Организация фолликулов и парафолликулярных регионов яичников на этапах их позитивного и атретического развития (иммуноцитохимические аспекты)

Бичерова, Ирина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Организация фолликулов и парафолликулярных регионов яичников на этапах их позитивного и атретического развития (иммуноцитохимические аспекты)
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация фолликулов и парафолликулярных регионов яичников на этапах их позитивного и атретического развития (иммуноцитохимические аспекты)"

На правах рукописи

□03452076

БИЧЕРОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА

ОРГАНИЗАЦИЯ ФОЛЛИКУЛОВ И ПАРАФОЛЛИКУЛЯРНЫХ РЕГИОНОВ ЯИЧНИКОВ НА ЭТАПАХ ИХ ПОЗИТИВНОГО И АТРЕТИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ (ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

003452076

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Волкова Ольга Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна

(ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) доктор медицинских наук, профессор Ерофеева Людмила Михайловна

(ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава)

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова.

Защита состоится «_» _ 2008 года в 14 часов

на заседании диссертационного совета Д.208.072.04. при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Автореферат разослан «_»_2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.И.Щеголев

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время актуальность проблемы овофолликулогенеза обусловлена высокой частотой заболеваний яичников, связанных с нарушениями процесса их развития, возникновением в репродуктивном периоде дисфункциональных состояний, возможностью бесплодия (Amsterdam A., Sasson R., 2002; Г.Т.Сухих и др. 2006 и многие другие). Накопленные данные позволяют сделать заключение, что женские половые железы относятся к наиболее динамичным системам организма, характеризующимся не только сложностью происходящих в них морфогенетических преобразований (для развивающихся фолликулов характерен целый комплекс тканей с высокой динамикой развития за очень короткий период времени), но и сложностью и многообразием механизмов регуляции их функции.

Установлено, что система регуляции фолликулогенеза представлена сложным иерархическим комплексом, включающим гипоталамо- гипофизарный и гонадный уровни. Кроме того, в регуляции развития яичников и фолликулогенеза принимают участие гормоны периферических эндокринных желез (щитовидной, надпочечников) (Алкадарская И.М. 1980; Миловидова Н.С. 1987; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 1998). Нарушение физиологического баланса гормонов и других биологически активных веществ в рассматриваемой системе неблагоприятно влияет на органогенез и гистофизиологию яичников на последовательных этапах развития.

Однако, полученные данные свидетельствуют о том, что именно внутрияичниковым, внутрифолликулярным механизмам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза, ибо они опосредуют и модулируют действие центральных и многих других механизмов регуляции (Волкова О.В. 1986; Бурлеев В.А. и др. 1998; О.В.Волкова, Т.Г.Боровая 1999; Adashi A. et al. 2000; Боярский К. Ю. 2001; Weestergaad L. et al. 2004; Erickson G. et al. 2007 и другие).

В настоящее время сохраняется пристальное внимание к локальным регуляторным механизмам. Именно им принадлежит определяющая роль в селекции фолликулов, генезе атрезии, ановуляторных состояний и бесплодия. Среди ведущих влияний этих механизмов: различия в активности рецепции фолликулами гонадотропных гормонов, разные уровни интрафолликулярного синтеза эстрадиола, неравноценное гемообеспечение фолликулярных регионов и многое другое. (Zeleznik A.J. 1981; Shipper I., Hop W. and Fauser B. 1998; Stouffer R., Dahl К. 2002 и др).

К таким местным модуляторным механизмам относятся, неспецифичекие факторы роста и многочисленные внутриклеточные белки - регуляторы процессов пролиферации и апоптоза. Наиболее яркими и информативным белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки K¡-67 и PCNA. К белкам, регулирующим процессы апоптоза, относятся белки семейства Вс1-2, р-53, каспазы. В исследованиях последних лет уделено большое внимание экспрессии этих белков и факторов элементами яичника. Наиболее широко изучается пролиферативная активность, механизмы клеточных иммунологических взаимодействий, механизмы апоптоза клеток созревающих и атрезирующихся фолликулов (Huirne J. and Lambalk С. 2001; Gougeon L. 2004; Butt A.J., Dickson K.A., Jambazov S. et al. 2005; Dragovic R.A., Ritter L.J. 2005; McNatty K.P., Fidler A.E. 2006 и другие).

С вопросом фолликулярной селекции тесно сопряжено и дальнейшее исследование систем передачи гормональных сигналов в соматических клетках фолликулярных гистионов, от состояния которых во многом зависит реализация всего комплекса регуляторных сигналов, поступающих в фолликул, включая местные пара- и аутокринные влияния. К таким вторичным мессенджерным системам относятся аденилилциклазная система, фосфатидилинозитольный механизм, принимающий участие в механизме передачи гормональных сигналов соматическим клеткам фолликулов в процессе роста и атрезии (Кулинский В.И. 1997; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 2000; Kodaman Р.Н., Behrman H.R. 2005; Emmen J.M., Couse J.F. 2008 и др).

Цель и задачи исследования

Получить новую информацию о структурно-цитохимической организации фолликулов яичников и их тканевого микроокружения. Выявить внутриклеточные белки и факторы роста в различных структурах яичников и проследить динамику этих химических соединенеий на этапах позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.

Для этих целей использовать комплексный морфологический, иммуногистохимический анализ структур яичников:

1. Провести исследование спектра белков, участвующих в процессах пролиферации и регуляции апоптоза в указанных структурах (белки РСЫА, Кл-67, Вс1-2, р-53, каспаза-9).

2. Исследовать распределение неспецифических факторов роста (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) и оценить их роль в процессе овофолликулогенеза и лютеогенеза.

3. Исследовать состояние внутри- и парафолликулярного матрикса на примере системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2.

4. Исследовать состояние гормонтрансдукторных систем соматических клеток фолликулов (на примере анализа содержания универсальных мессенджерных соединений - а-субъединиц в-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-Р).

5. Сопоставить активность и количественное распределение исследуемых соединений в структурах фолликулов и их микроокружения, временные параметры их взаимодействия в течение процесса позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено комплексное, многогранное изучение распределения химических соединений, выполняющих пара- и

аутокринное влияние в обеспечении жизнедеятельности структур яичников: 1)белков клеточной пролиферации и апоптоза (белки РСКА, Кл-67, Вс1-2, р-53, каспаза-9), 2)универсальных ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1), 3)системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, 4)гормонтрансдукторной системы ( а-субъединиц й-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-0). Оценены распределение и закономерности синтеза этих соединений в половых клетках, фолликулярном эпителии, клетках желтых тел, в структурах парафолликулярных регионов (в текальных оболочках, интерстиции и кровеносных сосудах) на этапах позитивного и атретического развития фолликулов и желтых тел.

Получены свидетельства о том, что регуляция жизнедеятельности яичников осуществляется не одним специфическим фактором, а экспрессией различных химических соединений, присутствующих в структурных компонентах яичника одновременно и меняющихся в количественном отношении в течении фолликулогенеза. Сочетание комплекса этих факторов обеспечивает адекватную реализацию функционального эффекта в каждый период овофолликуло- и лютеогенеза.

Кроме качественной оценки интенсивности иммуногистохимических реакций нами впервые был проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности структур фолликулов и их регионов методом компьютерной морфоденситометрии (КМДМ).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Исследование носит экспериментальный характер, направлено на изучение закономерностей овофолликулогенеза и лютеогенеза, оценки механизмов регуляции этих процессов (в частности пара- и аутокринных).

С использованием метода иммуногистохимии получена новая информация о наличии, взаимодействии и динамических преобразованиях важнейших

внутриорганных белков (белки РСЫА, К.1-67, Вс1-2, р-53, каспаза-9) и ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) в структурах фолликулов (овоцит, фолликулярные клетки), желтых тел и окружающей их гормонпродуцирующей интерстициальной ткани на всех этапах их позитивного и атретического развития. Особенности структуры яичника позволили одновременно визуализировать на серийных срезах исследуемые белки на этапах роста и атрезии фолликулов и желтых тел.

При подробном анализе фолликулогенеза были уточнены наиболее ответственные (круциальные) процессы в химической организации структур яичников, необходимые для поддержания жизнеспособности овоцитов, сохранения блока мейоза, подготовки к овуляции, образованию гормонопродуцирующих желтых тел и атретических фолликулов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявлен комплекс факторов - химических соединений, взаимодействие которых обуславливает оптимальность течения процессов роста и атрезии фолликулов и развития желтых тел Этим местным внутрияичниковым регуляторным факторам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза и лютеогенеза (они опосредуют и модулируют действия центральных нервных и гуморальных механизмов).

а) группа внутриклеточных белков (РСЫА, Кч-67), ответственных за пролиферацию и дифференцировку, индукцию митотической активности;

б) группа внутриклеточных белков (Вс1-2, р-53, каспаза-9), осуществляющих контроль за процессами апоптоза в указанных элементах яичника. Интенсивность их экспресси варьирует на этапах фолликулогенеза.

3. Универсальные ростовые факторы (инсулиноподобный-1, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный) - перманентные компоненты химической

организации овоцитов, фолликулярного эпителия, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани и желтых тел яичника. Интенсивность их экспрессии неоднозначна на различных этапах овофолликулогенеза, лютеогенеза и атретических процессов.

4. Выявлена экспрессия матриксных металлопротеиназ (1,9) и их тканевых ингибиторов (1,2) структурами фолликулов, желтых тел и парафолликулярного окружения. Спектр этих соединений меняется в соответствии со стадией развития фолликулов и желтых тел на этапах позитивного и атретического процесса, что свидетельствует об их значении, как региональных механизмов в реаранжировке тканевых структур яичников, обеспечивающих оптимальные условия роста фолликулов и желтых тел.

5. Выявлена закономерность в интенсивности экспрессии компонентов гормонотрансдукторной системы фолликулярного эпителия в процессе развития и созревания фолликулов.

Внедрение в практику.

Полученные данные найдут применение в курсах обучения студентов гистологии, эмбриологии, эндокринологии, работе научно-исследовательских лабораторий по репродукции и в клинической практике для разработки новых подходов в оценке гипопластических и дисфункциональных состояний яичников.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были доложены на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Всероссийской научной конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2006); Всероссийском конгрессе гистологов и морфологов (Москва, 2006); на съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (Казань, 2007); совместной научной конференции кафедр гистологии, цитологии, эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ.

Публикации.

Результаты исследования отражены в одиннадцати печатных работах. Структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 источника отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и иллюстрированы микрофотографиями, графиками, таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 100 белых беспородных половозрелых самках крыс, находящихся в репродуктивном периоде. В ходе работы применялись следующие варианты обработки экспериментального материала: Морфологический анализ.

Исследовались серийные срезы яичников толщиной 5 мкм. Подготовку материала для гистологического исследования проводили по общепринятой методике.

Морфологическая оценка состояния гонад крыс основывалась на:

1) анализе популяции фолликулов разных стадий развития (от примордиальных до преовуляторных). Пулы фолликулов идентифицировались на основании Международной классификации (1999).Определение видов фолликулов унифицировано проводилось на сечениях фолликулов, прошедших через ядрышки овоцитов, на каждом пятом срезе серии.

2) анализе желтых тел на разных стадиях развития и регрессии.

3) анализе атрезии фолликулов на разных стадиях атретического процесса (согласно критериям ВуБкоу, 1979).

4) анализе стероидпродуцирующей интерстициальной ткани (по методу С.Б.Стефанова, 1974)

Важно почерпнуть, что анализировалось серийныене срезы яичников каждого животного: один срез окрашивался гематоксилином и эозином, а соседние срезы обрабатывались на различные иммуногистохимические реакции. Приготовление препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, проводилось с целью определения добротности материала, для получения обзорного препарата и для последующего сравнительного сопоставления препаратов, полученных после иммуногистохимических реакций.

