Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация биодеградативных путей у родококков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Организация биодеградативных путей у родококков"

На правах рукописи

СОЛЯНИКОВА Инна Петровна

ОРГАНИЗАЦИЯ БИОДЕГРАДАТИВНЫХ ПУТЕЙ У РОДОКОККОВ

специальность 03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино, 2007

003164325

Работа выполнена в лаборатории энзиматической деградации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Головлева Людмила Алексеевна Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кулаковская Татьяна Валентиновна Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

доктор биологических наук, профессор Мальян Александр Нерсессович Институт фундаментальных проблем биологаи РАН

доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна Институт микробиологии РАН

Ведущая организация' Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита состоится^0> года в часов мин на заседании

Диссертационного совета Д 002 121 01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН по адресу. 142290, г Пущино Московской области, проспект Науки, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г К Скрябина РАН Автореферат размещен на сайте Ьйр/Уигогиг Лрш ги

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук В М Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние десятилетия в окружающую среду попало огромное количество промышленных отходов, сельскохозяйственных химикатов и продуктов их частичной трансформации, не имеющих аналогов или редко встречающихся в природе. Это оказало огромное влияние на все уровни организации живой материи и, без сомнения, нарушило то равновесие, которое создавалось на протяжении миллионов лет

Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость различных классов ксенобиотиков, мы выбрали для изучения процессов деградации гало-генированные моноароматические производные фенола и бензоата с одним-тремя заместителями Эти соединения широко используются при производстве пластика, жидкостей для тушения огня, красителей, гербицидов, фунгицидов, растворителей и др Так, в Финляндии с 1934 по 1988 г было использовано около 30 ООО тонн различных хлорфенолов [Kitunen et al, 1987, Kitunen, 1990], До 300 г хлорированных фенольных соединений (фенолы, катехолы, гваяколы, сиринголы и ванилины) образуется на одну тонну пульпы при ее хлорном отбеливании, что привело к их накоплению порядка микрограмм на литр воды и миллиграмм на один кг (сухой вес) донных отложений в озерах, принимающих обработанные сливы fSalkmoja-Salonen et al, 1981] Исследования in vitro показали, что хлорфенолы разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают микросомальную детоксификацию, влияют на синтез белков и РНК [Lundberg et al, 1980, Erhch et al, 1987, Prxston et al, 1987]

Физико-химические методы обезвреживания либо не обеспечивают детоксификацию хлорфенолов, либо чрезвычайно дороги по сравнению с биологическими (электронно-лучевой метод подготовки питьевой воды, считающийся одним из наиболее эффективных и надежных, требует 5 kBt-4/mj при производительности 50 м3/ч [Строкин, 2007]) То же касается сжигания хлорфенолов, - при недостаточно высокой температуре неизбежно образуются неизмеримо более токсичные полихлордиоксины, а проведение процесса при необходимо высоких температурах делает весь процесс дорогостоящим

Составляя основу круговорота углерода в биосфере, бактерии являются перспективными объектами для решения проблем рационального природопользования, а именно 1) создания технологий эффективного обезвреживания отходов на стадии производства, что будет препятствовать попаданию в окружающую среду вредных соединений, и 2) создания технологий и методов обезвреживания токсикантов, уже попавших в окружающую среду Только энзиматическое дегалогенирование позволяет получать безопасные продукты разложения галогенированных фенолов

Вышесказанным обусловлена необходимость всестороннего изучения ферментативных процессов разложения ксенобиотиков Такой подход позволяет не только интенсифицировать микробную деградацию трудно разлагаемых соединений, но способствует пониманию процессов эволюции путей метаболизма, что, в свою очередь, может служить основой для лабораторного создания био-деградативных путей и отдельных ферментов с заранее заданными свойствами

Исторически изучение микробного разложения ксенобиотиков начали с грам-отрицательных бактерий, преимущественно псевдомонад Однако более

1

поздние исследования грам-положительных бактерий показали, что их метаболический потенциал не ниже, чем у микроорганизмов других групп, а ряд физиологических отличий, в частности, устойчивость к стрессовым воздействиям и способность к длительному периоду метаболической активности, делают их перспективным объектом как для изучения фундаментальных вопросов (например, изучение основ субстратной специфичности ферментов), так и в прикладном аспекте Все это, плюс широкое распространение бактерий рода Rhodococcus в почве, и, самое главное, - способность разлагать широчайший круг абиотических соединений, определило наш интерес к этой группе бактерий

Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первые этапы разложения разнообразных ароматических соединений микроорганизмами приводят к образованию ограниченного числа ключевых интерме-диатов, дальнейшее превращение которых проходит по нескольким метаболическим путям. Одним из ключевых интермедиатов является пирокатехин [Omston, 1966], его разложение по opmo-xsym последовательно катализируют пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО), муконатциклоизомераза (МЦИ), муконолактонизомераза и еноллактонгидролаза При росте микроорганизмов на галогенированных субстратах помимо пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-путя обнаружен второй фермент, расщепляющий 3-хлорпирокатехин, -хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (ХПК 1,2-ДО) [Dorn, Knackmuss, 1978а, Schmidt et al, 1980] Было показано, что трансформацию 3-хлорпирокатехина в ß-кетоадипат у Pseudomonas sp. В13 осуществляют ХПК 1,2-ДО, хлормуконатциклоизомераза (ХМЦИ), диенлактонгидролаза (ДЛГ) и малеил-ацетатредуктаза (MAP) Этот путь назвали модифицированным орто-иутш [Schlomann, 1994] Данные работы можно считать началом разностороннего изучения ферментов разложения (хлор)пирокатехинов и это было одним из - немногих результатов, полученных к началу наших экспериментов Дальнейшие исследования, относящиеся с девяностым годам, также проводились в основном на грам-отрицательных бактериях [Pieper et al., 1985, 1988] Установлено, что гены, кодирующие ферменты модифицированного орто-пути у грам-отрицательных бактерий, организованы в опероны сходной структуры и характеризуются высокой степенью идентичности Показано, что ферменты, катализирующие аналогичные реакции разложения, характеризуются рядом общих свойств, тем не менее, субстратная специфичность ферментов находится в прямей зависимости от тех субстратов, которые являются ключевыми интермедиатами при разложении ксенобиотиков [van der Meer et al, 1991a,b] Предпринятая позже попытка методом сайт-направленного мутагенеза изменить субстратную специфичность (хлор)муконатциклоизомераз у грам-отрицательных. бактерий не дала однозначных результатов [Vollmer et al, 1998, Kaulmann et al , 2001]. Также ничего не было известно о пространственной структуре хлорпирокатехаз из грам-отрицательных бактерий, остался открытым вопрос об основах различий субстратной специфичности этих ферментов На- момент начала нашей работы практически ничего не было известно о ферментах разложения хлорпирокатехинов у родококков, но, учитывая их способность проявлять метаболическую активность, можно было предполо-

жить, что эта группа микроорганизмов представляет несомненный интерес для исследователей с точки зрения изучения влияния токсикантов на живые системы

Цель настоящей работы.

В связи с обозначенными предпосылками, целью работы явилось изучение организации биодеградативных путей бактерий рода Rhodococcus для выявления биохимических и молекулярных основ метаболической активности штаммов-деструкторов устойчивых поллютантов

Для достижения поставленной цели было необходимо выполнение следующих задач-

1. Оценка способности бактерий рода Rhodococcus разлагать или трансформировать незамещенные и замещенные ароматические соединения

2 Установление путей разложения ксенобиотиков наиболее активными штаммами родококков

3 Оценка активности, выделение и характеристика ферментов, участвующих в разложении бензоата, 4-метил-, 4-хлорбензоата, фенола, 2-хлор-и 4-хлорфенола у родококков

4 Сравнительный анализ структурных и каталитических особенностей ферментов, участвующих в разложении ксенобиотиков у родококков

5 Клонирование и секвенирование генов, кодирующих ферменты разложения хлорфенолов у родококков.

6 Кристаллизация хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и расшифровка трехмерной структуры ферментов

7 Выявление факторов, определяющих различия субстратной специфичности интрадиольных диоксигеназ, раскрывающих кольцо орто-дигидроксибензолов

Научная новизна работы. Проведен широкий поиск среди представителей грам-положительных бактерий po^-Mtedoceccus на способность разлагать галогенированные ароматические соединения и отобраны наиболее

Изучены процессы разложения 2- и 4-хлорфенолов, бензоата, фенола, 4-метилбензоата штаммами R opacus lcp, R ruber Р25, R rhodnn 135, R rhodochrous 89. Показано, что при использовании в качестве ростового субстрата каждого из эти соединений у родококков происходила индукция уникального набора ключевых ферментов, в первую очередь диоксигеназ, которые по субстратной специфичности можно разделить на три группы -пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного opmo-пути, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных opmo-путей, метилпирокатехин 1,2-диокси-геназы Впервые всесторонне охарактеризованы ферменты разложения 4-хлорпирокатехина 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатцикло-изомераза, диенлактонгидролаза штамма R opacus lcp Показано, что по физико-химическим и каталитическим свойствам они значительно отличаются от аналогичных ферментов из грам-отрицательных бактерий

Исследовано разложение 3-хлорпирокатехина у R opacus lcp, что позволило обнаружить новый модифицированный орто-путъ, который до сих

пор в литературе не описан Клонирован оперон, кодирующий ферменты 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-пути у штамма R opacus lcp Сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ключевые ферменты, показало, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа и хлормуконатциклоизомераза из R opacus lcp ближе к аналогичным ферментам обычного ор/ио-пути грам-положительных бактерий, чем к хлорпирокатехазам модифицированного орто-пуш грам-отрицательных бактерий

Изучены свойства муконатциклоизомеразы обычного орто-иути штамма R rhodochrous 89 и установлено, что этот фермент отличается по субъединичному составу и свойствам от всех известных муконатциклоизомераз и занимает промежуточное положение между аналогичными ферментами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий

Впервые изучено превращение 2-галомуконата (фтор-, хлор-) (хлор)му-конатциклоизомеразами грам-положительных бактерий - реакция, которую можно считать определяющей при характеристике ферментов этого класса Обнаружены их существенные отличия от ферментов из грам-отрицательных бактерий Показано, что муконат- и хлормуконатциклоизомеразы из R opacus lcp способны выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата, что приводит к образованию 5-галомуконолактона Реакцию превращения 5-гало-муконолактона в г/ис-диенлактон у R opacus lcp при росте на 2-хлорфеноле катализирует новый фермент, хлормуконолактондегалогеназа, аналог которого отсутствует в модифицированных орто-путях грам-отрицательных бактерий Обнаружена необычная способность муконатциклоизомеразы из штамма R rhodochrous 89 осуществлять превращение 2-хлормуконата, 2-хлор- и 5-хлормуконолактона в г/ие-диенлактон, а не в его игранс-изомер, что характерно для грам-отрицательных бактерий

Впервые методом рентгено-структурного анализа расшифрована пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного ор/ио-пути штамма R opacus lcp на основании разработанного нами способа получения высокоочищенных препаратов этих ферментов и наличия их полной аминокислотной последовательности Показано, что каждый фермент состоит из двух каталитических доменов и одного связующего центрального домена, содержащего две молекулы фосфолипидов Установлено, что структура центральной части каталитических доменов не отличается от таковой других интрадиольных диоксигеназ и содержит атом трехвалентного железа, пятикоординированный двумя остатками гистидина, двумя остатками тирозина и гидроксилом воды Тем не менее, в структуре активного центра обнаружены дополнительно по молекуле бензоата (у 4-ХПК 1,2-ДО) и бензогидроксамата (у 3-ХПК 1,2-ДО) Проведенное сравнение структур активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО позволило сделать предположение, что разница в субстратной специфичности этих ферментов опосредуется парами измененных аминокислотных остатков в той части, которая отвечает за связывание фермента с субстратом, прежде всего Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО/4-ХПК 1,2-ДО)

Практическое значение работы. Проведенные нами исследования позволили создать коллекцию наиболее активных штаммов, способных

разлагать устойчивые галогенированные поллютанты - хлор- и фторфенолы, 1Ш5рбигаоатыттШ5рбифёнил^ и 4-хлорфенолов получены

штаммы, адаптированные к высоким концентрациям токсикантов и характеризующиеся высокой скоростью их разложения Ряд результатов - изучение особенностей процессов биодеструкции хлорфенолов штаммом R opacus 1ср, разработка способов интенсификации процесса разложения токсикантов в биореакторе, возможность на основании полученных данных по пространственной структуре молекул методом сайт-направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью - позволяет создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистка загрязненных территорий, а также оптимизировать процессы биореме-диации и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные ксенобиотики

Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ и в лекциях для молодых ученых на Всероссийских конференциях, организуемых Пущинским Научным центром

Связь работы с крупными научными программами. Результаты, представленные в данной работе, были получены в ходе выполнения исследований, проведенных в рамках тем приоритетные направления АН СССР 0203 «Микробная деградация пестицидов», проектов программы ГНТП СССР/Министерства Науки РФ «Новейшие методы биоинженерии» (основное направление «Биотехнология защиты окружающей среды»), тем ИБФМ РАН «Новые микроорганизмы и ферментные пути для биоремедиации загрязненных сельскохозяйственных угодий» (№ гос per 01 86 0 009 296), «Клеточные механизмы разложения неприродных и высокоустойчивых природных соединений базидиомицетами и коринеподобными бактериями» (№ гос Per 0120 0403401), проектов РФФИ № 98-04-49393-а, № 05-04-49659, РФФИ-Наукоград 04-04-97266, РФФИ-Урал № 07-04-97625, международных грантов NATO Linkage Grant HT 951032, NWO РФФИ-Нидерланды № 047 007.021, INCO Copernikus (ERCIC15CT960103, ICA 1999-10046), DAAD (1992-1994, 2004), DFG N436 Rus 113/59/0, РФФИ-Германия ННИО_а № 99-04-04002

Апробация результатов и публикации. Результаты данной работы были представлены для обсуждения на международном конгрессе по химии пестицидов (Гамбург, Германия, 1990, Вашингтон, США, 1994), на втором всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991), третьем международном симпозиуме по биологии и биотехнологии псевдоманад (Триест, Италия, 1991), на ежегодных конференциях немецкого микробиологического общества (1993, 1994, 2000гг), на 94-й конференции американского микробиологического общества (Лас Вегас, США, 1994), на конференции «Биотехнология защиты окружающей среды» (Пущино, 1994), на международном рабочем семинаре EERO «Энзиматические и генетические аспекты биотехнологии окружающей среды» (Пущино, 1995), на международном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и биотехнологии» (Пущино, 2000), на конференции «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), на конференции «Подготовка специалистов-биотехнологов для пред-

приятий и организаций России» (Пущино, 2004), на второй европейской конференции «Оксиферменты» (Неаполь, Италия, 2004), на международных конференциях «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, Россия, 2005), INCOMID-2005 (Пермь, Россия, 2005) и «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск-Раков, Беларусь, 2006) А также на ежегодных Отчетных сессиях ИБФМим Г К.Скрябина РАН (1998-2006)

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы Работа изложена на страницах, содержит 54 таблицы и 67 рисунков Список литературы включает 494 наименований, из них 474 - публикации в иностранных журналах

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту дбн, профессору, заслуженному деятелю науки РФ JI.A Головлевой за многолетнюю помощь и поддержку, коллегам, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях дбн. Е. Л Головлеву, к.б н |0 В Мальцевой!, к б н В М.Травкину, к б н OB Моисеевой, к б н. М П Коломыцевой, асп. О.В Лисняк, студентке ММ Суворовой, лаборантам ГЙЗахаровой, ННЗемской, другим сотрудникам института, помогавшим в проведении исследований, а также сотрудникам ИГЭМО (г Пермь) к б н Е Г Плотниковой, к б н ДО Рыбкиной, асп Е С Шумковой

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В обзоре описаны основные пути разложения ключевых интермедиатов ((галогенированных)пирокатехинов, протокатехоата, гидроксигидрохинона), образующихся при бактериальной деструкции ароматических соединений с упором на (гало)фенолы, 2,4-Д, (хлор)бифенилы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Реактивы, используемые для приготовления минеральных сред, были аналитической чистоты («Реахим», СССР). Биохимические реактивы были получены от фирм «Sigma» (США) и «Serva» (Германия) З-Ме-тилпирокатехин - «Koch-Light» (Англия); 4-метилпирокатехин - «Fluka» (Швейцария) Монофторированные фенолы были получены от фирмы Janssen Chimica (Бельгия), ди-, три- и тетрафторфенолы, 2- и 4-хлорфенолы - от фирм Aldnch (Steinheim, Германия) и Fhiorochem (Derbyshire, Великобритания) Реактивы для электрофореза в полиакриламидном геле - от «Bio-Rad» (США).

Микроорганизмы. В данной работе использованы следующие микроорганизмы штамм Rhodococcus opacus lcp, способный использовать бензоат, 4-хлорфенол (4-ХФ) и 2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ), был выделен из накопительной культуры, поддерживаемой в течение нескольких месяцев с 2,4-ДХФ [Горлатов с соав., 1989] Вариант данного штамма, растущий на 2-хлорфеноле (2-ХФ) и 3-хлорбензоате (3-ХБК), получен после длительной адаптации к указанным субстратам [Моисеева с соавт., 1999] Штамм R rhodochrous 89 выделен из песчаной почвы соснового леса в пойме реки Волга,

штамм Rhodococcus rhodmi 135 выделен методом накопительных культур из почвы, загрязненной нефтью, дизельным топливом и хлорфенолами, штамм Rhodococcus opacus IG выделен методом накопительных культур из почв, загряз-ненных нефтью, в районе Самары, штамм Rhodococcus ruber Р25, выделен из почв, загрязненных галогенированными ароматическими соединениями [Плотникова с соавт, 2006]

Для культивирования родококков использована минеральная среда следующего состава (г/л) Na2HP04 0 7, КН2Р04 0 5, NH4NO3 0 75, MgS04 х 7Н20 0 2; MnS04 0 001, FeS04 002 Для получения биомассы проводили периодическое культивирование штаммов в 10-ти литровом биореакторе с объемом среды 7-7,5 литров Субстраты вносили дробно по 50-250 мг/л За ростом культур следили по снижению потребления кислорода, изменению значения pH и изменению оптической плотности клеточной суспензии pH ростовой среды поддерживали на уровне 7 0-7 2 периодическими внесениями 0 1 M NaOH Для выделения ДНК R opacus lcp выращивали при 30°С в минеральной среде, pH 7.2 [Dorn et al, 1974] с двойной концентрацией фосфатного буфера, содержащей 20 г/л глицина и 2 г/л глюкозы Штамм Р putida PRS2000 [Ornston, 1966] выращивали в той же среде без глицерина и глюкозы, но с 5 мМ бензоата натрия в качестве источника углерода и энергии Е coli DH5a выращивали на LB среде [Sambrook et al, 1989] с 100 цг/мл ампицилина при 37°С Для приготовления бесклеточных экстрактов штамм R opacus lcp выращивали на бензоате, пара-толуате, 2-хлорфеноле и 4-хлорфеноле, штаммы R rhodochrous 89, R opacus IG и R rhodnu 135 - на феноле, R ruber P25 - на 4-хлорбензоате (4-ХБК), иара-гидроксибензоате и пара-:толуате Биомассу размораживали, к клеточной суспензии добавляли дитиотреитол и MnS04 до конечной концентрации 0,1 и 2 мМ, соответственно Разрушение клеток проводили экструзионной дезинтеграцией на ИБФМ-прессе с рабочим давлением 3200 кГ/см2 или на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (США) мощностью 150 Вт при 20 кГц в течение 30 мин

Активность ферментов определяли на спектрофотометрах Shimadzu UV-160 (Япония) или Kontron Uvikon 810 Р (Германия) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см при 25 °С Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение одного цмоль субстрата или образование одного р.моль продукта в минуту Относительную активность рассчитывали, принимая за 100 %-ную активность с незамещенным или с лучшим субстратом Активность ферментов с фторированными субстратами определяли методом фтористого ядерно-магнитного резонанса на приборе Bruker DPX 400 Химические сдвиги соединений рассчитывали, принимая за ноль пик CFCI3 В качестве внутреннего стандарта использовали 4-фторбензоат Анализ продуктов превращения хлорированных и фторированных соединений методом ВЭЖХ проводили на Waters M600-PDA хроматографе с Waters 996 фотодиодным детектором, используя обращенно-фазовые колонки Alltima С]8 размером 4 6 х 150 мм (Alltech, Нидерланды) и Grom SIL 100 С8 («Grom», Германия) размером 4 6 х 125 мм Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц определяли электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS по модифицированному методу Лэммли [Laemmli, 1970] на пластинах с 10, 12 или

15%-ным акриламидом в разделяющем геле Гель окрашивали по модифицированному методу Меррила [Merril et al, 1981] Для калибровки использовали стандартные наборы низко- или высокомолекулярных белков фирмы «Sigma» (США) Молекулярную массу нативных белков определяли электрофорезом в ПААГ и гель-фильтрацией на колонке Superóse б (HR 10/30) Для электрофореза использовали готовые пластины Mmi-Protean II («Bio Rad») с 4-20% полиакриламидным градиентом в 0.375 М Tns-HCl, pH 8 8 N-концевую аминокислотную последовательность белков определяли после нанесения белка на пластину с ПААГ-SDS, проведения электрофореза и электропереноса на мембрану Immobilon Р («Millipore», США) Мембрану окрашивали Кумасси R-250, белковую линию вырезали Определение аминокислотной последовательности проводили на приборе Applied Biosystems модель 473 А Аминокислотный состав белков определяли после гидролиза 6 N HCl (110°С, 24 ч) на аминокислотном анализаторе Waters PICO-TAG [Bidlingmeyer et al, 1984] Очистку ферментов проводили с использованием носителей и колонок фирм Pharmacia (Швеция) и Toyo-Soda (Япония), используя установки "BioPiloí" и "FPLC" фирмы Pharmacia DEAE-Toyopearl 650М (180-240 мл), Sephacryl S-200 (250 мл), Q-Sepharose FF (20 мл), Q-Sepharose HP (60 мл), Superóse 6, Superóse 12 (25 мл), Superdex 75 (120 мл), Superdex 200 (120 мл), MonoQ 10/10 (6 мл), Mono Q 5/5 (1 мл), Resource Q (6 мл), Resource Iso (1 мл), Resource Phe (1 мл), Phenyl Superóse HR 10/10 (8 мл), Butyl-Sepharose (20 мл), для концентрирования белков использовали ячейки для ультрафильтрации фирмы «Amicon» объемом 10, 50 и 250 мл, размер пор мембран варьировал от 10000 до 30000 Для кристаллизации 4-ХПК 1,2-ДО использовали фермент, очищенный по обычной схеме из 100 г биомассы Для первоначальных опытов использовали Hampton Research Crystal Screen и Crystal Screen 2, используя метод сидячей капли 1 рл белкового раствора (20 мг/мл) в 20 мМ Tns-SOí, pH 7,2, в смеси с 1 |дл резервного раствора уравновешивали против 500 цл преципитирующего раствора Для кристаллизации З-ХПК 1,2-ДО использовали белок, очищенный согласно обычной схеме Начальную кристаллизацию проводили в Hampton Research Crystal Screen I и II методом сидячей капли Для этого 1 ¡JJi белкового раствора (15 мг/мл) в 20 мМ Tris-SOi, pH 7,2, смешивали с равным объемом резервного раствора и уравновешивали против 50 |лл преципитирующего раствора в плашках Chiyschem на 96-ячеек Результаты, позволившие получить кристаллы, в дальнейшем были оптимизированы Рентгено-структурный анализ кристаллов 4-ХПК 1,2-ДО проводили на приборе Bruker, используя вращающийся анодный источник, сопряженный с IK CCD детектором, используя дифракцию при 3 5 Á Полный набор данных при 100°К были получены в программе EMBL beamline BW7A в DORIS, DESY (Гамбург, Германия) Данные были получены с MAR CCD детектором и длиной волны 1,01 Á Данные рассчитывали с использованием программы DENZO SCALEPACK [Otwinowski & Minor, 1997]. Рентгено-структурный анализ кристаллов З-ХПК 1,2-ДО проводили при 100°К на X-ray дифракционном Beamline Elettra синхротроне (Триест, Италия), используя длину волны 1,01 Á Данные получали с MAR CCD детектором с максимальным разрешением 2,0 Ä

Геномную ДНК выделяли по стандартной процедуре [Eulberg et al, 1997] Плазмидную ДНК из Е coli DH5a выделяли с помощью набора Pharmacia Flexiprep Векторную ДНК, разрезанную одной рестриктазой, дефос-форилировали перед лигированием Для клонирования продукта ПЦР Т-вектор готовили как описано Марчуком с соавт [Marchuk et al., 1991]. Фрагменты ДНК для лигирования или метки дигогсигенином выделяли из геля с использованием набора Easy Pure (Biozym) Компетентные клетки готовили из Е coli DH5a, последующую трансформацию проводили по методу Иное с соавт [Inoue et al, 1990] Наличие вставки ДНК определяли на чашках с LB, содержащей 0,13 мМ IPTG и 32 цг X-Gal, по цветовому признаку Для проведения ПЦР использовали олигонукяеотиды, синтезированные на основе определенной N-концевой последовательности ферментов и одного из внутренних пептидов, полученного после обработки трипсином и разделения методом ВЭЖХ. Реакционная смесь (50|ол) содержала 50 пмоль каждого праймера,

0.5 цг геномной темплатной ДНК, 25 (jM каждого из дезоксинуклеозидтри-фосфата, 1х ПЦР буфер (MBI Fermentas), 2,0 Ед Tag полимеразы (MBI Fermentas), 3 мМ MgCl2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах

Из почв по признаку роста на 3-ХБК, 2,4-Д и 4-хлорфеноле было выделено около 50 культур, в дальнейшей работе использовали два штамма, идентифицированные по данным 168рнк-ДНК анализа как Rhodococcus sp 1 и Rhodococcus sp 2

Из коллекции д б н Е Л Головлева (ИБФМ РАН), насчитывающей порядка 500 штаммов нокардиоподобных микроорганизмов, ауксанографи-чески было проверено около 20 наиболее перспективных культур из группы Rhodococcus, растущих на ароматических соединениях, при этом основное внимание уделялось хлорированным фенолам и бензоатам Определено, что бактерии рода Rhodococcus разлагали широкий спектр ароматических соединений в качестве единственного источника углерода и энергии Так, практически все штаммы росли на твердой минеральной среде с бензоатом, фенолом. Два штамма росли на агаризованной среде с толуолом Поддерживали рост большинства из проверенных штаммов метилированные субстраты - пара-крезол и иара-толуат В скобках - оценка роста по пятибальной шкале Штамм Rhodococcus minimus la рос на бензоате (4), и-гидроксибензоате (5), и-толуате

(4), анисовой (5), феруловой (5) кислотах, 2-хлорфеноле (2), 2,4-Д (3) Для штамма R opacus 1G показана вариабельность роста на феноле, бензоате (2-4), и-оксибензоате (ПОБК) (2-3), и-крезоле (0-4) Штамм R opacus 6а в качестве единстенного источника углерода использовал З-Хлорбензоат (3-ХБК) (3), 2,4,6-трихлорфенол (2), феруловую кислоту (5). Широкий спектр ароматических субстратов окисляли штаммы Rhodococcus rhodochrous 172 (фенол (5), бензоат

(5), и-гидроксибензоат (4), фталат (5), терефталат (3), и-толуат (4), ацетофенон (5), анисовая к-та (5), нафталин (5), и-крезол (3), 2-хлорфенол (2), 4-хлорфенол (3), 2,4-Д (3), 3-ХБК (4)), Rhodococcus opacus 557 (фенол (5), бензоат (4), м-

гидроксибензоат (3), ПОБК (4), анисовая (4), феруловая (4) к-ты, «-крезол (2), фталат (4), вцетофенон (3), 2,4-Д (3), 3-ХБК (4)), Rhodococcus ruber Р25 (бифенил (5), 2-хлорбифенил (3), 4-хлорбифенил (4), 4-ХБК (3), и-толуат (5), п-гвдроксибензоат (5), фенантрен (1), антрацен (1)). Штаммы родококков 172 и 412 росли на нафталине.

В жидкой минеральной среде с ароматическими субстратами в качестве единственного источника углерода и энергии не все культуры были способны давать значительное увеличение плотности без добавления легко усваиваемых источников питания. В первую очередь это относится к таким соединениям, как 2-ХФ, 2,4-Д и 3-ХБК.

На рисунке 1 показаны кривые роста некоторых из проверенных родококков на бензоате, пара-толуате, феноле. Рост на бензоате сопровождался самой короткой лаг-фазой. Практически у всех культур, растущих на и-толуате, была продолжительная лаг-фаза. Наиболее быстро росли на этом субстрате штаммы 172, 400, 6а - оптическая плотность достигала максимума менее, чем за 48 часов.

Штамм Rhodococcus opacus lcp использовал в качестве единственного источника углерода и энергии широкий набор ароматических соединений, в том числе 2,4-дихлорфенол, фенол, бензоат, «-крезол, 4-хлорфенол (4ХФ). Изначально R. opacus lcp не был способен к росту на 2-хлорфеноле (2ХФ), рост на 4ХФ рост сопровождался увеличением оптической плотности до 0,2-0,25 ед при 560 нм, если концентрация токсиканта не превышала ] 00 мг/л, увеличение концентрации вносимого 4ХФ приводило к ингибированию роста культуры. В результате проведенной адаптации к 4ХФ штамм R. opacus lcp не проявлял признаков ингибирования роста при концентрации субстрата 200 мг/л, суммарная концентрация потребленного субстрата в условиях периодического культивирования в биореакторе составила порядка 4 г/л за 48-52 ч (Рис. 2).

Рисунок 2. Кривые роста неадаптированного (1) и адаптированного (2) штамма R. орасш 1ср при культивировании в колбах. Увеличение оптической плотности при периодическом культивировании штамма 1 ср в биореакторе (3).

20 40

ВО 100 120

Адаптация R. орасиэ 1ср привела к появлению 2ХФ4 фенотипа. В процессе культивирования на хлорированных фенолах была обнаружена морфологическая неоднородность состава популяции - выявлено две морфологически и физиологически отличающиеся формы с лабильным переходом между ними под действием токсических факторов.

» и

Рисунок 1. Рост родококков: R. opacus 557 (1), Rhodococcus sp. 400 (2), R. rhodochrous 172 (3), R. opacus 6a (4), R. minimus la (5), R. opacus 1G (6) на ароматических субстратах.

Клетки R. opacus lcp, поддерживаемые на 2-ХФ в качестве единственного источника углерода, при высеве на МПА образовывали колонии одинаковой гладкой формы (S1), имеющие розовую окраску с ровной и слегка блестящей поверхностью. Через 10-15 пересевов при культивировании исходного штамма на МПА происходило появление шероховатых форм (R) такого же розового цвета. При культивировании S-форм на хлорфенолах дальнейшей диссоциации не происходило.

Шероховатая форма, выращиваемая на хлорфенолах, давала расщепление на шероховатую R и гладкую S1 формы на 8-10 сутки культивирования. S-формы оказались наиболее приспособленными к росту на хлорфенолах, более интенсивно осуществляя их разложение, а R-форма - к росту на среде, содержащей легко усваиваемые источники углерода. В литературе описана гетерогенность популяции и R-S диссоциации у корине- и нокардиоподобных бакте-

рий [Ames et al, 1968, Милько E С , Егоров, 1991] Показана зависимость способности родококков утилизировать ароматическую фракцию арабской сырой нефти от морфотипа колоний [Iwabuchi et al, 2000,2002, Iwabuchi et al, 1997]

Мы показали, что длительный рост на хлорфенолах привел к адаптации штамма к токсичному субстрату, при этом изменялись как физиологические, так и морфологические характеристики клеток.

