Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация фокальных центров репликации ДНК в клетках человека: иммунофлуоресцентное исследование

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация фокальных центров репликации ДНК в клетках человека: иммунофлуоресцентное исследование"

РГ6 од

2 2 СЕН 1998

На правах рукописи УДК 576.315.42:577.213.24

СОЛОВЬЕВА С Людмила Викторовна

ОРГАНИЗАЦИЯ ФОКАЛЬНЫХ ЦЕНТРОВ РЕПЛИКАЦИИ ДНК В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

03.00.25

Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических паук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Н.В. Томилин Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

H.A. Ляпунова

Институт генетики человека РАМН, Москва

доктор биологических наук, профессор В.М. Михельсон Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение:

Петербургский институт ядерной физики РАН,

Санкт-Петербург, Гатчина

Защита состоится 1998г. в 13 ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр. д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослан

"У/" СЛН^яЯрА. 1998 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета , г ___—.

доктор биологических наук \JjjLCMsf--~' Л.Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

¡ктуальность проблемы

Репликация ДНК - одно из важнейших событий клеточного цикла эукариот, и зучение вопросов, связанных с этим процессом, является актуальной задачей паточной биологии. Исследование механизма удвоения генетического материала петок было начато более 30 лет назад, однако еще и сегодня многие аспекты роцесса репликации ДНК остаются далеко не ясными.

Известно, что хромосомы млекопитающих состоят из большого числа епликативных единиц - репликонов, удвоение которых осуществляется при работе дной или двух, движущихся в противоположных направлениях со средней скоростью т.п.н. в 1 мин, репликатавных вилок. Вопрос о размере основной массы репликонов о настоящего времени не решен. Широко популярной является точка зрения, что ольшинство репликонов имеют относительно малый размер (в среднем 100 т.п.н.), и сновной репликативной единицей является кластер из 20-25 репликонов, ктавируемых одновременно (Hand, 1978). Согласно этой модели среднее время епликации одного кластера малых репликонов (КМР) должно быть таким же, как ремя удвоения одного репликона, т.е. около 30 мин. Однако, имеются данные, олученные методом нитевой ДНК-радиоавтографии (НДР), которые показывают, что иачительно более длинные (со средним размером 150-900 т.п.н.) и реимущественно некпастеризованные репликоны, синтез ДНК в которых занимает 3ч, представляют собой главные единицы репликации в клетках млекопитающих Оров, Ляпунова, 1976; Liapunova, 1994).

Когда отдельные фокальные центры репликации ДНК (ФЦР) были изуализированы в клеточном ядре с применением метода иммунофлуоресценции vJakamura et al., 1986), они были интерпретированы, согласно общепринятой точке эения, как кластеры одновременно активированных малых репликонов. лительностъ синтеза ДНК в ФЦР была исследована с помощью двойной мпульсной метки (Manders et al., 1992) in vivo 5-йод-2'-дезоксиуридином (ИДУ) и 5-пор-2'-дезоксиуридином (ХДУ). Оказалось, что картина внутриядерного аспределения ФЦР меняется, если интервал между двумя импульсными двадцатиминутными метками составляет 1 ч или более, и в результате был сделан ывод о том, что средняя длительность репликации ДНК в одном ФЦР составляет 1 ч. зменение картины распределения ФЦР в течение S-фазы в опытах с двойной еткой in viva является следствием двух различных процессов зпрограммированного в течение S-фазы переключения синтеза ДНК на новые эзависимые ФЦР и локального вытеснения ДНК из мест синтеза в пределах одного

ФЦР (Pardoll et al., 1980; Manders et al., 1992, 1996). Поскольку в опытах in vivo эти два процесса различить весьма трудно, указанная выше оценка среднего времени синтеза ДНК в одном ФЦР (1 ч) представляется спорной.

Структура ФЦР не была исследована ни в одной из ранее опубликованных работ. Это связано с тем, что на полученных в этих работах фотографиях ФЦР выглядели как глобулярные образования, не имеющие видимой субструктуры.

Содержание ДНК в ФЦР могло бы быть оценено с использованием недавно разработанного статистического метода изучения геометрии поведения интерфазных хромосом (van den Engh et al., 1992; Yokota et al., 1995). Этот метод основан на результатах измерений линейных расстояний между сигналами флуоресцентной гибридизации in situ (ФГИС) от большого числа пар космидных проб с известным геномным расстоянием между пробами. График зависимости среднего квадрата физического расстояния между пробами и геномного расстояния между ними состоит из двух явно выраженных линейных участков, с резким переломом в районе ~2 м.п.н. (Рис. 1).

-20-

Л

N

f 10

о

■<1

о

б

о

о о о /

О/ 0

°,6 О 1р

4

200 0 2 Ь (м.п.н.)

Рис. 1. Зависимость между средним квадратом интерфазного расстояния <Ь2> и геномным расстоянием I- для проб, расположенных на хромосоме 4 человека.

Проанализированы 36 пар проб в диапазоне 10-190 м.п.н. (черные кружки) и 44 пары проб в диапазоне 0.1-4 м.п.н. (белые кружки), визуализированные в результате ФГИС не ядрах фибробластов человека в фазе 00/01 клеточного цикла, фиксированных МУН после гипотонической обработки, а - график для полного диапазона геномны> расстояний; б - участок графика в более крупном масштабе для геномных расстояний дс 4 м.п.н. Каждая точка графика представляет собой среднее для 154 измерений (Из Уоко1ае1а1„ 1995).

Эти результаты хорошо согласуются с моделью случайных блужданий/гигантски: петель для поведения интерфазного хроматина, согласно которой в фазе 60/С

леточного цикла хроматин организован в петли, содержащий'''несколько млн пар ¡уклеотидов (м.п.н.) ДНК, основания которых прик^ёпйейы У оси, изгибающейся лучайным образом. Таким образом, измерив линеино5 'расстояние между двумя очками на интерфазной хромосомной нити, возможно Jоценить соответствующее еномное расстояние между этами точками. Проблема в применении описанного !етода для анализа репликативных единиц в ядре состоит в том, что до сих пор сгается неясным вопрос, подчиняется ли поведение S-фазного хроматина 'Писанной модели случайных блужданий/гигантских петель для G0/G1-хроматина.

В данной работе мы исследовали организацию ФЦР в клетках млекопитающих ; помощью метода иммунофлуоресценции. Для этого исследования были выбраны летки человека, как типичного представителя класса млекопитающих.

(ель и задачи исследования

Целью данного исследования было проведение количественного 1ммунофлуоресцентного анализа репликативных единиц в ядрах клеток человека. В остоящей работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Усовершенствовать метод визуализации ФЦР в ядрах клеток человека после включения в ДНК нерадиоактивно меченных предшественников в ходе S-фазы клеточного цикла и последующего иммунофлуоресцентного окрашивания сайтов включения метки, таким образом, чтобы получить высококачественные изображения реплицированных участков хромосомных фибрилл при максимальном оптическом разрешении.

2. Провести морфометрический анализ указанных фибрилл в S-фазных клетках, позволяющий выяснить соответствие их конформации модели случайных блужданий и определить коэффициент упаковки ДНК в этих фибриллах.

3. Используя полученный коэффициент упаковки ДНК в S-фазных хромосомных фибриллах, провести количественный анализ среднего содержания ДНК в репликативных фокусах различных линий культивируемых клеток человека.

4. С помощью метода ФГИС изучить распределение всех уникальных последовательностей Х-хромосомы в S-фазных ядрах клеток человека и выяснить, не меняется ли макроструктура хромосом при репликации, и существуют ли гигантские петли хроматиновых фибрилл в S-фазе.

5. Провести временной анализ картины ФЦР в клеточном ядре после импульсного включения одиночной репликативной метки in viva или длительного последовательного включения двух различных меток, первая из которых вводилась бы in vivo, а вторая - либо in vivo, либо in vitro, что позволило бы

оценить длительность полной репликации основной массы ФЦР в клетках человека и дать независимое цитологическое подтверждение той или иной концепции в вопросе о размерах и кластеризации репликативных единиц.

Научная новизна результатов

В данной работе усовершенствован метод иммунофлуоресцентной визуализации ФЦР после включения в ДНК нерадиоактивно меченных предшественников в ходе Э-фазы клеточного цикла, что позволило анализировать структуру элементарных хромосомных фибрилл в ядрах клеток млекопитающих.

