M., Varecha M., Jezek P., Garlid K.D. (2001) Alkylsulfonates as probes of uncoupling protein transport mechanism. J. Biol. Chem., 276,31897-31905.

102. Javelle A., Thomas G., Marini A.M., Kramer R., Merrick M. (2005) In vivo functional characterization of the Escherichia coli ammonium channel AmtB: evidence for metabolic coupling of AmtB to glutamine synthetase. Biochem. J., 390, 215-222.

103. Javelle A., Lupo D., Li X.D., Merrick M., Chami M., Ripoche P., Winkler F.K. (2007) Structural and mechanistic aspects of Amt/Rh proteins. J. Struct. Biol., 158, 472^181.

104. Javelle A., Lupo D., Ripoche P., Fulford T., Merrick M., Winkler F.K. (2008) Substrate binding, deprotonation, and selectivity at the perip-lasmic entrance of the Escherichia coli ammonia channel AmtB. Proc. Natl. Acad. USA, 105, 5040-5045.

105. Jiang W., Filiingame R.H. (1998) Interacting helical faces of subunits a and c in the FiF0 ATP synthase of Escherichia coli defined by disulfide cross-linking. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 6607-6612.

106. Jiang Y., Lee A., Chen J., Cadene M., Chalt B.T., MacKinnon R. (2002) The open pore conformation of potassium channels. Nature, 417, 523-526.

107. Jezek P., Engstova H., Zackova M., Vercesi A.E., Costa A.D.T., Ar-ruda P., Garlid K.D. (1998) Fatty acid cycling mechanism and mitochondrial uncoupling proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1365, 319—- 327.

108. Jezek P., Garlid K.D. (1998) Mammalian mitochondrial uncoupling proteins. Int. J. Biochem. Cell Biology, 30, 1163-1168.

109. Jezek P. (1999) Fatty acid interaction with mitochondrial uncoupling proteins. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 457—465.

110. Jezek P., Zackova M., Ruzicka M., Skabisova E., Jabürek M. (2004) Mitochondrial uncoupling proteins: facts and fantasies. Physiol. Res., 53, 199-211.

111. Jones P.C., Jiang W., Filiingame R.H. (1998) Arrangement of the multicopy H^-translocating subunit c in the membrane sector of the Escherichia coli FiF0 ATP synthase. J. Biol. Chem., 273, 1717817185.

112. Junge W., Hong Y.-Q., Theg S., Förster V., Polle A. (1984) Localized protons in photosynthesis of green plants? Information and energy transduction in biological membranes (Ed. by Alan R. Liss), 139-148.

113. Junge W., Sielaff H., Engelbrecht S. (2009) Torque generation and elastic power transmission in the rotary F(0)F(l)-ATFase. Nature, 459, 364-370.

114. Kaim G. (2001) The Na -translocating F,F o ATP synthase of propi-onigenium modestum: mechanochemical insights into the F0 motor that drives ATP synthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 94-107.

115. Kamp F., Hamilton J.A. (1992) pH gradients across phospholipid membranes caused by fast flip-flop of un-ionized fatty acids. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 11367-11370.

116. Kamp F., Hamilton J.A. (1993) Movement of fatty acids, fatty acids analogues and bile acids across phospholipid bilayers. Biochemistry, 32,11074-11085.

117. Kessler J., Zande H.V., Tyson C.A., Blondin G.A., Fairfield J., Glasser P., Green D.E. (1977) Uncouplers and the molecular mechanism of uncoupling in mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 2241-2245.

118. Khademi S., O'Connell J.3rd, Remis J., Robles-Colmenares Y., Miercke L.J.W., Stroud R.M. (2004) Mechanism of ammonia transport by Amt/MEP/Rh: structure of AmtB at 1.35 A. Science, 305, 1587-1594.

119. Khademi S., Stroud R.M. (2006) The Amt/MEP/Rh family: structure of AmtB and the mechanism of ammonia gas conduction. Physiology, 21, 419^129.

120. Kim E.J., Kwak J.M., Uozumi N., Schroeder J.E (1998) AtKUPl: an Arabidopsis gene encoding high-affinity potassium transport activity. Plant Cell, 10, 51-62.

