Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Органная культура опухолевого и нормального эпителия человека и животного

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Органная культура опухолевого и нормального эпителия человека и животного"

"О од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

УДК 616-003.737

ГАЙНУЛЛИНА СУРАЙЯ МЕЛИКОВНА

ОРГАННАЯ КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВОГО И НОРМАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНОГО

03.00.02. - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук-

Пущино - 1993

Работа выполнена в лаборатории цитотехнологии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научный руководитель: доктор технических наук , профессор Э.И.Лежнев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н. А. Костенко, доктор биологических наук Д. А. Мошков.

Ведущая организация: Институт никробиологии и эпидемиологи! им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва.

Защита состоится "21" октября 1993г. в часов в здании специализированного совета л 200.22.01 в Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142292 г. Пущино Московской области. -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Автореферат разослан " " сентября 1993 года

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

П. А. Нелипович

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Возможности использования культур клеток и тканей для оценки эффективности действия противоопухолевых прегар iтов исследуются п точение нескольких десятилетий. Однако корректiровка химиотерапии о клинических условиях путем onpfдел1 чия интивидуальной чувстпительности опухоли к антираковым препаратам до нас г ояшего времени не находит практического применения в российских клиниках Этот подход используется в некоторых зарубежных медицинских центрах, при этом действие противоопухолевых препаратов йены гыпаеi с я чаше всего либо на нлет очных культурах, либо на клонированных опухолевых клетках. Полученные прогнозы устойчивости опухолей к антираковыи препаратам при использовании таких испытаний in vitro подтверждаются у пациентов в среднем на 60 - 70У, в случае положительных предсказаний и на 90У. в случае отрицательных предсказаний. Эти данные свидетельствуют об отсутствии полной адекватности процессов, происходяших в используемых испытательных моделях с событиями , происходяшшими в опухолях in vivo Бчлее близкой моделью для скрининга антираковых препаратов может служить органная культура эксплантата опухоли, развивающаяся на различных подложках. при этом в процессе культивирования кусочка ткани сохраняются различные компоненты эксплантата, анатомическое строение и функционирование которых близко напоминают родительскую ткань Одним из достоинств этого метода является возможность исспелованим на тотальных препаратах с развивающейся органной культурой связи между образующейся зоной роста и исходной тканью. Однако метод требует ряд усовершенствований для облегчения исследований динамики клеточных перемещений. Практичское применение органных культур в клинических исследованиях затрудняется -сравнительно коротким временим их жизни. Кусочки тканей в отличие от клеточных суспензий сложно сохранить вне условий культивирования Общепринятые способы криоконсервирования клеточных суспензий не эффективны для тканей, которые при этом теряют свои исходные свойства и становятся непригодными для дальнейшего культивирования Изучение клеточных взаимодействий в органной культуре эпителия с усовершнествованием методов культивирования и наблюдения за развитием ткани в культуре, а также нахождение возможности длительного консервирования кусочков тканей с сохранением всех натип-ных свойств ткани может сделать эффективным использование в клинике органного культивирования опухолевых эксплантатов с целью индивидуального скрининга противоопухолевых препаратов.

LIEJIb РА60ТЫ: Усовершенствование метода органного культивиро-

вания для использования его при индивидуальном подборе противоопухолевых препаратов и поиски способов длительного сохранения ткани в нативном состоянии. Это необходимо для практических клинических исследований и для решения задач экспериментальной онкологии.

РЕШАЛИСЬ СЛЕДУЮЩИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАЛАМИ

1. Исследовать развитие нормальной эпителиальной ткани млекопитающего в органной культуре на "плотиках" с помощью новых приспособлений и аппаратуры.

2.Провести сравнительные исследования развития опухолевого и нормального кишечного эпителия пациентов в органной культуре с использованием методов, доступных для применения в клинической практике

3. Найти метод создания банка опухолевых и нормальных тканей человека

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Исследовано развитие клеточных взаимоотношений в зоне роста эпителия млекопитающего и контактные взаимоотношения между зонами роста в зависимости от условий культивирования.

Проведено параллельное исследование развития опухолевой и нормальной ткани кишечника человека и установлено различие в поведениии опухолевых и нормальных тканой конкретных пациентоп в условиях органной культуры.