Обнаружено, что ФЦР состоят из субъединиц, и показано, что эта субъединицы являются структурными единицами организации хроматина, по содержанию ДНК (<260 т.п.н.) соответствующими известным микропетлевым доменам хроматина.

Впервые проведен анализ локальной конформации реплицированных хроматиновых фибрилл и показано, что модель случайных блужданий, предложенная для локального поведения С0Д31 -хроматина, справедлива и для Э-фазного хроматина. Выявлено, что размеры Х-хромосом не отличаются в Э-фазных клетках и в С0/в1-клетках, что показывает, что гигантские петли хроматиновых фибрилл, известные для 6(Ю1 -клеток, существуют в Э-фазе клеточного цикла. Таким образом, впервые показано, что модель случайных блужданий/гигантских петель, описывающая конформацию в0/С1-хроматина, применима и для Э-фазного хроматина.

Определен коэффициент локальной упаковки ДНК во вновь реплицированном хроматине, позволяющий оценивать содержание ДНК в ФЦР. Сделана оценка средневесового содержания ДНК в ФЦР клеток ранней Э-фазы.

Впервые показано, что длительность репликации ДНК в основной массе ФЦР составляет 1.5-3 ч, что противоречит общепринятой модели кластеров малых синхронно активируемых репликонов как основных репликативных единиц в клетках млекопитающих, но хорошо согласуется с альтернативной моделью репликации, согласно которой основные единицы репликации представляют собой отдельные или сгруппированные большие дол гожи вущие репликоны.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы

Полученные в работе результаты углубляют имеющиеся представления об организации процесса репликации ДНК в клетках млекопитающих.

Предложенные усовершенствования метода иммунофлуоресцентной визуализации ФЦР расширяют методические возможности анализа структуры ФЦР в клетках.

Материалы, полученные в работе, могут быть включены в курсы лекций по клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: "Сегрегация хромосом и анеуплоидия" (Сорренто, Италия, 1995 г.); "Репликация эукариотической ДНК" (Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, США, 1995 г.), "Регуляция репликации эукариотической ДНК" (Сент-Савер, Квебек, Канада, 1996 г.); а также на научных семинарах Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН и Центра по изучению рака Университета им. МакГилла, Монреаль, Канада.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из зведения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и эбсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 238 названий. Работа иллюстрирована 28 рисунками и 2 таблицами.

Список основных сокращений

5ДУ - 5-бром-2'-дезоксиуридин ЛДУ - 5-иод-2'-дезоксиуридин

<МР - кластер синхронно активируемых малых репликонов

и.п.н. - млн пар нуклеотидов

ИУК - смесь метанола и уксусной кислоты (3:1)

г.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

&ГИС - флуоресцентная гибридизация in situ

3>ДУ - 5-фтор-2'-дезоксиуридин

ЬЦР - фокальный центр репликации ДНК

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Линии клеток, использованные в работе. В работе были использованы линии клеток человека: HeLa, хронической миелоидной лейкемии К562, аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, диплоидные клетки легкого эмбриона MRC5, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН); клетки культур фибробластов кожи больных трихотиодистрофией TTD1RO, пигментной ксеродермой XP25RO, атаксией-телангиэктазией AT25BI, любезно предоставленные нам проф. А.Р. Леманом и Л. Майне (A.R. Lehmann, L. Маупе, Университет Сассекса, Брайтон, Великобритания); клетки культуры фибробластов кожи больных пигментной ксеродермой XP12RO, любезно предоставленные нам проф. Ф. Ханавальтом (P. Hanawait, Университет Стенфорда, США). Клетки К562 выращивали в суспензии в стеклянных флаконах Карреля при 37°С в среде DMEM с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФСКРС) и антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), клетки MCF-7, HeLa, MRC5, TTD1RO, XP12RO, XP25RO, AT25BI - в пластиковых флаконах (Nunclon) или на предметных стеклах, помещенных е чашку Петри, в аналогичной среде, но с 10% ФСКРС, при 37°С в атмосфере С02.

Включение в клетки одиночной репликативной метки. Клетки инкубировали с 0.01 мМ 5-фтор-2'-дезоксиуридина (ФДУ) 2 ч (в отдельных экспериментах ФДУ добавляли на 16 ч), затем в среду добавляли 0.01 мМ ИДУ или 5-бром-2'-дезоксиуридина (БДУ) на указанное время (5 мин - 2 ч в зависимости от эксперимента). Клетки К562, MCF-7, HeLa, MRC5, TTD1RO, XP25RO, AT25BI снимали с флаконов и промывали буфером PBS (2.7мМ KCl, 1.5мМ KHjPO*, 137мМ NaCI, 8.1мМ Na2HP04l рН7.1). Клетки MCF-7 и HeLa, прикрепленные к предметному стеклу, промывали на стеклах буфером PBS.

Включение в клетки двойной репликативной метки in vivo/In vivo и in vivo/in vitro. Для включения первой и второй репликатавной метки (ХДУ и ИДУ) /л vivo клетки XP12RO на стеклах вначале переводили на среду F10 без гипоксантана и тимидина (F10 НТ), смешанную в соотношении 1:1 со средой DMEM (F10 НТ /DMEM), с 5% ФСКРС, и инкубировали 60 мин в присутствии 0.01 мМ ФДУ. Затем в эту же среду добавляли 0.01 мМ ХДУ и инкубировали клетки 60 мин. После этого клетки быстро промывали 4 раза подогретой до 37°С средой F10 НТ, причем при второй промывке в среду добавляли 0.05мМ тимидина для блокирования включения ХДУ. Затем клетки помещали в среду F10 HT7DMEM с 5% ФСКРС, 0.01 мМ ФДУ и 0.01 мМ ИДУ, инкубировали их 60 мин и промывали 2 раза охлажденным на льду буфером PBS.

Для включения в клетки первой репликатавной метки (ИДУ) in vivo, а второй метки (биотин-ДУТФ) - in vitro использовали следующую схему. Клетки MCF-7 на стеклах переводили на среду F10 HT/DMEM с 5% ФСКРС, предварительно инкубировали 2 ч с ФДУ (0.01 мМ), а затем на 90 мин добавляли в среду ИДУ (0.01 мМ). После промывки в буфере PBS при комнатной температуре (KT) клетки обрабатывали раствором

лрептолизина О (Sigma) в буфере PBS (1000 ед./мл) 30 мин при 4°С. Клетки тромывали 5 раз охлажденным на льду буфером PBS и 2 раза модифицированным физиологическим" буфером (ФБ; Hassan, Cook, 1993) следующего состава (в мМ): 100 СНэСООК, 30 KCl, 10 Na2HP04, 1 MgCI2, 1 АТФ, 1 дитиотрейтола, 0.02 |эенилметалсульфонилфторида, 0.04 EGTA; pH буфера доводили до значения 7.4 «створом КН2Р04 (ЮОмМ). Затем клетки инкубировали в ФБ 2 мин при 37°С. После »того на стекла с клетками наносили репликационный буфер (состав в мМ: 0.1 ДГТФ, ).1 ДЦТФ, 0.1 ДАТФ, 0.05 биотин-11-ДУТФ, 0.1 ГТФ, 0.1 ЦТФ, 0.1 УТФ, 2 MgCI2 в ФБ), юдогретый до 33°С, и инкубировали клетки 90 мин при 33°С. Реакцию останавливали ]утем двукратного промывания стекол охлажденным на льду ФБ. Затем стекла с летками промывали охлажденным на льду буфером PBS.

Приготовление препаратов нитей ДНК с одиночной репликативной леткой, расправленных на стекле. В асинхронные клетки К562 первой порции ¡ключали ИДУ 30 мин, как описано выше. Вторая порция клеток была выращена без 1нкубации с ФДУ и ИДУ. Клетки первой и второй порции отдельно промывали PBS |ри KT, затем обе порции клеток смешивали. Клетки позировали при инкубации их в !изирующем буфере (0.6% SDS, 50мМ EDTA, ЮмМ Tris-HC!, рН8) 30 мин при 60°С. 7олученные в результате лизиса клеток нити ДНК наносили без растяжения на редметные стекла, давая лизату свободно течь по наклонному стеклу. Стекла с ¡итями ДНК высушивали при KT.

Фиксация клеток и нитей ДНК и последующая обработка препаратов с >диночной и двойной репликативной меткой. После включения одиночной 'епликатавной метки клетки К562, HeLa, MRC5, TTD1RO, XP25RO, AT25BI, ереведенные в суспензию, инкубировали в 50мМ KCl (10 мин, 37°С), фиксировали вежеприготовленной смесью метанола и уксусной кислоты (3:1) (МУК) (30 мин, 20°С), наносили на предметные стекла и высушивали на воздухе.

Высушенные нита ДНК на стеклах с одиночной репликативной меткой Фиксировали МУК (30 мин, -20°С), после чего высушивали на воздухе.

Клетей XP12RO и MCF-7 с двойной репликативной меткой фиксировали, помещая текла с выращенными на них клетками из буфера PBS, не высушивая, в МУК на 30 !ин при KT, после чего высушивали на воздухе.

Клетки HeLa и MCF-7, прикрепленные к предметному стеклу, фиксировали, пуская стекла из PBS в 4%-ный раствор формальдегида в PBS (10 мин, 0°С), а затем 70%-ный этанол (ночь, 4°С), обезвоживали 96%-ным этанолом и высушивали на оздухе.

Полученные при всех способах фиксации препараты обрабатывали 45%-ной ксусной кислотой (30 мин при KT), высушивали, обрабатывали 80%-ным этанолом 15 мин при KT или ночь при 4°С), обезвоживали 96%-ным этанолом и высушивали на оздухе.

Денатурация ДНК на препаратах. ДНК в ядрах денатурировали, помещая репараты з 4N HCl на 30 мин при KT. ДНК, расправленную на стекле, енатурировапи в 0.2N HCl 30 мин при KT. После денатурации препараты промывали

PBS при KT. Для ФГИС препараты денатурировали и промывали, как описано в методике ФГИС.

Иммунофлуоресцентнов окрашивание препаратов с одиночной и двойной репликативной меткой. Препараты после денатурации, промытые буфером PBS, инкубировали в 1 %-ном растворе блокирующего реагента (БР; Boehringer Mannheim, Германия) в PBS с добавлением 0.02% Tween 20 (Sigma, США) (30 мин, 37°С), промывали 0,5%-ным раствором БР в буфере PBS, содержащем 0.02% Tween 20 при KT, и все последующие инкубации с антителами проводили в этом растворе (при 37°С). Между инкубациями с антителами препараты промывали при покачивании 10 мин буфером PBS, содержащим 0.1% Tween 20 при KT и ополаскивали 0.5%-ным раствором БР в буфере PBS, содержащем 0.02% Tween 20.

На препараты ядер клеток с одиночной репликативной меткой наносили последовательно антитела: мышиные к бромуридину (БУ), (клон, изолированный М. Филатовым, ПИЯФ, Гатчина, 1:50, 60 мин), которые реагируют также с ИДУ; кроличьи к мышиному иммуноглобулину G (IgG) (Sigma, 1:50, 40 мин); козлиные к кроличьему IgG, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (Sigma, 1:50, 40 мин); кроличьи к козлиному IgG, конъюгированные с ФИТЦ (Sigma, 1:50, 40 мин).

Для окрашивания нитей ДНК с одиночной репликативной меткой препараты инкубировали с мышиными антителами к БДУ (Boehringer, 1:100, 1 ч), которые реагируют также с ИДУ, затем с овечьими антителами к мышиному IgG, конъюгированными с биотаном (Sigma, 1:50, 40 мин). Дальнейшее окрашивание проводилось с использованием набора реагентов Тирамидной системы амплификации сигнала (Tyramide System Amplification TSA-lndirect Renaissance Kit) (DuPont) при KT по инструкции, прилагаемой к этому набору. В конце окрашивания препараты инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с Техасом красным.

На препараты клеток, включивших двойную метку in vivo/in vivo, наносили мышиные антитела к БДУ (Becton Dickinson, 1:50, 40 мин) (для реакции с ИДУ), после чего препараты промывали в буфере PBS и выдерживали 7 мин при KT в буфере следующего состава: 0.5М NaCI, 37мМ Tris-HCI, 0.5% Tween 20, рН8 (Aten et al., 1992) Затем препараты промывали 10 мин буфером PBS при KT. На препарать последовательно наносили овечьи антитела к мышиному IgG, конъюгированные ( биотином (Sigma; 1:100, 30 мин); авидин, конъюгированный с Техасом красныь (Опсог; 1:50, 30 мин); крысиные антитепа к БДУ (Sera-Lab; 1:100, 40 мин) (для реакци! с ХДУ), в которые за 30 мин до инкубации было добавлено 0.02мМ ИДУ; кроличы антитела к крысиным иммуноглобулинам (DAKO; 1:100, 30 мин); козлиные антитела кроличьему IgG, конъюгированные с ФИТЦ (Sigma; 1:200, 30 мин).

Для окрашивания клеток, включивших двойную метку in vivo/in vitro, на препарат! последовательно наносили следующие антитела: мышиные антитела к БД (Boehringer, 1:50, 60 мин); кроличьи антитела к мышиному IgG (Sigma; 1:50, 40 мин козлиные антитела к кроличьему IgG, конъюгированные тетраметилродаминизотиоцианатом (ТРИТЦ; Sigma; 1:50,40 мин); кроличьи антител к козлиному IgG, конъюгированные с ТРИТЦ (Sigma; 1:50, 40 мин). Затем н

препараты наносили авидин, конъюгированный с ФИТЦ (Vector; 1.50, 40 мин), биотинилированные козлиные антитела к авидину (Vector; 1:50, 40 мин) и авидин, конъюгированный с ФИТЦ (Vector; 1:50, 40 мин).

Флуоресцентная гибридизация in situ (ФГИС) и последующее иммунофлуоресцвнтнов окрашивание препаратов. ФГИС с биотинилированной пробой, включающей все уникальные последовательности Х-хромосомы (Опсог) производили на меченных 90 мин БДУ и фиксированных формальдегидом клетках HeLa по методике, описанной в литературе (O'Keefe et al., 1992). Биотин выявляли с помощью авидина, конъюгированного с Техасом красным (Опсог, 1:50, 1 ч), БДУ - с помощью монокпональных мышиных антител к БДУ (Becton Dickinson, 1:50, 1 ч) и последующей инкубации с козлиными антителами к мышиному IgG, конъюгированными с ТРИТЦ (Boehringer, 1:10,1 ч).

Микроскопия и анализ изображений. После окрашивания препараты заключали в раствор пропилгаллата в 90%-ном глицерине (50 мг/мл), препятствующий выгоранию флуоресценции, и просматривали в флуоресцентном микроскопе Axioskop (Zeiss, Германия), снабженном наборами фильтров для ФИТЦ и для родамина (который подходит и для Техаса красного), объективом Plsn-NEOFLUAR 100/1.30 и фотоаппаратом.

Для конфокальной микроскопии использовали систему BioRad MRC-600 с лазерным сканированием изображения, в состав которой входил инвертированный микроскоп Nikon Optiphot-2 (Япония), снабженный объектовом PlanApo 60/1.4. Конфокальные оптические срезы фотографировали с экрана монитора или выводили на печать, используя термальный принтер (Mitsubishi, Япония), подключенный к конфокальной системе.

Съемку зеленой и красной флуоресценции клеток производили на черно-белую фотопленку РФ-3 (Тасма) или Kodak ТМАХ (ASA 400).

Для количественного анализа изображений на фотографиях применяли систему MOP-VIDEOPLAN (Kontron, Австрия).

Для анализа изображений клеток с двойной репликатавной меткой изображения на пленке вводили в память компьютера с помощью сканнера Arcus II Agfa, Германия). С применением программы Adobe Photoshop изображения жрашивали в псевдоцвета, получая для каждой клетки два изображения - зеленое и ;расное, которые затем совмещали, при этом области перекрывания двух указанных иображений клетки окрашивались в желтый цвет. С помощью программы TRIM Оптический институт, Санет-Петербург) производили для каждой клетки ¡егментацию её изображения, полученного в результате совмещения зеленого и расного изображений этой клетки, предварительно преобразовав его в полутоновое ¡ерно-белое. После выполнения этой операции можно было автоматически сосчитать ia изображении общее число объектов. Производили подсчет объектов, -дновременно имеющих как красное, так и зеленое включения. В результате ценивали в клетке процентное содержание репликативных доменов, включивших бе метки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Визуализация ФЦР

В качестве репликативной метки для включения в клетки /л vivo использовали нерадиоактивно меченный аналог тимидина ИДУ. Для включения метки в ФЦР асинхронные клетки человека, растущие в культуре, после предварительной двухчасовой инкубации с ФДУ инкубировали в среде с добавлением ИДУ в течение 90-120 мин.