Для трансмиссионной элеетронной микроскопии приготовление материала проводили по стандартной методике Millonig (Гайер Г., 1974). Полученные наблюдения позволили лишь детализировать уже известные сведения по ультрамикроскопической организации клеток фолликулов и дополнительно оценить состояние овоцитов.

Метод непрямого иммуиогистохимического анализа.

Этот метод использовали для выявления: а) белков пролиферации и апоптоза (р53, bcl-2, PCNA, Ki-67, каспаза-9), б) универсальных ростовых факторов (васкулярный эндотелиальный, инсулиноподобный и эпидермальный), в) группы ферментных систем матриксных металлопротеиназ (ММП-1,9) и их тканевых ингибиторов (ТИММП-1,2). Реакции проводились на серийных парафиновых срезах яичников половозрелых крыс. В работе применялись наборы реактивов фирмы ДАКО (2002) и Santa Cruz Biotechnology (2004). В качестве первичных антител использованы моноклональные кроличьи антитела (разведение 1:100). Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали LSAB+Detection System (ДАКО) согласно инструкции, пероксидазную активность выявляли с помощью 3,3 диаминобензидина (DAB), препараты докрашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам. Выявление а-субъединиц G-белков, фосфолипазы-С, аденилилциклазы проводили при помощи реакции непрямого иммуномечения. Реакцию ставили на криосрезах, фиксированных в 96% ацетоне. В качестве первичных антител использовали специфические наборы антител фирмы Dupon в разведении 1:500

в фосфатном буфере PBS с рН= 7,2, содержащем 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Визуализацию первичных связанных антител проводили с помощью авидин-биотин-пероксидазного комплекса (фирмы Camón). Результаты иммуногистохимических реакций в случае цитоплазматической локализации продукта оценивали в баллах (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток (п). Реакция считалась отрицательной при полном отсутствии или экспрессии антигена менее чем в 5%; п от 5 до 24% - 1-2 балла (слабая экспрессия); п от 25 до 75% - 3-4 балла (умеренная); п более 75% - 5-6 баллов (выраженная). В случае ядерной локализации продукта реакции подсчитывался процент окрашенных ядер на 100 клеток. Анализ материала и подсчет активности мечения проводили с помощью микроскопа «Leika».

Кроме полуколичественной оценки интенсивности иммуногистохимических реакций был проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности фолликулов и их регионов с использованием метода компьютерной морфоденситометрии.

Результаты исследования и их обсуждение. Иммуиогистохимическая характеристика развивающихся фолликулов.

Внутриклеточные белки (PCNA, Ki-67. Bcl-2. р-53, каспаза-9), участвующие в регуляции процессов пролиферации и апоптоза Анализировалось время появления, распределение, количественная оценка исследуемых белков.

Белок PCNA. По данным наших наблюдений этот белок экспрессируют овоциты и гранулезные клетки фолликулов всех стадий развития. Однако, экспрессия наиболее яркая в первичных и вторичных фолликулах В овоцитах и клетках гранулезной оболочки крупных и атрезирующихся фолликулов обнаружено слабое иммуномечение. При этом theca interna и стероидпродуцирующие клетки стромы также проявляют слабое иммуномечение.

Кроме полуколичественной оценки интенсивности иммуногистохимической реакции на белок РСЫА был проведен сравнительный количественный анализ иммуномечения активности фолликулов и их регионов с использованием компьютерного метода морфоденситометрии (КМДМ).

Распределение интегральной плотности (100) содержания белка РСМД (ООхА) в фол л и кул о цитах яичников на разных стадиях позитивного развития фолликулов

120

100

80 / \

€0

40 / i

20 ✓

0 1 II iii IV t

Рис 1

Распределение интегральной плотности (100) содержания белка РСЫА (ООА) в овоцитах фолликулов яичника на

разных стадиях позитивного развития

25 \ i

20 \

15 S 1

0 1 U III (V t

Рис 2

I - примордиальный фолликул, II - первичный фолликул, III - вторичный фолликул IV - третичный фолликул

Впервые с помощью системного подхода была проанализирована морфофункциональная взаимосвязь в системе «овоцит-фолликулярная зона» путем сравнительного анализа иммуногистохимического маркера в структурах яичника. Интегральный показатель морфофункционапьного состояния овоцита (как единичной клетки), в котором краситель распределен диффузно и интегральный показатель фолликулярной зоны (совокупности клеток)

оказались различными. Фолликулярная зона оценивалась как средняя оптическая плотность (00) и в то же время считалось количество зон (п) и брался интегральный показатель средней ОБ на количество зон. Аналогичным способом был проанализирован интегральный показатель оптической плотности некоторых других исследованных белков.

Контролируя наши данные, оцененные визуально (полуколичественно), мы выборочно сопоставили их с результатами, полученными методом КМДМ и на примере с оценкой интенсивности мечения белка РС^ выявили близкое сходство результатов оценки этих двух методов.

Белок РСЫА - белок клеточной пролиферации - дополнительный белок к репарационной полимеразе ДНК. Эта полимераза устраняет различные поломки молекулы ДНК при размножении и формировании клеток в эмбриональном развитии и в течение всей жизни. Содержание РСЫА в ходе клеточного цикла увеличивается и остается высоким до границы фаз С2/М. Учитывая важнейшее значение белка РСЫА в жизнедеятельности клеток понятна и целесообразна необходимость увеличения его экспрессии по мере высокой активации пролиферации и дифференцировки структур растущих фолликулов и желтых тел. Тем более, что эти процессы характеризуются не только высокой напряженностью, но и кратковременностью.

Белок К1-67. Иммуногистохимическая метка на этот белок выявляется в цитоплазме овоцитов и фолликулярных клеток примордиальных и вступивших в рост первичных фолликулов. В развивающихся фолликулах отмечается активная экспрессия в овоците, клетках гранулезной оболочки и единичных клетках формирующейся теки. Наиболее яркое мечение отмечается в фолликулярных клетках зрелых фолликулов. Степень мечения стероидпродуцирующих клеток, лютеоцитов желтых тел, клеток покровного эпителия оказывается менее интенсивной. В овоцитах атретических фолликулов специфической метки на белок Кл-67 не обнаруживается.

Белок Ю-67 участвует в стимуляции процесса репликации ДНК. Экспрессия Ю-67 четко ассоциирована с клеточной пролиферацией. Тот факт, что белок Ю-

67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1,S,G2 и митоз), но отсутствует в покоящемся состоянии (GO), делает его определение весьма информативным для характеристики пролиферации в конкретной клеточной популяции - в овоцит-гранулезном комплексе яичника.

Белок bcl-2. При проведении иммуногистохимической реакции регистрируется экспрессия белка овоцитами и фолликулярными клетками. Интенсивность иммуномечения фолликулярных клеток прямо пропорциональна степени развития фолликулов. Наиболее яркая экспрессия в овоците и в гранулезной оболочке характерна для третичных фолликулов. В клетках theca interna реакция значительно слабее. Интенсивно маркируются лютеоциты желтых тел. Стероидпродуцирующая строма иммунопозитивна. Сравнительно высокая экспрессия белка в клетках покровного эпителия свидетельствует об его участии в функционировании структур яичника. В овоцитах атрезирующихся фолликулов экспрессия bcl-2 отсутствует. В клетках уже сформированного атретического тела отмечается высокий уровень экспрессии данного белка.

Белок bcl-2 - ключевое белковое соединение - занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. Запуск процесса апоптоза происходит за счет высвобождения митоховдриальных факторов, которыми являются цитохром С, а также апоптозиндуцирующий фактор (по-видимому, протеаза). Высвобождение этих факторов приводит к распаду комплекса Bcl-2/неакгивная каспаза-9, что вызывает активацию каспазы-9, индуцирующей финальные стадии апоптоза. Однако, белок вс1-2, связывая белок «Ьах», может выступать и в роли ингибитора апоптоза.

В развитии и атрезии фолликулов, также как и в формировании и обратном развитии желтых тел, эта многогранная функция белка bcl-2 несомненно определяющая: контроль прогрессирующего фолликулярного развития, перехода в атрезию, формирование новой эндокринной структуры -атретического фолликула, развитие и дегенерация желтых тел.

Белок р53. Экспрессия этого белка в цитоплазме овоцитов примордиальных фолликулов в наших препаратах минимальна. В первичных фолликулах (с двуслойной гранулезной оболочкой) экспрессия несколько более выражена. Во вторичных фолликулах (без полости, с многослойной гранулезной оболочкой и формирующейся текой) интенсивность иммуномечения нарастает и цитоплазма овоцитов положительно маркируется. Затем маркирование цитоплазмы овоцитов, как и клеток гранулезной оболочки вторичных и третичных фолликулов, становится интенсивнее. Локусы стероидпродуцирующих клеток и покровный эпителий включают метку. Соединительнотканная строма инертна. В атретических фолликулах специфическая метка на белок р-53 в овоцитах не определяется.

Интенсивное маркирование цитоплазмы овоцитов и фолликулоцитов вторичных и третичных фолликулов на исследуемый белок может быть связано с определяющим участием этого белкового соединения на этапах большого роста фолликулов. Возможность репарации поврежденной ДНК в структурах растущих фолликулов предотвращает тем самым появление мутантных клеток, то есть сохраняется генетическая полноценность созревающих овоцитов в ходе сложного процесса овофолликулогенеза.

Каспаза-9. Иммуногистохимическая метка выявляется и в ядрах, и в цитоплазме овоцитов и клеток фолликулярного эпителия. В примордиальных фолликулах слабо маркируются ядра овоцитов и клетки фолликулярного эпителия. В первичных фолликулах с двуслойной гранулезной оболочкой, во вторичных и третичных фолликулах выраженно маркируется большинство ядер фолликулярных клеток. Клетки theca interna третичных фолликулов также активно включают метку. В стромальных элементах определяется положительная реакция в ядрах отдельных гладкомышечных клеток сосудов, эндотелии и в клетках покровного эпителия.

Свои особенности имеет распределение метки в популяции желтых тел. Выявляется метка в свежесформированных желтых телах. В лютеоцитах, лежащих на периферии желтых тел позитивны и ядра, и цитоплазма, а в

лютеоцитах, лежащих ближе к центру - только ядра. Иначе выгладят старые генерации желтых тел: умеренно маркируется часть ядер соединительнотканных клеток, слабо окрашивается цитоплазма лютеоцитов, расположенных по периферии этой временной железы. Активно маркируются и ядра, и цитоплазма клеток атретических тел.

Цистеиновые протеазы - каспазы - являются основными фигурантами эффекторной фазы апоптоза. Каспаза-9 относится к группе индукторов, принимающих апоптотический сигнал и передающих его на эффекторные каспазы, которые будучи активированными, начинают цепь протеолитических событий, цель которых — демонтаж клетки. Участие каспаз в апоптозе направлено на разрыв связей с окружающими клетками, реорганизацию цитоскелета, снижение возможностей репарации и репликации ДНК, разрыв ядерной мембраны и разрушение ДНК, выброс сигналов, маркирующих клетку для апоптоза, расчленение клетки на апоптотические тельца. В яичнике, как ни в каком другом органе, процессы роста и обратного развития являются составляющими его жизнедеятельности, превалируя или уменьшаясь на разных этапах фолликулогенеза, лютеогенеза и атрезии. Поэтому каспаза-9 -обязательный и постоянно работающий фермент в структурах яичника.