Найдена возможность криоконсервирования кусочков тканей животного и человека, с сохранением всех нативных свойств исходной ткани, что может сыграть важную роль в клинической практике и экспериментальной медицине.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Усовершенствованы методы наблюдения за развитием ткани в условиях органного культивирования.

Модифицирована методика органного культивирования эксплантатов для проведения индивидуального скрининга противоопухолевых препаратов на опухолевых и нормальных тканях пациентов, применимая в клинических условиях.

Найден принцип создания банка опухолевых и нормальных ткачей пациента в клинике, что важно не только для эффективного индивидуального скрининга цитостатиков in vitro в любые периоды жизни пациента, но может сыграть существенную роль в решении проблем экспериментальной онкологии и трансплантологии.

АПРОБАЦИЯ РАбОТЫ. Основные результаты работы доклалыпались

на 3-ем Всесоюзном совещаниии "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1990$ на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре", Ленинград, 1990$ на Всероссийском совещании "Биология клетки в культуре. ", Санкт-Петербург, 1992.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ и 2 работы приняты в печать.

ОБ'ЕМ И СТРУКТУРА РА60ТЫ. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (гл. 1), описания материалов и методов исследования (гл.2), изложения полученных результатови и их обсуждения (гл. 3- 5), выводов и списка литературы, содержащего 138 наименований.

МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве об'ектов исследования были выбраны: а) мочевой пузырь кролика как модельная культура, б) участки аденокарциномыи нормальной ткани толстого кишечника человека как основной об'ект для получения требуемых результатов.

Фрагменты тканей, предназначенных для культивирования, иссекали из мочевого пузыря кролика, забитого под нембуталовым наркозом, и из участка толстой кишки человека, удаленной во время операции по поводу аденокарциномы. После промывки в среде Игла, содержащей пенициллин или канамицин (360 мг/мл) ткани разрезали на кусочки размером О,5 мм. Эти фрагменты сразу после иссечения переносили в среду культивирования, где до начала культивирования они находились 4 часа: а) в среде Игла при 4°С или б) в перфторуглеродной эмульсии (ПФУЭ). В другом варианте опытов кусочки ткани замораживали: а) сразу после иссечения б) после выдерживания в ПФУЭ в течении 4-х часов. Материал замораживали по общепринятой методике до -70°С при скорости замораживания 1°С в минуту с использованием в качестве криопротектора диметилсульфок-сида (DMSO). Замороженный материал хранили в жидком азоте , оттаивание проводили быстрым помещением сосудов с материалом в водяную баню при температуре 38°С. В состав использованной ПФУЭ входили фторганическое соединение (ФОС) -10%, детергент - 4% в ;олевой среде, содержащей NaCI -102 mM, КС1 - 3,5 тМ, NaHgPO^ -1,2 тМ, NaHC03 - 11 тМ, глюкоза-10 тМ, рН эмульсии 7,4 -8.10 тМ, зН энульсии 7, 4 -8.

Эксплантаты мочевого пузыря кролика инкубировали по методу (ножественного органного культивирования (Chen, 1954; Лурия,1972). (ля этого фрагменты ткани помещали на дно чашки Петри с небольшим юличеством среды Игла, содержащей антибиотик, разрезали на кусочки