2. Конверсия фторфенолов родококками

Процессы разложения галогенированных соединений изучали, используя различные методы физико-химического анализа образующихся метаболитов Одним из наглядных и удобных является метод спектроскопии фтористого ЯМР, который позволяет использовать целые клетки родококков для анализа метаболизма ортио-фторированных ди- и трифторфенолов Субстраты и характер их превращения родококками представлены в таблицах 1,2

Таблица 1 Разложение фенолов, выход фтор-иона и накопление фторированных интермедиатов при инкубации родококков с различными орто-фторированными фенолами Время инкубации - 2 часа Абиотическое

Субстрат и его R opacus 1G, R rhodnu 135, R rhodochrous R opacus

производные % % 89, % lcp, %

2,3-дифторфенол

Остаток фенола 55 26 74 74

Выделенный Б" 26 38 9 16

Б в интермедиатах 19 36 17 10

2,4-дифторфенол

Остаток фенола 49 46 75 66

Выделенный К 42 53 11 32

Б в интермедиатах 9 1 14 2

2,5-дифторфенол

Остаток фенола 30 0 82 61

Выделенный Р 57 90 3 35

Б в интермедиатах 13 10 15 4

2,3,4-трифторфенол

Остаток фенола 43 12 90 80

Выделенный Б" 31 35 3 13

Б в интермедиатах 26 53 7 7

2,3,5-трифторфенол

Остаток фенола 63 59 94 66

Выделенный ¥" 23 38 4 34

¥ в интермедиатах 14 3 2 0

2,4,5-трифторфенол

Остаток фенола 65 19 94 79

Выделенный Б" 28 79 5 21

Б в интермедиатах 7 2 1 0

Таблица 2 Состав метаболитов при инкубации штаммов родококков с о/даго-фторированными ди- и трифторфенолами За 100% принято общее количество фторированных продуктов (за исключением фторфенола и фтор-иона)

Фторированные метаболиты Я орасш Я гкоАпи К гкос/оскгои.! К орасш

Ю,% 135,% 89, % 1ср,%

2,3-дифторфенол

3-фторпирокатехин 81±2 50±3 5±3 11±3

3,4-дифторпирокатехин 16±1 23±5 87±6 0

2-фтормуконат Ы 24±2 0 58±4

2,3-дифтормуконат 0 1±1 5±3 0

неизвестные 2±1 2±1 3±2 31±2*

2,4-дифторфенол

4-фторпирокатехин 47±30 - 5±3 -

3,5-дифторпирокатехин 16±8 - 94±3 -

3-фтормуконат 0 - 0 -

2,4-дифтормуконат 0 - 1±1 -

неизвестные 37±37* - 0 -

2,5-дыфторфенол

4-фторпирокатехин 64±9 9±9 0 1±1

3,6-дифторпирокатехин 0 12±12 47±5 2±1

3-фтормуконат 0 0 0 0

2,5-дифтормуконат 0 74±17 53±5 17±6

неизвестные 36±9* 5±5 0 80±7*

2,3,4-трифторфеноп

3,4-дифторпирокатехин 81±1 79±1 0 7±4

3,4,5-трифторпирокатехин 19±1 21 ±2 100±0 3±2

2,3-дифтормуконат 0 1±1 0 0

2,3,4-трифтормуконат 0 0 0 39±8

неизвестные 0 0 0 51±2*

2,3,5-трифторфенол

3,5-дифторпирокатехин 98±1 78±5 - -

3,4,6-трифторпирокатехин 0 2±2 - -

2,4-дифтормуконат 0 1±1 - -

2,3,5-трифтормуконат 0 5±5 - -

неизвестные 2x1 14±9 - -

2,4,5-трифторфено ч

4,5-дифторпирокатехин 95±2 - - -

3,4,6-трифторпирокатехин 0 - - -

3,4-дифтормуконат 0 - - -

2,3,5 -трифтормуконат 0 - - -

неизвестные 5±2 - - -

Примечание * Превращение 2,3-Дифтор- и 2,3,4-трифторфенола приводило к образованию основного метаболита, дающего сигнал при сдвиге -189 9 ррш и минорного при -196 6 ррш, для 2,4- и 2,5-дифторфенолов - основной метаболит регистрировался при сдвиге -90 3 ррш и минорные при сдвигах -100 3 и -113 2 ррт (2,4-дифторфенол) и -126 1 и -113 2 ррт (2,5-дифторфенол)

Выявленные существенные различия в превращении фторфенолов родококками заключаются как в количестве образующихся интермедиатов, так и в их природе Так, у штамма Я орасш Ш фенолгидроксилаза (ФГ) преимущественно осуществляла гидроксилирование фенолов во втором положении,

что, сопровождаясь дефторированием, приводило к образованию соответствующих фторпирокатехинов, доля которых преобладала среди других интермеди-атов Это указывало на лимитирующую роль ПК 1,2-ДО

Для штамма Я гкосЬт 135 закономерностей в природе и уровне накапливающихся интермедиатов выявлено не было Разложение 2,3-дифтор-фенола приводило к накоплению пирокатехинов и муконатов (Рис. 3) Разложение 2,3,4- и 2,3,5-трифторфенолов происходило с преимущественным накоплением фторпирокатехинов, утилизация 2,5-дифторфенола сопровождалась накоплением фтормуконатов В то же время, при разложении 2,4-дифтор- и 2,4,5-трифторфенолов значительного накопления фторированных интермедиатов не наблюдалось. Окислительное дефторированное в С2 преобладало над гидроксилированием в С6 положении Отмечена закономерность - если на первом этапе разложения окислительное дефторирование преобладает над гидроксилированием в €6 положении (2,3,4- и 2,3,5-трифторфенолы), наблюдалось накопление пирокатехинов В случае преимущественного гидроксили-рования в С6 положении (2,5-дифторфенол) происходила аккумуляция муконатов Таким образом, разложение фторфенолов Я rhodn.ii 135 определялось активностью ФГ и ПК-ДО, а лимитирующий этап в их превращении был связан с активностью ферментов, превращающих муконаты

Штамм Я гИоскзскгоив 89 весь спектр фторфенолов разлагал с накоплением разнообразных метаболитов Региоселективность ФГ обуславливала преимущественное гидроксилирование в С6 по сравнению с С2 положением

Обнаруженные отличия штамма Я орасш 1ср по метаболитному профилю выражались в накоплении большого количества неидентифицированных фторированных метаболитов Отличие от других штаммов выражалось также в более высоком уровне накопления муконатов по сравнению с пирокатехинами Лимитирование в данном случае происходило на более поздних этапах Региоселективность ФГ зависела от заместителей в ароматическом кольце Как и ФГ из Я гкойпи 135 и Я орасш Ш, фермент из Я орасш 1ср был способен катализировать окислительное дефторирование, например, 2,3-дифторфенола (табл. 1,2)

Анализ динамики разложения фторфенолов штаммами родококков показал, что только после полного исчезновения исходного субстрата количество накопленных интермедиатов начинало снижаться, сопровождаясь элиминацией фтор-иона (табл. 2, рис. 3)

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о достаточно широкой специфичности ферментов начальной атаки у родококков

3. Активность ферментов в бесклеточных экстрактах

Определена активность ключевых ферментов превращения (галогени-рованных) пирокатехинов В таблице 3 приведена активность ПК 1,2-ДО в бесклеточных экстрактах, полученных при выращивании штамма Я орасш 1ср на различных ароматических субстратах Нами показано, что скорость разложения 3-ХПК у Я гкос1осЬ.го№ 89, Я гИо/Зпи 135, Я орасш 1ср, выращенного на 2-ХФ и 4-метилбензоате, а также, взятого для сравнения

ррт -120 -140 Й15 480

Рисунок 3. 19Р ЯМР спектры превращения 2,3-дифторфенола (а) Я. орасих Ю, (Ь) К. гкоЛпи 135, (с) К. орасш 1ср.

Таблица 3. Удельная (относительная) активности ПК 1,2-ДО в бесклеточных экстрактах штамма Я.орасиз 1ср, выращенного на разных субстратах_

Субстрат для ПК-ДО Ростовой субстрат

Бензоат 2-ХФ 4-ХФ 4-МБК

ПК 3-ХПК 4-ХПК 3,5-ДХПК 0.079 (100%) 0.002 (2.5%) 0.0025 (3.15) 0.0015 (1.9%) 0.0227(100%) 0.0139(50.6%) 0.007 (26%) 0.066(100%) 0.010(15%) 0.060 (91%) 0.011 (17%) 0.53(100%) 0.15(29%)

штамма Р pitida 87, выращенного на 3-ХБК, примерно одинаковы, однако, было непонятно, является ли это результатом индукции нескольких диокси-геназ или определяется специфичностью одного фермента Выделение и очистка ферментов позволили выяснить количество диоксигеназ в каждом случае

4. Ферменты обычного орто-иута, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus 1ср на бензоате

Было проведено изучение ключевых ферментов обычного opwo-пути разложения пирокатехина (рис. 4), индуцирующихся при росте штамма на нетоксичном субстрате, в данном случае - на бензоате Эти исследования послужили отправной точкой и одновременно «контролем» для изучения свойств ферментов, индуцирующихся при росте R opacus lcp на галогени-рованной ароматике Была обнаружена активность ПК 1,2-ДО и муконатцикло-изомеразы (МЦИ) Определение относительной активности ПК 1,2-ДО с пирокатехином и замещенными пирокатехинами показало, что хлорированные субстраты расщепляются на уровне, не превышающем 3,2% от уровня превращения пирокатехина (табл. 3) Относительные скорости превращения 3-и 4-метилпирокатехинов по отношению к пирокатехину составили, соответственно, 99 и 88%

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа в результате очистки разделялась на два пика, обозначенных как ПК Д01-1 и ПК Д01-2 Удельная активность ПК ДО 1-1 составила 12 ед/мг белка, степень очистки - 151 раз Удельная активность ПК ДО 1-2 составила 11 ед/мг белка, степень очистки - 136 раз Для всех дальнейших экспериментов использовали препарат ПК Д01-1 с более высокой удельной активностью ПК Д01 была охарактеризована как гетеродимер, с молекулярной массой 67 кДа и субъединичной молекулярной массой 35 и 33 кДа

Определение субстратной специфичности ПК ДО показало, что активность с ПК 3-МПК 4-МПК составляла, соответственно, 100 98,7 87,5% Активность с хлорированными пирокатехинами не превышала 2% по сравнению с активностью с пирокатехином Кы для пирокатехина была 3,3 10"6 М, для 4-ХПК -17,6 10"6 М рН оптимум ПК-ДО равнялся 7,8, температурный оптимум - 35°С Муконатциклоизомераза характеризовалась высокой термостабильностью при 60°С. Субъединичная молекулярная масса равнялась 40 кДа Лучшим субстратом для нее был незамещенный цис,цис-муконат (Табл. 4) Скорость превращения других субстратов была минимум в три раза ниже И хотя значения Кы для всех проверенных субстратов, за исключением 3-хлормуконата, были одного порядка, наивысшее значение константы специфичности было рассчитано для цис, г/ые-муконата

МЦИ осуществляла превращение 2-хлормуконата с образованием единственного продукта - 5-хлормуконолактона (5-ХМЛ) Не было обнаружено тирамс-диенлактона ни спектрофотометрически, ни методом ВЭЖХ (+)-5-ХМЛ, используемый в качестве субстрата для МЦИ, превращался в 2-хлормуконат (+)-2-Хлормуконолактон (2-ХМЛ) не являлся субстратом для МЦИ

Таким образом, изучение особенностей роста штамма R opacus lcp на бензоате показало, что утилизация данного субстрата сопровождается индукцией ферментов, относящихся к обычному орто-пути - двух ПК 1,2-ДО и МЦИ

фенол

фгшлгждеэхек-«ыа

.он

rtnpoKS-rexiEH

лфккахеяш

ÖÖO' (f* 00,0'

мухокег

KJ

00'

Ф

j муквналяктои-¡нэдахергз»

cq0'

О шшшш

ек»лл»ктак. \ «Сфвлма

ООО" ооо"

$ tuiffa«-l>4ftiitnin

ÖH

Jv0H

j |f 4.1Пор0И{юкегвгИ!1

яиц «Еа^еш 1^.диок<яаеназа

iQ* СОО'

J З-хлермуконат

I $чи«}*9гх«»*-

1

ТОО*

. 4-ХЛ0|Ик^К0К0-

ЛЙДТОД

СГ

Чкс-даияяавгон ккеяяактон-

О4

З-свсоедипйг

маяеияацетаг-р e^xTxsa.

f

Ц£ОСЛ Тр0Кар&ЗИ!ЖЫ!Г КИСК9Г

Рисунок 4. Пути орото-расщепления (хлор)пирокатехинов (А) — обычный орто-путь, (В) - 4-хлорпирокатехиновая ветвь модифицированного орто-пути

У грам-отрицательных бактерий при росте на бензоате может индуцироваться несколько изоферментных ПК 1,2-ДО три у Pseudomonas arvilla C-l [Nakai et al, 1990], по две у Acmetobacter Iwoffii К24 [Kim et al, 1997], Frateuria sp ANA-18 [Aoki et al, 1984; Murakami et al, 1999], Acmetobacter radioresistens [Briganti et al, 2000] и две муконатциклоизомеразы у Frateuria sp ANA-18 [Murakami et al, 1998], а при росте на 3-хлоранилине Pseudomonas acidovorans СА28 и на 3-хлорбензоате Р putida 87 и Pseudomonas sp В13 были обнаружены ПК 1,2-ДО и ХПК 1,2-ДО [Hmterregger et al, 1992, Dorn & Rnackmuss, 1978a]

Таблица 4. Субстратная специфичность МЦИ из Л орасш 1ср, выращенного на бензоате _

Субстрат Утях (Ед/мг белка) Кса1 (мин1)8 ксаг !КМ (цМ1 мин-1)

цис, г/ис-муконат 81,3±14 36,9±3,9 1480 18,2

2-хлор-муконат 55,9±0,1 5,4±0,1 216 3,9

3-хлормуконат 1240±694 13,2±б,8 528 0,4

2-метилмуконат 66,7±23,6 3,0±0,5 120 1,8

3-метилмуконат 48,7±10,7 4,8±0,5 192 3,9

2,4-дифтормуконат <0,01®

а Значение кса, рассчитывали на основании молекулярной массы равной 40 кДа, 6 по данным ВЭЖХ 2-фтормуконат при концентрации 0,5 мМ не ингибирует активность ХМЦИ с 3-хлормуконатом в концентрации 0,2 мМ.

Охарактеризованные нами ферменты штамма К орасж 1ср на первый взгляд по каталитическим свойствам были типичными представителями обычного орто-пути, однако их существенным отличием от аналогичных ферментов грам-отрицательных бактерий была способность МЦИ выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата

5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма Я. орасия 1ср на 4-ХФ

Определение активности ферментов в бесклеточном экстракте Я орасш 1ср, выращенного на 4-хлорфеноле, показало наличие всех ферментов модифицированного орто-щш, ранее описанного для грам-отрицательных бактерий, - диоксигеназы, проявляющей высокую активность не только с пирокатехином, но и с хлорированными субстратами, ХМЦИ, активной только с хлорированными муконатами (Табл. 5) Необычной была активность ДЛГ -транс-диенлактон почти не гидролизовался данным ферментом

Таблица 5 Активность ферментов модифицированного орто-пут у штамма Я. ораст 1ср, выращенного на 4-хлорфеноле (4-ХФ) и 2-хлорфеноле (2-ХФ)

Фермент Субстрат для определения активности Активность удельная (ед/мг белка) и относительная при росте штамма на

4-ХФ 2-ХФ

ПК-ДО Пирокатехин 3-ХПК 4-ХПК 3,5-ДХПК 0,066 (100%) 0,010 (15%) 0,060 (91%) 0,011 (17%) 0,0227 (100%) 0,0139 (50 6%) 0,007 (26%) 0

МЦИ Муконат 2-ХМ 3-ХМ 0,004 (4,3%) 0,068 (73,1%) 0,093 (100%) 0 0,046 (100%) 0

ДЛГ транс- диенлактон ¡¿ис-диенлактон 0,016 (3,4%) 0,471 (100%) 0,0019 (1%) 0,194(100%)

МАР Малеилацетат (ТЧАОН) Малеилацетат (МАОРН) 0,643 (59,8%) 1,076 (100%)

Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, индуцирующаяся при росте Я орасш 1ср на 4-хлорфеноле (4ХПК 1,2-ДО) была адаптирована к разложению субстратов, несущих заместители в пара-положении, что подтверждается значениями константы специфичности, которые на порядок выше для пара-замещенных пирокатехинов по сравнению с л<е»ш-замещенными субстратами (Табл. 6) Данный факт указывает на высокую адаптацию ХГЖ 1,2-ДО к расщеплению именно 4-ХПК - интермедиата разложения 4-ХФ 3-ХПК -интермедиат разложения 2-ХФ - расщеплялся данным ферментом не очень эффективно, хотя, скорее всего, этот этап не являлся бы "узким местом" деградации 2-ХФ вариантом штамма Я орасш 1ср, выращенным на 4-ХФ

Таблица 6 Субстратная специфичность 4-ХПК-ДО из Я орасш 1ср Значения £са1 были рассчитаны, исходя из субъединичной массы 26,5 кДа _

Км или К', V ' шах, к-г-лъ ксгц/Км

Субстрат /иМ % 1ШП"' тт"' рМ'1

пирокатехин 22,3 100 268 12

3 -хлорпирокатехин 2 14 36 18

4-хлорпирокатехин 1,2 95 253 211

З-метилпирокатехин 27 208 557 21

4-метилпирокатехин 4,2 242 648 154

3 -фторпирокатехин 5,7 12 33 6

4-фторпирокатехин 9,5 212 269 28,3

3 -метоксипирокатехин 22,2 19 51 2,3

3,5-дихлорпирокатехин 1,2 18 49 41

3,6-дихлорпирокатехин 6,8 5 14 2

4,5-дихлорпирокатехин 1,9 5 14 7

3,4,5-ТХПК 0,7* - - -

3,4,5,6-ТетХПК 0,6* - - -

Ингибиторный анализ показал, что пирокатехины, содержащие в своем составе три или четыре атома хлора, являются конкурентными ингибиторами 4-ХПК 1,2-ДО, при этом их отличает высокое сродство к данному ферменту Хлор- и метилпроизводные фенола, аналоги пирокатехинов, также оказывали ингибирующее действие на изучаемый фермент (Табл. 7) Тип ингибирования был определен как конкурентный Самыми сильными ингибиторами были трихлорфенолы Замена галогена на метальную группу снижает сродство соединения к ферменту

Хлормуконатциклоизомераза, выделенная из биомассы Я орасш 1ср, выращенного на 4-ХФ (ХМЦИ), не превращала 2-хлормуконата в транс-дшв-лактон - реакцию, обычную в метаболизме 3-ХПК ферментами модифицированного орто-щ-ш грам-отрицательных бактерий, однако эффективно циклои-зомеризовала ряд муконатов, отдавая предпочтение 2,4-дихлор- и 3-хлор-муко-натам (Табл. 8) З-Хлор-г/ис, 1/мс-муконат, как показано, превращался ХМЦИ в цис-диенлактон

Таблица 7. Константы ингибирования 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО из II

Ингибитор К„ мкМ

4-ХПК-1,2-ДО 3-ХПК-1,2-ДО

Пирокатехин 4-ХПК Пирокатехин

фенол 1800 2000 91

2-хлорфенол 38 35 0 55

3-хлорфенол 70 80 1 02

4-хлорфенол 150 150 30 7

2,4-дихлорфенол 6 11 0 23

2,5-дихлорфенол 6 н о. 0 127

2,6-дихлорфенол 11 н о. 1 43

3,4-дихлорфенол 15 н о 0.44

3,5-дихлорфенол 41 н.о 0 026

2,4,5-трихлорфенол 1.1 5 0.297

2,4,6-трихлорфенол 09 н о 34

2-метилфенол 1566 1750 535

3-метилфенол 943 720 46

4-метилфенол 878 600 65 4

Таблица 8 Субстратная специфичность ХМЦИ из Я орасш 1ср, выращенного на 4-хлорфеноле____

Субстрат Км (цМ) ^тах (Ед/мг белка) kcat (мин"1)" kcat ¡Км (цМ"1 мин'1)

цис, г^ис-муконат 6997±134 6,5±0,1 260 0,037

2-хлор-муконат 312±35 3,3±0,3 132 0,42

3-хлормуконат 173±12 90,9±3,3 3640 21,0

2,4-дихлормуконат 119±26 33,5±5,6 1340 11,3

2-метилмуконат 47±11 0,084±0,007 3,4 0,072

3-метилмуконат 66±0,1 1,2±0,01 48 0,73

3-фтормуконат 52±10 9,1 ±0,7 364 7,0

2-фтормуконат « <0,03

"Значение кса1 рассчитывали на основании молекулярной массы равной 40 кДа, 6 по данным ВЭЖХ 2-фтормуконат при концентрации 0 5 мМ не ингибирует активность ХМЦИ с 3-хлормуконатом в концентрации 0 2 мМ

Диенлактонгидролаза из Л орасш 1ср, выращенного на 4ХФ (ДЛГ), была очищена за 4 этапа в 93 раза Конечный препарат имел удельную активность 30 ед/мг белка, выход по активности составил 19% ДЛГ представляла собой мономер с массой ЗОкДа и была активна с г/иодиенлактоном (Ки = 28 рМ, кса, = 923 мин"1) и 2-хлор-г/ис-диенлактоном (Км = 2,2 цМ, кса, = 1190 мин"1) Константа специфичности ДЛГ для 2-хлордиенлактона, который является интермедиатом разложения 4ХФ, была почти в 17 раз выше, чем для незамещенного аналога и в 564 раза выше, чем для 2-метил-г/ис-диенлактона

Активность ДЛГ с »граяс-диенлактоном была меньше 0,5% от активности с г^мс-изомером. По предложенной классификации, эта ДЛГ относилась ко второй группе ферментов [8сЫбтапп, 1994].

Превращение 2-хлормуконата ХМЦИ, выделенной из 4ХФ биомассы.

ХМЦИ превращала 3-хлор- и 2,4-дихлормуконаты в соответствующие диенлактоны без накопления интермедиатов. В случае с 2-хлормуконатом происходило образование и накопление в качестве интермедиата 5-хлормуко-нолактона (5-ХМЛ). Реакция была обратимой, и в ходе нее наступало равновесие между исходным 2-хлормуконатом и образующимся 5-ХМЛ. О прямом образовании 5-ХМЛ свидетельствовали две изосбестических точки на перекрывающихся УФ-спектрах и ВЭЖХ анализ. При этом не происходило ожидаемого (как в случае с 3-хлор- и 2,4-дихлормуконатами) образования диенлактона (рис. 5).

Рисунок 5. (А) Спектральные изменения при превращении 2-хлормуконата (максимум поглощения 270 нм) ХМЦИ из Я. орасив 1ср, выращенного на 4-ХФ. Реакционная смесь (1 мл) содержала 30 мМ Тпб/НС1 (рН 7,0), 2 мМ МпС12, 0,1 мМ 2-хлормуконата и 1 цг очищенного белка. УФ спектры снимали в диапазоне 190 и 360 нм каждые 2 мин. (В) Превращение (+)-5-хлормуконолактона (максимум поглощения 205 нм) (условия те же, концентрация не определена из-за недостатка субстрата).

Таким образом, характер превращения 2-хлор-г^ис,^ис-муконата (2-ХМ) (хлор)муконатциклоизомеразами можно рассматривать как один из важных критериев при сравнительном изучении данных ферментов. Известно, что ХМЦИ из грам-отрицательных бактерий катализируют превращение 2-ХМ в /ярднс-диенлактон, сопровождающееся выделением хлор-иона [Kuhm et al., 1990; Schmidt & Knackmuss, 1980; Vollmer & Schlömann, 1995] (Рис. 6). Это превращение осуществляется в два этапа, катализируемых одним и тем же ферментом: на первом этапе происходит образование 2-ХМЛ и 5-ХМЛ; на

втором этапе дегалогенирование 5-ХМЛ приводит к образованию транс-диенлактона. Напротив, МЦИ обычного орто-иута из Pseudomonas sp В13, Pseudomonas putida PRS2000, Acinetobacter calcoaceticus ADP1 способны осуществлять превращение 2-XM в 2-XMJI и 5-ХМ, но не могут катализировать второй этап реакции - дехлорирование 5-ХМЛ [Vollmer et al., 1994]. МЦИ обычного opwo-пути и ХМЦИ, индуцирующаяся при росте R. opacus lcp на 4-ХФ, отличаются способностью выбирать между двумя возможными направлениями циклоизомеризации 2-ХМ, при этом образуется только один продукт - 5-ХМЛ, однако, ни один из этих ферментов не способен проводить его дальнейшего дегалогенирования. В случае с ХМЦИ 4-хлорпирокатехиновой ветви данное обстоятельство не играет никакой физиологически значимой роли, так как разложение 4-ХФ идет с образованием 4-ХПК и, соответственно, 3-хлормуконата. А способность этого фермента циклоизомеризовать 3-хлормуконат и осуществлять реакцию дегалогенирования с образованием цис-диенлактона оправдывает ее статус хлормуконатциклоизомеразы.

Рисунок 6. Превращение 2-хлормуконата МЦИ и ХМЦИ из различных штаммов. 1 - МЦИ грам-отрицательных бактерий; 2 - ХМЦИ штамма Р. риМа рАС27 и Я. еШгорка рЗР4; 3 - МЦИ штамма Я. орасш 1СР; 4 - ХМЦИ обеих ветвей модифицированного орто-пути штамма Я. орасш 1СР; 5 - МЦИ штамма Я. rhodochrous 89

В результате изучения ферментов, участвующих в разложении 4-ХФ, нами было выявлено несколько принципиальных моментов.

1. Показано, что при росте Я. орасш 1ср на 4-ХФ происходила индукция всех ферментов, описанного нами модифицированного орто-тгути, что позволяет определить этот модифицированный орто-путь как "стандартный", позволяющий сравнивать его с модифицированными орто-путями грам-отрицательных бактерий.

2. Сравнительный анализ каталитических свойств выделенных ферментов выявил ряд существенных отличий от аналогичных ферментов из грам-отрицательных бактерий:

- хлорпирокатехаза отличалась необычной региоселекттивностью Константы специфичности для субстратов с замесителями в иара-положении были на порядок выше, чем константы специфичности для субстратов с заместителями в л<едаа-положении

- ХМЦИ была способна выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата Образующийся 5-хлормуконолактон не подвергался дехлорированию данным ферментом

- ДЛГ в отличие от ферментов из грам-отрицательных бактерий не активна с транс-диенлактоном

Определение структуры метаболитов и изучение каталитических свойств выделенных и очищенных ферментов позволило нам установить путь разложения 4-ХПК, образующегося при росте штамма Л орасш 1ср на 4-ХФ (Рис. 4)

6. Новый модифицированный орто-путь у Якойососст ораст 1СР

Особенности субстратной специфичности ферментов 4-хлорпирокатехи-новой ветви не позволяли штамму Л орасш 1СР разлагать 2-хлорфенол (2-ХФ) Однако, после продолжительной адаптации был получен вариант штамма, использующий 2-ХФ в качестве единственного источника углерода и энергии [Моисеева с соавт, 1999] Мы показали, что разложение 2-ХФ новым вариантом штамма опосредуется необычным набором ферментов и происходит с образованием 3-ХПК по новому модифицированному орто-путя

В бесклеточном экстракте штамма К орасш 1ср, выращенного на 2-ХФ, была определена активность ферментов ПК 1,2-ДО, МЦИ, ДЛГ с различными субстратами (Табл. 5) ПК 1,2-ДО проявляла относительно невысокую активность с хлорированными субстратами, что могло объясняться присутствием фермента обычного орто-пути Активность с 3-ХПК была вдвое выше, чем с 4-ХПК Не выявилось активности ХМЦИ с 3-хлормуконатом. Субстратная специфичность ДЛГ в экстрактах, полученных из 2-ХФ и 4-ХФ биомассы, была похожа, хотя известно, что разложение 2-ХФ проходит с образованием транс-диенлактона, а 4-ХФ - г/ис-изомера

Наиболее интересным был вопрос, способна ли ХМЦИ из биомассы, выращенной на 2-ХФ, осуществлять циклоизомеризацию и дехлорирование 2-хлормуконата с образованием /и/мис-диенлактона, как это происходит при превращении 2-хлормуконата ХМЦИ грам-отрицательных бактерий

3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (3-ХПК 1,2-ДО) была очищена в два этапа с выходом по активности 66% Удельная активность фермента была 9,6 ед/мг белка 3-ХПК 1,2-ДО была гомодимером с молекулярной массой 66 кДа, масса субъединицы равнялась 28 кДа

Мы установили, что наибольшее сродство фермента наблюдалось к его непосредственному субстрату, 3-хлорпирокатехину, и 3-метилпирокатехину (табл. 9) В целом фермент не проявлял ярко выраженной избирательности к какому-либо субстрату Субстратами являлись пирокатехин и его моноза-мещенные производные, в то время как дихлор- и тетрахлорпирокатехины оказывали конкурентное ингибирующее действие на фермент (Табл. 7)

Таблица 9 Субстратная специфичность 3-ХПК-ДО Для расчета использовали значение молекулярной массы субъединицы, равное 28,5 кДа, которая была рассчитана по сиквенсу гена, кодирующего 3-ХПК-ДО_

Субстрат Кт или К", ^тах, k-C'dU

мкМ Ед/мг мин"1 мин'1 мкМ"1

Пирокатехин 2,1 16,1 458,8 218,5

3-хлорпирокатехин 1,4 11,5 327,7 234,1

4-хлорпирокатехин 3,5 10,0 285 81,4

3 -метилпирокатехин 1,9 45,5 1295,3 681,7

4-метилпирокатехин 3,4 43,5 1239 364,4

3,5-дихлорпирокатехин 3,04* - - -

4,5-дихлорпирокатехин 0,0102* - - -

3,4,5,6-ТетХПК 0,059* - - -

Хлормуконатциклоизомераза, индуцирующаяся при росте на 2-ХФ, была очищена в 251 раз в три этапа, выход по активности составил 89%, удельная активность равнялась 11,6 ед/мг белка ХМЦИ представляла собой гомооктамер с молекулярной массой нативного фермента, равной 340 кДа, и субъединичной массой 40 кДа Фермент был активен в борат-фосфат-ацетатном буфере (pH оптимум 5,7) Температурный оптимум равнялся 65°С ЫН2-концевая аминокислотная последовательность определена до 18-го остатка TXXITEMSATIVDLPSRR

ХМЦИ характеризовалась высокой субстратной избирательностью цис, ^ме-муконат, 3-хлор-, 3-метил- и 2,4-дихлормуконаты не являлись субстратами для данного фермента ХМЦИ была активна с 2-хлор- и 2-фтормуконатами Кы для 2-хлормуконата равнялась 142,9 цМ, Fmax =71,43 ед/мг белка, Ас« = 2850 мин"1, fccat/KM = 19,95 min"1 /¿M"1

Хлормуконолактондегалогеназа (ХМЛДГ), новый фермент, обнаруженный в биомассе R орасш 1ср, была очищена в три этапа, удельная активность составила 250 ед/мг белка Масса субъединицы равнялась 12 кДа Масса нативного фермента определена как 66 кДа Таким образом, фермент состоял из 5-6 субъединиц Определена ЫН2-концевая аминокислотная последовательность ХМЛДГ MLYLVRMTVNLPRNLDPREEEEC)LKASSC?)

