Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние "Тингол-1" и "Тингол-2" на морфологию яичников крыс в разные стадии эстрального цикла

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние "Тингол-1" и "Тингол-2" на морфологию яичников крыс в разные стадии эстрального цикла"

На правах рукописи

ЗЕНКИНА ВИКТОРИЯ ГЕННАДЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ «ТИНГОЛ-1» И «ТИНГОЛ-2» НА МОРФОЛОГИЮ ЯИЧНИКОВ КРЫС В РАЗНЫЕ СТАДИИ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена во Владивостокском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Каредина Валентина Семеновна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Черток Виктор Михайлович кандидат медицинских наук Грибань Андрей Николаевич

Ведущая организация:

Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и • патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства.

Защита состоится « » декабря 2004 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу: 690990, г. Владивосток, пр. Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан ноября 2004 года

Учёный секретарь диссертационного совета

Рева Г.В.

дуоззср

g&Qof- 3

Введение

Актуальность проблемы Проблема регуляции процессов роста, созревания, овуляции, атрезии фолликулов, функционирования желтого тела в яичниках является одной из наиболее важных в репродуктивной биологии.

Интерес к этой проблеме связан с клиническими задачами — лечение и профилактика различного рода нарушений в репродуктивной функции женщин и не утрачивает свою актуальность до настоящего времени. В частности, дисгенезия гонад может быть результатом тотальной или субтотальной атрезии оогоннй как во время, так и сразу после их миграции в эмбриональные гонады. Синдром истощения яичников является следствием усиленной атрезии фолликулов на одной или нескольких стадиях их развития. Недостаточность яичников, лечение которой химиотерапевтическими препаратами осложняется возможностью малигнкзации, можно будет предупредить, конкурентно блокируя индукцию программированной клеточной гибели в фолликулах. Даже физиологическую недостаточность яичников, возникающую в климактерическом периоде, можно значительно отсрочить, если будет обнаружена возможность замедлить атретические процессы [B.C. Новиков, 1996; Г.Т. Сухих с соавт., 1999].

В последние годы появилось много публикаций о биологической и фармакологической активности органических природных соединений морского происхождения [В.И. Калинин, B.C. Левин, В.А Стоник, 1994; Oshsima, 1998; ВА Мулындин, 2002]. Многие виды морских организмов в настоящее время применяются в пищевых целях, в традиционной и нетрадиционной медицине, в качестве пищевых добавок. Из морских гидробионтов обращают на себя внимание, в качестве источников биологически активных веществ, представители класса голотурий, из которых наиболее распространенным представителем в прибрежных водах Приморья, является кукумария японская (Cucumaria japonica). Биологически активные вещества (БАВ) кукумарии обладают антимикробным, фунгицидным действием. Они стимулируют

антикоагулянтиое и гипотензивное действие, задерживают рост опухолевых клеток [Elyakov, 1990; Conde, 1997; Т.К. Лебская, 2000]. СИ. Ефимова и Л.Ю. Савватеева (1999) установили, что отходы переработки кукумарии в качестве подкормки в рацион норок усиливают половую активность и улучшают качество спермы у самцов. У самок становится выше плодовитость, повышается жизнеспособность потомства. Изучение действия препаратов из иглокожих на морфологическом уровне репродуктивной системы самок экспериментальных животных до настоящего времени не проводилось. В связи с этим актуальны научные исследования в этой области.

Цель исследования: изучить морфологию яичников крыс на разных стадиях эстрального цикла при воздействии «Тингол-1» и «Тингол-2».

Задачи исследования:

1. Изучить особенности влияния «Тингол-1» и «Тингол-2» на общеморфологические показатели животных, эстральный цикл.

2. Дать морфофункциональную характеристику Тканевым базофилам мезовариальной брыжейки в разные стадии полового цикла в контроле и эксперименте.

3. Описать морфологию стероидпродуцирующих структур яичников в эструсе и диэструсе у интактных животных.

4. Изучить морфофункциональное состояние яичников крыс в эструсе и диэструсе после получения ими «Тингол-1» и «Тингол-2» в половозрелом периоде.

5. Изучить морфофункциональное состояние яичников крыс в разные стадии полового цикла (эспрус, диэструс) после получения ими «Тингол-1» и «Тингол-2» до момента полового созревания.

6. Описать морфологию яичников неонатально андрогенизированных крыс до и после получения ими «Тингол-2».

Научная новизна

1. Впервые получены данные о состоянии эстрального цикла самок крыс после получения ими «Тингол-1» и «Тингол-2».

2. Впервые проведен морфометрический и гистохимический анализ ТК мезовариальной брыжейки крыс в разные стадии эстрального цикла до и после введения в рацион животных «Тингол-1» и «Тингол-2».

3. В работе впервые дана комплексная оценка состояния яичника в эструсе и диэструсе, базирующаяся на результатах количественного морфологического анализа после введения в рацион животных «Тингол-1» и «Тингол-2» в половозрелом периоде и до момента полового созревания.

4. Впервые представлены данные об изменении морфологии гонад неонатально андрогенизированных крыс под воздействием экстракта из кукумарии японской, выявлено значение и степень нарушений морфологических структур в патологии репродуктивной системы.

Практическая значимость работы

Изложенные данные расширяют представления о морфологических особенностях тканевых элементов овариальных фолликулов и их производных в яичниках крыс в процессе физиологического фолликулогенеза и при некоторых формах его нарушения. Определен эффект действия гицрэлизата и экстракта из кукумарии на гонады самок крыс на морфологическом уровне, а также возможность формирования фолликулярных кист и кист желтого тела.

