Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологическое обоснование отбора штаммов гриба Beauveria bassiana S.L. для снижения численности саранчовых в Казахстане

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Биологическое обоснование отбора штаммов гриба Beauveria bassiana S.L. для снижения численности саранчовых в Казахстане"

На правах рукописи

005061531

УСПАНОВ Алибек Маратович

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОТБОРА ШТАММОВ ГРИБА ВЕАиУЕША ВАЯБММ вХ. ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ САРАНЧОВЫХ В КАЗАХСТАНЕ

Шифр и наименование специальности: 06.01.07 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 ИЮН 2013

Санкт-Петербург - Пушкин 2013

005061531

Работа выполнена в ТОО «Казахский научно-исследовательский институт защиты и карантина растений» АО «Казагроиновация» МСХ республики Казахстан и Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии (ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии)

Научный руководитель: Леднев Георгий Рэмович

кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: Сухорученко Галина Ивановна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, руководитель лаборатории защиты растений Россельхозакадемии

Гришечкина Светлана Денисовна

кандидат биологических наук, и.о. руководителя лаборатории ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Ведущая организация: ВНИИ биологической

зашиты растений Россельхозакадемии

Защита состоится «_27_» июня 2013 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006.015.01 на базе Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.

Факс:(812) 470-51-10; e-mail: vizrpb@mail333.com, Web-сайт: www.vizrspb.narod/ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан «_27_» мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

^ Галина Анатольевна Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Саранчовые в особенности стадные являются одной из наиболее вредоносных групп многоядных вредителей сельскохозяйственных культур. В настоящее время в станах СНГ для борьбы с ними используются только химические инсектициды. Однако известно, что масштабное применение пестицидов имеет ряд существенных недостатков, важнейшими из которых являются возникновение резистентных популяций вредителей и загрязнение окружающей среды. В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных экологически безопасных методов защиты растений. Одним из таких способов подавления вредных фитофагов является микробиологический метод защиты. Особую актуальность использование биологических приемов снижения численности саранчовых приобретает для водоохранных зон и заповедных территорий, где использование химических пестицидов законодательно полностью запрещено (Сергеев, Лачининский, 2006).

Среди всего разнообразия энтомопатогенных микроорганизмов одной из наиболее перспективных групп, с точки зрения снижения численности саранчовых являются грибы из анаморфных родов - Metarhizium и Beauveria. Исследования с этими микроорганизмами активно проводятся во многих станах мира (Lomer et al., 2001; Inglis et al., 2007; Charnley, Collins, 2007, Faria, Wraight, 2007). К настоящему времени ассортимент зарубежных микоинсектицидов для снижения численности саранчовых включает 11 наименований (Faria, Wraight, 2007).

На территории СНГ исследования в этом направлении до недавнего времени были немногочисленны и носили эпизодический характер.

К настоящему времени в списках, разрешенных к применению средств защиты растений, как в Казахстане, так и в России нет ни одного препарата на основе энтомопатогенных грибов для снижения численности вредных членистоногих и саранчовых в частности.

Цель работы. Целью работы являлась скрининг штаммов-продуцентов микоинсектицидов на основе гриба Beauveria bassiana s.l., эффективных для снижения численности наиболее вредоносных видов саранчовых в условиях Казахстана.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отбор новых штаммов и природных изолятов казахстанского происхождения гриба В. bassiana s.l. по признаку вирулентности в отношении саранчовых;

2. Оценка специфичности отобранных культур гриба в отношении насекомых из других систематических групп;

3. Подбор оптимальных концентраций инокулюма для эффективного снижения численности сараранчовых;

4. Определение температурных преферендумов отобранных штаммов;

5. Оценка продуктивности перспективных культур гриба при поверхностном и глубинном культивировании;

6. Определение биологической эффективности лабораторных образцов биопрепаратов в полевых условиях.

Научная новизна. Впервые на большой выборке штаммов, выделенных на территории Казахстана, показана высокая гетерогенность В. bassiana по признаку вирулентности в отношении саранчовых. Выявлено шесть штаммов гриба В.

6а.ш'апа, обладающих высокой биологической активностью для представителей данной группы вредителей. Для них подобраны оптимальные титры рабочей суспензии. Показано, что отобранные культуры обладают высокой вирулентностью и на насекомых других систематических групп. Для данных штаммов гриба определены температурные преферендумы и отработаны лабораторные методы глубинной и твердофазной ферментации.

Теоретическая и практическая значимость работы. В качестве перспективных штаммов-продуцентов для создания новых биологических препаратов отобраны два новых штамма гриба В. Ьазз1апа казахстанского происхождения, обладающие высокой вирулентностью в отношении различных видов саранчовых, продуктивностью и термотолерантностью. Разработаны лабораторные регламенты их производства и подобрана препаративная форма. Показана эффективность лабораторных образцов микоинсектицидов в условиях Юго-Восточного Казахстана.

Основные положения, выносимые на защиту:

- отбор культур гриба В. Ьа$$1апа, выделенных из природных источников, обладающих высокими показателями по основным целевым признакам в качестве потенциальных продуцентов новых противосаранчовых микоинсектицидов. Штамм ЮК4 - 09 подтвержден инновационным патентом;

- методы культивирования (поверхностного и глубинного) отобранных культур;

- способы использования местных штаммов гриба В, Ьаяягапа для борьбы с саранчовыми в условиях Юго-Восточного Казахстана.

Апробация работы. Материалы, полученные в ходе исследований, докладывались на 2-м междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010), 8-м межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока с участием зарубежных ученых, Новосибирск (Россия, 2010), Научной конференции ППС СПбГАУ (С.-Петербург, 2009, 2012), Международной молодежной конференции «Инфекционная патология членистоногих» (С.-Петербург, 2012), 14-м съезде Русского энтомологического общества. (С.-Петербург, 2012.), 3-м съезде микологов России. 10-12 октября (Москва, 2012), 2-й международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы и перспективы защиты и карантина растений» (Алматы, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 2 в рецензируемых российский журналах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 19 таблицами. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 215 названий, в том числе 142 на иностранных языках.

Работа выполнялась в 2008 - 2012 гг. в ТОО КазНИИЗиКР АО «Казагроино-вация» и ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии при частичной финансовой поддержке проектов по бюджетным программам Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан № 0106РК01034 и Министерства образования и науки Республики Казахстан №.0109РК00270 и 0108РК00070.

Благодарности. Автор выражает благодарность к.б.н., доценту Г.Р. Ледневу (ВИЗР Россельхозакадемии) за руководство научной работой, д.б.н., академику

НАН Республики Казахстан А.О. Сагитову, к.б.н. Б.А. Дуйсембекову, Е.Ж. Байма-гамбетову (КазНИИЗиКР, Алматы), к.б.н. М.В. Левченко (ВИЗР Россельхозакаде-мии), за помощь на всех этапах исследования, Е.М. Макарову (КазНИИЗиКР, Алматы) за ценные замечания, сделанные при работе над рукописью. Признательность за помощь в проведении экспериментальной работы всем сотрудникам лаборатории биотехнологии КазНИИЗиКР, к.б.н. В.Ю. Крюкову и О.Н. Ярославцевой (ИСиЭЖ СО РАН).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1 ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ МИКОЗОВ

САРАНЧОВЫХ

В главе приводится анализ данных литературы, посвященных распространению основных видов саранчовых на территории Казахстана, видовому составу, симптоматике, жизненным циклам грибов из анаморфных родов, паразитирующих на саранчовых. Дана характеристика основных факторов патогенности. Приведены сведения о методах культивирования энтомопатогенных грибов и их использовании для снижения численности саранчовых

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в течение пяти лет (2008 - 2012 гг.) в лаборатории биотехнологии КазНИИЗиКР и лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР. Полевые испытания биологической активности образцов биопрепаратов проводили в Жамбылской области и Алматинской областях.

В опытах по оценке вирулентности использовали 33 новых штаммов гриба Beauveria bassiana s.l., выделенных из патологического материала, собранного в ущелье реки Чапайки (Заилийский Алатау, Алматинская обл.), а также 6 культур, изолированных из погибших насекомых в Кордайском районе Жамбылской области (сухая степь). В качестве эталона использовали штамм ББК-1 из коллекции ВИЗР.