ХМЛДГ осуществляла превращение 5-ХМЛ в г/ис-диенлактон, однако она не была способна к трансформации незамещенного муконолактона Именно из-за особенностей субстратной специфичности она и получила такое название, в остальном же ХМЛДГ напоминала классические муконолактонизомеразы, ферменты обычного орто-пути разложения пирокатехина, не имеющие аналогов в 3- и 4-хлорпирокатехиновых ветвях модифицированного орто-вуги [Katti et al, 1989, Prucha et al, 1996] ХМЛДГ была термостабильна, в то время как МЛИ из штамма Pseudomonas putida быстро инактивировалась при 65° МЛИ штамма Alcaligenes eutrophus JMP134 осуществляла дехлорирование 5-хлор-3-метилмуконолактона в 3-метилдиенлактон и 5-хлормуконолактона в г/ис-диенлактон [Prucha et al, 1996]

Диенлактонгидролаза (ДЛГ) была очищена из 2-ХФ биомассы за 4 этапа, с выходом по активности 12%, удельная активность - 60 ед/мг белка ДЛГ представляла собой мономер с молекулярной массой 30 кДа, имела pH оптимум

24

около 8,6, температурный оптимум - 40°С. Км для г/ис-диенлактона составила 200 цМ, Ктах =167 Ед/мг белка, £са, = 4633 мин-1, £са1/Км = 23 min"1- ¿¿М"1.

Превращение 2-фтормуконатов

Субстратную специфичность ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus 1ср на 2-ХФ, изучали методом 19F ЯМР используя ряд фторпирокатехи-нов. Энзиматически были получены З-хлор-5-фторпирокатехин (с резонансом -126.7 ррт, рисунок 7а), 3-фторпирокатехин (-140.5 ррт, рисунок 7а), 3-хлор-6-фторпирокатехин (-142.6 ррт), 5-хлор-З-фторпирокатехин (-139.5 ррт).

а)

is

Ь)

CI

(АйОО-рЛ^соо-

is

fSzocr

А

is

<J)

Ii

г1

11

V

F

ррт .110 -115 -120 -125 -130

а)

Ь)

is

is

c' Acoo-Ц^СОО-

J

is

d)

is

öC

i

-00^° H

ppm .120 -140 -160 -180 -200

Рисунок 7. Р ЯМР анализ продуктов инкубации 2-хлор-4-фторфенола (слева) с: 1,6 мкМ 2-гидроксибифенил монооксигеназы (а); 1,4 мкМ 3-ХПК 1,2-ДО (С1сА2) (Ь); 0,5мкМ ХМЦИ (с1сВ2) (с) и 1,3 мкМ ХМЛДГ (СкБ) (а) и инкубации 3-фторпирокатехина (справа) (а) с: 1,4 мкМ С1сА2 (В); 0,5 мкМ С1сВ2 (с) и 1,3 мкМ С1сР (а). В рамках приведены спектры, полученные в результате проведения сопряженного фтористо-протонного ЯМР.

После добавления З-ХПК 1,2-ДО к полученным фторпирокатехинам происходило их превращение в соответствующие фтормуконаты Лучшим субстратом для диоксигеназы (50% от активности с З-ХПК) являлся 3-фторпи-рокатехин, З-хлор-6-фтор-, З-хлор-5-фтор- и 5-хлор-З-фторпирокатехины расщеплялись гораздо медленнее, с относительной скоростью, составляющей, соответственно, 25,10 и 5% по сравнению с З-ХПК.

На рисунке 76 представлены 19Б ЯМР спектры превращения З-хлор-5-фторпирокатехина Образующийся муконат (-109 2 ррт) был идентифицирован на основе значений констант сопряжения 3У(4Р,ЗН) и 1/(4Р,5Н), равных 30 7 и 21 5 Гц, соответственно, как 2-хлор-4-фтормуконат В таблице 10 представлены 19Р ЯМР характеристики вновь идентифицированных 2-галомуконатов

Таблица 10. Величины 19Р ЯМР химических сдвигов и идентификация фтор-

муконатов и фтормуконолактонов

Соединение Химический сдвиг (ррт) Константы сопряжения, Гц Превращение ХМЦИ

4-хлор-2-фтормуконат -111 1 V(2F,3H)(20 9) Нет

2-хлор-4-фтормуконат -109.2 V(4F,3H)(30 7) 37(4F,5H)(21 5) Да

2-хлор-5-фтормуконат -112 0 V(2F,3H)(20 1) даа>

2-фтормуконат6) -112 0 V(2F,3H)(20 7) Да

2-хлор-4-фтор-муконолактон -111 7 V(4F,5H)(19.9) V(4F,5H)(13 8) продукт конверсии 2-хлор-4-фтормуконата

5-фтор-муконолактон -201.0 V(5F,5H)(47 4) V(5F,4H)(25 2) продукт конверсии 2-фтормуконата

а) очень низкий уровень конверсии не позволил идентифицировать соответствующий муконолактон

^ЯМР значения по Боэрсме с соавт [Воегета е1 а1,1998]

Исследование превращения образующихся 2-фтормуконатов ХМЦИ показало, что в контрольной реакции без добавления ХМЦИ 2-галомуконаты теряли только около 10% сигнала за 10 часов инкубации, что свидетельствовало об их относительной устойчивости при pH 7,2. Известно, что муконаты, имеющие галозаместители во втором положении, особенно 2-фтор-муконат, наиболее устойчивы к действию циклоизомераз [Vollmer ei al., 1998, Schmidt, Knackmuss, 1980] Мы показали, что ХМЦИ нового модифицированного орто-пути R opacus 1СР катализирует превращение этого субстрата в 5-фтормуконолактон. Инкубация ХМЦИ с 2-хлор-4-фтор- (Рис. 7в) и 4-хлор-2-фтормуконатами приводила к значительной убыли первого соединения

Продукт реакции ХМЦИ с 2-хлор-4-фтормуконатом был идентифицирован как 2-хлор-4-фтормуконолактон на основании данных сопряженного протонно-фтористого ЯМР резонанса (V(4F.5H) константы, равные 199и 13 8 Гц на -1117 ррт) и фактов, что 1) из-за существенно удаленного положения атома фтора по отношению к лактоновому кольцу местное сопряжение СЗ-Н, C4-F у

4-фтормуконолактона в основном не определяется и 2) анизохрония в диастереотипичных метальных протонах приводит к неравным значениям 3JF.H констант сопряжения [Boersma et al., 2001, Schlomann et al, 1990a] (Табл. 10) По аналогии с более стабильным 4-фтормуконолактоном [Boersma et al, 2001, Schlomann et al, 1990], это соединение может подвергаться дефторированию с образованием, что наиболее вероятно, 2-хлормалеилацетата

На рисунке 7в (справа) представлены результаты 19F ЯМР анализа инкубации 2-фтормуконата с ХМЦИ 64%-ное снижение сигнала 2-фтормуконата при -112 0 ррт сопровождается появлением нового пика при -201 0 ррт, при этом интенсивность появляющегося пика соответствует убыли пика 2-фтормуконата Проведенный сопряженный протонно-фтористый ЯМР (Рис. 7в, вставка) показал, что резонанс при -201 0 ррт характеризуется величиной 2J(5F,5H), равной 47 4, и V(5F,4H), равной 25 2 Гц, что можно отнести к 5-фтормуконолактону (Табл. 10) и находится в соответствии с литературными данными [Boersma et al., 2001, Wray, 1983]

Превращение фтормуконолактонов ХМЛДГ (ClcF).

В процессе работы были идентифицированы два новых муконолактона - 2-хлор-4-фтормуконолактон и 5-фтормуконолактон 2-Хлор-4-фтор-муконолак-тон оказался крайне нестабильным, его дальнейшее превращение было неэнзи-матическим. 5-Фтормуконолактон был стабилен и превращался в г/ис-диенлак-тон с участием ClcF (Рис. 7с,d), что спектрально выражалось увеличением резонанса при -123 0 ррт, соответствующим фтор-иону Добавление ДЛГ к препарату приводило к исчезновению г/ис-диенлактона (данные ВЭЖХ)

7. Клонирование генов, кодирующих превращение 3-ХПК у R. opacus lcp

Проведенное нами секвенирование 9 5-кб вставки pROPl выявило наличие 9-ти открытых рамок считывания (ORF) (Рис. 8) ORF1 (позиции 599-1) и ORF 2 (позиции 1229-648) имели высокую степень сходства (57 и 59%) с, соответственно, З-гексулозо-6-фосфат синтазой и 6-фосфо-З-гексулоизомеразой из Mycobacterium gastri MB 19 [Mitsui et al, 2000] ORF3 имела сходство с несколькими регуляторами транскрипции LuxR семейства. ORF4 (позиции 4085-2802) имела 55-56% идентичности с глюкозо-6-фосфат 1-дегидрогеназами из Mycobacterium tuberculosis H37RV [Cole etal, 1998] и Streptomyces coelicolor ORF5 (позиции 4818-5582, рассчитанная молекулярная масса 28 105 Да) показала значительное сходство с известными (хлор)пирокатехин 1,2-диоксигеназами ORF6 (позиции 5608-6372, масса 27 400 Да) имела сходство с ДЛГ, особенно с ДЛГ из этого же штамма - 40% идентичных позиций [Eulberg et al, 1998], что позволило обозначить его как clcD2. ORF7 (позиции 6369-7484) кодирует белок (рассчитанная молекулярная масса 39 539 Да), сходный с (хлор)муконатциклоизомеразами 46% идентичных позиций с МЦИ CatB Р putida PRS2000 [Houghton et al, 1995] и 35% с ClcB R opacus lcp [Eulberg et al, 1998] КПНг-концевая последовательность данного белка была идентична определенной ранее ЫНг-концевой последовательности ХМЦИ, выделенной из биомассы R opacus lcp, выращенного на 2-ХФ Таким образом, ORF7 была определена как clcB2 ORF8 (позиции 7520-7804, рассчитанная молекулярная масса 11 193 Да), показал сходство с несколькими

Ш 1 f св II '. с ? И О О О О — & мм i I III! !

pROPl (9,510 bp)

L

1kB

PR0PT3 }

( ÜRCP27 ;

¡зВОРЮ

т:

PROP22

tttaaeditl Mint »omiarat! кймгавМк ¡Мщага b^dase су&кдащв uehacgsn^

й9ейг ilosfs

В

lysMj« MI dtAfc

Gfcfti IiШЛЙ ШШйЙОАб

Ц-гёкдазя еДОЖЮ fem®!

gsr»i <ga>

Рисунок 8. (А) Рестрикционная карта вставки pROPl, несущей 9,510 бп фрагмент ДНК R. opacus lcp (светлая полоса) в множественный сайт клонирования pBluescript II SK(+) (черная полоса). Указаны локализация и направление ORF на pROPl. Для сравнения приведены генные кластеры R. opacus lcp для катаболизма 4-ХПК и 3,5-ДХПК (В) и незамещенного ПК (С). Гомологичные гены обозначены одинаковым цветом.

муконолактонизомеразами, особенно с метилмуконолактон изомеразой из R. eutropha JMP134 [Erb et al., 1998] - 55% идентичных позиций. Аминокислотная последовательность этого белка была идентична №12-концевой последовательности ХМЛДГ, выделенной из биомассы штамма R. opacus lcp, выращенной на 2-ХФ. На основании этого ген для нового в хлорпирокатехиновом пути белка был обозначен clcF.

Сравнение аминокислотных последовательностей 3-ХПК 1,2ДО и 4-ХПК 1,2-ДО штамма R opacus lcp показало, что 3-ХПК 1,2-ДО была более близка к ферментам обычного орто-пути, чем к 4-ХПК 1,2-ДО (Рис. 9).

TfdCn pJP4

TfdC pJP4

CatA P.puüda FRS2000 ШвЛ Pseudomonas 41ESTIOOI

CatA Jcmetoiaciersp.ADPl^ N1 CatA Aada>ai:eticitsNCm8250--^~^^ CatAä A.heoffiiK24 CatA AbvoffiiTOA-

TcbC pP51 '^ClcA pAC27

ClcA R.oparus icp ClcA2 R-opacus lcp CatA Kopacus lcp

-CatA R.rhodochrcus 'CatA ReiyÜiropoäs AN-13

CatA S.seUinii

ГГХ 1,2-ДО Р -субъединица Т1КК ДО го различных бактерий ш различных бактерий

Рисунок 9. Дендрограмма, показывающая родство ЗХПК 1,2-ДО нового модифицированного орто-пути Д. орасш 1ср с аналогичными ферментами.

28

__L

Таким образом, изучение ферментов, участвующих в разложении 2-ХФ штаммом 7? орасш 1ср, позволило выяснить следующие наиболее интересные моменты

1. Изначально выделенный из накопительной культуры штамм не был способен рости на ряде соединений (2-хлорфенол, 3-хлорфенол) из-за отсутствия специфических ферментов

2 Внесение в среду 2-ХФ привело к появлению способности штамма утилизировать токсикант. Адаптация происходила благодаря появлению набора ферментов, имеющих аналоги в модифицированном орто-тгут разложения (хлор)пирокатехинов и обычном пути разложения пирокатехина (Рис. 10).

3 Факт, что выделенные ферменты характеризуются высокой специфичностью к интермедиатам превращения нового субстрата, указывает на неслучайность возникновения (или активизации) данного пути

А

ен

.он

З-хлоргатехол

ХПК 1,2-ДО

ЗХПК1£-Др

-он

но

4-хтркэтехол

тклг-рр

и

2-хяОрвуконэт

I-

ХМЦИ

&хп орм^кшшгакмн

"ОС© й!

лрэнодиёняакгон

®1

Рисунок 10. Модифицированные орто-пути разложения хлорпирокатехинов А — у грам-отрицательных бактерий, Б и В — у Я орасш 1ср' Б — новый модифицированный орто-иутъ, В - 4-хлорпирокатехиновый орто-щгъ

8. Ферменты штаммов R. rhodochrous 89 и R. rhodnii 135, R. opacus 1G, выращенных на феноле

Пирокатехин 1,2-диокеигеназа штамма R. rhodochrous 89 (ПК 1,2-ДО_89) была очищена за 5 этапов с выходом по активности 15% Фермент был гомодимером с молекулярной массой 69-70 кДа и субъединичной молекулярной массой 37 кДа Наиболее высокой активность ПК 1,2-ДО_89 была с метилзамещенными пирокатехинами Необычно высокой была активность с 3-ХПК (Табл. 11)

Таблица 11 Окисление замещенных пирокатехинов ПК 1,2-ДО из родококков

Субстрат для определения активности ПК-ДО Относительная активность, %

R rhodochrous 89 R rhodnii 135 R opacus 1G

Пирокатехин 100 100 100

3 -Метилпирокатехин 161 157 16

4-Метилпирокатехин 130 134 34

З-Метоксипирокатехин 2 3 H 0

3 -Хлорпирокатехин 22 20 H 0

4-Хлорпирокатехин 5 9 6

3,4-Дихлорпирокатехин 0 0 0

3,5 - Дихлорпирокатехин 0 0 0

3,5 -Дибромпирокатехин 0 0 0

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа штамма R.rhodnii 135 (ПК 1,2-ДО_135) была очищена за семь этапов в 103 раза, удельная активность составила 20,5 ед/мг бедка, что соответствовало выходу по активности в 24%. Молекулярная масса ПК 1,2-ДО_135, как и ПК 1,2-ДО_89, составила 69-70 кДа Субъединичная молекулярная масса равнялась 37 кДа Таким образом, фермент являлся гомодимером Оба фермента были похожи между собой и по способности окислять различные пирокатехины (Табл. 11)

Очистка пирокатехин 1,2-диоксигеназы штамма R. opacus 1G приводила к разделению пирокатехазной активности на два пика Фермент из первого пика был крайне нестабилен и быстро инактивировался Фермент из второго пика (ПК 1,2-Д02_Ш) был очищен за 4 этапа в 41 раз, с выходом по активности 14% Удельная активность этой изоформы была выше, чем у других пирокатехин 1,2-диоксигеназ (29 ед/мг белка) Фермент был активен с пирокатехином, 3-МПК и 4-МПК (Табл. 11) Значения Ки для этих субстратов были 1,3 LtM (ПК), 1 рМ (3-МПК) и 1,3 цМ (4-МПК). Ингибиторами конкурентного типа для ПК 1,2-Д02_Ш являлись следующие соединения 3,5-ди-хлорпирокатехин (K¡ = 0,25 цМ), 3,6-дихлорпирокатехин (К, = 12,5 цМ), 4,5-дихлорпирокатехин (K¡ = 0,5 ¡дМ), 2-ХФ (К, = 6,5 цМ) и 4-ХФ (К^ - 125 иМ)

Муконатцнклоизомераза штамма R.rhodochrous 89 (МЦИ 89) была очищена за семь этапов в 186 раз, конечный препарат имел удельную активность 16 ед/мг белка МЦИ_89 состояла из двух типов субъединиц с молекулярной массой 35,5 и 37 кДа МН2-Концевая аминокислотная последовательность большей субъединицы определена до 27-го остатка

МУКТ1(К)ЕТЬЬМВ1Р01КРх11НМддх8. ЫН2-Концевая аминокислотная последовательность меньшей субъединицы определена до 32-го остатка АУАТМОТдТЬУМУКЦК^ТОБОРЮххЕАТТЮО.

Превращение 2-хлормуконата МЦИ_89 сопровождалось образованием г^ис-диенлактона. Изучена динамика превращения метаболитов. Наиболее интенсивно конверсия 2-ХМ проходила в первые 30 мин после добавления МЦИ Через 4 часа инкубации в смеси оставалось только 8% внесенного субстрата. В процессе трансформации образовывались 2-ХМЛ и 5-ХМЛ в качестве интермедиатов. гуие-Диенлактон был единственным продуктом реакции (Рис. 11).

Мы обнаружили, что у родококков присутствовали различные наборы ключевых ферментов при росте на различных субстратах. У R. opacus IG при росте на феноле происходила индукция двух ПК 1,2-ДО, различающихся по стабильности. При росте штамма R. opacus lcp на бензоате было обнаружено две ПК 1,2-ДО, различающихся по значениям Кт для пирокатехина и константы ингибирования фенолом и 4-ХФ. При росте на 4-хлор- и 2-хлорфенолах у R. opacus lcp обнаружено по одному ферменту модифицированного орто-пути.

Изоферменты ПК 1,2-ДО из Р. arvilla [Nakai et al., 1988; 1990, 1995] и А. radioresistent [Briganti et al., 2000] не различались между собой по каталитическим свойствам, в то время как для изоферментов из Frateuria [Aoki et al., 1984b] и A. Iwoffii [Kim et al., 1997] показаны различия в молекулярном весе и каталитических свойствах. Причины необычного набора ферментов обсуждаются в литературе. Орнстон и Парке [Ornston & Parke, 1976] подчеркивали биологическую значимость изофункциональности белков: так как часто индукция является моментом узкоспецифичным, то возможность индукции одного из ферментов позволяет клеткам адаптироваться к условиям, существующим в данный момент или к постоянному окружению, что увеличивает широту ответа. Кроме того, гены разложения таких соединений, как бензоат, фенол, толуол, 2,4-Д, располагаются в различных оперонах плазмидного и хромосо-мального происхождения и имеют различные активаторы [Ehrt et al., 1995; Eulberg et al., 1997; Winstanley et al., 1987]. Таким образом, способность синтезировать несколько ключевых изоферментов в ответ на воздействие ксенобиотика может или повышать биодеградативный потенциал штамма и обеспечи-

Рисунок 11. Динамика продуктов трансформации 2-хлормуконата МЦИ из Р. rhodochrous 89, определенная ВЭЖХ. За 100% принято: 0.1 мМ для муконата, 0.09 мМ для ^ис-диенлактона и наибольшая площадь пиков для муконолактонов. 2-хлормуконат (1), 5-хлормуконолактон (2), 2-хлормуконо-лактон (3), г^ис-диенлактон (4).

вать ему выживаемость в меняющихся условиях окружающей среды или отражает неспецифический ответ микроорганизмов на действие токсиканта

9. Ферменты разложения ароматических субстратов штамма R. ruber Р25 Ферменты разложения 4-ХБК

В плане сравнительного изучения хлорированных ароматических соединений родококками нами был использован штамм R ruber Р25, характеризующийся широким биодеградативным потенциалом и способный полностью разлагать ряд устойчивых токсикантов, в том числе хлорбифенилы Поскольку промежуточным метаболитом при разложении полихлорированных бифенилов является 4-хлорбензоат (4-ХБК), были изучены ферменты, участвующие в деструкции этого соединения

Путь разложения 4-ХБК схематично можно представить следующим образом (Рис. 12)

ПКК 2,3-ДО " ПКК 3,4-ДО ^ ПКК 4,5-ДО

4-ХБК ПОБК ПКК

Рисунок 12 Путь разложения 4-ХБК и возможные сайты расщепления протокатеховой кислоты (ПКК) ПОБК - иора-гидроксибензоат, ПКК ДО -протокатехоат диоксигеназа

В бесклеточном экстракте R ruber Р25 были определены активности пара-гидроксибензоат гидроксилазы (ПОБГ) и ПКК-ДО

иа/?а-Гидроксибензоат гидроксилаза (ПОБГ) была очищена в 71 раз, выход по активности составил 15 4% ПОБГ содержала две субъединицы с молекулярной массой 43 кДа и 45кДа Удельная активность ПОБГ равнялась 11,67 ед/мг белка, #МП0БК = 9,85 мкМ, KuNADU = 14,2 мкМ Удельная активность ПОБГ при внесении NAD(P)H составила 14,25% от удельной активности ПОБГ при внесении NADH

Протокатехоат диоксигеназа (ПКК ДО). Раскрытии ароматического кольца4-ХБК, как правило, катализирует протокатехоат 3,4-диоксигеназа -интрадиольная диоксигеназа, хорошо изученная у грам-отрицательных бактерий В литературе также описаны две экстрадиольные ПКК диоксигеназы - ПКК 4,5-ДО и ПКК 2,3-ДО ПКК ДО была очищена в 18,7 раз, выход по активности составил 47,2% Удельная активность ПКК-ДО равнялась 15 ед/мг белка, Кч = 5,26 мкМ, фермент был термолабилен, расщепление протокатехоата происходило по С4-С5 с образованием полуальдегида 2-окси-4-карбокси-г/мс, г/мс-муконовой кислоты

Ферменты разложения /гора-гидроксибензоата штаммом R. ruber Р25

Рост R ruber P25 на среде с ПОБК, одним из ключевых интермедиатов разложения ПХБ, сопровождался индукцией ПОБГ и ПКК ДО ПКК расщеплялась между СЗ-С4 атомами, что свидетельствовало о различии свойств ПКК ДО, индуцирующейся при росте Р25 на 4-ХБК и ПОБК Очистка ПКК 3,4-ДО сопровождалась разделением фермента на две активные фракции Очищенные ПКК 3,4-ДО различались по каталитическим характеристикам Так, значение Км ПКК 3,4-Д01 для ПКК равнялось 7 7 цМ, Км ПКК 3,4-ДОП для ПКК было 83 рМ ПКК 3,4-ДО П окисляла ПКК со скоростью, вдвое превосходящей скорость окисления этого субстрата ПКК 3.4-Д01 Дальнейшая очистка приводила к значительной инактивации ПКК 3,4-ДОП, ПКК 3,4-ДО I была стабильна Удельная активность конечных препаратов ПКК 3,4-Д01 и ПКК 3,4-ДОП составила, соответственно, 143 и 85 Ед/мг белка,

10. Ферменты разложения иора-толуата (4-метилбензоата) у родококков Ферменты орто-пути у R.opacus lcp

В бесклеточном экстракте R opacus lcp скорость окисления 4-ХПК и 4-МПК составляла, соответственно, 29% и 250% от скорости окисления пирокатехина. В результате очистки получены две ПК 1,2-ДО, различающихся по субстратной специфичности

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа I была очищена в 14 раз с удельной активностью 7,48 ед/мг белка, выход соответствовал 1,53 % SDS-электро-форез показал наличие в препарате двух полос с молекулярной массой 33 и 35 кДа 1Ж2-концевая последовательность субъединицы массой 33 кДа определена до 15 остатка (KAERATANTSPERLA) Фермент имел выраженный температурный оптимум при 40-50°С

ПК 1,2-Д01 катализировала окисление с наиболее высокой скоростью пирокатехина, ЗМПК и 4-МПК (табл. 12) Активность с 4-ХПК составляла всего 2,09% от максимальной, а с 3,5- и 4,5-дихлорпирокатехинами активность отсутствовала

Таблица 12 Кинетические характеристики пирокатехин 1,2-диоксигеназы I

При расчете kcal брали усредненную субъединичную массу 34 кДа_

Субстрат__Кт, рМ Утах, ед/мг ксМ> мин KJKm, мин"' рМ"г

Пирокатехин 6,5 9,1 309,1 47,9

3-метилпирокатехин 20,0 25 850,0 42,5

4-метилпирокатехин 9,1 10 340,0 _37,4_

Пирокатехин 1,2-диоксигеназа П была очищена в 18 раз за пять этапов, выход составил 37%, удельная активность составила 9,7 ед/мг белка. Субъединичная молекулярная масса ПК 1,2-ДО II равнялась 26-27 кДа. Определена МН2-концевая аминокислотная последовательность исследуемого фермента, ANTRVIELFDEFTDLIKDFIVRHEITTPEYETI, которая полностью соответствовало МН^-концевой последовательности ХПК 1,2-ДО, индуцирующейся при росте R opacus lcp на 4-ХФ [Eulberg et al, 1998]

Каталитические свойства ПК 1,2-ДОП. Фермент был способен катализировать окисление широкого круга замещенных пирокатехинов

Относительная активность ПК 1,2-ДО II с ПК • 4ХПК ЗМПК 4МПК 3,5-ДХПК составила, соответственно 100 113 . 191 253 22%, что было похоже на результаты, полученные для 4-ХПК 1,2-ДО

Муконатциклоизомераза (МЦИ) была очищена в четыре этапа, удельная активность МЦИ с муконатом возросла с 0,02 ед/мг белка до 1,92 ед/мг белка, что соответствовало очистке в 96 раз Выход по активности составил 37,3 % Субъединичная молекулярная масса МЦИ была 40 кДа МЦИ катализировала превращение ряда замещенных (3-хлор-, 2- и 3-метил-) муконатов с относительной активностью 14, 6 и 28% по отношению с муконату, соответственно, по этим свойствам была похожа на фермент того же штамма, индуцирующийся при росте на бензоате.

Набор ферментов, индуцирующихся у R opacus lcp при росте на пара-толуате, является необычным. Известно, что индукторами для пирокатехаз и муконатциклоизомераз могут служить бензоат и сам муконат, поэтому оправданной является индукция МЦИ и ПК 1,2-ДО обычного орто-пут Присутствие еще одной диоксигеназы, а именно 4-ХПК 1,2-ДО, при отсутствии параллельной индукции ХМЦЙ свидетельствуют о более сложном ответе на новый для штамма субстрат, что, с одной стороны, позволяет ему эффективно разлагать данное соединение, избегая непродуктивной индукции фермента (ХМЦИ), малоэффективного в отношении образующегося 3-метилмуконата, а, с другой, возможно, может служить примером возникновения нового метаболического пути

Ферменты разложения «й/>а-толуата у штамма R. ruber Р25

В бесклеточном экстракте, полученном из биомассы, выращенной на пара-толуате, обнаружена активность ПК 1,2-ДО и МЦИ

Пирокатехин 1,2-диокеигеназа (ПК 1,2-ДО) была очищена в 3 этапа, удельная активность составила 5,4 ед/мг белка, температурный оптимум 30 С, рН оптимум - 7 2-7 4, фермент был активен с пирокатехином, 3-метил-пирокатехином, 4-метилпирокатехином удельная активность равнялась 5,7, 11,1 и 6,7 ед/мг белка, соответственно, активность с 3-ХПК и 4-ХПК была 2% от активности с пирокатехином Ряд соединений конкурентно ингибировал активность ПК 1,2-ДО с пирокатехином со значениями константы ингибирова-ния 0,3 цМ (3,5-ДХПК), 05 рМ (4,5-ДХПК), 0,4 цМ (3,6-ДХПК), 1 цМ (тетра-хлорпирокатехин), 27 ¡дМ (2-ХФ) 4-МБК, 4-ХБК, взятые в концентрации до 200 мкМ, не ингибировали активность этой ПК 1,2-ДО

Муконатциклоизомераза была очищена в 36 раз, удельная активность равнялась 2 2 ед/мг белка МЦИ была стабильна при 60°С, Км для муконата равнялась 6,67 мкМ, отсутствовала активность с 2-хлормуконатом

Наши данные по субстратной специфичности пирокатехин 1,2-диокси-геназ родококков находятся в соответствии с данными, полученными другими авторами, и позволяют выделить в первую очередь два типа ферментов

Первый - пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-путт, проявляющие узкую субстратную специфичность,

Второй - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей (можно сказать, что их количество/специфичность зависит от того, сколько различных хлопирокатехинов может образоваться в качестве ключевых интермедиатов разложения хлорированных ароматических соединений), характеризующиеся высоким сродством к хлорированным субстратам и широкой субстратной специфичностью

Однако, нельзя обойти вниманием еще один тип интермедиатов, а именно метилпирокатехинов, образующихся при разложении ряда ароматических соединений, например, метилбензоатов (толуатов) или метилфенолов (крезолов). Микробная деградация метилзамещенной ароматики обычно проходит через мета-щтъ расщепления метилпирокатехинов, так как их орто-расщепление приводит к образованию «dead-end» продуктов - метилзамещенных 4-карбок-симетилбут-2-ен-4-олидов (метилмуконолактонов) [Catelam et al, 1971, Knackmuss et al, 1976] Особый интерес представляет разложение 4-метилмуко-нолактона, поскольку наличие алкильного заместителя при С-4 атоме препятствует дальнейшему разложению этого соединения по классическому 3-оксо-адипатному пути [Erb et al, 1998] Тем не менее, обнаружено несколько исключений, у штаммов R eutropha JMP134, Rhodococcus sp и Rhodococcus rhodochrous N75 описаны модифицированные орто-щти для разложения метилпирокатехинов, причем у наиболее изученных R eutropha и R rhodochrous N75 эти пути различались [Bruce, Cam, 1988, Pieper et al, 1985, Cha et al., 1998]

Проведенное нами изучение процессов разложения метилбензоата родо-кокками показало, что они используют opmo-щть расщепления метилпирокате-хина Мы обнаружили наличие фермента с широкой субстратной специфичностью у штамма R opacus 1ср Хотя, согласно литературным данным, ПК 1,2-ДО-зы считались ферментами с узкой субстратной специфичностью, это не противоречит полученным нами результатам, так как в большинстве случаев о широте субстратной специфичности судили на основании сравнения скоростей окисления пирокатехина и галогензамещенных субстратов, с которыми и в наших исследованиях была показана низкая активность фермента

ПК 1,2-ДО из R ruber Р25, выращенного на 4МБК, отличается от известных диоксигеназ: ПК 1,2-ДО обычного opmo-пути у описанных ранее штаммов окисляют 3-МПК и 4-МПК со скоростью, не превышающей скорость окисления пирокатехина (Таблица 13), скорость окисления хлорпиро-катехинов, как правило, незначительна

ХПК 1,2-ДО модифицированного орто-пути окисляют 3-МПК и 4-МПК со скоростью, составляющей 200-300% от скорости окисления пирокатехина, вместе с тем, ферменты активны с хлорированными субстратами

ПК 1,2-ДО из R ruber Р25 окисляет метилпирокатехины со скоростью, превышающей скорость окисления пирокатехина, но этот фермент характеризуется низкой активностью с хлорированными субстратами (Таблица 13)

Полученные нами данные, касающиеся особенности индукции ферментов, участвующих в разложении 4-МПК, и их субстратной специфичности у R opacus и lcp и R ruber Р25, указывают на особенности метаболизма пара-толуата исследованными бактериями и свидетельствуют о наличии еще одного типа пирокатехин 1,2-диоксигеназ -метилпирокатехаз (МПК 1,2-ДО)

Таблица 13. Скорости окисления пирокатехина (ПК), 3-метилпирокатехина (ЗМПК) и 4-метилпирокатехина (4МПК) пирокатехин диоксигеназами (ПК 1,2-ДО) и хлорпирокатехин диоксигеназами (ХПК 1,2-ДО) из различных бактерий

Бактерия Ростовой I Фермент Отн активность, %

субстрат Субстрат ПК 1,2-ДО

ПК 3-МПК 4-МПК

Р arvüla С1 бензоат ПК 1,2-ДО 100 5,4 94,6

Pseudomonas sp В13 бензоат ПК 1,2-ДО 100 и Но

Alcahg eutrophus СНЗ бензоат ПК 1,2-ДО 100 20

Pseudomonas sp PS 12 бензол I ПК 1,2-ДО 100 68 82

R eutropha JMP 134 2,4-Д ПК 1,2-ДО 100 41 Но

Acinetobacter Iwoffii анилин ПК 1,2-ДО! 100 3 39

№ 1,2-ДОП 100 22 51

Acinet calcoaceticus бензоат 1 ТК 1,2-ДО 100 12 18

Acinet radioresistens фенол [ ПК 1,2-ДО 100 14,4 16,5

Rhod rhodochrous B259 бензоат ТК 1,2-ДО 100 79 68

Rhod Rhodochrous N75 и-толуат Й ТК 1,2-ДО 100 64 83

R opacus lcp бензоат t ТК 1,2-ДО 100 99 88

и-толуат ПК 1,2-ДО 100 73 89

\КПК 1,2-ДО 100 208 242

Rhodococcus ruber P25 и-толуат | МПК 1,2-ДО 100 195 117

Pseudomonas sp B13 3-ХБК t ШК 1,2-ДО 100 337 Но

Pseudomonas sp РАС 27 3-ХБК ШК 1,2-ДО 100 Но 300

R eutropha JMP 134 2,4-Д ШК 1,2-ДО 100 167

Pseudomonas sp PS 12 1,2,4-ТХБен-л t ШК 1,2-ДО 100 319 230

Pseudomonas putida 87 3-ХБК ШК 1,2-ДО 100 235 187

Pseudomonas sp P51 хлорбензол t ШК 1,2-ДО 100 202 189

Xantobacter phlavus дихлорбен-л р ШК 1,2-ДО 100 239 168

Pseudomonas acidovorans 2-хлоранилин t ШК 1,2-ДО 100 307 205

Rhodococcus opacus lcp 2-хлорфенол l ШК 1,2-ДО 100 283 270

4-хлорфенол |] ШК 1,2-ДО 100 208 242

Но - не определяли, 1,2,4-ТХБен-л - 1,2,4-трихлорбензол

11. Пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

Сравнение гомологичных ферментов обычного и модифицированных ордао-дутей, участвующих в разложении ароматических соединений, из ряда бактерий, выращенных на разных субстратах, показало, что физико-химические и каталитические свойства таких ферментов различаются, хотя ферменты катализируют одинаковые реакции Наиболее наглядно это наблюдение проявляется в случае раскрытия ароматического кольца пирокатехинов (хлор)пирокатехазами Так, у штамма R opacus 1ср при росте на 2-ХФ и 4-ХФ индуцируются два фермента, значительно различающихся по субстратной специфичности Вместе с тем, полученные нами данные, касающиеся структуры центральной части активного центра этих ферментов (железо (III), пятикоординированное остатками двух молекул гистидина, двух молекул

тирозина и воды), указывают на то, что эта часть фермента не отличается по структуре от других интрадиольных диоксигеназ, таких как протокатехоат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин 1,2-диоксигеназы и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы. Таким образом, необходимо было сравнить пространственную структуру этих ферментов с тем, чтобы выявить факторы, опосредующие различия в субстратной специфичности изучаемых диоксигеназ.