Матриксные металлопротеииазы (ММШ и их тканевые ингибиторы (ТИММЩ. Экспрессия ММП-1 обнаруживается в половых клетках всех стадий развития фолликулов. Специфическое маркирование выявляется и в ядре, и в цитоплазме овоцитов. Иммунопозитивны и клетки гранулезной оболочки фолликулов разных стадий развития. Степень мечения гранулезных клеток прямо пропорциональна степени зрелости фолликулов: в примордиальном и начавшем рост первичном фолликуле гранулезные клетки слабо включают метку, в то время как наибольшее количество иммуногистохимических включений обнаруживается в клетках полостных вторичных и третичных фолликулах. Клетки theca interna маркируются умеренно, в то время как локусы интерстициальных гормопродуцирующих клеток и клетки покровного эпителия визуализируются четко. В сосудах

определяется следовая реакция. Соединительнотканная строма яичника иммунонегативна. В лютеиновых клетках функционально активных желтых тел ММП-1 определяется, в стромальных компонентах - не выявляется.

Распределение ММП-9 в соматических и половых клетках фолликулов разных стадий развития, клетках желтых и атретических тел, интерстициальной ткани яичников и покровного эпителия практически идентично ММП-1.

Как показывают проводимые исследования, семейство ММП и ТИММП является мощной ферментной системой, способной активно перестраивать матрикс в процессе физиологического и патологического развития тканей. В яичнике происходит постоянный рост фолликулов и желтых тел, что требует непрерывной реорганизации в клеточном составе этих структур и реорганизации окружающего соединительнотканного матрикса. Этим объясняется иммуномечение этих ферментов не только в фолликулоцитах растущих фолликулов, но и в овоцитах. При участии коллагеназы ММП-1 происходит перестраивание фибриллярного коллагена (важного структурного компонента матрикса), а при участии желатиназы ММП-9 - перестройка коллагена четвертого типа (основного компонента базальных мембран). Благодаря этой перестройке создаются оптимальные условия для быстрорастущих фолликулов и желтых тел, образования атретических тел. В результате этого овоциты и фолликулоциты созревающих фолликулов получают возможность расти и дифференцироваться. Перестройка коллагена также способствует клеточной миграции: пролиферация фолликулярных клеток, разрастание и накопление клеток theca interna вокруг увеличивающихся в объеме фолликулов, врастание клеток тека при формировании атретических тел, прогрессивное увеличение лютеоцитов, врастание периферических лютеоцитов в формирующиеся желтые тела.

Действие ММП регулируется рядом ингибиторов - тканевые ингибиторы ММП (ТИММП). В наших препаратах ТИММП-1 присутствует в овоцитах и гранулезных клетках фолликулов разных стадий развития. Фолликулы ранних стадий развития выявляют слабую экспрессию. Наиболее ярко маркируются

зрелые фолликулы. Более выражено маркируются фолликулоциты, theca interna, интерстициальные эндокриноциты и покровный эпителий. Экспрессия ТИММП-1 в соединительнотканной строме не выявляется и слабо определяется в атретических телах.

Экспрессия ТИММП-2 наиболее ярко проявляется в гранулезной оболочке и theca interna вторичных и третичных фолликулов и на ранних этапах атрезирующихся фолликулов. Интенсивность маркирования зависит от степени атрезии и давности существования атретических тел. Лютеоциты и клетки атретических тел метятся менее интенсивно. Отмечена экспрессия и в клетках покровного эпителия. В клетках и сосудах соединительной ткани специфическое мечение отсутствует, выявляется слабая реакция в отдельных эндотелиальных и гладкомышечных клетках.

Таким образом, матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы вовлечены в процесс ремоделирования внеклеточного матрикса яичника, что является определяющим фактором в течение процесса фолликулогенеза и обратного развития фолликулов, обуславливая стремительный рост, дифференцировку, структурные изменения гонад в кратчайший промежуток времени. Помимо данных о способности ТИММП регулировать активность ММП в настоящее время существует предположение, что ТИММП определенным образом влияют на апоптоз, клеточный цикл, стимулируют стероидную продукцию в яичниках.

Состояние мессенджерных соединений гормонтрансдукторной системы.

Активность иммуномечения гранулезных клеток на а-субъединщы G-белков

Специфического мечения а-субъединиц G-белков в гранулезных клетках примордиальных фолликулов не отмечается, в первичных фолликулах -активность включения метки незначительна. С увеличением размеров фолликулов число меченых клеток возрастает до 44% и к преовуляторным стадиям достигает 75%. Эндокриноциты внутренней текальной оболочки

фолликулов (начиная со стадии малых вторичных фолликулов) также включают метку.

Активность мечения клеток гранулезной оболочки на аденилшциклазу (АЦ) возрастает прямо пропорционально степени развития фолликула и достигает максимума в клетках гранулёзы третичного фолликула.

Фосфолипаза-С не обнаруживается в клетках гистионов примордиальных и первичных овариальных фолликулов, но активно экспрессируется в гранулезных клетках фолликулов поздних стадий.

Позитивная динамика включения метки на активные а-субъединицы G-белков свидетельствует об активации передачи гормональных сигналов в гранулезных клетках и текацитах в процессе роста фолликулов Отсутствие экспрессии фосфолипазы-С в фолликулах ранних стадий развития и увеличение активности иммуномечения гранулезных клеток вторичных фолликулов может быть связано с увеличением внутриклеточного синтеза простагландинов, поддерживающих финальные стадии роста фолликулов и инициирующих преовуляторную перестройку.

Соответственно, вторичные мессенджерные соединения - G-белки, АЦ-комплекс и фосфатидилинозитольный механизм принимают участие в восприятии гормональных сигналов, стимулирующих и ингибирующих фолликулогенез.

Ростовые факторы

Экспрессия инсулиноподобного фактора роста -I (ИПФР) ярко выражена в половых и фолликулярных клетках примордиальных фолликулов. В первичных фолликулах маркируется цитоплазма всех гранулезных клеток. Во вторичных фолликулах отмечается интенсивная экспрессия не только клеток гранулезной оболочки, но и формирующихся клеток внутренней теки. В малых полостных фолликулах позитивно маркируется цитоплазма всех клеток theca externa, в то время как в крупных полостных положительная реакция определяется только в отдельных клетках наружной соединительнотканной

оболочки. Положительно маркируются клетки интраовариальной сети, покровного эпителия, эндотелиальные клетки и некоторые ядра гладкомышечных клеток сосудов. Иммунонегативны стромальные клетки и миоидные элементы. В желтых телах выраженная реакция в цитоплазме лютеоцитов.

ИПФР принимает активное участие не только в фолликулогенезе, но и в процессах атрезии фолликулов - его транскрипты были обнаружены в атретических фолликулах. В атретических телах, находящихся в стадии расцвета, регистрируется выраженное маркирование и в ядрах, и в цитоплазме эндокриноцитов. В погибающих атретических телах сохраняется метка в ядрах Стромальные клетки обнаруживают иммунонегативность.

Наши материалы подтверждают данные, что инсулиноподобные факторы роста имеют широкие митогенные и метаболические эффекты в яичнике. ИПФР синтезируетя в фолликулах яичника, что подтверждает наличие рецепторов в клетках фолликулов и самого фактора в фолликулярной жидкости. Высокие концентрации ИПФР способствуют воздействию ФСГ на клетки гранулезы (ЕпскБоп в., ЗЬщшак! 8.,2001). Доминантный фолликул содержит ИПФР-1 в большей концентрации, чем недоминантные когорты. Более того, уровень ИПФР-1 в фолликулярной жидкости положительно коррелирует как с концентрацией эстрадиола и прогестерона, так и с объемом фолликулярной жидкости. ИПФР стимулирует рост, пролиферацию и дифференцировку различных клеточных элементов фолликула, усиливает продукцию эстрадиола. ИПФР, действуя синергично с ФСГ, стимулирует ароматазную активность в клетках гранулезы и таким образом увеличивает синтез эстрогенов.

При постановке иммуногистохимической реакции на выявление васкулярного эндотелиального фактора роста (ВЭФР) метка в структурах яичника распределялась следующим образом: на начальных этапах развития фолликулов, уже в примордиальных и затем в первичных, выраженно маркируется цитоплазма овоцитов. Также ярко маркируется и цитоплазма всех

фолликулярных клеток. Положительная экспрессия ВЭФР отмечена в овоцитах, фолликулоцитах и в прилежащих к фолликулу клетках интерстициальной ткани (будущие клетки теки) первичных фолликулов. По мере роста фолликулов, начиная с вторичных, цитоплазма овоцитов и фолликулоцитов маркируется менее интенсивно. В третичных фолликулах метка обнаруживается во всех фолликулярных клетках и клетках theca interna, однако, по сравнению с вторичными активность включения метки менее выражена. В функционально активных желтых телах маркируется цитоплазма лютеиновых клеток. В формирующихся атретических телах выраженная реакция отмечена в цитоплазме эндотелия растущих сосудов. Позитивно реагируют локусы гормонопродуцирующих клеток, эндотелиоциты и ядра отдельных гладкомышечных клеток сосудов, ядра клеток покровного эпителия, цитоплазма клеток интраовариальной сети.

ВЭФР, стимулируя пролиферацию и ингибируя апоптоз овоцитов, обладает ангиогенной активностью. Образование сосудов и васкуляризация играют важнейшую роль в росте и формировании доминантного фолликула. С самого начала развития адекватное гемообеспечение примордиальных фолликулов играет важную роль в инициации большого роста овоцита, в дальнейшем ВЭФР способствует активной пролиферации клеток и дифференцировки во время роста фолликулов и формирования желтого тела.

Проведенное иммуногистохимическое исследование выявило наличие рецепции к эпидермальному фактору роста (ЭФР) Активно маркируются фолликулоциты и клетки theca interna вторичных фолликулов. В третичных фолликулах эффект неоднозначный: фолликулоциты corona radiata и кумулюса слабо позитивны, а в клетках гранулезного слоя экспрессия более интенсивная. Максимально ярко маркируются гранулезные клетки преовуляторных фолликулов. Цитоплазма овоцитов созревающих фолликулов выявляет только слабое мечение. Активно метится цитоплазма лютеоцитов, клетки атретических тел и покровного эпителия.

Максимальное содержание рецепторов эпидермального фактора роста в гранулезных клетках приходится на стадию преовуляторной подготовки. Установлено, что ЭФР потенцирует эффект гонадотропных гормонов, подавляет апоптоз в клетках зернистого слоя путем стимуляции синтеза прогестерона и регуляции распределения внутриклеточного свободного кальция, стимулирует созревание овоцитов. ЭФР принимает участие в атрезии фолликулов. Избыточное образование ЭФР в регионе развивающегося фолликула способствует переключению внутрифолликулярного эстрогенобразования на синтез прогестерона. Такой фолликул не сможет закончить свое развитие и уйдет в атрезию.

Таким образом, активная экспрессия исследованных факторов роста как соматическими, так и половыми компонентами гонад подтверждает их функциональную необходимость в региональном механизме ауто- и паракринной регуляции текущих процессов в яичнике.

Обобщая полученные данные, следует заключить, что в основе физиологического течения фолликулогенеза и лютеогенеза лежит комплекс структурно-функциональных интрагонадных механизмов - различных химических соединений, которые синтезируются в яичнике и накапливаются в его структурах. К ним относятся ростовые факторы (васкулярный эндотелиальный, эпидермапьный, инсулиноподобный фактор роста-1), белки пролиферации и апоптоза (РСЫА, Кь67, Вс1-2, р-53, каспаза-9), трансформирующие различные центральные сигналы, и, таким образом, паракринно регулирующие овофолликулогенез и лютеогенез.

Выводы

каспаза-9), матриксные металлопротеиназы-1,9, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ-1,2, гормонтрансдукторная система.

2) Выявлена динамика экспрессии исследуемых внутриклеточных белков на стадиях позитивного и атретического процесса овофолликулогенеза и лютеогенеза:

• В примордиальных фолликулах (в овоцитах и фолликулярных клетках)

на границе их начала роста уже выявляется положительное иммуномечение, чго обеспечивает активный переход фолликулов в стадию большого роста.

• В течение последующего роста фолликулов и, особенно, в антральных стадиях и стадии расцвета желтых тел происходит прогрессирование экспрессии изучаемых белков с дальнейшим снижением их активности в финальных стадиях овофолликулогенеза.