Основные положения, выносимые на защиту

1. «Тингол-1» и «Тингол-2» не изменяют общеморфологические показатели крыс и не нарушают течение эстрального цикла. Пищевые добавки из кукумарии уменьшают количество атрезирующихся фолликулов в яичниках половозрелых животных, вызывают гипертрофию теки полостных фолликулов.

2. Достоверным критерием диагностики стадий эстрального цикла является степень дегрануляции тучных клеток мезовариальной брыжейки с выходом биогенных моноаминов.

3. «Тингол-2» у неонатально андрогенизированных животных, на фоне нарушенного фолликулогенеза стимулирует образование кист яичников.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на 1-й международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, 2002); на конференции студентов и молодых ученых «Колосовские чтения-2002» (Санкт-Петербург, 2002); на III, IV, V Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2002,2003,2004) и на заседании Проблемной комиссии «Морфология, физиология, биохимия» Владивостокского государственного медицинского университета (25 мая 2004).

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных данных, заключения, выводов, списка литературы. Работа содержит 150 страниц машинописного текста, 19 таблиц*, 37 рисунков, включающих 24 фотографии и 13 графиков. Указатель литературы представлен 130 работами отечественных и 81 работами зарубежных авторов.

Характеристика материалов и методов исследования

Эксперименты проводились на нелинейных белых крысах-самках, которых разделили на следующие группы: 1) интактные половозрелые животные (возраст 5,5 месяцев), получавшие обычный рацион, 2) половозрелые животные, получавшие наряду с обычным кормом «Тингоя-1» в дозе 3 мл/кг в течение двух месяцев, 3) половозрелые животные, получавшие наряду с обычным кормом «Тингол-2» в дозе 0,03 мл/кг в течение двух месяцев, 4) интактные половозрелые животные (возраст 3,5 месяца), получавшие обычный рацион, $) животные, получавшие «Тингол-1» в дозе 3 мл/кг в качестве добавки к основному корму в неполовозрелом, периоде, 6) животные, получавшие «Тингол-2» в дозе 0,03 мл/кг в качестве добавки к основному корму в неполовозрелом периоде, 7) животные в возрасте 3,5 месяцев, которым в

неонатальном периоде проводили андрогенизацию путем подкожного введения 25 мкг тестостерона пропионата, 8) неонатально андрогенизированные крысы, получавшие наряду с обычным кормом «Тингол-2» в дозе 0,03 мл/кг с 1,5 до 3,5 месяцев жизни.

Объектом исследования служили яичники 78 экспериментальных крыс к 34 интактных, содержавшихся в условиях одного вивария, при обычном световом и температурном режиме. В каждой экспериментальной группе просчитывали от 1,5 до 3,5 тысяч срезов. Кормление животных пищевыми добавками осуществлялось в осенне-зимний период. Исследования яичников проводились в разные фазы полового никла, для чего каждую группу животных делили на две (эструс, диэструс). На протяжении второго месяца кормления животных пищевыми добавками оценивали функциональное состояние яичников путем изучения эстральиого цикла. В течение двадцати дней подряд брали влагалищные мазки у крыс в опытных и контрольных группах с последующей окраской по Романовскому - Гнмза. Дополнительно стадия никла подтверждалась методом Е.Н. Гордиенко и С.С. Цслуйко (1999). Способ основан на идентификации фазы эстрального никла при помощи морфометрической диагностики функциональной активности тучных клеток (ТК) мезовариальной брыжейки, которую окрашивали толуидиновым синим. Для исследования содержания биогенных аминов в ТК применяли гистохимический метод Фурнесс и Коста (1979).

В эксперименте использовали пищевые общеукрепляющие лечебно-профилактические добавки ТИНРО - Центра г. Владивостока (директор центра Л.Н. Бочаров): «Тингол-1» (патент РФ №2117435) и «Тингол-2» (патент РФ №2210377). «Тингол-1» (ГУ 9265-074-00472012-96, ТИ 36-72-96) представляет собой гидролизат из кукумарии японской, полученный ферментативным гидролизом с помощью протеолитического фермента из внутренностей краба либо кислотным гидролизом, содержащий тритернсновые гликозиды не менее 100 мкг/см3. Массовая доля сухих веществ в данной пищевой добавке составляет 10% и включает в себя белки, гексозамины, сахара, витамины группы В, макро-

и микроэлементы (Fe, Mn, Co, Zn). Аминокислотный состав белков представлен незаменимыми (валин-2,4, лейцин-4,0, изилейцин-2,6, трсонин-3,7, метионин-2,1, лизин-2,2, фенилаланин-2,8, гистидин-1,0% к белку) и заменимыми (глицин-27,3, аланин-10,1, серин-6,3, аспарагиновая кислота-10,5, глутаминовая кислота-17,1, аргинин-3,3, цистин-0,1, пролин-4,4, тирозин-0,6, оксипролин-3,6% к белку) аминокислотами. «Тингол-2» (ТУ 9265-165-00472012-00, ТИ 36-1502000) - спиртовый экстракт из кукумарии японской, содержащий тритерпеновые гликозиды не менее 550 мкг/см3.

Общеморфологический анализ включал в себя определение массы тела животного, массы яичника, матки, надпочечника, печени, селезенки, вычисление коэффициента массы внутренних органов (КМВО), изучение эстрального никла, обзорное изучение препаратов яичников, окрашенных гематоксилином и эозином, метиленовым синим. На срезах яичников подсчитывали следующие морфометрические показатели: среднее число примордиальных, растущих, преовуляторных, атретических фолликулов, желтых тел, общее число генеративных элементов в гонадах на разных стадиях эстрального цикла в контроле и эксперименте, соотношение между числом растущих и атретических фолликулов, измерение диаметра (в мкм) примордиальных, растущих, преовуляторных фолликулов (толщина теки, гранулезы, прозрачной зоны), диаметр, периметр, площадь овоцитов в них и их ядер, ядерно-цитоплазматическое соотношение, коэффициент формы овоцита, диаметр атретических фолликулов и желтых тел.