Механизм реакции и пространственную структуру активного центра и молекул нативного белка диоксигеназ в основном изучали на примере протокатехоат 3,4-диоксигеназ, ПК 1,2-ДО были изучены незначительно [Funabiki et al., 1990; Ohlendorf et al., 1988; 1994]. Показано, что атом железа активного центра ферментов координирован двумя тирозиновыми, двумя гистидиновыми аминокислотными остатками и гидроксилом воды. На всех стадиях реакции железо не изменяет заряда. Долгое время все попытки получить ПК 1,2-ДО в кристаллическом виде были неудачны.

Нами были получены 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus lcp в кристаллическом виде, пригодном для рентгено-структурного анализа и расшифрована пространственная структура этих ферментов.

Кристаллы 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы, полученные в растворе, содержащем 1,6 М (NH4)2S04, 0,1 М NaCl, 100 мМ Tris/HCl, pH 9,0, 515% глицерин, имели размер 0.4 х 0.4 х 1.0 мм (Рис. 13), их хранили в жидком азоте в присутствии 30% глицерина как криопротектора. Кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО принадлежат к первичной гексагональной пространственной группе Р6322, с размерами элементарной ячейки а = Ь - 90.4, с = 307.5 Ä. Исходя из присутствия одной молекулы на одну ассиметрическую единицу, раствор составляет около 61% ячейки (Км = 3.13 Ä3 Да"1 [Mattews, 1968].

Рисунок 13. Кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО (слева) и 3-ХПК 1,2-ДО (справа)

Кристаллы 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы, полученные в буфере, содержащем 0,3 М Mg(CH3C02)2, 0,1 М HEPES, рН 7,5, 15% ПЭГ 8000, 5% глицерин, достигали максимальных размеров 0.2 х 0.5 х 0.5 мм (Рис. 13) и были заморожены в жидком азоте, 25% ПЭГ 400 добавляли к маточному раствору как криопротектор. Они принадлежат к первичной триклинной пространственной группе Р1 Рассчитано, что на ассиметрическую единицу приходится четыре димера (aFe111^ (молекулярная масса мономера 29 кДа).

До сих пор, помимо проводимых нами исследований, получены в кристаллическом виде еще две ПК 1,2-ДО - из штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259 [Strachan et al., 1998] и из A. calcoaceticus ADP1 [Vetting &

Ohlendorf, 2000]. Однако, структура ПК 1,2-ДО из R. rhodochrous расшифрована не была. В настоящее же время основное сравнение полученных нами структур проводится с ПК 1,2-ДО из А. calcoaceticus ADP1.

Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

Изучение пространственной структуры 4-ХПК 1,2-ДО показало, что конечная модель содержала 2-257 аминокислот каждого мономера, два атома Fe(III), две молекулы бензоата, две молекулы фосфолипида, 284 молекулы воды и молекулу Tris буфера. На рисунке 14 схематически представлена вторичная структура фермента, полученная на основании его аминокислотной последовательности, на рисунке 15 - его третичная структура. Установлено, что молекула фермента состоит из двух каталитических доменов, связанных линкерным доменом. Общая структура каталитических доменов образована рядом ß-слоев и несколькими редкими спиралями, соединенных неупорядоченной структурой. Линкерный домен образован а-спиралями обоих мономеров и находится в центре молекулы. Линкерный домен образован двумя длинными (Н1 и Н2) и тремя короткими (НЗ-Н5) а-спиралями каждой субъединицы: четыре спирали с NH2-KOHua каждого мономера образуют петлю, которая взаимодействует с подобным мотивом другой субъединицы, и с пятой петлей, вытянутой из каталитического домена.

VI BLP'llEE TDL ХЗЫ? 11Т£НВХ Г'ТР Д ГЗТ XKQ УНХ S VGBA GET?PL TffLDJ.FF ST IVß SV.SY GX SHWT 1 10 2 0 3 0 40 5 0 6 0 7 0

SSAI0&PEEKE SAPLLTGKPATLPHfcADEPGDEHaiiTGSVRIJtS&TPITGÄVIDVmTSTirBG.irVSrESPA 71 SO Э0 100 110 120 130 140

GSIEFHSIILPVPYEIE

23 0 240 250 257

Рисунок 14. Вторичная структура 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1ср

Центральная часть каталитического домена образована рядом р-слоев, собранных в Р-сэндвичи, и нескольких редких колец, расположенных между линкерным доменом и Р-сэндвичем. Металл активного центра расположен в участке редких колец, ограничен с одной стороны системой р-сэндвича каждого мономера, с другой - а-цепями линкерного домена. Гидрофобный вход в активный центр образован остатками Leu-49, Pro-77, Phe-78, lie-171 (Pro-172) и скелетом лигандов железа Туг-134 и Туг 169.

Рисунок 15. Модель третичной структуры 4-ХПК 1,2-ДО из Л. орасш 1ср (вверху) и она же, повернутая на 90° вдоль горизонтальной оси (внизу).

Молекула 4-ХПК 1,2-ДО содержит два связанных фосфолипида, что, вероятно, характерно для ферментов этого класса [Vetting and Ohlendorf, 2000]. Точной идентификации этого соединения проведено не было из-за отсутствия электронной плотности головной части. В данном случае эти молекулы были смоделированы на основе молекулы фосфатидилхолина с двумя С14/С15 гидрофобными хвостами. Обе фосфолипидные структуры локализованы в пространстве между двумя субъединицами, каждая - в конце большого гидрофобного канала, образованного петлями Н1 и Н2 обоих мономеров, с головными группами, направленными наружу в раствор, и с хвостовыми частями, направленными внутрь друг к другу. Функциональной роли фосфолипидов в молекуле ферментов пока не дано какого-либо объяснения.

3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

Конечная модель включала 2-257 аминокислотный остаток каждой субъединицы, два атома Fe(III), два бензогидроксамата, два фосфолипида, 284 молекул воды и одну молекулу Tris буфера. Вторичная структура этого фермента представлена на рисунке 16.

Усредненная модель димера содержит два каталитических домена, образованных четырьмя ß-слоями и несколькими редкими кольцами, и линкерным доменом, образованным несколькими а-спиралями обоих мономеров и расположенных в центре молекулы. Каждая субъединица содержит каталитический пакет с атомом железа(Ш), доступный для субстрата с наружной стороны молекулы. Таким образом, пространственная структура 3-ХПК 1,2-ДО в целом была сходна со структурой 4-ХПК 1,2-ДО.

Сравнение активных центров диоксигеназ

Идентифицируя аминокислотный состав активного центра фермента, мы установили, что в центре содержится мононуклеарный ион Fe(III), связанный с остатками Tyr-134, Tyr-169, His-194 и His-196. His2Tyr2 координация является

HSTDRTGMlVGKHI AAIKAVIKDEKVSYSEYKASTG'WLI SVGEKHEWPLELBVFEEHAIESVAAESHRGS 1 10 20 30 40 SO 60 70

Q SS IQ GP YFI P GAPEL SIPYTHPHRBDES GD TL IEEGEVVDQE GAPLADVLLDHWQABAAGEYSJTi ЙР TL 11 80 90 100 110 120 130 140

PBYLERGKIRTDENGRS TLRTI VP AP YEIPKH GP 7 GALL AAAGWAWRPAHLlWn ÄÜEGYE SI T*I(iLYS

EKGQWTG SU VAJIAVKPELLLSLDKI EAQSGPHiE TSYKJ? TL GKV 211 220 230 240 250

__ A, A

Рисунок 16. Вторичная структура 3-ХПК 1,2-ДО. типичной для интрадиольных диоксигеназ расщепления кольца [Lange & Que, Jr. 1998; Briganti et al., 2000]. Данные рентгено-структурной абсорбционной спектроскопии показали, что нативный фермент является пятикоорди-нированным с двумя сферами атомов: или два 1.9 Ä и три 2.1 А или три 1.9 А и два 2.1 А [Benvenuti et al., 1999].

Каталитический карман 4-ХПК 1,2-ДО (Рисунок 17) образован несколькими аминокислотными остатками: Leu-49, Asp-52, Ala-53 НЗ петли; Ile-74, Gln-75, Gly-76, Pro-77, Phe-78, Phe-79 участка отдельных петель; Trp-126 слоя S3; лиганд железа Туг-134 второй редкой петли; Tyr-169 S6 слоя; lie-171 третьей редкой петли; Arg-191 слоя S7; His-194 и His-196 слоя S8; Gln-210 слоя S9; Cys-224 редкой петли.

Рисунок 17. Наложение структуры активного центра 4-ХПК 1,2-ДО и ПК 1,2-ДО из А. са1соасеИст (номера аминокислотных остатков указаны в скобках).

Каталитический карман 3-ХПК 1,2- ДО образован несколькими аминокислотными остатками Leu49, Asp52, Val53 петли НЗ, Ile74, Gln75, Gly76, Pro77, Туг78, Phe79 одиночной редкой петли, Тгр125 из слоя S3, лигандов железа Туг133 из второй редкой петли, Туг 167 слоя S6, Не 169 третьей редкой петли, Argl88 слоя S7, Hisl91 и Hisl93 из слоя S8, Gln207 из слоя S9 и А1а221 редкой петли Остатки Leu49, Рго77, Туг78, Ие169 и скелетные цепи лигандов железа Туг133 и Туг167 образуют гидрофобный вход в активный центр Каталитический центр 3-ХПК 1,2-ДО содержит атом (III), связанный с остатками четырех аминокислот. Туг 133, Туг 167, His 191 и Hisl93.

Дополнительные плотности, определенные как молекулы бензогидро-ксамата в координационной сфере железа 3-ХПК 1,2-ДО и бензоата - у 4-ХПК 1,2-ДО, были также обнаружены в структуре гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы из Nocardiodes simplex ЗЕ (Ferraran et al, 2006) Их присутствие можно объяснить, если допустить, что эта плотность является фрагментом сидерофора Фактически, бактерии и грибы обладают сложной системой, основанной на сидерофорах, для приобретения, транспортировки и использования атомов железа Грам-положительные бактерии, в том числе и родококки, обладающие толстой липоидной клеточной оболочкой, действующей как барьер для различных материалов, разработали более сложные системы переноса, чем у других бактерий [Ratledge & Dover, 2000] Среди нескольких структурно-различных молекул, которые, как предполагается, участвуют у микобактерий в получении железа, есть сложные свдерофоры, чья способность хелатировать железо определяется орнитин-производными гидроксаматами [Carrano et al, 2001, De Voss et al, 1999], что позволяет объяснить присутствие их фрагментов в активном центре диоксигеназ

Таким образом, пространственная структура одной субьединицы 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО модифицированных орто-путей штамма R opacus lcp в целом обладает рядом сходных черт Но сравнение аминокислотных последовательностей 4-ХПК 1,2-ДО с 3-ХПК 1,2-ДО показывает (Рис. 18), что несколько участков, аминокислотные остатки которых составляют активный центр, имеют значительные замены Особенно это заметно в выровненных последовательностях ХПК 1,2-ДО штаммов Р putida рАС27, R eutropha pJP4, Р chlororaphis RW71 и 3-ХПК 1,2-ДО R opacus lcp, которые более специфичны к 3-ХПК [Pieper et al., 1988, Brodenck & O'Halloran, 1991, Maltseva et al, 1994, Potrawfke et al, 1998]. Мы предполагаем, что возможной причиной наблюдаемых различий в субстратной специфичности диоксигеназ может быть замена остатка Val и Туг (последний взаимодействует с заместителем субстрата в положении 3), у 3-ХПК 1,2-ДО(з) на А1а-53 и Phe-78, соответственно, у 4-ХПК 1,2-ДО Кроме того, из Cys-223 и 224, которые являются консервативными у всех хлорпирокатехиндиоксигеназ и, как предполагается, важны для связывания хлорированных заместителей, у 4-ХПК 1,2-ДО присутствует только Cys-224, а 223 заменен на Ser [Vetting & Ohlendorf, 2000] Более того, эти два остатка цистеина полностью отсутствуют у 3-ХПК 1,2-ДО, таким образом, сводя на "нет" приписываемую им функцию выбора субстрата

10 20 ЗО 40 50

MSTDRT GNX VGKbdEBJUH AVXKDEKVS YSE lOCASTGWLIS VGE KKEWE9

man'i KV u; im:>ki'i IXI rani i VRHK IT TI> к YI I 1 t-tjYMi s VI,F Агит-.т;!

10 20 ЗО 40 50

60

gFF^HaiE

SFF grTVD SO

70

SViUiESBBGSQS S&jSGl

BO 9 О lOO 110 «

|f:dpgap els - не имюешее s got lifrge?toqegsbl ad

SVS-K5KGNWTSS^gaG| 70

gETCE GAP LLT GKP SIL6MRflDEPGDEMBFTGS VEDT SGTPIXG .80 90 lOO HO 120

120 130 1140 ISO ISO ПО

3C1CD VLLEMnTCiaD ЛЛС EMS FMPTLPD- VXJTRGK mt DEHGBET LET IVE йрВЕЛ KHG PTGAL

4 C1CD AVIDVWHST WDGH|S FFSPmPDO^LBSRVra №DGi!IE FHS ИШ VE|gE XP KSGSTGQL 13 0 140 150 160 17 0 180

180 ISO 200 2Ю 220 230

3 C1CD % A AA- G WHA^ Ц P Ml IAKEGYE SLTliLiFEHGQBTG SDV^WAVKI? КЗ JLXSLDKIEA

¿WSTOjGRHSWHPPHIHTIlirriUXlYIWLTri QMFEGDPYLDSriS|i5BVK£;ELVIi>V!«iXDJ 190 200 210 220 . 230 240

3C1CD 4010D

240 250

QSGPHFETSYKFILGKV

DGE TWQLVD FHF IIiQHM 25 О

p Лиганды Fe

Амк-ые остатки, участвующие в связывании субстрата

Рисунок 18. Сравнение аминокислотных последовательностей 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1ср.

Argl88 и Gln207 консервативны во всех ПК 1,2-ДО и ПКК 3,4-ДО, и, как показано, определяют расположение субстрата, его депротонирование путем ван-дер-ваальсового взаимодействия с кольцом, что предотвращает его вращение в двух экваториальных плоскостях и/или обеспечивая электростатический противозаряд для создания электронной плотности на углеродных атомах кольца.

Наложение активных центров диоксигеназ по четырем лигандам железа (Туг 133/134, Туг 167/169, His 191/194 и Hisl93/196 у 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХГЖ 1,2-ДО, соответственно) (Рис. 19) ясно показывает, что только несколько аминокислотных замен наблюдается в каталитической полости, из них наиболее видимые Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО, соответственно), в то время как другие остатки, за исключением некоторых незначительных сдвигов в скелетных и боковых цепях, остаются одинаковыми.

Таким образом, сравнение активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из R. opacus ср позволило выявить аминокислотные остатки, участвующие в связывании субстратов, и на этой основе определить те аминокислоты, замена которых может определять различия в субстратной специфичности данных ферментов.

Заключение

Родококки, являясь представителями большой таксономической группы нокардиоподобных микроорганизмов, до недавнего времени оставались

Рисунок 19. Сравнение активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО из Я. орасш 1ср.

довольно слабо изученными в отношении их биодеградативного потенциала, в частности, практически не были изучены ферменты, участвующие в разложений ароматических соединений и их галогенированных и метилзамещенных аналогов. Проведенный нами скрининг среди бактерий рода Ккоскэсоссия выявил активные штаммы-деструкторы ароматических соединений. Для изучения их метаболческого потенциала были использованы субстраты, различающиеся по степени влияния на клетку: токсичные галофенолы, менее токсичные фенол и бензоат, которые, тем не менее, служат консервантами, и метилбензоат.

Проведенные нами исследования показали, что ответ клетки на внесение ароматических соединений носит многосторонний характер, который мы отмечали на всех уровнях ее организации, начиная от аминокислотного состава ферментов и заканчивая ростовыми характеристиками. В таблице 14 суммиро-

41

I

Таблица 14. Ферменты и биодеградативные пути у родококков, описанные в данной работе

Ростовой субстрат Тип пути Ферменты Особенности Примечание

Шюйососст гкойоскгоия 89

фенол обычный орто-путь ПК 1,2-ДО высокая активность с 3-ХПК » - ~

мин активна с 2ХМ, два интермедиата (2ХМЛ, 5ХМЛ), образуется цис-диенлактон отличается от всех известных (Х)МЦИ -А?*

ЩюЛососсш- гкойпп 135 ' ?

фенол обычный орто-луть ПК 1,2-ДО высокая активность с 3-ХПК

Ююйососст ораст Ш

фенол обычный орто-путь _ * ПК 1,2-ДО два изофермеята, различающиеся по стабильности

Шойососсш оросив 1ср

бензоат эбычный орто-путь МЦИ способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ

пара-толуат обычный орто-яуть ПК 1,2-ДО широкая субстратная специфичность

ХПК 1,2-ДО присутствие дополнительного фермента из 4-ХПК ветви модифицированного орто-пути

4-ХФ иодифицирован-ный орто-щтъ у родококков охарактеризован впервые

4-ХПК 1,2-ДО специфичность к субстратам с заместителями в пара-ноложент впервые расшифрована пространственная структура фермента, размещена в 11С5В базе данных под номером 1Б9А

ХМЦИ способность выбирать направление циклоизомеризации 2-ХМ

цлг специфична к г/ис-диенлактонам

2-ХФ новый описан впервые, аналогов нет

модифицированный орто-тгръ 3-ХПК 1,2-ДО активна с 3 -хлорпирокатехином впервые расшифрована пространственная структура фермента, размещена в RCSB базе данных под номером 2BOY, нукяеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером 067987

ХМЦИ Высокая специфичность, способность выбирать направление щдаюизомеризации 2-ХМ нукяеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD 28144

ХМЛДГ Активна с 5-хлормуконолактоном нукяеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD28145

цлг специфична к уне-диенлактонам нуклеотидная последовательность расположена в NCBI базе данных под номером CAD28143

Rhodococcus ruber P25

4-ХБК ПОБГ специфичность к МАОН

ПКК 4,5-ДО экстрадиольное раскрытие ароматического кольца

ПОБК [ТКК 3,4-ДО два изофермента, различающихся по скорости раскрытая кольца ПКК

napa-голуат обычный opmo-путь ПК 1,2-ДО активность с метилпирокатехинами выше, чем с пирокатехином, низкая активность с хлорпирокатехинами новый тип пирокатехин 1,2-диоксигеназ

ваны данные, полученные в настоящей работе с акцентом на выявленные особенности ферментов и путей разложения ароматических соединений родококками

Изученная нами способность родококков разлагать ароматические соединения показала, что эти штаммы осуществляли трансформацию или полную утилизацию различных соединений Этот факт является свидетельством разнообразия ферментных систем, участвующих в разложении ароматических соединений родококками Эксперименты по разложению фторфенолов клетками Я орасш 1ср, Я гкойпи 135 и Я гкосЬскгош 89 убедительно показали, что эти штаммы способны в условиях кометаболизма осуществлять трансформацию ди- и трифторированных фенолов с различной степенью глубины данного процесса, а широта субстратной специфичности ферментов, катализирующих первые этапы разложения субстратов, определяла степень этой "глубины"

В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что у родококков присутствовали различные наборы ключевых ферментов при росте на ароматических субстратах Так, у К орасш Ш при росте на феноле происходила индукция двух ПК 1,2-ДО При росте штамма Я орасш 1ср на бензоате было обнаружено две ПК 1,2-ДО, при росте на 4-хлор- и 2-хлорфенолах - по одному ферменту модифицированного орто-пути, на 4-метилбензоате - ПК 1,2-ДО и ХПК 1,2-ДО 4-хлорпирокатехиновой ветви Изоферменты различались по стабильности и каталитическим характеристикам Таким образом, способность индуцировать несколько ключевых изоферментов в ответ на воздействие ксенобиотика может или повышать биодеградативный потенциал штамма и обеспечивать ему выживаемость в меняющихся условиях окружающей среды или отражает в какой-то мере неспецифичный ответ микроорганизмов на действие токсиканта

Особенно наглядным примером адаптации родококков к изменяющимся условиям культивирования является показанная нами на примере штамма Я орасш 1ср способность адаптироваться к росту на изначально неростовых субстратах, путем приобретения пути, ферменты которого характеризуются высокой специфичностью к новым субстратам

Проведенные исследования существенно расширили представления о каталитических и структурных свойствах ферментов, участвующих в разложении токсичных соединений у родококков Впервые были обнаружены, выделены в гомогенном виде и охарактеризованы ферменты 4-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-щш, описан новый модифицированный орто-щгъ разложения 3-хлорпирокатехина и проведен сравнительный анализ гомологичных ферментов родококков и грам-отрицательных бактерий Такой подход позволил выявить наличие существенных различий в каталитических свойствах сравниваемых ферментов, и в целом свидетельствовал о высокой адаптации ферментов родококков к превращению интермедиатов, образующихся в результате разложения разных токсикантов.

Одним из основных итогов данной работы явилось выявление факторов, определяющих различия в субстратной специфичности ключевых ферментов разложения ароматических соединений на примере хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Эти работы явились новьм шагом на пути понимания механизмов

разложения чужеродных соединений бактериями и открывают в дальнейшем

широкие перспективы для получения ферментов с заранее заданными

свойствами

Выводы

1 Создана коллекция активных штаммов-деструкторов фенолов, 2-, 3- и 4-монохлор-фенолов, 2,4-Д, 3-хлорбензоата, 4-метилбензоата (ияра-толуат) В результате проведенного анализа были отобраны штаммы КкосЬсоссш гЪо<1оскгош 89, ЯЪойососсш орасш Ю, ЯкосЬсосст гкос1пп 135, разлагающие фенол, Якойососсив орасш 1ср, полностью минерализующий фенол, 2-хлор-, 4-хлор- и 2,4-дихлорфенол, и-толуат, ЯЬойососсш орасш Р25, утилизирующий и-толуат и хлорбифенилы

2 Впервые изучены ферменты модифицированного орто-пути разложения 4-хлорпирокатехина у грам-положительной бактерии — Якойососст орасш 1ср Обнаружены, выделены в гомогенном виде и охарактеризованы хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, диенлак-тонгидролаза Константа специфичности 4-хлорпирокатехин 1,2-диокси-геназы была на порядок выше для субстратов с заместителями в пара-положении, чем для мета-замещенных Хлормуконатциклоизомераза была специфична к 3-хлор-г/мс, г^мс-муконату, а диенлактон гидролаза проявляла активность только с г/иодиенлактоном

3 Впервые описан новый модифицированный орто-щгъ разложения 3-хлорпирокатехина у штамма Я орасш 1ср, выращенного на 2-хлорфеноле Выделены, охарактеризованы ферменты этого пути хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, хлормуконолактондегалоге-наза, диенлактонгидролаза Показано, что новый путь содержит в своем составе как ферменты модифицированного орто-пути разложения хлорпирокатехинов, так и один из ферментов обычного орто-щш

4 Детально изучены реакции циклоизомеризации (хлор-)фтормуконовых кислот и последующего дегалогенирования образующихся муконо-лактонов ферментами родококков Показано, что реакция циклоизоме-ризации 2-галомуконата является определяющей для характеристики катализирующих ее (хлор)муконатциклоизомераз и позволяет выявить принципиальные различия между муконатциклоизомеразами родококков и грам-отрицательных бактерий.

5 Впервые получены в кристаллическом виде хлорпирокатехазы 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного орто-пути штамма Я орасш 1ср Рентгено-структурный анализ полученных кристаллов позволил установить пространственную структуру хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, выявил наличие молекулы бензоата в активном центре 4-ХПК 1,2-ДО и бензогидроксамата у 3-ХПК 1,2-ДО. Показано, что факторами, определяющими различия субстратной специфичности диоксигеназ, являются аминокислоты, формирующие как активный центр в местах связывания и позиционирования субстратов, так и вход в него

6 Проведенное широкое исследование ферментов, участвующих в разложении незамещенных и замещенных ароматических соединений у бактерий рода Rhodococcus, заполнило значительный пробел в изучении процессов биодехрадации устойчивых поллютантов микроорганизмами 7. Изучение биодеградативных путей разложения метил- и галоароматических соединений у родококков с биохимических, генетических и структурных позиций показало, что их высокий биодеградативный потенциал объясняется своеобразной организацией этих метаболических путей, включающей способность бактерий реагировать на новые для них субстраты индукцией изофункциональных ферментов с различной субстратной специфичностью, образованием новых стабильных и высоко специфичных метаболических путей, а также привлечением нескольких специфичных ферментов из уже существующих метаболических путей

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи

1 MB Суворова, И П Соляникова, Л А Головлева (2006) Особенности орто-расщепления пирокатехина при разложении пара-толуата бактерией Rhodococcus opacus lcp 12 ,1616-1624.

2 М Ferraroni, IР Solyanikova, М Р Kolomytseva, A Scozzafava, LGolovleva, FBriganti (2006) Crystal structure of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase key enzyme of a new modified огйо-pathway from the gram-positive Rhodococcus opacus 1CP grown on 2-chlorophenol J Mol Biol, 360, 788-799

3 MFerraroni, IP Solyanikova, MP KofSmytseva,.......if1' Scozzafava,

L.Golovleva, FBriganti (2006) Crystal structure of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus opacus 1CP ProtemD^aBOTk, accession number

4 Коломыцева M П, Соляникова И П., Головлев Е Л, Головлева Л А (2005) Гетерогенность Rhodococcus opacus ЮР как ответ на стрессовое воздей-ствие хлорфенолов Прикл биохим микроби.ол.,41. 5. стр 541-546

5 M.Ferraroni, IР Solyanikova, М Р Kolomytseva, L A Golovleva, А Scozzafava, FBriganti (2004) Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utihzing gram-positive Rhodococcus opacus lcp. J Biol Chem.. 279 (26), 27646-27655

6 M Ferraroni, IP Solyanikova, M P Kolomytseva, L A Golovleva, A Scozzafava, FBriganti (2004) Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus opacus lcp. Protein Data Bank, accession number ls9a

7 IP Solyanikova, О VMoiseeva, S.Boeren, MGBoersma, M P. Kolomytseva, J Vervoori, IM С M Rietjens, LA Golovleva, WJHvan Berkel (2003) Conversion of 2-fluoromuconate to m-dienelactone by purified enzymes of Rhodococcus opacus lcp Appl Environm Microbiol, 69, 5636-5642

8 VMTravkm, IP SоlyапШоva7 Т^геооЙГ"!MCMRietjens, WJHvan Berkel, L A Golovleva (2003) Degradation of 3,4-dichloro- and 3,4-difluoroamline by Pseudomonas fluorescers 26-K J Environm Sci Health. B38, p 121-132

9 M Ferraroni, M V R Tanffa, A Scozzafava, IP Solyanikova, M P.Kolomytseva, L A Golovleva, F Briganti (2003) Preliminary crystallographic analysis of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from a new modified ortho-paûmay from the gram-positive Rhodococcus opacus 1CP grown on 2-chlorophenol Acta Crystallagraphica.D 59.188-190

10 О V.Moiseeva, IP Solyanikova, S Kaschabek, M Thiel, L.A Golovleva, M Schloemann (2002) A new modified ortho-cleavage pathway of 2-chlorophenol degradation by Rhodococcus opacus 1CP genetic and biochemical evidences J.Bacteriol., 184,5282-5292

1'J "'M'Perràroni, M V R Tariffa, F.Bnganti, A. Scozzafava, SMangano, I P.Solyanikova, M P Kolomytseva, L.A Golovleva (2002) 4-Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizmg gram-positive Rhodococcus opacus 1CP Crystallization and preliminary crystallographic analysis. Acta Crystallography, D58,1074-1076

l z. Соляникова ИП, Шлеманн M, Головлева Л А (2001) Новый тип муконатциклоизомеразы из Rhodococcus rhodochrous 89 Биохимия._б6. 7, стр. 922-928

13 Моисеева О В , Белова О В , Соляникова И П., Шлеманн M, Головлева Л А (2001) Ферменты нового модифицированного орто-пути из Rhodococcus opacus 1СР, утилизтрующего 2-хлооФенол. Биохимия^бб. 5, стр 678-687

14 M G.Boersma, IP Solyanikova, WJHVan Berkel, JVervoort, LA Golovleva, IM C.M Rietjens (2001) 19F NMR metabolomics for the elucidation of microbial degradation pathways of fluorophenols J of Ind Microbiol and Biotechnol, 26,22-34. «я«««»* ТВГСоляникова ИП, Головлев ЕЛ, Лисняк ОВ, Головлева Л А (1999) Выделение и характеристика пирокатехаз из штаммов Rhodococcus rhodnn 135 и Rhodococcus rhodochrous 89 сравнение с аналогичными ферментами обычного и модифицированного остио-пути Биохимия-64.7, стр 982-989

16 F Briganti, S Mangani, L Pedocchi, A Scozzaiava, L A Golovleva, A P Jadan, IP Solyanikova (1998) XAS characterization of the active sites of novel mtradiol ring-cleaving dioxygenases hydroxyquinol and chlorocatechol dioxygenases FEBS Lett 433, 58-62

17. V S.Bondar, MGBoersma, EL.Golovlev, JVervoort, WJHVan Berkel, ZI Fmkelstem, IP Solyanikova, LA Golovleva, I.M С M Rietjens (1998) 19F NMR study on the biodégradation of fluorophenols by various Rhodococcus species Biodégradation 9,475-486

18 IP Solyanikova, YaTu.Protopopova, VMTravkm, LA.Golovleva (1996) Key enzymes of 2,4-D and 2,4,5-T degradation from Nocardioides simplex strain 3E Biochemistry (Moscow) 61, 461-466 Translated from Biokhimiya 61, 635-642Г-Г-*-———

19 IP Solyanikova, О V Maltseva, M D Vollmer, L A Golovleva, M Schlomann (1995) Characterization of muconate and chloromuconate cycloisomerase from Rhodococcus erythropohs 1CP indications for functionally convergent evolution among bacterial cycloisomerases J Bacterid 177,2821-2826

20 Соляникова И П, Мальцева О В, Головлева Л А (1995) Модифицированный орто-путь у штамма Pseudomonas putida 87 очистка и свойства диенлактонгшшолазкцБиохимия. 60, 8, стр 1251-1260

21 О V.Maltseva, IР Solyanikova, L A Golovleva (1994) Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus erythropohs 1CP Kinetic and immunochemical comparison with analogous enzymes from gram-negative strains Eur J Biochem 226,1053-1061 " 1......