Вирулентность энтомопатогенных гифомицетов оценивали на 7 видах представителей семейства Acrididae (Locustae migratoria migratoria L., Calliptamus italiens L., Dociostaurus maroccanus Thunb., Calliptamus barbarus Costa., комплекс видов трибы Dociostaurini, Oedaleus decorus Germar, Chorthippus parallelus Zett.).

Для определения специфичности изучаемых штаммов грибов в опытах использовали местные природные популяции колорадского жука, яблонной моли и крапивницы, а также лабораторную популяцию большой вощинной огневки.

Культивирование грибов для массового получения конидий грибов производили в поверхностной культуре на агаризованных средах Сабуро и Чапека. Оценку продуктивности штаммов гриба в глубинной культуре осуществляли на жидкой среде Сабуро, а при поверхностном культивировании на сыпучих зерновых субстратах: рисе, пшене, перловой крупе.

Лабораторная оценка вирулентности грибов проводилась по стандартным методикам в садках в климакамерах.

В ходе мелкоделяночных полевых опытов насекомых обрабатывали в их естественных стациях с помощью ранцевого моторного опрыскивателя «Микронер AU-8000» (титр рабочей суспензии из расчета 1-5х1012 конидий/га). Расход рабочей жидкости 10 л/га. Площадь делянки 300 - 400 м2.

Глава 3 СКРИНИНГ ГРИБА ВЕАиУЕЫА ВАБ81АЯА ПО ПРИЗНАКУ ВИРУЛЕНТНОСТИ В ОТНОШЕНИИ САРАНЧОВЫХ

3.1 Первичный скрининг штаммов Веамепа Ьа$$1апа

В ходе первых экспериментов оценивали биологическую активность 33 штаммов гриба В. Ъа$$1апа на личинках младших возрастов природной популяции азиатской саранчи.

Выявлена высокая степень гетерогенности изучаемых культур по признаку вирулентности. Только 13 культур гриба (40% от всех испытуемых штаммов) проявили высокую биологическую активность в отношении личинок вредителя (90100% на 13-е сутки после инокуляции). При этом удельный вес слабовирулентных форм (активность менее 60%) составил 37%.

Рисунок 1 - Соотношение культур гриба В. ЪаББгапа , выделенных из насекомых различных систематических групп по признаку вирулентности на личинках азиатской саранчи

В итоге в качестве наиболее перспективных с точки зрения снижения численности азиатской саранчи были отобраны шесть изолятов гриба: ВСи,-06, ВСи22-07, ВСо6-07, В04-07, ЮК-4 и ББК-1.

3.2 Восприимчивость различных видов саранчовых к штаммам Веаигепа Ьа$$1апа

Важным элементом при разработке биопрепаратов является определение круга целевых насекомых - вредителей.

В связи с этим нами была оценена чувствительность шести видов насекомых из семейства АспсМае (азиатская саранча, итальянский прус, мароккская саранча, пустынный прус, чернополосая кобылка и конек короткокрылый) к штаммам В. Ьсихгапа, отобранным в качестве наиболее перспективных по признаку вирулентности на азиатской саранче (ВСи22-07, ЮК-4 и ББК-1).

Все испытуемые штаммы проявили высокую биологическую активность на всех указанных видах саранчовых. К 13-м суткам после заражения все обработанные особи в не зависимости от вида тест-насекомого погибли.

По динамике смертности между видами насекомых вывялены существенные различия. Наиболее высокая скорость гибели характерна для пустынного пруса и чернополосой кобылки (смертности - 85-100%. через неделю после заражения). К 9-м суткам аналогичный уровень биологической активности наблюдался еще для двух видов - итальянский прус и мароккская саранча (86,7-100%). Наибольшую устойчивость показала азиатская саранча. К этому сроку уровень смертности варьировал в пределах от 55 до 90% (в среднем по трем штаммам 75%) (рисунок 2).

22,8%

1090-100% □ 60-90% Именее 60%~|

Рисунок 2 - Чувствительность различных видов саранчовых к грибу В. Ьа$$1апа (суммарно по трем штаммам)

□ 1. ггодгаЮпа В СИ. рага11е1из ОС. КаПсив

Яй. тагоссапиэ □ С. ЬагЬагиэ ■ О. с1есогиз

Таким образом, наибольшую чувствительность к микозу проявили одиночные виды, занимающие ксерофитные стации. Близкими к ним по восприимчивости оказались и стадные виды, приуроченные аридным условиям. Наиболее высокая устойчивость характерна для азиатской саранчи. Данный вид в местах резервации занимает гигрофитные стации.

3.3 Оценка биологической активности изучаемых штаммов на насекомых из других систематических групп

Для определения уровня специфичности штаммов гриба В. Ьаз$1апа, показавших наибольшую вирулентность на саранчовых, нами был проведен ряд экспериментов по оценке биологической активности этих культур на четырех видах насекомых из других систематических групп (жуки и чешуекрылые).

На личинках колорадского жука большинство испытуемых культур гриба показали высокую вирулентность. Для пяти из шести штаммов итоговый уровень смертности хозяина на 13- сутки после заражения составил 100%. Максимальная скорость гибели наблюдалась для штаммов ВСи22-07 и ББК-1 (эталон).

НСР .05=12,4

100 # 90 | 80 | 70 " 60 50

■ Азиатская саранча П Колорадский жук О Вощинная моль

На личинках младших возрастов вощинной моли выявлен более высокий уровень гетерогенности штаммов по признаку вирулентности. Только для трех из восьми штаммов итоговый уровень смертности составил 100%. По скорости гибели лучшими, также как оказались штаммы ВСи22-07 и ББК-1.

НСР.05=24,6

НСР. «5=21,5 НСР.о5=15,9

100 * 80

ё 60 I

Б. 40 ф

? 20 О

Рисунок 3 - Сравнительная чувствительность трех видов насекомых к грибу В. Ьачх1апа (в среднем по 5 штаммам)

На гусеницах младших возрастов яблонной моли и крапивницы результаты оказались аналогичными, что и на гусеницах вощинной моли. Итоговый уровень смертности (11-е сутки после заражения) вне зависимости от вида насекомого варьировал в пределах от 45 до 95%.

Полученные данные свидетельсвуют о том, что гусеницы чешуекрылых обладают повышенной устойчивостью к возбудителю микоза, по сравнению с личинками колорадского жука. Существенных различий в чувствительности между личинками колорадского жука и азиатской саранчи выявлено не было (рисунок 3).

При этом, два штамма (ВСи22-07 и ББК-1) показали наибольшую скорость гибели тест-насекомых, как для всех указанных выше нецелевых видов, так и для личинок азиатской саранчи.

3.4 Зависимость смертности личинок азиатской саранчи и пустынного пруса от концентрации инокулюма

Важнейшим элементом при разработке технологии применения биопрепаратов является определение оптимальных доз патогена.

В этой связи был проведены опыты по определению зависимостей доза -смертность для трех отобранных штаммов гриба В. Ъаззшпа на личинках младших возрастов азиатской саранчи и пустынного пруса. Использовались рабочие суспензии с четырьмя различными титрами конидий (1х10б, 5х106,1х107, 5х107).

ВСи,,-07 ЮК-4

ББК-1

1 млн 5млн. Юмлн. 50млн. Титр конвдий

Рисунок 4 - Зависимость биологической активности штаммов гриба В. Ьс/зэкта на личинках младших возрастов азиатской саранчи (7-е сутки) и пустынного пруса (5-е сутки) в зависимости оттатрарабочей суспензии

ЕЭЬ. гг^гаупа ВС. ЬагЬагиа

Для личинок азиатской саранчи выявлены существенные различия, как по итоговому уровню смертности, так и по скорости гибели вредителя в зависимости от концентрации инокулюма. Так для штамма ВСи22-07 на 9-е сутки после заражения при концентрациях 1х107 и 5x107 уровень смертности составлял уже 90 и 100%

соответственно, то при минимальном титре (1x106) значение этого показателя не превышало 45% (рисунок 4). Этот штамм оказался самым лучшим по скорости гибели хозяина и существенно не различался с эталонной культурой ББК-1 (90100% к 11-м суткам после заражения).