величиной О,3 - О, 4 мм, каждый из которых переносили на "плотик" из миллипорового фильтра типа НА диаметром 5-6 мм. "Плотики" устанавливали над конусными сквозными отверстиями в кольцеобразной платформе из оргстекла (наружный диаметр 55 мм, толщина 2 мм, ножки высотой 2 мм). Платформы ставили на дно чашки Конвея и заполняли средой так, чтобы смачивалась нижняя поверхность фильтра , и эксплантат находился на границе жидкой и воздушной фаз. Затем чашку продували смесью воздуха с 5*/.-107. СО^ и герметически закрывали стеклянной крышкой, смазанной смесью воска и вазелина (5:95). Платформы помешали и на на дно чашек Петри, которые устанавливали в инкубатор СО^ типа УЛИ-2. Кроме этого, модифицируя метод Тго-well(1954),плотики устанавливали на специальные металлические сеточки, стоящие на ножках на дне чашки Петри и покрытые полоской бумаги, опущенные концы которой впитывают среду со дна чашки Петри. Чашки с сеточками помещали в инкубатор С02 Среду меняли 2 раза в неделю. Продолжительность культивирования - от 3-х до 11 дней. Используемая среда имела следующий состав: среда Игла и среда RPMI в соотношении 1:1 - 80%, гретая бычья сыворотка - 157., эмбриональная телячья сыворотка - 5%, глютамин - 0,5 мг на мл, аскорбиновая кислота -1,5 мг на мл, глюкоза - 4 мг на мл, дезок-симетазон - 10 ® М ( "Галеника", Югославия) , инсулин - 1 мг на мл, канамицин 120 ед. на мл. При культивировании аденокарциномы толстой кишки человека в среду добавляли 2, 57. сыворотки крови больного. Для гистологического исследования материал фиксировали через 8-11 дней культивирования. "Плотик" с прикрепленным к нему эксплантатом осторожно промывали средой Игла и опускали в Эб^этанол на 20 -30 мин, затем переносили его в 70 этанол, где материал мог храниться длительное время.Препараты окрашивали гематоксилин-эозином. Основным требованием к препаратам являлось сохранение целостности связи эксплантата и зоны роста. Для избежания механических повреждений манипуляции, связанные с перенесением "плотика" из одной среды в другую, старались свести до минимума. Для этих целей нами была изготовлена камера для тотальных препаратов. Окрашенный материал после ополаскивания "плотика" дистиллированной водой помещали в центр стеклянного кольца, приклеенного эпоксидной смолой к предметному стеклу . Затем пространство,, ограниченное кольцом, заполняли смесью желатины и глицерина и герметически с помощью специальной замазки закрывали покровным стеклом Этот способ не требует предварительного обезвоживания, позволяя избежать дополнительных манипуляций. Полученные таким образом тоталь-

ные препарараты хранили при Для приготовления тотальных пре-

паратов использовали также заливку канадским бальзамом с предварительным обезвоживании препарата в серии возрастающего по концентрации по этанола, а-затем в ксилоле. Исследование гистологического состояния эксплантата и зоны роста и получение микрофотографий проводили с помощью микроскопов "Jenoval и "Opton".

Для прижизненного наблюдения за развитием зоны роста эксплантата в органной культуре использовали созданную в лаборатории цитотехнологии ИТЭБ РАН специально для этих целей установку -(Лежнев, Казаков, 1992).

Для исследования гистологических срезов тотальных препаратов, использовали общепринятый метод заливки в парафин с последующим изготовлением срезов на микротоме. После удаления парафина с помощью проведения через растворы ксилола и спиртов с уменьшающейся концентрацией срезы заливали канадским бальзамом и исследовали под микроскопом.

Ультраструктуру исходных тканей опухоли и здоровой части толстой кишки человека исследовали на фрагментах этих тканей,

3

взятых сразу после эксирпации (величина фрагментов около 10 мм ), зафиксированных в 0,5% растворе глютарового альдегида. Фрагменты выдерживали в фиксаторе не менее 12 часов с последующей постфиксацией в О, 5 - О, 8У. Оа Од, продолжавшейся не менее 6 часов. Оба фиксатора готовили на 0,1 М какодилатном буфере, pH 7,4 - 7,6. Фиксированный материал обезвоживовали в серии возрастающего по концентрации этанола, в каждом не менее 10 минут. Материал, заключенный в Эпон 812/Аралдит использовали как для получения полутонких ( на ультрамикротоме "Reichert"б Австрия), так и для ультратонких срезов (на ультрамикротоме LKB, Швеция). Ультратонкие срезы окрашивали в насыщенном уранилацетаток растворе 70'/. ацетоне (5 -10 мин. ) и цитрата свинца (5 - Юмин). Исследования проводили на электронном микроскопе JEM-100B, (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Органное культивирование мочевого пузыря кролика (КПК).