22 О V Maltseva, IP Solyanikova, LA Golovleva, MSchlomann, HJ Knackmuss (1994) Dienelactone hydrolase from Rhodococcus erythropohs 1CP: purification and properties Arch Microbiol 162,368-374 -

23 Соляникова ЙП, МалшцеваОВТ*Толовлева Л A. ((1992) Очистка и свойства пирокатехин 1,2-диоксигеназы II из Pseudomonas putida 87 Биохимия. 57.12. стр 1883-1891

24 L A.Golovleva, О V Maltseva, IР Solyanikova (1992) Metabolism of foreign compounds in Pseudomonas spp in Pseudomonas Molecular Biology and Biotechnology (Galli, E, Silver, S., Witholt, B, eds), pp 231-238, ASM, Washington, D C.

25 Мальцева OB , Соляникова ИП, Головлева Л A (1991) Пирокатехазы штамма Rhodococcus erythropohs - деструктора хлорфенолов очистка и свойства faoxHMHS. 56, 12, стр 2188-2197

Обзоры

26 V М Travkm, IР Solyanikova, L A Golovleva (2006) Hydroxyquinol Pathway for Microbial Degradation of Halogenated Aromatic Compounds J Environm Sci Health,41,1361-1382

27 I.P Solyanikova, L A Golovleva (2004) Bacterial Degradation of Chlorophenols Pathways, Biochemical, and Genetic Aspects J Environm Sci Health,B39,p 333-351

28. Соляникова ИП, Головлева Л A (1999) Фенол гидроксилазьг современное состояние вопроса. Биохимия, 64,437-446. Тезисы докладов и стендовых cSSBflfifflffl®8 1. О. V.Maltseva, IР Solyanikova, LA Golovleva (1990) The metabolism of chlorophenols by Rhodococcus erythropohs 06C-02 Book of abstracts of 7th International congress of pesticide chemistry Hamburg August 5-10, 1990

2 IP Solyanikova, О V Maltseva, L A Golovleva (1991) Purification and comparison study on key enzymes of ort/?o-pathway from strains-degraders of chlorinated aromatic compounds P181 Book of abstracts 2nd All-union simposium "Teoretical and applied aspects of molecular biology" Samarkand, September 22-28, 1991

3 LP.Solyanikova, О V Maltseva, L.A Golovleva (1991) Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase II from Pseudomonas putida 87 p.57 Book of abstracts of 3rd International symposium on Pseudomonads Biology and biotechnology Trieste, Italy, June 16-20, 1991

4 IP Solyanikova, OV. Maltseva, MD Vollmer, LA Golovleva, MSchlomann (1993) Chloromuconate cycloisomerase from Rhodococcus erythropohs 1CP, an intermediate stage m the adaptation for chlorosubstituted substrates Bioengineenng, 1993, V 9(1), P210

5. MSchlomann, MD Vollmer, IP Solyanikova, HHoier (1993) Muconate versus chloromuconate cycloisomerases Implications for the evolution of chlorocatechol degradative pathways Bioengmeenng, 1993,9(1), V201

6 IPSolyanikova, MD,Vollmer, OVMaltseva, LA.Golovleva, MSchlomann (1994) Muconate cycloisomerase of Rhodococcus erythropohs 1CP and its contributions to an evolutionary puzzle. Bioengmeenng, 1994,10(3), P410

7 M D Vollmer, IP Solyanikova, O.V Maltseva, L.A Golovleva, M.Schlomann (1994) Diversity in 2-chloromuconate cycloisomerization Indications for convergent evolution of chlorocatechol degradative pathways Abstr of the 94th General Meeting of the American Society for Microbiol Las Vegas, Nevada May 23-27 1994 Q-367

8. О V Maltseva, IP Solyanikova, L A Golovleva, M Schlomann, H -J Knackmuss (1994) Purification and properties of dienelactone hydrolase from the chlorophenols degrading strain Rhodococcus erythropohs 1CP Abstr of the 94th General Meeting of the American Society for Microbiol Las Vegas, Nevada May 23-27 1994 Q-368

9. О VMaltseva, IP Solyanikova, L A Golovleva (1994) Chlorophenols are competitive inhibitors of catechol- and chlorocatechol 1,2- dioxygenases of the strain Rhodococcus erythropohs 1CP Abstr of the 8th IUPAC Intern Congress of Pesticide Chemistry Washington July 4- 9 1994 Book of Abstr V 2,693

ЮСоляникова ИП, Мальцева OB., Головлева Л.А. (1994) Особенности разложения хлорфенолов штаммом Rhodococcus erythropolislXQ Тезисы докладов конференции Биотехнология защиты окружающей среды. Пущино. 18-19 октября 1994

11 Соляникова И П, Мальцева О В , Фольмер М.Д, Шлеманн М, Головлева Л А (1994) Особенности циклоизомерйзации хлормуконовых кислот штаммом Rhodococcus erythropohs 1ХФ. Тезисы докладов конференции Биотехнология защиты окружающей среды Пущино 18-19 октября 1994

12 MSchlomann, Eulberg D, IР Solyanikova, VSeibert, LA Golovleva (1995) Convergent evolution of chlorocatechol catabolic pathways'? Characterization of degradative genes from Rhodococcus erythropohs 1CP and comparison to those of Gram-negative bacteria EERO Workshop. Enzymatic and genetic aspects of environmental biotechnology Pushchino, 1995

13 IP Solyanikova, OVMaltseva, LA Golovleva (1995) Competitive inhibition of catechol and chlorocatechol 1,2-dioxygenases of Rhodococcus erythropohs 1CP by different phenolic compounds EERO Workshop Enzymatic and genetic aspects of environmental biotechnology Pushchino, 1995

14.S R Kaschabek, I P.Solyamkova, OVMoisseeva, LA Golovleva, and M Schlomann (2000) Degradation of 2-chlorophenol by Rhodococcus opacus 1CP via dehalogenation of 5-chloromuconolactone to cis-dienlactone BlOspectrum, Sonderausgabe zum 1 Gemeinsamen Kongress der DGHM, OGHMP und VAAM "Microbiology 2000", 12-16 Marz 2000, Munchen. 13 P 1.39, p 47

15 0 Moisseeva, IP Solyanikova, О Belova, L A Golovleva (2000) Novel modified ori/to-pathway of Rhodococcus opacus 1CP utilizing of 2-chlorophenol enzyme

characterization International symposium Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology Pushchmo, June 25-30,2000 p 117

16 L A Golovleva, ZI Finkelstein, E L Golovlev, О Moisseeva, В P Baskunov, IP Solyanikova (2000) Bacterial degradation of chloroaromatic compounds. Abstracts of the conference "Biotechnology-2000" Pushchmo, September 2000 P 39

17Коломыцева МП, Соляникова ИП, Головлева JI А. (2003) Изофункциональные диоксигеназы Rhodococcus opacus lcp структурно-функциональные свойства Биология - наука XXI века. Сб тез VII-й Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 14-18 апреля, 2003, стр 343

18,Solyanikova I, Kolomytseva M., Ferrarom M, Scozzafava A, Bnganti F, Golovleva LA. (2004) Chlorocatechol 1,2-dioxygenases from Rhodococcus opacus lcp kmetic and structural aspects Abstracts of the conference Oxizymes in Naples 2nd European meeting Universita di Napoli Federico II, 3-5 June 2004, p 23.

19 Рыбкина ДО, Соляникова ИП, Головлева Л А, Плотникова ЕГ (2005) Штамм Microbacterium sp В51 - природный деструктор ароматических ксенобиотиков Тезисы международной конференции ICOMID-2005 Пермь, Россия, стр 85-86

20 Головлева Л А, Травкин В M, Соляникова И П, Коломыцева M П, Феррарони М., Бриганти Ф (2005) Биодеградация хлорфенолов и хлорфеноксиалкановых гербицидов биохимические, генетические и структурные аспекты Тезисы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» 14-16 сентября 2005, Саратов, Россия, стр 4-5

21 Головлева Л А , Коломыцева M П, Феррарони M, Бриганти Ф., Соляникова И.П, Травкин В.М (2006) Структурно-функциональные свойства диоксигеназ Материалы международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» 1-2 июня 2006, Минск-Раков, Беларусь, стр 20-23

Подписано в печать 09 07 2007 г Исполнено 10 07 2007 Печать трафаретная

Заказ № 587 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Соляникова, Инна Петровна

Список сокращений

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Состояние вопроса

1.3. Цель и задачи исследования

1.4. Научная новизна И

1.5. Практическая значимость

1.6. Связь работы с крупными программами

1.7. Апробация работы 14 Благодарности

2. Обзор литературы «Аэробное разложение (хлор)ароматических соединений бактериями»

Глава 1. Аэробное разложение ароматических соединений грам-отрицательными бактериями

2.1.1. Штаммы-деструкторы хлорфенолов

2.1.2. Подготовительные этапы разложения моно-полигалогенированных фенолов, фенолгидроксилазы

2.1.3. Основные пути разложения (хлор)пирокатехинов

2.1.3.1. .метд-Расщепление пирокатехинов

2.1.3.2. opwo-Расщепление (хлор)пирокатехинов

2.1.4. Гидроксигидрохиноновый путь расщепления

Глава 2. Генетические основы разложения ксенобиотиков микроорганизмами

Глава 3. Родококки как биодеструкторы ксенобиотиков

3. Методу и материалы

3.1. Организмы, методы их культивирования

3.2. Клонирование генов 3-ХПК катаболизма у R. opacus lcp

3.3. Приготовление бесклеточных экстрактов

3.4. Определение активности ферментов

3.4.1. Спектрофотометрическое определение активности ферментов

3.4.2. Определение активности ферментов методом фтористого ядерно-магнитного резонанса

3.5. Анализ образующихся метаболитов методом ВЭЖХ

3.6. Анализ образующихся метаболитов методом УФ-спектроскопии

3.7. Нативный и SDS-электрофорез

3.8. Определение N-концевой аминокислотной последовательности и аминокислотного состава

3.9. Очистка ферментов

3.9.1. Очистка ферментов из биомассы штамма R. opacus lcp, выращенной на бензоате

3.9.1.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

3.9.1.2. Муконатциклоизомераза

3.9.2. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 2-хлорфеноле

3.9.2.1. 3-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

3.9.2.2. Хлормуконатциклоизомераза

3.9.2.3. Хлормуконолактондегалогеназа

3.9.2.4. Диенлактонгидролаза 64 3*9.3. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 4хлорфеноле.

3.9.3.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

3.9.3.2. Хлормуконатциклоизомераза

3.9.3.3. Диенлактонгидролаза

3.9.4. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. opacus lcp на 4-метилбензоате

3.9.4.1. Пирокатехин диоксигеназа I

3.9.4.2. Пирокатехин диоксигеназа II

3.9.4.3. Муконатциклоизомераза

3.9.5. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма/?, rhodochrous 89 на феноле.

3.9.5.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

3.9.5.2. Муконатциклоизомераза

3.9.6. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте штамма R. rhodnii 135 на феноле

3.9.6.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

3.9.7. Очистка ферментов, индуцирующихся при росте R. ruber Р25 на различных ароматических субстратах.

3.9.7.1. Очистка и-гидроксибензоат гидроксилазы

3.9.7.2. Очистка протокатехоат диоксигеназы

3.9.7.3. Очистка ферментов из биомассы, выращенной на и-толуате 73 ЗЛО.Влияние ЭДТА и л-ХМБ на активность ферментов

3.11. Определение кинетических характеристик ферментов

3.12. Кристаллизация белков из R. opacus lcp 75 3.12.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

3.12.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

3.12.3. Рентгено-структурный анализ кристаллов

4. Результаты и обсуждение

4.1. Оценка роста родококков на различных ароматических субстратах 76 4.1.1. Морфологическая диссоциация R. opacus lcp при росте на (хлор)ароматических соединениях

4.2. Конверсия фторфенолов родококками

4.3. Ферменты обычного орто-пути, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus lcp набензоате

4.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.3.2. Муконатциклоизомераза

4.4. Ферменты opmo-пути, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus lcp на 4-метилбензоате (лдрд-толуате)

4.4.1. пирокатехин 1,2-диоксигеназа I

4.4.2. пирокатехин 1,2-диоксигеназа II

4.4.3. муконатциклоизомераза

4.5. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R.opacus lcp на 4-хлорфеноле 112 4.5.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.5.2. Хлормуконатциклоизомераза

4.5.3. Диенлактонгидролаза

4.6. Ферменты, индуцирующиеся при росте штамма R. opacus lcp на 2-хлорфеноле

4.6.1. 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.6.2. Хлормуконатциклоизомераза

4.6.3. Хлормуконолактондегалогеназа

4.6.4. Диенлактонгидролаза

4.7. Доказательство функций ферментов

4.7.1. Клонирование генов, кодирующих ферменты превращения 3-хлорпирокатехина

4.7.2. ВЭЖХ и спектральный анализ превращения 2-хлормуконата С1сВ2, ClcF и ClcD

4.8. Превращение 2-фтормуконатов и фтормуконолактонов

4.9. Ферменты штамма R. rhodochrous 89, выращенного на феноле

4.9.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.9.2. Муконатциклоизомераза

4.9.3. Превращение 2-хлормуконата

4.10. Ферменты штамма R. rhodnii 135, выращенного на феноле 162 4.10.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.11. Ферменты штамма R. opacus 1G, выращенного на феноле 163 4.11.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.12. Ферменты разложения ароматических субстратов штамма R. ruber Р

4.12.1. Ферменты разложения 4-хлорбензоата

4.12.1.1. иоря-Гидроксибензоат гидроксилаза

4.12.1.2. Протокатехоат диоксигеназа 166 4:12.2. Ферменты разложения иора-гидроксибензоата 167 4.12.3. Ферменты разложения 4-метилбензоата (идрд-толуата)

4.12.3.1. Пирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.12.3.2. Муконатциклоизомераза

4.13. Кристаллизация ферментов 175 4.13.1.4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.13.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа 176 4. 14. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ

4.14.1.4-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.14.2. З-Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа

4.14.3. Сравнение активных центров диоксигеназ 181 Заключение 192 Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Организация биодеградативных путей у родококков"

1.1. Актуальность проблемы

Живые организмы, в том числе микроорганизмы, подвергаясь воздействию различных условий среды и влиянию разнообразных факторов, включая пищевой рацион, температурный режим, уровень рН и солености, адаптировались к условиям окружающей среды. Изучение реакций основного метаболизма у бактерий показало, что за миллионы лет эволюции они приспособились к эффективному использованию природных соединений в качестве источника энергии, углерода, азота, серы и других, необходимых для жизнедеятельности, элементов и блоков. Совершенно иная ситуация возникла, когда в результате сельскохозяйственной и промышленной деятельности человека в окружающую среду стали попадать соединения и продукты их частичной трансформации, не имеющие аналогов или встречающиеся в природе в относительно небольших количествах, например, промышленные химикаты, фармакологические препараты и т.д., оказывающие влияние на все виды живой материи [Landber et al., 1977;

Renberg et al., 1980] и вызывающие явный дисбаланс в уже установившихся отношениях.

Поэтому изучение взаимодействия появившихся в биосфере соединений и ее биотической составляющей на примере модели «ксенобиотик-бактерия» является чрезвычайно интересным для понимания процессов, происходящих в настоящее время в окружающей среде, и прогноза возможных последствий. Бактерии являются ключевым л звеном в углеродном цикле и в этой связи оценка их ответа на атаку ксенобиотиков является принципиальной для построения модели поведения ксенобиотиков в биосфере и в составлении прогнозов, касающихся как охраны окружающей среды, так и влияния ксенобиотиков на различные формы жизни. Данные исследования позволяют: 1) изучить вопрос о приспособляемости бактерий к меняющимся условиям среды; 2) оценить широту метаболического потенциала бактерий; 3) выявить механизмы перестройки метаболических процессов при смене источников питания; 4) выделить и изучить штаммы-деструкторы различных ксенобиотических соединений, что позволит успешно применять их в промышленности в очистных установках.

В современных подходах к рациональному природопользованию можно выделить несколько ключевых моментов:

1) создание безотходных технологий;

2) создание технологий эффективного обезвреживания отходов на стадии производства, что будет препятствовать попаданию в окружающую среду вредных соединений;

3) создание технологий и методов обезвреживания токсикантов, уже попавших в окружающую среду в результате практической деятельности человека.

Поскольку в настоящее время применение безотходных технологий ограничено, то наиболее актуальным представляется решение проблем, связанных с разработкой технологий обезвреживания токсичных веществ, уже попавших в окружающую среду. В частности, для решения данных задач в первую очередь необходимо иметь прогнозируемую модель поведения токсиканта в природе и его влияние на биотическую составляющую, в случае нашего исследования - бактерий рода Rhodococcus. В свою очередь, создание такой модели предполагает изучение ответа родококков на воздействие токсиканта на различных - генетическом, биохимическом, физиологическом, молекулярном - уровнях и включает: выделение активных штаммов-деструкторов, определение метаболических путей, по которым происходит процесс биодеструкции, выявление особенностей функционирования этих путей у микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, изучение структуры ферментов и выявление генетических детерминант, обеспечивающих биодеградативный потенциал, установление на молекулярном уровне структур, определяющих различия в субстратной специфичности гомологичных ферментов.

В силу особенностей метаболизма первоначально изучение разложения токсических соединений было проведено у грам-отрицательных бактерий, преимущественно у псевдомонад. Однако исследования грам-положительных бактерий показали, что их метаболический потенциал не ниже, чем у микроорганизмов других групп, а некоторые физиологические отличия, например, устойчивость к стрессовым воздействиям и способность к длительному, в отличии от псевдоманад, периоду метаболической активности, делают их интересным объектом как для изучения фундаментальных вопросов (например, изучение основ субстратной специфичности ферментов), так и в прикладном аспекте. Среди грам-положительных бактерий род Rhodococcus является одним из интереснейших объектов для изучения. Это определяется и широким распространением бактерий этого рода в почве, и сохранением метаболической активности в разных диапазонах температур, и способностью к выживанию в самых неблагоприятных условиях, и, самое главное, первые же исследования метаболического потенциала родококков показали, что эти бактерии могут разлагать широчайший круг абиотических соединений, что определило наш интерес к этой группе бактерий.

При ^выборе токсических соединений, используемых в качестве модели для изучения влияния на клетки, учитывалось как их распространение, так и оказываемый токсический эффект. Нами были выбраны галогенированные, с одним-тремя заместителями, моноароматические производные бензоата и фенола. Галогенированные органические соединения широко используются в промышленности и сельском хозяйстве в качестве предшественников при производстве пластика, жидкостей для тушения огня, красителей, гербицидов, фунгицидов, растворителей и дезинфектантов. Так, в одйой Финляндии с 1934 по 1988 г было использовано около 30 ООО тонн различных хлорфенолов [Kitunen et al., 1987; Kitunen, 1990]. От 100 до 300 г хлорированных фенольных соединений (фенолы, катехолы, гваяколы, сиринголы и ванилины) образуется на одну тонну пульпы при ее хлорном отбеливании, что привело к накоплению хлорфенольных соединений порядка микрограмм на литр воды и порядка миллиграмм на один кг (сухой вес) донных отложений в озерах, принимающих обработанные сливы [Salkinoja-Salonen et al., 1981]. Исследования in vitro показали, что хлорфенолы могут разобщать окислительное фосфорилирование, нарушать микросомальную детоксификацию, влиять на синтез белков и РНК [Lundberg et al., 1980; Erlich et al., 1987; Priston et al., 1987]. Хлорфенолы склонны к О-метилированию с образованием хлоранизолов, димеризации и полимеризации и другим превращениям *

Haggblom,1992; Banerni et al., 1993; Laine and Jorgensen, 1996]. Образующиеся продукты биотрансформации могут быть более токсичными, чем исходные соединения [Заборина с соавт.,1997; van Hylckama Vlieg et al., 2000].

Известно, что ни один из современных химических методов очистки (например, термальный) не дает полного избавления от хлорфенолов, кроме того, такие методы чрезвычайно дороги по сравнению с биологическими (для примера - электроннолучевой метод подготовки питьевой воды, который на данный момент считается одним из наиболее эффективных и надежных, требует энергетических затрат 5 кВт-ч/м3 при производительности 50 м /ч [Строкин, 2007]), сжигание хлорфенолов при недостаточно высокой температуре неизбежно приводит к образованию полихлордиоксинов, оказывающихся неизмеримо более токсичными для здоровья людей, а проведение данного процесса при необходимо-высоких температурах делает весь процесс дорогостоящим. Кроме того, устойчивость хлорфенолов к электрохимической деструкции повышается в ряду: 2,4-дихлорфенол < 2,4,6-трихлорфенол < пентахлорфенол < 4-хлорфенол [Томилов с соавт., 2007] И только энзиматическое дегалогенирование позволяет получать безопасные для здоровья людей и окружающей среды продукты разложения галогенированных фенолов. Этими предпосылками обосновывались выбор субстратов в начале работы и необходимость всестороннего изучения процессов разложения устойчивых соединений. Такой подход позволяет не только интенсифицировать микробную деградацию трудно разлагаемых соединений, но также способствует пониманию процессов эволюции путей метаболизма, что, в свою очередь, может служить основой для лабораторного создания путей и отдельных ферментов с заранее заданными, желаемыми свойствами.

1.2. Состояние вопроса

К началу настоящей работы было известно, что начальные этапы разложения разнообразных ароматических соединений микроорганизмами приводят к образованию ограниченного числа ключевых интермедиатов, дальнейшее превращение которых проходит по нескольким метаболическим путям, широко распространенным у микроорганизмов. Одним из наиболее часто встречаемых ключевых интермедиатов при разложении ароматических соединений является пирокатехин (1,2-дигидроксибензол), превращение которого в Р-кетоадипат по обычному орто-пути [Ornston, 1966] последовательно катализируют пирокатехин 1,2-диоксигеназа, муконатциклоизомераза, муконолактонизомераза и еноллактонгидролаза. Иная картина была обнаружена при изучении ферментов, индуцирующихся при росте микроорганизмов на галогенированных субстратах. Так, в биомассе Pseudomonas sp. В13, выращенной на 3-хлорбензоате, помимо пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути, обнаружен второй фермент, расщепляющий 3-хлорпирокатехин, - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа [Dorn, Knackmuss, 1978а; Schmidt et al., 1980]. Было показано, что трансформацию 3-хлорпирокатехина в Р-кетоадипат у Pseudomonas sp. В13 осуществляют хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, диенлактонгидролаза и малеилацетатредуктаза. Данный путь назвали модифицированным opmo-uyim [Schlomann, 1994]. Эти работы можно считать началом разностороннего изучения ферментов разложения (хлор)пирокатехинов и это было одним из немногих результатов, полученных к началу наших экспериментов. Дальнейшие исследования, относящиеся с девяностым годам, также проводились в основном на грам-отрицательных бактериях [Pieper et al., 1985, 1988]. Установлено, что гены, кодирующие ферменты модифицированного орто-пуги у грам-отрицательных бактерий, .организованы в опероны сходной структуры и характеризуются высокой степенью идентичности. Показано, что ферменты, катализирующие аналогичные реакции разложения, характеризуются рядом общих свойств, тем не менее зачастую субстратная специфичность ферментов находится в прямой зависимости от тех субстратов, которые являются ключевыми интермедиатами при разложении ксенобиотиков [van der Meer et al., 199la,с]. В таком случае различия в субстратной специфичности аналогичных ферментов надо искать в структуре их активных центров. К началу '-нашей работы была изучена кристаллическая структура (хлор)муконатциклоизомераз и диенлактонгидролаз из грам-отрицательных бактерий и определены те аминокислоты, которые могут определять субстратную специфичность этих ферментов [Cheah et al., 1993]. Значительно позже была предпринята попытка методом сайт-направленного мутагенеза изменить субстратную специфичность (хлор)му-конатциклоизомераз у грам-отрицательных бактерий, однако однозначных результатов получено не было [Vollmer et al., 1998, Kaulmann et al., 2001]. Также ничего не известно о пространственной структуре хлорпирокатехаз грам-отрицательных бактерий; остался открытым вопрос об основах различий субстратной специфичности хлорпирокатехаз. На момент начала нашей работы практически ничего не было известно о ферментах разложения хлорпирокатехипов у родококков, хотя и имелось ограниченное количество публикаций о способности родококков разлагать ароматические соединения [Janke et al., 1988а,b; Straube, 1987] и, учитывая высокую перспективность бактерий этой группы как дектрукторов устойчивых ксенобиотиков, можно было предположить, что родококки, несомненно, представляет интерес для исследователей с точки зрения изучения метаболических путей и ферментов биодеградации токсикантов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Соляникова, Инна Петровна

Выводы

1. Создана коллекция активных штаммов-деструкторов фенолов, 2-, 3- и 4-монохлор-фенолов, 2,4-Д, 3-хлорбензоата, 4-метилбензоата (пара-топуж). В результате проведенного анализа были отобраны штаммы Rhodococcus rhodochrous 89, Rhodococcus opacus 1G, Rhodococcus rhodnii 135, разлагающие фенол; Rhodococcus opacus lcp, полностью минерализующий фенол, 4-хлор- и 2,4-дихлорфенол, п-толуат; Rhodococcus opacus Р25, утилизирующий и-толуат и хлорбифенилы. А

2. Впервые изучены ферменты модифицированного орто-пути разложения 4-хлорпирокатехина у грам-положительной бактерии - Rhodococcus opacus lcp. Обнаружены, выделены в гомогенном виде и охарактеризованы хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, диенлактонгидролаза. Константа специфичности 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы была на порядок выше для субстратов с заместителями в ш/хг-положении, чем для л/е/иа-замещенных. Хлормуконатциклоизомераза была специфична к 3-хлор-цис,цис-муконату, а диенлактон гидролаза проявляла активность только с z/ис-диенлактоном.

3. Впервые описан новый модифицированный орто-путь разложения 3-хлорпироА катехина у штамма R. opacus lcp, выращенного на 2-хлорфеноле. Выделены, охарактеризованы ферменты этого пути: хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатциклоизомераза, хлормуконолактондегалогеназа, диенлактонгидролаза. Показано, что новый путь содержит в своем составе как ферменты модифицированного орто-пути разложения хлорпирокатехинов, так и один из ферментов обычного орто-пути.

4. Подробно изучены реакции циклоизомеризации (хлор-)фтормуконовых кислот и последующего дегалогенирования образующихся муконолактонов ферментами родококков. Показано, что реакция циклоизомеризации 2-галомуконата является определяющей для характеристики катализирующих ее (хлор)муконат-циклоизомераз и позволяет выявить принципиальные различия между муконат-циклоизомеразами родококков и грам-отрицательных бактерий.

5. Впервые получены в кристаллическом виде хлорпирокатехазы 3-хлор- и 4-хлор-катехольных ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus lcp.

Рентгено-структурный анализ полученных кристаллов позволил установить пространственную структуру хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, выявил наличие молекулы бензоата в активном центре 4-ХПК 1,2-ДО и бензогидроксамата у 3-ХПК 1,2-ДО. Показано, что факторами, определяющими различия субстратной специфичности диоксигеназ, являются аминокислоты, формирующие как активный центр в местах связывания и позиционирования субстратов, так и вход в него.

6. Проведенное широкое исследование ферментов, участвующих в разложении незамещенных и замещенных ароматических соединений у бактерий рода Rhodococcus, заполнили значительный пробел в изучении процессов биодеградации устойчивых поллютантов микроорганизмами. я

7. Изучений биодеградативных путей разложения метил- и галоароматических соединений у родококков с биохимических, генетических и структурных позиций показало, что их высокий биодеградативный потенциал объясняется своеобразной организацией этих метаболических путей, включающей способность бактерий реагировать на новые для них субстраты индукцией изофункциональных ферментов с различной субстратной специфичностью, образованием новых стабильных и высоко специфичных метаболических путей, а также привлечением нескольких специфичных ферментов из существующих метаболических путей. А А

Заключение л

Родококки, являясь представителями большой таксономической группы нокардиоподобных микроорганизмов, до недавнего времени оставались довольно слабо изученными в отношении их биодеградативного потенциала, в частности, практически не были изучены ферменты, участвующие в разложении ароматических соединений и их галогенированных и метилзамещенных аналогов. Только лишь в последние годы появились работы, подробно описывающие разложение ароматических соединений представителями рода Rhodococcus. Литературные данные на протяжении значительного временного периода говорят о том, что, в целом, научные исследования в области биодеградации органических соединений проводятся с ограниченным числом штаммов. Если учесть, что в почве (в пересчете

7 1П на грамм сухого веса) и в зависимости от способа высева находится 10-10 бактерий, если не на несколько порядков больше, а количество активных штаммов-деструкторов ароматических соединений, описанных в мировой литературе, ограничивается порядком нескольких сотен культур, то можно сделать вывод, что способность микроорганизмов разлагать чужеродные соединения является в достаточной степени уникальной. Такое заключение следует из результатов множества скринингов, в том числе и наших. Обычной является ситуация, когда из почвы высеваются сотни бактерий, число выделенных из накопительных культур бактерий резко снижается, а количество чистых культур, способных к полной деструкции токсичных соединений, исчисляется единицами. Далее, даже среди этих штаммов удается отобрать только несколько, способных к разложению большого А числа токсикантов. Тем не менее, ситуация такова, что, если удается выделить активный штамм-деструктор, то очень велика вероятность того, что он будет разлагать большое количество соединений, различающихся в том числе по степени сложности и природе и количеству расположенных в ароматическом кольце заместителей. Как результат - в литературе описано ограниченное число бактериальных штаммов, относящихся к разным таксономическим группам, которые можно назвать уникальными в отношении их биодеградативного потенциала. К таким, в частности, относятся штаммы R. eutropha JMP 134, R. chlorophenolicus PCP-1, S. rochei 303, Rhodococcus sp. RHOl. К сожалению, в литературе не всегда удается проследить судьбу перспективных штаммов, так как только с некоторыми из них исследования ведутся непрерывно на протяжении значительного временного периода. а

Проведенный нами скрининг среди бактерий рода Rhodococcus позволил выявить ряд активных штаммов-деструкторов ароматических соединений. Для изучения их метаболического потенциала были использованы субстраты, различающиеся по степени влияния на клетку: токсичные галофенолы, менее токсичные фенол и бензоат, которые, тем не менее, служат консервантами, и метилбензоат.

Проведенные нами исследования показали, что ответ клетки на внесение ароматических соединений носит многосторонний характер, который мы отмечали на всех уровнях ее организации, начиная от аминокислотного состава ферментов и заканчивая физиологией роста колоний. В таблице 54 суммированы данные, полученные в настоящей работе с упором на выявленные особенности ферментов и путей разложения ароматических соединений родококками.

Изученная нами способность бактерий рода Rhodococcus разлагать ароматические соединения показала, что эти штаммы осуществляли трансформацию или полную утилизацию ароматических соединений. Этот факт является свидетельством разнообразия ферментных систем, участвующих в разложении ароматических соединений у данной группы микроорганизмов. Эксперименты по разложению фторфенолов клетками R. opacus lcp, R. rhodnii 135 и R. rlipdochrous 89 убедительно показали, что эти штаммы были способны в условиях кометаболизма осуществлять трансформацию ди- и трифторированных фенолов с различной степенью глубины данного процесса, а широта субстратной специфичности ферментов, катализирующих первые этапы разложения субстратов, определяла степень этой "глубины". А

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Соляникова, Инна Петровна, Пущино

1. Головлев E.JI. 1983. Биология сапрофитных микобактерий. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. 386 стр.

2. Горлатов, С.Н., Мальцева, О.В., Шевченко, B.JI. и Л.А.Головлева. 1989. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis. Микробиология, 58, 802-806.

3. Грищенков, В.Г., Федечкина, И.Е., Баскунов, Б.П., Анисимова, Л.А., Воронин, A.M. и Л.А.Головлева. 1983. Деградация 3-хлорбензойной кислоты штаммом Pseudomonas putida 87. Микробиология, 1983, 52, 771-776.

4. Донова, М.В. 2007. Трансформация стероидных соединений актинобактериями. Прикладная биохимия и микробиология, 43,1-12.

5. Жуков, Д.В., Мурыгина, В.П. и С.В.Калюжный. 2007. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов бактериями Rhodococcus ruber и Rhodococcus erythropolis. Прик. Биохим. Микробиол., 43, №1, 1-4.

6. Заборйна, О.Е., Барышникова, Л. М., Баскунов, Б. П., Головлев, Е.Л. и Л.А.Головлева. 1997. Разложение пентахлорфенола в почве интрадуцированным штаммом Streptomyces rochei 303 и активированной почвенной микрофлорой. Микробиология, 66, 661-666.

7. Ивойлов, B.C. 1979. Подготовительбный метаболизм я-гидроксибензойной кислоты у дрожжей рода Debaryomyces. Доклады Академии Наук СССР, 249,474-476.

8. Ившина, И.Б., Гришко, И.И., Ноговицина, Е.М., Кукина, Т.П. и Г.А.Толстиков. 2005. Биотрансформация Р-ситостерола и его сложных эфиров актинобактериями рода Rhodococcus. Прикладная биохимия и микробиология, 41, 626-633.

9. Карасевич, Ю.Н. и B.C.Ивойлов. 1977. Препаративный метаболизм пара-оксибднзоата у дрожжей Candida tropicalis. Микробиологи, 46, 687-695.

10. Козырева Л.П. и Л.А.Головлева. 1993. Рост Nocardioides simplexs на смеси гербицидов 2,4,5-Т и 2,4-Д. Микробиология, 62,189-192.

11. П.Козырева, Л.П., Перцова, Р.Н. и Л.А.Головлева. 1992. Особенности превращения 2,4,5-Т штаммом Nocardioides simplex. Микробиология, 61, 609-614.

12. Козырева, Л.П., Шурухин, Ю.В., Финкельштейн, З.И., Баскунов, Б.П. и Л.А.Головлева. 1993. Метаболизм гербицида 2,4-Д штаммом Nocardioides simplex. Микробиология, 62, 78-85.

13. Коронелли Т.В. 1984. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1984.160 с.

14. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во МГУ, 1991. 144 с.

15. Моисеева, О.В., Линько, Е.В., Баскунов, Б.П. и Л.А.Головлева. 1999. Разложение 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата культурой Rhodococcus opacus lcp. Микробиология, 68,400-405.

16. Николаев, Ю.А., Мулюкин, А.Л., Степаненко, И.Ю. и Эль-Регистан, Г.И. 2006. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов. Микробиология, 75, № 4, 489496.

17. Пирог Т.П., Шевчук, Т.А., Волошина, И.Н., Карпенко, Е.В. 2004. Производство сурфактантов штаммом Rhodococcus erythropolis ЕК-1, растущим на гидрофильных и гидрофобных субстратах. Прик. Биохим. Микробиол., 40,

18. Строкин, Н.А. 2007. Электронно-лучевая подготовка питьевой воды в промь!шленной системе. Химия выс. эн., 41, №1.

19. Томилов, А.П., Турыгин, В.В., Каабак, Л.В. 2007. Развитие исследований в области электрохимии органических соединений в 2000-2006 г.г. Электрохимия, 43, №10, 116.

20. Травкин, В.М., Линько, Е.В. и Л.А.Головлева. 1999. Очистка и свойства малеилацетат редуктазы из Nocardioides simplex ЗЕ, утилизирующего 2,4-Д и 2,4,5-Т. Биохимия, 64, 751-757.

21. Abramowicz, D.A. 1990. Aerobic and anaerobic biodegradation of PCBs: a review. Crit. Rev. Biotechnol., 10,241-251.

22. Abu-Ruwaida, A.S., Banat, I.M., Haditirto, S., and A.Khamis. 1991. Nutritional requirements and growth characteristics of a biosurfactant producing Rhodocccus bacterium. World J. Microbiol Biotechnol., 7, 53-61.

23. Ahmed, M & D.D.Focht. 1973. Degradation of polychlorinated biphenyls by two species of Achromobacter. Can. J. Microbiol., 19,47-52.

24. Ames, G., Spudish, E., and H. Nicaido. 1968. J. Bacteriol., 95, 833-843.

25. Aldrich, T.L., Frantz, В., Gill, J.F., Kilbane, J.J., and A.M.Chakrabarty. 1987. Cloning and complete nucleotide sequence determination of the catB gene encoding c/^cw-muconate lactonizing enzyme. Gene, 52,185-195.

26. Alfreider, A., Vogt, C., and W.Babel. 2003. Expression of chlorocatechol 1,2-dioxygenase and chlorocatechol 2,3-dioxygenase genes in chlorobenzene-contaminated subsurface samples. Appl. Environm. Microbiol., 69, 1372-1376.

27. Allard, A.-S., Remberger, M., and A.H.Neilson. 1985. O-methylation of chloroquaiacols: effect of substrate concentration, cell density, and growth conditions. Appl. Environm. Microbiol., 49,279-288.л

28. Anderson, J.J. & S. Dagley. 1980. Catabolism of aromatic acids in Trichosporon cutaneum. J. Bacterid., 141, 534-543.

29. Angelova, В., Mutafov, S., Avramova, Т., Dimova, I., L. Boyadjieva. 1996. 9a-Hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione by resting Rhodococcus sp. cells. Process Biochem., 31,179-184.

30. Aoki, K., Konohana, Т., Shinke, R., and H.Nishira. 1984. Two catechol 1,2-dioxygenases from aniline-assimilating bacterium, Frateuria species ANA-18. Agric. Biol. Chem., 48, 2097-2104.

31. Apajalahti, J.H.A., & M.S. Salkinoja-Salonen. 1986. Degradation of polychlorinated phenols by Rhodococcus chlorophenolicus. Appl. Microbiol. Biotechnol., 25, 62-67.

32. Armengaud, J., Timmis, K.N., and R.-M. Wittich. 1999. A functional 4-hydroxysalicylate/hydroxyquinol degradative pathway gene cluster is linked to the initial dibenzo-p-dioxin pathway genes in Singomonas sp. strain RW1. J.Bacteriol., 181, 34523461.

33. Arnold, S.M., Hickey, W.J., Harris, R.F., and R.E.Talaat. 1996. Integrating cheminal and biological remediation of atrazine and S-triazine-contaminating pesticide wastes. Environm. Toxicol Chem., 15, 1255-1262.

34. Asturids, J.A., Eltis, L.D., Prucha, M., and K.N. Timmis. 1994a. Analysis of three 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenases found in Rhodococcus globerulus P6: identification of a new family of extradiol dioxygenases. J.Biol.Chem., 269,7807-7815.

35. Asturias, J.A. and K.N.Timmis. 1993. Three different 2,3-dihydroxybiphenyl-l,2-dioxygenases in the Gram-positive polychlorobiphenyl-degrading Rhodococcus globerulus P6. J.Bacteriol., 175,4631-4640.

36. Bae, H.S., Lee, J.M., and S.-T. Lee. 1996. Biodegradation of 4-chlorophenol via a hydroquinone pathway by Arthrobacter urefaciens CPR706. FEMS Microbiol. Lett., 145, 125-129.

37. Banerni, S.K., Wei, M., and R.K.Bajpai. 1993. Pentachlorophenol interactions with soil. Water Air Soil Pollut., 69, 149-163.

38. Barkay, Т., S. Navon-Venezia, E. Z. Ron, and E. Rosenberg. 1999. Enhancement of solubilization and biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier alasan/Appl. Environ. Microbiol., 65, 2697-2702.

39. Bartels, I., Knackmuss, H.-J., and W.Reineke. 1984. Suicide inactivation of catechol 2,3-dioxygenase from Pseudomonas putida mt-2 by 3-halocatechols. Appl. Environ. Microbiol., 47,500-505.

40. Bartilson, M. and Shingler, V. 1989. Nucleotide sequence and expression of the catechol 2,3-dioxygenase encoding gene of phenol-catabolizing Pseudomonas CF600. Gene, 85, 233-23,8.

41. Bateman, A., Birney, E., Cerruti, L., Durbin, R., Etwiller, L., Eddy, S.R., Griffits-Jones, S., Howe, K.L., Marshall, M., and E.L.Sonnhammer. 2002. The pfam protein families database. Nucleic Acids Res., 30, 276-280.

42. Baxter, R.A., Gilber, P.E., Lidgett, R.A., Mainprize. J.H., and H.A.Vodden. 1975. The degradation of polychlorinated biphenyls by microorganisms. Sci. Total Environ., 4, 53-61.

43. Begona Prieto, M., Hidalgo, A., Serra, J.L., M.J.Llama. 2002. Degradation of phenol by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized on Biolite in a packed-bed reactor. J. Biotechnol., 97,1-11.

44. Behki, R.M., Торр, E.E., and B.A.Blackwell. 1994. Ring hydroxylation of Nmethylcarbamate insecticides by Rhodococcus TE1. J.Agric. Food Chem., 42,1375-1378. *

45. Behki,"R., Торр, E., Dick, W., and P. Germon. 1993. Metabolism of the herbicide atrazine by Rhodococcus strains. Appl Environ Microbiol., 59,1955-1999.

46. Bell, K.S., Philp, J.C., Aw, D.W.J., and N.Christofi. 1998. The genus Rhodococcus. J.Appl.Microbiol., 85,195-210.

47. Bertini, I., Briganti, F., Mangani, S., Nolting, M., and A.Scozzafava. 1994. Substrate, substrate analogue, and inhibitor interactions with the ferrous active site of catechol 2,3-dioxygenase monitored through XAS studies. FEBS Lett., 350, 207-212.

48. Beveridge, A.J. & D.L.Ollis. 1995. A theoretical study of substrate-induced activation of dienelactone hydrolase. Protein Engineering, 8,135-142.

49. Bidlingmeyer, B.A., Cohen, S.A., and T.L.Tarvin. 1984. Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization. J.Chromatogr., 336, 93-104.

50. Blasco, R., Wittich, R-M., Mallavarapu, M., Timmis, K. N., and D. H.Pieper. 1995. From xenobiotic to antibiotic, formation of protoanemonin from 4-chlorocatechol by enzymes of the 3-oxoadipate pathway. J. Biol. Chem. 270:29220-29235.

51. Boyle, A.W., Silvin, C.J., Hassett, J.P., Nakas, J.P., and S.W.Tanenbaum. 1992. Bacterial PCB degradation. Biodegradation, 3, 285-298.

52. Briganti, F., Pessione, E., Giunta, C., Mazzoli, R., and A.Scozzafava. 2000. Purification and catalytic properties of two catechol 1,2-dioxygenase isozymes from benzoate-grown cells о$ Acinetobacter radioresistens. J.Protein.Chem., 19, 709-716.

53. Briglia, M, Middeldorf, P.J.M., and M.S.Salkinoja-Salonen. 1994. Mineralization performance of Rhodococcus chlorophenolicus strain PCP-1 in contaminated soil simulating on site conditions. Soil Biol. Biochem., 26, 377-385.

54. Briglia, M., Rainey, F.A., Stackebrandt, E., Schraa, G., and M.S.Salkinoja-Salonen. 1996. Rhodococcus percolatus sp. nov., a bacterium degrading 2,4,6-trichlorophenol. Int. J. Syst. Bacterid., 46,23-30.

55. Broderic, J.B. & T.V.O'Halloran. 1991. Overproduction, purification, and characterization of chlorocatechol dioxygenase, a non-heme iron dioxygenase with broad substrate tolerance. Biochemistry, 30, 7349-7358.

56. Bruce, N.C., and Cain, R.B. 1988. Methylmuconolactone, a key intermediate in the dissimilation of methylaromatic compounds by a modified 3-oxoadipate pathway evolved in nocardioform actinomycetes FEMS Microbiol Lett., 50,233-239.

57. Bruheim, P., H. Bredholt, and K. Eimhjellen. 1997. Bacterial degradation of emulsified crude oil and the effect of various surfactants. Can. J. Microbiol., 43,17-22.

58. Buswell, J.A. & K.-E.Eriksson. 1979. Aromatic ring cleavage by the white-rot fungus Sporotrichumpulverulentum. FEBS Lett., 104,258-260.

59. Cai, M. & L.Xun. 2002. Organization and regulation of pentacjlorophenol-degrading genes in Sphingobium chlorophenolicum ATCC 39723. J.Bacteriol., 184, 4672-4680.

60. Carrano, C. J., Jordan, M., Drechsel, H., Schmid, D. G., & G.Winkelmann. 2001. Heterobactins: A new class of siderophores from Rhodococcus erythropolis IGTS8 containing both hydroxamate and catecholate donor groups. Biometals, 14,119-125.

61. Catelani, D., Fiecchi, A., and Galli, E. 1971. (+)-y-methyl-Aa-butenolide. A 1,2-ring-fission product of 4-methylcatechol by Pseudomonas desmolyticum. Biochem.J., 121, 89-92.

62. Cha,C.-J., Cain, R.B., Bruce, N.C.1998. The modified (3-ketoadipate pathway in Rhodococcus rhodochrous N75: enzymology of 3-methylmuconolactone metabolism. J.Bacteriol., 180, 6668-6673.

63. Chapman, P.J. & D.W.Ribbons. 1976a. Metabolism of resorcinolic compounds by bacteria: orcinol pathway in Pseudomonas putida. J. Bacteriol., 125, 975-984.

64. Chapman P. & D.W.Ribbons. 1976b. Metabolism of resorcinylic compounds by bacteria: alternative pathways for resorcinol catabolism in Pseudomonas putida. J. Bacteriol., 125, 985-998.

65. Chapman P.J., Sangodcar U.M.X., and A.M.Chakrabarty. 1987. 2,4,5-T degrdation pathway in Pseudomonas cepacia AC 1100. In: Eight Annual Meeting of The Society for Environmental Toxicology and Chemistry, Pensacola, Fla., p. 127.л 207

66. Chaudhry, G. R. & G. H.Huang. 1988. Isolation and characterization of a new plasmid from a Flavobacterium sp. which carries the genes for degradation of 2,4dichlorophenoxyacetate. J Bacteriol 170, 3897-3902. «

67. Cheah, E., Austin, C., Ashley, G.W., and D.Ollis. 1993. Substrate-induced activation of dienelactone hydrolase: an enzyme with a naturally occurring Cys-His-Asp triad. Protein Engineering, 6, 575-583.

68. Chen, В., G. W. Kirby, G. V. Rao, and R. B. Cain. 1996. Stereochemistry of the enzymic lactonization of m,m-muconic acid and 3-methyl-c/5,m-muconic acid. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1996:1153-1156.

69. Chu, J., I. & E.J.Kirsh. 1973. Utilisation of halophenols by a pentachlorophenol metabolizing bacterium. Develop. Ind. Microb., 14,264-273.

70. Chun, J., Blackall, L.L., Kang, S.O., Hah, Y.C., and M.Goodfellow. 1997. A proposal to reclassify Nocardia pinensis Blackall et al. as Skermartia piriformis gen.nov., comb. nov. Int.J.Sys.Bacterid., 47,127-131.

71. Chun, J., Kang, S.O., Hah, Y.C., and M.Goodfellow. 1996. Phylogeny of mycolin acis-containing actinomycetes. J. Ind. Microbiol., 17,205-213.

72. Clement, P., Matus, V., Cardenas, L., and B.Gonzales. 1995. Degradation of trichlorophenols by Alcaligenes eutrophus JMP 134. FEMS Microbiol. Lett., 127, 51-55.

73. Cole, J.R., Cascarelli, A.L., Mohn, W.W., and J.M.Tiedje. 1994. Isolation and characterization of a novel bacterium growing via reductive dehalogenation of 2-chlorophenol. Appl. Environ. Microbiol., 60, 3536-3542.

74. Copley, S.D. 2000. Evolution of a metabolic pathways for degradation of a toxic xenobiotics: the pachwork approach. TIBS, 25, 261-165.

75. Crawfford, R.L. 1978. Hydroxylation of 4-hydroxyphenoxyacetate by a Bacillus sp. FEMS Microbiol.Lett., 4,233-234.

76. Crosby, D.G. & K.W.Moilamen. 1973. Photodecomposition of chlorinated biphenyls and bibenzofurans. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 10, 372-377.

77. D'Argenio, D.A., Vetting, M.W., Ohlendorf, D.H., and L.N.Ornston. 1999. Substitution, insertion, deletion, suppression, and altered substrate spesificity in functional protocatechuate 3,4-dioxygenase. J. Bacteriol., 181, 6478-6487.

78. Daubaras, D.L., Hershberger, C.D., Kitano, K., and A.M.Chakrabarty. 1995. Sequence analysis of a gene cluster involved in metabolism of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by Burkholderia cepacia AC1100. Appl. Environ. Microbiol., 61, 1279-1289.

79. Davison, J. 1999. Genetic exchange between bacteria in the environment. Plasmid 42:73— 91.

80. Demone, S.A., Oldfield, С., Nash, L.J., and K.D.Yang. 1994. Characterization of the desulfurization genes from Rhodococcus sp. strain IGTS8. J. Bacteriol., 176, 6707-6716.

81. Deng-Yu, L., Eberschpacher, J.,Wagner, В., Kuntzer, J., and F.Lingens. 1991. Degradation of 2,4^6-trichlorophenol by Azotobacter sp. Strain GP1. Appl. Environ. Microbiol., 57, 1920-1928.

82. Derore, H., K. Demolder, K. Dewilde, E. Top, F. Houwen, and W. Verstraete. 1994. Transfer of the catabolic plasmid RP4 Tn4371 to indigenous soil bacteria and its effect on respiration and biphenyl breakdown. FEMS Microbiol. Ecol., 15,71-77.

83. Detmer, K. & V.Massey. 1984. Effect of monovalent anions on the mechanism of phenol hydroxylase. J.Biol.Chem., 259,11265-11272.

84. De Voss, J. J., Rutter, K., Schroeder, B. G., & C. E.Barry III. 1999. Iron acquisition and metabolism by mycobacteria. J.Bacteriol., 181, 4443-4451.

85. Diefenbach, R., H.-J. Heipieper, and H. Keweloh. 1992. The conversion of cis into trans unsaturated fatty acids in Pseudomonas putida P8: evidence for a role in the regulafion of membrane fluidity. Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, 382-387.

86. Don, R. H. & J. M.Pemberton. 1981. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus. J.Bacteriol., 145, 681— 686.

87. Don, R. H. & J. M.Pemberton. 1985. Genetic and physical map of the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmid pJP4. J Bacteriol 161,466-468.

88. Dorn, E., Hellwig, M., Reineke, W., and H.-J.Knackmuss. 1974. Isolation and characterization of a 3-chlorobenzoate degrading pseudomonad. Arch. Microbiol., 99, 61-70.

89. Dorn, E., and H.-J.Knackmuss. 1978a. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Two catechol 1,2-dioxygenases from a 3-chlorobanzoate-grown pseudomonad. Biochem. J., 174,73-84.

90. Dorn, E., and H.-J.Knackmuss. 1978b. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Substituent effects on 1,2-dioxygenation of catechol. Biochem. J., 174,85-94.

91. Dowhan W. 1997. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids? Annu.Rev.Biochem. 1997. V.66. P. 199-232.

92. Droge, M., A. Puhler, and W. Selbitschka. 2000. Phenotypic and molecular characterization of conjugative antibiotic resistance plasmids isolated from bacterial communities of activated sludge. Mol. Gen. Genet. 263:471-482.

93. Duxbury, J.M., Tiedje, J.M., Alexander, M., and J.E.Dawson. 1970. 2,4-D metabolism: enzymatic conversion of chloromaleylacetic acid to succinic acid. J.Agric. Food Chem., 18,199-201.

94. Ehrt, S., Schirmer, F., and W.Hillen. 1995. Genetic organization, nucleotide sequence and regulation of expression of genes encoding phenol hydroxylase and catechol 1,2-dioxygenase in Acinetobacter calcoaceticus. Mol Biol., 18,13-20.

95. Eley, K.L., Crowley, P.J., and T.D.Bugg. 2001. A solvolytic C-C cleavage reaction of 6-acetoxycyclohexa-2,4-dienones: mechanistic implications for the intradiol catechol dioxygenases. J. Org.Chem., 66, 2091-2097.

96. Elgren, A.M., Orville, A.M., Kelly, K.A., Lipscomb, J.D., Ohlendorf, D.H., and L.Que; Jr. 1997. Crystal ctructure and resonance Raman studies of protocatechuate 3,4-dioxygenase complexed with 3,4-dihydroxyphenylacetate. Biochemistry, 36, 11504-1513.

97. Embley, T.M. and E.Stackebrandt. 1994. The molecular phylogeny and systematics of the actinomycetes. Ann. Rev. Microbiol., 48,257-289.

98. Erb, R.W., Timmis, K.N., and D.H.Pieper. 1998. Characterization of a gene cluster from Ralstonia eutropha JMP 134 encoding metabolism of 4-methyl-muconolactone. Gene, 206,53-62.

99. Erlich, W., Mangir, M., and E.-R.Lochman. 1987. The effect of pentachlorophenol and its metabolite tetrachlorohydroquinone on RNA, protein and ribosome synthesis in Sacharomyces cells. Ecotoxicology and Environmental Safety, 13, 7-12.

100. E<spuni, M.J., Egido, S., Rodon, I., Manresa, A., and M.E.Mercade. 1996. Nutritional requirements of a biosurfactant producing strain Rhodococcus sp. 51T7. Biotechn. Lett., 18, 521-526.

101. Eulberg, D., Golovleva, L.A., and M.Schlomann. 1997. Characterization of catechol catabolic genes from Rhodococcus erythropolis 1CP. J.Bacteriol., 179, 370-381.

102. Fava, F., Armenante, P.M., and D.Kafkewitz. 1995. Aerobic degradation and dechlorination of 2-chlorophenol, 3-chlorophenol and 4-chlorophenol by a Pseudomonas pickettii strain. Lett. Appl. Microbiol., 21, 307-312.

103. Feakin, S.J., Blackburn, E., and R.G.Burns. 1995. Inoculation of granular activated carbon in fixed-bed with S-triazine degrading bacteria as a water treatment process. Water Research, 29,819-825.

104. Feigel, B.J & H.-J.Knackmuss. 1993. Syntrophic interactions during degradation of 4-aminobenzenesulfonic acid by a two species bacterial culture. Arch. Microbiol., 159, 124130.

105. Fernandes, P., Cruz, A., Angelova, В., Pinheiro H.M., Cabral, J.M.S. 2003. Microbial conveftion of steroid compounds: recent developments. Enz. Microb. Technol., 32, 688705.

106. Ferrero, M., Llobet-Brossa, E., Lalucat, J., Garcia-Valdes, E., Rossello-Mora, R., and

107. Bosch, R. 2002. Coexistence of two distinct copies of naphthalene degradation genes in Pseudomonas strains isolated from the western mediterranean region. Appl. Environm. Microbiol., 68, 957-562.

108. Fetzner, S., & F.Lingens. 1994. Bacterial dehalogenases: biochemistry, genetics, and biotechnological applications. Microbiological Reviews, 58, 641-685.

109. Fiechter, A. 1992. Biosurfactants: moving toward industrial application. Trends in Biotechnol., 10, 208-217.

110. Fieschi, F., Niviere, V., Frier, C., Deeout, J.-L., and M.Fontecave. 1995. The mechanism and substrate specificity of the NADPH:flavin oxidoreductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 270,30392-30400.

111. Finnerty, W.R. 1992. The biology and genetics of the genus Rhodococcus. Ann. Rev. Microbiol., 46,193-218.

112. Finnerty, W.R. 1994. Biosurfactants in environmental biotechnolojy. Curr. Opin. Biotechnol., 5,291-295.

113. Fortin, P.D., Lo, A.T.-F., Наго, M.-A., Kashabek S.-R., Reineke, W., and L.D. Eltis. 2005. Evolutionary devergent extradiol dioxygenases possess higher specificities for polychlorinated biphenyl metabolites. J.Bacteriol., 187,415-421.

114. Frantz, B. and A.M.Chakrabarty. 1987. Organization and nucleotide sequence determanation of a gene cluster involved in 3-chlorocatechol degradation. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84,4460-4464.

115. Frazee, K. W., Livingston D. M., LaPorte D.C., and J. D.Lipscomb. 1993. Cloning, sequencing, and expression of Pseudomonas putida protocatechuate 3,4-dioxygenase genes. J. Bacteriol., 175,6194-6202.

116. Fiiffner, F. & R.Miiller. 1998. A novel phenol hydroxylase and catechol 2,3-dioxygenase from the termophilic Bacillus thermoleovorans strain A2: nucleotide sequence ans analysis of the genes. FEMS Microbiol. Lett., 161, 37-45.

117. Fukuda, M., Shimizu, S., Okita, N., Seto, M., E.Masai. 1998. Structural alteration of linear plasmids encoding the genes for polychlorinated biohenyl degradation in Rhodococcus strain PHA1. Antonie Van Leeuwenhoek, 74, 169-173.

118. Fukumori, F., & R.P.Hausinger. 1993. Alcaligenes eutrophus JMP 134 "2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase" is an a-ketoglutarate-dependent dioxygease. J.Bacteriol., 175,2083-2086.

119. Fulthorpe, R. R., C. McGowan, О. V. Maltseva, W. E. Holben, and J. M.Tiedje. 1995. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria contain mosaics of catabolic genes. Appl. Environ. Microbiol. 61:3274-3281.

120. Fulthorpe, R. R., A. N. Rhodes, and J. M. Tiedje. 1998. High levels of endemicity of 3-chlorobenzoate-degrading soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 64:1620-1627.

121. Funabiki, Т., Inoue, Т., Kojima, H., Konishi, Т., Tanaka, Т., and S.Yoshida. 1990. Extended-Huckel study on oxygen insertion into the aromatic ring by model complexes for catechol dioxygenases. J. Mol. Catal., 59, 367-371.

122. Fulthorpe, R. R., and R. C. Wyndham. 1991. Transfer and expression of the catabolic plasmid pBRC60 in wild bacterial recipients in a fresh-water ecosystem. Appl. Environ. Microbiol. 57:1546-1553.

123. Funke, G., Stubbs, S., Altweigg, M., Carlotti, A., and M.D.Collins. 1994. Turicella olitidiZ gen.nov., sp. nov., a coryneform bacterium isolated from patients with otitis media. Int.J. Syst.Bacteriol., 44, 270-273.

124. Furukawa, K. 1994. Molecular genetics and evolutionary relationship of PCB-degrading bacteria. Biodegradation, 5,289-300.

125. Furukawa, K. 2000. Engineering dioxygenases for efficient degradation of environmental pollutans. Cur. Opin. Biotechnol., 11, 244-249.

126. Furukawa, K. 2006. Oxygenases and dehalogenases: molecular approaches to efficient degradation of chlorinated environmental pollutants. Biosci. Biothechnol. Biochem., 70, 2335-2348.

127. Furukawa, K., Tomizuka, N., and A.Kamibayashi. 1979. Effect of chlorine substitution on the bacterial metabolism of various polychlorinated biphenyls. Appl. Environ. Microbiol., 38, 301-310.

128. Furukawa, K., Tonomura, K., and A.Kamibayashi. 1978. Effect of chlorine sunstitution on the biodegradability of polychlorinated biphenyls. Appl. Environm. Microbiol., 35,223-227.

129. Gaal, A. & H.Y.Neujahr. 1979. Metabolism of phenol and resorcinol in Trichosporon cutaneum. J. Bacteriol., 137,13-21.

130. Galan, N., Diaz, E., Prieto, M., and J.Garcia. 2000. Functional analysis of the small component of the 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase of Escherichia coli W: a prototype of a new fIavin:NAD(P)H reductase subfamily. J.Bacteriol., 182, 627-636.

131. Garrec, G.M.-L.; Artaud, I.; Capeillere-Blandin, C. 2001. Purification and properties of the chlorophenol 4-monooxygenase from Burkholderia cepacia strain AC 1100. Biochem. Biophys.Acta, 1547,288-301.

132. Gerischer, U., Segura A., and L.N.Ornston. 1998. PcaU, a transcriptional activator of genes for protocatechuate utilization in Acinetobacter. J.Bacteriol., 180, 1512-1524.

133. Geyer, H„ Freitag, D., and F.Korte. 1984. Polychlorinated biohenyls (PCBs) in the marine environment particuilarly in the Mediterranean. Ecotoxicol. Environm. Saf., 8, 129151.

134. Ciapina, E.M., Melo, W.C., Santa, Anna. L.M., Santos, A.S., Freire, D.M., Pereira, Junior N. 2006. Biosurfactant production by Rhodococcus erythropolis grown on glycerol as sole carbon source. Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 880-886.

135. Gisit, M.R. & L.Xun. 2003. Characterization of chlorophenol 4-monooxygenase (TftD) and NADH:flavin adenine dinucleotide oxidoreductase (TftC) of Burkholderia cepacia AC 1100. J.Bacteriol., 185,2786-2792.

136. Golovleva, L.A., Zaborina, O., Pertsova, R., Baskunov, В., Shurukhin, Yu., and S.Kuz/nin. 1992. Degradation of polychlorinated phenols by Streptomyces rochei 303. Biodegradation, 2,201-208.

137. Goncalves, E.R., Нага, H„ Miyazawa, D., Davies, J.E., Eltis, L.D., W.W. Mohn. 2006. Transcriptomic assessment of isozymes in the biphenyl pathway of Rhodococcus sp. strain RHA1. Appl. Environ. Microbiol., 72, 6183-6193.

138. Goodfellow, M. 1989a. Genus Rhodococcus. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4. Ed Williams S.T., Sharpe M.E. and Holt J.G. pp. 2362-2371. Baltimore: Williams and Wilkins.

139. Goodfellow, M., Thimas, E.G., Ward, A.C., and A.L.James. 1990. Classification and identification of the rhodococci. Zentralblatt fur Bakteriologie, 274, 299-315.

140. Golovleva, L.A., Zaborina, O.E., Pertsova, R.N., Baskunov, B.P., Schurukhin, J.V., and S.N.Kuzmin. 1992. Degradation of polychlorinated phenols by Streptomyces rochei 303. Biodegradation, 2,201-208.

141. Gonzalez, J.M. & M.A.Moran. 1997. Numerical dominance of a group of marine bacteria in the a-subclass of the class Proteobacteria in coastal seawater. Appl. Environm. Microbiol., 63, 4237-4242.

142. Haddad, S., Eby, D.M., and E.L.Neidle. 2001. Cloning and expression of the benzoate dioxygenase genes from Rhodococcus sp. strain 19070. J.Bacteriol., 67, 25072514.

143. Haggblom, M. 1990. Mechanisms of bacterial degradation and transformation of chlorinated monoaromatic compounds. J. Basic Microbiol., 30, 115-141.

144. Haggblom, M.M. 1992. Microbial breakdown of halogenated aromatic pesticides and related compounds. FEMS Microbiol. Rev., 103, 28-72.

145. Haggblom, M.M., Apajalahti, J.H.A., and M.S.Salkinoja-Salonen. 1988. Hydroxylation and dechlorination of chlorinated guaiacols and syringols by Rhodococcus chlorophenolicus. Appl. Environ. Microbiol., 54, 683-687.

146. Haggblom, M. M., Nohynek, L. J., and M.S.Salkinoja-Salonen. 1988. Degradation and O-metylation of chlorinated phenolic compounds by Rhodococcus and Mycobacterium strains. Appl. Environ. Microbiol., 54, 3043-3052.

147. Hammer, A., Hildenbrand, Т., Hoier, H., Ngai, K.-L., Schlomann, M., and J.J. Stezowski. 1993. Crystallization and preliminary X-ray data of chloromuconate cycloisomerase from Alcaligenes eutrophus JMP134 (pJP4). J. Mol. Biol., 232, 305-307.

148. Harayama, S., Кок, M., and E.L.Neidle. 1992. Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases. Annu. Rev. Microbiol., 46, 565-601.

149. Harayama, S. and M.Rekik. 1989. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. J.Biol. Chem., 264,15328-15333.

150. Harper, D.B. & E.R.Blakley. 1971. The metabolism of j9-fluorobenzoic acid by

151. Pseudomonas sp. Can.J.Microbiol., 17,1015-1023. *

152. Harwood,C.S. & R.E.Parales. 1996. The /?-ketoadipate pathway and the biology of self-identity. Annu. Rev. Microbiol., 50, 553-590.

153. Hasin M., Kennedy E.P. 1982. Role of phosphatidylethanolamine in the biosynthesis of pyrophosphoethanolamine residues in the lipopolysaccharide of Escherichia coli. J.Biol. Chem. V.257. P. 12475-12477.E.P.

154. Hayaishi, O., Katagiri, M., and S.Rothberg. 1957. Studies on oxygenases. Pyrocatechase. J.Biol. Chem., 229, 905-920.

155. Rayaishi, О. 1969. Nature and mechanism of oxygenases. Science, 164, 389-396.

156. Heipieper, H.-J., and J. A. M. de Bont. 1994. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to ethanol and toluene at the level of fatty acid composition of membranes. Appl. Environ. Microbiol. 60:444(M444.

157. Heiss, G.S., Gowan, B, and E.R.Dabbs. 1992. Cloning of DNA from Rhodococcus strains conferring the ability to decolorize sulfonated azo dyes. FEMS Microbiol. Lett., 99, 221-226.

158. Held, M., Suske, W. A., Schmid, A., Engesser, K-H., Kohler, H-PE., Witholt, В., and

159. Wubbolts, M. G. 1998. Preparative scale production of 3-substituted catechols using a novel monooxygenase from Pseudomonas azelaica HBP1. J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 5, 87-93.

160. Helin, S., Kahn, P.C., Guha, B.L., Mallows, D.G., and A.Goldmann. 1995. The refined X-ray structure of muconate lactonizing enzyme from Pseudomonas putida PRS2000 at 1.85 A resolution. J. Mol. Biol., 254, 918-941.

161. Hendrickson, W., Hubner, A., and A.K.Black. 1996. Chromosome multiplicity in Burkholderia cepacia, In: Molecular biology of pseudomonads; Nakazava Т., Ed.; ASM Press, Washington, D.C.

162. Hensel, J., & G.Straube. 1984. Physiologie des Phenolabbaus bei Rhodococcus spes. PI. Tell 2: Untersuchungen zur Regulation des Phenolabbaus. Acta hydrochim., hydrobiol., 12, 273-283.

163. Hidalgo, A, Lopategi, A, Prieto, M, Serra, J.L., Llama, M.J. 2002 Formaldehyde removal in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1. Appl. Microbiol. Biotechnol., 58(2), 260-263.

164. Hider, R. C. & A.D.Hall. 1991. Clinically useful chelators of tripositive elements. Prog.Med.Chem., 28, 41-173

165. Hinterregger, С., Loidl, M., and F.Streichsbier. 1992. Characterization of isofunctional ring-cleavage enzymes in aniline and 3-chloroaniline degradation by Pseudomonas acidovorans CA28. FEMS Microbiol. Lett., 97, 261-266.

166. Hirrlinger, В., Stolz, A., Knackmuss, H.J. 1996. Purification and properties of an amidase from Rhodococcus erythropolis MP50 which enantioselectively hydrolyzes 2-arylpropionamides.J. Bacteriol, 178, 3501-3507.

167. Hoffmann, D., Kleinsteuber, S., Muller, R.H., and W.Babel. 2003. A transposon encoding the complete 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation pathway in the alkalitolerant strain Delftia acidovorans P4a. Microbiology, 149,2545-2556.

168. Hollender, J., W. Dott, and J. Hopp. 1994. Regulation of chloro- and methylphenol degradation in Comamonas testosteroni JH5. Appl. Environ. Microbiol. 60:2330-2338.

169. Hollender, J., Hopp, J., and Dotti, W. 1997. Degradation of 4-chlorophenol via the meta cleavage pathway by Comamonas testosteroni JH5. Appl. Environm. Microbiol., 63, 4567-4572.

170. Hooper, S.W., Pettigrew, C.A., and C.S. Sayler. 1990. Ecological fate, effects and prospects for the elimination of environmental polychlorinated biphenils (PCBs). Environm. Toxicol. Chem., 9, 655-667.

171. Houghton, J.E., Brown, T.M., Appel, A.J., Hughes, E.J., and L.N.Ornston. 1995. Discontinuities in the evolution of Pseudomonas putida cat genes. J.Bacteriol., 177, 401412.

172. Hutzinger, O., S.Safe, and V.Zitko. 1974. The chemistry of PCBs. CRC Press, Boca Raton, FL.

173. Inoue, H., Nojima, H., and H.Okayama. 1990, One step preparation of competent E.coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,2172-2175.

174. Iwabuchi, N., Sunairi, M., Anzai, H., Nakajima, M., and Harayama S. 2000. Relationships between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus rhodochrous. Appl. Environm. Microbiol., 66, 5073-5077.

175. Iwabuchi, N., Sunairi, M., and Nakajima M. 1997. Cloning a DNA fragment from Rhodococcus rhodochrous, which suppresses its mucoidal morphology. Actinomycetology, 11,59-63

176. Iwabuchi, N., Sunairi, M., Urai, M., Itoh, C., Anzai, H., Nakajima, M., Harayama, S. 2002. Extracellular Polysaccharides of Rhodococcus rhodochrous S-2 Stimulate the

177. Degradation of Aromatic Components in Crude Oil by Indigenous Marine Bacteria. Appl. Environ.Microbiol.,. 68,2337-2343.

178. Iwagami, S.G., Yang, K., and J.Davies. 2000. Characterization of the protocatechuic acid catabolic gene cluster from Streptomyces sp. strain 2065. Appl.Environm.Microbiol., 66, 1499-1508.

179. Iwaki, M., Kagamiyama, H., and M.Nozaki. 1981. The primary structure of the subunit of protocatechuate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas aeruginosa. Arch. Biochem. Biophys., 210,210-223.

180. Jain, R.K., Dreisbach, J.H., and J.C.Spain. 1994. Biodegradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzenetriol by an Arthrobacter sp. Appl.Environ. Microbiol., 60, 3030-3032.

181. Jang, H.G., Cox, D.D., and L.Que, Jr. 1991. A highly reactive functional model for the catechol dioxygenases. Structure and properties of Fe(TPA)DBC.BPh4. J.Am.Chem.Soc., 113, 9200-9204.

182. Johnson, G.R., Jain, R.K., and J.C.Spain. 2002. Origing of the 2,4-dinitrotoluene pathway. J.Bacteriol., 184,4219-4232.

183. Jones, K.H., Trudgill, P.W., and D.J.Hopper. 1995. Evidence of two pathways for the metabolism of phenol by Aspergillus fumigatus. Arch. Microbiol., 163,176-181.

184. Ka, J. O., Holben, W.E. & Tiedje, J.M. 1994. Genetic and phenotypic diversity of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)-degrading bacteria isolated from 2,4-D-treated field soils. Appl. Environm. Microbiol., 60,1106-1115.

185. Ka, J. O. & Tiedje, J.M. 1994. Integration and excision of a 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmid in Alcaligenes paradoxus and evidence of its natural intergeneric transfer. J Bacteriol 176, 5284-5289.

186. Kamagata, Y., Fulthrope, R., R., Tamura, K., Takami, H., Forney, L.J., and J.M.Tiedje. 1997. Pristine environments harbor a new group of oligotrophic 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 63, 2266-2272.

187. Kasberg, Т., Daubaras, D.J., Chakrabarty, A.M., and W.Reineke. 1995. Evidence that operons tcb, tfd, and clc encode maleylacetate reductase, the forth enzyme of the modified ortho pathway. J.Bacteriol., 177, 3885-3889.

188. Kasberg, Т., Seibert, V., Schlomann, M., and W.Reineke. 1997. Cloning, characterization, and sequence analysis of the clcE gene encoding the maleylacetate reductase of Pseudomonas sp. strain B13. J.Bacteriol., 179, 3801-3803.

189. Kaschabek, S.R.Untersuchungen zur Dehalogenierung von Chlormaleylacetaten in Pseudomonas sp. Stamm В13. Diplomarbeit, Bergische Universitat-Gesamthochschule Wuppertal. 1996, 176 c.

190. Kaschabek, S., & W.Reineke. 1993. Degradation of chloroaromatics: purification and characterization of maleylacetate reductase from Pseudomonas sp. strain В13. J. Bacteriol., 175,6075-6081.

191. Kaschabek, S.R. & W.Reineke. 1995. Maleylacetate reductase of Pseudomonas sp. strain В13: specificity of substrate conversion and halide elimination. J.Bacteriol., 177, 320-325.

192. Katti, S.K., Katz, B.A., and H.W.Wyckoff. 1989. Crystal structure of muconolactone isomerase at 3-3 A resolution. J. Mol. Biol., 205, 557-571.

193. Kaulmann, U., Kaschabek, S. R., and M.Schlomann. 2001. Mechanism of chloride elimination from 3-chloro- and 2,4-dichloro-c«,cw-muconate: New insight obtained from analysis of muconate cycloisomerase variant CatB-K169A. J. Bacteriol. 183: 4551-4561.

194. Keil, H., Lebens, M.R., and P.A.Williams. 1985. TOL plasmid pWW15 contains twononhomologous independently regulated catechol 2,3-dioxygenase genes. J.Bacteriol., 163, 248-255.

195. Keweloh, H., R. Diefenbach, and H. J. Rehm. 1991. Increase of phenol tolerance of Escherichia coli by alterations of the fatty acid composition of the membrane lipids. Arch. Microbiol. 157:49-53.

196. Kilbane, J.J., Chatterjee, D.K., Karns, J.S., Kellog, S.T., and A.M.Chakrabarty. 1982. Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetie acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia. Appl. Environ. Microbiol., 44,72-78.

197. Kim, S.I., Leem, S.-H., Choi, J.-S, Chung, Y.H., Kim, S., Park, Y.-M., Park, Y.K., Lee, Y.N., and K.-S.Ha. 1997. Cloning and characterization of two cat A genes in Acinetobacter lwoffiiK24. J. Bacteiol., 179, 5226-5231.

198. Kita, A., Kita, S.-i., Inaka, K., Ishida, Т., Horiike, K., Nozaki, M., and K.Miki. 1997. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of expressed Pseudomonas putida catechol 2,3-dioxygenase. J.Biochem., 122,201-204.

199. Kitagawa, W., Miyauchi, K., Masai, E., and M.Fukuda. 2001. Cloning and characterization of benzoate catabolic genes in the gram-positive polychlorinated biphenyl degrader Rhodococcus sp. strain RHA1. J.Bacteriol., 183, 6598-6606.

200. Kitunen, V.N. 1990. The use and formation of CPs, PCPPs and PCDDs/PCDFs in mechanical and chemical wood processing industries. PhD thasis, Department of general microbiology, University of Helsinki.

201. Kitunen ,V., Valo, R., and M.Salkinoja-Salonen. 1987. Contamination of soil around wood-preserving facilities by polychlorinated aromatic compounds. Environ. Sci. Technol., 21,96-101.

202. Kiyohara, H., Hatta, Т., Ogawa, Y., Kakuta, Т., Yokoyama, H., and N.Takizava. 1992. Isolation of Pseudomonas pickettii strains that degrade 2,4,6-trichlorophenol and their dechlorination of chlorophenols. Appl. Environ. Microbiol., 58, 1276-1283.

203. Klecka, G.M.& D.T.Gibson. 1981. Inhibition of catechol 2,3-dioxygenase from Pseudomonas putida by 3-chlorocatechol. Appl. Environ. Microbiol., 41,1159-1165.

204. Knackmuss, H.-J., Hellwig, M., Lackner, H., and Otting, W. 1976. Microbiological synthesis of (+)-cw-l,2-dihydroxy-l,2-dihydronaphthalene-2-carboxylic acid. Eur. J. Microbiol., 2,267-276.

205. Kobayashi, H., H. Takami, Н. Hirayama, К. Kobata, R. Usami, and K. Horikoshi. 1999. Outer membrane changes in a toluene-sensitive mutant of toluene-tolerant Pseudomonas putida IH-2000. J. Bacteriol. 181:4493-4998.

206. Koiv, V., Marits, R., and Heinaru, A. 1996. Sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase gene tfdB and 3,5-dichlorocatechol 1,2-dioxygenase gene tfdC of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading plasmid pEST4011. Gene, 174,293-297.

207. Koronelli, T.V. 1996. Principles and methods for raising the efficiency of biological dagradation of hydrocarbons in the environment: review. Appl. Biochem. Microbiol., 32, 519-525.

208. Kramer, C.M. & M.M.Koiy. 1991. Bacteria that degrade p-chlorophenol isolated from a continuous culture sysrem. Can.J.Microbiol., 38, 34-37.

209. Kuhm, A. E., Schlomann, M., Knackmuss, H-J., and D.H.Pieper. 1990. Purification and characterization of dichloromuconate cycloisomerase from Alcaligenes eutrophus JMP 134. Biochem. J. 266:877-883.

210. Kukor, J.J. & R.H.Olsen. 1991. Genetic organisation and regulation of a meta cleavage pathway for catechols produced from catabolism of toluene, benzene, phenol, and cresols by Pseudomonaspickettii PKOl. J.Bacteriol., 173,4587-4594.

211. Kukor, J.J. & R.H.01sen. 1996. Catechol 2,3-dioxygenases functional in oxygen-limited (hypoxic) environments. Appl. Environ. Microbiol., 62,1728-1740.

212. Laemli, U.K. 1970. Cleavaje of structural proteins during the assembly of the head of bacteriaphage T4. Nature (London) 227, 680-685.

213. Laemmli, C.M., Leveau, J.H., Zehnder, A.J., and J.R.van der Meer. 2000.

214. Characterization of a second tfd gene cluster for chlorophenol and chlorocatechol metabolism on plasmid pJP4 in Ralstonia eutropha. J.Bacteriol., 182, 4165-4172.

215. Laine, M.M. & K.S.Jorgensen. 1996. Straw compost and bioremediated soils as inocula for the bioremediation of chlorophenol-contaminated soil. Appl. Environ. Microbiol., 62,1507-1513.

216. Landner, L., Lindstrom, K., Karlsoon, L., Nordin, J., and L.Sorensen. 1977. Bioaccumulation in fish of chlorinated phenols from kraft pulp mill bleachery effluents. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 18,663-673.

217. Larkin, M.J., Allen, C.C.R., Kulakov, L.A., Lipscomb, D.A. 1999. Purification and characterization of a novel naphthalene dioxygenase from Rhodococcus sp. strain NCIMB 12038. J.Bacteriol., 181,6200-6204.

218. Larway, P. & W.C.Evans. 1965. Metabolism of quinol and resorcinol by soil pseuddmonads. Biochem. J., 95, 52.

219. Latus, M., Seitz, H.-J., Eberspacher, J., and F.Lingens. 1995. Purification and characterization of hydroxyquinol 1,2-dioxygenase from Azotobacter sp. strain GP1. Appl. Environ. Microbiol., 61,2453-2460.

220. Leander, M., T. Vallaeys, and R. Fulthorpe. 1998. Amplification of putative chlorocatechol dioxygenase gene fragments from a- and b-proteobacteria. Can. J. Microbiol. 44:482-486.

221. Lechevalier, H.A. 1989. Nocardioform actinomycetes. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4. Ed Williams S.T., Sharpe M.E. and Holt J.G. pp. 23482350. Baltimore: Williams and Wilkins.

222. Lechavalier, M.P. and H.A.Lechavalier. 1970. Chemical composition as criterion in the classification of aerobic actinomycetes. Int. J. Syst. Bacterid., 20, 435-443.

223. Lee, J.-Y. & L.Xun. 1997. Purification and characterization of 2,6-dichloro-/> hydroquinone chlorohydrolase from Flavobacterium sp. strain ATCC 39723. J.Bacteriol., 179,1521-1524.

224. Lee, M., Kim, M.K., Singleton, I., Goodfellow, M., Lee, S.T. 2006. Enhanced biodegradation of diesel oil by a newly identified Rhodococcus baikonurensis EN3 in the presence of mycolic acid. J. Appl. Microbiol., 2006,100,325-333.

225. Lei, В., Liu, M., Huang, S., and S.C.Tu. 1994. Vibrio harveyi NADPH-fiavin oxidoreductase: cloning, sequencing, and overexpression of the gene and purification and characterization of the cloned enzyme. J.Bacteriol., 176, 3552-3558.

226. Leveau, J.H., Konig, F., Fuchslin, H., Werlen, C., and van der Meer, J.R. 1999. Dynamics of multigene expression during catabolic adaptation of Ralstonia eutropha JMP 134 (pJP4) to the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate. Mol. Biol., 33, 396-406.

227. Leveau, J.H., Zender, J.B., and van der Meer, J.R. 1998. The tfdK gene product facilitates uptake of 2,4-dichlorophenoxyacetate by of Ralstonia eutropha JMP 134 (pJP4). J.Bacteriol., 180,2237-2243.

228. Li, D.-Y., Eberspacher, J., Wagner, В., Kuntzer, J., and F.Lingens. 1991. Degradation of 2,4,6-trichlorophenol by Azotobacter sp. strain GP1. Appl. Environ.Microbiol., 57, 1920-1928.

229. Lim, PE, Ong, SA, Seng, CE. 2002. Simultaneous adsorption and biodegradation processes in sequencing batch reactor (SBR) for treating copper and cadmium-containing wastewater, Water Res., 36(3), 667-75.

230. Liu, S., Ogawa, N., Senda, Т., Hasebe, A., and K.Miyashita. 2005. Amino acids in4positions 48, 52, and 73 differentiate the substrate specificities of the highly homologous chlorocatechol 1,2-dioxygenases CbnA and TcbC. J.Bacteriol., 187,5427-5436

231. Loffhagen, N., Hartig, C. & W.Babel. 1997. The toxicity of substituted phenolic compounds to a detoxifying and an acetic acid bacterium. Ecotoxicol. Environ. Saf., 36, 269-274.

232. Loffhagen, N., Hartig, C. & W.Babel. 2001. Suitability of the trans/cis ratio of unsaturated fatty acids in Pseudomonas putida NCTC 10936 as an indicator of the acute toxicity of chemicals. Ecotoxicol. Environ. Saf., 50, 65-71.

233. Lotfy HR, Rashed IG. 2002. A method for treating wastewater containing formaldehyde. Water Res., 36(3), 633-637.

234. I«ouie, T.M., Webster, C.M., and L.Xun. 2002. Genetic and biochemical characterization of a 2,4,6- trichlorophenol degradation pathway in Ralstonia eutropha JMP 134. J.Bacteriol., 184, 3492-3500.

235. Lundberg, P., Renberg, L., Arrhenius, E., and G.Sunbdstrom. 1980. Detoxification disturbances and uncoupling effects in vitro of some chlorinated quaiacols, catechols and benzoquinones. Chimica-Biological Interactions, 32, 281-290.

236. Mae, A. A., Marits, R. O., Ausmess, N. R., Ko~ iv, V. M. & A.L.Heinaru. 1993. Characterization of a new 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading plasmid pEST4011: physical map and localization of catabolic genes. J.Gen.Microbiol., 139, 3165-3170.

237. Mahato, S.B., Garai, S. 1997. Advances in micbobial steroid biotransformation. Steroids, 62,332-345.

238. Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A., and F.S.Collins. 1991. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning f unmodified PCR products. Nuclear Acids Res., 19,1154.

239. Margesin, R., and F. Schinner. 1997. Heavy metal resistant Arthrobacter sp.—a tool for studying conjugational plasmid transfer between Gram-negative and Gram-positive bacteria. J. Basic Microbiol. 37:217-227.

240. Mars, A.E., Kasberg, Т., Kaschabek, S.R., van Agteren, M.H., Janssen, D.B., and

241. W.Reineke. 1997. Microbial degradation of chloroaromatics: use of the meta-cleavage pathway for mineralization of chlorobenzene. J.Bacteriol., 179, 4530-4537.

242. Masai, E., Yamada, A., Healy, J.M., Hatta, Т., Kimbara, K., Fukuda, M., and K.Yano. 1995. Characterization of biphenyl catabolic genes of gram-positive polychlorinated biphenyl degrader Rhodococcus sp. RHA1. Appl. Environ. Microbiol., 61,2079-2085.

243. Massey, V. 1994. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J. Biol. Chem., 269, 22459-22462.

244. Mattews, B.W., 1968. Solvent content of protein crystals. J.Mol.Biol, 33,491-497.

245. Matus, V., Sanchez, A., Martinez, M., and B.Gonzalez. 2003. Eficient degradation of 2,4,6-trichlorophenol requires a set of catabolic genes related to tcp genes from Ralstonia eutropha JMP 134 (pJP4). Appl. Envir. Microbiol., 69, 7108-7115.

246. McGowan, С., Fulthorpe, R., Wright, A. & J. M.Tiedje. 1998. Evidence for interspecies gene transfer in the evolution of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degraders. Appl. Environ-Microbiol., 64,4089-4092.

247. McGraw, M.G. 1983. The PCB problem: separation fact from fiction. Electrical World, Feb., 49-72.

248. Mercade, M.E., Monleon, L., and C.Deandres. 1996. Screening and selection of surfactant-producing bacteria from waste lubrication oil. J. Appl. Bacteriol., 81, 161-166.

249. Merlin, C., Springael, D., Mergeay, M. & A.Toussaint. 1997. Organization of the bph gene cluster of transposon Tn4371, encoding enzymes for the degradation of biphenyl and 4-chlorobiphenyl compounds. Mol. Gen. Genet., 253,499-506.

250. Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A., and M.H.Ebert. 1981. Utrasensitive stain for proteins in polyacrylamid gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins. Science, 211,1437-1438.

251. Mes, J., Davies, D.J., and D.Turtou.1982. Polychlorinated biphenyls and other chlorinated hydrocarbons residues in adipose tissue of Canadians. Bull. Envirun. Contam. Toxicol., 28, 97-104.

252. Miethling, R. and U.Karlson. 1996. Accelerated mineralization of pentachlorophenol in soil upon inoculation with Micobacterium chlorophenolicus PCP-1 and Sphingomonas chloroghenolica RA2. Appl. Environm. Microbiol., 62,4361-4366.

253. Mikolasch, A., Hammer, E., F. Schauer 2003. Synthesis of imidazol-2-yl amino acids by using cells from alkane-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 69,1670-1679.

254. Mitsui, R., Sakai Y., Yasueda H., and N.Kato. 2000. A novel operon encoding formaldehyde fixation: the ribulose monophosphate pathway in the gram-positive facultative methylotrophic bacterium Mycobacterium gastri MB 19. J.Bacteriol., 182, 944948.

255. Miyauchi, K., Adachi, Y., Nagata, Y., and M.Takagi. 1999. Cloning and sequencing of a novel meta-cleavage dioxygenase gene whose product is involved in degradation of y-hexachlorocyclohexane in Sphingomonas paucimobilis. J.Bacteriol., 181, 6712-6719.

256. Mohn, W.W., & J.M.Tiedje. 1992. Microbial reductive dehalogenation. Microbiol. Rev., 26,482-507.

257. Moon, J., Chang, II., Min, K.R., and Y.Kim. 1995. Cloning and sequencing of the catechol 2,3-dioxygenase gene of Alcaligenes sp. KF711. Biochem. Biophys. Res. Commun., 208,943-949.

258. Moonen, M.J.H., Fraaije, M.W., Rietjens, I.M.C.M., Laane, C., and W.J.H.van Berkel. 2002. Flavoenzyme-catalyzed oxygenations and oxidations of phenolic compounds. Adv.Synth.Catal., 344,1023-1035.

259. Moran-Ramallal, R., Liz, R., V. Gotor. Bacterial preparation of enantiopure unactivated aziridine-2-carboxamides and their transformation into enantiopure nonnatural amino acids and vic-diamines. Org Lett., 2007,1, 521-524.

260. Mulbry, W.W. 1994. Purification and characterization of an inducible S-triazine hydrolase from Rhodococcus corralinus NRRL B-1554R. Appl. Environm. Microbiol., 60, 613-618.

261. Mtiller, C., Petruschka, L., Cuypers, H., Burchhardt, G., and H.Herrmann. 1996. Carboy catabolite repression of phenol degradation in Pseudomonas putida is mediated by the inhibition of the activator protein PhlR. J. Bacterid., 178,2030-2036.

262. Miiller, T. A., Wcrlen, C., Spain, J. & J. R.van der Meer. 2003. Evolution of a chlorobenzene degradative pathway among bacteria in a contaminated groundwater mediated by a genomic island in Ralstonia. Environ Microbiol., 5,163-173.

263. Murakami,S., Takashima, A., Takemoto, J., Takinaka, S., Shinke, R., and K. Aoki. 1999. Cloning and scqucnce analysis of two catechol-degrading gene clusters from the aniline-assimilating bacterium Frateuria species ANA-18. Gene, 226,189-198.

264. Murakami, S., Takemoto, J., Takashima, A., Shinke, R., and K.Aoki. 1998. Purification and characterization of two muconate cycloisomerase isozymes from aniline-assimilating Frateuria species ANA-18.

265. Mutafov, S., Angelova, В., Avramova, Т., Boyadjieva, L., Dimova, I. 1997. The inducibility of 9a-hydroxylation activity in resting Rhodococcus sp. cells. Process Biochem., 32, 585-589.

266. Nakai, C., Horiike,K, Kagamiyama, H., Nakazawa, Т., and M.Nozaki. 1983a. Purification, subunit structure, and partial amino acid sequence of metapyrocatechse. J.Biol. Chem., 258, 2916-2922.

267. Nakai, С., Horiike, К., Kuramitzu, S., Kagamiyama, H., and M.Nozaki. 1990. Three isozymes of catechol 1,2-dioxygenas (pyrocatechase), aa, сф, and PP, from Pseudomonas arvilla C-l. J. Biol. Chem., 265, 660-665.

268. Nakai, C., Kagamiyama, H., Nozaki, M., Nakazawa, Т., Inouye, S., Ebina, Y., and A.Nakazawa. 1983. Complete nucleotide sequence of the metapyrocatechase gene on the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt-2. J.Biol. Chem., 258, 2923-2928.

269. Nakai, C., Nakazawa, Т., and M.Nozaki. 1988. Purification and properties of catechol 1,2-dioxygenase (pyrocatechase) from Pseudomonas putida mt-2 in comparison with that from Pseudomonas arvilla C-l. Arch. Bochem. Biophys., 267, 701-713.

270. Nakatsu, C., Ng, J., Singh, R, Straus, N. & C.Wyndham. 1991. Chlorobenzoate catabolic transposon Tn5271 is a composite class I element with flanking class II insertion sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 8312-8316.

271. Nakatsu, С. H., Straus, N. A. & R.C.Wyndham. 1995. The nucleotide sequence of the Tn5271 3-chlorobenzoate 3,4-dioxygenase genes (cbaAB) unites the class IA oxygenases in a single lineage. Microbiology 141, 485-495.

272. Nakatsu, С. H., Providenti, M. & R.C.Wyndham. 1997. The cw-diol dehydrogenase cbaC gene of Tn5271 is required for growth on 3-chlorobenzoate but not on 3,4-dichlorobenzoate. Gene 196,209-218.

273. Nakatsu, С. H. & R. C.Wyndham. 1993. Cloning and expression of the transposable chlorobenzoate-3,4-dioxygenase genes of Alcaligenes sp. strain BR60. Appl. Environ. Microbiol., 59, 3625-3633.

274. Neu, T.R. 1996. Significance of bacterial surface-active compounds in interaction of bacteria with interfaces. Microbiol. Rev., 60, 151-166.

275. Ne'ujahr, H. Y. and K.G.Kjellcn. 1978. Phenol hydroxylase from yeast. Reaction with phenol derivatives. J.Biol.Chem., 253, 8835-8841.

276. Neujahr, II. & J.M.Varga. 1970. Degradation of phenols by intact cells and cell-free preparations of Trichosporon cutaneum. Eur. J. Biochem., 13, 37-44.

277. Nieschcr. S, Wray, V., Lang, S., Kaschabek, S.R., Schlomann, M. 2006. Identification and structural characterisation of novel trehalose dinocardiomycolates from n-alkane-grown Rhodococcus opacus 1CP. Appl Microbiol Biotechnol., 70, 605-611.

278. Nordlund, I., Powlowski, J., and V.Shing! r. 1990. Complete nucleotide sequence and polypeptide analysis of multicomponent phenol hydroxylase from Pseudomonas sp. strain CF600. J. BacterioL 172, 6826-6833.

279. N^ozaki, M. Kagamiyama, H., and O.l layaishi. 1963. Metapyrocatechase. I. Purification, crystallization and some properties. :5iochem. J., 338,582-590.

280. Nozaki, M. Kotani, S., Ono, K., and S.Fission. 1970. Metapyrocatechase. III. Substrate speficicity and mode of ring fission. .V. 'A, 220,213-223.

281. Nozaki, M. Ono, K., Nakazava, Т. Kotani, S., and O.Hayaishi. 1968. Metapyrocatechase. II. The role of iron and su' liydryl groups. J.Biol. Chem., 243, 26822690.

282. Nwankwoaki. A.U., Egiebor, N.O., Nyavor, K. 2001. Enhanced biodegradation of methylhydrazine and hydrazine contaminated NASA wastewater in fixed-film bioreactor.1. Biodegradation, 12, 1-10.

283. Ohlendorf, D.H., Orville, A. M, and J.D.Lipscomb. 1994. Structure of protocatechuate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas aeruginosa at 2.15A resolution. J. Mol. Biol., 244, 586-608.

284. Ono, K., Nozaki, M., O.Hayaishi. 1970. Purification and some properties of protocatechuate 4,5-dioxygenase. Biochem Biophys. Acta, 220,224-238.

285. Ornston, L.N. 1966. The conversion of catechol and protocatechuate to 3-ketoadipate by Pseudomonas putida. Enzymes of the catechol pathwat. J.Biol. Chem., 241, 3795-3799.

286. Ornston, L.N. and D.Parke. 1976. Properties of an inducible uptake system for 3-ketoadipate in Pseudomonas putida. J.Bacteriol., 125,475-488.

287. Orser, C.S., Dutton, J., Lange, C., Jablonski, P., Xun, L., and M.Hargis. 1993. Characterization of a Flavobcterium glutatione S-transferase gene involved in reductive dechlorination. J.Bacteriol., 175, 2640-2644.

288. Orville A.M., Elango N., Lipscomb J.D., and D.H.Ohlendorf. 1997a. Structure of competitive inhiditor complexes of protocatechuate 3,4-dioxygenase: multiple exogenous ligand binding orientations within the active site. Biochemistry, 36,10039-10051.

289. Otwinowski, Z. & W.Minor. 1997. Processing of x-ray diffraction data in oscillation mode. Methods Enzymol., 276, 307-326.

290. Padilla, L., Matus, V., Zenteno, P., and B.Gonzales. 2000. Degradation of 2,4,6-trichlorophenol via chlorohydroxyquinol in Ralstonia eutropha JMP 134 and JMP 222. J. Basic. Microbiol., 40,243-249.

291. Pai, S.L., Hsu, Y.L., Chong, N.M., Sheu, C.S., and C.H.Chen. 1995. Continuous degradation of phenol by Rhodococcus sp. immobilized on granular activated carbon and in calcium alginate. Bioresource Techn., 51, 37-42.

292. Parales, R.E., Ditty, J.L., and C.S.Harwood. 2000. Toluene-degrading bacteria are chemotactic toward the environmental pollutants benzene, toluene, and trichloroethylene. Appl. Environm. Microbiol., 66,4098-4104.

293. Parekh, N.R., Walker, A., Roberts, S.J., and S.J.Welch. 1994. Rapid degradation of the triazinone herbicide metamitron by a Rhodococcus sp. isolated from treated soil. J.Appl.Bacteriol., 77,467-475.

294. Parke, D. 1997. Acquisition, reorganization, and merger of genes: novel management of the b-ketoadipate pathway in Agrobacterium tumefaciens. FEMS Microbiol. Lett., 146,3.12.

295. Parry, R., & W.Li. 1997. An NADPH:FAD oxidoreductase from the valanimycin producer, Streptomyces viridifaciens: cloning, analysis, and overexpression. J.Biol.Chem., 272,23303-23311.

296. Pathak, D. & D.Ollis. 1990. Refined structure of dienelactone hydrolase at 1-8 A. J. Mol. Biol., 214,497-525.

297. Perkins, E.J., Gordan, M.P., Caceres, O., and P.F.Lurquin. 1990. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenolhydroxylase and dichlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4. J.Bacteriol., 172,2351-2359.

298. Pieper, D. H., K.-H. Engesser, R. H. Don, K. N. Timmis, and H.-J. Knackmuss. 1985. Modified ortho-cleavage pathway in Alcaligenes eutrophus JMP 134 for the degradation of4.methylcatechol. FEMS Microbiol. Lett. 29:63-67.

299. Pieper, D. H. & W.Reineke. 2000. Engineering bacteria for bioremediation. Cur. Opinion Biotechnol., 11,262-270.

300. Pieper, D. H., Reineke W., Engesser K-H., and H.-J.Knackmuss. 1988. Metabolism of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2-chloro-4-methyl-phenoxyacetic acid and 2-methyl-phenoxyacetic acid by Alcaligenes eutrophus JMP134. Arch. Microbiol., 150, 95-102.

301. Pieper, D. H., Stadler-Fritzsche, K., Engesser, K-H., and H.-J.Knackmuss. 1993. Metabolism of 2-chloro-4-methylphenoxyacetate by Alcaligenes eutrophus JMP 134. Arch. Microbiol. 160:169-178.

302. Pieper, D. H., Stadler-Fritzsche, K., Knackmuss, H-J., and K.N.Timmis. 1995. Formation of dimethylmuconolactones from dimethylphenols by Alcaligenes eutrophus JMP134. Appl. Environm. Microbiol. 61:2159-2165.

303. Pieper, D.H., Stadler-Fritzsche, K., Schlomann, M., and Knackmuss, H.-J. In: Pseudomonas. Molecular biology and biotechnology. Washington: American Society for Microbiology, 1992.

304. Pinkart, H. C., J. W. Wolfram, R. Rogers, and D. C. White. 1996. Cell envelope changes in solvent-tolerant and solvent-sensitive Pseudomonas putida strains following exposure to o-xylene. Appl. Environ. Microbiol. 62:1129-1132.

305. Plumier, I., Perez-Pantoja, D., Heim, S., Gonzalez, В., and D.H.Pieper. 2002. Importance of different tfd genes for degradation of chloroaromatics by Ralstonia eutropha JMP 134. J. Bacteriol., 184,4054-4064.

306. Poh, R. P.-C., Smith, A. R. W. & I.J.Bruce. 2002. Complete characterization of Tn5530 from Burkholderia cepacia strain 2a(pIJBl) and studies of 2,4-dichlorophenoxyacetate uptake by the organism. Plasmid 48,1-12.

307. Potrawfke, Т., Armengaud, J. & R.M.Wittich. 2001. Chlorocatechols substituted atpositions 4 and 5 are substrates of the broad-spectrum chlorocatechol 1,2-dioxygenase of Pseudomonas chlororaphis RW71. J.Bacteriol., 183, 997-1011.

308. Potrawfke, Т., Timmis, К. N. & R. M.Wittich. 1998. Degradation of 1,2,3,4-tetrachlorobenzene by Pseudomonas chlororaphis RW71. Appl Environ Microbiol 64, 3798-3806.

309. Powlowski, J. В., and S. Dagley. 1985. р-Ketoadipate pathway in Trichosporon cutaneum modified for methyl-substituted metabolites. J. Bacteriol. 163:1126-1135.

310. Powlowski, J. & V.Shingler. 1994. Genetics and biochemistry of phenol degradation by Pseudomonas sp. CF600. Biodegradation, 5,219-236.

311. Prieto, M. & J.Garcia. 1994. Molecular characterization of 4-hydroxyphenylacetate 3-hydrolase of Esherichia coll J.Biol.Chem., 269,22823-22829.

312. Pruchta, M., Peterseim, A., Timmis, K.N., & D.H.Pieper. 1996. Muconolactone isomerase of the 3-oxoadipate pathway catalyzes dechlorination of 5-chlorosubstituted muconolactones. Eur.J.Biochem., 237, 350-356.

313. Qian, H, Edlund, U., Powlowski, J.B., Shingler, V., and I.Sethson. 1997. Solution structure of phenol hydroxylase protein component P2 determined by NMR spectroscopy. Biochemistry, 36, 495-504.

314. Radjendirane, V., Bath, M.A., and C.S.Vaidyanathan. 1991. Affinity purification and characterization of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from Pseudomonas cepacia. Arch.Biochem.Biophys., 288,169-176.

315. Raetz C.R., and W.Dowhan. 1990. Biosynthesis and function od phospholipids in Escherichia coli. J.Biol.Chem. 1990. V.265. P. 1235-1238.

316. Rani, N.L. & D.Lalithakumari. 1994. Degradation of methylparathion by Pseudomonas putida. Can. J.Microbiol., 40, 1000-1006.

317. Reineke, W. 1998. Development of hybrid strains for the mineralization of chloroaromatics by patchwork assembly. Annu. Rev. Microbiol., 52, 287-331.

318. Reineke, W. & H.-J.Knackmuss. 1980. Hybrid pathway for chlorobenzoate metabolism in Pseudomonas sp. B13 derivatives. J. Bacteriol., 142,467-473

319. Reineke, W., Wessels S.W., Rubio M.A., Latorre J., Schwien U., Schmidt E., Schlomann M., & H.-J.Knackmuss. 1982. Degradation of monochlorinated aromatics following transfer of genes encoding chlorocatechol catabolism. FEMS Microbiol., 57, 1430-1440.

320. Rainey, F.A., Klatte, S., Kroppenstedt, R.M., and E.Stackebrandt. 1995a. Dietzia, a new genus including Dietzia maris comb, nov., formely Rhodococcus maris. Int. J.Syst. Bacterid., 45,32-36.

321. Ratledge, C. & L.G.Dover. 2000. Iron metabolism in pathogenic bacteria. Annu.Rev.Microbiol., 54, 881-941.

322. Rieble, S., Joshi, D.K., and M.N.Gold. 1994. Purification and characterization of a 1,2,4-trihydroxybenzene 1,2-dioxygenase from the basidiomycete Phanerochaete chrisosporium. J. Bacterid., 176,4838-4844.

323. Ritchie D.W. & Kemp G.J.L. Fast computation, rotation, and comparison of low resolution spherical harmonic molecular surfaces. 1999. J.Comp.Chem., 20,383-395.

324. Rogan, W.Y., Gladen, B.C., Hung, K.-L., Koong, S.-L., Shih, L.-Y., Taylor, J.S., Wu, Y.-C., Yang, D., Ragan, N.B., and C.-C.Hsu. 1988. Congential poisoning by polychlorinated biphenyls and their contaminants in Taiwan. Science, 241, 334-336.

325. Saint, C.P., McClure, N.C., and W.A.Venables. 1990. Physical map of the aromatic amine and w-toluate catabolic plasmid pTDNl in Pseudomonas putida: location of a unique meta-cleavage pathway. J. Gen. Microbiol., 136, 615-625.

326. Sambrook, J., Fritsch, E.F., & T.Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY.

327. Sanders, H.O. & J.H.Chandler. 1972. Biological magnification of a polychlorinated *biophenyl (Arochlor 1254) from water by aquqtic invertebrates. Bull. Environm. Contam. Toxicol., 7,257-263.

328. Sangodkar, U.M.X., Chapman, P.J., and A.M.Chakrabarty. 1988. Cloning, physical mapping, and expression of chromosomal genes specifying degradation of the herbicide 2,4,5-T by Pseudomonas cepacia AC 1100. Gene, 71,267-277.

329. Sankaran, K., &H.C.Wu, 1994. Lipid modification of bacterial prolipoprotein. Transfer of diacylglyceryl moiety from phosphatidylglycerol. J.Biol.Chem., 269, 19701-19706.

330. Sayler, G.S., Lund, L.C., Shiaris, M.P., Sherill, T.W., and R.E.Perkins. 1979. Comparative effects of Arochlor 1254 and phenanthrene on glucose uptake by freshwater microbial populations. Appl. Environ. Microbiol., 37, 878-885.

331. Schell, U., Seibert, V., Vollmer, M., and M.Schlomann. 1994. TfdF a second plasmid-encoded maleylacetate reductase of Alcaligenes eutrophus JMP 134 (pJP4), abstr. P413. Bioengineering, 10, 83.

332. Schirmer, F., Ehrt, S., and W.Hillen. 1997. Expression, inducer spectrum, domain structure, and function of MopR, the regulator of phenol degradation in Acinetobacter calcoaceticus NCIB8250. J.Bacteriol., 179, 1329-1336.

333. Schlomann, M. 1988. Die verschiedenen Typen der Dienelacton-Hydrolase und ihre Rolle beim bakteriellen Abbau von 4-Fluorbenzoat. Ph.D.Thesis, Universitat Stuttgart.

334. Schlomann, M. 1994. Evolution of chlorocatechol catabolic pathways. Biodegradation, 5, 301-321.

335. Schlomann, M., Fischer, P., Schmidt, E., and H.-J.Knackmuss. 1990a. Enzymaticformation, stability, and spontaneous reactions of 4-fluoromuconolactone, a metabolite of the bacterial degradation of 4-fluorobenzoate. J. Bacterid., 172, 5119-5129.

336. Schlomann, M., Fischer, P., Schmidt, E., & H.-J.Knackmuss. 1990b. Enzymatic formation, stability, and spontaneous reactions of 4-fluoromuconolactone, a metabolite of the bacterial degradation of 4-fluorobenzoate. J.Bacteriol., 172, 5119-5129.

337. Schmidt E. & H.-J.Knackmuss. 1980. Chemical structure and biodegradability of halogejiated aromatic compounds. Conversion of chlorinated muconic acids into maleoylacetic acid. Biochem.J., 192, 339-347.

338. Schmidt, E., Remberg, G., and H.-J.Knackmuss. 1980. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Biochem.J. 192:331-337.

339. Schreiber, A., Dorn, M.H.E., Reineke, W., & H.-J.Knackmuss. 1980. Critical reactions in fluorobenzoic acid degradation by Pseudomonas sp. В13. Appl. Environ.Microbiol., 39, 58-67.

340. Seibert, V., Stadler-Fritzsche, K., and M.Schlomann. 1993. Purification and characterization of maleylacetate reductase from Alcaligenes eutrophus JMP134 (pJP4). J.Bacteriol., 175, 6745-6754.

341. Seibert, V., Thiel, M., Hinner, I.-S., and M.Schlomann. 2004. Characterization of a4 • Tgene cluster encoding the maleylacetate reductase from Ralstonia eutropha 335 , an enzyme recruited for growth with 4-fluorobenzoate. Microbiology, 150,463-472.

342. Sejlitz, Т., and H.Y.Neujahr. 1987. Phenol hydroxylase from yeast. A model for phenol binding and improved purification procedure. Eur.J.Biochem., 170,343-349.

343. Sentchilo, V. S., Perebituk, A.N., Zender, A.J.B., and J.R.van der Meer. 2000. Molecular diversity of plasmid genes that encode toluene and xylene metabolism in

344. Pseudomonas strains isolated from different contaminated sites in Belarus. #

345. Appl.Environ.Microbiol., 66, 2842-2852.

346. Seto, M., Kimbara, K., Shimura, M., Hatta, Т., Fukuda, M., and K.Yado. 1995. A novel transformation of polychlorinated biphenyls by Rhodococcus sp. strain RHA1. Appl. Environm. Microbiol., 61, 3353-3358.

347. Severn, W. В., and J.C.Richards. 1999. The structure of the specific capsular polysaccharide of Rhodococcus equi serotype 4. Carbohydr. Res., 320, 209-222.

348. Shanley, M.S., Harrison, A., Parales, R.E., Kowalchuk, G., Mitchell, D.J., and L.N.Ornston. 1994. Unusual G+C content and codon usage in catlJF, a segment of the ben-atf-operonic cluster in the Acinetobacter calcoaceticus chromosome. Gene, 138, 59-65.

349. Shao, Z., Dick, W.A., and R.M.Behki. 1995a. An improved Escherechia coli-Rhodococcus shuttle vector and plasmid transformation in Rhodococcus spp. using electroporation. Lett.Appl.Microbiol., 21, 261-266.

350. Shiaris, M.P. & G.S.Sayler. 1982. Biotransformation of PCB by natural assemblages of freshwater microorganisms. Environ. Sci. Technol., 16, 367-369.

351. Shibuya, I. Metabolic regulations and biological functions of phospholipids in Escherichia coli. Prog.Lipid Res. 1992. V.31. P. 245-299.

352. Shimizu, S., Kobayashi, H., Masai, E., and M.Fukuda. 2001. Characterization of the 450-kb linear plasmid in a polychlorinated biphenyl degrader, Rhodococcus sp. strain RHA1. Appl. Environ. Microbiol., 67,2021-2028.

353. Sikkema, J., J. A. M. de Bont, and B. Poolman. 1994. Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes. J. Biol. Chem. 269:8022-8028.

354. Sikkema, J., J. A. M. de Bont, and B. Poolman. 1995. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiol. Rev. 59:201-222.

355. Smith, M.R. 1990. The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria. Biodegradation, 1, 191-206.

356. Sorkhoh, N.A., Alhasan, R.H., Khanafer, M., and S.S.Radwan. 1995. Establishment of oil-degrading bacteria associated with cyanobacteria in oil-polluted soil. J.Appl.Bacteriol., 78,194-199.

357. Spain, J.C. & D.T.Gibson. 1991. Pathway for biodegradation of p-nitrophenol in a Moraxella sp. Appl. Environm. Microbiol., 57, 812-819.

358. Sparnins, V.L., Burbee, D.G., and S.Dagley. 1979. Catabolism of L-tyrosine in

359. Trichosporon cutaneum. J.Bacteriol., 138,425-430. *

360. Springael, D., Kreps, S. & M.Mergeay. 1993. Identification of a catabolic transposon, Tn4371, carrying biphenyl and 4-chlorobiphenyl degradation genes in Alcaligenes eutrophus A5. J.Bacteriol., 175,1674-1681.

361. Springael, D., A. Ryngaert, C. Merlin, A. Toussaint, and M. Mergeay. 2001.

362. Occurrence of Tn43 71-related mobile elements and sequences in (chloro-)biphenyl1degrading bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 67:42-50.

363. Stackebrandt, E. and B.M.Goebel. 1994. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol., 44, 846-849.

364. Stackebrandt, E., Rainey, F.A., Ward-Rainey, N.L. Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. Int.J. Systemat. Bacterid., 47,479-491.

365. Stanier, R.Y., J.L.Ingraham. 1954. Protocatechuic acid oxidase. J. Biol. Chem., 210, 799-808.

366. Steiert, I., G., Pignatello, J., and R.Crawford. 1987. Degradation of chlorinated phenols by a pentachlorophenol-degrding bacterium. Appl.Environ.Microbiol., 53, 907910.a

367. S'tolz, A.& H.-J.Knackmuss. 1993. Degradation of 2,4-dihydroxybenzoate by Pseudomonas sp. BN9. FEMS Microbiol. Lett., 108, 219-224.

368. Strachan, P.D., Freer, A.A., and C.A.Fewson. 1998. Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259 and cloning and sequencing of its catA gene. Biochem. J., 333, 741-747.

369. Straube, G. 1987. Phenol hydroxylase from Rhodococcus sp. PI. J.Basic Microbiol., 27,229-232.

370. Suske, W. A., van Berkel, W. J. H., and H-P.E.Kohler. 1999. Catalytic mechanism of 2-hydroxybiphenyl 3-monooxygenase, a flavoprotein from Pseudomonas azelaica HBP1. J.Biol.Chem., 274, 33355-33365.

371. Sze, I. S. & S.Dagley. 1984. Properties of salicylate hydroxylase and hydroxyquinol 1,2- dioxygenase purified from Trichosporon cutaneum. J.Bacteriol., 159, 353-359.

372. Takenaka, S., Okugava, S., Kadowaki, M., Murakami, S., and K.Aoki. 2003. The metabolic pathway of 4-aminophenol in Burkholderia sp. strain AK-5 from that of aniline and aniline with C-4 substituents. Appl. Environm. Microbiol., 69, 5410-5413.

373. Tan, H.-M. 1999. Bacterial catabolic transposons. Appl. Microbiol. Biotechnol., 51,1Л12. "

374. Tomasi, I., Artaud, I., Bertheau, Y., and D.Mansuy. 1995. Metabolism of polychlorinated phenols by Pseudomonas cepacia AC1100: determination of the first two steps and specific inhibitory effect of methimazole. J.Bacteriol., 177, 307-311.

375. Tomioka, N., Uchiyama, H., and O.Yagi. 1994. Cesium accumulation and growth characteristics of Rhodococcus erythropolis CS98 and Rhodococcus sp. strain CS402. Appl. Environm. Microbiol., 60,2227-2231.

376. Top, E. M., Holben, W. E. & L.J.Forney. 1995. Characterization of diverse 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmids isolated from soil by complementation. Appl.Environ.Microbiol., 61,1691-1698.

377. True, A.E., Linda, A.M., Pearce, L.L., Lipscomb, J.D., and Jr.L.Que. 1990. An EXAFS study of the interaction of substrate with the ferric active site of protocatechuate 3,4-dioxygenase. Biochemistry, 29,10847-10854.

378. Tsitko, I.V., Zaitsev, G.M., Lobanok, A.G., and M.S.Salkinoja-Salonen. 1999. Effect of aromatic compounds on cellular fatty acid composition of Rhodococcus opacus Appl. Environ.Microbiol., 65, 853-855.

379. Uotila, J.S., Kitunen, V.H., Saastamoinen, Т., Coote, Т., Haggblom, M.M., and M.S.Salkinoja-Salonen. 1992. Characterization of aromatic dehalogenases of Mycobacterium fortuitum CG-2. J.Bacteriol., 174, 5669-5675.

380. Uz, I., Duan, Y.P., and A.Ogram. 2000. Characterization of the naphthalene-degrading bacterium, Rhodococcus opacus M213. FEMS Microbiology Lett., 185, 231238.

381. Vallaeys, Т., Albino, L., Soulas, G., Wright, A. D. & A. J.Weightman. 1998. Isolation and characterization of a stable 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading bacterium, Variovoraxparadoxus, using chemostat culture. Biotechnol Lett., 20,1073-1076.

382. Ца\И, К. & M.H.Gold. 1991. Degradation of 2,4-dichlorophenol by the lignin-degrading fungus Phanerochaete chrysosporium. J.Bacteriol., 173, 345-352.

383. Valli, K., Wariishi, H., and M.H.Gold. 1992. Degradation of 2,7-dichloro-dibenzo-p-dioxin by the lignin-degrading bassidiomycete Phanerochaete chrysosporium. J. Bacterid., 174,2131-2137.

384. Valenzuela, J., Bumann, U., Cespedes, R., Padilla, L., and B.Gonzalez. 1997. Degradation of chlorophenols by Alcaligenes eutrophus JMP134 (pJP4) in bleached kraft mill effluent. Appl.Environ.Microbiol., 63,227-232.

385. Vallaeys, Т., Courde, L., McGowan, C., Wright, A. D. & R. R.Fulthorpe. 1999. Phylogenetic analyses indicate independent recruitment of diverse gene cassettes during assemblage of the 2,4-D catabolic pathway. FEMS Microbiol. Ecol., 28, 373-382.

386. Vallaeys, Т., Fulthorpe, R. R., Wright, A. M. & G.Soulas. 1996. The metabolic pathway of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation involves different families of tfdA and tfdB genes according to PCRRFLP analysis. FEMS Microbiol.Ecol., 20,163-172.

387. Van Voorst, F., de Kruijff, B. 2000. Role of lipids in the translocation of proteins across membranes. Biochem. J., 347, 601-612.

388. Vedler, E., Koiv, V. & A.Heinaru. 2000. Analysis of the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmid pEST4011 of Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans strain EST4002. Gene, 255,281-288.

389. Vetting, M. W., D'Argenio D. A, Ornston L. N., and D. H.Ohlendorf. 2000. Structure of Acinetobacter sp. ADP1 protocatechuate 3,4-dioxygenase at 2.2 A resolution: implications for the mechanisms of an intradiol dioxygenase. Biochemistry, 39, 79437955.

390. Vetting, M.W., Earhard, C.A., and D.H.Ohlendorf. 1994. Crystallization and preliminary X-ray analysis of protocatechiate 3,4-dioxygenase from Acinetobacter calcoaceticus. J. Mol. Biol., 236, 372-373.

391. Vetting, M.W. and D.H.Ohlendorf. 2000. The 1.8 A crystal structure of catechol 1,2-dioxygenase reveals a novel hydrophobic helical zipper as a subunit linker. Struct. Fold. Des., 39,429-440.

392. Vollmer, M., Fischer, P., Knackmuss, H.-J. & M.Schlomann. 1994. Inability of muconate cycloisomerases to cause dehalogenation during conversion of 2-chloro-cis,cis-muconate. J.Bacteriol., 176,4366-4375.

393. Vollmer, M.D., Hoier, H., Hecht, H.-J., Schell, U., Groning, J., Goldmann, A., and M.Schlomann. 1998. Substrate specificity of and product formation by muconatecycloisomerases: an analysis of wild-type enzymes and engineered variants. Appl. «

394. Environ.Microbiol., 64,290-3299.

395. Vollmer, M. & M.Schlomann. 1995. Conversion of 2-chloro-c/5,c/5-muconate and its metabolites 2-chloro- and 5-chloromuconolactone by chloromuconate cycloisomerases of pJP4 and pAC27. J.Bacteriol., 177,2938-2941.

396. Wang, M.X., S.J.Lin. 2002. Practical and convenient enzymatic synthesis of enantiopure alpha-amino acids and amides. J, Org. Chem., 67, 6542-6545.

397. Wang, Y., Garnon, J., Labbe, D., Bergeron, H., and P.C.K.Lau. 1995. Sequence and expression of the bpdClC2BADE genes involved in the initial steps of biphenyl/chlorobiphenyl degradation by Rhodococcus sp. M5. Gene, 164, 117-122.

398. Warhurst, A.M., Clarke, K.F., Hill, R.A., Holt, R.A., and C.A.Fewson. 1994. Metabolism of styrene by Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259. Appl. Environ.Microbiol., 60,1137-1145.

399. Warhurst, A.M. and C.A.Fewson. 1994. Biotransformations catalyzed by the genus

400. Rhodococcus. Critic. Rev Biochem., 14,29-73. *

401. Weber, F. J., S. Isken, and J. A. M. de Bont. 1994. Cis/trans isomerization of fatty acids as a defense mechanism of Pseudomonas putida strains to toxic concentrations of toluene. Microbiology 140:2013-2017.

402. Wieser, M., Eberspacher, J., Vogler, В., and F.Lingens. 1994. Metabolism of 4-chlorophenol by Azotobacter sp. strain GP1: structure of the meta cleavage product of 4-chlorocatechol. FEMS Microbiol. Lett., 116, 73-78.

403. Wieser, M., Wagner, В., Eberspacher, J., and F.Lingens. 1997. Purification and characterization of 2,4,6-trichlorophenol-4-monooxygenase, a dehalogenating enzyme from Azotobacter sp. Strain GP1. J.Bacteriol., 179,202-208.

404. Winstanley C., Taylor S.C., and P.A.Williams. 1987. pWW174: a large plasmid from Acinetpbacter calcoaceticus encoding benzene catabolism by the beta-ketoadipate pathway. Mol. Microbiol., 1, 219-227.

405. Wong, P.T.S. & K.L.E.Kaiser. 1974. Bacterial degradation of polychlorinated byphenyls. II. Rate studies. Bull. Environ. Contam. Toxicon., 13, 249-256.

406. Wray, V. 1983. Fluorine-19 nuclear magnetic resonance spectroscopy. In: Webb GA (Ed) Annual Reports onNMR Spectroscopy, 14,149-191. Academic Press Inc., London.

407. Wu, Q., Sowers, K.R., and H.D.May. 2000. Establishment of a polychlorinated Biphenyl-dechlorinating microbial consortium, specefec for doubly flanked chlorines in a defined, sediment-free medium. Appl. Environ. Microbiol., 66,49-53.

408. Wu, Z.L., and Z.Y.Li. 2003. Highly enantioselective synthesis of alpha,alpha-disubstituted malonamic acids through asymmetric hydrolysis of dinitriles with Rhodococcus sp. CGMCC 0497. Chem. Commun. (Camb), 7, 386-387.

409. Wyndham, R. C., Cashore, A. E., Nakatsu, С. H. & M. C.Peel. 1994a. Catabolic transposons. Biodegradation 5, 323-342.

410. Wyndham, R. C., Nakatsu, C., Peel, M., Cashore, A., Ng, J. & F.Szilagy. 1994b. Distribution of the catabolic transposon Tn5271 in a groundwater bioremediation system. Appl.Environ.Microbiol., 60, 86-93.

411. Xia, X.-S., Aathithan, S., Oswiecimska, K., Smith, A. R. W. & I. J.Bruce. 1998. A novel plasmid pIJBl possessing a putative 2,4-dichlorophenoxyacetate degradative transposon Tn5530 in Burkholderia cepacia strain 2a. Plasmid, 39,154-159.

412. Xu, D., Ballou, D.P., and V.Massey. 2001. Studies of the mechanism of phenol hydroxylase: mutants Tyr289Phe, Asp54Asn, and Arg281Met. Biochemistry, 40, 12369122378.

413. Xun, L. 1996. Purification and characterization of chlorophenol 4-monooxygenase from Burkholderia cepacia AC1100. J.Bacteriol., 178, 2645-2649.

414. Xun, L., Topp, E., and C.S.Orser. 1992. Diverse substrate range of a Flavobacterium pentachlorophenol hydroxylase and reaction stoichiometries. J.Bacteriol., 174,2898-2902.

415. Xun, L. & K.B.Wagnon. 1995. Purification and properties of component В of 2,4,5-trichlorophenoxyacetate oxygenase from Pseudomonas cepacia AC 1100. Appl.Environ.Microbiol., 61, 3499-3502.

416. Xun, L. & C.M.Webster. 2004. A monooxygenase catalyzes sequential dechlorinations of 2,4,5-trichlorophenol by oxidative and hydrolytic reactions. J. Biol.Chem., 279,6696- 6700.

417. Yagafarova, G.G. & I.N.Skvortsova. 1996. A new oil-oxidizing strain of Rhodococcus erythropolis. Appl.Biochem.Microbiol., 32,207-209.

418. Yagi, O. and R.Sudo. 1980. Degradation of polychlorinated biphenyls by microQrganisms. J. Water Pollut. Control Fed., 52, 1035-1043.

419. Yamada, A., Kishi, H., Sugiyama, K., Nakamura, K., Masai, E., and M.Fukuda. 1998. Two nearly identical aromatic compound hydrolase genes in a strong polychlorobiphenyl degrader, Rhodococcus sp. strain RHA1. Appl. Environm. Microbiol., 64,2006-2012.

420. Young, D.M., Parke, D., D'Argenio, D.A., Smith, M., and L.N.Ornston. 2001. Evolution of a catabolic pathway. ASM News, 67, 362-369.

421. Zaborina, O., Daubaras, D.L., Zago, A., Xun, L., Saido, K., Klem, Т., Nikolic, D., and A.M.Chakrabarty. 1998. Novel pathway for conversion of chlorohydroxyquinol to maleylacetate in Burkholderia cepacia AC1100. J. Bacteriol., 180,4667-4675.

422. Zaitsev, G.M., Uotila, J.S., Tsitko, I.V., Lobanok, A.G., and M.S.Salkinoja-Salonen 1995. Utilization of halogenated benzenes, phenols, and benzoates by Rhodococcus opacus GM-14. Appl. Environ. Microbiol., 4191-4201.

423. Zenno, S., Saigo, K., Kanoh, H., and S.Inouye. 1994. Identification of the gene encoding the maior NAD(P)H-flavin oxidoreductase of the bioluminiscent bcterium Vibrio fisheri ATCC 7744. J.Bacteriol., 176, 3536-3543.

424. Zylstra, G.J., Olsen, R.H., and D.P.Ballou. 1989a. Cloning, expression, and regulationof the Pseudomonas cepacia protocatechuate 3,4-dioxygenase genes. J. Bacteriol., 171, 5907-5914.

425. Zylstra, G.J., Olsen, R.H., and D.P.Ballou. 1989b. Genetic organization and sequence of the Pseudomonas cepacia genes for the alpha and beta subunits of protocatechuate 3,4-dioxygenase. J.Bacteriol., 171,5915-5921.