При минимальной концентрации (1х10б), итоговый уровень смертности (15-е сутки после обработки) также был достаточно высок и составил 80-100%.

На личинках пустынного пруса также четко прослеживается зависимость восприимчивости личинок к микозу от титра рабочей суспензии гриба. Так если при заражении штаммом ВСи22-07 с титрами 1х107 и 5х107уже на 5-е сутки после инокуляции уровень смертности личинок достиг 80 и 90% соответственно, то при уменьшении концентрации до 1х106 - 5х10б значения этого показателя не превышали 25 - 45%. Аналогичная закономерность была выявлена и для других штаммов.

При этом уровень смертности пустынного пруса в динамике был существенно выше по сравнению с азиатской саранчой. Так к 9-м суткам после обработки во всех вариантах опыта у первого вида все обработанные особи погибли, тогда как для второго смертность при минимальных концентрациях к этому не превышала 10- 80%. Это еще раз подтверждает представленные выше данные по видовой чувствительности саранчовых.

Подводя итог настоящего раздела, следует отметить, что в отношении двух указанных видов саранчовых все три испытуемые культуры показали высокую вирулентность при титрах рабочей суспензии 1х107и 5х107.

3.5 Влияние пассирования на вирулентность штаммов гриба Веаиуепа Ьазв1сша

Одним из важных элементов в поддержании вирулентности штаммов-продуцентов является их периодическое пассирование через организм целевого насекомого-хозяина.

В этой связи нами был проведен опыт по определению влияния реизоляции на вирулентность четырех штаммов гриба - два высоковирулентные (ЮК-4 и ББК-1) и два с существенно более низкой биологической активностью в отношении личинок итальянского пруса (таблица 1).

Таблица 1 - Влияние пассирования на вирулентность гриба В. Ьа$з1апа в отношении личинок младших возрастов итальянского пруса_

Штамм Смертность, % на 7 сутки после заражения НСР.05

исходный реизолят

ВСи9-07 6,7±6,7 63,3±6,7 21,5

ВУевз-Об 40,0± 11,6 73,3±6,7 19,6

ЮК-4 40,0±11,6 66,7±13,3 22,3

ББК-1 60,0±11,6 86,7±13,3 20,5

Контроль 0,0 -

НСР.05 25,34

На данном виде вредителя во всех вариантах опыта итоговый уровень смертности (13-е сутки после заражения) составил 100%. Однако по скорости гибели хозяина между исходными культурами и их реизолятоми для всех испытуемых

штаммов были выявлены существенные различия. Особенно ярко они проявились для менее вирулентных штаммов. Так если к 7-у дню после инокуляции для исходной культуры ВСи9-06 уровень смертности не превышал 7%, то в варианте с его реизолятом значение этого показателя превысило 63%, что почти в 10 раз выше. Для штаммов ЮК-4 и ББК-1 существенные различия между исходной и пропасси-рованной культурами наблюдались только на 7-й день после заражения и не превышали 30%.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что пассирование через организм целевого насекомого-хозяина существенно повышает скорость гибели насекомых по сравнению с исходным штаммом. Особенно четко эта зависимость проявляется для культур с невысокой вирулентностью.

3.6 Оценка гетерогенности штаммов по признаку вирулентности

Поддержание стабильности по основным целевым признакам перспективных штаммов-продуцентов является одним из важнейших этапов промышленной биотехнологии. В этой связи нами был проведен эксперимент по оценке биологической активности на личинках младших возрастов итальянского пруса моноклоно-вых изолятов двух штаммов гриба В. Ьаззшпа, отобранных на предыдущих этапах исследований.

100

80

л" н 60

8

с 40

О 20

и 0

5 сутки

в

7 сутки

; ВСи22-07 исходный : ЮК4-09 исходный

Ч. ВСи22-07 ср. моноклон. IIЮК4-09 ср. моноклон.

Рисунок 5 - Гетерогенности штаммов гриба В. ЬазБ1апа по признаку вирулентности в отношении личинок итальянского пруса

Итоговый уровень смертности (9-е сутки после заражения), как для исходных культур, так и для моноклоновых изолятов составил 100%.

Несмотря на то, что в динамике смертности наблюдалось относительное высокое варьирование по клонам, существенных различий между ними и исходными культурами обнаружено не было.

Для штамма ВСи22-07 на 5-й день после заражения уровень смертности по отдельным клонам варьировал в пределах от 43,3 до 80%, на 7-й день - от 60 до 100%.

В целом средний уровень смертности суммарно по всем клонам не отличался существенно от исходных культур (рисунок 5). Так, если доля погибших особей при обработке исходными культурами на 5-е сутки после заражения составляла 56,7 и 66,7% соответственно, то в среднем по моноклоновым изолятам значения этого показателя составляли 56,6 и 62,7%.

Таким образом, проведенные исследования показали, что оба испытуемых штамма являются достаточно стабильными по признаку вирулентности и, следовательно, перспективны в качестве штаммов-продуцентов новых микоинсектицидов.

ГЛАВА 4 ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ГРИБА BEAUVERIA В ASSI AN А

4.1 Влияние температуры на прорастание конидий штаммов гриба Beauveria bassiana

Известно, что устойчивость гриба к повышенным температурам воздуха в значительной степени определяет его биологическую эффективность. Особенно этот вопрос приобретает актуальность для регионов, характеризующихся жарким и сухим климатом в течение вегетационного сезона.

Оценка термического преферендума конидий шести высоковирулентных в отношении саранчовых штаммов гриба В. bassiana, показала значительную гетерогенность испытуемых культур по данному показателю. Итоговая доля проросших спор (через 72 часа) варьировала в пределах от 0 до 85% (таблица 2).

Таблица 2 - Жизнеспособность конидий штаммов гриба В. Ьа$з1апа. при разных температурах воздуха__

Штамм Уровень прорастания конидий в капле воды, %, (температура,°С),

через 72 часа

20 25 30 35

Предгорная зона

BCui-06 39,4±6,9 36,4±9,9 27,0±7,0 12,6±4,8

BCu22-07 53,2±6,1 76,0±3,2 б,2±1,0 0,0±0,0

ВСо6-07 65,4±3,9 68,5±4,2 23,6±3,5 0,0±0,0

BD4-07 74,3±10,2 45,5±3,9 5,9±2,6 2,1 ±0,6

Степная зона

ЮК-4 70,7±6,3 26,0± 11,5 23,6±6,6 33,3±10,4

ББК-1 85,6±6,3 71,3±5,9 51,4±7,9 50,8±9,6

НСР-05 19,8 21,4 15,6 13,4

Для двух культур (BD4-07 и ЮК-4) максимальный уровень прорастания конидий наблюдается при температуре 20°С, ВСи22-07 при 25°С, а для трех остальных культур существенных различий по жизнеспособности конидий при этих температурах не было обнаружено.

При 30°С уровень прорастания конидий для большинства штаммов от 2 до 12 раза ниже по сравнению с более низкими температурами. И только эталонная культура ББК-1 проявила высокую жизнеспособность при данном температурном режиме (51,4%). При 35°С максимальный уровень прорастания конидий наблюдался у штаммов ЮК-4 и ББК-1 (33,3 и 50,8% соответственно). Таким образом, эти культуры, изолированные из ксерофитных стаций, являются наиболее термотолерантными и могут быть рекомендованы для дальнейших исследований.

4.2 Влияние температуры воздуха на интенсивность развития штаммов гриба Beauveria bassiana в поверхностной культуре

Оценка динамики радиального роста колоний отобранных штаммов гриба В. bassina в поверхностной культуре на среде Сабуро при разной температуре воздуха показала, что для данной выборки штаммов максимальный рост колоний также наблюдался при температурах 20 и 25°С. Для штамма BCur06 не было выявлено

существенных различий по итоговому диаметру колоний в интервале от 20 и 30°С, а для ББК-1 интенсивность роста при 30°С была существенно выше по сравнению с более низкими температурами.