Характер созревания фолликулов в условиях гормонального дисбаланса изуча1ся на модели Э.М. Китаева с соавторами (1986).

Морфометрию структурных элементов яичников осуществляли с помощью окуляр-микрометра и автоматизированной системы анализа изображений Allegro-MC, которая включает систему оцифровки изображений ATM28 pro, стандартную программу «Statistics». Рассчитывались следующие показатели: средняя арифметическая (М), ошибка средней арифметической (т), среднее квадратичное отклонение, критерий Стьюдента (t), показатель достоверности

различий (р). для оценки существенности различий полученных результатов использовали доверительный интервал 95% (р<0,05).

Результаты исследования и Н1 обсуждение

1 Наши исследования показали, что у животных контрольной группы и получавших дополнительно «Тингол-1» и «Тингол-2», содержавшихся в условиях одного вивария не наблюдалось изменения поведенческих реакций. Крысы во всех группах были активными, вовремя принимали пищу, отклонений физиологических отправлений не отмечалось. Выявили, что БАВ из кукумарии японской не обладают токсическим действием на различные органы и ткани. КМВО яичников, матки, надпочечников, печени, селезенки экспериментальных животных остается в пределах контрольных показателей. Одной из задач нашего исследования было определение влияния «Тингол-1» и «Тингол-2» на функциональное состояние гонад, то есть исследование астрального цикла животных. По нашим данным, пищевые добавки не вызывают каких либо отклонений в эстрадьном цикле, его общей продолжительности и длительности отдельных стадий (табл. 1), а также не оказывают отрицательного влияния на качественный состав влагалишных мазков.

Таблица 1

Продолжительность стадий астрального цикла у крыс в контрольной и экспериментальны! группах

Стадия цикла Продолжительность стадии в часах

Контроль Тингол-1 Тингол-2

Диэструс 58,50+1,25 59,45+1,30 60, оо+:, 40

Проэструс 15,0+1,30 15,00+1,20 14,50+1,20

Эструс 26,00+1,00 26,50+1,00 26,0011,00

Метаэструс 6,50+0,35 6,00+0,30 6,00+0,35

Общая продолжительность 106,4+1,45 107,35+1,50 106,5+1,40

Примечание: Р>0,05

ю

Другим компонентом, по которому можно судить о течении полового цикла являются ТК мезовариальной (брыжейки [Е.Н. Гордиенко, С.С. Целуйко, 1999]. Тучные клетки - важный источник биогенных моноаминов, которые могут быть существенными модуляторами различного рода нарушений в некоторых органах. Показано, что при определенных условиях тканевые базофилы могут депонировать, синтезировать, захватывать из окружающей ткани и секретировать в ткань моноамины. К настоящему времени ТК рассматриваются как источник основных медиаторов сосудисто-экссудативных явлений, определяющих фазу повышенной проницаемости капилляров, которая характерна для стадии эструса. Известно, что тканевые базофилы реагируют деграггуляцией на любое изменение физиологических условий, это опосредовано наличием на их мембране рецепторов к нейромедиаторам [НА. Клименко, СВ. Татарко, 1997]. Результаты наших исследований доказали, что наиболее активная реакция этих клеток в контрольной группе животных наблюдается в стадию эструса: общее количество тканевых базофилов достоверно выше, преобладают дегранулирующие клетки по сравнению с интактными, отмечается высокий коэффициент дегрануляции - 0,79 с выходом биогенных моноаминов за пределы клеток. У экспериментальных животных наблюдается аналогичная картина, что подтверждает отсутствие отрицательного влияния «Тингол-1» и «Тингол-2» на местные механизмы регуляции через тучноклеточную популяцию (табл. 2). Поскольку для этой стадии характерен выброс определенного количества тропчых гормонов гипофиза, вследствие чего происходит овуляция, можно считать, что тканевые базофилы мезовария являются определенным индикатором уровня данных гормонов. В связи с этим, различного рода нарушения полового цикла, ановуляцию можно диагностировать по реакции ТК мезовариальной брыжейки. Таким образом, значение данных элементов определяется не только их участием в микроциркуляторных изменениях, возникающих в определенную стадию эстрального цикла, но и непосредственно воздействием сскретируемых тканевыми базофилами веществ на местном уровне. Разная степень дегрануляиии, выход биогенных моноаминов за пределы

тучных клеток является диагностическим критерием стадий полового цикла как в контроле так и при экспериментальных воздействиях.

Таблица 2

Общая характеристика тучных клеток меэовариалыгой брыжейки крыс в контроле и после получения ими пищевых добавок

Показатели Контроль Тингол-1 Тингол-2

1. Общее количество ТК на 1 мм2- эструс - диэструс 10,5+1,21 7,0+0,59 10,7+0,59 7,7+0,75 9,7+0,74 7,75+0,5

2. Количество ГК: - эструс: интактные дегранул ирующие - диэструс: интактные дегранулирующие 2,2+0,42 8,3+0,86 7,8+0,74 1,4+0,14 2,85+0,27 7,85+0,77 6,5+0,60 1,2+0,06 1,95+0,31 7,65+0,74 6,95+0,45 1,4+0.24

3. Коэффициент дегрануляции эструс диэструс 0,79+0,04 0,20+0,01 0,74+0,05 0,16+0,01 0,79+0,06 0,18+0,02