121. Kimimura M., Katon S., Ikegami I., Takamiya A. (1971) Inhibition site of carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazon in the electron transfer system of the chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 234, 92-102.

122. Kirwin P.M., Meadows J.W., Shackleton J.B., Musgrove J.E., Elder-field P.D., Mould R., Hay N.A., Robinson C. (1989) ATP-dependent import of a lumenal protein by isolated thylakoid vesicles. EMBO J., 8, 2251-2255.

123. Klosgen R.B., Brock I.W., Herrmann R.G., Robinson C. (1992) Proton gradient-driven import of the 16 kDa oxygen-evolving complex protein as the full precursor protein by isolated thylakoids. Plant. Mol. Biol., 18, 1031-1034.

124. Kolajova M., Antalik M., Sturdik E. (1993) Study of the complex formation between amine local anesthetics and uncouplers of oxidative phosphorylation carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazones. Gen. Physiol. Biophys., 12, 213-229.

125. Kosola K.R., Bloom A.J. (1994) Methylammonium as a transport analog for ammonium in tomato (Lycopersicon esculenfum L.). Plant. Physiol., 105, 435-442.

126. Kraayenhof R., De Wolf F.A., Van Walraven H.S., Krab K. (1986) The significance of interfacial charge and proton displacements for themechanism of energy transduction in biomembranes. Bioelectrochem. Bioenerg., 16, 273-285.

127. Krasinskaya I.P., Marshansky V.N., Dragunova S.F., Yaguzhinsky L.S. (1984) Relationships of respiratory and ATP-synthetase in energized mitochondria. FEBS Lett., 167, 176-180.

128. Krishnamoorthy G. (1988) Mutual inactivation of valinomycin and protonophores by complex formation in liposomal membranes. FEBS Lett., 232, 199-203.

129. Krogmann D.W., Jagendorf A.T., Avron M. (1959) Uncouplers of spinach chloroplasts photosynthetic phosphorylation. Plant. Physiol., 34, 272-277.

130. Kronzucker H.J., Britto D.T., Davenport R.J., Tester M. (2001) Ammonium toxicity and the real cost of transport. Trends in Plant Science, 6, 335-337.

131. Labonia N., Muller M., Azzi A. (1988) The effect of non-esterified fatty acids on the proton-pumping cytochrome c-oxidase reconstituted into liposomes. Biochem. J., 254, 139-145.

132. Lacombe B., Pilot G., Michard E., Gaymard F., Sentenac H., Thibaud J.B. (2000) A shaker-like K+ channel with weak rectification is expressed in both source and sink phloem tissues of Arabidopsis. Plant Cell, 12, 837-851.

133. Laidler V., Chaddock A.M., Knott T.G., Walker D., Robinson C. (1995) A SecY homolog in Arabidopsis thaliana. Sequence of a full-length cDNA clone and import of the precursor protein into chloroplasts. J. Biol. Chem.,210, 17664-17667.

134. Lebaudy A., Very A-A., Sentenac H. (2007) K+ channel activity in plants: genes, regulations and functions. FEBS Lett., 581, 2357-2366.

135. Lerner A., Shnaiderman R., Avi-Dor Y. (1982). Valinomycin as a tool for the reversal of the effect of protonophoric uncouplers. FEBS Lett., 146, 9-12.

136. Li L., Kim B.-G., Cheong Y.H., Pandey G.K., Luan S. (2006) A Ca2+ signaling pathway regulates a K+ channel for low-K response in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 12625-12630.

137. Liberman E.A., Topaly L.M., Tsofina L.M., Jasaitis A.A., Skulachev V.P. (1969) Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria. Nature, 222, 1076-1078.

138. Long S.B., Tao X., Campbell E.B., MacKinnon R. (2007) Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment. Nature, 450, 376-82.

139. Loque D., von Wiren N. (2004) Regulatory levels for the transport of ammonium in plant roots. J. Exp. Bot., 55, 1293-1305.

140. Ludewig U., von Wiren N., Rentsch D., Frommer W.B. (2001) Rhesus factors and ammonium: a function in efflux? Genome Biol., 2, 1-5.