• В стадии преовуляторных фолликулов (и затем в начале овуляции в период отрыва овоцита и лучистого венца) выявляется резкое снижение экспрессии внутриклеточных белков («опустошение»), в то время как в фолликулярной жидкости идентифицируется видимое накопление пептидов.

• В ходе атретических процессов минимальная экспрессия белков отмечена в начале стадии атрезии с последующим максимальным содержанием в период завершения формирования атретического тела.

3)Выявлена перманентная экспрессия ростовых факторов: инсулиноподобного, васкулярного эндотелиального и эпидермального. Иммуномечение овоцитов, фолликулоцитов, стероидпродуцирующих клеток теки, интерстициальной ткани и желтых тел свидетельстует о постоянстве этих химических компонентов в обеспечении хода процессов развития и атрезии в яичнике.

Для фолликулов на начальных стадиях атрезии характерна волна снижения экспрессии ростовых факторов с последующим подъемом их количественного представительства при формировании активно продуцирующего гормоны атретического тела.

По своей динамике экспрессии эти факторы во многом тождественны динамике экспрессии внутриклеточных белков, активизирующих процессы пролиферации. Особенно функционально активны инсулиноподобный и васкулярный эндотелиальный факторы.

4) Наличие маркирования клеток покровного эпителия и интраовариальной сети предполагает возможность их функционального участия в жизнедеятельности структур яичника.

5) Соединительнотканная строма при иммуногистохимическом анализе на указанные белки и ростовые факторы иммунонегативна В структурных компонентах сосудов экспрессия слабая и локусная. Более выраженное иммуномечение эндотелия обнаруживается при реакции на выявление васкулярного эндотелиального фактора роста.

6) Матриксные металлопротеиназы (ММП-1,9) и тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (ТИММП-1,2) параллельно нарастающие по мере роста фолликулов и желтых тел, в своем взаимодействии контролируют специфичность локального ремоделирования внеклеточного матрикса яичника, обуславливая адекватность условий как для роста и размещения значительно увеличивающихся в объеме фолликулов и желтых тел, так и для перестройки тека при атрезии.

7)Позитивная динамика иммуномечения компонентов гормонтрансдукторной системы свидетельствует об активации передачи гормональных сигналов фолликулярными клетками по мере роста фолликулов, достигая максимума к преовуляторной стадии.

8) Распределение и динамика экспрессии исследуемых внутриклеточных белков (белки пролиферации РСКА, Ю-67 и апоптоза вс1-2, р-53, каспаза-9), ростовых факторов (инсулиноподобный, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный), матриксных металлопротеиназ-1,9, тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, состояния гормонтрансдукторной системы свидетельствуют о функционировании многогранной локальной регуляции функции яичников. Эти механизмы являются неотъемлемыми компонентами

прогрессивного развития овофолликулогенеза, лютеогенеза и процесса атрезии, и их динамичное взаимодействие лежит в основе оптимального течения этих сложнейших, скоротечных процессов в яичнике.

Практические рекомендации

Полученные результаты могут быть использованы в лекционных курсах для студентов медицинских вузов на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, акушерства и гинекологии. Кроме того, полученные данные могут послужить основой для развития и совершенствования методов терапии дисфункциональных состояний женской репродуктивной системы, для разработки новых подходов при диагностике и лечении врожденной яичниковой формы бесплодия и комбинированной адьювантной терапии опухолей яичника.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Т.Г.Боровая, О.В.Волкова, И.А.Бичерова. Актуальные аспекты проблемы репродукции// Материалы конференции «Функциональная нейро-морфология -фундаментальные и прикладные исследования» - Минск. - 2001,- С.242-245.

2. О.В.Волкова, Т.Г.Боровая, Е.О.Погорельская, И.А.Бичерова. Актуальные аспекты ово-фолликулогенеза // Ж. «Успехи современного естествознания» -Москва. - 2003,- № 1,- с.45-47.

3. Т.Г.Боровая, О.В.Волкова, И.А.Бичерова. Исследование матриксных металлопротеиназ и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ в структурах яичника// Материалы I съезда физиологов стран СНГ. - Сочи. -2005.-с. 149-150.

4. О.В.Волкова, Т.Г.Боровая, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. Аспекты проблемы регуляции физиологических и репаративных процессов // Материалы Всероссийского научного конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2005.-с.244-246.

5. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.Г.Кругликов, Г.А.Демяшкин. Морфо-цитохимические особенности гамет в процессе роста // «Морфология» -Москва. - 2006. - №4. - с.34.

6. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. Факторы локальной регуляции гаметогенеза // Материалы 5-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле». - Орел. - 2006. - с.58-60.

7. О.В Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. Факторы роста и их значение в процессах репродукции // Ж. «Фундаментальные исследования» - Москва. -2006. - №5,- с.82-83.

8. И.А.Бичерова, О.В.Волкова, В.А.Степаненко. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы в морфогенезе яичника // Материалы Всероссийского научного конгресса морфологов. - Москва - 2006.-№ 4,- с.23.

9. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин. О механизмах регуляции репродукции // «Морфология». - Москва. - 2007. - №2. - с.73-74.

10. О.В.Волкова, И.А.Бичерова, Г.А.Демяшкин, Н.В.Шевлягина. Ранние этапы гаметогенеза и специфика их гистионов // «Астраханский медицинский журнал». - 2007. - №2. - с.49-50.

11. И А.Бичерова. Иммуноцитохимические аспекты фолликулогенеза и система его локальной регуляции // Материалы Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке. Концепции болезней цивилизации». - Москва -РУДН,- 2007.-c.145

Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Бичерова, Ирина Анатольевна

ВВЕДЕНИЕЗ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИСС ЛЕДОВ АНИ41 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И PIX ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Организация фолликулов и парафолликулярных регионов яичников на этапах их позитивного и атретического развития (иммуноцитохимические аспекты)"

Литературные данные и проведенная большая работа в нашей лаборатории свидетельствуют, что система регуляции фолликулогенеза представлена сложным иерархическим комплексом, включающим гипоталамический, гипофизарный и гонадный уровни. Кроме того, в регуляции развития яичников и фолликулогенеза принимают участие гормоны периферических эндокринных желез (щитовидной, надпочечников) (Алкадарская И.М. 1980; Миловидова Н.С. 1987; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 1998). Нарушение физиологического баланса гормонов и других биологически активных веществ в рассматриваемой системе неблагоприятно влияет на органогенез и гистофизиологию яичников па последовательных этапах развития.

Однако, полученные данные, и в том числе в нашей лаборатории, свидетельствуют, что именно внутрияичниковым, внутрифолликулярным механизмам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза, ибо они опосредуют и модулируют действие центральных и многих других механизмов регуляции (О.В.Волкова,3Т.Г.Боровая 1999; Боярский К. Ю. 2001; Weestergaad L. et al. 2004; Erickson G. et al. 2007).

Локальные биологически активные соединения модифицируют центральные влияния и в случае их недостаточности определенное время даже поддерживают региональный гомеостаз фолликула в границах физиологической нормы (Бурлеев В.А. и др. 1998; Adashi A. et al. 2000; Erickson G. et al. 2001).

В настоящее время сохраняется пристальное внимание к локальным регуляторным механизмам. Именно им принадлежит определяющая роль в селекции фолликулов, генезе атрезии, ановуляторных состояний и бесплодия. Среди ведущих влияний этих механизмов: различия в активности рецепции фолликулами гонадотропных гормонов, разные уровни интрафолликулярного синтеза эстрадиола, неравноценное гемообеспечение фолликулярных регионов и многое другое. (Zeleznik A.J. 1981; Shipper 1., Hop W. and Fauser B. 1998; Stouffer R., Dahl К. 2002).

К таким местным модуляторным механизмам относятся, неспецифичекие факторы роста и многочисленные внутриклеточные белки — регуляторы процессов пролиферации и апоптоза (Diebold J., Baretton G., Felcgner M. et al. 1996; Curry Т.Е., Osteen K.G. 2003; Cristina С., Diaz-Torga G. 2005).

Наиболее яркими и информативным белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки Ki-67 и PCNA. К белкам, регулирующим процессы апоптоза относятся белки семейства Вс1-2, р-53, каспазы. В исследованиях последних лет уделено большое внимание экспрессии этих белков и факторов элементами яичника (Sirotkin A.V., Dukesova J. 2002; Spicer L.J. 2004; Butt A.J., Dickson K.A., Jambazov S. et al. 2005; Dragovic R.A., Ritter L.J. 2005; McNatty K.P., Fidler A.E. 2006).Наиболее широко изучается пролиферативная активность, механизмы клеточных иммунологических взаимодействий, механизмы апоптоза клеток созревающих иатрезирующихся фолликулов (Huirne J. and Lambalk С. 2001; Gougeon L. 2004).

С аспектом проблемы фолликулярной селекции тесно сопряжено и дальнейшее исследование систем передачи гормональных сигналов в соматических клетках фолликулярных гистионов, от состояния которых во многом зависит реализация всего комплекса регуляторных сигналов, поступающих в фолликул, включая местные пара- и аутокринные влияния. К таким вторичным мессенджерным системам относятся аденилилцпклазная система, фосфатидилинозитольный механизм, принимающий участие в механизме передачи гормональных сигналов соматическим клеткам фолликулов в процессе роста и атрезии (Кулинский В.И. 1997; Волкова О.В., Боровая Т.Г.2000; Kodaman Р.Н., Behrman H.R. 2005; Emmen J.M., Couse J.F. 2008).

Цель и задачи исследованияПолучить новую информацию о структурно-цитохимической организации фолликулов яичников и их тканевого микроокружения. Выявить внутриклеточные белки и факторы роста в различных структурах яичников и проследить динамику этих химических соединенеий на этапах позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.

Для этих целей использовать комплексный морфологический, иммуногистохимический анализ структур яичников:1. Провести исследование спектра белков, участвующих в процессах пролиферации и регуляции апоптоза в указанных структурах (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, р-53, каспаза-9).

3. Исследовать состояние внутри- и парафолликулярного матрикса на примере системы матриксных метал л опротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2.

4. Исследовать состояние гормонтрансдукторньтх систем соматических клеток фолликулов (на примере анализа содержания универсальных мессенджерных соединений - сс-субъединиц в-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-Р).

Научная новизнаВ настоящей работе впервые проведено комплексное, многогранное изучение распределения химических соединений, выполняющих пара- и аутокринное влияние в обеспечении жизнедеятельности структур яичников: 1)белков клеточной пролиферации и апоптоза (белки РОЧА, Кл-67, Вс1-2, р-53, каспаза-9), 2)ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1), 3)системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металл опротеиназ-1,2, 4)гормонтрансдукторной системы ( а-субъединиц О-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-Р). Оценены распределение и закономерности синтеза этих соединений в половых клетках, фолликулярном эпителии, клетках желтых тел, в структурах парафолликулярных регионов (в текальных оболочках, интерстиции и кровеносных сосудах) на этапах позитивного и атретического развития фолликулов и желтых тел.

Получены свидетельства о том, что регуляция жизнедеятельности яичников осуществляется не одним специфическим фактором, а6экспрессией различных химических соединений, присутствующих в структурных компонентах яичника одновременно и меняющихся в количественном отношении в течении фолликулогенеза. Сочетание комплекса этих факторов обеспечивает адекватную реализацию функционального эффекта в каждый период овофолликуло- и лютеогенеза.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Исследование носит экспериментальный характер, направлено на изучение закономерностей ов о фолликулогенеза и лютеогенеза, оценки механизмов регуляции этих процессов (в частности пара- и аутокринных).