Гистологическое исследование МПК, выращиваемого в органной культуре от 3-х до 11-ти дней, показало, что при помещении эксплантатов в условия культивирования сразу после иссечения из органа идет активное образование зоны роста. Основными ее компонентами являются эпителиоподобные и фибробластоподобные клетки, а также макрофаги. Эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму,

светлоокрашенную цитоплазну и пузырьковидное ядро. Они расположены в виде небольших групп или в виде обширных эпителиальных пласто между которыми расположены скопления макрофагов - округлых, свободно лежащих клеток со светлой цитоплазмой и эксцентрически расположенным ядром. Макрофаги в больших количествах находятся на поверхности эпителиальных пластов и между фибробластоподобными клетками, которые находятся вблизи эксплантата. Однако в основном фибробластоподобные клетки находятся на периферии зоны роста, где, соединяясь своими длинными отростками, формируют рыхлую сеть. Сравнение препаратов показывает различие между гистологическими картинами на 8-ой и 11-ый дни культивирования. Так на 8-ой день культивирования в зоне роста обнаружены лишь клетки одного типа -эпителиоподобные, которые, судя по их состоянию (отсутствие клеточных границ, конденсация хроматина и пикноз ядер), находятся на стадии разрушения. На 11-ый день на препаратах видна мощная зона роста, сформированная разнообразными клеточными элементами. Их строение (четкие границы, структурированность ядра и цитоплазмы ) свидетельствует о том, что это жизнеспособные клетки, активно участвующие в морфогенетических процессах. Культивирование эксплантатов в среде с 15У. эмбриональной сыворотки теленка ведет к ускорению развития зоны роста и появлению картины роста на 3-ий день культивирования, сходной с таковой на 8-ой день на более бедной среде.

Обработка эксплантатсв мочевого пузыря кролика.

При культивировании эксплантатов, выдерживавшихся перед культивированием при 4 С в ПФУЭ, было показано, что на 8-ой день куль-тивировния вокруг эксплантата образовалась нощная зона роста, имеющая сложный клеточный состав. Многочисленные макрофаги наблюдаются рядом с эксплантатом и на значительном расстоянии от него. Эпителиоподобные клетки расположены или отдельными скоплениями, или формируют пласт. Рядом с эксплантатом и в толще пласта клетки мелкие с плохо различимыми границами. На периферии эпителиальный -пласт состоит из более крупных полигональных клеток со светлой цитоплазмой и светлым ясно очерченным ядром, имеющим четкую сетчатую структуру. По периферии зоны роста расположены фибробластоподобные клетки. На 11-ый день культивирования зона роста очень хорошо развита, однако в ней наблюдались и деструктивные процессы, о чем можно судить по обилию макрофагов и разрушающихся эпителиальных клеток. Исследование состояния эксплантатов, помещенных в культуру после 4-х часового содержания в среде Игла при 4 С

показало, что такое пребывание при 4°С не оказывало принципиального влияния на жизнеспособность эксплантата. В некоторых случаях наблюдалось более медленное развитие зоны роста. на этом фоне проявилось защитное действие перфторановой эмульсии. Обработанные ею эксплантаты на 8-оЙ день культивирования сохраняли клеточное строение, а вокруг них наблюдали мощную зону роста, представленную многослойным эпителиальным пластом. Расположенные по краю обрастания фибробластоподобные клетки свидетельствуют о возможности -дальнейшего распространения клеток по подложке. Обширные участки, состоящие из разрушающихся клеток и обилие макрофагов характеризуют деструктивные процессы, которые, судя по препаратам 11 дня -культивирования, усиливаются в период от 8-го до 11-го дня. В наших экспериментах показано, что состояние культуры, развившейся из эксплантата, обработанного перфторановой эмульсией, на 8-оЙ день культивирования больше соответствует состоянию контрольной культуры на 11-ый день культивирования. Применение ПФУЭ для хранения эксплантатов перед их помещением в органную культуру не только не снижает их жизнеспособности, но, возможно, и стимулирует более быстрое формирование зоны роста. Культивирование эксплантатов после прохождения ими процедур замораживания - размораживания дало следующие результаты: эксплантаты, замороженные без предварительной обработки перфторановой эмульсией, в большинстве случаев не сформировали зону роста ни на 8-ой, ни на 11-ый день культивирования. Обработка эксплантатов перед замораживанием ПФУЭ привела к резкому повышению жизнеспособности эксплантатов, что проявилось в ихспособности формировать мощную зону роста. Она состоит, в основном, из эпителиоподобных клеток, сформировавших обширные клеточные поля, между которыми находятся скопления свободно лежащих макрофагов. Последние в большом количестве заселяют поверхность самих эпителиальных пластов. Через 11 дней культивирования вокруг эксплантата наблюдается хорошо выраженная зона роста, представленная широким пластом эпителиоподобных клеток$ в центре слоя и около эксплантата расположены мелкие клетки, в которых хорошо просматривается овальное тонко гранулированное ядро с 1-2-мя ядрышками. Близко к краю эксплантата лежат более крупные клетки с зернистой цитоплазмой и крупным гранулированным ядром, имеющим четкие очертания. Форма клеток овальная или полигональная. Среди эпителиоподобных клеток изредка встречаются митозы.