141. Ludewig U., Neuhauser B., Dynowski M. (2007) Molecular mechanisms of ammonium transport and accumulation in plants. FEBS Lett., 581, 2301-2308.

142. MacKinnon R. (2003) Potassium channels. FEBS Lett., 555, 62-65.

143. Maresova L., Sychrova H. (2006) Arabidopsis thaliana CHX17 gene complements the khal deletion phenotypes in Saccharomyces cere-visiae. Yeast, 23, 1167-1171.

144. Marini A-M., Sousii-Boudekou S., Vissers S., Andre B. (1997) A family of ammonium transporters in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol, 17, 4282^1293.

145. Marmagne A., Vinauger-Douard M., Monachello D. (2007) Two members of the Arabidopsis CLC (chloridechannel) family, AtCLCe and AtCLCf, are associated with thylakoid and Golgi membranes, respectively. J. Exp. Bot., 58, 3385-3393.

146. Marques J.P., Schattat M.H., Hause G., Dudeck I., Klosgen R.B. (2004) In vivo transport of folded EGFP by the ApH/T-dependent pathway in chloroplasts of Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot., 55, 1697-1706.

147. Marten I., Hoth S., Deeken R., Ketchum K.A., Hedrich R. (1999) AKT3, a phloem-localized K+ channel, is blocked by protons. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 7581-7586.

148. Maser P., Thomine S., Schroeder J.I. (2001) Phylogenetic relationships within cation transporter families in Arabidopsis. Plant Physiol, 126, 1646-1667.

149. McLaughlin S.G.A., Dilger J.P. (1980) Transport of protons across membranes by weak acidc. Physiol Review., 60, 825-863.

150. Mitchell P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature, 191, 144-148.

151. Mitchell P., Moyle J. (1965) Stoichiometry of proton translocation through the respiratory chain and adenosine triphosphatase systems of rat liver mitochondria. Nature, 208, 147-151.

152. Mitchell P. (1966) Chemiosmotic coupling in oxidative and photosyn-thetic phosphorylation. Biol Rev. Cambridge Phil Soc., 41, 445-540.

153. Mitchell P., Moyle J. (1967a) Proton-transport phosphorylation: some experimental tests. Biochemistry of mitochondria (Ed. by Slater E.C., et al.), New York: Acad. Press., 53-74.

154. Mitchell P., Moyle J. (1967b) Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria. Biochem. J., 105, 1147-1162.

155. Mitchell P., Moyle J. (1969) Estimation of membrane potential and pH difference across the cristal membrane of rat liver mitochondria. Eur. J. Biochem., 7, 471^184.

156. Mitchell P., Moyle J. (1974) The mechanism of proton translocation in reversible proton-translocating adenosine triphosphatases. Biochem. Soc. Spec. Suppl., 4, 91-111.

157. Mitchell P. (1975) Proton translocating mechanisms and energy transduction by adenosine triphosphatases: an answer to criticism. FEBS Lett., 50, 95-97.

158. Mitchell P. (1977) A commentary of alternative hypotheses of protonic coupling in the membrane systems catalysing oxidative and pho-tosynthetic phosphorylation. FEBS Lett., 78, 1-20.

159. Monachello D., Allot M., Oliva S., Krapp A. (2009) Two anion transporters AtCICa and AtClCe fulfill interconnecting but not redundant roles in nitrate assimilation pathways. New Phytol., 183, 88-94.

160. Mori H., Summer E.J., Ma X., Cline K. (1999) Component specificity for the thylakoidal Sec and delta pH-dependent protein transport pathways. J. Cell. Biol., 146, 45-56.

161. Mori H., Summer E.J., Cline K. (2001) Chloroplast TatC plays a direct role in thylakoid (delta) pH-dependent protein transport. FEBS Lett., 501, 65-68.

162. Mori H., Cline K. (2002) A twin arginine signal peptide and the pH gradient trigger reversible assembly of the thylakoid ApH/Tat translo-case. J. Cell. Biol., 157, 205-210.