Таблица 3 - Влияние температуры воздуха на прирост колоний штаммов гриба В. bassina, на агаризованной среде Сабуро_

Штамм Диамет р колоний, мм на 29-е сутки после посева

+20°С +25°С | +30°С | +35°С

Предгорная зона

ВСи,-06 67,5±1,3 64,0±3,0 60,8±2,3 0

BCU22-07 87,00±88,12 90,5± 1,04 53,33±2,17 2,33±0,33

BD4-07 41,3±0,9 45,7±0,7 21,3±0,9 0

Степная зона

ЮК-4 42,3±2,0 5б,3±0,9 31,3±5,2 24,7±2,2

ББК-1 34,3±0,7 31,3±0,3 48,0±1,5 0

HCP.Q5 10,5 9,6 9,4 10,9

При 35°С относительно высокий уровень мицелиального роста наблюдался только у штамма ЮК-4.

Таким образом, проведенные исследования выявили значительную вариабельность изучаемых культур по признаку термотолерантности мицелиального роста. При этом наибольшую лабильность в диапазоне температур от 20 до 30°С проявили три штамма (ВСи,-06 и ББК-1). И еще одна культура - ЮК-4 показала относительно высокую термофильность. Здесь следует подчеркнуть, что два из трех указанных штаммов были изолированы из ксирофтных стаций.

43 Продуктивность штаммов при глубинном культивировании

Одним из наиболее распространенных способов массовой наработки энтомо-патогенных грибов является жидкофазная ферментация.

Опыты по оценке продуктивности тех же пяти штаммов гриба В. Ьаз51апа, отобранных по признаку вирулентности на саранчовых, в глубинной культуре на среде Сабуро показали, что четыре из пяти изучаемых культур показали достаточно высокую продуктивность (ВСи22-07, ВВ4-07, ЮК-4 и ББК-1). Для них максимальный титр составил от 5,6 до 9,1х109 бластоспор на 1 мл (таблица 4).

Таблица 4 - Продуктивность гриба В. bassiana при глубинном культивировании на модифицированной среде Сабуро__

Штамм Титр бластоспор nxl О8, сутки посева инокуляции

3 сутки 6 сутки 9 сутки

ВСи,-06 2,00±1,56 11,10±1,0б 48,00±9,03

ВСи22-07 1,33±0,17 55,73±3,59 91,33±9,34

BD4-07 1,87±0,42 71,20±10,22 36,00±5,51

ЮК-4 0,50±0,08 64,66±3,47 38,6б±1,33

ББК-1 39,30±2,16 70,67±0,13 84,67±3,18

НСР05 2,33 9,80 12,80

При этом для штаммов ЕШ4-07 и ЮК-4 максимальная продуктивность наблюдалась на шестые сутки после посева (7,1 и 6,4 х109 соответственно). К девятому дню титр бластоспор в данном случае существенно снизился. Для двух других культур (ВСи22-07 и ББК-1) максимальные титры бластоспор наблюдались на девятые сутки - 9,1 и 8,6 х109 соответственно, что существенно выше по сравнению с другими штаммами. При этом для эталонного штамма ББК-1 продуктивность на шестой день после инокуляции существенно не различается с культурами, показавшими максимальный прирост к этому сроку.

Таким образом, с точки зрения глубинного культивирования наиболее перспективными являются культуры ВСи22-07 и ББК-1. Кроме того, достаточно технологичными в данном отношении являются также штаммы В04-07 и ЮК-4.

4.4 Продуктивность штаммов при твердофазном культивировании

Сравнительное изучение продуктивности отобранных штаммов в поверхностной культуре проводили на трех видах сыпучих субстратов: пшене, рисе и перловой крупе.

Наибольшая продуктивность конидий на всех испытуемых субстратах и для всех изучаемых культур гриба наблюдалась через две недели после инокуляции. К 21-м суткам произошел существенный спад титра конидий. Максимальный выход конидий наблюдается у эталонного штамма ББК-1 (таблица 5). В этом случае на 14-е сутки после посева в зависимости от вида субстрата выход конидий составил от 1,1х109 до 1хЮ10 с 1 тр., что существенно выше с большинством других испытуемых культур. При этом наибольшая продуктивность для этого штамма наблюдалась при его культивировании на рисе и пшене.

Таблица 5 - Продуктивность штаммов В. Ьа.^1апа при поверхностном культивировании на сыпучих субстратах_

Штамм Титр п х 10ч/г, в зависимости от субстрата на 14 сутки после посева

пшено перловая крупа рис

ВСи,-06 0,76±0,15 0,21±0,03 0,85±0,18

ВСи22-07 2,18±0,31 0,46±0,05 0,75±0,14

ВЭ4-07 0,3б±0,12 0,41 ±0,15 0,63±0,17

ЮК-4 0,88±0,23 0,51±0,13 0,95±0,07

ББК-1 6,41±1,51 1,17±0,08 10,5±0,91

НСР.05 0,56 0,69 0,35

Среди новых культур наибольшую продуктивность показал ВСи22-07. Для него выход конидий через две недели после посева на пшене составил 2,2х109 с 1 гр. Для других культур данной выборки продуктивность была существенно ниже.

Таким образом, с точки зрения наработки конидий наиболее продуктивным штаммом является эталонный ББК-1. Среди новых культур максимальная продуктивность наблюдалась у штамма ВСи22-07 (на пшене).

Глава 5 БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБА BEA UVERIA BASSIANA ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ САРАНЧОВЫХ В ПОЛЕВЫХ

УСЛОВИЯХ

5.1 Оценка биологической активности водной суспензии конидий В. bassiana при обработке кулиг в полевых условиях В 2008 году в ходе мелкоделяночных полевых опытов были проведены эксперименты по оценке вирулентности водной суспензии гифомицетов в отношении личинок 5-го возраста азиатской саранчи в окрестностях г. Уштобе Алматинской области.

Результаты проведенных исследований показали, что во всех вариантах опыта заражение личинок в поле прошло успешно. К 27-му дню после инокуляции уровень смертности хозяина при содержании его в лабораторных условиях (пластиковые контейнеры) составил 96 - 100%. При этом наибольшая скорость гибели саранчи наблюдалась в варианте со штаммом ББК-1 (100% на 15-е сутки).

Таблица 6 - Влияние солнечной инсоляции на активность гриба В. Ьазягапа (титр 5х107) в отношении личинок 5-го возраста азиатской саранчи при содержании насекомых в садках в полевых условиях (заражение в поле)_

Вариант Освещенность Смертность %, сутки после обработки

13 17 21 25 29

ББК-1 Свет 5,0±2,9 10,0±0,0 10,0±0,0 40,0± 11,6 50,0±11,6

Тень 80,0±11,6 80,0±11,6 90,0±5,8 100 100

Контроль Свет 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Тень 0,0 0,0 0,0 10,0±5,8 10,0±5,8

НСРп, 13,34 15,89 15,29 22,28 21,64

Анализ данных по уровню смертности саранчи на открытом воздухе (под изоляторами из газовой ткани) показал, что в садках, поставленных в затененном месте, гибель хозяина была существенно выше по сравнению с участком без затенения. При затенении к 25-м суткам после заражения составила 100% (таблица 6). В то же время при интенсивной солнечной инсоляции значение этого показателя к 29-му дню не превышало 50%.

Установлено, что на открытом участке уровень солнечной инсоляции достигает 80- 100 тыс. люкс, в то время как в условиях затенения значения этого показателя не превышают 4-8 тыс. люкс. При этом температура воздуха в первом случае варьировали в пределах от 22 до 45°С, то во втором от 22 до 33°С.

Выявленная закономерность, на наш взгляд, может быть обусловлена следующими обстоятельствами: 1) при высокой инсоляции и температуре происходит гибель конидий, не проникших в полость тела в течение первых 16 часов после заражения; 2) указанные условия тормозят развитие инфекции уже в полости тела хозяина.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании водной суспензии конидий В. Ьаззгапа на естественном фоне температуры и солнечной инсоляции в условиях Юго-Восточного Казахстана эффективность гриба существенно ниже по сравнению с лабораторными условиями. Это вызывает необходимость поиска различных добавок, выступающих в роли фотопротекторов.