С использованием метода иммуногистохимии получена новая информация о наличии, взаимодействии и динамических преобразованиях важнейших внутри органных белков (белки РСИА, Кь 67, Вс1-2, р-53, каспаза-9) и ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) в структурах фолликулов (овоцит, фолликулярные клетки), желтых тел и окружающей их гормонпродуцирующей интерстициальной ткани на всех этапах их позитивного и атретического развития. Особенности структуры яичника позволили одновременно визуализировать на серийных срезах исследуемые белки на этапах роста и атрезии фолликулов и желтых тел.

При подробном анализе фолликулогенеза были уточнены наиболее ответственные процессы в химической организации структур яичников, необходимые для поддержания жизнеспособности овоцитов, сохранения блока мейоза, подготовки к овуляции, образованию гормонопродуцирующих желтых тел и атретических фолликулов.

Положения, выносимые на защиту:1. Выявлен комплекс факторов - химических соединений, взаимодействие которых обуславливает оптимальность течения процессов роста и атрезии фолликулов и развития желтых тел. Этим местным внутрияичниковым регуляторным факторам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза и лютеогенеза (они опосредуют и модулируют действия центральных нервных и гуморальных механизмов).

2. Важнейшими компонентами этих химических соединений в овоцитах, фолликулярном эпителии, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани, в желтых телах на всех этапах позитивного роста и атрезии являются:а) группа внутриклеточных белков (PCNA, Кл-67), ответственных за пролиферацию и дифференцировку, индукцию митотической активности;б) группа внутриклеточных белков (Вс1-2, р-53, каспаза-9), осуществляющих контроль за процессами апоптоза в указанных элементах яичника. Интенсивность их экспресси варьирует на этапах ф о лликулогенеза.

3. Универсальные ростовые факторы (инсулиноподобный-1, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный) — перманентные компоненты химической организации овоцитов, фолликулярного эпителия, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани и желтых тел яичника. Интенсивность их экспрессии неоднозначна на различных этапах овофолликулогенеза, лютеогенеза и атретических процессов.

4. Выявлена экспрессия матриксных металлопротеиназ (1,9) и их тканевых ингибиторов (1,2) структурами фолликулов, желтых тел и парафолликулярного окружения. Спектр этих соединений меняется в соответствии со стадией развития фолликулов и желтых тел на этапах8позитивного и атретического процесса, что свидетельствует об их значении, как региональных механизмов в реаранжировке тканевых структур яичников, обеспечивающих оптимальные условия роста фолликулов и желтых тел.

Внедрение в практику. Полученные данные найдут применение в курсах обучения студентов гистологии, эмбриологии, эндокринологии, работе научно-исследовательских лабораторий по репродукции и в клинической практике для разработки новых подходов в оценке гипопластических и дисфункциональных состояний яичников.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Всероссийской научной конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2006); Всероссийском конгрессе гистологов и морфологов (Москва, 2006); на съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (Казань, 2007); совместной научной конференции кафедр гистологии, цитологии, эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ.

Публикации. Результаты исследования отражены в одиннадцати печатных работах.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В ДИССЕРТАЦИИАЦ — аденилилциклазаВЭФР — васкулярный эндотелиальный фактор роста ИЛ — интерлейкины ИФ — интерфероныИПФР — инсулиноподобный фактор роста КМДМ — компьютерный метод морфоденситометрии ЛГ — лютеинизирующий гормон ММП — матриксные металлопротеиназыММПМТ — матриксные металлопротеиназы мембранного типаРЭФР — рецепторы эпидермального фактора ростаТИММП — тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназТФР-а — трансформирующий фактор роста-аФИ-система - фосфатидилинозитольная системаФЛ — фосфолипазаФНО — фактор некроза опухолиФР — факторы ростаФРТ — фактор роста тромбоцитовФРФ — фактор роста фибробластовФСГ — фоликулостимулирующий гормонЭФР — эпидермальный фактор роста

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бичерова, Ирина Анатольевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные данные, следует заключить, что в основе физиологического течения фолликулогенеза и лютеогенеза лежит комплекс структурно-функциональных интрагонадных механизмов, важнейшими из которых являются ово-соматические и межфолликулярные отношения. Соматические элементы фолликулов играют важную роль в регуляции созревания овоцита и развития фолликула, осуществляя защиту и трофику овоцита, способствуют возникновению блока мейоза и последующую реинициацию мейоза.

Развивающиеся и атрезирующиеся фолликулы, желтые тела характеризуются необычайно высокой динамикой развития большого комплекса тканей в очень короткий промежуток времени, и, как показали наши исследования, обеспечиваются химическими соединениями активными стимуляторами деления и дифференцировки их клеток. Это местные внутригонадные модуляторы. Они воспринимают внешние и внутриовариальные сигналы нервной, эндокринной и иммунной природы, тем самым локально регулируют состояние развивающихся фолликулов и желтых тел.

В нашей работе получены весомые доказательства наличия различных химических соединений - белков, которые синтезируются в яичнике и накапливаются в структурах фолликулов, желтых тел и их окружения.

К ним относятся белки пролиферации и апоптоза (РСМА, Кь67, Вс1-2, р-53, каспаза-9).

Белок РСИА, участвующий в контроле процессов пролиферации в физиологических условиях, в случае повреждения ДНК задерживает клетку на переходе 8-периода (период репликации молекулы ДНК) до момента полного восстановления структуры ДНК. Белок Кь67 присутствует во время всех активных фаз клеточного цикла. Повышение его содержания и белка

РСЫА является свидетельством активации пролиферативных процессов в фолликулах.

Параллельно с процессами пролиферации и дифференцировки в структурах яичника происходит физиологическая гибель клеток, проявляясь, в частности, в атрезии фолликулов и обратном развитии желтых тел. Семейство белков Вс1-2 занимает центральное место в регуляции процесса апоптоза в структурах фолликулов. С другой стороны белок Вс12 является фактором выживания клетки, защищая ее от программированной гибели.

Белок р-53 является одним из транскрипционных факторов, повышенная экспрессия которого приводит к задержке клеток в фазе клеточного цикла С-1 и в-2 и делает возможной репарацию поврежденной ДНК, предотвращая появление мутантных клеток.

Каспаза-9 - основной индуктор эффекторной фазы апоптоза в фолликулах и желтых телах. Активация каспазы-9 связана с распадом гетеродимеров белков семейства Вс1-2. Путем апоптоза погибает большинство овоцитов и фолликулов в яичнике. Этому способствует активная экспрессия каспазы-9 в крупных фолликулах и клетках атретических тел. Апоптоз также вовлечен в процесс регрессии желтых тел.

Подробно исследованы полипептидные ростовые факторы (васкулярный эндотелиальный, инсулиноподобный фактор роста-1), специфические клеточные рецепторы (рецепторы эпидермального фактора роста). Эти факторы являются цитокинами, каждый из них имеет свои особенности действия, но в целом, они способствуют пролиферации и дифференцировке фолликулярных и не эпителиальных клеток, потенцируют действие гонадотропных гормонов, предотвращают развитие апоптоза клеток гранулезы, обладают ангиогенной активностью (особенно ВЭФР) и др., что подтверждает их функциональную необходимость в региональном механизме ауто- и паракринной регуляции текущих процессов в яичнике.

Информативные данные получены при исследовании системы передачи гормональных сигналов в соматических клетках фолликулов, от состояния

которых во многом зависит реализация всего комплекса регуляторных сигналов, поступающих в фолликул, включая ауто/паракринные влияния. Синтезируемые в клетках гранулезной оболочки фолликулов белки семейства О-протеинов, принимают участие в передаче гормональных сигналов гранулезными клетками фолликулов в процессе фолликулогенеза. Динамика мечения а-БЙтикйэгу и а-тЫЬйогу субъединиц О-белков в гранулезных оболочках фолликулов сходна. Это предполагает, что под влиянием различных комбинаций внешних и внутрифолликулярных регуляторных факторов каждый фолликул имеет шансы развиваться как по пути позитивного, так и по пути атретического развития. Фосфатидилинозитольному механизму и его ключевому ферменту фосфолипазе -Ср может принадлежать важное значение в регуляции финальных стадий фолликулогенеза, связанное с увеличением внутриклеточного синтеза простагландинов.

Новая информация получена при исследовании матриксных металлопротеиназ (ММП-1,9) и тканевых ингибиторов (ТИММП-1,2). В яичнике внеклеточный матрикс представляет собой определенный барьер для активного и постоянного роста фолликулов и их оболочек, атрезирующихся фолликулов, желтых тел и всего процесса овуляции в целом. При этих процессах происходит и перманентная перестройка сосудистого микроциркуляторного русла. Изначально клетки, прикрепленные к матриксу, должны приобрести миграционную способность. Этот процесс требует (помимо активации моторной функции цитоскелета) локальной перестройки матрикса. Металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы продуцируются локально (изменяют стабильность и растворяют молекулы коллагена). В основе ремоделирования внеклеточного матрикса яичника лежит постоянное взаимодействие в системе указанных ММП и их тканевых ингибиторов, которые и обуславливают локальное специфическое действие.

Структуры яичника реагируют не на какой-либо один специфический фактор, а на комплекс факторов. Это затрудняет выяснение роли конкретных

условий в регуляции фолликулогенеза, лютеогенеза и структур их окружения.

В яичнике протекают сложнейшие биологические процессы в очень короткий период времени, важнейшая роль в регуляции которых, наряду с центральными и гуморальными механизмами, принадлежит региональным (внутри овариальным и интрафолликулярным) белковым химическим соединениям — локальным регуляторам.

Благодаря особенностям приготовления препаратов (серийные срезы), удалось получить как обзорные препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, так и на последующих (соседних срезах) препараты после проведения иммуногистохимических реакций, свидетельствующие о распределении различных внутриклеточных белков и неспецифических факторов роста, белков гормонтрансдукторных систем, матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов. Полагаем, что эти данные явятся базисной гистохимической характеристикой физиологического течения процессов позитивного и атретического фолликулогенеза и лютеогенеза. И, несомненно, будут использоваться гистологами и биологами в экспериментах со стимуляцией и ингибированием фолликулогенеза, представляя интерес и для клиницистов, работающих в сфере репродукции -в оценке патогенеза дисфункциональных состояний и бесплодия.

Исходя из наших первых наблюдений по разработке и использованию метода компьютерной морфоденситометрии (КМДМ) с целью количественной оценки функциональных показателей химической организации сложных структур яичника полагаем, что можно рекомендовать использование этого метода.

выводы.

1) Использование метода иммуногистохимии позволило определить различия в активности ряда химических соединений в структурах яичников: ростовые факторы (инсулиноподобный, васкулярный эндотелиальный и эпидермальный), внутриклеточные белки - регуляторы пролиферации (РСМА, Кл-67) и апоптоза (вс1-2, р-53, каспаза-9), матриксные металлопротеиназы-1,9, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ-1,2, компоненты гормонтрансдукторной системы.

• В примордиальных фолликулах (в овоцитах и фолликулярных клетках) на границе их начала роста уже выявляется положительное иммуномечепие, что обеспечивает активный переход фолликулов в стадию большого роста.

3)Выявлена перманентная экспрессия ростовых факторов: инсулиноподобного, васкулярного эндотелиального и эпидермального.

Иммуномечение овоцитов, фолликулоцитов, стероидпродуцирующих клеток теки, интерстициальной ткани и желтых тел свидетельстует о постоянстве этих химических компонентов в обеспечении хода процессов развития и атрезии в яичнике.

5) Соединительнотканная строма при иммуиогистохимическом анализе на указанные белки и ростовые факторы иммунонегативна. В структурных компонентах сосудов экспрессия слабая и локусная. Более выраженное иммуномечение эндотелия обнаруживается при реакции на выявление васкулярного эндотелиального фактора роста.

7)Позитивная динамика иммуномечения компонентов гормонтрансдукторной системы свидетельствует об активации передачи гормональных сигналов

фолликулярными клетками по мере роста фолликулов, достигая максимума к преовуляторной стадии.

8) Распределение и динамика экспрессии исследуемых внутриклеточных белков (белки пролиферации РСЫА, Кл-67 и апоптоза вс1-2, р-53, каспаза-9), ростовых факторов (инсулиноподобный, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный), матриксных металлопротеиназ-1,9, тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, состояния гормонтрансдукторной системы свидетельствуют о функционировании многогранной локальной регуляции функции яичников. Эти механизмы являются неотъемлемыми компонентами прогрессивного развития овофолликулогенеза, лютеогенеза и процесса атрезии, и их динамичное взаимодействие лежит в основе оптимального течения этих сложнейших, скоротечных процессов в яичнике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Бичерова, Ирина Анатольевна, Москва

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников H.H., Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и при патологии.// Вопросы биол. мед. и фарм. химии.-1999.-№3- с.3-16.

2. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций.-М.:Наука.-1994.-с.94-96.

3. Агол В.А. Самопожертвование клетки. М.-1997.- с.99.

4. Алкадарская И.М. Морфология процесса овуляции в норме и при изменении уровня простагландинов в организме.// Автореф. дис. к.м.н.-М.,1982. -с.19.

5. Белушкина H.H., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза.//

6. Арх. пат.-2001.-Вып.1 -Т.63. -с.51-60.

7. Белушкина H.H. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний.// Арх. пат.-2005.-№4- с.13-16.

8. Боровая Т.Г. Фолликулогенез и факторы его модуляции// Автореф. дис. д.м.н.- М., 1993.-е. 17.

9. Боровая Т.Г. Желтое тело: развитие, строение, функция.//М.,2005.-с.40-47.

10. Боровая Т.Г., Волкова О.В. Морфологическая характеристика гистионов развивающихся и атретических фолликулов яичника человека.//Бюлл. эксп.биол. и мед.-1995.-Вып.8. -с. 188-191.

11. Ю.Боярский К.Ю. Овариальная стимуляция и фолликулогенез.// Пробл. репрод.-1997.-Т.З.-№4.-с.61-68.

12. Боярский К.Ю. Фолликулогенез и современная овариальная стимуляция (обзор литературы).//Центр планирования семьи.-СПб.-2003.

13. Бурлев В.А., Гаспаров A.C., Аванесян Н.С., Волков Н.И., Стыгар Д.А. Факторы роста и их роль в регуляции репродуктивной функции у больных с синдромом поликистозных яичников (обзор литературы).// РНИЦ акуш., гинек. и перинат РАМН.- М.-2006.

14. Волкова O.B. Структура и регуляция функции яичников.- М.-1970.- с. 180.

15. Н.Волкова О.В., Алкадарская И.М., Миловидова Н.С. Морфологические изменения в яичнике при овуляции.//Архив АГЭ.-1980.-Т.79.-№8.-с.5-18.

16. Волкова О.В., Мельникова Л.М., Пекарский М.И., Повалий Т.М. Динамика структурных преобразований микроциркуляторного русла растущих и атретических фолликулов яичников.//Бюлл. экспер. биол. и мед.-1980.-Вып.2.- с. 229-232.

17. Волкова О.В. Функциональная морфология женской репродуктивной системы.- М.:Медицина,- 1983.- с.211.

18. Волкова О.В., Миловидова Н.С. Становление фолликулогенеза в неонатальном периоде развития яичника.// Арх. анат.-1987.-Т.92.- С.-34-39.

19. Волкова О.В., Боровая Т.Г. Методы количественного анализа в оценке морфофункционального состояния яичника.//Арх.анат., гист. и эмбр.-1990.-№1-с.81-84.

20. Волкова О.В., Боровая Т.Г. Морфогенетические основы развития и функции яичников. М.-1999.- с.-110-125.

21. Высоцкий М.М. Молекулярно-биологические факторы в патогенезе опухолей яичников и их роль в выборе объема операции.//Дисс.докт. мед. наук.- М.-2006.

22. Диндяев C.B. Паракринная и аутокринная регуляция фолликулогенеза яичников.//Иваново.-2002.-Деп. в ВИНИТИ -1.02.02.- №211-В2002.

23. Киселев С.М., Луценко C.B., Северин С.Е. Ингибиторы опухолевого ангиогенеза.//Биохимия-2003-№68(5)-с.611-631.

24. Китаев Э.М. Элиминация половых клеток в процессе гаметогенеза и ее значение в репродукции.// Акуш. и гинек.-1977.-№86- с.61-68.

25. Китаев Э.М., Никитин А.И. Закономерности фолликулогенеза в яичниках млекопитающихся животных и человека// Пробл. репрод.-1995.-Вып.З.- с. 10-15.

26. Коган Э.М., Жукоцкий A.B., Копылов В.М. Компьютерный морфоденситометрический анализ клеток крови.//М.,1993.-с.145-156.

27. Коптева A.B., Дзенис И.Г., Бахарев В.А. Гипоталамо-гипофизарная регуляция репродуктивной системы (обзор литературы).// Пробл. репрод.-2000.-№3.-с.63-78.

28. Кулаков В.И., Сухих Г.Т., Гатаулина Р.Г. Апоптоз в клинике гинекологических заболеваний (обзор литературы).// Пробл. репрод.-1999.-вып.-2.-с. 15-26.

29. Кулаков В.И., Адамян J1.B. Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний.//Конгресс: Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний.//М.-2006-с.З-П.

30. Кулинский В.И. Передача и трансдукция гормонального сигнала в разные части клетки.// Соровский образовательный журнал.-1997.- №9.- с.14-19.

31. Кулинский В.И., Колесниченко J1.C. Общая гормонология.// Биомедицинская химия 2004.-№50(4)-с.344-366.

32. Курило Л.Ф. Развитие яичника человека в пренатальный период.// Арх. анат.-1980.- Вып.7. -с.73-79.

33. Курило Л.Ф., Пшеничникова Т.Я. Современное представление о влиянии повреждающих факторов на половые клетки человека.//Вопр. охр. мат. и дет.-1983.-Т.28.- с.29-31.

34. Лукьянова Н.Ю., Кулик Г.И., Чехуп В.Ф. Роль генов р-53 и bcl-2 в апоптозе лекарственной резистентности опухолей.// Вопросы онкологии.-2000.-Вып.2.-Т.46- с.121-124.

35. Лушников Е.Ф., Загребин В.М. Апоптоз клеток: морфология, биологическая роль, механизмы развития.// Арх. пат.-1987.-т.49- с.84-89.

36. Лушников Е.Ф., Абросимова А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).//М.: Медицина-2001-c. 192.

37. Манухин И.Б., Геворкян М.А., Кушлинский Н.Е. Синдром поликистозных яичников.//М.: Медицинское информационное агентство.-2004-с.190.

38. Маянский А.Н., Маянский H.A., Абаджиди М.А., Заславская М.И Апоптоз: начало будущего.//Микробиол.-1997.-№2- с.88-94.

39. Мельникова JI.M. Сосудисто-тканевой регион фолликулов яичника в процессе роста и атрезии.//Автореф. дис. к.м.н,- М.-1979.- с.24-25.

40. Миловидова Н.С., Алкадарская И.М. Морфология преовуляторного фолликула в условиях гормонально индуцированной овуляции.//Тр. 2-го Моск.медиц.ин-та.-1981.-Т. 164-серия «Гистология»-вып.2.-с.40-47.

41. Нестерова М.В., Чщ-Чанг Ю.С., Северин Е.С. Роль олигонуклеотидов в регуляции клеточных процессов.// Вопросы биол. мед. и фарм. химии. -1998.-№4- с.3-14.

42. Никитин А.И., Воробьева О.В. Факторы регуляции дифференцировки соматических клеток фолликулов яичников млекопитающих.// Цитология.-1988.- с.1115-1171.

43. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель.- СПб.:Наука.-1996. -с.194-211.

44. Павлович C.B., Бурлеев В.А. Сосудисто-эндотелиальный фактор роста в патогенезе синдрома гиперстимуляции яичников.//Акуш. и гинек.-2004-№2-с. 11-13.

45. Пальцев М.А. Введение в молекулярную медицину.//М., Медицина-2004-с.496.

46. Панков Ю.А. Новые системы проведения сигналов в механизмах гормональной регуляции.//Проблемы эндокринологии.-2000.-Т.46.-№2.-с.3-8.

47. Персианинов Л.С. Роль простагландинов в регуляции репродуктивной функции у женщин.//В кн.: Простагландины и их применение в акушерстве.-М.: Медицина-1977.-с.9-25.

48. Петропавловская М.С. Инициация роста фолликулов в норме и придисбаллансе стромального и фолликулярного компонентов яичника мыши.// Морфология.-1994.-Вып.-6.-с. 140-148.

49. Пирс Э. Гистохимия//М.:Изд.ИЛ.-1962.-е. 175-178.

50. Полушкина И.Н., Степанова Е.В., Дбар Ж.Н. Молекулярно-биологические маркеры, характеризующие апоптоз, пролиферацию и ангиогенез при раке яичников.//Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.-2004-№4-с.60-64.

51. Попов Л.С., Корочкин Л.И. Генетически программированная смерть клеток (апоптоз).//Генетика.-2004.-№40(2)-с. 149-166.

52. Рухадзе Е.В. Структурно-функциональная характеристика прозрачной зоны овоцитов, ее биогенез и значение для репродуктивной функции.// Автореф. дис. К.М.Н.-М.-1986.- с.20.

53. Савицкий Г.А., Иванова Р.Д. Некоторые итоги изучения гематофолликулярного барьера в яичнике.//Акуш. и гин.-1981.-№12.-с.8-11.

54. Савченко О.Н., Степанов Г.С. Механизмы гормональной регуляции функции яичников и роль принципа обратной связи в этих процессах.//Механизмы гормональной регуляции и роль обратных связей в явлениях развития и гомеостаза. - М.-1981.-С.203-228.

55. Семенов В.В., Китаев Э.М., Никитин А.И., Иванова Р.Д. Ультраструктурное изучение процесса атрезии фолликулов яичника человека при некоторых нарушениях репродуктивной функции.//Акуш. и гин.-1983.-№2.-с. 18-20.

56. Серов В.Н., Кудрявцева Л.И. Доброкачественные опухоли и опухолевидные образования яичников.// М.-1999-С.152.

57. Слинченко H.H., Курский М.Д. Механизмы регуляции аденилатциклазной активности.//Успехи современной биологии.-1979.-Т.88.-№3.-с.337-352.

58. Степанова Е.В., Барышников А.Ю., Личиницер М.Р. Оценка ангиогенеза опухолей человека.//Успехи соврем. биологии.-2000.-№120(6).-с.599-604.

59. Степанова Е.В., Полушкина И.Н., Дбар Ж.Н.-2002.-№.4.-с. 14-20.

60. Сухих Г.Т., Дементьева М.М., Серов В.Н., Жданов A.B., Файзуллин Л.З.

61. Апоптоз в гормонально-зависимых тканях репродуктивной системы.// Акуш. и гин.-1999.-Вып.5.- с.12-14.6¡.Тимошенко Л.И., Травянко Т.Д., Лялъкина А.И. Циркадный контроль репродуктивной системы женского организма.//Акуш. и гин.-1981.-№8.-с.4-7.

62. Титов В.Н. Роль макрофагов в становлении воспаления, действие интерлейкина-1, интерлейкина-6 и активность гипоталамо-гипофизарной системы (обзор литературы).//Клинич.лабораторная диагностика.-2003.-№12.-с.З-10.

63. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы.// Молекулярная биология.-1996.-t.30- вып.З- с.487-502.

64. Черняева Л.К. Дифференциальный анализ примордиальных фолликулов и окружающей их стромы в яичниках кролика.//Тр.Крым.мед.ин-та.-1984.-T.102.-C.100-102.

65. Хиршдиад А.Н, Шмидт В.А. Кинетические аспекты развития фолликулов у крыс.//Онтогенез.-1989.-№1.-с.5-27.

66. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме.-М.: Медицина.-1998.-Вып.8.-с.42-44.

67. Adashi E., Baird D. and Crosignani P. Folliculogeneses and gonadotropins. In book Gonadotropins and fertility in the women.// Serono Fertility Series.-Rome.-1999.- p. 1-10.

68. Aittomaki K., Tapanainen J., Huntaniemi I. FSH and FSH receptor - new developments in molecular genetics.// World Congress of Pediatr. Adolescent Gynecol. Helsinki.-1998.-WS76.

69. Amstrdam A., Tajima K., Sasson R. Cell-specific regulation of apoptosis byglucocorticoids: implication to their anti-inflammatory action.// Biochem. Pharmacol.-2002.-Sep.-v.64(5-6)- p.843-850.

70. Arends M.J., Wyllie A.H. Apoptosis. Mechanism and role in patology.// Intern. Rev. Exp. Pathol.-1991.-v.32- p.223-254.

71. Baird D. A model for follicular selection and ovulation: lessons from superovulation.// J.Steroid. Biochem.-1987.-v.27- p. 15-23.

72. Baker S. and Spears N. The role of intra-ovarian interactions in the regulation of follicle dominance.// Human Reprod. Update.-1999.-vol.5- p.153-165.

73. Berker B., Dunder I., Ensari A., Cengiz S.D. Prognostic value of p53 accumulation in epithelial ovarian carcinomas.//Arch.Gynecol.Obstet.-2002.-v.266-p.205-209.

74. Biswas S.K., Huang J., Persaud S., Basu A. Down-regulation of Bcl-2 is associatet with cisplatin resistance in human small lung cancer H69 cells.//Mol.Cancer Ther.-2004.-v.3-p.327-334.

75. Bomone T., Lee J.Y., Park D.C. et al. Expression profiling of serous low malignant potential, low grade and high grade tumors of ovary.//Cancer Res.-2005.-v.65 (22)-p. 10602-12.

76. Brown J. Pituitary control of ovarian function - concepts derived from gonadotropin therapy. // J. Obstet. Gynaec.-1978.-v.18- p.47-54.

77. Bu S.Z., Yin D.L., Ren X.H. et al. Progesterone induces apoptosis and up-regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines.// Cancer. -1997.-v.79:10- p.1944-1950.

78. Burke F., East N., Upton C. et al. Interferon gamma induced cell cycle arrest and apoptosis in a model of ovarian cancer.// Eur. J Cancer.-1997.- v.33:7p. 1114-1121.

79. Chi L., Zhou W., Prikhozhan A. et al. Cloning and characterization of thehuman GnRH receptor.// Mol. Cell Endocrinol.-1993.-v.91- p.Rl-R6.

80. Childs G.V., Ganten D., Pfaff D. Functional ultrastructure of gonadotropes.//Berlin. Reproduction.-1984.-v.39-p.258-266.

81. Chun S., Eisenhauer K., Kubo M. And Hsueh A. Interleukin-1? Suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide production.// Endocrinology.-1995.-v. 136- p.3120-3127.

82. Ciardiello F., Caputo R., Bianco R. et al. Inhibition of growth factor production and angiogenesis in human cancer cells, a selective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor.//Clin.Cancer.Res.-2001-v.7 (5)-p. 1459-65.

83. Cook C., Siow Y., Brenner A. and Fallat M. Relationship between serum mullerian-inhibiting substance and other reproductive hormones in untreated women with polycystic ovary syndrome and normal women.// Fertil. Steril.-2002-v.77- p. 141-146.

84. Cooke R.G.L., Nothnick W.B., Komar C. et al. Collagenase and gelatinase messenger ribonucleic acid expression and activity during follicular development in the rat ovary.// Biol. Reprod.-1999.- Nov.,1.-61(5).- p.1309-1316.

85. Corcoran M.L., Emmer-Buck M.R., McClanahan J.L., Pelina-Parker M., Stetler-Stevenson W.G. TIMP-2 mediates cell surface binding of MMP-2. // Adv. Exp. Med. Biol.-1996.-v.389- p.295-304.

86. Cotman C. et al. The neuro-immune-endocrine connection.// New York. Raven Press.-1986.-p.150.

87. Couse J.F., Yates M.M., Deroo B.J., Korach K.S. Estrogen receptor-beta is critical to granulose cell differentiation and the ovulatory response to gonadotropins.// Endocr.-2005.-Apr.-v.14- p.34-41.

88. Cristina C., Diaz-Torga G., Baldi A., Gongora A. et al. Increased pituitary vascular endothelial growth factor-A in dopaminergic D2 receptor knockout female mice.// Endocrinol.-2005.-Apr.-v.7- p.219-225.

89. Cromoll J., Pekel E., Nieschlag E. The structure and organization of the human follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) gene.// Genomics.-1996.-v. 15101р.308-311.

90. Curry Т.Е., Osteen K.G. The matrix metalloproteinase system: Changes,Regulation and Impact throughout the Ovarian and Uterine Reproductive Cycle.//Endocr. Rev. -2003.-Aug.l- 24(4).- p.428-465.

91. Curry Т.Е., Song L., Wheeler S.E. Cellular localization of gelatinases and tissue inhibitors of metalloproteinases during follicular growth, ovulation and early luteal formation in the rat.//Biol. Reprod.-2001.- Sept.,l.-65(3).-p.855-865.

92. Curry Т.Е., Osteen K.G. Cyclic changes in the matrix metalloproteinases system in the ovary and uterus.//Biol. Reprod.-2001.-May,l.-64(5).-p.l285-1296.

93. Curry Т.Е., Mann J.S., Estes R.S., Jones P.B. Alpha 2-macroglobulin and tissue inhibitor of metalloproteinases: collagenase inhibitors in human preovulatory ovaries.// Endocrinology.-2004.-vol.l27-p.63-68.

94. Debernardis D., Sire E.G., De-Feudis P. et al. P53 status does not effect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to paclitaxel.// Cancer Res.- 1997.-v.57:5- p.870-874.

95. De Wet A., Laven J., de Jong F., Themmen A. and Fauser B. Antimulleran hormone serum levels: a putative marker for ovarian aging.// Fertil. Steril.-2002.-v.77.- p.357-362.

96. Diebold J., Baretton G., FelcgnerM. et al. Bcl-2 expression, p53 accumulation, and apoptosis in ovarian carcinomas.// J. Clin. Pathol.-1996.- v.l05:3- p.341-349.

97. Dissen I.A., Paredes A., Romero C. et al. Нервная и нейротрофная регуляция яичников.// J. Ovary.-2004.-v.l- р.3-4.

98. DiZerega G.G., Hodgen G.D. Folliculogenesis in the primate.// Biol, reprod.-1998.-v.2- p.27-49.

99. Dragovic R.A., Ritter L.J., Schulz S.J. et al. Role of oocyte-secreted growth differentiation factor 9 in the regulation of mouse cumulus expansion.// Endocrinol.-2005.-Mar.-v. 10- p.77-78.

100. Dufau M.L. The luteinezing hormone receptor.// Rev. Physiol.-1998.-v.60р.461-469.

101. Eliopoulos A.G., Kerr D.G., Herod J. et al. The control of apoptosis and drug resistance in ovarian cancer: influence ofp53 and bcl-2.// Oncogene.-1995.-v.l 1:7- p.1217-1228.

102. Emmen J.M., Couse J.F., Elmore S.A., et al. In vitro growth and ovulation of follicles from ovaries of estrogen receptor (ER)-a and (ER)-|3 null mice indicate a role for ER-(3 in follicular maturation.// Endocrinol.-2005.-Feb.-v.24- p.58-62.

103. Emmert BuckM.R., Emonard H.P., Corcoran M.L., Krutzsch H.C., Foidart J.M., Stetler-Stevenson W.G. Cell surface binding of TIMP-2 andpro-MMP-2/TIMP-2 complex.//FEBS Lett.-1995.-364- p.28-32.

104. Erickson G. and Shimasaki S. The role of oocyte in folliculogenesis.// Trends Endocrinol. Metab.-2000.-v. 11.- p. 193-198.

105. Erickson G. and Shimasaki S. The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors.//Fertil Steril.-2001.-v.76- p.943-949.

106. Faddy M. and Gosden R. A mathematical model of follicle dynamics in the human ovary. //Human Reprod.-1995.-v.10- p.770-775.

107. Fauser B. Follicular development and oocyte maturation in hypogonadotrophic women employing recombinant FSH: the role of oestradiol.// Human Reprod. Update.-1997.-v.3-p. 101-108.

108. Fenichel P. Преждевременная яичниковая недостаточность: физиологическая роль иммунной системы в осуществлении яичниковой функции.// Endocrinol.-1999.-v.57-p. 114-116/

109. Fieber C., Baumann P., Vallon R., Tenneer C., Simon J.C., Hofmann M., Angel P., Herrlich P., and Sleeman J.P. Hyaluronan-oligosaccharide-induced transcription of metalloproteinases.// J. Cell. Sci.-2004.-Jan.15.-l 17(2)-p.359-367.

110. Filippovich I.V., Sorokina N.I., Robillard N., Chatal J.F. Radiation-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells growing as a monolayer and as multicell spheroids.// J. Cancer.-1997.- v.72:5- p.851-859.

111. Fink G., Knobil E., Neil J.D. In the physiology of reproduction.// New York.-1998.- p.1349-1377.

112. Fowler P. and Tempelton A. The nature and function of putative gonadotropin surge-attenuating/inhibiting factor (GnSAF/IF).// Endocrine Reviews.-1996.-v.17- p.103-120.

113. Fowler P., Sorsa T., Harris W., Knight P. and Mason H. Relationship between follicle size and gonadotropin surge attenuating factor (GnSAF) bioactivity during spontaneous cycles in women.// Human Reprod.-2001.-v.16- p. 13531358.

114. Frankel A., Buckman R., Kerbel R.S. Abrogation of taxol-indused G2-M arrest and apoptosis in human ovarian cancer cells grown as multicellular tumor spheroids.// Cancer Res.-1997.-v.57:12- p.2388-2393.

115. Ginter O., Wiltbank M., Fricke P., Gibbons J. and Kot K. Selection of the dominant follicle. //Biol. Repr.-1996.-v.55- p.l 187-1194.

116. Gougeon A. Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses.// Endocrine Rev.-1996.-v.17- p.121-155.

117. Gougeon L. Фолликулогенез: морфология, динамика и функциональные аспекты. // J. 0vary.-2004.-v.2- р.25-29.

118. Gregory L. Ovarian markers of implantation potential in assisted reproduction.// human Reproduction.-1998.-v.13- Suppl 4- p.l 17-132.

119. Groom N., Illingworth P., O'Brien M. et al. Measurement of dimeric inhibin В throughout the human menstrual cycle.// J. Clin. Endocrinol. Metab.-1996.-v.81- p.1401-1405.

120. Hagglund A-C., Ny A., Ny G.L. Regulation and localization of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in the mouse ovary during gonadotropin-induced ovulation.//Endocrinology.-2004.-vol.140.-9- p.4351-4358.

121. Havrilesky L.J., Hurteau J.A., Whitaker R.S. et al. Regulation of apoptosis in normal and malignant ovarian epithelial cells by transforming growth factor-beta.// Cancer Res.-1995.-v.55:4- p.944-948.

122. Hodgen G.D. Ovarian function for multiple follicle maturation.// Clin. Obstet. Gynecol.-1996.- v.29(l) p.127-140.

123. Huhtaniemi I. LH and LH receptor — new developments in molecular genetics.// World Congress of Pediatr. Adolescent Gynecol. Helsinki.-1998. WS75.