163. Moroni A., Bardella L., Thiel G. (1998) The impermeant ion methylammonium blocks K+ and NH4+ currents through KAT1 channel differently: evidence for ion interaction in channel permeation. J. Membr. Biol, 163, 25-35.

164. Mould R.M., Robinson C. (1991) A proton gradient is required for the transport of two lumenal oxygen-evolving proteins across the thyla-koid membrane. J. Biol. Chem., 266, 12189-12193.

165. Nagle J.F., Dilley R. (1986) Models of localized energy coupling. J. Bioenerg. Biomembr., 18, 55-64.

166. Nakai M., Goto A., Nohara T., Sugita D., Endo T. (1994) Identification of the SecA protein homolog in pea chloroplasts and its possible involvement in thylakoidal protein transport. J. Biol. Chem., 269, 31338-31341.

167. Nelson N., Ben-Shem A. (2004) The complex architecture of oxygenic photosynthesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5, 971-982.

168. Neuhâuser B., Dynowski M., Mayer M., Ludewig U. (2007) Regulation of NH4+ transport by essential cross talk between AMT monomers through the carboxyl tails. Plantphysiol., 143, 1651-1659.

169. Neuhâuser B., Dynowski M., Ludewig U. (2009) Channel-like NH3 flux by ammonium transporter AtAMT2. FEBS Lett., 583, 28332838.

170. Nielsen K.H., Schjoerring J.K. (1998) Regulation of apoplastic NH/ concentration in leaves of oilseed rape. Plant Physiol., 118, 13611368.

171. Ninnemann O., Jauniaux J.C., Frommer W.B. (1994) Identification of a high affinity NH/ transporter from plants. EMBO J., 13, 34643471.

172. Ohnishi M., Fukada-Tanaka S., Hoshino A., Takada J., Inagaki Y., Iida S. (2005) Characterization of a novel Na'TET1" antiporter gene

173. NHX2 and comparison of InNHX2 with InNHXl, which is responsible for blue flower coloration by increasing the vacuolar pH in the Japanese morning glory. Plant Cell Physiol., 46, 259-267.

174. Opanasenko Y.K., Red'ko T.P., Kuz'mina V.P., Yaguzhinsky L.S. (1985) The effect of gramicidin on ATP synthesis in pea chloroplasts: two modes of phosphorylation. FEBS Lett., 187, 257-260.

175. Opanasenko V.K., Red'ko O.N., Gubanova O.N., Yaguzhinsky L.S. (1992) Induction of an electrogenic transfer of monovalent cations (K+, NH4+) in thylakoid membranes by N,N -dicyclohexylcarbodi-imide. FEBSLett., 307, 280-282.

176. Opanasenko V.K., Semenova G.A., Agafonov A.V. (1999) Changes in the structure and the functional state of thylakoids under the conditions of osmotic shock. Photosynth. Res., 62, 281-290.

177. Opanasenko V.K., Agafonov A.V., Demidova R. (2002) Effects of heterocyclic and tertiary perment amines on the electron transfer in thylakoid membranes. Photosynth. Res., 72, 233-253.

178. Orlova V.N., Antonenko Y.N., Bulychevb A.A., Yaguzhinsky L.S. (1994) Combination of the electrogenic ionophores, valinomycin and CCCP, can lead to non-electrogenic KVhT exchange on bilayer lipid membranes. FEBS Lett., 345, 104-106.

179. Papazian D.M., Timpe L.C., Jan Y.N., Jan L.Y. (1991) Alteration of voltage-dependence of Shaker potassium channel by mutations in the S4 sequence. Nature, 349, 305-10.

180. Pardo J.M., Cubero B., Leidi E.O., Quintero F.J. (2006) Alkali cation exchangers: roles in cellular homeostasis and stress tolerance. J. Exp. Bot., 57, 1181-1199.

181. Pick U., Weiss M., Rottenberg H. (1987) Anomalous uncoupling of photophosphorylation by palmitic acid and by gramicidin D. Biochemistry, 26, 8295-8302.

182. Pick U., Weiss M. (1988) The mechanism of stimulation of photophosphorylation by amines and by nigericin. Biochim. Biophys. Acta, 934, 22-31.