Поведение зон роста МПК, развивающихся навстречу друг другу.

- в -

Проведено исследование развития зон роста эксплантатов кочевого пузыря кролика, посаженных на подложке на расстоянии 1 -2 ни друг от друга с целью наблюдения за контактными взаимодействиями между 2-мя растущими навстречу друг к другу эпителиальными слоями, происходящими из нормальной ткани млекопитающего. Во всех случаяхпо-граничная зона представлена слоем, включающем клетки от обоих эксплантатов и множество макрофагов. Иногда наблюдается клиновидное внедрение клеток одного эксплантата в зону второго. Весь клин практически "оцеплен" макрофагами.

Поток клеток от обоих эксплантатов навстречу друг к другу неравномерен. Наблюдается небольшое доминирование одного потока над другим при равномерном развитии зон роста со свободной стороны экспланта. Распределение митотических индексов (МИ) в зонах роста в среднем выглядит следующим образом:

Пограничная зона со стороны 1-го эксплантата: Кол-во делящихся клеток 62

_ - _ ; МИ - 6,2 %

Кол-во неделящихсй клеток 1000

Пограничная зона со стороны 2-го эксплантата: Кол- во делящихсяся клеток 11

; МИ - 1,1%

Кол-во неделящихся клеток 1000

Возле самих эксплантатов митозы единичны. На периферии, со свободной стороны: МИ 1-го эксплантата 0,2/., МИ 2-го эксплантата -0,37..

На более поздних стадиях развития от эксплантатов отходят по 1-му крупному потоку клеток, направленному в сторону другого эксплантата. Они проходят рядом не перекрываясь. Клетки 1-го и 2-го эксплантатов отличаются: клетки 1-го эксплантата (проходят сверху) округлой формы и несколько крупнее клеток другого эксплантата, более темноокрашенные. От 2-го эксплантата идет поток светлоокрашенных мелких вытянутой формы клеток. Между клетками эксплантатов достаточно четко различимая граница. Клетки 2- го эксплантата -вплотную подходят к ней, но не перемежаются с клетками другого эксплантата. В пограничном пространстве наблюдается большое количество макрофагов, которые различаются по размерам: от мелких до крупных раздувшихся. Они расположены вдоль всей границы.

Потоки клеток от разных эксплантатов идут , не перекрываясь. Один поток проходит под другим ( в разных плоскостях).

ОРГАННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭКСПЛАНТАТОВ ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ (ЭОТ) И ЭКСПЛАНТАТОВ НОРМАЛЬНОЙ ТКАНИ (ЭНТ) ТОЛСТОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА.

В проведенных нами исследованиях было показано, что вокруг эксплантатов опухолевой и нормальной ткани толстой кишки человека с 8-го дня начинает формироваться зона роста, которая даже при оптимальном развитии эпителиального слоя к 14 дню культивирования на среде без добавления сыворотки больного распространяется по радиусу от эксплантата на расстояние, не превышающее более 2-х длин самого эксплантата.