4. Средний диаметр ТК(мкм): интактные дегранулирующие 8,59+0,22 13,8+0,77 8,66+0,22 13,41+0,68 8,39+0,27 14,29+0,74

5. Величина профильного поля: интактные дегранулирующие 39,41+2,07 104,16+9,43 41,63+2,22 99,63+8,52 42,47+3,06 99,92+7,61

Примечание: р>0,05

При изучении серийных срезов яичников половозрелых экспериментальных крыс с установившимися эстральными циклами (получавших «Тинтол-1» и «Тингол-2» с 3,5 до 5,5 месяцев) мы не выявили визуальных отклонений в гистоархитектонике органа от таковой интактных животных. Численность примордиальных, растущих, зрелых фолликулов, желтых тел, общее число генеративных элементов колеблется у опытных животных по сравнению с. интактными недостоверно (табл'. 3). Количественные изменения достоверно коснулись лишь «молодых» атретических фолликулов, число которых сократилось на 38,8 - 51,4% в обеих экспериментальных группах как в эструсс, так и в диэструсе по сравнению с интактными самками.

Таблица 3

Количество генеративных элементов (абсолютное число) в яичниках половозрелых крыс (5,5 месяцев) контрольной и экспериментальных групп

Показатель контроль Тингол-1 Тингол-2

эструс диэструс эструс диэструс эструс диэструс

ОЧГЭ 2159,6+ 101,37 2269,0+ 109,85 1905,0+ 90,27 1982,2± 98,54 1939,8+ 103,85 1979,7+ 105,26

примордиаль-ные фолликулы 1429,2± 117,99 1455,8+ 127,54 1355,0+ 133,08 1438,3± 127,53 1435,0+ 141,65 1448,3+ 136,61

растущие фолликулы 215,0+ 27,99 249,2+ 25,15 229,2+ 23,25 256,7+ 17,06 210,0+ 22,82 247,5± 20,07

зрелые фолликулы 7,0+0,58 8,0+0,37 6,0+0,57 7,5+0,62 7,0+0,37 7,5+0,76

атрстические фолликулы 498,3+ 25,3 546,7+ 25,8 305,0+ 17,84 * 269,2+ 24,53 * 278,3+ 17,50 * 265,8+ 24,81 ♦

желтые тела 10,2+ 1,02 10,2+ 0,98 9,8+ 0,60 10,5± 1,34 9,5+ 0,96 . 10,5+ 1,38

растущие/ атретические 0,54 0,46 0,76 0,96 0,76 0,94

Примечание: * - достоверность различий с показателем контрольной группы (р<0,05)

Известно, что апоптоз клеток гранулезы, а, следовательно, атрезия фолликула запускается Ca2+/Mg2+ - зависимой эндонуклеазой, осуществляющей расщепление ДНК, а фермент, возможно, активируется возрастающим уровнем кальция и/или магния [Д.Л. Аминин, М.М. Анисимов, 1990]. По данным Б.В. Рубцова с соавторами (1980) и И. Китагавы (1988) БАВ юлотурий, а именно тритерпеновые гликозиды, изменяют проницаемость биологических мембран для ионов кальция. Весьма вероятно, что снижение количества атрезиругащихся фолликулов в данных экспериментальных группах связано с блокадой апоптогенного фермента. Учитывая, что количество растущих фолликулов в

экспериментальных группах, получавших гидролизат и экстракт кукумарии в половозрелом периоде не изменяется в сравнении с контрольной, а количество атрезиругощихся фолликулов уменьшается, соотношение этих структур достоверно изменяется.

Несколько иная картина наблюдается в количественном составе структурных элементов в яичниках крыс, получавших пищевые добавки в возрасте 1,5-3,5 месяцев. Результаты наших исследований выявили достоверное уменьшение количества атрезирующихся фолликулов в диэструсе (в 1,27 раза в опытной группе, получавшей «Тингол-1», в 1,36 раза - в группе, получавшей «Тингол-2») и увеличение растущих фолликулов в 1,5 раза в обеих экспериментальных группах в стадию эструса (табл. 4).

Таблица 4

Количество генеративных элементов в контроле и эксперименте (крысы 3,5- месячного возраста) в разные стадии эстрального цикла

показатель контроль Тингол-1 Тингол-2

эструс диэструс эструс диэструс эструс диэструс

Примордиаль- 1579,2+ 1555,7+ 1521,0± 1576,3± 1588,0+ 1509,0+

ные фолликулы 110,71 127,10 134,22 129,54 112,33 159,22

растущие 210,0+ 242,2+ 319,0+ 238,0+ 318,0+ 240,0+

фолликулы 20,11 20,05 29,18* 24,88 24,48 ♦ 22,08

зрелые 4,6+0,5 6,2+0,79 4,6+0,24 6,0+0,19 5,0+0,73 6,4+0,24

фолликулы

атретические 440,3+ 496,7+ 393,0± 391,0+ 400,0+ 365,0+

фолликулы 28,51 24,34 38,03 27,34* 27,16 28,24 *

растущие)' 0,48 0,49 0,81 0,61 0,80 0,66

атретические

желтые тела 7,4+0,5 7,2+0,37 7,0+0,67 7,0+0,77 7,8+0,80 7,6+0,60

ОЧГЭ 2241,5+ 2388,0± 2244,6+ 2218,3+ 2318,8+ 2128,0±

100,47 105,75 95,29 101,54 99,77 103,28

Примечание: *- достоверность различий с показателем контрольной группы (р<0,05)

Факт резкого увеличения растущих везикулярных фолликулов может быть объяснен переходом фолликулов предыдущих классов в последующие, следовательно, происходит естественный, свойственный эстральному циклу процесс. Однако не исключено, что определенная часть антральных фолликулов является фолликулами, «возвращенными» из состояния ранней атрезии [О.В. Волкова, 1983].