5.2 Влияние растительного масла на биологическую активность гриба В. bassiana в полевых условиях

В настоящее время основной препаративной формой микоинсектицидов, применяемых для снижения численности саранчовых, является масляная суспензия конидий грибов, предназначенная для ультромалообъемного опрыскивания (Lomer et al., 2001 ; Faria, Wraight, 2007).

В связи с этим нами был проведен ряд опытов, направленных на оценку биологической активности данной препаративной формы на основе конидий гриба В. bassiana в условиях Юго-Восточного Казахстана.

В ходе первого эксперимента (апрель 2009 г.) оценивали биологическую активность масляной и водной суспензиями конидий гриба (штамм ББК-1; норма расхода - 1х1012/га) на личинках младших возрастов азиатской саранчи.

А Б

100

S 60

140 Ï 20

0

Рисунок 6 - Биологическая активность гриба В. Ьа5з1апа (штамм ББК-1) в на азиатской саранче (А) и комплексе нестадных саранчовых (Б) (Алматинская обл., 2009 г.)

При использовании масляной суспензии патогена уровень смертности личинок вредителя через две недели после обработки при содержании под изоляторами из газовой ткани в полевых условиях составил 75% (рисунок 6 А). В случае с водной суспензией конидий гриба его биологическая активность была существенно ниже (42%).

Аналогичные результаты были получены в том же году при обработке на личинок старших возрастов и имаго комплекса видов нестадных саранчовых, результаты. Здесь смертность вредителей при использовании масляной суспензии к 16-м суткам после обработки достигала 83% (рисунок 6 Б). Для водной суспензии, также как и в предыдущем случае, биологическая активность была существенно ниже и не превышала 44%.

Сравнительный анализ данных второго эксперимента при содержании обработанных насекомых в поле (изоляторы из газовой ткани) и в лабораторных условиях (пластиковые стаканы) показал, что в последнем случае уже на 9-е сутки после заражения все обработанные особи погибли вне зависимости от препаративной формы. Таким образом, результаты данного эксперимента показали, что при полевой обработке с помощью малообъемного опрыскивателя заражение насекомых произошло в 100% случаев.

ш

А.* " г

2 4 6 8 11 13 15 17 20 сутки

-наело —контр

-масло контр

Однако при размещении обработанных насекомых в полевых условиях (под изоляторами) максимальный уровень смертности наблюдался только на 16-е сутки и не превысил 83%. Причина этого явления кроется, как уже отмечено выше в высоком естественном температурном фоне и действии прямой солнечной инсоляции. Об этом также свидетельствует тот факт, что в полевых условиях водная суспензия гриба также оказалась малоэффективной, а масло сработало в качестве хорошего фотопротектора.

А Б

1(0 ю

(О 40

20 о

13 15 17 19 Сутки

—♦— ББК-1 ЮК-4

Коктрогъ (М»С№) —Контроль (вода)

Рисунок 12 - Биологическая активность гриба .В. Ьам/аиа (штаммы ББК-1 и ЮК-4) в отношении личинок азиатской саранчи (А) и пустынного пруса (Б) (Алматинская обл., 2010 г.)

В ходе первого опыта в 2010 году на личинках младших возрастов азиатской саранчи использовали масленую суспензию двух штаммов В. Ьавз1апа (ЮК-4 и ББК-1). Титре рабочей суспензии 1х1012/га (рисунок 12 А).

При размещении тест-насекомых в садках из газовой ткани итоговый уровень биологической активности составил 83,8 и 73,8% соответственно. При этомсамо растительное масло (без конидий), не оказывала ни какого токсического действия на личинок саранчи.

Оценка биологическая активность масляной суспензии тех же штаммов гриба на личинках младших возрастов пустынного пруса притом же титре рабочей суспензии показала, что смертность этого вида была существенно выше по сравнению с азиатской саранчой. Уже на 13-е сутки после обработки в варианте со штаммом ББК-1 погибло 97,5% особей (рисунок 12 Б).

В 2012 году оценивали биологической активность масляной суспензии уже трех штаммов гриба (ЮК-4, ВСи22-07 и ББК-1) в отношении личинок младших возрастов итальянского пруса при двух нормах расхода 1х1012 и 5х1015 конидий на гектар (рисунки 13 А и Б).

Все испытуемые культуры в обеих концентрациях показали высокую биологическую активность. На 19-й день после обработки уровень смертности личинок вредителя составил 100%. При этом выявлены существенные различия в динамике гибели в зависимости от титра конидий. При максимальном титре (5х1012) уже на 11 -е сутки после заражения вне зависимости от штамма смертность личинок составляла 88,9-98,2%. К этому сроку при более низкой концентрации уровень биологической активности варьировал в пределах от 48,3 до 64,4%. Между всеми тре-

мя штаммами при одинаковых концентрациях различий по динамике биологической активности обнаружено не было. Таким образом, в этом опыте отобранные нами штаммы существенно не отличались от эталона.

А Б

Сути Сук»

|—^—ЕБК-1 ■■•»■-•ВСц22--*--1СЖ-4—Контрод] |-»-ЕЕК-1 -■■■ВСи22-*-КЖ-<-»-Кащ!Мь|

Рисунок 13 - Биологическая активность гриба В. Ьа$з1апа (штаммы ББК-1 и ЮК-4) в отношении личинок итальянского пруса при титрах рабочей суспензии 1х1012 конидий/га (А) и 5х1012 конидий/га (Б) (Алматинская обл., 2012 г).

В целом, оценивая полученные данные нужно отметить, что использование новых биопрепаратов на основе гриба В. Ьа$я1апа в форме масляной суспензии может быть вполне эффективно для снижения численности саранчовых. Особенно это касается территорий, где использование химических инсектицидов законодательно запрещено (водоохранные зоны, заповедные территории и другие).

ВЫВОДЫ

1. Новые казахстанские штаммы гриба В. Ьазз1апа показали высокую гетерогенность по признаку вирулентности на азиатской саранче. Из тридцати трех протестированных культур высокую вирулентность показали 46% штаммов, а 37% оказались слабовирулентными. Отобрано пять культур гриба: ВСиг06, ВСи22-07, ВСо6-07, ВБ4-07, КЖ-4, показавших лучшие результаты по скорости гибели хозяина.

2. Виды саранчовых обитающие в ксерофитных стациях (итальянский и пустынный прус, мароккская саранча) обладают повышенной восприимчивостью к микозу по сравнению с мезо- и гигрофилами (азиатская саранча, конек коротко-крылый и др.).

3. На личинках азиатской саранчи и пустынного пруса наибольшую биологическую активность показали культуры ВСи22-07 ЮК-4 и ББК-1 при титрах рабочей суспензии 1х107и 5х107. Отобранные культуры гриба обладают широким спектром действия. Они проявляют высокую вирулентность кроме саранчовых на личинках колорадского жука и на ряде видов вредных чешуекрылых.

4. Выявлена высокая степень гетерогенности культур по признаку термотолерантности конидий В. ЬаБ$1апа в диапазоне температур от 20 до 35°С. Наибольшую лабильность к повышенным температурам показали штаммы, изолированные из ксерофитных стаций. Температура воздуха оказывает сильное влияние на интенсивность роста гриба в поверхностной культуре. Наибольшей термофильностью

также обладают культуры, выделенные из материала, собранного в условиях сухих степей.

5. Из пяти протестированных культур четыре обладают высокой продуктивностью при глубинной ферментации (ВСи22-07, ББК-1, BD4-07 и ЮК-4). С точки зрения твердофазного культивирования лучшим по продуктивности является эталонный штамм ББК-1. Среди новых культур максимальный выход конидий наблюдалась у культуры ВСи22-07. Оптимальным субстратом для поверхностного культивирования являются пшено и рис.