В отличие от предыдущих авторов, которые окрашивали ФЦР в ядрах не обработанных гипотоническим раствором клеток млекопитающих после их фиксации 4%-ным раствором формальдегида, метанолом, ацетоном, 70%-ным этанолом или смесью метанола и ацетона 1:1, мы применили иной способ фиксации, который обычно используется для получения препаратов метафазных хромосом. Это -фиксация клеток в суспензии смесью метанола и уксусной кислоты 3:1 (МУК) с предварительной обработкой клеток гипотоническим раствором. Такой способ фиксации приводит к тому, что ядра клеток на препарате становятся значительно более плоскими, чем при использовании других способов фиксации, что значительно улучшает качество изображения при наблюдении препаратов в флуоресцентном микроскопе при большом увеличении, а гипотоническая обработка клеток приводит к повышению разрешения картины ФЦР.

На полученных нами изображениях можно выделить три наиболее характерных типа картон распределения сайтов включения ИДУ в ядрах клеток. В клетках с картиной репликации первого типа (тип А) со слабой и средней по насыщенности меткой наблюдалось большое число равномерно распределенных по ядру ФЦР в виде мелких фокусов размером 0.2-0.4 мкм, одиночных или сгруппированных в небольшие кластеры. В клетках с картиной репликации второго типа (тип Б) метка была настолько насыщена, что мелкие фокусы и их кластеры практически непрерывно заполняли все ядро. Третий тип картины репликации (тип В) был характерен тем, что мелкие фокусы были объединены в крупные кластеры, расположенные на значительном расстоянии друг от друга, и их число составляло несколько единиц на клетку. Клетки, не находящиеся в S-фазе, отличались полным отсутствием метки.

Сопоставив наблюдаемые нами типы картин репликации с картонами, полученными предыдущими авторами, мы пришли к заключению, что выявленные нами типы картин репликации А и Б, видимо, соответствуют картине 1, полученной ранее после формальдегидной фиксации (O'Keefe et al., 1992), наблюдаемой в клетках ранней S-фазы. Тип В картины репликации скорее всего соответствует ранее

1аблюдаемым картинам 4 и 5, характерным для средней и поздней S-фазы. Картины зепликации, соответствующие картинам 2 и 3, в которых отмечалась повышенная концентрация ФЦР вокруг ядрышек и вдоль ядерной мембраны, в наших опытах мы & наблюдали. Возможно, эти картины распределения ФЦР вошли, как составная 4асть, в картаны тепа Б и В, т.к. время включения метки в наших опытах значительно 1ревышало время 10 мин, использованное предыдущими авторами.

Элементарные субъединицы ФЦР

Гипотоническая обработка клеток с последующей фиксацией МУК позволили при использовании обычной (неконфокальной) микроскопии увидеть отдельные ;убъединицы ФЦР - мелкие фокусы диаметром 0.2-0.4 мкм - которые мы назвали 'мини-фокусами" репликации. Мини-фокусы располагаются в ядре либо одиночными точками, либо формируют кластеры, часто имеющие вид изгибающихся цепочек. Подобные картины наблюдались не только в клетках К562, но и в клетках человека других линий (HeLa, AT25BI, TTD1RO, XP25RO, MCF-7, MRC5), фиксированных МУК.

Сходные по размеру мини-фокусы можно наблюдать на конфокальном срезе печенного в ходе репликации ядра клетки MCF-7, фиксированной 4%-ным формальдегидом. Такая фиксация лучше всего сохраняет натавные репликатавные структуры, наблюдаемые в нефиксированных клетках (Hassan, Cook, 1993). Клетки MCF-7 были взяты ввиду того, что они растут непосредственно на предметном стекле, на котором и фиксируются без перевода в суспензию; это сохраняет природную морфологию клеток. Таким образом, можно сделать вывод, что обнаруженные нами мини-фокусы репликации не являются артефактами, вызванными примененным нами способом обработки и фиксации клеток.

Конформация вновь синтезированных хроматиновых фибрилл в S-фазных ядрах клеток человека. Применимость модели случайных блужданий для описания локального поведения хроматина в S-фазе

Для анализа реплицированных сегментов хромосом в S-фазных ядрах мы использовали методику мечения ДНК, включающую короткую (2 ч) предварительную инкубацию клеток с ФДУ, после чего в ростовую среду на 2 ч добавляли ИДУ. Чтобы убедиться, что короткая обработка клеток ФДУ не вызывает нарушения процесса репликации в наших экспериментальных условиях, мы проанализировали вид репликонов на расправленных на стекле нитях ДНК после лизиса клеток и иммунофлуоресцентной окраски включенного в ДНК ИДУ. Визуализированы двунаправленные репликоны нормального размера, образованные парами репликативных вилок, движущихся со скоростью 1-3 т.п.н./мин, что согласуется с

данными НДР для нормально пролиферирующих клеток млекопитающих (Liapunova, 1994). Следовательно, 2-х часовая предобработка ФДУ не вызывает видимых нарушений нормальной репликации.

На изображениях ядер S-фазных клеток с картаной репликации типа А, которые после включения ИДУ были обработаны гипотоническим раствором и зафиксированы МУК, были визуализированы реплицированные фибриллы толщиной 0.3-0.4 мкм, соответствующие по толщине фибриллам интерфазного хроматина (Manuetidis, Chen, 1990; Gilbert et al., 1995) и состоящие из мини-фокусов. Результаты произведенных с помощью компьютера измерений контурных длин этих фибрилл Ц и соответствующих им линейных расстояний h мевду центрами конечных для данной фибриллы мини-фокусов на 5-ти изображениях разных ядер показаны на рис. 2, а, где точки для величин h построены относительно L«, в целом сделано 400 пар измерений. Точность измерения L, и h (при повторном многократном измерении этих величин для одной и той же фибриллы) составляла ±20%. Наблюдаемая высокая вариабельность значений h для данного интервала L, позволяет предположить, что в ядрах ранней S-фазы фибриллы могут принимать различные конформации. Отличительной чертой случайной конформации хроматина является линейная зависимость квадрата среднего интерфазного расстояния между двумя точками на хромосоме от соответствующего геномного расстояния (van den Engh et al., 1992). Чтобы проанализировать, удовлетворяют ли данные рис. 2, а модели случайных блужданий, мы вычислили средние значения h для дискретных интервалов LK и построили квадраты средних значений h (<h>2) относительно соответствующих значений L„, усредненных в выбранных интервалах (рис. 2, б). Интервалы Ц были выбраны с использованием стандартного алгоритма (Lloyd, 1984) отдельно для данных,, полученных двумя независимыми исследователями (заполненные и пустые квадраты на рис. 2, б). Видно, что простейшая зависимость, которой можнс экстраполировать эти данные, это прямо пропорциональная зависимость межд> контурными длинами реплицированных фибрилл и соответствующими квадратаму средних интерфазных расстояний, описываемая линейной функцией <h>z=kLK, где к=\.525±0.135 мкм. Хотя полученные нами результаты могли бы бьт аппроксимированы и другими более сложными моделями, мы считаем, что нашь данные дают основания полагать, что локальная конформация реплицированных S фазных хромосомных фибрилл на данном уровне организации является случайной Это заключение согласуется с результатами ФГИС-анализа на GO/GI-хромосомах < использованием близко расположенных (на расстоянии 0.1-2 м.п.н.) космидных про! (van den Engh et al., 1992) и указывает на то, что вновь реплицированньи

хроматиновые фибриллы быстро принимают конформацию, характерную для хромосом клеток, находящихся в фазе СОЮ! клеточного цикла.

л г

Я

ГЦ

ГЦ

V

'А ..">/ • -

— * ! *

12

Ьк(шсм)

б

5ис. 2. Результаты морфометрического анализа реплицированных фибрилл в 5 щрах клеток человека (К562, МСР-7, АТ25В1) с картиной репликации типа А.

I - линейные расстояния между концами меченых фибрилл (И) построены относительно онтурных длин этих фибрилл (Ц).

I - линейные расстояния (И) усреднены для дискретных интервалов контурных длин (Ц) I квадраты средних линейных расстояний (<И>2) построены относительно средних начений Ц в выбранных интервалах для результатов, полученных двумя ¡езависимыми исследователями (заполненные и пустые квадраты)-

Ранее с помощью ФГИС на С0Л31-фазных клетках было показано, что оэффициент угла наклона прямой, представляющей график зависимости квадрата

среднего интерфазного расстояния <h>2 (van den Engh et a!., 1992), а также среднего квадрата интерфазного расстояния <h2> (Yokota et al„ 1995) от геномного расстояния для близко расположенных (0.15-2 м.п.н.) проб равен 1.9 мкмг/м.л.н. Геномное расстояние между двумя определенными точками на хромосомной нити прямо пропорционально контурной длине этого участка нити, и соответствующий пересчетный коэффициент отражает плотность упаковки ДНК при данном состоянии конденсации хромосом и способе их фиксации. Сделав предположение, что коэффициент угла наклона графика зависимости <h>2 от геномного расстояния L для вновь реплицированного хроматина для геномных расстояний 0.15-2 м.п.н. (калибровочный коэффициент для коротких расстояний) такой же, как для G0/G1-хроматина, т.е. равен 1.9 мкм2/м.п.н. (Yokota et al„ 1995), и зная коэффициент угла наклона графика зависимости <h>z от контурной длины хромосомной фибриллы Ц, можно вычислить плотность упаковки ДНК в реплицированной S-фазной хромосомной фибрилле - 0.80+0.07 м.п.н. (с учетом ошибки определения к) на 1 мкм Ц. Это значение соответствует коэффициенту упаковки ДНК по отношению к полностью релаксированной ДНК, равному 240-290, что хорошо согласуется с известным коэффициентом упаковки интерфазной ДНК 200-350, определенным ранее для GO/GI-клеток, фиксированных МУК (Lawrence et al., 1990). Поэтому, калибровочный коэффициент для коротких расстояний (1.9 мкм2/м.п.н.), определенный для GO/GI-клеток, оказывается справедливым и для реплицированного S-фазного хроматина.

Этот коэффициент и сделанная нами оценка плотности упаковки ДНК в реплицированных участках хромосомы позволяют анализировать содержание ДНК в ФЦР.

Оценка размеров мини-фокусов и содержания ДНК в них

Поскольку на фотографиях, полученных в световом микроскопе, мини-фокусы имеют округлую форму, мы измеряли диаметр мини-фокуса. Основная масса мини-фокусов имеет диаметр 0.2-0.4 мкм со средним значением 0.30±0.07 мкм (здесь v далее дается среднее значение со стандартным отклонением для 100 измерений для клеток, фиксированных МУК, и 0.31+0.09 мкм для клеток, фиксированны) формальдегидом.

Известно, что космидные пробы, в среднем содержащие 50 т.п.н. ДНК человека дают при ФГИС на интерфазном МУК-фиксированном ядре точку диаметром 0.3 мка (van den Engh et al., 1992). Это позволяет предполагать, что средний мини-фоку) может содержать около 50 т.п.н. ДНК.

Поскольку размер мини-фокуса близок к пределу разрешения световой микроскопии (0.25 мкм), это может создавать неточность при определении истинного размера такого объекта. Поэтому мы оценили содержание ДНК в мини-фокусе в более крупных по размеру объектах - цепочках, состоящих из 2-5 мини-фокусов. Среднее расстояние между центрами соседних мини-фокусов в цепочке равно 0.33+0.08 мкм. С учетом определенной нами плотности упаковки ДНК в S-фазных фибриллах это расстояние соответствует геномному расстоянию 264±64 т.п.н. Полагая, что среднее геномное расстояние между соседними мини-фокусами в цепочке больше или равно среднему содержанию ДНК одного мини-фокуса, мы можем заключить, что один мини фокус содержит в среднем <260 т.п.н. упакованной ДНК.

Кластеризация и число мини-фокусов в клетках

В нескольких клетках, находящихся в ранней и поздней S-фазе, мы сосчитали общее число мини-фокусов в клетке и проанализировали, как они распределены численно по кластерам. Оказалось, что в клетке, независимо от стадии S-фазы, число мини-фокусов варьирует от 500 до 1500. В клетках ранней S-фазы кластеры образованы из 2-12 мини-фокусов, при этом с увеличением размера кластера частота его встречаемости в клетке падает (рис. 3, о); непастеризованные мини-фокусы составляют 15-25% от общего числа мини-фокусов в клетке. В клетке поздней S-фазы наблюдается увеличение кластеризации до 40 мини-фокусов в кластере (рис. 3, в), и заметное уменьшение доли одиночных мини-фокусов (до 5% от общего числа).

Картина репликации в клетке с короткими репликонами

Отдельные мини-фокусы могут представлять собой отдельные малые репликоны, так как, во-первых, содержание ДНК в них соответствует известной из НДР величине малого репликона, во-вторых, количество мини-фокусов в клетке (500-1500) близко к половине числа одновременно функционирующих в клетке репликативных вилок (Hozak et al„ 1993). Интересно было поэтому посмотреть, как выглядят фокусы репликации в клетке с более короткими, чем в норме, репликонами.

Известно, что длительная (более 12 ч) инкубация клеток с ФДУ приводит к активизации множественных (обычно молчащих) сайтов начала репликации, отстоящих друг от друга на расстоянии около 12 т.п.н. (4 мкм), что означает то, что средний размер репликона уменьшается до 12 т.п.н. (Taylor, Hozier, 1976; Tomilin et al., 1993). Исходя из этого, клетки К562 инкубировали с ФДУ 16 ч перед добавлением ИДУ. Если бы мини-фокусы представляли собой отдельные репликоны, то при

12 Л 14 Я 30 72

12 1« Н 1» » Я

В

4 I I! II > » « 1 » с « а э > С

Рис. 3. Кластеризация мини-фокусов репликации в в-фазных клетках человека.

По оси абсцисс - число мини-фокусов в кластере; по оси ординат - абсолютная частота встречаемости кластера данного размера. Клетки К562 после инкубации в течение указанного времени с ФДУ, затем 2 ч в той же среде с добавлением ИДУ обработаны гипотоническим раствором и зафиксированы МУК. а - клетки в ранней Б-фазе, инкубированные 2 ч с ФДУ; б - клетки в ранней Б-фазе, инкубированные 16 ч с ФДУ; в - клетки в поздней Б-фазе, инкубированные 2 ч с ФДУ.

уменьшении релликона до 12 т.п.н. мы должны были увидеть резкое увеличение, по сравнению с нормальными клетками, числа мини-фокусов и уменьшение их размера. Поскольку 0.25 мкм представляет предел разрешения светового микроскопа, мы ожидали увидеть в этом случае отдельно стоящие мини-фокусы такого же вида, как в нормальных клетках, но вместо цепочек мини-фокусов - сплошные линии толщиной порядка 0.25-0.3 мкм, вместо кластеров другой формы - сплошные структуры без разрешения отдельных мини-фокусов. Однако, на полученных нами изображениях мини-фокусы формировали кластеры такого же вида, как и в клетках с репликонами обычного размера. Гистограмма, характеризующая кластеризацию мини-фокусов в ранней Б-фазе, имела такой же вид, как в нормальной клетке (рис. 3, б). Диаметр мини-фокусов (0.29+0.06 мкм) и число их в ФДУ-обработанных клетках с картиной репликации типа А были такими же, как в клетках, не обработанных ФДУ. Эти результаты дают право предположить, что отдельные мини-фокусы в кластерах представляют собой не функциональные единицы репликации (каковыми являются репликоны), а структурные единицы хроматина.

Известно, что в ядрах эукариотических клеток на всех этапах клеточного цикла присутствуют структурные элементы упаковки ДНК - петлевые домены хроматина, содержащие 10-180 т.п.н. ДНК (напр., Paulson, Laemmli, 1977; Vogelstein et al., 1980; Hancock, Boulikas, 1982; Pienta et al., 1989; Jackson et al., 1990; Cook, 1995). Наблюдаемые нами кластеризованные мини-фокусы сходны по содержанию ДНК и, возможно, представляют собой визуализированные с помощью репликативной метки петлевые домены хроматина. Однако, при этом некластеризованные мини-фокусы являются, по-видимому, одиночными малыми репликонами или начальными участками начавших репликацию больших репликонов.

Сравнительный анализ кластеров мини-фокусов и содержания ДНК в ФЦР, представляющих собой цепочки мини-фокусов, в разных клеточных линиях

Используя возможность подсчета числа мини-фокусов в кластерах в клетках, фиксированных МУК после гипотонической обработки, мы провели статистический анализ кластеров мини-фокусов в клетках с картинами репликации типа А и В в трех клеточных линиях: К562, AT25BI и TTD1RO. Клетки К562 не имеют мутаций, затрагивающих процессы репликации и репарации ДНК. Клетки AT25BI были получены у пациента с наследственным заболеванием Ataxia telangiectasia (AT). У этих клеток наблюдается чувствительность к рентгеновскому излучению, и при этом низкая чувствительность репликации ДНК к действию этого излучения (Jaspers et al., 1982). Ранее было высказано предположение, что в клетках AT нарушена синхронная инициация репликации в кластерах малых репликонов, и это уменьшает эффективный размер мишени для мутагенов на ДНК (Painter, Young, 1980). Клетки TTD1RO были получены у пациента с трихотиодистрофией - наследственным заболеванием, характеризующимся увеличением чувствительности клеток к УФ-облучению без увеличения предрасположенности к раку, при этом устойчивостью к рентгеновскому излучению (Broughton et al., 1994).

Анализ кластеров мини-фокусов в клетках с картанами репликации А и В указанных трех клеточных линий после 2 ч включения ИДУ показал, что в кластеризации мини-фокусов в клетках этих линий не наблюдается существенных различий (рис. 4, а, б). Клетки с картиной репликации А содержали 17-23% некластеризованных мини-фокусов и незначительное количество кластеров из более 12 субъединиц (рис. 4, а); клетки с картиной репликации В содержали 5-10% некластеризованных мини-фокусов и 25-50% мини-фокусов в кластерах из более 12 субъединиц (рис. 4, б). Взвешенное среднее число мини-фокусов в кластере

Рис. 4. Анализ кластеров мини-фокусов в клетках человека линий К562, АТ25В1

и ТТ01ИО с картиной репликации А (а) и В (б) после 2 ч включения ИДУ.

Перед добавлением ИДУ клетки инкубировали 2 ч в присутствии ФДУ, затем после гипотонической обработки фиксировали МУК.

По оси абсцисс - число мини-фокусов в кластере, по оси ординат - % мини-фокусов е кластерах указанного размера.

(с учетом доли мини-фокусов в кластере данного размера) для трех рассматриваемых линий клеток приведено в Таблице 1.

Таблица 1. Взвешенное среднее число мини-фокусов репликации в кластере* после 2 ч инкубации клеток в среде с меченым ДНК-предшественником для различных линий клеток

Линия клеток Клетки с картиной Клетки с картиной

репликации А репликации В

К562 4.8+1.46 13.6+4.01

АТ25В1 5.9+1.76 11.5±3.40

ТГОШО 5.1И.49 9.5+2.85

Среднее: 5.3+1.76 11.5+4.01

"рассчитано с учетом доли мини-фокусов в кластере данного размера от общего числа мини-фокусов в клетке (1\)„ = Б Ъ х 1\1„ где К -число мини-фокусов в кластере данного размера, Ъ - весовая доля суммарного числа мини-фокусов в кластерах данного размера от общего числа мини-фокусов в клетке). Для каждой линии проанализировано 3 клетки (по 150-200 кластеров мини-фокусов в каждой) и приведено среднее со стандартным отклонением по трем клеткам.

Наша оценка плотности упаковки ДНК в реплицированных участках хромосомной фибриллы (0.80±0.07 м.п.н./мкм) позволяет анализировать содержание ДНК в ФЦР, имеющих вид цепочек мини-фокусов. Мы исследовали распределение контурной длины таких фибрилл в клетках с картиной репликации А после 2 ч инкубации клеток с ИДУ. Была рассчитана взвешенная средняя длина реплицированных фибрилл (с учетом доли общей длины меченых фибрилл данного размера) для 3 ядер каждой линии, позволяющая вычислить взвешенное среднее содержание ДНК в указанных реплицированных фибриллах (Таблица 2).

Из табл. 2 следует, что оно составляет около 1 м.п.н. для каждой из трех проанализированных клеточных линий. Предполагая, что одна реплицированная за 2 ч фибрилла с видимыми терминальными элементами в обработанных гипотоническим раствором и фиксированных МУК клетках представляет собой один элемент репликации в Э-фазном ядре, эквивалентный известному единичному ФЦР в фиксированных формальдегидом клетках (№катига е! а!., 1986; О'КееГе е1 а1., 1992), можно сделать вывод, что взвешенное среднее содержание ДНК одного ФЦР после 2 ч мечения как в устойчивых, так и чувствительных к рентгеновскому излучению клетках человека ранней Э-фазы составляет примерно 1 м.п.н.

Таблица 2. Взвешенный средний размер реплицированных фибрилл после 2 ч инкубации клеток в среде с меченым ДНК-предшественником в клетках с картиной репликации А различных клеточных линий

Линия клеток Взвешенная средняя длина (мкм) меченых фибрилл* (Ц.) Взвешенное среднее содержание ДНК (м.п.н.) (1.ж х 0.8 м.п.н./мкм)

К562 1.22+0.33 0.98+0.27 .

АТ25В1 1.57+0.47 1.26±0.38

ТТ01НО 1.32±0.40 1.06±0.32

Среднее: 1.37+0.47 1.10+0.38

* рассчитана с учетом доли общей длины меченых фибрилл данного размера от общей длины меченых фибрилл в клетке (и = 2 ^ х Ц где и - среднее значение длины в данном диапазоне длин меченых фибрилл, 1/ - весовая доля общей длины меченых фибрилл, имеющих длину в данном диапазоне, от полной длины меченых фибрилл в клетке). Для каждой линии проанализировано 3 клетки (по 150-200 фибрилл в каждой) и приведено среднее значение со стандартным отклонением по трем клеткам.

Отсутствие различия в кластеризации мини-фокусов (в клетках с картинами репликации А и В) и содержании ДНК в ФЦР (в клетках с картиной репликации А) между чувствительными (АТ25В1) и устойчивыми (К562, "ГГОШО) к рентгеновскому излучению клетками указывает на то, что устойчивый к рентгеновскому излучению синтез ДНК в чувствительных к этому излучению клетках АТ25В1 не связан с изменением размеров единиц репликации в этих клетках, как предполагалось ранее.

Второй уровень организации Э-фазного хроматина, наблюдаемый на больших геномных расстояниях

Ранее полученные данные (Уоко\а е1 а!., 1995) показывают, что наклон графика зависимости между средним квадратом интерфазного расстояния (-Ф2>), а также квадратом среднего интерфазного расстояния (<Ь>2) и геномным расстоянием и в СОЛЗ 1 -клетках, фиксированных МУК, резко меняется для больших значений Угол наклона падаете 1.9 мкм2/м.п.н. для проб, разделенных менее чем 2 м.п.н., до 0.065 мкм2/м.п.н. для проб, отстоящих друг от друга на расстояние более 10 м.п.н., что говорит о наличии жестких ограничений (гигантских петель) на структуру хромосомы на больших расстояниях. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными с помощью ФГИС с пробами, "окрашивающими" целые хромосомы, показывающими, что хромосомы сохраняют свою глобальную форму и занимают определенные территории в СОЮ 1-ядрах (обзор: 2а!епзку, 1998), однако, дс

настоящего времени не было получено данных, показывающих, что такое глобальное расположение хромосом наблюдается и в S-фазных клетках.

В данной работе была проведена ФГИС биотинилированной пробы, включающей все уникальные последовательности Х-хромосомы, на клетках HeLa, инкубированных в присутствии БДУ. Биотин и БДУ были затем окрашены соответственно зеленым и красным цветом с применением иммунофлуоресцентной окраски и визуализированы с использованием конфокальной микроскопии. Обнаружено, что в ядрах как S-фазных (включающих БДУ), так и G0/G1 -клеток Х-хромосомы занимают ограниченные территории. Был определен средний максимальный размер Х-хромосом в S-фазных и G0/G1-клетках, и не найдено существенных различий между ними. Средний максимальный размер Х-хромосом в GO/GI-клетках составил 4.21+0.19 мкм, в S-фазных клетках - 4.25±0.21 мкм (среднее со стандартным отклонением для 35-ти измерений в GO/GI-клетках и 20-ти в S-фазных клетках), среднее значение для тех и других клеток составило 4.23+0.20 мкм. Это было близко к среднему максимальному расстоянию (4.5 мкм) в пределах GO/GI-хромосом 4 и 5 (Yokota et al., 1995), близких по длине в метафазе с Х-хромосомой (Morton, 1991). Это наблюдение говорит о том, что для больших геномных расстояний в S-фазном ядре, также как в GO/GI-ядре, существует более высокий уровень организации хроматина, для которого калибровочный коэффициент перехода от геномного расстояния к среднему квадрату интерфазного расстояния значительно ниже, чем для малых геномных расстояний. Следовательно, гигантские петли хроматиновых фибрилл, известные для GO/GI-хромосом, должны существовать и в S-фазных хромосомах.

Для гибридизации Х-хромосомы мы использовали клетки, фиксированные формальдегидом, но для больших геномных расстояний в GO/GI-клетках калибровочный коэффициент перехода от L к <h>2 примерно одинаков для клеток, фиксированных МУК и формальдегидом (Yokota et al., 1995).

Если предположить, что коэффициент угла наклона прямой, представляющей график зависимости <h>2 от L для больших геномных расстояний (больше 10 м.п.н.) такой же (0.065 мкм2/м.п.н., Yokota et al., 1995), как для GO/GI-хроматина, то можно построить этот график для больших L, проведя прямую через точку, определяемую размерами целой Х-хромосомы (для которой L=160 м.п.н. и определенная в нашем эксперименте длина 4.23 мкм), с указанным углом наклона (рис. 5). Точка пересечения графика этой зависимости с графиком зависимости <h>2 от L для малых расстояний находится в районе 5 м.п.н. геномной длины, и-это означает, что размер гигантских петель составляет около 10 м.п.н. Этот размер превышает ранее оцененный размер гигантских петель (3 м.п.н.) для GO/GI-клеток (Yokota et al., 1995),

L (м.п.н.)

Рис. 5. Зависимость квадрата среднего интерфазного расстояния (<h>2) от геномного расстояния (L) для реплицированных хромосомных фибрилл S-фазных клеток человека в широком диапазоне геномных расстояний.

но более близок к новой оценке размера этих петель - 6 м.п.н. (Liu, Sachs, 1997). Нужно отметить, что положение точки пересечения графиков двух указанных зависимостей очень сильно зависит от значения коэффициента угла наклона графика зависимости <h>2 от L для больших геномных расстояний, и действительный размер гигантских петель может отличаться от сделанной нами оценки. Для того, чтобы правильно оценить размер гигантских петель, необходим дальнейший анализ методом ФГИС на S-фазных ядрах с использованием проб, удаленных на геномные расстояния больше 10 м.п.н.

Временной анализ картины ФЦР в клеточном ядре

Кластеры синхронно активируемых малых или больших репликонов, начавшие репликацию, должны быть видны в S-фазном ядре после короткого импульсного включения нерадиоактивно меченного ДНК-предшественника. Мы сделали 5-минутный пульс БДУ, s течение которого одна пара репликатавных вилок, движущихся со средней скоростью 2 т.п.н./мин, синтезирует около 20 т.п.н. ДНК. Во флуоресцентном микроскопе такие меченые отрезки ДНК должны быть видны как отдельные точки около 0.3 мкм в диаметре (van den Engh et al„ 1992), или как пары

таких точек. Синхронно активированный кластер из нескольких малых или больших репликонов будет виден как один большой ФЦР, или будет представлять собой кластер отдельных близко стоящих мини-фокусов репликации. На полученных изображениях ядер клеток были визуализированы такие относительно большие ФЦР, что согласуется с тем положением, что кластеры одновременно функционирующих малых или больших репликонов действительно существуют. Однако, помимо больших ФЦР было видно большое число некластеризованных, иногда сдвоенных мини-фокусов, которые могут представлять собой: 1) малые некластеризованные репликоны, 2) члены кластера несинхронно активируемых малых или больших репликонов, вступившие в репликацию первыми, 3) короткие реплицированные участки некластеризованных больших репликонов.

Чтобы отличить кластеры синхронно активированных малых репликонов от других типов репликативных единиц, мы использовали экспериментальный подход, основанный на разном времени репликации малых и больших репликонов. Поскольку время репликации кластера синхронно функционирующих малых репликонов равно примерно 30 мин, то после двух последовательных продолжительных инкубаций (6090 мин каждая) с двумя различными мечеными предшественниками ДНК только незначительная доля больших ФЦР, представляющих собой кластеры синхронно активированных малых репликонов, будет содержать двойную метку. И наоборот, большинство больших репликонов, полностью удваиваивающихся за 3.5 часа, в этих экспериментальных условиях дожны включить оба меченых ДНК-предшественника.

В первой серии опытов сразу после первого одночасового мечения клеток ХДУ их помещали на 1 ч в среду с ИДУ и затем фиксировали. На изображениях клеток, находящиеся в средней S-фазе, при включении в ДНК in viva сначала ХДУ в течение 50 мин, а затем ИДУ в течении 60 мин основная часть доменов, включивших ХДУ, толностью перекрывается или соприкасается с доменами, включившими ИДУ.

При двумерной сегментации суммированного двумерного изображения и тоследующем сравнении полученной картины с картиной распределения каждой из иеток было определено, что около 60% всех ФЦР содержат обе метки и некоторые из чих определенно увеличиваются в размерах. Этот результат хорошо согласуется с данными, полученными Мандерсом и соавторами (Manders et al., 1996) при грехмерной сегментации конфокальных трехмерных изображений клеток, меченных л vivo сначала 5 мин ИДУ, затем 5 мин ХДУ, с 60-минутным интервалом между включениями меток, в течение которого клетки культивировали в среде с немеченым гимидином. Полученный результат показывает, что: 1) неконфокальный двумерный анализ плоских клеток, фиксированных МУК, произведенный в настоящей работе, триводит к тем же выводам, что и трехмерный конфокальный анализ клеток,

фиксированных формальдегидом, выполненный Мандерсом и соавторами (Manders et al., 1996), 2) две метки оказываются пространственно сближенными не только при 70-минутной общей продолжительное™ интервала времени между началом и окончанием мечения клеток обоими предшественниками ДНК (5+60+5 мин), использованной Мандерсом и соавторами, но и при общей длительности мечения 120 мин, использованной в настоящей работе, 3) длительность синтеза ДНК в одном пространственно едином ФЦР существенно превышает 60 мин и может быть даже больше 120 мин. Как установлено Мандерсом и соавторами (Manders et al., 1996), при репликации ДНК in vivo, вновь синтезированная ДНК активно или пассивно перемещается, удаляясь от зон её синтеза, и наши результаты показывают, что длительность такой транслокации ДНК, т.е. длительность непрерывного синтеза её в одной зоне синтеза, составляет более 60 мин.

Во второй серии опытов клетки метили по схеме ИДУ in vivo 90 мин - биотин-ДУТФ in vitro 90 мин. При таком способе мечения клеток локализация обеих меток в большинстве ядер почти полностью совпадает. По-видимому, в пермеабилизованных клетках нарушен процесс транслокации ДНК из зон её синтеза, что приводит к сближению реплицированных доменов ДНК, включивших первую и вторую метки.

В пермеабилизованных клетках скорость движения репликатавных вилок, как известно, значительно меньше, чем in vivo. Для клеток, пермеабилизованных стрептолизином О, скорость включения биотин-11-ДУТФ составляет 0.26 скорости включения ДТТФ, но синтез после пермеабилизации клеток продолжается в течение 2 ч (Hassan, Cook, 1993). Поэтому, количество ДНК, включившей метку после пермеабилизации клеток в наших опытах, должно соответствовать количеству ДНК, которое синтезируется в течение по крайней мере 20 мин при репликации in vivo. Таким образом, средняя длительность синтеза ДНК в одном ФЦР составляет более 90 мин.

Полученные результаты можно сопоставить с существующими данными о структуре репликатавных единиц в клетках млекопитающих. Эти результаты противоречат общепринятой модели организации репликатавных единиц (Hand, 1978), согласно которой главными единицами репликации в клетках млекопитающих являются кластеры синхронно активируемых малых репликонов, так как, по нашим данным, синтез ДНК в большинстве ФЦР продолжается больше 90 мин, о чем особенно наглядно свидетельствуют результаты опытов с двойной меткой по схеме in vivo/in vitro. При двойном непрерывном мечении клеток in vivofm vivo пространственная близость доменов ДНК, включивших первую и вторую метки, также прослеживается достаточно четко, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными о неслучайной пространственной близости ФЦР, выявляемых при двух

последовательных 5-минутных импульсных мечениях клеток двумя предшественниками ДНК с промежуточной 60-минутной инкубацией клеток в среде эез меченого предшественника (Manders et al., 1996). Можно предположить, что такая пространственная близость ФЦР, выявляемых с помощью двух меток, связана с тем, что при импульсном мечении обе метки включаются в различные участки одного и того же ФЦР, средняя часть которого остается немеченой. Наши результаты подтверждают такую возможность.

Результаты проведенного в настоящей работе анализа репликативных единиц в 3-фазном ядре в целом не противоречат представлению о больших репликонах, как основных единицах синтеза ДНК (Uapunova, 1994), хотя формально и не подтверждают это представление, поскольку не могут провести различие между большими репликонами и кластерами асинхронно активируемых малых репликонов, которые наблюдались в некоторых работах с применением метода НДР (обзор: Edenberg, Huberman, 1975). Соседние асинхронно активируемые малые репликоны надо рассматривать как независимые единицы репликации, и, если они действительно существуют и составляют значительную долю репликативных единиц, это должно сильно уменьшать средний размер репликативных единиц в клетке, что противоречит данным цитогенетики и радиобиологии, показывающим, что репликатавные единицы в клетках млекопитающих имеют средний размер 1-3 м.п.н. (Stubblefield, 1975; Painter, Young, 1975). Данные, полученные нами, могут быть также интерпретированы и в рамках модифицированной КМР-модели репликации ДНК, согласно которой соседние КМР активируются не независимо один от другого. Это может происходить таким образом, что активация одного из них вызывает последующую активацию соседнего КМР, а она, в свою очередь, приводит к активации следующего рядом стоящего КМР, и т. д. В этом случае основными единицами репликации должны считаться группы соседних КМР. Теоретически такую возможность исключить трудно, но, учитывая то обстоятельство, что большинство существующих радиоавтографических данных о малых репликонах являются артефактами (Liapunova, 1994), мы считаем, что в настоящее время более обоснованным является представление о долгоживущих больших репликонах как основных единицах репликации ДНК в клетках млекопитающих. "Эта модель организации единиц репликации ДНК не исключает и существования в клетке некоторого числа изолированных или сгруппированных малых репликонов, репликация ДНК которых может осуществляться особенно в ранней S-фазе, когда реплицируются эффективно транскрибирующиеся гены (Liapunova, 1994). Результаты настоящей работы также не исключают наличия в клетке небольшой доли кластеров малых репликонов, функционирующих синхронно. Однако, согласно результатам

наших экспериментов с двойной репликативной меткой основную массу единиц, реплицирующихся в средней S-фазе, представляют отдельные или сгруппированные большие репликоны (более 300 т.п.н.), ДНК которых синтезируется в течение длительного времени (более 90 мин). Это и вызывает видимое смещение

г:

синтезированной ДНК в опытах Мандерса и соавторов с двойным мечением клеток /л vivo (Manders et al., 1996).

Точную длительность синтеза ДНК в одном ФЦР еще предстоит определить. По оценкам Ляпуновой (Liapunova, 1994) для средних по величине репликонов, эта длительность составляет 3-4 ч, однако нам эта величина представляется несколько завышенной, поскольку при 3-часовом интервале между двумя 15-минутными импульсами мечения большинство доменов ДНК, включивших первую и вторую метки, в S-фазном ядре пространственно разобщены (Manders et al., 1992). По-видимому, длительность синтеза ДНК в одном ФЦР, скорее всего, составляет 2-3 ч, и тогда при суммарной средней скорости движения двух репликативных вилок 4 т.п.н./мин средний размер репликонов должен быть 500-750 т.п.н.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован метод иммунофлуоресцентной визуализации фокальных центров репликации в ядрах клеток млекопитающих, в результате этого повышены качество и разрешение наблюдаемой картины включения репликативной метки, что позволило анализировать структуру S-фазных элементарных хромосомных фибрилл.

2. Фокальные центры репликации состоят из субъединиц - мини-фокусов репликации со средним диаметром 0.3 мкм, которые являются структурными единицами организации хроматина, соответствующими по содержанию ДНК (<260 т.п.н.) известным петлевым доменам хроматина.

3. В нормально пролиферирующих клетках человека локальная конформация вновь реплицированных элементарных хромосомных фибрилл соответствует модели случайных блужданий с коэффициентом упаковки хроматина 240-290 или 0.80±0.07 м.п.н. на 1 микрон контурной длины указанных фибрилл.

1. Фокальные центры репликации весьма гетерогенны по содержанию ДНК, и значительное их количество содержит менее 150 т.п.н., однако средневесовое значение (Lw) для клеток ранней S-фазы различных клеточных линий после 2 ч мечения соответствует примерно 1000 т.п.н.

5. Макроструктура Х-хромосом в S-фазных клетках не отличается от таковой в G0/G1-клетках, и гигантские петли элементарных хромосомных фибрилл существуют на протяжении S-фазы. Таким образом, модель случайных блужданий/гигантских петель, предложенная для хроматина GO/GI-клеток, применима и для хроматина S-фазных клеток.

5. Основная масса ФЦР в клетках человека удваивает ДНК в течение 1.5-3 ч, что противоречит общепринятой модели синхронной репликации кластеров малых (около 100 т.п.н.) репликонов и указывает на существование значительного числа больших репликонов (более 300 т.п.н.), одиночных или объединенных в небольшие (из 2-3) группы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Svetlova М., Solovjeva L„ Stein G., Chamberland С., Vig В. and Tomilin N. The structure of human S-phase chromosome fibers // Chromosome Res. 1994. Vol. 2. P. 47-52.

2. Tomilin N„ Solovjeva L, Krutilina R., Chamberland C., Hancock R„ Vig B. Visualization of elementary DNA replication units in human nuclei corresponding in size to DNA loop domains II Chromosome Res. 1995. Vol. 3. P. 32-40.

3. Tomilin N.V., Solovjeva L., Svetlova M., Chamberland C., Vig В., Hancock R. 1995. Organization of DNA replication units in human chromosomes // An International Conference "Chromosome Segregation and Aneuploidy", Sorrento, Italy, April 24-29,

1995. Abstract book, p.33.

4. Solovjeva L.V., Rozanov Y.M., Tomilin N.V. 1995. Units of DNA replication in human S-phase nucleus // Meeting on "Eucaryotic DNA Replication", Cold Spring Harbor, New York, USA, September 6-10,1995. Abstract book, p. 183.

5. Tomilin N., Solovjeva L., Svetlova M., Hancock R., Price G., Zannis-Hadjopoulos M.

1996. Three types of the DNA replication units in mammalian S-phase nucleus II The 4m McGill Conference "Regulation of Eukaryotic DNA Replication", St.Sauveur, Quebec, October 17-20,1996. Abstract book, abstract No. 56.

6. Tomilin N., Solovjeva L., Svetlova M„ Rosanov Yu., Chamberland C., Hancock R„ Vig B. Organization of DNA replication units in human chromosomes II Proceedings on Chromosome Segregation and Aneuploidy. Edited by A. Abbondandolo, B.K.Vig, R. Roi. 1ST: Genova. 1996. P.151-163.

7. Соловьева Л.В., Светлова М.П., Крутмлина Р.И., Розанов Ю.М., Штейн Г.И., Томилин Н.В. Единицы репликации ДНК в S-фазных клетках человека // Цитология.

1997. Т. 39 (2/3). Стр. 138-149.

8. Соловьева Л.В., Томилин А.Н., Розанов Ю.М., Плескач Н.М., Чагин В.О., Томилин Н.В. Организация репликативных доменов в S-фазных ядрах клеток человека II Цитология, 1998, Т. 40 (8/9). Стр. 791-797.

9. Solovjeva L., Svetlova М., Stein G., Chagin V., Rozanov Yu., Zannis-Hadjopoulos M., Price G. and Tomilin N. Conformation of replicated segments of chromosome fibres in human S-phase nucleus II Chromosome Research (в печати).