Таким образом, происходит закономерный процесс: при уменьшении одних стероидпродуцирующих структур увеличивается количество других. Соотношение растущих и атретических фолликулов в этих группах также изменяется по стадиям цикла, но менее выражено в диэструсе, приближаясь к контрольным показателям.

За счет чего же происходит компенсация количественной нехватки атретических фолликулов в экспериментальных группах, получавших пищевые добавки в половозрелом периоде, ведь атрезирующиеся фолликулы - это не просто «погибшие» структурные элементы яичников, они • важные гормонообразующие «железы», поскольку от уровня их активности (выработка андрогенов) зависит рост новых фолликулов [И.Б. Манухин, 2001]? Качественные изменения (морфометрические показатели), произошедшие в стероидпродуцирующих структурах помогут нам разобраться в этом вопросе.

Овариальные фолликулы на последовательных стадиях развития можно рассматривать как совершенствующиеся морфологические системы, состоящие из генеративных элементов и соматических тканей [Т.Г. Боровая, О.В. Волкова, 1995]. Считают, что длительность развития фолликула зависит от возраста животных, но этот процесс несомненно значительно больше, чем половой цикл. У самок мышей она составляет не менее 60-70 дней, у женщин - около 85 дней [И.В. Саноцкий, 1979; И.Б. Манухин, 2001]. Хотя развитие этих систем (гистионов) направляется аденогипофизарными механизмами, немаловажная роль в их регуляции принадлежит системе взаимодействия тканевых и клеточных компонентов гистионов. Нами выявлено достоверное увеличение диаметра антральных и зрелых фолликулов у экспериментальных половозрелых

самок обеих групп в эструсе и диэструсе. Средний диаметр растущего преантрального фолликула в экспериментальны;; группах соответствует этому показателю у интактных животных в обе стадии эстрального цикла Средний диаметр полостного фолликула в группе, получавшей гидролизат достоверно превышает этот показатель у контрольных животных в 1,2 раза в эструсе и 1,1 раза в диэструсе и составляет 255,98+7,55 и 268,43+7,31 мкм соответственно. В экспериментальной группе, получавшей экстракт кукумарии средний диаметр полостного фолликула также достоверно больше такового в контроле (245,98+7,00 - эструо, 260,11+6,10 - диэструс). . Средний диаметр преовуляторного фолликула в эструсе у животных, получавших «Тингол-1» достоверно превышает этот показатель контрольной группы в 1,1 раза в обе стадии полового цикла и составляет 406,52+5,54 в эструсе и 513,24+7,20 в диэструсе. Аналогичные данные мы получили и в экспериментальной группе животных, получавшей «Тингол-2». Преовуляторные фолликулы яичников крыс в опытных группах содержат все те же структурные элементы, что и у интактных животных. Увеличение диаметра зрелого фолликула происходит, главным образом, за счет толщины теки, она достоверно утолщается в 0,88 раз по сравнению с контрольным показателем. Развитие текальной оболочки фолликула является важным событием в фолликулогенезе. С этого- момента фолликул вступает в контакт с кровью и начинает подвергаться действию ее гормональной среды. Фолликул инициирует серию структурных и биохимических изменений, превращаясь в антральный. Возможно, причина этого явления заключена в клетках фолликулярного эпителия, поскольку они вырабатывают текальный организатор, способствующий формированию теки. Мы предполагаем, что гипертрофия теки, в данном случае, происходит компенсаторно за счет увеличения в ней интерстициальных клеток, продуцирующих андрог?ны, в связи с тем, что уменьшается количество атрезирующихся фолликулов, выполняющих эту функцию. Андрогены в последствие ароматизируются в клетках гранулезп в эстрогены и по принципу обратной связи происходит выброс лютепниэирующего и

фолликулостимулирующегс гормонов, а далее овуляция [И.Б. Манухин, 2001]. Толщина гранулезы, зоны радиаты, прозрачной зоны остаются в пределах контрольных показателей.

Наши исследования показали, что в обеих экспериментальных группах животных признаки атрезии фолликулов появляются на любой стадии их развили», но основная часть возникает из многослойных, полостных фолликулов. Атрезия антральных фолликулов осуществляется в виде двух форм со своей спецификой трансформации фолликулярных клеток. В одних случаях в фолликулах некоторое время сохраняются обе оболочки, но в дальнейшем гранулеза дегенерирует и перестает существовать как элемент структуры. Тека при этом практически не изменяется, базальная мембрана, вступая в контакт с фолликулярной жидкостью гиалинизируется. При другой форме атрезии в фолликулах сохраняются обе оболочки, базальная мембрана остается неизмененной, но клетки внутренней теки гипертрофируются. При атрезии преантральных фолликулов первичные изменения отмечаются в овоците, а именно пикноз и рексис ядра, вакуолизация цитоплазмы вокруг ядра, деформация овоцита. Морфометрический анализ позволил установить достоверную разницу в размере атретических фолликулов у экспериментальных животных в зависимости от стадии эстральиого цикла. В яичниках крыс, получавших 'Тингол-1 и "Тингол-2" в эструсе средний диаметр атрезирующихся фолликулов составляет 170,54+5,21 мкм и 172,20+4,38 мкм соответственно.' Устаночлено, что диаметр выше указанных структур Изменяется в зависимости от стадии эстрального никла, увеличиваясь в диэструсе в 1,5 раза в обеих экспериментальных группах (рис. 1). При этом мы выявили, что атрезия фолликулов в контрольной группе чаще осуществляется на б стадии развития, тогда как у экспериментальных животных - на 7. Это явление мы рассматриваем как попытку компенсировать количественный дефицит этих структур качественной перестройкой для поддержания гормонального баланса. Механизм этого явления, по-видимому, связан косвенным стероидоподобным действием ТГ, что не противоречит литературным данным [В.А. Стоник, 1999]. Атрезия

антральных фолликулов при всех рассматриваемых состояниях (в контроле и эксперименте) осуществляется в виде двух форм со своей специфической трансформацией фолликулярных гистионов.

И Контроль □ Тингол-1 II Тингол-2

300 200 100 О

эструс диэструс

Рис. 1. Средний диаметр атретичегких фолликулов у половозрелых контрольных и экспериментальных животных

Одними из информативных показателей, отражающих физиологическое состояние половых клеток и их микроокружения являются площадь сечения овоцита, ширина его прозрачной зоны и их корреляционная взаимосвязь. Нарушение их корреляции указывает на изменение ово- и/или фолликулогенеза [С.Л. Бачалдин, 1994]. Результаты нашего исследования позволяют говорить о том, что «Тингол-1» и «Тингол-2» в исследуемых дозах не вызывают нарушение образования прозрачной оболочки в фолликулах на разных этапах их развития. Что же касагтся овоцита, то размер его (диаметр, площадь, периметр) увеличивается параллельно росту фолликула до преантральной стадии, когда тот и другой растут одновременно (от 17,20+0,19 мкм - диаметр овоцита в примордиальном фолликуле до 23,7+0,65 мкм - диаметр овсцита в растущем фолликуле). На более поздних этапах рост фолликула продолжается до размеров, определенных видовыми различиями, а овоцит при этом не увеличивается (диаметр овоцита остается в пределах 24,01+1,18 мкм). Эти данные не противоречат результатам других авторов [Мооге, 1974, О.В. Волкова, 1983]. В соответствии с этим, ядсрно-цитоплазматическое соотношение площадей уменьшается от примордиального фолликула к растущему, и практически не изменяется уже в-зрелых фолликулах как у

контрольных животных, так и у крыс экспериментальных групп (рис. 2). Коэффициент формы овоцита также остается в пределах 1,0 у опытных и интактных животных.

□ Контроль □Тингол-1 ПТингол-2

Примордиальные Растущие фолликулы Зрелые фолликулы фолликулы

Рис. 2. Ядерно-цитоплазмагическое соотношение площадей овоци гов в фолликулах разных стадий роста в контроле и эксперименте

Динамика соотношения различных компонентов органа свидетельствует о том, что в разные стадии полового цикла значительно колеблегся количество фолликулов и их производных (атретических тел) во-первых, и соотношение числа различных стероидпродуцирующих структур, во-вторых. Поскольку каждая из последних секргтирует преимущественно один из половых гормонов (фолликулы - эстрогены, атретические тела - андрогены, желтые тела -прогестерон), эти изменения можно расценивать, как возможный 'механизм,' определяющий различия в соотношении эстрогенов, гестагенов и андрогенов, характеризующие различные фазы полового цикла.

Интегральным показателем оценки состояния яйцеклеток является способность к оплодотворению и к зачатию. Показателем также считается плодовитость. Следует отметить, что пищевые добавки «Тингол-1» и «Тингол-2» в исследуемых дозах не нарушают эту способность и не оказывают контрацептивного эффекта как некоторые тритерпеновые гликозиды.

О закономерностях и механизмах регуляции процессов роста, овуляции, «гибели» гистионов фолликулов в детском возрасте и препубертатном периоде

известно очень мало. Согласно денным некоторых исследователей [Л.И. Никитин, .1987], для яичников указанных периодов онтогенеза характерно наличие большого количества средних и крупных пузырчатых фолликулов. К моменту половой зрелости налаживается циклическое выделение гонадотропинов гипофизом, что обусловливает закономерное вступление фолликулов в рост, формирование пузырчатых фолликулов и овуляцию. Все это подтверждает некоторые особенности изменений в яичниках на разных этапах онтогенеза (1,5-3,5 месяца и 3,5-5,5 месяцев). Интактные животные и самки, получавшие «Тингол-1» и «Тингол-2» имеют достоверные отличия в количестве зрелых фолликулов и желтых тел в разные возрастные периоды (3,5 и 5,5 месяцев), что связано с особенностями строения половой системы на начальных этапах полового созревания и в период репродуктивной активности. Так абсолютное число преовуляторных фолликулов в яичниках интактных крыс 3,5 месяцев составляет 4,6+0,5 в эструсе и 6,2+0,79 в диэструсе, в 5,5 месяцев данный показатель достоверно увеличивается до 7,0+0,58 в эструсе и 8,0+0,37 в диэструсе. Аналогичные изменения наблюдаются в яичниках экспериментальных животных разных возрастных групп. Желтые тела, образующиеся после овуляции, располагаются по всей поверхности срезов, разнообразны по величине и строению, в связи с тем, что находятся на разных этапах. Количество желтых тел в срединном срезе у интактных животных в возрасте 3,5 месяцев составляет 7,4+0,51 в эструсе, и практически не изменяется в стадию диэструса. При сравнении данного показателя с контрольной группой 5,5 месячного возраста выявлено достоверное его увеличение в последней до 10,5+1,34. 3 экспериментальных группах животных также выявлено закономерное изменение данного показателя в зависимости от возраста самок. Средний диаметр данных структур у интактных крыс составляет 316,л+10,71 мкм в фазу эструса, в диэструсе их размер достоверно больше и равен 350,2+11,12 мкм. Диаметр желтых тел у опытных животных также изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла, достоверно увеличиваясь в диэструсе.

Следует отметить, что рассмотренные выше процессы являются «физиологическими», следовательно, соответствуют процессам, происходящим в организме здоровых женщин. Однако в повседневной работе врача -репродуктолога чаще встречаются ситуации, когда изменения, характерные для старения репродуктивной функции, встречаются гораздо раньше, чем в среднем в популяции. К ним можно отнести хронический воспалительный процесс в малом тазу, при котором может значительно страдать фолликулогенез, различную эндокринологическую патологию, при которой повышается интенсивность атрезии фолликулов разных стадий развития [К.Ю. Боярский, 1996, В.И. Кулаков, 1997, КБ. Манухин, 20011.

По данным Э.М. Китаева с соавторами (1985, 1987), введение тестостерона новорожденным крысам приводит к нарушению роста и созревания фолликулов, отсутствию овуляции и бесплодию в половозрелом периоде. Результаты нашего исследования подтверждают эти данные. Так, на 1/3 снизилось количество примордиальных фолликулов, почти в 2 раза уменьшилось число растущих фолликулов с преобладанием неполостных. Многие фолликулы уже на стадии примордиальных имели признаки атрезии. Чувствительными к действию препарата оказываются и растущие, многослойные фолликулы. Количество их достоверно снижено по сравнению с контролем, причем основная масса растущих фолликулов находится на стадии преантральных, количество-же полостных форм составляет около 7%. На этом фоне во многих вторичных фолликулах отмечается массовая гибель фолликулярного эпителия, утолщение блестящей оболочки, гранулеза и внутренняя текальная оболочки дезорганизованы. Количество атлетических фолликулов у неонатально .шдрогенизированных животных достоверно больше по сравнению с контрольной группой. Соотношение растущих и атретических фолликулов в данной группе животных составило 0,18, что в 2,5 раза меньше по сравнению с контрольной группой. Зрелых, окончательно сформированных фолликулов в яичниках самок мы не выявили На срединных срезах выявлены желтые тела в количестве до 3-4 на один яичник, имеющие вил островков среди

интерстициальной ткани. Данные структуры, по нашему мнению, не являются полноценными желтыми телами, так как мы не нашли последовательных стадий развития желтых тел на препаратах, а также отсутствовали преовуляторные фолликулы, являющиеся их предшественниками.

Таким образом, введение андрогенов крысам в раннем неонатальном перицде вызывает длительные нарушения роста и созревания фолликулов, отсутствие овуляции, а также гипертрофию стромы гонад с очагами лютеинизации последних.

У экспериментальных неонатально андрогенизированных животных, которым с 1,5 до 3 месяцев жизни дополнительно в рацион вводили «Тингол-2» наблюдаются неоднозначные результаты. Яичники андрогенизированных животных, получавших «Тингол-2» характеризуются, также как и получавшие тестостерон без пищевой добавки, достоверно меньшим числом по сравнению с контрольной группой фолликулов разных стадий' развития. В этой группе животных недостоверно увеличивается количество растущих фолликулов, возрастает в несколько раз число полостных, и, следовательно, изменяется соотношение неполостных и антральных фолликулов (табл. 5). Среди пузырчатых фолликулов встречаются зрелые, но большинство из них имеют признаки деструкции и лютеинизации.

Наши исследования показали наличие фолликулярных кист в данной группе самок. Фолликулярная киста представляет собой образование, размерами до 900 и более мкм, имеет истонченную оболочку, на одном из полюсов сохраняется распластанная яичниковая ткань. Гранулеза -с признаками атрезии и в некоторых местах - лютеинизированная. На яйценосном бугорке сохраняется неовулировавший овоцит. Полость кисты заполнена неоднородным содержимым. У животных, получавших «Тингол-2» после введения тестостерона наблюдается достоверное уменьшение количества атрезирующихся фолликулов, а соотношение растущих и атретических фолликулов увеличивается по сравнению с крысами не получавшими пищсрум добавку до 0,35. На срединном срезе гонада! четко контурируют несколько

мелких желтых тел, на фоне которых появляются кисты. Размер кист колеблется от 950до 1200 мкм. Структура их неоднородна, на одном из полюсов сохраняется участок лютеинизирэванной ткани в виде островка, полость заполнена жидкостью, стенка кисты истончена. Общее число генеративных элементов составило 1749,0+85,15, что недостоверно отличается от не получавших пищевую добавку анарогенизированных крыс.

Таблица 5

Количество генеративных элементов в яичниках андрогенизированных

животных

показатель тестостерон Тестостерон + Тингол-2

примордиальные фолликулы 1080,0+75,31 1110,0+91,71

¿растущие фолликулы: неполостные полостные 120,2+11,10 112,1+10,10 8,1+0,75 160,3+17,25 120,5+12,75 40,3+4,12 ♦

зрелые фолликулы 0 1,2+0,05

атретические фолликулы 665,4+25,67 475,6+28,90 *

растущие/ атретические 0,18 0,34

желтые тела 3,3+0,55 3,2+0,12

общее число генеративных элементов 1868,11+71,65 1749,21+85,15

Примечание: * • достоверность разэдчий с показателем контрольной труппы (р<0,05)

Таким образом, БАВ пищевых добавок «Тинтол-1» и «Тйнгол-2» обладают целенаправленным действием на морфологические структуры яичников крыс, главным образом, на атрезирующиеся фолликулы. Следовательно, «Тингол-1» и «Тингол-2» могут быть использованы в гинекологии в качестве биологически активных добавок в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся усиленной гибелью фолликулярного аппарата. Однако, учитывая возможность образования фолликулярных кист и кист желтого тела, необходимым условием применения данных пищевых добавок яваяется определение исходного уровня стероидных гормонов.

Выводы

1, Пищевые добавки «Тингол-1» и «Тингол-2» не влияют на общеморфологические показатели крыс и не вызывают отклонений в эстралыюм цикле, его общей продолжительности и длительности отдельных стадий (эструс, метаэструс, диэструс, проэструс), а также не оказывают отрицательного действия на качественный состав влагалищных мазков.

1. Тканевые базофилы мезоварйальной брыжейки реагируют на изменения эстрального цикла, проявляя высокую функциональную активность в эструсе. Разная степень дегрануляции, выход биогенных моноаминов за пределы тучных клеток является диагностическим критерием стадий полового цикла как в контроле так и при экспериментальных воздействиях.

2. Интактные животные и самки, получавшие «Тингол-1» и «Тингол-2» имеют достоверные отличия в количестве морфологических структур яичника в разные возрастные периоды (3,5 и 5,5 месяцев), что связано с особенностями строения половой системы на начальных этапах полового созревания и в период репродуктивной активности.

3. «Тингол-1» и «Тичгол-2» вызывают уменьшение числа атрезирующихся фолликулов в яичниках половозрелых животных в эструсе и диэструсе, при этом достоверно увеличивается соотношение растущих и атретических фолликулов, а также диаметр полостных и преовулчторных фолликулов за счет гипертрофии теки.

4. У животных, получавших пищевые добавки до момента. полового созревания, «Тингол-1» и «Тингол-2» вызывают эффект снятия ранчих атретических явлений, при этом уменьшается число атретических фолликулов в диэструсе и увеличивается количество растущих фолликулов в эструсе по сравнению с контрольной группой.

5. При неонатальной андрогенизации у животных Я половозрелом периоде отмечаются нарушения фолликулогенеза, при этом уменьшается количество растущих фолликулов, отсутствуют полостные формы и

полноценные зрелые фолликулы, .отмечается их массовая атрезия. Пищевая добавка «Тингол-2» у неонатально андрогенизированных крыс вызывает увеличение числа полостных фолликулов, уменьшение количества атретических фолликулов, при этом достоверно увеличивается соотношение растущих и атретических . фолликулов, формируются фочликулярные кисты и кисты желтого тела.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зенкина В.Г. Влияние тритерпеновых гликозидов на репродуктивную функцию неполовозрелых самок крыс // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (25 апреля 2002г.): тезисы докл. Ш-й Тихоокеан. научно-практ. конф. студентов и молодых ученых с международ. участием. - Владивосток, 2002.-C.3-4.

2. Каредйна B.C., Зенкина В.Г. Влияние биологически активных добавок «Тингол-1» и «Тингол-2» на морфофункционалыюе состояние яичников и плаценты крыс // Колосовские чтения-2002 (29-31 мая 2002г.). - СПб, 2002. -С.125.'

3. Каредйна B.C., Зенкина В.Г., Слуцкая Т.Н. Влияние тритерпеновых гликозидов (ТГ) морских гидробионтов на овогенез млекопитающих // 1 Междунар. • конф.: Морские прибрежные экосистемы: водорослиЛ беспозвоночные и продукты их переработки (27-30 августа 2002г.). - М., 2002.-С.80 81.

4. Влияние тритерпеновых гликозидов морских гидробионтов на надпочечники и яичники крыс 7 ОА Солодкова, В.Г. Зенкина, НА Никифорова, А.Л. Юферева //Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (2Л апреля 2003г.): тезисы докл. IV-й Тихоокеан. научно-практ. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием. - Владивосток, 2003. -СИ.

5. Каредина B.C., Зенкина В.Г., Солодкова ОА Морфология яичников неполовозрелых крыс при кормлении пищевыми добавками «Тишол-1» и «Тингол-2» // Успехи современ. естествознания. - 2003. - № 11. - С. 53.

6. Каледина B.C., Зенкина В.Г. Действие пищевых добавок «Тингол-1» и «Тингол-2» на яичники крыс // Тихоокеан. мед. жуон/-2003. - № 4.- С.35-36.

7. В.Г. Зенкина, ОА Солодкова. Общая характеристика тучных клеток мезометриальнои брыжейки крыс в разные стадии эстрального цикла // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (24 апреля 2004г.): тезисы докл. V-й Тихоокеан. научно-практ. конф. студентов и мотодых ученых с международ, участием.

- Владивосток, 2004. - С. 8.

8. В.Г. Зенкина, ОА Солодкова. Общеморфологические показатели некоторых органов крыс при кормлении животных «Тингол-1» и «Тингол-2» // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (24 апреля 2004г.): тезисы докл. V-й Тихоокеан. научно-практ. конф. студентов и молодых ученых с между народ, участием.

- Владивосток, 2004.-С. 7-8. •

9. Зенкина В.Г, Каредина B.C., Солодкова ОА Яичники крыс под воздействием тритепеновых гликозидов из кукумарии японской // Фундаментальные исследования. - 2004. - № 2. - С. 53.

Список сокращений; БАВ - биологически активные вещества КМВО - коэффициент массы внутренних органов ОЧГЭ - общее число генеративных элементов ТК - тучные клетки

Зеикина Виктория Геннадьевна

Влияние «Тингол-1» и «Тингол-2» на морфологию яичников крыс в разные стадии астрального цикла

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 4.10.2004г. Усл. п. л. 1,0. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Зак. №63п. Печать офсетная с оригинала заказчика. Отпечатано в типографии ОАО «ДАЛЬПРИБОР» 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50 Тел. 32-70-49 (32-44)

»22 473

РНБ Русский фонд

2005-4 23907