183. Pobezhimova T., Grabelnych O., Kolesnichenko A., Voinikov V. (2001) The comparison of uncoupling activity of constituently synthesized and stress-induced forms of winter rye stress uncoupling protein CSP 310. J. Therm. Biol., 26, 95-101.

184. Pottosin I.I., Schônknecht G. (1995) Anion and cation channels in the thylakoid membrane. Photosynthesis: From Light to Biosphere. Vol. Ill, 99-102, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

185. Pottosin I.I., Schoenknecht G. (1996) Ion channel permeable for divalent and monovalent cations in native spinach thylakoid membranes. J. Membr. Biol., 152, 223-233.

186. Pressman B.C., Lardy H.A. (1956) Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. Biochem. Biophys. Acta, 21, 458466.

187. Pyo Y.J, Gierth M, Schroeder J.I, Cho M.H. (2010) High-affinity K+ transport in Arabidopsis: AtHAK5 and AKT1 are vital for seedling establishment and postgermination growth under low-potassium conditions. Plant Physiol., 153, 863-875.

188. Rastogi V.K. Girvin M.E. (1999) Structural changes linked to proton translocation by subunit c of the ATP synthase. Nature, 402, 263-268.

189. Ren Z.H., Gao J.P., Li L.G., Cai X.L., Huang W. (2005) A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter. Nat. Genet., 37, 1141-1146.

190. Renger G. (1972) Studies on the mechanism of the water oxidation in photosynthesis. Eur. J. Biochem., 27, 259-269.

191. Renger G., Bouges-Bocquet B., Delosme R. (1973) Studies on the ADRY agent induce mechanism of the discharge of the holes trapped in the photosynthetic water splitting enzyme system Y. Biochem. Bio-phys. Acta, 292, 796-807.

192. Renger G., Inoue Y. (1983) Studies on the mechanism of ADRY agents (agent acceleration the deactivation reaction of water-splitting enzyme system Y) on thermoluminescence emission. Biochem. Bio-phys. Acta, 725, 146-154.

193. Robinson C., Thompson J.S., Woolhead C. (2001) Multiple pathways used for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts. Traffic, 2, 245-251.

194. Rottenberg H., Grunwald T., Avron M. (1972) Determination of AH in chloroplasts. 1. Determination of 14C.methylamine. Eur. J. Biochem. 25, 54-63.

195. Rottenberg H., Grunwald T. (1972) Determination of AH in chloroplasts. 3. Ammonium uptake as a measure of AH in chloroplasts and sub-chloroplast particles. Eur. J. Biochem. 25, 71-84.

196. Rottenberg H. (1990) Decoupling of oxidative phosphorylation and photophosphorylation. Biochim. Biophys. Acta, 1018, 1-17.

197. Rousset S., Alves-Guerra M.C., Mozo J., Miroux B., Cassard-Doulcier A.M., Bouillaud F., Ricquier D. (2004) The biology of mitochondrial uncoupling proteins. Diabetes, 53, 130-135.

198. Rubio F., Santa-Maria G.E., Rodriguez-Navarro A. (2000) Cloning of Arabidopsis and barley cDNAs encoding HAK potassium transporters in root and shoot cells. Physiol. Plant., 109, 34-43.

199. Rubio F., Nieves-Cordones M., Aleman F., Martinez V. (2008) Relative contribution of AtHAK5 and AtAKTl to K+ uptake in the high affinity range of concentration. Physiol. Plantarum, 134, 598-608.

200. Rufty T.W. Jr., Jackson W.A., Raper C.D. (1982) Inhibition of nitrate assimilation in roots in the presence of ammonium: the moderating influence of potassium. J. Exp. Bot., 33, 1122-1137.

201. Rottenberg H. (1990) Decoupling of oxidative phosphorylation and photophosphorylation. Biochim. Biophys. Acta, 1018, 1-17.

202. Samarsev V.N., Smirnov A.V., Zeldi I.P., Markova O.V., Mokhova E.N., Skulachev V.P. (1997) Involvement of aspartate/glutamate antiporter in fatty actd-induced uncoupling of liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1319, 251-257.