6. Применение отобранных штаммов гриба В. bassiana в форме масляной ко-нидиапьной суспензии показывает высокую эффективность для снижения численности азиатской саранчи, итальянского и пустынного пруса.

Практические рекомендации

1. Для разработки нового микоинсекгицида против вредных саранчовых предлагается использовать штаммы гриба Beauveria bassiana BCu22- 07 и ЮК-4.

2. Наработку указанных штаммов рекомендуется проводить методом поверхностного твердофазного культивирования на рисе или пшене.

3. Для эффективной борьбы с саранчовыми пред лагается использование отобранных штаммов в форме масляной суспензии методом малообьемного опрыскивания из расчета 5х1012 конидий/га по личинкам младших возрастов.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах: Статьи, опубликованные в российских рецензируемых журналах

1. Леднев Г.Р. Способы применения энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana для снижения численности саранчовых/ Г.Р. Леднев, М.В. Левченко, В.Ю. Крюков, О.Н. Ярославцева, П.В. Барашкова, А.М. Успанов, А.О. Сагитов, В.В. Глупов, В.А. Павлюшин // Иммунология, аллергология, инфектология. -2010. -№ 1. - С. 113-114.

2. Леднев Г.Р. Состояние и перспективы использования микоинсектицидов для снижения численности саранчовых/ Г.Р. Леднев, М.В. Левченко, В.Ю. Крюков, П.В. Митъковец, О Н. Ярославцева, A.M. Успанов, В.А. Павлюшин//Защита и карантин растений. -2012. -№6. -С. 18-21.

Статьи, опубликованные в прочих научных журналах и сборниках

3. Леднев Г.Р. Подходы к созданию новых микоинсектицидов и разработке стратегии их применения в защите растений для аридных зон/ Г.Р. Леднев, В.Ю. Крюков, М.В. Левченко, A.M. Успанов, А.О. Сагитов, В.В. Глупов, В.А. Павлюшин // Информационный бюллетень ВПРС МОББ. -2011. -№43. - С. 132-136.

4. Успанов А.М. Термотолерантностъ и продуктивность новых природных изолятов гриба Beauveria bassiana, перспективных для снижения численности саранчовых/ А.М. Успанов, A.C. Каменова, Н.Д. Слямова, А.Б. Бельгибаева, М.В. Левченко, Г.Р. Леднев // Вестник КазНУ. Серия биологическая. -2010. -№2(44). - С. 91 -94.

5. Смагулова Ш.Б. Биологическая эффективность полупрепаративной формы на основе штамма гриба Beauveria bassiana (bals.) Vuill. против личинок колорадского жука / Ш.Б. Смагулова, A.A. Нусипбекова, A.B. Лукина, Н.Д. Слямова, A.M. Успанов, Б.А. Дуйсембеков // Биологические науки Казахстана. - 2012. - С. 84-89.

6. Успанов A.M. Биологическая эффективность химических препаратов и препаративной формы энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. против саранчовых на юго-востоке Республики Казахстан / A.M. Успанов, A.C. Динасилов, Г.Р. Леднев, Ж.Б. Ниязбеков // Вестник КазНУ. Серия биологическая. - 2012. - №3(55). - С. 33-36.

Материалы научных конференций

7 Леднев Г Р. Проблемы и перспективы использования энтомопатогенных грибов против саранчовых / Г.Р. Леднев, М.В. Левченко, В.Ю. Крюков, П.В. Барашкова, О.Н. Ярославцева, А.М. Уепанов, АО. Сагтов, В.В. Глупов, В.А. Павлюшин // Материалы 8 Межрегианального(»вещания энтомологов Сибири и Дальнего Востока с участием зарубежных ученых. Новосибирск: -2010. -С. 281-282.

8 Леднев Г Р Скрининг штаммов гриба Beauveria bassiana по вирулентности на колорадском жуке / Г.Р. Леднев, Ш.Б. Смагулова, A.C. Каменова, A.M. Уепанов, М.В. Левченко, П.В^ Барашкова, О.Н. Ярославцева В.Ю. Крюков // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию со дня организации РУЛ «Институт защиты растений» «Интегрированная защита растений: стратегия и тактика». Минск: -2011. -С.

9 Уепанов А.М. Влияние температуры воздуха на прорастание конидий высоковирулентных штаммов гриба Beauveria bassiana/ A.M. Уепанов, Б.А. Дуйсембеков, М.В. Левченко, Г.Р. Леднев // Сборник научных трудов «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности. Ульяновск: -2011. - С. 83-85.

10 Уепанов A.M. Биологическая активность гриба Beauveria bassiana в полевых условиях Казахстана / AM. Уепанов, М.В. Левченко, Б.А Дуйсембеков, Г.Р. Леднев // Материалы межц^к^дной молодежной конференции «Инфекционная патология членистоногих». Санкт-Петербург -2012. - С. 70-72.

11 Леднев Г Р Чувствительность внутривидовых форм насекомых к возбудителям микозов / Г.Р. Леднев, Б.А. Борисов, Левченко М.В., A.M. Уепанов, П.В. Митьковец // Материалы 14-го Съезда Русского энтомологического общества. Санкт-Петербург: -2012. - С. 242.

12 Леднев Г Р Особенности скрининга энтомо- и нематопаразитических грибов для снижения численности вредителей растений / Г.Р. Леднев, Б.А. Борисов, П.В. Митьковец, Д.С. Конурова, A.M. Уепанов // Современная микология в России. Том 3. Материалы 3-го Съезда микологов России Москва: Национальная академия микологии. - 2012. - С. 344.

13 Лукина А В Поиск насекомых с признаками микоза в нижнегорьях Джунгарского Алатау и выделение новых изолятов энтомопатогенных грибов / A.B. Лукина, Н. Сейткали, А. Адилханкы-зы Е М Макаров, Е.Ж. Баймагамбегов, A.M. Уепанов // 2-ая Международная научная конференция молодых ученых «Актуальные проблемы защиты и перспективы карантина растений». Алма-

ты-Рахат: - 2012. - С. 203-205.

14 Уепанов А.М. Оценка специфичности высоковирулентных для саранчовых штаммов гриба Beauveria bassiana (Blas.) Vuill. в отношении насекомых из других систематических групп / AM Уепанов АС Каменова, Б.А. Дуйсембеков // 2-ая Международная научная конференция молодых ученых «Актуальные проблемы защиты и перспективы карантина растений». Алматы-

Рахат: - 2012. - С. 234-236.

15 Скендиров ДК. Морфофизиологические особенности перспективных изолятов энгомопатогенного гриба Beauveria Bassiana (Blas.) Vuill. / Д.К. Скендиров, А. Бельгибаева А.М. Уепанов, Б.А. Дуйсембеков // 2-ая Международная научная конференция молодах ученых «Актуальные проблемы защиты и перспективы карантина растений». Алматы-Рахат: - 2012. - L. 210-21У.

16 Скендиров Д.К. Оценка термошлершггности новых казахстанских штаммов энгомопагогенного гриба Beauveria bassiana (Blas.) Vuill. / ДК. Скендиров, AM. Уепанов, A.C. Каменова, Б А Дуйсембеков, АО. Сагигов // 2-ая Международная научная конференция молодьк ученых «Акгуаль-ные проблемы защиты и перспективы карантина растений». Алматы-Рахат: - 2012. - С. 214-216.

17 Уепанов A.M. Оценка продуктивности новых перспективных изолятов гриба Beauveria bassiana (Blas.) Vuill. / A.M. Уепанов, М.В. Левченко, A.C. Каменова, Д.К. Скендиров, Б.А. Дуйсембеков, Г.Р. Леднев // 2-ая Международная научная конференция молодых ученых «Аетуальные проблемы защиты и перспективы карантина растений». Алматы-Рахат: - 2012. - С. 216-219.

Патент

18 Сагигов А.О. Инновационный патент №26599 на изобретение. Штамм гриба Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin ЮК, - 09 для получения биопрепарата против саранчовых. / А О Сагигов, Б.А. Дуйсембеков, В.Ю. Крюков, Е.Ж. Баймагамбетов, Н.Д. Слямова, Ш.Б. Смагулова, A.M. Уепанов // Государственный реестр изобретений Республики Казахстан; 2012.