124. Huime J. and Lambalk C. Gonadotropin-reeasing-hormone-receptor antagonists.// Lancet.-2001.-v.358- p. 1793-1803.

125. Hulboy D.L., Rudolph L.A. and Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases as mediators of reproductive function.//Mol. Hum. Reprod.-Jan.1997- 3.-p.27-45.

126. Evidence for autocrine or paracrine roles of a2-macroglobulin in regulation of estradiol production by granulosa cells and development of dominant follicles.// Endocrinology.-2004.-Jun.-145.-p.2784-2794.

127. Jameson J.L. Inherited disorders of the gonadotropin hormones.// Mol. Cell Endocrinol.1996.-v. 125 -p. 143-149.

128. Karsch F.J., Battaglia D.F., Breen K.M. et al. Mechanisms for ovarian cycle disruption by immune/inflammatory stress.// Stress.-2002.-Jun.-v.5(2)-p.l01-112.

129. Kerr Y.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.// J. Cancer.-1972.-v.26:2- p.239-257.

130. Kodaman P.H., Behrman H.R. Endocrine-regulated and protein kinase C-dependent generation of superoxide by rat preovulatory follicles.// Endocrinol.-2001.-Feb.-v.142 (2)- p.687-693.

131. Koshikawa N., Minegishi T., Sharabi A., Quaranta V., Seiki M. Membranetype matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) is a processing enzyme for human laminin gamma 2 chain.//J. Biol. Chem.-2004.-Nov.-v.3-p. 115-123.

132. Kuwashima Y., Kobayashi Y., Kavwarai A. et al. Expression of bcl-2 and apoptotic DNA fragmentation in human endometrial adenocarcinoma cella.// Anticancer Res.-1996.-v.l6:5B- p3221-3224.

133. Lacker H.M., Beers W.H., meuli L.E. et al. A theory of follicular selection: hypotheses and examples.// Biol. Reprod.-1987.-v.37- p.570-580.

134. Lafon C., Mathieu C., Guerrin M. et al. Transforming growth factor beta 1-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and bcl-2.// Cell Growth Differ.-1996.- v.7:8p.1095-1104.

135. Licht P., Wildt L. Luteal and extraluteal receptors for hCg and LH.// Zentral. Gynakol.-1998.-v.120- p.98-105.

136. Mahdavi A., Pejovic T., Nezhat F. Induction of ovulation and ovarian cancer: a critical review of the literature./ZFertil Steril.-2006.-v.85 (4)-p.819-826.

137. Martin D.C.,Folkes J.L., Babic B., Khokha R. Insulin-like growth factor II signaling in neoplastic proliferation is blocked by transgenic expression of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1.// J.Cell.Biol.-1999.-146.-p.881-892.

138. Mason H., Carr L., Leake R. and Franks S. Production of transforming growth factor-? by normal and polycystic ovaries.// J. Clin. Endocrinol. Metab.-1995.-v.80- p.2053-2056.

139. McGee E. and Hsueh A. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles.// Endocrine Reviews.-2000.-v.21- p.200-214.

140. McGeehan G.M.,Becherer J.D., Bast R.C. et al. Regulation of tumour necrosis factor-alpha processing by a metalloproteinase inhibitor.// Nature.-1994.-370-p.558-561.

141. McNatty K.P., Smith D.M., Makris A., Osathanonolh R. The microenvironment of the human antral follicle: interrelations of the antral fluid, the population of granulose cells and the theca cells.// Endocrinol, and Metabol.-1979.-v.49- №6- p.851-860.

142. McNatty K.P., Fidler A.E., Juengel J.L. et al. Growth and paracrine factors regulating follicular formation and cellular function.// Mol. Cell. Endocrinol.-2000.-163-p.l 1-20.

143. Miller B.T., Lakoski J.M., Perez-Polo J.R., Liss A.R. Peptide modulation of luteinizing hormone releasing control of reproductive function.// Endocrinol.-1989.-v.56- p.255-271.

144. Motta P.M., Makabe S., Nottola S.A. The ultrastructure of human reproduction. The natural history of female gern cell: origin, migration and differentiation inside the developing ovary.// Hum. Reprod. Update.-1997- 3-p.281-295.

145. Murphy G., Knauper V., Cowell S., Hembry R., Stanton H., Butler G. et al. Evaluation of some newer matrix metalloproteinases.// The New York Academy of Sciences.-1999.-878- p.25-39.

146. Murrs R.P., Lobo J.D., Campeau J.D. et al. Correlation of human follicular fluid inhibin activity with spontant ovary maturation.// J. of Clinical Endocrinol, and metabol.-1987.-v.69- p.321-326.

147. Nagase H., Woessner J.F. Matrix metalloproteinases.// J. Biol. Chem.- 1999.-274.-p.21491-21494.

148. Nilsson M.B., Wangley R.R., Fidler I.Z. Interleukin-6, secreted by human ovarian carcinoma cells is a potent proangiogenic cytokine.//Cancer res.-2005.-v.65(23)-p. 10794-800.

149. Pepe G.J., Billiar R.B., Leavitt M.G., Zachos N.C., Gustafsson J.A., Albrecht E.D. Expression of estrogen Receptors a and p in the rat ovary.// Biol, of Repr.-2002.- 66- p.1054-1060.

150. Perez G., Robles R., Knudson M., Flaws J., Korsmeyer S. and Tilly J. Prolongation of ovarian lifespan into advanced chronological age by Bax — deficiency.//Nature Genetics.-1999.-v.21- p.200-203.

151. Perez-Polo J.R., Lakoski J.M. Introduction: neuroimmune modulation of reproductive function.//Endocrinol.-1989.-v.89- p.307-309.

152. Rajah R., Katz L., Nunn S. et al. Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) proteases: functional regulators of cell growth. // Prog. Growth Factor Res.-1995.-v.6- p.273-284.

153. Reed J.C. Apoptosis-based therapies.//Nat.Rev.Drug Discon.-2002.-v.l(2)-p.ll 1-121.

154. Reichmann E. The biological role of the Fas/FasL system during tumor formation and progression.//Cancer Biol.-2002.-v.l2-p.309-315.

155. Saegusa M., Kamata Y. et al. Bcl-2 expression is correlated with a low apoptosis index and associated with progesterone receptorin endometrial carcinomas.// J. Pathol.-1996.-v.180- p.275-282.

156. Saha S.K., Ghosh P., et al. Differential expression of plod and MMP isoformsin hypothyroid rat ovary and disintegration of extra cellular matrix.// Endocrinol.-2005.-Apr.-v.7- p. 113-119.

157. Schuler M., Bossy-Wetzel E., Goldstein J. et al. P53 induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial citochrome c release.// J.Biol.Chem.-2000.-v.275.-p.7337-7342.

158. Seifer D., MacLaughlin, Christian B., Feng B. and Shelden R. Early follicular serum mullerian-inhibiting substance levels are associated with ovarian response during assisted reproductive technology cycles.// Fertil. Steril.-2002.-v.77.- p.468-477.

159. Shapiro S.D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences.// Curr. Opin Cell Biol.-1998.-10.-p.602-608.

160. Sheets E.E., Yeh J. the role of apoptosis in gynaecologica malignancies.// Ann Med.-1997.-v.29- p.121-126.

161. Sirotkin A.V., Dukesova J., Pivko J., Makarevich A.V., Kubek A. Effect of growth factors on proliferation, apoptosis and protein kinase A expression in cultured porcine cumulus oophorus cells.// Reprod. Nutr. Dev.-2002.-Jan-Feb.-v.42(l)- p.35-43.

162. Skiles J.W., GonnellaN.C., Jeng A.Y. The design, structure, and clinical update of small molecular weight matrix metalloproteinase inhibitors.// Curr. Med. Chem.-2004.-Nov.-v. 11 (22)- p.2911-2977.

163. Skirnisdottir I., Seidal T., Gerdin E., Sorbe B. The prognostic importance of p53, bcl-2, and bax in early stage epithelial ovarian carcinoma treated with adjuvant chemotherapy.//Endocr.-Related Cancer.-2002.-v. 12-p.265-276.

164. Soini Y., Paakko P. Extent of apoptosis in relation to p53 and bcl-2 expression in germ cell tumor.//Human Pathol.-1996.-v.27:l 1- p.1221-1226.

165. Sogaard M., Kjaer S.K., Gayther S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention.// Acta Obstet Gynecol Ccand.-2006.-v.85(l)-p.93-105.

166. SpicerL.J. Proteolytic degradation of insulin-like growth binding proteins by ovarian follicles:a control mechanism for selection of dominant follicles.// Biol. Reprod.-2004.- May, 1 -70(5).-p. 1223-123 0.

167. Stegh A.H., Barnhart B.C., Volkland J. et al. Inactivation of caspase-8 on mitochondria of Bcl-XL-expressing MCF7-Fas cell. Role for the bifunctional apoptosis regulator protein.// J.Biol. Chem.-2002.-v.277-p.4351-4360.

168. Stouffer R., Dahl К. Влияние гонадотропинов на исходы индукции овуляции и уровень стероидных гормонов яичника.// Пробл. репрод.-2002.-№2-с.29-34.

169. Tajima К., Yoshii К., Orisaka М. et al. LH-induced ERK activation differently modulates progesterone and androstenedione production in bovine theca cells.// Endocrinol.-2005.-Apr-v.7- p.255-261.

170. Teixeira J., Maheswaran S. and Donahoe P. Mullerian inhibiting substance: an instructive developmental hormone with diagnostic and possible therapeutic applications.// Endocrine Reviews.-2001.-v.22- p.657-674.

171. Tsuji Y., Tamaoki Т.Н., Hasegawa A. et al. Expression of interleukin-18 and its receptor in mouse ovary.// J. Reprod. Immunol.-200l.-Nov.-v.46 (5)- p.349-357.

172. Vital-Reyes V., Rodriguez-Burford C., Chhieng D.C. Ovarian expression of markers associated with proliferation or apoptosis in women with diminished ovarian reserve.// Fértil. Steril.-2006.-May-v.25- p.275-284.

173. Vu Т.Н., Werb Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology.// Genes Dev.-2000.-14.-p.2123-2133.

174. Weestergaad L., Andersen C. and Byskov A. Epidermal growth factors in small antral follicles in pregnant women.// Endocrinology.-1990.-v.127- p.363-367.

175. Wildt L. Die endocrine Kontrolle der Ovarialfimktion und die

176. Ovarialfunktionsstorungen.// Neue Wege in Diagnostik und Therapi. Stuttgart: Enke.-1987.-s.l-25.

177. Yasuda K., Hagiwara E., Takeuchi A. et al. Changes in the distribution of tenascin and fibronectin in mouse ovaiy during folliculogenesis, atresia, corpus luteum formation and luteolisis.// Endocrinol.-2005-Feb.-v.22(2).-p.237-245.

178. Yong P.Y., Harlow C., Thong K.J. et al. Regulation of 1 lbeta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 gene expression in human ovarian surface epithelial cells by interleukin-1.// Hum. Reprod.-2002.-Sep.-v.l7(9).- p.2300-2306.

179. Yu M.H., Woessner J.F. et al. Heparan sulfate proteoglycans as extracellular docking molecules for matrilysin (matrix metalloproteinase 7). //J.Biol.Chem.-2000.-275.-p.4183-4191.

180. Yu Q., Stamenkovic I. Cell Surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.// Genes & Dev.-2000.-14.-p.l63-176.

181. Zeleznik A.J., Schuler H.M., Reichert L.C. Gonadotropin by ovaiy: role of the vasculature in the selective distribution of preovulatory follicle.// Endocrinol.-1981-V.109- p.359-363.

Информация о работе

Бичерова, Ирина Анатольевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Организация фолликулов и парафолликулярных регионов яичников на этапах их позитивного и атретического развития (иммуноцитохимические аспекты) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы