Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСНОВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ОТБОРЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАМПОВ ГРИБА BEAUVERIA BASSIANA (BALS) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БОВЕРИНА ГЛУБИННЫМ МЕТОДОМ

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "ОСНОВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ОТБОРЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАМПОВ ГРИБА BEAUVERIA BASSIANA (BALS) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БОВЕРИНА ГЛУБИННЫМ МЕТОДОМ"

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ ' На правах рукописи

КОНОНОВА Эра Владимировна

ОСНОВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ОТБОРЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ ГРИБА &еаииеИа.

ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БОВЕРИНА ГЛУБИННЫМ МЕТОДОМ

Специальность - 03.00.05. - Ботаника

О

АВТОРЕФЕРАТ

/

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА - 1979

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте иичро биологических средств защиты растений и бактериальных препаратов.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник О.А.Алешина

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор В.В,Колосов; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.И.Сидорова

Ведущее предприятие: Институт биологии АН Латвийской ССР. Защита диссертации состоится "/& "Ь^СДЗрЯ 1979 г. в

I

№ часов на заседании специализированного Биологического Совета № 5 в Московском Государственном университете им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "М '■ 1979 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью учреждения, просим направлять по адресу: 117234, Москва, МГУ, Биологический факультет, Ученый Совет № 5.

Ученый секретарь специализированного Совета, до к тер : биологических наук .

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В "Основных направлениях развития народного хозяйства СССР на 1976-1980 гг." сказано: "... Обеспечить повсеместно рост урожайности сельскохозяйственных культур. Усилить работу по созданию необходимых средств защиты растений от болезней и вредителей. Ускоренными темпами развивать микробиологическую промышленность. Обеспечить значительный рост производства микробиологических средств защиты растений» Расширить исследсза-ния, направленные на получение высокопродуктивных и устойчивых проявленных втамыов микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ, создание более совершенной технологии производства микробиологической продукции на основе новых более дешевых видов сырья и повышение выхода продукции из единицы сырья".

Такие вопросы выдвинута не случайно. Их решение является одним из направлений повышения урожайности всех видов сельскохозяйственных культур.

Актуальность работы. Глубинный метод получения конидио-спор гриба составляющих основу препарата боверин,

разработай во БНШЗакщюпарат. Этот метод получил признание и нашел широкое практическое применение в отечественной микробиологической промышленности.

Удовлетворить возрастающую потребность сельского хозяйства СССР в этом препарате можно только при условии производства боверина глубинным способом, позволявшим использовать крупнотоннажное оборудование. Это мнение разделяют и зарубежные исследователи (Реьгоп , 1975, И^грт , 1975), которые

iЦcзIp.■y.ы¡^Jthyчлaa СиЭлвсиез (-ГД. Сгльмз. . ич. ¡с, д. Тшпризем.

{ ЛЗ. 3.6Щ

г

считают, что для быстрого и экономически выгодного производства препарата необходимо получение его в ферментерах.

Производство биопрепарата глубинным способом требует наличия активных промышленных штаммов гриба« формирующих ко-нидиоспоры в глубинных условиях. При этом конидиосторы должны сохранять активность на протяжении всего технологического процесса. До последнего времени промышленность такими штаммами не располагал^, поскольку не были разработаны критерии их отбора с учетом экологических условий выращивания культуры.

В связи с этим возникла необходимость разработки методов оценки и отбора штаммов гриба для производства препарата в промышленных условиях.

Использование вирулентных и продуктивных штаммов 4qs. ййт является основой для получения высоких экономических показателей при производстве препарата боверина. Это ставит вопросы отбора штаммов гриба на уровень актуальных задач.

Цель работы. Изучить норфолого-культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства культур гриба В. Sass!a.na с целью отбора промышленных штаммов для получения препарата боверин* глубинным методом. При этом требовалось создать коллекция штатов В. 4<ял<<*-»&. различного географического происхождения, провести их всесторонняя оценку и выявить направление отбора среди них активных форм, стабильно сохраняющих высокую продуктивность и вирулентность. Это позволит обеспечить производство качественным посевным материалом с высокий выходом активного гродукта.

Основные задачи. Провести сравнительную оценку штаммов по морфолого-культуральдам и фиаиолого-биохишческим показа-

телям. Изучить факторы, влияющие на формирование-активных оргаммов. Выявить оптимальные условия для развития и спороно-шения гриба в глубинных условиях. Разработать критерии оценки активности и методику отбора, промышленных штаммов для получения боверина глубинным способом. Выяснить условия хранения штаммов в активном состоянии.

Научная ндвк^на работы. Впервые исследованы морфолого-куль туральные признаки и физиологе-биохимические показатели 190 штаммов В. iatsiana . Создана коллекция промышленных штаммов,"пригодных для культивирования в глубинных условиях, характеризующихся высокой продуктивность!) и вирулентностью.

Разработан метод предварительной оценки продуктивности штаммов В. tais/ann по их первичной люминесценции.

Разработана схема отбора перспективных промыпленных штаммов для получения препарата боверика глубинным методом.

Практическая значимость". Разработаны методы идентифкка-* ции продуктивных и вирулентных штаммов гриба В. ¿arss/aftcr для глубинного культивирования и составлена методика по оценке и отбору штаммов В.£аг«7ллст.

Получен штамм II3H-278, который внедранка Ефреью веком биохимическом заводе для получения препарата боверин.

Апробация работы. Основные результаты доложены на Координационном совещании по микробиологическим препаратам для сельского хозяйства (Москва, 1972 г.), на Ш Всесоюзной Конференции по генетическим основам селекции промышленных микроорганизмов (Минск, 1975 г.), на I Конференции молодых ученых (Кишинев, 1974 г.) и I Всесоюзной научной конференции по микробиологическим методам защиты растений (Кишинев* 1976 г*),

»а Советско-Американской конференции по изучению возможности выращивания и использования энтомопатогенных грибов (Рига, 1978 г.).

Публикации. По материалам диссертации оцублииовано 12 работ в периодических журналах к сборниках.

Структура ц объем работы. Реферируемая работа изложена на 149 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц, 15 рисунков. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, семи глав собственных экспериментальна исследований, обсуждения, выводов и списка используемой литературы, включавшего 175 работ, из них 100 работ отечественных и 75 зарубежных авторов.

ОВЬШЫ И ЙЕТОда ИССЛЕДОВАНИЕ!

Объектами настоящего исследования вились изоляты и штаммы из природных популяций гриба Неацус-ыа ¡ас&апя имеющихся в коллекции лаборатории грибных энтомопатогенных препаратов института.

Биоматериад коллекции, полученный из отечественных и зарубежных учреждений, содержит культуры, наделенные кз разных _ насекомых-хозяев, различного географического происхождения.

Для выращивания гриба использовали агариэованные и жидкие питательные среды: гяшоаную среду Сабуро, среду с тавшм суслом, картофельнопегггонную среду, среду Райстрик, среда1 Чапека, синтетическую квдкув среду и среду с пептоном.

Культуры идентифицировали по определителя А„Л,Евл юсовой (1974). Контроль за стерильностью гриба при выращивании на жидких средах проводили пут«* взятия проб и их последующего микроскопирования.

Интенсивность прорастания и жизнеспособность биоматериала учитывали при высеве на предметные стекла и на чашки Петри с агариэовакной средой, йтоенсивность споруляции определяли дутем подсчета конидиоспор в камере Горяева. Статистическую обработку данных проводили по В.Г.Воль$у (1966). Данные по продуктивности штаммов приведены в таблицах с вероятностью 0,95.

Изучение физиологии глубинной культуры проводили с помощью витального окрашивания 0,1% водным раствором нейтральной (фасной. Дня цитологических наблюдений мицелий и споры гриба фиксировали в Карнуа и окрашивали•по Романовскому-Гимза,

Исследования проводили на микроскопе МБИ-15У с увеличением в 140,200,400,. 900 раз; фотографии подучены с помощью сканирующего микроскопа (-¡¡¡сап ННУ-2Я..

Проведение первичного отбора активных форм из природной популяции гриба предполагает массовый моноконидиальный рассев и анализ большого количества изолятов по признакам продуктивности и вирулентности. Общепринятые в настоящее время методики оценки этих показателей трудоемки. В связи с этим нами были разработаны применительно грибу В. (сих/ала следующие методики оценки активности культур: продуктивности штаммов гриба по их первичной люминесценции на агаризованных питательных средах; первичного определения вирулентности по коэффициенту Пфефера и липаз ной активности...

Опытно-промышленную наработку препарата проводили на Ефремовском биохимическом заводе (Отчет Ефремовского завода,

1975-1978 гг.).

2-/72$-

I. Изучение Факторов, влиявшие на Формирование активны^ штаммов гриба В. ¿ап;а/>А при поверхностном выращивания.

Проведены исследования ю выяснению влияния сред синтетического и полусннтетичесхого состава на продуктивность гриба.

Штаммы, ввделенные из природных популяций, при выращивании на различных питательных средах, значительно отличались между собой ю своим культуральным признакам. Для каждой питательной среды был характерен определенный тип роста колоний. Интенсивность споруляции штаммов на различных средах представлена в табя.1. Из приведенных в таблице данных видно, что продуктивность всех исследованных штаммов на глюкозной среде Сабуро была выше по сравнению с продуктивностью культур, выращенных на других средах. Поскольку глюкозная среда Сабуро тйложительно влияет на продуктивность штаммов гриба, эта среда была использована в качестве контрольной во всех последующих экспериментах*

Таблица I

Интенсивность споруляции штаммов В. ¿аа/<яп<я на различных агариз овакных средах

!Интенсивность споруляции, млн.спор на I мл .среда, I_на сюедах;_

{Сабу*« { £

_I_I_' тонок_1_!_

I 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6

70-В</ 60,0 23,0 29,0 15,0 1.0

ВК-76 68,0 32,0 1.0 7,0 1.0

517-3 180,0 102,0 73,0 41,0 21,0

430 33,0 18,0 19,0 7,0 2,0

ЧМК-2 100,0 2,0 2,0 2,0 1.0

кмк-з 180,0 20,0 10,0 70,0 7,0

I 1 2 Г 3 ! 4 1 5 ! 6

КМК-5 280,0 36,0 60,0 70,0. 5,0

КМК-1. 220,0 100,0 5,0 32,0 4,0

489 161,0 115,0 80,0 62,0 18,0

80«з 100,0 80,0* 44,0 18,0 1.0

406 284,0 113,0 30,0 91,0 4,0

ПЗ-278 1200,0 210,0 40,0 192,0 56,0

32-4 500,0 201,0 48,0 160,0 42,0

124Р 415,0 121,0 21,0 235,0 61,0

юзк3 61,0 30,0 7,0 26,0 4,0

105КЗ 240,0 120,0 5,0 44,0 1.0

27В-Ш1 790,0 219,0 18,0 300,0 13,0

Исследования по влиянию температурного режима на развитие штаммов гриба были начаты с установления оптимальных температур для их роста и спорообразования на агаризованной глшсоэкой среде Сабуро.

Проведенные наблюдения показали, что температуры +5°С и +10°С неблагоприятны для роста и развития гриба. Диапазон оптимальны* температур для штаммов В. tatua.no- находится в пределах +20 - +30°С & зависимости от географического происхождения культур. Так, для штамма 124Р он лежит в пределах +15 -+20°С, а для штамма 406 теилература должна быть не нше +30°С Необходимо отметить, что при оптимальных тем-

пературах для роста и развития штаммов большая длина ростковой тр^ки соответствовала большему количеству проросших спор (табл.2).

Наблюдаемые различия при прорастанции конидиостор и последующем развитии культур гриба В. С сш г<а пл при различных температурах определяют их продуктивность.

Таблица 2

Влияние температурных режимов на интенсивность прорастания ковкдаоспор и дянцу ростковой трубки

1Содер*анив проросших спор через 22-26 ч. I Длина ростковой трубки, мен, при температуре

I ' тти тшпимчцпи 1

Штаммы г Г +5°С I +10°С \ +20°С I +2б°С Г +30°С ! +5°С 1 +10°С 1 +20°С ( +26°С ! +30°С

113-278 0 0 58 82 63 15,0 20,0 15,0

406 0 0 0 б 30 л* - 10,0 19,0

278-НЛ 0 0 74 85 81 *т 21,0 31,0 29,0

32-5 0 0 63 96 ' 80 - 38,0 43,0 40,0

124-Р 0 12 98 73 44 6,0 39,0 36,0 . 18,0 »

409 0 6 96 96 83 4,0 39,0 46,0 32,0

300 0 19 98 97 66 '4.0 34,0 33,0 16,0

(

Таким образом, прорастание конидиосшр, последующее формирование конидиального слоя и максимальная продуктивность различных штаммов гриба наблюдаются при оптимальных для развития культуры температурах, которые зависят от температурных режимов географических районов, где они впервые были выделены.

2. Естественная изменчивость гриба В.

Выяснение изменчивости гриба В, /««/ала и выявление признаков, которые необходимо учитывать при отборе перспективных штаммов в отношении юс продуктивности - основная цель этих исследований.•

Все штаммы, использованные в опытах, по характеру роста и формированию конидиального слоя можно разделить на две основные культуральные группы. К первой группе относятся штаммы, которые обладают интенсивным иицелиальным ростом и прижатой формой колоний. Одновременно с ростом мицелия происходит образование конидиального слоя.

Вторая группа включает штаммы, характеризующиеся мице-лиальним ватообразныы ростом. Подобный характер роста мицелия культуры сохраняется длительное время и только через месяц или позднее пушистая ватообраэная мицели&дьнал масса опускается на субстрат.

Как правило, первая группа содержит формы с высокой интенсивность» споруляции; ко второй группе относятся культуры с более низкой продуктивностью.

По литературным данным гриб В. блшллл обладает естественной изменчивостью. Изменчивость гриба изучалась на примере четырех штаммов, три из которых откосились к первой (К-87,

113-278, и один - ко второй кулътуральньм группам

(KMK-I). Анализируя изменчивость штаммов ори моноконидиаль-ноы рассеве установлено, что наибольшая вариабильность наблюдалась у тех из них, которые при последоватеяьных пересевах сохраняли высокий процент атипичных для данного штамма форм. У всех штаммов процент типичных колоний превышал 5055. При последовательных пересевах только у штамма 113-278 процент типичных колоний оставался близким к исходному (табл.3).

Перспективными для глубинного культивирования можно считать штаммы, которые характеризуются плоским прижатым типом роста колоний без складчатости и вторичного роста, формированием конидиального слоя меловой консистенции. Количественное содержание колоний такого типа должно быть у штаммов не гаме 90$ и сохраняться при последовательных пересевах.

Таблица 3

Морфологическая изменчивость штаммов гриба при последовательных пересевах

I Штамм 676 1 Штамм KMK-I t Штамм К-87 Штамм ! 13-278

Пересев Г- 1типич.ат1 !колонки. tgtra 4. 1 ТКПИЧ.а?! !колонии. ^ич. !тилич.атипнч!типич.атидич. 1колонии, % !колонии, %

исход. 60 40 60 20 90 ю 90 10

I 37 63 28 72 32 68 82 18

П - 40 60 33 67 22 78 70 30

Ш 28 72 33 67 32 68 73 27

3. Оценка штаммов гриба b^iast/a^ta. при глубинном вырадавакни -

Штаммы гриба культивировали при оптимальных темпера- "*-турах для каждого штаымака синтетической и полусинтетической средах в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл на качалке фирмы "f/eiv bzumwick scientific* при частоте вращения 200 об/мин.

Проведенные опыты показали, что не все штаммы гриба В, при глубинном культивировании обладали способ-

ностью с одинаковой интенсивностью образовывать кокидиоспоры. Тем не менее, штаммы, обладавшие высокой интенсивностью соо-руляции при выращивании на агариэованной среде в чашках Петри, сохранили это свойство и в условиях глубинного культивирования (табл.4), Таи, если на агариэованных средах показатель интенсивности споруляции был в пределах 30-1166 млн. спор на I мл среды, то при выращивании в глубинной культуре он колебался от 48 до 1466 млн.спор на I ил среды, т.е. интенсивность спорообразования не снижалась, а даже несколько увеличивалась. Необходимо отметить, что при глубинном выращивании вирулентность конидоспор не ниже, чем у поверхностных спор.

Установлено, что при глубинном выращивании гриба активность различных штаммов в значительной мере зависит от продолжительности их культивирования. При этом наблюдается снижение не только продуктивности, но и вирулентности культуры.

При длительном культивировании (свыше 96 ч.) в погруженных условиях сформированные конндиоспоры начинают прорастать,

Таблица 4

Сравнительная оценка активности различных штаммов В. выдать- при выращивании на ага-ризованной среде Сабуро и глубинным методом на полусинтетвческой среде

I Интенсивность споруляции, (Вирулентность кони-1 млн.спор на I мл среда (диоспор Л{Цп, тыс. Штаммы I (спор, гаД^ад среды

[агаризованная I полуеинтетич»! поверх_I среда_I екая жидкая |ностных|Г^-тц'""1"л

125-Т 430 875 44,7 25,1

727 249 732 169,8 707,7

766 589 883 500,0 316,2

1244? 415 1350 63,1 22,4

489 161 874 1501,2 1000,0

32-Ф 500 602 1702,0 784,3

292 30 48 1413,0 89,1

113-278 1140 1466 251,2 19,9

278-НД 790 1060 25,1 22,4

К-87-3 1168 1210 56,2 22,4

406 284 825 631,0 500,0

что приводит к снижение споруляции. Кроме того, вторичные комедии снижают вирулентность полученного биоматериала. В связи с этим возникла необходимость выявления влияния зрелости кокидиоспор в процессе выращивания на активность культуры. С этой целью был использован метод витальной окраски глубинной культуры нейтральной красной.

Распределение красителя в живой неповрежденной клетке гриба в значительной степени зависит от функционального состояния мицелия и его возрастной фазы. Появление гранулярной окраски в клетках и спорах гриба объясняется наличием в них на определенных этапах развития гранул вошвтина, которые окрашиваются нейтральным красным красителем в красно-малиновый цвет. Микросхопировакие окрашенных ыаэков глубинных культур В. б&и'чьпа. нейтральной краской показало, что гифы гриба определенным образом реагируют на внедрение витального красителя, давая диффузную или гранулярную окраску. Протоплазма молодых клеток окрашивается диффузно, в то время, как в зрелом мицелии преобладает гранулярный характер окраски* В визирующем мицелии окраска принимает вновь диффузный характер,

В результате проведенных исследований выявлена реакция культуры на внедрение витального красителя в зависимости от ее развития, которая выражается в виде следующих пяти каче-ственио различных этапов:

прорастание спор; окрашивание отсутствует; диффузное окрашивание протоплазмы гиф и появление мелких гранул; окрашивание отчлененных «юр зрелой культуры диффузное;

единичные волютиновые гранулы наблюдаются в молодом мицелии, в участках гиф ближе к проросшей споре; диффузное окрашивание протоплазмы отмечается лишь в отдельных клетках;

мелкие или редко расположенные крупные гранулы волютина встречаются по вешу мицелию; гранулы наблюдаются и в бласто-спорах;

массовое спорообразование, волютиновые гранулы крупные,

о

Рис,

Ш

йР

ш

!***

Л "V* ■'« Л роста х мпм.те?/

I.Зависимость продуктивности штаммов ДАхи/алс» от продолжительности фаз развития культур» на минеральной среде о пептоном.

У»»«

М^к.

Рис.2.Зависимость продуктивности штаммов е. <**«<»>•* от про, хительности фаз развития культуры иа минеральной 1

'дол— "

среде,.

«♦/»и

-гмчвта»

I

заполнят почти весь мицелий; во многих отчлененных конвдио-спор&х отмечается волютиковые гранулы,

* Таким образом, учитывал возрастаное состояние культур гриба В» taiiian^ можно судить о степени зрелости ее и готовности конидиоспор к состоянию покоя, что имеет большое значение для сохранения активности.

Наблпденил за ростом и развитием культур гриба показали, что каждый штамм в зависимости от состава питательных сред имеет определенную продолжительность стадий развития.

Завершение цикла развития культуры в оптимальные сроки дает возможность получения активного спорового материала* В случае увеличения длительности прохождения возрастных фаз набяодается снижение активности, что выражается в более низкой продуктивности штаммов о незавершенным циклам развития (рисунки ¿,30.

Таким образом, при отборе активных штаммов необходимо учитывать физиологическое состояние культуры, о котором можно судить по стадиям развития гриба, поскольку зрелые конидиоспор» обеспечивают получение активного биоматериала.-

4. Условия хранения штаммов В. foss/<xn&. -

В результате проведенных опытов установлено, что хранить коллекционные культуры В. башлпл ка сусло-агаре при пониженной температуре 44°±2°С можно до 2-х лет. Однако процент жизнеспособных спор у разных штаммов различен (табл.5). Поэтому при хранении необходимо учитывать особенности каждого штамма.

Хранение культуры на сусло-агаре при пониженных температурах требует периодического пересева биоиатериала, что приводит к увеличение числа генераций и к появлению спор,

w

» M

OOOOOO ОЮОПООООООООООООО OOOOOOO0®°®Р

(OinmOMcJ ^^f^SSSGU^^^^^""^-* М*н"нн^пм*ммннн00000000000000

Cst

I

toftWtiÇOp CO MOOMWQTOO! PVpCOO0»O £> (H N-ífNOtOO'-'OXO^'iOaUNCOlMOOi-iíOtOC'-tOtQ'-'1

йо^^оосос^ O»COOIOIC^OO3<ÛS)M3Î МИОММС) in йлоахжЧЛ о ioSSi—Ii—its•

мСОМ

О

c^wa, t-HCji ^ Tjii-

мЛбБВЙе'-'06"

т-мгюючге

M

ft) ^ O O*}1

ÍQ «inwä HiA

di i

conhhh i

" fCJ. I. J b

£ QO

образующих колонии1с сильно развитым воздушным мицелием и низкой споруляцаей. В связи с этим проводили исследования для выявления более совершенных методов хранения штаммов

Был предложен другой способ хранения конвдиоспор гриба. Конвдиосторы, полученные при выращивании гриба на зерновом субстрате (пшено), подвергались высушиванию в вакууме при температуре +20£2°С. Оушку проводили до постоянного веса культуры в колбах в течение 3-5 суток. При этом установлено, что морфологическая изменчивость штаммов практически отсутствует. жизнеспособность спор не снижается ниже 77% (табл.6). Снижения продуктивности и вирулентности вакуумно высушенного биоматериала при культивировании его в.глубинных условиях не1 наблюдается.

Таким образом, хранение промышленных штаммов на зерновом субстрате - пшене - о применением вакуумного высушивания дает возможность использовать посевной материал одной и той же генерации в течение года.

5. Критерии оценки активности штаммов гриба В.^ак/дло дл>г глубинного культивирования

В результате проведенных работ представляется возможным: предложить следующую схему отбора и оценки активных штаммов для глубинного культивирования:

на агаризованной гдюкоэной среде Сабуро отбираются формы с плоским прижатым типом роста колоний и конндиадьным слоем меловой консистенции, без складчатости я вторичного роста;■

■■ при оптимальных температурах для каждого штамма на агаризованной среде Сабуро определяют период роста культур и их продуктивность;-

Таблицаб

Влияние вакуумной сушки на жизнеспособность и изменчивость культур Ъ.воли'агк*

Штаммы'

Способ хранения

[Содержание и?! ИнтенсиЫ Вирулент-,ержа-1 фологичйсиого I ность 1 кость ЛК=л нив жиэ-1 типа,КОЛОНИЙ,1слоруля-1 тыс.спор 1неспосоЯ % !пии. млн1в I мл

¡ных слов, типич1н}ще_ |спор В1среда

- % I них 1лиаль--

1

1

!ных

113-278

113-278 124-Р

124-Р

Вакуумная сушка •

Контроль*^

Вакуумная сушка

Контроль'

V

69 87 13 480 158,5

100 90 10 530 79,4

77 72 26 512 259,0

100 78 22 683 119,3

Примечание: Типичные колонии - плоские, прижатые с конидиальным слое» меловой консистенции

х/ Контролем служили 21 суточные культуры, выращенные на агаризованной среде

Выявляют диапазон естественной изменчивости штаммов путем ввделения монохонцдиаяьных изохятов. Отбирают изоляты, дающие при моноспоровом рассеве не менее 90$ морфлогически однородных высокосгорулирующих колоний. Предварительная оценка продуктивно ста кзодятов проводитсяс помощью люминесцентного метода;

вирулентность монококидааяьных изояятов предварительно определяют биохимическими методами; -

высокопродуктивные и вирулентные штаммы проверяют на возможность выращивания их глубинным методом. Дм »того штаммы культивируй« при оптимальных для них температурах на сж-тетической и полусинтетической с пептоном средах. Определяют продолжительность стадий развития культур, их максимальную продуктивность и вирулентность. Контроль за физиологическим состоянием культур осуществляют с помощью витальной окраски мазков глубинной культуры гриба. Вирулентность определяют биохимическими методами. Отбирает штаммы, которые в максимально короткие сроки интенсивно образуют глубинные конидио-еггоры, физиологически подготовленные х состоянию покоя. Отобранные штаммы проверяют на вирулентность на тест-объекте.

Разработанная схема оценки и отбора продуктивных » вирулентных культур для глубинного выращивания позволила создать коллекция перспективных штаммов для получения боверина в промышленных условиях. Лучшим является штамм ПЗН-278, который внедрен в промышленное производство. На этот штамм получено авторское свидетельство V 507645.

Впервые разработанный глубинный способ получения ко-нидиоспор гриба В. ta.it/лги* , составлящих основу энтокопато-генного препарата боверин, подучил признание и нашел практическое применение как у нас в стране, так и за рубежом.

ВЫВОДЫ.

1. Перспектив кьми для глубинного культивирования являются штаымя В.4ахи'а/1<*, харахтериэуоциеся интенсивным про- ■ растанием конидиоспор и формированием конидиального слоя' меловой консистенции без складчатости и вторичного роста. Количественное содержание колоний■такого типа у штаммов должно быть не ниже 90?.

2. Продуктивность штаммов гриба при выращивании на ага-риэовашшс питательных средах зависит от состава питательной среда. Агаризованная глюкозная среда Сабуро является наиболее благоприятной для первичной оценки штаммов В. ¿ш^еик* по продуктивности и вариабильности морфолого-культуральных признаков.

3. Температурный оптимум для роста и развития штаммов, выделенных из северных районов, находится в пределах +15° -+25°С, для штаммов южных районов - +25° - <30°С.

4. Разработан метод оценки продуктивности штаммов гриба

на агариэованных средах по их первичной яюмине- ■

сценции.

5. Штаммы, стабильно проявляющие высокую продуктивность и вирулентность на агаризованной среде, сохраняют эти свойства при глубинном культивировании.

6. Показателем скорости созревания культуры в глубинных условиях служит окрашивание волотиновых гранул витальным красителем в период интенсивного формирования и отчленення конидиоспор гриба, что необходимо учитывать при отборе,

7. Для глубинного культивирования рекомендована минеральная ^ среда и модфицированная полусинтетическая среда с пептоном.

8. Вирулентные штаммы характеризуются низкой протеояи-тической и высокой дипазной активностью.

9. Штаммы гриба В. , выращенные на пшене и высушенные под вакуумом, сохраняют активность в течение года.

10. Разработана схема отбора и оценки активных штаммов гриба В. &asiicjntt для глубинного культивирования.

Основное содержание диссертации изложено в сведущих работах:

1. Алешина O.A., Ильичева С.Н., Кононова Э.В., Коляда H.A.,

Львова E.H. О хранении штаммов гриба Beauvei/cf /аи/сма {&aii)Vuitg, Краткие тезисы докладов, на первой конференции о задачах и методах работы микробных коллекций СССР. Москва, 1972, 86-07.

2. Алешина O.A., Ильичева С.Н., Кононова Э.В., Коляда H.A.

Основные критерии отбора штаммов гриба В. Sans texnet для производственных целей. "Микология и фитопатология", 6, т.4, 1972, 341-344.

3. Алешина O.A., Ильичева С.Н., Кононова Э.В. Способ сохра-

нения жизнеспособной культуры В. Satsiana "Микология и фитопатология", 7, т.б, 1973, 455-456.

4. Алехина O.A., Ильичева С.Н., Кононова Э.В., Коляда H.A.,

Львова Е.Л. О некоторых биохимических особенностях гриба В. t аШапа в связи со степенью паразитизма различных штаммов. "Антибиотики в борьбе с болезнями с/х культур. Бактериальные и 0нтошпатогенные препараты", вып.1, 1973, 89-94.

5. Исаенко Н.И., Казаченяо В.И., Кононов Э.В,, Саркисова Н.Б

Влияние температуры выращивания на продуктов ность различных штаммов В. tassi&tn*. Биологи ческий метод в защите растений. Тезисы

докладов 1-й конференции молодых ученых, Кишинев, 1974, 12-13.

6. Ильичева С.Н., Алешина O.A., Кононова Э.В., Оршенене Я.Э.

Хранение штаммов гриба В. tassiana "Микология и фитопатология", б, т.9, 1975, . 536-538.

7. Кононова Э.В. Отбор активных штаммов В. éosn &net— проду-

центов боверина, 10 Всесоюзная конференция по генетическим основам селекции промышленных, микроорганизмов. Тезисы, Минск, 1975, 39. 8* Ильичева С.Н., Алешина O.A., Кононова Э.В., Сршекене Я.Э.

Влияние температуры на развитие гриба В. всяа/ачс/. "Микология и фитопатология", 2, т.10, 1976, 87-92.

9. Кононова Э.В., Ис&енко Н.И. Изучение условий хранения и

изменчивости штаммов гриба В. ia st i<xr>c< . Микробиологические методы защиты растений. Тезисы на 1-ой Всесоюзной научной конференции, Кишинев, 1976, I0I-IQ2.

10. Ильичева С.Н., Алешина O.A., Кононова Э.В. Использование

первичной люминесценции гриба В. Sois liorna для отбора продуктивных форм. Микробиологические средства защиты растений и бактериальные препараты, вып.4, 1976, 42-47,

11. Примак Т.А., Алешина O.A., Ильичева С.Н., Кононова Э.В.,

Казаценко В.И., Круглова Н.П. Штамм ИЗК278. Авторское свидетельство № 507645, М.Кл.С12К1/06, 1976.

12. Hononova t.V. SeCtdion of соттегЫлС sízaLns of títt

Junouí Beofurtzic* ¿a ss i ал л (/ia.6t) TpioUedinQs üf tht F'Zít Joint UX/USf/t CetiftTShat £>r> the Ppoc/uction, SeSec-iton ojirf Sianda.xoLiiayfn. af ¿^to/^o/o^thpj^tnk CSS/tstSSfi. -■'-■*

Gboup on

p„„o} 01f ¿A» US/USSft Joint ШгАТио Áocfuctt™

¿Hiisoubi, t3?¿, m-w.