Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Морфофункциональные особенности репродуктивной системы при свинцовой интоксикации

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные особенности репродуктивной системы при свинцовой интоксикации"

На правах рукописи

ДУДЕНКОВА НАТАЛЬЯ АНАТОЛИЕВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

(экспериментальное исследование)

06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-•3 Ш 2015

Саранск-2015

005570409

Работа выполнена на кафедре биологии, географии и методик обучения, на базе научно-исследовательской лаборатории «Цифровая микроскопия» и научно-образовательной лаборатории «Молекулярная и клеточная биология» научно-образовательного центра «Естественнонаучное образование» ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт имени М. Е. Евсевьева».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Шубина Ольга Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Баймишев Хамидулла Балтуханович

(ФГБОУ ВПО «Самарская государственная сельскохозяйственная академия», зав. кафедрой анатомии, акушерства и хирургии, г. Самара)

доктор биологических наук, профессор Шевлюк Николай Николаевич (ФГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия», профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, г. Оренбург)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ивановская государственная

сельскохозяйственная академия имени академика Д. К. Беляева», г. Иваново

Защита диссертации состоится «14» сентября 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.15 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарева» по адресу г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. М. Бахтина Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева и на сайте Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева www.mrsu.ru и Интернет-сайте ВАК http://vak2.ed.eov.ru

Автореферат разослан ¿¿Х&сиР 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета гс^г Т. А. Романова

2

1. Введение

1.1. Актуальность темы. Экзогенное воздействие свинца на репродуктивную систему организма является важным аспектом в прогнозировании и предупреждении патологии беременности и родов у человека и животных (Волощенко О. И., Мудрый И. В., 1991; Савельева Г. М. и соавт., 1991; Полякова А. Н. и соавт., 1995; SaxenaD. К. et al, 1994; Gupta G., 1997; Schneider H., 1997; Torry D. S., Torry R. J., 1997; Reichrtova E. et al., 1998). Однако до сих пор остается неясным вопрос о влиянии ацетата свинца на морфофункционапьное состояние мужских и женских половых желез (Вылегжанина Т. А., Кузнецова Т. Е., Манеева О. А. и соавт., 1993; Корне-ваЕ.В., 2003; Нарбутова Т. Е., 2011; Butrimovitz G. Р., 1983; Sallmen М., 2001; Sallmen М., Lindbohm L., Anttila A. et al., 2000).

В условиях падения рождаемости и высокого уровня общей смертности населения проблема охраны репродуктивного здоровья приобретает особую, не только медицинскую, но и социальную значимость. Уровень заболеваемости мужчин в плане репродуктивной патологии неуклонно растет. Среди этиологических факторов, вызывающих бесплодие, практически всеми исследователями выделяются воздействия факторов внешней среды (Галимов Ш. Н., Амирова 3. К., Галимова 3. К., 2005; Снакин В. В., 1999). Данная проблема приобретает особую актуальность в настоящее время и в связи с тем, что параллельно с увеличением степени загрязнения окружающей среды и ослаблением контроля за ее качеством, наблюдается рост так называемого идиопатического бесплодия, то есть тех его форм, при которых найти явную причину патологических изменений в организме пациента не представляется возможным (Божедомов В. А., Громенко Д. С., Ушакова И. В. и соавт., 2009; Вылегжанина Т. А., Кузнецова Т. Е., Рыжковская Е. Л., 2008). Механизмы этих нарушений интенсивно изучаются. Но по некоторым принципиальным аспектам рассматриваемой проблемы единое мнение отсутствует. Поэтому возникла необходимость изучения воздействия ацетата свинца (проведения экспериментального исследования) на мужские и женские половые железы в период постнаталыюго развития организма.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью работы является анализ поражения семенников и яичников белых крыс ацетатом свинца в условиях эксперимента.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологию семенников и яичников белых крыс, а также особенности протекания в них процессов сперматогенеза и фолликулогенеза (контроль).

2. С помощью гистохимических и морфометрических методов исследования изучить изменения, происходящие в семенниках и яичниках белых крыс при воздействии ацетата свинца.

3. Выяснить влияние ацетата свинца на особенности протекания процессов сперматогенеза и фолликулогенеза.

4. Изучить влияние ацетата свинца на эстральный цикл самок белых крыс.

Работа является самостоятельным разделом комплексной темы кафедры биологии, географии и методик обучения ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт имени М. Е. Евсевьева» «Влияние факторов окружающей среды на морфофункционапьное состояние организма)», выполненной при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках Программы стратегического развития «Педагогические кадры для инновационной России» на 2012-2016 гг. (Проект 2.2.2. Решение комплексных проблем в области биологии, экологии, химии, физиологии, спортивной медицины на базе научно-образовательного центра и научно-исследовательских лабораторий (Развитие Научно-образовательного центра «Естественнонаучное образование»)), базовой

части государственного задания вузу на 2014-2016 гг. в части выполнения научно-исследовательских работ (проект «Влияние антропогенных факторов на морфофункци-ональное состояние организма») и программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК») при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере на 2015-2016 гг. (проект «Исследование морфофункциональных особенностей органов репродуктивной системы при антропогенном воздействия свинца»).

1.3. Научная новизна. Впервые установлено, что ацетат свинца влияет на морфофункциональное состояние мужских и женских половых желез, а также протекающие в них процессы образования и формирования половых клеток. Доказано, что при воздействии ацетата свинца снижается репродуктивность половых желез.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфофункциональные изменения в яичниках и семенниках в норме и после воздействия ацетата свинца

2. Сперматогенез, фолликулогенез и сроки прохождения различных стадий астрального цикла в норме и после воздействия ацетата свинца.

1.4. Научно-практическая значимость работы. Полученные данные по мор-фофункциональным изменениям половых желез белых крыс в условиях свинцовой интоксикации представляют интерес для сравнительной морфологии и физиологии животных и человека.

Данные по изменениям процессов сперматогенеза и фолликулогенеза белых крыс в условиях антропогенного воздействия свинца могут быть использованы для прогнозирования наступления и течения беременности, а также возможных форм патологий у плода.

Результаты по морфофункциональному состоянию половых желез в условиях свинцовой интоксикации могут быть рекомендованы к использованию во врачебной практике для глубокого понимания патогенеза заболеваний, связанных с нарушением репродуктивных функций в экологически неблагоприятных регионах.

Полученные экспериментальные данные могут быть использованы анатомами, гистологами, экологами в практике научных исследований, направленных на прогнозирование и углубленное изучение роли ацетата свинца при оценке состояния репродуктивной системы животных, а также в оценке их продуктивности.

1.5. Реализация результатов исследования. Материалы исследования используются в научных и учебных целях на кафедрах биологического профиля: Мордовского педагогического института; Брянского, Мордовского государственных университетов; Казанской, Санкт-Петербургской академий ветеринарной медицины; Воронежского, Омского, Оренбургского, Ставропольского аграрных университетов; Орловской, Ивановской, Костромской сельскохозяйственных академий.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы: на Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Окружающая среда: экологические и медицинские проблемы» (Саранск, 2011); на VI Международной заочной научно-практическая конференции «Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии» (Москва, 2013); на XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ - 2013» (Москва, 2013); 3rd International Conference on Science and Technology (London, 2013); на XXIX Международной научно-практической конференции «Инновации в науке» (Новосибирск, 2014); на Всероссийской заочной студенческой научно-практической конференции «Актуальные проблемы науки в студенческих исследованиях (биология, экология и

химия)» (Саранск, 2014); на XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ - 2014» (Москва, 2014); на Международной научно-практической конференции с элементами научной школы для молодых ученых «50-е Ев-севьевские чтения» (Саранск, 2014); на XTV Международной научно-практической конференции «Теория и практика современной науки» (Москва, 2014); 4th European Conference on Biology and Medical Sciences (Vienna, 2015); на V Международной научно-практической конференции «Современная биология: актуальные вопросы» (Санкт-Петербург, 2015).

1.7. Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 24 работах, в т. ч. 5 работ в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ и 5 работ - в журналах, входящих в базу цитирования Scopus и Web of Science.

1.8. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 224 источника, из которых отечественных работ - 143, иностранных - 81. Текст иллюстрирован 46 рисунками (фотографии, графики) и 12 таблицами.

2. Материалы и методы исследования

В качестве биологического тест-объекта в работе использовали самцов и самок белых беспородных половозрелых крыс массой 200-250 г. в возрасте 60 дней. Всего использовано 300 животных из 38 пометов - 150 самцов и 150 самок белых крыс.

Эксперимент проводился в течение года в помещении при температуре воздуха 22-25 °С и относительной влажности 67-70%. Животные находились на общем режиме вивария, имели свободный доступ к корму и воде.

В соответствии с поставленными задачами животные разбивались на две группы. Контрольную группу животных составили крысы, содержащихся на общем режиме вивария. Опытную группу составили животные, получавшие в течение 7 суток перорально ацетат свинца РЬ(СНзСОО)гхЗНгО в среднетоксической дозе -45 мг/кг/сутки (в пересчете на свинец).

Материалом исследования служили половые железы половозрелых самцов и самок белых крыс. Готовили гистологические поперечные срезы семенных желез толщиной 10-15 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином (Семченко В. В., 2006). Образцы тканей исследовали с помощью цифрового микроскопа Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония) с программным обеспечением для анализа изображений Axio Vision SE64 Reí. 4.8.3 и ZEN 2011.

Производился анализ абсолютного и относительного веса семенников и яичников у самцов и самок белых крыс. Вес семенников и яичников определяли при помощи аналитических весов Sartorius (Германия). Наиболее чувствительным показателем, отражающим морфофункциональное состояния органа является его весовой индекс, представляющий собой отношение массы органа к массе тела, выраженное в процентах (МинаМ. В., Клевезаль Г. А., 1976).

При обзорной микроскопии изучали морфологические особенности строения семенных желез, после чего определяли следующие морфометрические параметры:

1) толщину белочной оболочки семенника;

2) количество извитых семенных канальцев в одном поле зрения, площадь поперечного сечения извитого семенного канальца и его просвета, площадь спермато-генного эпителия и его толщину;

3) количество участков интерстиция между извитыми семенными канальцами в одном поле зрения, а также их площадь;

4) количество миоидных клеток в стенке извитого семенного канальца, площадь миоидных клеток, площадь цитоплазмы миоидных клеток, диаметр и площадь их ядер;

5) количество клеток Сертоли в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца, ширину базальной и длину апикальной частей клеток Сертоли, площадь клеток, диаметр и площадь их ядер;

6) количество сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца, площадь головки и ядра сперматозоида, ширину шейки и длину его хвостовой части;

7) количество клеток Лейдига в участке интерстиция, площадь и диаметр клеток и их ядер, а также площадь цитоплазмы;

8) отношение площади интерстициальной ткани к площади извитых семенных канальцев в одном поле зрения препарата.

Измерения проводили в 75 поперечных срезах извитых семенных канальцев и окружающих их участках интерстициальной ткани.

На основе количественных данных, полученных при цитологическом исследовании семенников, рассчитывали ряд функциональных показателей, характеризующих состояние сперматогенеза. К этим показателям относятся:

1. Сперматограмма (цитологический профиль сперматогенеза) - процентное распределение клеток сперматогенного эпителия в одном извитом семенном канальце (Шейко Л. Д., 1998).

2. Индекс сперматогенеза - отношение суммы всех подсчитанных слоев клеток в одном канальце к количеству всех просчитанных канальцев.

Индекс сперматогенеза рассчитывали по формуле: 18=Ха/М, где а — количество слоев, выделенных в каждом канальце (первый слой — сперматогонии, второй — спер-матоциты, третий - сперматиды, четвертый - сперматозоиды); N - количество просчитанных канальцев (НарбутоваТ. Е., 2011).

3. Индекс релаксации (напряженности сперматогенеза или клеточный индекс Сертоли) — отношение суммы всех сперматогенных клеток к сумме клеток Сертоли в одном извитом семенном канальце (Шейко Л. Д., 1998).

4. Индекс созревания - отношение сумм юных (сперматогонии, сперматоциты) и зрелых форм сперматогенного эпителия (сперматиды, сперматозоиды) в одном извитом семенном канальце.

5. Индекс мейотической активности - отношение суммы мейотических клеток (сперматоцитов) к сумме остальных половых клеток в одном извитом семенном канальце.

6. Герминативный индекс — отношение суммы сперматогоний к сумме клеток Сертоли в одном извитом семенном канальце (Шевантаева О. Н., 2012).

Влияние ацетата свинца на репродуктивность семенных желез самцов белых крыс оценивали по следующим показателям:

1) общая концентрация сперматозоидов;

2) концентрация живых сперматозоидов;

3) концентрация мертвых сперматозоидов;

4) жизнеспособность сперматозоидов (% живых клеток от их общего количества) (Шейко Л. Д., 1998).

Живые клетки трипановый синий окрашивает по краям, мертвые - однородно по всей клетке (Николаев В. В., Строев В. А., Асграханцев А. Ф., 1993).

Суспензию сперматозоидов получали из хвостовой части продольно вскрытого и освобожденного от жира придатка семенника (эпидидимиса).

Для анализа морфофункциональных параметров эпидидимальных сперматозоидов качества сперматозоидов самцов белых крыс суспензию сперматозоидов исследовали на предметном стекле при помощи цифрового микроскопа Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония) при увеличении 40x10, после чего определяли следующие морфо-метрические параметры:

1) площадь головки сперматозоида;

2) длина хвостовой части сперматозоида;

3) ширина шейки сперматозоида.

Для изучения функционального состояния яичников применяли следующие методы:

1) количественная оценка микроструктурных элементов яичника;

2) исследование эстрального цикла (Шейко JI. Д., 1998).

Количественную оценку микроструктурных элементов яичника изучали по следующим морфометрическим параметрам:

1) толщина однослойного эпителия, покрывающего яичник, а также толщина белочной оболочки;

2) площадь поперечного среза яичника;

3) площадь и толщина коркового и мозгового вещества яичника;

4) количество разных типов фолликулов в корковом веществе яичника, их площадь, толщина наружной оболочки фолликула, а также площадь ооцита, толщина оболочки, окружающей ооцит, количество и площадь окружающих его фолликулярных клеток, количество, площадь полостей и толщину теки, появляющихся у вторичных и третичных фолликулов;

5) количество и площадь менструальных желтых тел в корковом веществе яичника, количество и площадь составляющих их лютеиновых клеток, а также площадь их ядер;

6) площадь клеток соединительнотканной стромы, составляющих корковое и мозговое вещество яичника, а также их ядер;

7) диаметр кровеносных сосудов, пронизывающих мозговое вещество яичника;

8) отношение площади мозгового вещества яичника к корковому.

Динамика эстрального цикла в контрольной и опытной группе животных изучалась в соответствии с правилом «одного часа». Учитывалась общая продолжительность эстрального цикла, длительность отдельных фаз и ритмичность их чередования.

Для определения стадий эстрального цикла у самок белых крыс обернутый ватой и смоченный физиологическим раствором конец палочки осторожно вводили во влагалище самки и слегка поворачивали. Вынув его из влагалища переносили захваченную ватой пробу на предметное стекло. Анализ влагалищных мазков осуществляли при осмотре под цифровым микроскопом Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония) при увеличении 100х 10.

В связи короткими стадиями проэструса и метаэструса (12 и б часов соответственно), характер эстралыюй цикличности исследовали по более продолжительным стадиям — эструс и диэструс, по следующим характеристикам:

1) эструс - мазок практически состоит из ороговевших безъядерных эпителиальных клеток (>90%);

2) диэструс - в мазке содержатся в основном лейкоцитарные клетки (>60%) и редкие эпителиальные клетки (Клочков Д. В., Алехина Т. А., 2012).

Для получения более полной характеристики эстрального цикла, также было изучено количество циклов, приходившихся на самку в течение последних 22 суток экспозиции.

Статистическая обработка цифровых данных проводилась с помощью программ FStat и Excel. Проверка статистических гипотез осуществлялась по t-критерию Стьюдента (Лапач С. Н., Чубенко А. В., Бабич П. Н., 2001).

Все наблюдаемые различия считали достоверными при уровне значимости Р<0,05.

3. Собственные исследования

3.1. Морфофункциональные изменения семенников самцов белых крыс в норме и при воздействии ацетата свинца

3.1.1. Морфологические изменения семенников самцов белых крыс в норме и при воздействии ацетата свинца

В ходе проведенных исследований было выявлено, что после 7 суток воздействия ацетата свинца происходит увеличение массы семенников самцов белых крыс, по сравнению с контролем, с 0,588±0,014 г. до 0,798±0,012 г., т. е. на 35,71% (Р<0,05). Причем масса левого семенника несколько превышает массу правого. Увеличение массы семенных желез самцов белых крыс свидетельствует, возможно, о их отеке. Установлено, что после 7 суток воздействия ацетата свинца весовой индекс семенника, по сравнению с контролем, увеличивается с 0,235±0,006% до 0,319±0,005%, т. е. на 26,33% (Р<0,05).

Морфометрические исследования показали, что в опытной группе животных, по сравнению с контролем, происходит уменьшение толщины белочной оболочки семенника с 35,23±3,42 до 20,35±4,73, т. е. на42,24% (Р<0,05).

В извитых семенных канальцах происходят следующие изменения:

1) уменьшается количество извитых семенных канальцев в одном поле зрения на 25,14% (Р<0,05) (табл. 1);

2) увеличивается площадь поперечного сечения извитых семенных канальцев и их просвета соответственно на 13,72% (Р<0,05) и 58,01% (Р<0,05) (табл. 1);

3) уменьшается площадь сперматогенного эпителия и его толщина соответственно на 13,76% (Р<0,05) и 21,19% (Р<0,05) (табл. 1);

4) уменьшается количество миоидных клеток в стенке извитого семенного канальца на 35,80% (Р<0,001), при этом увеличивается площадь миоидных клеток на 44,26% (Р<0,05) и площадь их ядра - на 22,45% (Р<0,05) (табл. 1);

5) уменьшается количество клеток Сертоли в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца на 22,48% (Р<0,05) (табл. 1);

6) уменьшается площадь клеток Сертоли и их ядер соответственно на 19,81% (Р<0,05) и 36,35% (Р<0,05) (табл. 1);

7) уменьшается количество стволовых сперматогониев в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца, площадь клеток и их ядер соответственно на 12,30% (Р<0,05), 3,56%, 9,00% (табл. 1);

8) уменьшается количество дифференцирующихся сперматогониев в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца, площадь клеток и их ядер, а также площадь цитоплазмы соответственно на 6,31%, 29,77% (Р<0,05), 33,33% (Р<0,05) (табл. 1);

9) уменьшается количество сперматоцитов, их площадь соответственно на 8,43%, 19,83% (Р<0,05) (табл. 1);

10) уменьшается количество сперматид в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца, их площадь соответственно на 17,36% (Р<0,05), 12,27% (Р<0,05) (табл. 1);

11) уменьшается количество сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца и площадь головки сперматозоида соответственно на 26,70% (Р<0,05), 12,41% (Р<0,05). В тоже время обнаружено увеличение длины его хвостовой части на 8,05% (табл. 1).

Таблица 1 — Морфометрические показатели извитых семенных канальцев белых крыс.

№ п/п Морфометрические показатели Контроль Опыт

1 Количество извитых семенных канальцев в одном поле зрения 34,68±0,94 25,96±0,69*

2 Площадь поперечного сечения извитого семенного канальца, мкм2 45469,74± 1746,76 52701,15±2703,18*

3 Площадь просвета канальца, мкм2 8878,17±832,41 21146,15±1091,75*

4 Плошааь сперматогенного эпителия, мкм2 36591,57±1243,36 31554,72±2526,31*

5 Толщина сперматогенного эпителия, мкм 36,62±2,34 28,86±1,77*

6 Количество миоидных клеток в стенке извитого семенного канальца 19,44±1,42 12,48±1,49*

7 Площадь миоидной клетки, мкм2 10,63±2,55 19,07±4,49*

8 Площадь ядра миоидной клетки, мкм2 1,14±0,30 1,47±0,29*

9 Количество клеток Сертоли в сперматоген-ном эпителии извитого семенного канальца 23,84±3,16 18,48±2,52*

10 Площадь клетки Сертоли, мкм2 189,73±18,59 152,15±13,96*

11 Площадь ядра клетки Сертоли, мкм2 15,82±0,73 10,07±1,72*

12 Количество стволовых сперматогониев в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца 17,89±3,32 15,69±3,02*

13 Плошаяь стволового спермагогония, мкм2 150,70±7,99 145,33±5,32

14 Площадь ядра стволового сперматогония, мкм2 25,99±2,44 23,65±1,96

15 Количество дифференцирующихся сперматогониев в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца 52,44±1,46 49,44±1,30

16 Площадь дифференцирующегося сперматогония, мкм2 27,58±2,07 19,37±2,68*

17 Количество сперматоцитов в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца 40,80±1,97 37,36±1,71

18 Площадь сперматоцита, мкм2 41,19±5,86 33,02±2,07*

19 Количество сперматид в сперматогенном эпителии 34,80±1,52 28,76±1,31*

20 Площадь сперматиды, мкм2 32,69±4,36 28,68±4,26*

21 Количество сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца 304,52±13,14 223,20±31,02*

22 Площадь головки сперматозоида, мкм2 17,48±2,12 15,31±0,82*

23 Длина хвостовой чали сгкрмагаюиоа, мкм 20,11±0,96 21,87±1.05

Примечание: * - достоверно по отношению к контролю Р<0,05.

Гистологическое изучение сперматогенного пласта семенных канальцев показал, что в норме стволовые сперматогонии лежат на базальной мембране изолировано от других клеток. Они имеют округлую форму. Дифференцирующиеся (зрелые) сперматогонии с темным оптически плотным ядром и узким ободком цитоплазмы. Между ними видны клетки Сертоли, имеющие крупные бледно-розовые ядра Основания клеток Сертоли лежат на базальной мембране между сперматогониями. Апикальная часть клетки обращена к просвету семенного канальца и имеет треуг ольную или пирамидальную форму.

Ближе к центру канальца располагаются сперматоциты. Это крупные клетки с большим ядром и широким ободком цитоплазмы. Они имеют округлую или овальную форму (рис. 1). Самый внутренний слой извитого канальца составляют сперматиды,

9

мелкие со светлым ядром клетки, лежащие в несколько рядов. Ранние спер-матиды округлой формы со сферическим ядром, находятся в средних слоях сперматогенного эпителия. Поздние сперматиды лежат в слое, прилегающем к просвету канальца, имеют вытянутую форму. У некоторых поздних сперматид обнаруживается жгутик. В некоторых канальцах видны сформированные сперматозоиды. Их темные вытянутые головки направлены на периферию канальца в сторону клеток Сертоли, а хвосты свисают в просвет канальца. Сперматозоиды в просвете извитого семенного канальца располагаются группами в количестве 6-8 по всему контуру просвета (рис. 1). В ходе проведенных исследований отмечено, что сперматогонии, по сравнению с контролем, имеют меньший размер. Стволовые сперматогонии имеют неправильную форму. Сперматоци-ты приобретают овальную, реже сферическую форму. Ранние и поздние сперматиды практически не различаются между собой. Они преимущественно овальной формы. Их ядра смещаются в центр клетки.

После 7 суток воздействия ацетата свинца, по сравнению с контролем, отмечено беспорядочное расположение сперматозоидов в просвете канальца. Уменьшаются размеры и форма головки сперматозоида. На гистопрепаратах наблюдаются обрывы хвостов и агглютинация сперматозоидов. Были обнаружены извитые семенные канальцы, в просвете которых отсутствовали сперматозоиды (рис. 1).

Рис. 1. Извитой семенной каналец. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 40 х ок. 10: А — контроль; Б - опыт; 1 - миоидные клетки; 2 - клетки Сертоли; 3 - дифференцирующиеся сперматогонии; 4 - сперматоциты; 5 - ранние сперматиды; 6 - поздние сперматиды; 7 - сперматозоиды.

Установлено, что площадь извитых семенных канальцев у самцов крыс при свинцовой интоксикации увеличивается на 13,72% (Р<0,05), по сравнению с контролем, при одновременном уменьшении площади сперматогеннного эпителия и его толщины соответственно на 13,76% (Р<0,05) и 21,19% (Р<0,05).

Подсчёт сперматогонии вели, начиная с 60-х суток постнатального онтогенеза, поскольку, согласно современным представлениям о процессах сперматогенеза, у крыс в период новорожденности практически все сперматогенные клетки являются гоноцитамии (Zoghi С. et al., 2012). Образование первых сперматогоний датируется 3-6 сутками постнатального онтогенеза (De Rooij D. G., 1998; Morales A. et al., 2007; Ruwanpura S. M. et al., 2008; Zoghi C. et al, 2012). Хотя, согласно отдельным сообщениям, даже у 15-суточных животных часть клеток, морфологически идентичных сперматогониям, в действительности являются гоноцитами (Zoghi С. et al., 2012).

О Сперматогоний

□ Спермятоииты

□ Сперматиды

□ Сперматозоиды

Контроль

Опыт

Рис. 2. Процентное соотношение половых клеток в извитых семенных канальцах семенных желез самцов белых крыс.

Анализ суммарного количества сперматогоний показал, что их количество у животных экспериментальной группы на 60-е сутки снижено на 6,31%, по сравнению с контролем. Снижение данного показателя, очевидно, связанно с началом новой волны сперматогенеза к периоду полового созревания, проходящего более интенсивно и завершающегося уже не апоптозом, а формированием полноценных сперматозоидов (Ruwanpura S. М. et al., 2008).

Согласно данным литературы, первые сперматоциты в семенниках крыс появляются на 9-10 сутки постнатального онтогенеза (Ruwanpura S. М. et al., 2008; Marchlewska К. et al., 2011), позже в результате первой волны сперматогенеза количество сперматоцитов сначала увеличивается, а затем останавливается на определённом уровне, ограниченном апоптозом (Moreno R. D. et al., 2006; Morales A. et al., 2007).

Анализ суммарного количества сперматоцит и сперматид экспериментальной группы животных позволил установить, что их количество снижено, по сравнению с контролем, соответственно на 8,43% и 17,36% (Р<0,05). В результате полученных исследований отмечено снижение числа сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца на 26,70% (Р<0,05) по сравнению с контролем, уменьшение количества данных клеток является, по-видимому, отражением изменения численности сперматогоний, сперматоцит и сперматид (рис. 3).

Клетки Сертоли играют ключевую роль в процессах развития и функционирования яичек. Они обеспечивают развивающиеся гаметы питательными веществами (трофическая функция), фагоцитируют остатки цитоплазмы формирующихся сперматозоидов и дегенерирующие половые клетки, секретируют жидкость для транспорта сперматозоидов в семенных канальцах (Држевецкая И. А., 1983).

Проведенные исследования показали, что клетки Сертоли располагаются между сперматогониями, их основания лежат на базальной мембране. Апикальная часть клетки обращена к просвету семенного канальца и имеет треугольную или пирамидальную форму. После 7 суток воздействия ацетата свинца по сравнению с контролем, отмечено значительное уменьшение количество клеток Сертоли. Базальная часть клеток значительно уменьшается в размерах и имеет более округлую форму. Апикальная часть клетки имеет более вытянутую форму.

□ Контроль □ Опыт

Рис. 3. Количественное изменение отдельных типов сперматогенных клеток в извитых семенных канальцах семенников самцов белых крыс при воздействии ацетата свинца: 1 - сперматогонии; 2 - сперматоциты; 3 - сперматиды; 4 — сперматозоиды.

Нами производился подсчёт количества клеток Сертоли в поперечных срезах семенных извитых канальцев. На основе полученных данных был рассчитан клеточный индекс Сертоли, который является одним из лучших показателей продуктивности процессов сперматогенеза, поскольку его величина положительно коррелирует со спермопродукцией (Gon^alves De Barros J.B. et al., 2007). После воздействия ацетата свинца, по сравнению с контролем происходит снижение показателя клеточного индекса с 18,14±1,72 до 17,33±1,02, т.е. на22,48%(Р<0,05).

Согласно современным представлениям, в процессе формирования стенки семенных извитых канальцев учавствуют 2 популяции сустентоцитов - «светлые» и «темные», соотношение которых на разных этапах постнатального развития неодинаково (Wartenberg Н. et al., 1981; Ritzen Е. М. et al., 1981). «Тёмные» клетки развиваются из пресустентоцитов в эмбриональном периоде и стимулируют процессы митоза проспер-матогоний, но к моменту рождения они исчезают, уступая место «светлым» клеткам, ин-гибирующим процесс сперматогенеза. Однако на 5-е сутки постнатального развития темные клетки появляются вновь, стимулируя тем самым начало первой волны сперматогенеза (Кушнарев А. А., 2002). Пролиферация сустентоцитов заканчивается после образования гематотестикулярного барьера примерно на 16-18 сутки постнатального развития (Orth J. М., 1982), хотя при этом они не утрачивают полностью способности к делению (Захидов С. Т. с соавт., 1995).

Очевидно, процессы усиления и угнетения секреции сустентоцитов отражают развивающиеся в них неспецифические процессы адаптации и исчерпания внутренних резервов (Гаркави Л. X. и др., 1990). В данном контексте наблюдаемое у животных опытной группы повышение размеров извитых семенных канальцев может являться следствием сильной интоксикации ацетатом свинца, и выраженного проявления угнетения функции поддержки своими отростками «скелета» сперматогенного пласта.

Кроме изучения сперматогенного пласта семенников изучалась интерстициальная ткань, в состав которой входят клетки Лейдига. В контроле участки интерстиция между извитыми семенными канальцами расположены равномерно. Они преимущественно треугольной формы. В ходе проведенного эксперимента выявлено, что участки интерстиция между извитыми семенными канальцами располагаются неравномерно, рыхло, в большинстве случаев имеет многогранную форму (рис. 4). Отмечено увеличение площа-

12

ди интерстициальной ткани по сравнению с контролем на 23,01% (Р<0,05). Клетки Лей-дига помимо общего эндокринного действия оказывают также паракринное, поскольку тестостерон, синтезируемый этими клетками, диффундирует через базальную мембрану семенных извитых канальцев, регулируя тем самым интенсивность процессов сперматогенеза (Демяшкин Г. А.. Амиров Н. Ш., 2009). Поэтому изучение эндокринного ком-партмента семенников является необходимым условием для оценки генеративной функции. Отмечено, что в контроле клетки Лейдига залегают вокруг кровеносных сосудов одиночно, или чаще группами по 5-7 клеток. Они крупные, овальной или многоугольной формы. В контроле общее количество клеток Лейдига в одном участке интерстиция достигало 10-12 шт. После воздействия ацетата свинца общая картина распределения клеток Лейдига в интерстициальной ткани носила диффузный характер. Интерстициальные гландулоциты располагались одиночно, лишь изредка встречаются небольшие группы по 2-3 клетки. Общее их количество в одном участке интерстиция достигало 5-7 шт. Они округлой формы, их ядра овальные и вытянутой формы (рис. 4).

Рис. 4. Интерстициальная ткань семенных желез (опыт). Окраска гематоксилин-эозин. Об. 100 х ок. 10: А - контроль; Б - опыт; 1 - участок интерстиция; 2 -клетки Лейдига; 3 - кровеносный сосуд.

Для оценки популяции клеток Лейдига производился подсчет суммарного количества данных клеток в одном участке интерстиция в 75 полях зрения цифрового микроскопа, отдельно площади и диаметра клеток и их ядер, площади цитоплазмы, а также площадь одного участка интерстициальной ткани между извитыми семенными канальцами. В ходе исследования при воздействии ацетата свинца зафиксировано уменьшение площади и диаметра клеток Лейдига, площади и диаметра их ядер, а также площади цитоплазмы клеток Лейдига. Площадь клеток Лейдига снижается на 61,13% (Р<0,05), диаметр клеток Лейдига - на 37,88% (Р<0,05), площадь клеток Лейдига - на 69,68% (Р<0,05), диаметр клеток Лейдига - на 49,33% (Р<0,005), площадь цитоплазмы клеток Лейдига - на 58,03% (Р<0,05), по сравнению с контролем.

ЗЛ.2. Функциональные изменения семенников самцов белых крыс в норме и при воздействии ацетата свинца

Отмечено снижение индекса сперматогенеза в экспериментальной группе по сравнению с контролем на 10,24% (Р<0,05). Снижение данного показателя всегда свидетельствует о нарушении процесса сперматогенеза и о снижении функциональной активности семенных желез (Потемина Т. Е., 2008; ЯегуапГаг М. А. еХ а1., 2008). Увеличение индекса созревания на 20,00% (Р<0,05), индекса мейотической активно-

А

Б

сти - на 23,08% (Р<0,05) и герминативного индекса - на 31,79% (Р<0,05) свидетельствует о преобладании молодых клеток над более зрелыми, а также задержке созревания мужских половых клеток (Rezvanfar М. A. et al., 2008) (табл. 2). Функциональное состояние сперматозоидов оценивали комплексно, с учетом их содержания, характера жизнеспособности и морфометрических параметров (Молнар Е., 1969; Kuriyama К., et al., 2004) с помощью автоматического счетчика клеток Countess™ (Invitrogen, США) при увеличении 100х2,3. Для этого смесь суспензии сперматозоидов и физраствора (1:4) окрашивали трипановым синим. Живые клетки трипановый синий окрашивает по краям, мертвые - однородно по всей клетке (Николаев В. В., Строев В. А., Астрахан-цев А. Ф., 1993). Установлено, что у подопытных животных содержание эпидиди-мальных сперматозоидов в 1 мл суспензии придатков семенника снижено, по сравнению с контрольной группой, на 50,63% (Р<0,05). Полученные данные коррелируют со значениями клеточного индекса Сертоли, что согласуется с литературными данными Gongalves De Barros J. В. et al (2007).

Другим показателем, оказывающим существенное влияние на фертильность, является жизнеспособность сперматозоидов. Установлено увеличение количества мертвых сперматозоидов в гомогенате придатков мужских половых желёз у половозрелых животных подопытных групп по сравнению с интактными контрольной группой животных на 60,68% (Р<0,05). Так у животных интактной контрольной группы содержание мёртвых клеток в 1 мл суспензии составило 11,56% от общего количества клеток, а у животных экспериментальной группы - 59,54% (Р<0,05) (табл. 2, рис. 5).

Таблица 2 - Функциональная активность семенных желез самцов белых крыс в норме и при воздействии ацетата свинца.

№ п/п Показатель Контроль Опыт

1 Индекс сперматогенеза 3,32±0,15 2,98±0,12

2 Индекс релаксации (напряженности сперматогенеза, клеточный индекс Сертоли) 18,14±1,72 17,33±1,02

3 Индекс созревания 0,28±0,01 0,35±0,04*

4 Индекс мейотической активности 0,10±0,01 0,13±0,01*

5 Герминативный индекс 2,21 ±0,17 3,24±0,36*

6 Количество сперматогоний в извитом семенном канальце 70,33±4,78 65,13±4,32*

7 Количество сперматоцит в извитом семенном канальце 40,80±1,97 37,36±1,71*

8 Количество сперматид в извитом семенном канальце 34,80±1,52 28,76±1,31*

9 Количество сперматозоидов в извитом семенном канальце 304,52±13,14 223,20±31,02*

10 Общая концентрация сперматозоидов в суспензии, х107/мл 7,96±0,45 3,93±0,11*

11 Концентрация живых сперматозоидов суспензии, х107/мл 7,04±0,12 1,59±0,09*

12 Концентрация мертвых сперматозоидов в суспензии, х]07/мл 0,92±0,07 2,34±0,14*

13 Жизнеспособность сперматозоидов, % 88,62±3,48 35,57±2,75*

Примечание: * - достоверно по отношению к контролю Р<0,05.

□ Живые сперматозоиды

□ Мертвые сперматозоиды

Контроль

Опыт

Рис. 5. Суспензия сперматозоидов самцов белых крыс.

Анализ количества патологических форм сперматозоидов позволил зафиксировать значительное увеличение количества дегенеративных форм после воздействия ацетата свинца. В ходе проведенных исследований было выявлено, что в норме сперматозоиды в просвете извитого семенного канальца располагаются группами в количестве 6-8 по всему контуру просвета. На мазках зрелые сперматозоиды имеют четкое разделение на составляющие части: головку, шейку и хвост. У большинства сперматозоидов головка имеет форму крючка. После 7 суток воздействия ацетата свинца отмечено беспорядочное расположение сперматозоидов в просвете канальца. Уменьшаются размеры и форма головки сперматозоида. На гистопрепаратах наблюдаются обрывы хвостов и агглютинация сперматозоидов. Обнаружены извитые семенные канальцы, в просвете которых отсутствовали сперматозоиды.

При воздействии ацетата свинца происходит снижение репродукции всех спер-матогенных клеток: сперматогоний на 6,31%, сперматоцитов - на 8,43%, сперматид -на 17,36% (Р<0,05) и сперматозоидов - на 26,70% (Р<0,05) (табл. 2). Одновременно происходит уменьшение общей концентрации сперматозоидов в 1 мл суспензии на 50,63% (Р<0,05), концентрации живых сперматозоидов - на 77,41% (Р<0,05), а также жизнеспособности - на 53,05% (Р<0,05), увеличение концентрации мертвых сперматозоидов - на 60,68% (Р<0,05) (табл. 2). О репродуктивных функциях семенников свидетельствуют данные: площадь интерстициальной ткани (мкм2), количество участков интерстиция между извитыми семенными канальцами в одном поле зрения препарата, площадь клеток Лейдига, количество клеток Лейдига в участке интерстиция. Все эти показатели резко снижаются после воздействия ацетата свинца, кроме площади интерстициальной ткани. Она увеличивается.

После воздействия ацетата свинца отмечается: снижение индекса сперматогенеза, по сравнению с контролем на 10,25%, индекса релаксации (напряженности сперматогенеза, клеточный индекс Сертоли) - на 4,46%. Это свидетельствует о снижении функциональной активности семенных желез. Одновременно с этим происходит увеличение индекса созревания, по сравнению с контролем, на 20,00% (Р<0,05), индекса мейотической активности - на 23,08% (Р<0,05) и герминативного индекса -на 31,79% (Р<0,05). Это свидетельствует о преобладании молодых клеток над более зрелыми, а также задержке созревания мужских половых клеток (табл. 2).

3.2. Морфофункциональиые изменения яичников самок белых крыс в норме и при воздействии ацетата свинца

3.2.1. Морфологические изменения яичников самок белых крыс в норме н при воздействии ацетата свинца

При оценке структурных особенностей яичников экспериментальных животных кроме гистологических параметров использовались следующие общепринятые критерии: весовые параметры, величина площадей коркового и мозгового вещества, содержание фолликулов на разных стадиях развития, атретических фолликулов и жёлтых тел (Волкова О. В., 1990, 1999).

В ходе проведенных исследований отмечено, в корковом веществе яичника находятся фолликулы на разных стадиях развития вплоть до зрелых граафовых пузырьков (третичных фолликулов). Они округлой формы. Местами наблюдаются атретические фолликулы. Между фолликулами располагается соединительнотканная строма яичника Примордиаль-ные фолликулы располагаются непосредственно под белочной оболочкой яичника в виде компактных групп. Лишь изредка встречаются одиночные примордиальные фолликулы. Ооциты в примордиальных фолликулах окружены одним слоем фолликулярных клеток, имеющих плоскую или округлую форму. Первичные фолликулы отличаются большим размером первичного ооцита и появлением вокруг него блестящей оболочки. Фолликулярные клетки в первичном фолликуле имеют кубическую форму и лежат в 1-2 слоя. Хорошо различимы ядра первичных ооцитов. Вторичные фолликулы имеют значительно большие размеры, по сравнению с первичными фолликулами. Вокруг фолликула начинает формироваться дополнительная оболочка - тека. Фолликулярный эпителий становится многослойным. В фолликуле появляется одна или несколько мелких полостей, заполненных жидкостью. Основной объём третичного фолликула занят большой полостью с жидкостью. Встречаются также малые полости, ещё не успевшие слиться с основной полостью. У третичного фолликула более выражена текальная оболочка Внутренний слой теки содержит интерстициальные (текальные) клетки с округлыми ядрами. Наружный слой теки образован плотной волокнистой соединительной тканью. Клетки (фибробласты) имеют узкие вытянутые ядра Ооцит в третичном фолликуле окружен блестящей оболочкой и слоем фолликулярных клеток - зернистым слоем. При этом внутренние части фолликулярных клеток (обращенные к блестящей оболочке) выглядят как лучистый венец.

После воздействия ацетата евин на примордиальные фолликулы располагаются преимущественно одиночно. Лишь изредка встречаются небольшие группы. Среди более зрелых форм фолликулов, были выявлены фолликулы овальной и неправильной формы. Обращает на себя внимание высокое содержание атретических фолликулов. Атрезии чаще подвергаются вторичные растущие фолликулы, реже третичные фолликулы (рис. 6, 7).

После 7 дней воздействия ацетата свинца происходит, по сравнению с контролем, увеличение площади и толщины мозгового вещества яичника соответственно на 30,03% (Р<0,05) и 19,01% (Р<0,05), при этом одновременно происходит уменьшение толщины и площади коркового вещества яичника соответственно на 12,04% (Р<0,05) и 6,18% (табл. 3). При исследовании соотношения площади мозгового вещества яичника к корковому выявлено, что в контроле оно составляет примерно 1:3. После воздействия ацетата свинца соотношение площади мозгового вещества яичника к корковому составляет примерно 1:2. Уменьшение коэффициента, отражающего отношение площади коркового вещества к мозговому веществу яичника, свидетельствует об уменьшении массы коркового вещества, ответственного за осуществление генеративной и эндокринной функции женских половых желёз. Одновременно наблюдается увеличение диаметра кровеносных сосудов, пронизывающих мозговое вещество яичника на 34,02% (Р<0,05), что свидетельствует об усилении кровоснабжения яичников (табл. 3).

А Б

Рис. 6. Корковое вещество яичника. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 20 х ок. 10: А — контроль; Б - опыт; 1 -примордиальные фолликулы; 2 — первичные фолликулы; 3 - вторичные фолликулы; 4 - третичные фолликулы; 5 - соединительнотканная основа; 6 — желтое тело.

Рис. 7. Третичный фолликул. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 20 х ок. 10: А - контроль; Б — опыт.

Одним из важнейших показателей структурно-функциональной зрелости яичника является общее количество фолликулов и их клеточный популяционный состав.

В контроле общее количество фолликулов составило 52,36±4,93, при воздействии ацетата свинца 42,12± 3,62, что меньше на 19,56% (Р<0,05) (табл. 3). Установлено, что в контроле число примордиальных фолликулов в яичнике самок белых крыс составило 17,72±1,31, первичных - 13,88±1,09, вторичных - 10,92±0,98, третичных -7,04±0,77. В опытной группе число примордиальных фолликулов в яичнике самок белых крыс составило 15,04±0,78 (Р<0,05), первичных - 11,28±1,07 (Р<0,05), вторичных-6,08±0,68, третичных -3,56±0,33 (табл. 3, рис. 8).

Мы не встретили литературных данных по влиянию ацетата свинца на фолликулярный состав яичников. Из приведенных данных (табл. 3) видно, что наибольшее изменение в количественном составе приходится на третичные фолликулы (в опыте на 49,43% (Р<0,05) меньше, чем в контроле). Анализ морфометрических параметров фолликулярного аппарата яичников показал, что после 7 дней воздействия ацетата свинца происходит снижение площади примордиальных, первичных, вторичных и третичных фолликулов соответственно на 0,59%, 4,29%, 15,91% (Р<0,05), 32,16% (Р<0,05) (табл. 3). Одним из показателей интенсивности фолликулогенеза в яичниках экспериментальных животных является содержание атретических фолликулов (Боровая Т. Г. и др., 1995). У

экспериментальных животных число атретических фолликулов увеличилось на 54,54% (Р<0,05) по сравнению с контролем, что указывает на связь между увеличением суммарного числа фолликулов и увеличением их атрезии (табл. 3).

1 2 3 4 5 6

В Контроль И Опыт

Рис. 8. Количественные показатели структурных компонентов коркового вещества яичников самок белых крыс: 1 - примордиальные фолликулы; 2 - первичные фолликулы: 3 - вторичные фолликулы; 4 - третичные фолликулы; 5 - атретические фолликулы; 6 - желтые тела.

Таблица 3 — Морфометрические показатели яичников самок крыс в норме и при воздействии ацетата свинца.

№ п/п Показатели Контроль Опыт

1 2 3 4

1 Толщина однослойного эпителия, мкм 10,07±0,48 6,49±0,24*

2 Толщина белочной оболочки яичника, мкм 19,67±0,38 16,94±0,39*

3 Площадь поперечного среза яичника, х103мкм2 9586,76±25,50 9868,5 Ш8Д7

4 Площадь коркового вещества яичника, х 103 мкм2 6912,15±23,79 6484,85^22,63*

5 Толщина коркового вещества яичника, мкм 1538,98±18,73 1353,73*21,07*

6 Площадь мозгового вещества яичника, х 10J мкм2 2176,05±24,84 3110,23±22,63

7 Толщина мозгового вещества яичника, мкм 799,43±3,79 987,09±5,92*

8 Диаметр кровеносных сосудов, пронизывающих мозговое вещество яичника, мкм 11,81±1,38 17,90±1,97*

9 Количество фолликулярных клеток в фолликулярном слое примордиаяьного фолликула 5,48±0,69 4,20±0,75*

10 Площадь фолликулярных клеток в примордиальном фолликуле, мкм2 36,05±0,79 33,34±1,01

11 Площадь ядра фолликулярных клеток в примордиальном фолликуле, мкм2 5,91±0,14 4,94±0,11 *

12 Количество первичных фолликулов в яичнике 13,88±1,09 11,28±1,07*

13 Площадь первичного фолликула, мкм2 6937,52±68,12 6639,89*131,99

14 Площадь ооцига в первичного фолликуле, мкм2 1427,48±4,11 1396,80±15,56

15 Толщина блестящей оболочки ооцита в первичном фолликуле, мкм 3,97±0,22 3,48±0,24*

16 Площадь ядра ооцита в первичном фолликуле, мкм2 354,72±2,75 334,31±5,01

17 Толщина фолликулярного слоя в первичном фолликуле, мкм 25,68±0,22 24,89±0,50

1 2 3 4

18 Количество фолликулярных клеток в фолликулярном слое первичного фолликула 29,68±2,20 24,04±1,64*

19 Площадь фолликулярных клеток в первичном фолликуле, мкм2 42,85±0,50 41,93±0,31

20 Площадь ядра фолликулярных клеток в первичном фолликуле, мкм2 6,51±0,16 6,11±0,25**

21 Количество вторичных фолликулов в яичнике 10,92±0,98 6,08±0,68*

22 Площадь вторичного фолликула х103мкм2 41,23±2,85 34,67±3,34*

23 Толщина теки, окружающей вторичный фолликул, мкм 20,15±1,30 14,75±0,62*

24 Площадь ооцита во вторичном фолликуле, х103мкм2 4,93±0,12 4,67±0,30

26 Толщина блестящей оболочки ооцита во вторичном фолликуле, мкм 4,63±0,46 3,68±0,28*

27 Площадь ядра ооцита во вторичном фолликуле, мкм2 455,91±7,12 416,72±8,85*

28 Диаметр ядра ооцита во вторичном фолликуле, мкм 23,95±1,08 22,93±1,12*

29 Толшина фолликулярного слоя во вторичном фолликуле, мкм 71,28±2,91 66,43±3,84

30 Количество фолликулярных клеток в фолликулярном слое вторичного фолликула 72,16±8,10 57,32±5,51*

31 Площадь фолликулярных клеток во вторичном фолликуле, мкм2 70,25±2,17 64,82±2,39

32 Площадь полости во вторичном фолликуле, мкм2 2973,84±112,31 2417,61±202,71*

33 Количество третичных фолликулов в яичнике 7,04±0,77 3,56±0,33*

34 Площадь третичного фолликула, хю3 мкм2 252,44±07,76 171,25±4,36*

35 Толщина теки, окружающей третичный фолликул, мкм 43,66±3,53 36,06±2,13*

36 Площадь ооцита в третичном фолликуле, х 103 мкм2 15,45±0,21 14,17±0,19

37 Толщина блестящей оболочки ооцита в третичном фолликуле, мкм 5,71±0,45 3,86±0,39*

38 Толщина зернистой оболочки ооцита в третичном фолликуле, мкм 8,80±0,84 4,02±0,30*

39 Площадь ядра ооцита в третичном фолликуле, мкм2 557,09±8,43 499,12±4,64*

40 Толшина фолликулярного слоя в третичном фолликуле, мкм 213,35±4,35 166,34±3,00*

41 Количество фолликулярных клеток в фолликулярном слое третичного фолликула 120,32±14,60 94,44±7,67*

42 Площадь фолликулярных клеток в третичном фолликуле, мкм2 81,56±10,33 77,15±2,65

43 Площадь ядра фолликулярных клеток в третичном фолликуле, мкм2 11,64±1,28 8,21±0,75*

44 Площадь полости в третичном фолликуле, хЮ3 мкм2 104,78±8,94 86,65±6,53*

45 Количество атретических фолликулов в яичнике 2,80±0,78 6,16±0,76*

46 Площадь клеток соединительнотканной сгромы, составляющих корковое и мозговое вещество яичника мкм2 73,36±5,58 87,80±8,61*

47 Площадь ядер клеток соединительнотканной сгромы, составляющих корковое и мозговое вещество яичника мкм2 7,25±1,15 7,63±1,33

Примечание: * — достоверно по отношению к контролю Р<0,05.

Таким образом, анализ результатов показал, что у самок крыс с экспериментальным воздействием ацетата свинца имеет место нарушение процесса фолликуло-генеза, проявляющееся в снижении суммарного содержания фолликулов и изменением фолликулярного состава яичников.

3.2.2. Функциональные изменения яичников самок белых крыс в норме и при воздействии ацетата свинца

Показателем эффективности роста и овуляции фолликула служит образование жёлтых тел ^оссо С. е1 а!., 2007). Проведенные исследования показали, что в контроле менструальные желтые тела в корковом веществе яичника располагаются равномерно. Они покрыты соединительнотканной капсулой, от которой к центру направляются тонкие прослойки, содержащие кровеносные и лимфатические сосуды. Обнаруженные желтые тела имеют округлую или овальную форму. Большинство из них находятся в стадии образования или зрелости. После 7 суток перорального введения ацетата свинца отмечено уменьшение количества менструальных желтых тел в яичниках самок белых крыс по сравнению с контролем, что свидетельствует об уменьшении количества созревших и вышедших из яичника яйцеклеток. Обнаруженные желтые тела имеют неправильную форму. Большинство из них находятся в стадии инволюции или на начальном этапе образования. Сосуды менструального желтого тела, по сравнению с контролем, находятся в разном морфо-функциональном состоянии. В одних участках желтого тела капилляры расширены и кро-веналолнены, а в других - разрушены (рис. 9).

А Б

Рис. 9. Менструальное жёлтое тело яичника. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 20 х ок. 10: А - контроль; Б - опыт.

Уменьшение числа менструальных жёлтых тел у экспериментальных животных на 45,30% (Р<0,05), по сравнению с контролем, отражает состояние овуляции больших фолликулов у подопытных животных. Полученные данные согласуются с общей тенденцией медленного роста и созревания фолликулов в подопытных группах (табл. 4).

Таблица 4 - Показатели менструальных желтых тел в яичниках самок белых крыс.

№ п/п Показатели Контроль Опыт

1 Количество менструальных желтых тел в яичнике 4,68±0,68 2,56+0,62*

2 Плошадь менструального желтого тела х 103 мкм2 863,43±6,56 602,38+7,24*

3 Количество лютеиновых клеток в менструальном желтом теле 877,24+13,01 679,12+17,53*

4 Площадь лютеиновых клеток, мкм2 185,90±2,30 137,20+2,32*

5 Площадь ядер лютеиновых клеток, мкм2 19,65±0,68 13,06+0,46*

6 Продолжительность эсгрального цикла, сутки 4,13+0,26 4,67±0,28*

7 Продолжительность стадии эструс, сутки 1,33+0,11 1,20±0,12*

8 Продолжительность стадии диэструс, сутки 2,80+0,15 3,47±0,19*

Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с контрольными животными.

20

Эстральный цикл является наиболее чувствительным к воздействию каких-либо факторов внешней среды (Лужников Е. А., 1994). По данным Мелик-Алавердяна Н. О. (1967) устойчивые нарушения эстрального цикла наступают значительно раньше, чем количественные изменения морфоструктурных элементов яичника. Динамика эстрального цикла в контрольной и опытной группе животных изучалась в соответствии с правилом «одного часа». Учитывалась общая продолжительность эстрального цикла, длительность отдельных фаз и ритмичность их чередования. Методика основана на том, что циклические изменения стенки влагалища отражаются на влагалищном содержимом, которое исследуется взятием влагалищного мазка. Каждой фазе полового цикла соответствует определенный клеточный состав влагалищного мазка (Leng Z. et al., 1998).

Учитывая, что период полового созревания у крыс наступает на 60-е сутки — период пубертата, а 90-е сутки - период ранней половозрелости (Бабичев В. Н., 1981; Шаляпина В. Г., 1991), определение стадии эстрального цикла начинали с возраста 60 суток. С помощью данной методики, возможно, судить о наступлении полового созревания, о нормальной циклической функции яичников, о различных нарушениях этой функции. Для получения более полной характеристики эстрального цикла, также было изучено количество циклов, приходившихся на самку в течение последних 22 суток экспозиции. Установлено, что в результате воздействия ацетата свинца происходит уменьшение количества эстральных циклов в течение 22 дней с 4,27±0,39 до 3,60±0,48, т. е. на 15,69% (Р<0,05), увеличение их продолжительности на 11,56% (Р<0,05), нарушение последовательности фаз со смещением его в сторону диэструса. Отмечено уменьшение продолжительности стадии эструс на 9,78% (Р<0,05) и увеличение продолжительности стадии диэструс на 19,31% (Р<0,05) (табл. 4).

Установлено, что после воздействия ацетата свинца семенники подвергаются изменению кровоснабжения, гипоксии и нарушению аутоимунного процесса, что, в конечном счете, приводит к изменению экспрессии генов, отвечающих за митотический потенциал первичных половых клеток (Pepling М. Е., 2006). Вместе с тем, существенную роль в развитии нарушений репродуктивной функции может играть и повреждение органов эндокринной системы.

Репродуктивная функция, регулирует многоуровневую систему «гипоталамус — гипофиз — гонады», звенья которой тесно взаимосвязаны механизмами положительных и отрицательных обратных связей. Нарушение последних приводит к развитию патологического процесса, как в регулируемой системе, так и в организме в целом. При этом изменения репродуктивной функции проявляются как у данного организма, так и сказываются на жизнеспособности последующих поколений (Волкова О. В., 1999).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Ацетат свинца приводит к следующим морфологическим и морфометриче-ским изменениям семенных желез белых беспородных крыс-самцов:

а) уменьшению толщины белочной оболочки семенных желез;

б) увеличению площади поперечного сечения извитых семенных канальцев и площади интерстиция;

в) уменьшению площади сперматогенного эпителия и его толщины;

г) уменьшению количества миоидных клеток в стенке извитого семенного канальца, увеличению площади клеток и их ядер;

д) снижению продукции всех популяций клеток сперматогенного эпителия, особенно его зрелых форм — сперматид;

е) уменьшению количества клеток Лейдига и клеток Сертоли, изменению их формы, уменьшению площади клеток и их ядер.

2. При воздействии ацетата свинца отмечается снижение индекса сперматогенеза и индекса релаксации (напряженности сперматогенеза), что свидетельствует о понижении функциональной активности семенных желез. Увеличивается индекс созревания, индекс мейотической активности и герминативного индекс, что свидетельствует о преобладании молодых клеток над более зрелыми, а также задержке созревания мужских половых клеток. Ацетат свинца приводит к уменьшению продуктивности семенных желез, что проявляется в уменьшении концентрации эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии, а также их жизнеспособности.

3. Воздействие ацетата свинца приводит к следующим морфологическим и мор-фометрическим изменениям яичников самок белых беспородных крыс:

а) уменьшению толщины покрывающего яичник снаружи однослойного эпителия;

б) уменьшению толщины белочной оболочки яичника;

в) уменьшению площади и толщины коркового вещества яичника, при одновременном увеличении площади и толщины мозгового вещества;

г) уменьшению количества примордиальных, первичных, вторичных, третичных фолликулов и желтых тел, при одновременном увеличении количества атретиче-ских фолликулов;

д) увеличению диаметра кровеносных сосудов, пронизывающих мозговое вещество яичника.

4. Ацетат свинца влияет на состояние эстрального цикла самок белых крыс, что проявляется в уменьшение числа циклов на одну самку, уменьшении продолжительности стадии эструс и увеличении продолжительности диэструса. Ацетат свинца приводит к следующим морфологическим и морф-метрическим изменениям менструального желтого тела в яичниках самок белых крыс:

а) изменению формы желтых тел от округлой или овальной до неправильной;

б) уменьшению количества желтых тел в яичнике, а также составляющих их лютеиновых клеток;

в) уменьшению площади желтых тел, площади лютеиновых клеток и их ядер;

г) дезорганизация кровоснабжения в желтом теле.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ (РЕКОМЕНДАЦИИ)

1. Полученные результаты дополняют данные по особенностям строения и структурной организации семенников и яичников, а также особенностям протекания в них процессов сперматогенеза и фолликулогенеза могут быть использованы в научных исследованиях и в учебном процессе при изложении вопросов влияния экологических факторов на репродуктивную систему.

2. Описанные морфофункциональные изменения могут быть использованы клиницистами как норму и для проведения лечебно-профилактических мероприятий с целью предотвращения развития патологических процессов в семенниках и яичниках при свинцовой интоксикации, или же их фармакологической коррекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Дуденкова, Н. А. Изменения морфофункционального состояния и продуктивности семенных желез белых крыс при воздействии ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 10 (часть 6). -С. 1253-1259.

2. Мельникова, Н. А. Исследование жизнеспособности клеток при воздействии ацетата свинца на организм крысы / Н. А. Мельникова, О. С. Шубина, Н. А. Дуденкова. М. В. Лапшина, О. В. Лиференко, О. И. Тимошкина // Современные проблемы науки и образования. -2013. -№ 5; URL: http://www.science-education.ru/111-10588

3. Дуденкова. Н. А. Морфологические изменения интерстициальной ткани семенников самцов белых крыс при воздействии ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина, Л. П. Тельцов // Глобальный научный потенциал. - 2014. - № 9 (42). -С. 7-10.

4. Дуденкова. Н. А. Влияние ацетата свинца на структурные изменения яичников самок белых крыс в период постнатального онтогенеза / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 2; URL: www.scíence-education.ru/122-17522

5. Дуденкова. Н. А. Морфофункциональные особенности эпидидимальных сперматозоидов самцов белых крыс после воздействия ацетата свинца / Н. А. Дуденкова // Научное обозрение. - 2015. - № 7 - С. 17-22.

В журналах, входящих в базы цитирования Scopus и Web of Science:

6. Shubina, O. S. Morphological and functional changes in seminal glands of albino rats exposed to lead acetate / O. S. Shubina, N. A. Dudenkova // World Applied Sciences Journal. - 2013. - Vol. 25.-№ 6. - P. 886-891.

7. Shubina, O. S. Morphological changes in the structure of ovarian white rats under the influence of lead acetate / O. S. Shubina, N. A. Dudenkova // 3rd International Conference on Science and Technology, London, 17-18 June 2013. - London : SCIEURO, 2013. -P. 313-322.

8. Shubina, O. S. Modficalons of the Morphological Structure of Ovaries and the Estral Cycles of Albino Rat Females under the Effect of Lead Acetate / O. S. Shubina, N. A. Dudenkova // Global Veterinaria. - 2014. - Vol. 12. - № 4. - P. 449-454.

9. Shubina, O. S. The effect of lead on the process of spermatogenesis in male albino rats / O. S. Shubina, N. A. Dudenkova, L. P. Teltsov // Ciencia e Técnica Vitivinícola. -2014. - Vol. 29. - Xa 8. - P. 225-233.

10. Shubina, O. S. Effect of Lead Acetate on the Productivity of the Sem-inal Glands of Male Albino Rats / O. S. Shubina, N. A. Dudenkova // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. -2015. -№ 6 (1). - P. 1616-1621.

В других изданиях:

11. Лиференко, О. В. Влияние свинца на человека и животных (обзор литературы) / О. В. Лиференко, Н. А. Дуденкова. О. С. Шубина // Окружающая среда: экологические и медицинские проблемы: матер. Всерос. науч.-пракг. интернет-конф. с Между-нар. участием, Саранск, 15-16 ноября 2011 г. - Саранск : Мордов. гос. пед. ин-т, 2012. -С. 86-88.

12. Дуденкова. Н. А. Морфологические особенности клеток Лейдига в условиях острой интоксикации ацетатом свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Международный научно-исследовательский журнал. — Екатеринбург, 2012. - № 7. - Ч. 1. -С. 29-31.

13. Дуденкова, Н. А. Морфофункциональные особенности извитых семенных канальцев под воздействием ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Научная перспектива. - Уфа, 2013.-№ 1.-С. 51-52.

14. Дуденкова, Н. А. Морфофункциональные особенности клеток Лейдига и клеток Сертоли под воздействием ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Научная дискуссия: вопросы физики, химии, биологии: матер. VI Междунар. заочн. науч.-практ. конф., Москва, 31 января 2013 г. - М.: Изд. «Международный центр науки и образования», 2013. — С. 102-110.

15. Дуденкова, Н. А. Морфофункциональные изменения интерстициальной ткани семенных желез белых крыс под воздействием ацетата свинца / Н. А. Дуденкова // ЛОМОНОСОВ - 2013: тез. докл. XX Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология», Москва, 8-13 апреля 2013 г. - М.: МАКС Пресс, 2013.-С. 150.

16. Дуденкова, Н. А. Морфофункциональные изменения сперматогенного эпителия семенных желез белых крыс в условиях воздействия ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Современные научные исследования. Выпуск 1. - Концепт. -

2013. - URL: http://e-koncept.ru/article/766/

17. Dvdenkova. N. Morphological and functional changes in seminiferous epithelium of the testes of white rats under the effect of lead acetate /N. Dydenkova, O. Shybina // DOAJ - Lund University: Koncept : Scientific and Methodological e-magazine. - Lund, Sweden, 2013. - Vol. 1. - № 2 (Best Article). - P. 291-295.

18. Дуденкова, H. А. Морфофункциональные изменения желтого тела в яичниках белых крыс при воздействии ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Инновации в науке: матер. XXIX Междунар. науч.-практ. конф., Новосибирск, 29 января 2014 г. - Новосибирск : Изд. «СибАК», 2014. - № 1 (26). - С. 20-27.

19. Леушкина, О. В. Влияние свинца на женскую репродуктивную систему (обзор литературы) / О. В. Леушкина, Н. А. Дуденкова // Актуальные проблемы науки в студенческих исследованиях (биология, экология и химия): матер. Всерос. заочн. сту-денч. науч.-практ. конф., Саранск, 28 марта 2014 г. - Саранск : Мордов. гос. пед. ин-т,

2014.-С. 31-34.

20. Дуденкова. Н. А. Особенности протекания процесса сперматогенеза в семенных железах самцов белых крыс при воздействии ацетата свинца / Н. А. Дуденкова // ЛОМОНОСОВ - 2014: тез. докл. XXI Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология», Москва, 7-11 апреля 2014 г. - М.: Изд. Московского университета, 2014. - С. 5.

21. Дуденкова. Н. А. Влияние ацетата свинца на клетки Лейдига семенных желез самцов белых крыс / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина, Л. П. Тельцов // Теория и практика современной науки: матер. XIV Меж-дунар. науч.-практ. конф., Москва, 2-3 июля 2014 г. - М.: Изд. «Спецкнига», 2014. - С. 59-66.

22. Дуденкова. Н. А. Морфологические изменения структуры яичников самок белых крыс после воздействия ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Актуальные проблемы биологии, экологии, химии и методик обучения: матер. Междунар. науч.-пракг. конф. с элементами научной школы для молодых ученых - 50-е Евсевьев-ские чтения, Саранск, 21-23 мая 2014 г. - Саранск: Мордов. гос. пед. ин-т, 2015. -С. 26-30.

23. Dudenkova. N. A. Morphological features of the structure of the testes of male albino rats during postnatal ontogenesis / N. A. Dudenkova, O. S. Shubina // 4th European Conference on Biology and Medical Sciences, Austria, Vienna, 13 January 2015. - Vienna : «East West» Association for Advanced Studies and Higher Education GmbH, 2015. - P. 138-144.

24. Дуденкова. H. А. Цитологическая оценка репродуктивной способности семенников самцов белых крыс после воздействия ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Современная биология: актуальные вопросы: матер. V Междунар. науч.-практ. конф., Санкт-Петербург, 13-14 февраля 2015 г. - СПб. : Научный фонд «Биолог», 2015. - С. 53-56.

Подписано в печать 05.06.2015. Формат 60*84 1/16. Печать лазерная. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 110 экз. Заказ № 61.

ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный педагогический институт имени М. Е. Евсевьева» Редакционно-издательский центр 430007, г. Саранск, ул. Студенческая, 11а