Научное издание. ИгО-печать ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ Лицензия ПЛД № 69-253. Подписано к печати 23 мая 2013 г., тир. 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Успанов, Алибек Маратович, Санкт-Петербург-Пушкин

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

04201

На правах рукописи

Успанов Алибек Маратович

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОТБОРА ШТАММОВ ГРИБА ВЕЛ \JVERIA ВАЗБЫМА ЭХ. ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ САРАНЧОВЫХ В КАЗАХСТАНЕ

\

Шифр и наименование специальности: 06.01.07 - защита растений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -кандидат биологических наук, доцент Леднев Г.Р.

Санкт-Петербург - Пушкин 2013

СОДЕРЖАНИЕ

стр

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1 Энтомопатогенные грибы - возбудители микозов саранчовых

(аналитический обзор)..............................................................................................................................................11

1.1 Видовой состав саранчовых Казахстана....................................................................................Ир

1.2 Энтомопатогенные грибы- возбудители микозов саранчовых................................14

1.2.1 Видовой состав возбудителей и распространенность..................................................14

1.2.2 Цикл развития....................................................................................................................................................21

1.2.3 Факторы патогенности микромицетов....................................................................................27

1.2.3.1 Ферментативная активность............................................................................................................27

1.2.3.2 Токсины............................................................................................................................................................33

1.2.4 Культивирование..................................................................................................................................36

1.2.5. Препаративные формы..........................................................................................................................41

1.2.6 Применение энтомопатогенных гифомицетов для подавления

численности вредных саранчовых............................................................................................................43

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................49

2.1 Место проведения исследований......................................................................................................49

2.2 Объекты исследований..................................................................................................................................49

2.2.1 Штаммы................................................................................................................................................................49

2.2.2 Тест-насекомые................................................................................................................................................49

2.3 Методика исследований..............................................................................................................................50

2.3.1 Культивирование грибов........................................................................................................................50

2.3.2 Изучение продуктивности при поверхностном и глубинном культивировании........................................................................................................................................................53

2.3.3 Определение скорости прорастания конидий в капле воды................................54

2.3.4 Определение жизнеспособности конидий..............................................................................54

2.3.5 Лабораторная оценка биологической активности........................................................54

2.3.6 Оценка биологической активности в полевых условиях..........................................55

2.3.7 Обработка полученных данных......................................................................................................57

ГЛАВА 3 СКРИНИНГ ГРИБА BEAUVERIA В ASSI AN А ПО ПРИЗНАКУ 58 ВИРУЛЕНТНОСТИ В ОТНОШЕНИИ САРАНЧОВЫХ..........................

3.1 Первичный скрининг штаммов Beauveria bassiana............................ 58

3.2 Восприимчивость различных видов саранчовых к штаммам Beauveria 62 bassiana........................................................................................

3.3 Оценка биологической активности изучаемых штаммов на насекомых из 65 других систематических групп..........................................................

3.4 Зависимость смертности личинок азиатской саранчи от концентрации 68 инокулюма....................................................................................

3.5 Влияние пассирования на вирулентность штаммов гриба Beauveria 73 bassiana........................................................................................

3.6 Оценка гетерогенности штаммов по признаку вирулентности............... 74

ГЛАВА 4 ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ГРИБА 78 ВЕЛ U VERI A BASSIANA...................................................................

4.1 Влияние температуры на прорастание конидий штаммов гриба Beauveria 78 bassiana........................................................................................

4.2 Влияние температуры воздуха на интенсивность развития штаммов гриба 81

Веат?ег'ш bassiana в поверхностной культуре........................................

4.3 Продуктивность при глубинном культивировании..................................... 84

4.4 Продуктивность при твердофазном культивировании........................ 85

ГЛАВА 5 БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБА ВЕАиУЕША ВАБЗЫКА ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЧИСЛЕННОСТИ САРАНЧОВЫХ В ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ........................................................................................ 88

5.1 Биологическая активность гриба Веашепа bassiana для контроля численности саранчовых в полевых условиях........................................ 88

5.1.1 Оценка биологической активности водной суспензии конидий Веагмег1а Ьа551апа при обработке кулиг в полевых условиях.....................

5.1.2 Влияние растительного масла на биологическую активность гриба 92 Веашег1а Ьа88{апа в полевых условиях................................................

выводы

ВВЕДЕНИЕ

Саранчовые в особенности стадные являются одной из наиболее вредоносных групп многоядных вредителей сельскохозяйственных культур. Их вспышки массового размножения отмечались ещё задолго до нашей эры в Древнем Египте, а позже - по всему Ближнему Востоку и в Китае (Лачининский (ред.), 2002).

На территории Казахстана обитает 270 видов и подвидов саранчовых. Наибольшую опасность сельскохозяйственным посевам и угодьям представляют 15-20 видов (Нурмуратов и др., 2000).

В странах СНГ на протяжении последних двух столетий было зарегистрировано 84 случая массовых вспышек саранчовых. Несмотря на значительные успехи в разработке химического метода проблема массовых размножений саранчовых на территории бывшего СССР в конце прошлого века не только не уменьшилась, а наоборот резко усилилась. В 1999 году саранчовые уничтожили в Казахстане только зерновые культуры на площади 220 тыс. га. При этом потери составили 15 млн. долларов США. В 2000 году площадь, обработанная инсектицидами, превысила 8,0 млн. га, что почти в 9 раз превосходила среднемноголетние объемы обработок всех предшествовавших лет. Затраты Республики Казахстан на противосаранчовые мероприятия составили в 1999 г.- 4,8 млн., а в 2000 - 23,0 млн. долларов (Камбулин и др., 2010).

Аналогичная ситуация складывается и на сопредельных территориях России. Так, в 2000 году для борьбы с саранчой химические обработки были проведены на площади 10 млн. га (Сергеев, Лачининский, 2006). В начале XXI века только в Южном Федеральном округе химические инсектициды против саранчовых ежегодно использовались на площади 300-500 тыс. га (Столяров, 2007).

В настоящее время в странах СНГ для контроля численности саранчовых используются только химические инсектициды. Однако, известно, что масштабное применение пестицидов имеет ряд существенных недостатков,

важнейшими из которых являются возникновение резистентных популяций вредителей и загрязнение окружающей среды. Кроме того, многолетний опыт борьбы с саранчовыми свидетельствует о том, что инсектициды обеспечивают обычно лишь временное снижение численности и вредоносности в местах их применения, но в целом, практически не могут повлиять кардинально на ход многолетней динамики численности. Напротив, тотальные обработки дестабилизируют экологическую ситуацию за счет истребления естественных врагов и природных эпизоотий, что удлиняет периоды массового размножения на несколько лет (Камбулин и др., 2010).

В связи с этим возникает необходимость поиска альтернативных экологически безопасных методов защиты растений.

Одним из таких способов подавления вредных фитофагов является микробиологический метод защиты. Особую актуальность использование биологических приемов контроля численности саранчовых приобретает для водоохранных зон и заповедных территорий, где использование химических пестицидов законодательно полностью запрещено.

Среди всего разнообразия энтомопатогенных микроорганизмов одной из наиболее перспективных групп, с точки зрения контроля численности саранчовых являются анаморфные аскомицеты из двух родов - Metarhizium и Beauveria.

Исследования с этими микроорганизмами активно проводятся во многих станах мира - США, Аргентина, Бразилия, Южно-Африканская Республика, Франция, Германия, Испания и др. (Lomer et al., 2001; Inglis et al., 2007; Charnley, Collins, 2007, Faria, Wraight, 2007). В апреле 2004 г. на заседании Консультационного комитета по пестицидам ФАО было рекомендовано расширить долю микробиологического метода в интегрированных программах контроля численности саранчовых и в первую очередь препаратов на основе энтомопатогенных грибов (Сергеев, Лачининский, 2006).

В результате проведенных за рубежом работ было создано и успешно внедрено два препарата на основе гриба Metarhizium anisopliae var. acridum -Green Muscle® (Африка) и Green Guard© (Австралия), обладающие высокой

биологической эффективностью (85-95%) против перелетной, пустынной, мароккской саранчи и кобылок (Langewald et al., 1997; Lomer et al., 2001). Ha основе В. bassiana в США созданы два экспериментальных противосаранчовых препарата - Mycocide GH® и Mycotrol®. К настоящему времени ассортимент зарубежных микоинсектицидов для контроля численности саранчовых включает 11 наименований (Faria, Wraight, 2007).

На территории СНГ исследования в этом направлении до недавнего времени были немногочисленны и носили эпизодический характер.

Кроме того, в Казахстане в начале XXI века были проведены работы по изучению видового состава возбудителей инфекционных заболеваний саранчовых, а также по испытанию препаративных форм на основе гриба Metarhizium anisopliae var. acridum и микроспоридии Nosema locusta в полевых условиях (Темрешев, 2003). Однако в результате этих исследований было показано, что коммерческие препараты (производство Китая) на основе указанных патогенов проявляют низкую биологическую активность (до 54%).

К настоящему времени в списках разрешенных к применению средств защиты растений, как в Казахстане, так и в России нет ни одного препарата на основе энтомопатогенных грибов для контроля численности вредных членистоногих и саранчовых в частности.

Уже более десяти лет в ВИЗР совместно с ИСиЭЖ СО РАН (г.Новосибирск) проводятся интенсивные работы по разработке новых микоинсектицидов (Крюков и др., 200., Левченко, 2007; Леднев и др., 2012). В последние годы к этим исследованиям активно подключились сотрудники КазНИИЗиКР и настоящая работа является составной частью данных совместных исследований.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлась скрининг новых штаммов-продуцентов микоинсектицидов на основе гриба Beauveria bassiana эффективных для подавления численности наиболее вредоносных видов саранчовых в условиях Казахстана. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отбор новых штаммов и природных изолятов казахстанского происхождения гриба В. Ъазъ'шпа по признаку вирулентности в отношении саранчовых;

2. Оценка специфичности отобранных культур гриба в отношении насекомых из других систематических групп;

3. Подбор оптимальных концентраций инокулюма для эффективного подавления численности сараранчовых;

4. Определение температурных преферендумов отобранных штаммов;

5. Оценка продуктивности перспективных культур гриба при поверхностном и глубинном культивировании;

6. Определение биологической эффективности лабораторных образцов биопрепаратов в полевых условиях.

Научная новизна. Впервые на большой выборке штаммов, выделенных на территории Казахстана, показана высокая гетерогенность В. Ъа851апа по признаку вирулентности в отношении саранчовых. Выявлено шесть штаммов гриба В. Ъа$$\апа, обладающих высокой биологической активностью для представителей данной группы вредителей. Для них подобраны оптимальные титры рабочей суспензии. Показано, что отобранные культуры обладают высокой вирулентностью и на насекомых других систематических групп. Для данных культур гриба определены температурные преферендумы и отработаны лабораторные методы глубинной и твердофазной ферментации.

Теоретическая практическая значимость работы. В качестве перспективных штаммов-продуцентов для создания новых биологических препаратов отобраны два новых штамма гриба В. Ъа88\апа казахстанского происхождения, обладающие высокой вирулентностью в отношении различных видов, саранчовых, продуктивностью и термотолерантностью. Разработаны лабораторные регламенты их производства и подобрана препаративная форма.

Показана эффективность лабораторных образцов микоинсектицидов в условиях юго-восточного Казахстана.

Основные положения, выносимые на защиту:

- отбор культур гриба В. Ъа$8\апа, выделенных из природных источников, обладающих высокими показателями по основным целевым признакам в качестве потенциальных продуцентов новых противосаранчовых микоинсектицидов. Штамм ЮК4 - 09 подтвержден инновационным патентом;

- методы культивирования (поверхностного и глубинного) отобранных культур;

- способы использования местных штаммов гриба В. Ьа&$1апа для борьбы с саранчовыми в условиях юго-восточного Казахстана.

Апробация работы. Материалы, полученные в ходе исследований, докладывались на 2-м междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010), 8-м межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока с участием зарубежных ученых, Новосибирск (Россия, 2010), Научной конференции ППС СПбГАУ (С.-Петербург, 2012), Международной молодежной конференции «Инфекционная патология членистоногих» (С.-Петербург, 2012), 14-м съезде Русского энтомологического общества. (С.-Петербург, 2012.), 3-м съезде микологов России. 10-12 октября (Москва, 2012), 2-й международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы и перспективы защиты и карантина растений» (Алматы, 2012).

Личный вклад соискателя. Сбор и выделение грибов, а также полевые испытания отобранных культур проводился диссертантом совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии КазНИИЗиКР, а также коллегами из ВИЗР Россельхозакадемии (С.-Петербург) и ИСиЭЖ СО РАН (Новосибирск). Лабораторные эксперименты, анализ и обобщение результатов исследований выполнены лично автором.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, и получен 1 инновационный патент.

Благодарности. Автор выражает благодарность к.б.н., доценту Г.Р. Ледневу (ВИЗР Россельхозакадемии) за руководство научной работой, д.б.н., академику НАН Республики Казахстан А.О. Сагитову, к.б.н. Б.А. Дуйсембекову (КазНИИЗиКР, Алматы), к.б.н. М.В. Левченко (ВИЗР Россельхозакадемии), за помощь на всех этапах исследования, Е.М. Макарову и Е.Ж. Баймагамбетову (КазНИИЗиКР, Алматы) за ценные замечания, сделанные при работе над рукописью. За помощь в проведении экспериментальной работы я признателен всем сотрудникам лаборатории биотехнологии КазНИИЗиКР, к.б.н. В.Ю. Крюкову и О.Н. Ярославцевой (ИСиЭЖ СО РАН).

ГЛАВА 1 ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ МИКОЗОВ САРАНЧОВЫХ

(аналитический обзор)

1.1 Видовой состав саранчовых Казахстана

Как уже отмечено выше на территории Казахстана обитает 270 видов и подвидов саранчовых. Наибольшую опасность сельскохозяйственным посевам и угодьям ежегодно представляют 15-20 видов. В их числе стадные саранчовые -итальянский прус (Caíliptamus italicus L.), перелетная азиатская (Locusta migratoria migratoria L.) и мароккская саранча (Dociostaurus maroccanus Thnb.); нестадных - крестовая (Arcyptera microptera F.d.W.), атбасарская (.Dociostaurus kraussi Ingen.), чернополосая (Oedaleus decorus Germ.), темнокрылая (Stauroderus scalaris F.d.W.), белополосая (Chorthippus albomarginatus DeG. (Stauroderus scalaris F.d.W.), сибирская кобылки (Aeropus sibiricus L.) и др. (Нурмуратов и др., 2000).

По данным К.А.Васильева (1965), в Центральном Казахстане итальянский прус встречается на высоком уровне численности от лесостепной до полупустынной зон. Заселяемые им местообитания наиболее разнообразны в

Ш* г г

степях, плотность популяций здесь максимальна. Но тяготение пруса к полынникам проявляется весьма отчетливо: только личинки пятого возраста и имаго начинают расселяться в другие типы местообитаний (Соболев и Сергеев, 1985).

Вместе с тем в Восточном Казахстане четко очерчен и другой район, в пределах которого численность пруса бывает, как правило, высока и где могут отмечаться его вспышки, - это территория, занятая сосновыми борами на песчаных массивах (Бунин, 1979).

На Западе Казахстана (Актюбинекая область) прус с максимальной численностью заселяет полупустыни с ковыльно-типчаково-полынной растительностью на легких супесчаных почвах, тогда как в злаковых степях и солянково-полынных пустынях его численность несколько ниже (Жасанов, 2001).

На Юге Казахстана поселения итальянского пруса связаны в основном с речными долинами и оазисами (Лепешкин, 1931, 1934; Лер, 1962). В пределах последних он может размножаться в массе и, в результате, нередко является серьезным вредителем хлопчатника и люцерны. В связи с резким сокраще