Зона роста ЭОТ и ЭНТ развивается активнее при добавлении в среду сыворотки крови больного. . Эксплантат нормального кишечного эпителия, обработанный в течении 4-х часов ПФУЭ окружен обильной зоной роста , состоящей из клеток разного строения. Формирование зоны роста вокруг эпителия здоровой ткани как правило начинается позже, чем вокруг опухолевого эксплантата. Особенностью препаратов ЭНТ кишечной стенки является наличие длинных гомогенноокрашенных тяжей аморфного строения. Они расположены и над клеточной частью культуры и особенно по внешней границе зоны роста. Возможно предположить, что это слизь, выделяемая клетками эксплантата и зоны роста, и что именно она является причиной некоторого отставания в развитии зоны роста от опухолевой ткани.В нормальных несекретирующих слизь МПК никакой задержки в развити зоны роста не наблюдается. По всему клеточному слою нормального кишечного эпителия рассеяны макрофаги. При тех же условиях культивирования эксплантаты аденокар-циномы толстой кишки человека окружены настолько мощной зоной роста, что она заполняет собой всю поверхность миллипорового фильтра. Основную часть зоны роста составляет сплошной эпителиальный слой клеток, так плотно прилегающих друг к другу, что границы их плохо различимы. Их цитоплазма окрашена однородно и не содержит никаких включений ( крайне редко в них встречаются мелкие пустые вакуоли). Ядра этих клеток прозрачные, мелкие, овальной или более удлиненной формы. В большинстве ядер можно различить по одному ядрышку. Встречаются также очень мелкие ядра с интенсивно окрашенным хроматином. Такие ядра имеют вид коротких темных палочек. Среди эпите-лиоподобных клеток, за исключением мест плотного скопления клеток и края обрастания, часто обнаруживаются картины митоза. На исследованных препаратах не обнаружены макрофаги.

Обработка ЭОТ и ЭНТ 5-фторурацилм привела к различному характеру подавления развития зон роста.

Исследования препаратов ЭОТ, помешенных в культуру, после

предварительного замораживания при -196^С показало, что после процедуры замораживания - размораживания в большинстве случаев зоны роста не образуется вовсе, а эксплантат окружен анорфной прозрачной массой без каких-либо признаков клеточного строения. ЭОТ и ЭНТ лишены жизнеспособности. Если перед замораживанием кусочки ткани были обработаны ПФУЭ, то последующее их культивирование дает совершенно другие результаты. Как показывает изучение гистологических препаратов, вокруг ЭОТ образуется мощная зона роста. На некотором расстоянии от эксплантата клетки имеют эпителиообразный вид и образуют рыхлую ткань с большими межклеточными пространствами. По всей зоне роста видны многочисленные митозы и фибробластопо-добные клетки с короткими отростками. По краю обрастания расположены самые крупные клетки, их ядра часто имеют неправильную форму и содержат крупные ядрышки. Наблюдаются двуядерные клетки. ЭНТ в той же ситуации развиваются идентично свежеэксерпированным тканям.

Поведение зон роста ЭОТ и ЭНТ, растущих навстречу друг другу.

Эксплантаты опухолевых и нормальных тканей культивировали, как и в случае МПК, помещая их на подложке на расстоянии 1-2 мм друг от друга. Культивирование проводили в разныз сочетаниях: а) ЭНТ - ЭНТ, б)ЭОТ - ЭОТ, в) ЭОТ - ЭНТ. В случае а) наблюдалось отклонение от радиального направления клеток зон роста и латеральное ориентирование клеток в пограничной зоне роста, четко обнаруживающее место встречи зон. В случае б) наблюдалась активная взаимная инвазия зон роста, в случае в) наблюдалась невзаимная инвазия со стороны ЭОТ и скопления пикнотических ядер вблизи ЭНТ, слабое развитие зоны роста ЭНТ в сторону ЭОТ по сравнению со свободной зоной роста.

Такое поведение при совместном культивировании на подложке может быть использовано в клинике. Органная культура ЭОТ и ЭНТ пациента может выращиваться в контроле и под действием цитостатикв. Затем с помощью приспособления для тотальных препаратов, описанного выше, могут быть исследованы 3 варианта взаимотношенй соседних зон роста в контроле и под действием лекарства. Характер поведения при встрече зон роста в контроле может служить маркером для опухолевых и нормальных тканей. Иожет быть дана оценка действия цитостатика для данного индивидуума.

ВЫВОДЫ.

1. Установлены четкие различия в развитии и норфологии зон роста эксплантатов опухолевой и нормальной ткани эпителия в органной культуре.

2.Скорость образования зон роста опухолевых и нормальных эксплантатов человека и животного в органной культуре зависит от состава культуральной среды и может регулироваться с его помощью.

3. Зоны роста соседних идентичных эксплантатов стимулируют развитие друг друга, при этом подтверждается контактное торможение, обнаруженное АЪегсготЫе на фибробастах. у нормальных тканей и отсутствие такого у опухолевых тканей.

4. Установлено, что использование сыворотки крови больного контрастирует различие в поведении опухолевой и нормальной ткани при органном культивировании.

5. Обработка перфторуглеродной эмульсией способствует более длительному сохранению кусочков ткани после эксирпации.

6. Обработка перфторуглеродной эмульсии перед криоконсервиро-ванием способствует сохранению нативных свойств эксплантатов эпителиальных тканей и нормальному развитию после хранения в жидком аз оте.

7. Предложена схема . позволяющая идентифицировать два со седних эксплантата тканей пациента на одной подложке в органной культуре в различные моменты развития, что может быть использовано для индивидуалього скрининга противоопухолевых препаратов.

8. Разработанные методы могут быть переданы для использования в клинических лабораториях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. С. М. Гайнуллина, Э. И. Лежнев, В. Б. Александров, В. И. Попов. "Органное культивирование опухолевой и нормальной ткани прямой кишки человека". 3-е Всеесоюзное совещание "Культ ивирование клеток животных и человека" Пленарный доклад. Пущино, 13-15 фев-раля1990 г.

2.С.М.Гайнуллина, Э.И.Лежнев. "Органное культивирование эпителия мочевого пузыря кролика " 3-е Всесоюзное совещание "Культивирование клеток животных и человека", Стендовый доклад. Пущино, 13-12 февраля 1990 г.

. 3. С. М. Гайнуллина, Э. И. Лежнев, В. Б. Александров, В. И. Попов. "Органное культивирование эпителиальных тканей человека и млекопитающих". Всесоюзное совещание "Биология клетки в культуре". Стендовый доклад. Ленинград, октябрь 1990 г.

4.Гайнуллина с.М., Лежнев Э.И., Александров В. Б. , Попов В. И. "Органное культивирование эксплантатов из аденокарциномы толстой кишки человека". Экспериментальная онкология, 1991, Т. 13, с. 11.

Депонированная статья, 12 стр.

5. С. М. Гайнуллина, Э.И.Лежнев. Н. Ю Сахарова. "Использование перфторуглеродной эмульсии для консервирования тканей животных и человека." Всероссийское совещание "Биология клетки в культуре". Стендовый доклад. Санкт-Петербург, 20-22 октября 1992г.

6.С.Н.Гайнуллина,Э.И. Лежнев, В.Б.Александров, В.И.Попов. "Органное культивирование эксплантатов из аденокарциномы и здоровой части прямой кишки человека". Сборник статей "Культивирование клеток животных и человека". Пущино, 1992, с.31-38.

7.С.М.Гайнуллина, Э.И.Лежнев, В.Б.Александров, В.И Попов "Органное культивирование эпителия толстой кишки человека". Цитология, 1992, Т. 34, N9, с. 59.

8. С. М. Гайнуллина, Э.И.Лежнев, Н.Ю.Сахарова. "Органное культивирование эпителкя мочевого пузыря кролика с использованием перфторановой эмульсии". Известия Академии Наук РАН, 1993, в печати.

9. С. М. Гайнуллина, И. Ю. Сахарова, Э. И. Лежнев. "Использование перфторуглеродой эмульсии для хранения и криоконсервирования кусочков тканей при органной культивировании". Сборник сатей "Применение перфторуглеродов в практике". Пущино, 1993, в печати.

15.09.93 г. Зак.5778Р. Тир. 100 экз. Уч.-изд.л. 1,0 Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПНЦ РАН