203. Samuilov V.D., Barsky E.L. (1993) Interaction of carboniylcyanide-m-chlorophenylhydrazone with the photosystem II acceptor side. FEBS Lett., 320, 118-120.

204. Schachtman D.P., Schroeder J.I., Lucas W.J., Anderson J.A., Gaber R.F. (1992) Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science, 258, 1654-1658.

205. Scherer H.W., Mackown C.T., Everett Leggett J. (1984) Potassium-ammonium uptake interactions in tobacco seedlings. J. Exp. Bot., 35, 1060-1070.

206. Schonfeld P. (1990) Does the function of adenine nucleotide translo-case in fatty acid uncoupling depend on the type of mitochondria? FEBSLett., 264, 246-248.

207. Schonknecht G., Hedrich R., Junge W., Raschke K. (1988) A voltage-dependent chloride channel in the photosynthetic membrane of a higher plant. Nature, 336, 589-592.

208. Schubert M., Petersson U.A., Haas B.J., Funk C., Schroder W.P., Kieselbach T. (2002) Proteome map of the chloroplast lumen of Arabidopsis thaliana.J. Biol. Chem., 277, 8354-8365.

209. Schuenemann D., Amin P., Hartmann E., Hoffman N.E. (1999) Chloroplast SecY is complexed to SecE and involved in the translocation of the 33-kDa but not the 23-kDa subunit of the oxygen-evolving complex. J. Biol. Chem., 274, 12177-12182.

210. Seelert H., Poetsch A., Dencher N.A., Engel A., Stahlberg H., Muller D.J. (2000) Structural biology proton-powered turbine of a plant motor. Nature, 405, 418^119.

211. Segalla A., Szabo I., Costantini P., Giacometti G.M. (2005) Study of the effect of ion channel modulators on photosynthetic oxygen evolution. J. Chem. Inf. Model., 45, 1691-1700.

212. Selstam E., Wigge A.W. (1993) Chloroplast lipid and the assembly of membranes. Cell Biology, a series of monographs (Ed. by Sundg-vist C., Ruberg M.), 241-277.

213. Semenova G.A., Agafonov A.V., Opanasenko V.K. (1996) Light-inducer reversible local fusion of thylakoid membranes in the presence of dibucaine or tetracaine. Biochim. Biophys. Acta, 1285, 29-37.

214. Senior A.E. (1988) ATP synthesis by oxidative-phosphorylation. Physiol Rev., 68, 177-231.

215. Sentenac H., Bonneaud N., Minet M., Lacroute F., Salmon J.-M., Gaymard F., Grignon C. (1992) Cloning and expression in yeast of a plant potassium ion transport system. Science, 256, 663-665.

216. Settles A.M., Yonetani A., Baron A., Bush D.R., Cline K., Mar-tienssen R. (1997) Sec-independent protein translocation by the maize Hcf 106 protein. Science, 278, 1467-1470.

217. Shin R., Schachtman D.P. (2004) Hydrogen peroxide mediates plant root cell response to nutrient deprivation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 8827-8832.

218. Shingles R., Wimmers L.E., McCarty R.E. (2004) Copper transport across pea thylakoid membranes. Plant Physiol., 135, 145-151.

219. Skulachev V.P., Sharaf A.A., Liberman E.A. (1967) Proton conductors in the respirator chain and artificial membranes. Nature, 216,718-719.

220. Skulachev V.P. (1991) Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation. FEBS Lett., 294, 158-162.

221. Skulachev V.P. (1998) Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 100-124.

222. Skulachev V.P. (1999) Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 431-445.

223. Sluse F, Jarmuszkiewicz W, Navet R, Douette P, Mathy G, Sluse-Goffart C.M. (2006) Mitochondrial UCPs: new insights into regulation and impact. Biochim. Biophys. Acta, 1757, 480—485.

224. Spetea C, Hundal T, Lohmann F, Andersson B. (1999) GTP bound to chloroplast thylakoid membranes is required for light-induced, multienzyme degradation of the photosystem II D1 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6547-6552.

225. Spetea S, Hundal T, Lundin B., Heddad M, Adamska I, Andersson B. (2004) Multiple evidence for nucleotide metabolism in the chloroplast thylakoid lumen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 1409-1414.

226. Spetea C, Schoefs B. (2010) Solute transporters in plant thylakoid membranes. Key players during photosynthesis and light stress. Communicative & Integrative Biology, 3(2), 122-129.

227. Stock D, Leslie A.G.W, Walker J.E. (1999) Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase. Science, 286, 1700-1705.

228. Stuart J.A, Cadenas S, Jekabsons M.B, Roussel D, Brand M.D. (2001) Mitochondrial proton leak and the uncoupling protein 1 homologues. Biochim. Biophys. Acta, 1504, 144-158.

229. Sun C, Rusch S.L, Kim J, Kendall D.A. (2007) Chloroplast SecA and Escherichia coli SecA have distinct lipid and signal peptide preferences. J. Bacteriol., 189, 1171-1175.

230. Szczerba M.W., Britto D.T., Balkos K., Kronzucker H.J. (2008a) Alleviation of rapid, futile ammonium cycling at the plasma membrane by potassium reveals K+-sensitive and -insensitive components of NH4+ transport. J. Exp. Bot., 59, 303-313.

231. Szczerba M.W., Britto D.T., Shabana A.A., Balkos K.D., Kronzucker H.J. (2008b) NH4+-stimulated and -inhibited components of K+ transport in rice (Oryza sativa L ). J. Exp. Bot., 59, 3415-3423.

232. Szczerba M.W., Britto D.T., Kronzucker H.J. (2009) K+ transportin-plants: Physiologyand molecular biology. Plant Physiol., 166, 447466.

233. Terada H. (1981) The interaction of highly active uncouplers with mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 639, 225-242.

234. Terada H., Shima O., Yoshida K., ShinoharaY. (1990) Effects of the local anesthetic bupivacaine on oxidative phosphorylation in mitochondria. J. Biol. Chem., 265, 7837-7842.

235. Tester M., Blatt M.R. (1989) Direct measurement of K+ channels in thylakoid membranes by incorporation of vesicles into planar bilayers. Plant Physiol., 91, 249 252.

236. Tikhonov A.N., Agafonov R.V., Grigorev I.A., Kirilyuk I.A., Ptu-shenko V.V., Trubitsin B.V. (2008) Spin-probes designed for measuring the intrathylakoid pH in chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1777, 285-288.

237. Uozumi N., Gassmann W., Cao Y., Schroeder J.I. (1995) Identification of strong modifications in cation selectivity in an Arabidopsis inward rectifying potassium channel by mutant selection in yeast J. Biol. Chem., 270, 24276-24281.

238. Uozumi N., Kim E.J., Rubio F., Yamaguchi T., Muto S. (2000) The Arabidopsis HKT1 gene homolog mediates inward Na+ currents in Xenopus laevis oocytes and Na+ uptake in Saccharomyces cerevisiae. Plant Physiol., 122, 1249-1259.

239. Van Beusichem M.L., Kirkby E.A., Baas R. (1988) Influence of nitrate and ammonium nutrition on the uptake, assimilation and distribution of nutrients in Ricinus communis. Plant Physiol., 86, 914-921.

240. Venema K., Quintero F.J., Pardo J.M., Donaire J.P. (2002) The Arabidopsis Na+/H+ exchanger AtNHXl catalyzes low affinity Na+ and K+ transport in reconstituted liposomes. J. Biol. Chem., 277, 2413-2418.

241. Very A.-A., Sentenac H. (2003) Molecular mechanisms and regulation of K+ transport in higher plants. Ann. Rev. Plant Biol., 54, 575-603.

242. Voelker C., Schmidt D., Mueller-Roeber B., Czempinski K. (2006) Members of the Arabidopsis AtTPK/KCO family form homomeric vacuolar channels in planta. Plant J., 48, 296-306.

243. Vonck J., von Nidda T.K., Meier T., Matthey U., Mills D.J., Kuehl-brandt W., Dimroth P. (2002) Molecular architecture of the unde-cameric rotor of a bacterial Nal-ATP synthase. J. Mol. Biol., 321, 307-316.

244. Von Wiren N., Merrick M. (2004) Regulation and function of ammonium carriers in bacteria, fungi and plants. Top Curr. Genet., 9, 95120.

245. Walker M.B., Roy L.M., Coleman E., Voelker R., Barkan A. (1999) The maize tha4 gene functions in sec-independent protein transport in chloroplasts and is related to hcfl06, tatA, and tatB. J. Cell. Biol., 147, 267-276.

246. Walz D., Goldstein L., Avron M. (1974) Determination and analysis of the buffer capacity of isolated chloroplasts in the light and in the dark. Eur. J. Biochem., 47, 403-407.

247. Wang M.Y., Siddiqi M.Y., Glass A.D.M. (1996) Interactions between K+ and NH/: effects on ion uptake by rice roots. Plant, Cell and Environment, 19, 1037-1046.

248. Ward J.M., Maser P., Schroeder J.I. (2009) Plant ion channels: gene families, physiology and functional genomics analyses. Ann. Rev. Plant Physiol, 71, 59-82.

249. White P.J. (1996) The permeation of ammonium through a voltage independent K+ channel in the plasma membrane of rye roots. J. Membrane Biology, 152, 89-99.

250. Williams R.J.P. (1961) Possible functions of chains of catalysts. J. Theor. Biol, 1, 1-13.

251. Williams R.J.P. (1978) The history and the hypotheses concerning ATP-formation by energised protons. FEBS Lett., 85, 9-19.

252. Williams R.J.P. (1983) The nature of local chemical potentials. A comment on a letter by professor V.P. Skulachev. FEBS Lett., 150, 1-3.

253. Williams R.P.J. (1985) Proton diffusion and the bioenergies of enzymes in membranes. In "The enzymes of biological membranes " (Ed. by Martonosi A.N.), 4, 71-109.

254. Williams R.J.P. (1986) The connection between particle flow and mechanical, electrical and chemical work. J. Theor. Biol., 121, 1 -22.

255. Williams R.J.P. (1988) Proton circuits in biological energy interconversions. Ann. Rev. Biophys. Chem., 17, 71-97.

256. Xu J., Li H.-D, Chen L.-Q, Wang Y., Liu L.-L., He L., Wu W.-H. (2006) A protein kinase, interacting with two calcineurin P-like proteins, regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell, 125, 1347— 1360.

257. Yamaguchi A., Anraku Y. (1978) Mechanism of 3,5-di-teri-butyl-4-hydroxybenzylidenemalononitrile-mediated proton uptake in liposomes. Kinetics of proton uptake compensated by valinomycin-induced K+-efflux. Biochim. Biophys. Acta, 502, 136-149.

258. Yamaguchi T., Aharon G.S., Sottosanto J.B., Blumwald E. (2005) Vacuolar Na+/H+ antiporter cation selectivity is regulated by calmodulin from within the vacuole in a Ca and pH-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 16107-16112.

259. Yin L., Lundin B., Bertrand M., Nurmi M., Solymosi K., Kangasjarvi S., Aro E.-M., Schoefs D., Spetea C. (2010) Role of thylakoid ATP/ADP carrier in photoinhibition and photoprotection of photosystem II in Arabidopsis. Plant Physiol., 153, 666-677.

260. Yokoi S., Quintero F.J., Cubero B., Ruiz M.T., Bressan R.A., Hase-gawa P.M., Pardo J.M. (2002) Differential expression and function of Arabidopsis thaliana NHX Na+/H+ antiporters in the salt stress response. Plant J., 30, 529-539.

261. Yuan J., Henry R., McCaffery M., Cline K. (1994) SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont derived sorting. Science, 266, 796-798.

262. Zheng L., Kostrewa D., Berneche S., Winkler F.K., Li X.D. (2004) The mechanism of ammonia transport based on the crystal structure of AmtB Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 17090-17095.

Информация о работе

Васюхина, Лилия Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Особенности аммонийного разобщения фотосинтетических реакций в тилакоидных мембранах хлоропластов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы