Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro

Катасонова, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro"

На правах ру котя и

UQ3058120

Катасонова Анна Александровна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ IN VITRO_ ...

03 00 23 - «Биотехнология» 03 00 12 - «Физиология и биохимия растений»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2007

003058120

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» (кафедра биохимии и биотехнологии биологического факультета) и в ГУ «Институт биологии Уфимского научного центра РАН» (лаборатория генетики и цитологии растений)

Научный руководитель доктор биологических наук, проф

Шаяхметов Изгам Фазлиахметович

Научный консультант доктор биологических наук, проф

Круглова Наталья Николаевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, проф

Чемерис Алексей Викторович

доктор биологических наук, проф Хайруллин Рамиль Магзинурович

Ведущая организация ГНЦ РФ «Всероссийский научно-

исследовательский институт растениеводства имени Н И Вавилова» РАСХН (г Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится « » t/JJXtJL- 2007 г в ч на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002 13601 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу 450054 г Уфа, пр Октября, д 69 Тел /факс (347)-235-53-62, e-mail ib@anrb ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии Уфимского научного центра РАН и на официальном сайте http //www anrb ru/mbio/dissovet/index htm

Автореферат разослан « {ß » О'Ль^РЛ.'мЯ 2007 г

Ученый секретарь

Регионального диссертационного совета, кандидат биологических наук

Р В Уразгильдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Получение морфогенного каллуса и последующая регенерация растений - неотъемлемая часть многих растительных биотехнологий Трудности, зачастую возникающие при прохождении этих этапов, особенно характерны для культуры in vitro клеток, тканей и органов злаков Несмотря на то, что регенерация целого растения из культивируемых каллусных клеток описана для многих представителей этого семейства (пшеницы [Копертех, Бутенко, 1995, Игнатова, 2004, Круглова с соавт, 2005], кукурузы [Сатарова, 2002], риса [Кучеренко, 1993], ячменя [Ryschka et al 1991, Дунаева с соавт, 2000], сорго [Hagio, 2002], овса [Nuutila et al, 2002]), усовершенствование системы культивирования in vitro и повышение выхода растений-регенерантов злаков остаются актуальными

Поскольку у злаков в качестве экспланта для получения in vitro каллусов с высокой регенерационной способностью предпочтительным является использование незрелых зародышей, успех в применении новых биотехнологий во многом связан с изучением эмбриогенеза представителей семейства Роасеае Отдельная проблема в этой области - выявление цитофизиологических условий формирования морфогенных каллусов зародышевого происхождения, тотипотентные клетки которых в условиях in vitro способны развиваться по различным путям морфогенеза Имеющиеся в литературе данные сводятся, как правило, к сведениям о составе и рН питательной среды, освещенности, температуре, использование которых способствовало формированию морфогенного каллуса [Суханов, Папазяп, 1983, Гапоненко, 1987, 1994, Сайб, Карабаев, 1992, Шаяхметов, 1999, Huang, Wei, 2004, Pellegrineschi et al, 2004, и мн др ] Недостаточно полно изучены стадии развития зародыша, давшего начало морфогенному каллусу Остается открытым вопрос о путях морфогенеза зародышевых каллусов in vitro Недостаточно выявлены и цитофизиологические особенности путей морфогенеза ш vitro, ведущие к формированию фертильных растений-регенерантов в каллусе

В то же время, именно от полноты комплексных знаний об эмбриологических и цитофизиологических особенностях этих процессов во многом зависит эффективность биотехнологий, связанных с массовым получением фертильных растений-регенерантов из каллусов зародышевого происхождения Важно и то, что цитофизиологическое изучение развития незрелых зародышей в строго контролируемых условиях т vitro способствует решению важнейшей фундаментальной проблемы биологии - морфогенеза Более того, именно зародыш, обладающий всеми потенциями особи [Батыгина, 2000], наиболее перспективен в качестве модельной системы при изучении различных аспектов реализации морфогенетических программ растения

Все эти проблемы особенно необходимо разрабатывать по отношению к яровой мягкой пшенице - основному хлебному злаку

В связи с этим, цель исследований состояла в оптимизации технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro на основе эмбриологических и цитофизиологических данных Для достижения цели были поставлены задачи

1 Изучить развитие зародыша от зиготы до зрелой структуры на основе данных цито-гистологического анализа

2 Разработать периодизацию эмбриогенеза, удобную в биотехнологической практике

3 Разработать критерии оценки стадий эмбриогенеза, сопряженных со способностью зародыша формировать морфогенный каллус

4 Выявить условия максимальной пролиферации морфогенных каллусов (стадия развития ипокулируемого зародыша, состав культуральной среды)

5 Исследовать патофизиологические особенности путей морфогенеза в культуре т vitro каллусов зародышевого происхождения и вьивить оптимальные пути получения фертильных растений-регенерантов

6 Разработать оптимизированный регламент биотехнологии получения фертильных растений-регенерантов в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения

Основные положения, выносимые на защиту

1. Способность к формированию морфогенного каллуса определяется оптимальной стадией развития инокулируемого зародыша, характеризующегося определенным цито-гистологическим статусом

2 Зависимость регенерационной способности каллусов от продолжительности культивирования in vitro на индукционной питательной среде обусловлена особенностями прохождения путей морфогенеза, ведущих к формированию растений-регенерантов

3 Регенерация фертильных растений из каллусов происходит по таким путям морфогенеза т vitro, как гемморизогенез и соматический эмбриогенез (эмбриоидогенез)

4 Увеличения количества растений-регенерантов можно добиться отбором экспланта с высокой морфофизиологической активностью, а также оптимальной продолжительностью культивирования in vitro морфогенных каллусов

Научная новизна. На основании комплексных эмбриологических и детальных цитофизиологических исследований установлено, что основным условием формирования морфогенных каллусов является инокуляция незрелых зародышей яровой мягкой пшеницы на подстадии три стадии органогенеза (согласно авторской периодизации), которая характеризуется определенным цито-гистологическим статусом зародыша Выявлены и исследованы пути морфогенеза в каллусной культуре т vitro незрелых зародышей яровой мягкой пшеницы Продемонстрирована универсальность начального этапа всех путей морфогенеза in vitro, состоящая в формировании в каллусе морфогенетического очага, представленного главным образом меристематическими клетками Охарактеризованы цитофизиологические особенности развития морфогенетического очага по каждому из выявленных путей морфогенеза т vitro Показано, что регенерация фертильных растений проходит по таким путям морфогенеза in vitro, как гемморизстенез и соматический эмбриогенез, при этом биотехнологически оптимален соматический эмбриогенез

Практическая значимость работы. Периодизация эмбриогенеза яровой мягкой пшеницы может быть использована для подбора эксплантов с высоким морфогенетическим потенциалом в биотехнологических работах, связанных с массовым получением регенерантов Оптимизированный регламент получения фертильных растений-регенерантов пшеницы в каллусной культуре in vitro может быть использован при клеточной селекции, соматической гибридизации и генно-инженерных экспериментах Результаты исследования могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах ВУЗов

Связь работы с научными программами. Исследования поддержаны РФФИ (грант 05-04-97911, 2005-2007 гг), а также выполнены в рамках программы «Ведущие научные школы РФ» (грант НШ 4834 2006 4, 2006-2007 гг) и ГНТП Академии наук РБ на 2005-2007 гг

Личный вклад автора состоит в разработке программы исследования, получении и анализе экспериментального материала, описании результатов исследования, формировании выводов

Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены значительным объемом экспериментального материала, обработанного с применением современных математических методов

Реализация результатов. Полученные результаты используются при чтении спецкурса по биотехнологии растений на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета

Апробация работы Результаты исследования были представлены на II научной конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), VIII международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), II (Москва, 2004), III (Москва, 2005) и IV (Пущино, 2006) съездах Общества биотехнологов России, I международной школе молодых ученых «Эмбриология и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005), I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006), XIII международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006),

международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), X международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Путано, 2006), Всероссийском симпозиуме «Биолошя клетки в кулыуре» (Санкт-Петербург 2006), международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006), XIV международной конференции мо юдых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007)

Публикации По геме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОИ РФ

С груктура и объем шссертации Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов Список литературы включает 203 работы, в том числе 122 работ зарубежных авторов Диссертация иллюстрирована 83 рисунками и 4 таблицами

ОБЬЕК! II МЬТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования послужили 7 сортов и гибридная линия яровой мя1кой пшеницы, используемые в селекционно-генетических программах Башкирского НИИ СХ РАСХН Детальные цито-гистологические исследования выполнены на растениях сорта Симбирка

Использованы метод культуры т vi/io незрелых зародышей пшеницы [Суханов, Папазян, 1983, Konepiex, Бутснко, 1995] в модификации [Шаяхметов, 1999], цию-гистлогпческие метды исследования [Паушева, 1988, Барыкина с соавг, 2004J в мо шфиклции [Круглова с еоавг , 2007], меюды фенологических наблюдений за развитием пшеницы [Куперман, 1977] Препараты просматривали с применением светового микроскопа Jenamed-2 (Carl Zeiss, Jena), фотографировали при помощи цифровой камеры «Canon» с программным управлением (Canon Ine , China) Статистическую обработку полученных результатов ве m е применением программы Microsoft Office Excel 2003, учитывая основные статистические параметры

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Периодизация эмбриогенеза in vivo яровой мягкой пшеницы

Основным условием формирования in vilto каллусов с высокой регенерационной способностью является инокуляция экспланта (у злаков, как правило, зародыша) на оптимальной стадии развития Для выявления такой стадии было проведено цито-гистологическое исследование эмбриогенеза т \ч\о яровой мягкой пшеницы через каждые 0 5 сут после опыления (на примере растений сорта Симбирка) На основании результатов цито-гистологических исследований зародыша разработана периодизация эмбриогенеза пшеницы

I. Этап недифференцированного зародыша. Включает стадии зигота — первая клетка зародыша (рис 1 а), происходит становление полярности зародыша, двунлеточпый зародыш - состоит из апикальной и базальной клеток как результата асимметричного деления зиготы (рис 16), происходит становление клеточной специализации зародыша, четырехклеточпьш зародыш - состоит из 2-х клеток апикального полюса и 2-х клеток базального полюса (рис 1в), происходит становление дорсовентральности зародыша, многоклеточный зародыш - как результат делений клеток четырехклеточного зародыша (рис 1 г), происходит накапливание массы клеток, необходимой для дифференциации зародыша

II. Этап дифференциации зародыша. Включает стадию органогенеза, которая подразделяется на три подстадии В течение подстадии один происходят интенсивные клеточные деления в апикальной части зародыша, формируется первый орган - щиток (единственная семядоля), закладывается точка роста (рис 1д) В течение подстадии два клеточные деления замедляются, формируется колеоптиль (рис le) В течение подстадии три клеточные деления также замедлены, зародыш растет за счет растяжения клеток, постепенно формируются апекс побега, зародышевый корень, колеориза, эпибласт, лигула, 1-й лист (рис !ж,з) К концу этапа завершаются процессы морфологической дифференциации зародыша и органогенеза (рис 1и)

III. Этап дифференцированного зародыша Включает стадии сформированный зародыш, в котором наличествуют все органы, характерные для зародыша злаков, происходит незначительный рост органов зародыша (за счет растяжения клеток), формируется 1-й лист, начинается интенсивное накопление запасных веществ (рис 1к), зародыш готовится к вступлению в период покоя В начале стадии зрелого зародыша формируются 2-й и 3-й листья и корневой чехлик (рис 1л), зародыш вступает в период покоя

В таблице № 1 выделенные стадии эмбриогенеза для удобства практиков (биотехнологов, селекционеров) совмещены с морфологическим критерием -длиной зародыша (в миллиметрах) и временным критерием - временем от искусственного опыления (в сутках)

Отзывчивость разновозрастных зародышей на условия культуры in vitro

Установлено, что отзывчивость зародышей на условия культивирования in vitro на среде I (по [Murashige, Skoog, 1962] с добавлением 0 2 мг/л кинетина и 2,4-Д) зависела от стадии эмбриогенеза* и концентрации 2,4-Д в этой среде (табл 2) Так, при культивировании чстырехкпеточного и многометочного зародыша, а также зародышей на подстадии один стадии органогенеза при всех концентрациях 2,4-Д и в контроле (без 2,4-Д) отмечена их постепенная дегенерация При культивировании т vitro зародышей, инокулированных на подстадии два стадии органогенеза при концентрациях 2,4-Д в I 0-8 0 мг/л через 5-7 сут наблюдали формирование рыхлых обводненных каллусов желтоватого цвета неопределенной формы, представленных рыхло расположенными клетками с большими межклетниками, ядра в которых отсутствуют Такой каллус отнесен к неморфогенному (рис 2) В контрольном варианте экспланты постепенно дегенерировали Культивирование зародышей, инокулированных на подстадии три стадии органогенеза, на среде при концентрации 2,4-Д в I 0-4 0 мг/л вело к формированию на 5-7 сут каллусов компактной консистенции, матового желтоватого цвета, узловатой формы

*Злро пиши па стадии ¡шогы и двуклеточною мродыша в эксперименты не вводити в си и\ чрсшычашю мелких ра!чсров

ж) l) ti) к) л)

Рис. 1. Эмбриогенез Ш vivo яровой мягкой шпсиииы:

a) jHroia п семязачатке, 0.5 сут. СМ. х ] 50; б) дву клеточный зародыш, 1.5 су т. СМ. \900; в) четыре* клеточный зародыш, 2.5 сут. СМ. \9<Ш; г) многоклеточный зародыш, 3.0 сут. СМ. .*750; д) Зародыш на подстадии 1 органогенеза, 7,0 сут. СМ. х550; е) зародыш на но дета дни 2 органог-eneja, 10.0 сут. СМ. \5S(); ж) зародыш на подстадии 3 органогенез«, 13.0 сут. СМ. \350; i) зародыш па нодегадии 3 органогенеза, 15.(1 суг. СМ. х150; и) зародыш на подстадии 3 органогенеза, 17.0 сут. СМ. х!50; к) сформированный зародыш, 20.0 сут. с vi. xJ50; л) зрелый зародыш, 25 сут после опыления. Í'M. \70.

Ускн'ныс обозначения {здесь и далее! АпКч - апикальная кметка, ЛП - опеке побега, ЛпП - апЩальиый полюс. АпЧ-апикальная часть. frtKi - бажгыкф клетка, В <11 базазьныЦ полюс. БзЯ- базалыщ часть. ВЛ - втором лист. 3? - зигота, ЗК- зародышевый корень. K i ■ колеоптыль. Kpj - wieopit КЧ - корисаои чсх:тх . Тг - I' 1 первый .'¡нет, С - суспеизор. ■ ' - световая мыкросктшя сут - cvrriKi/

от искусственного ппмлепин Г. I mpemúñ .тал. 111 - щип]ОК. Эп - ->пи6лост. ~1исп - зндоспсрм

Ли* ^

Г)

а)

*9нсп •

а г! [ í

Таблица 1

Периодизация эмбриогенеза /я vivo яровой мягкой пшеницы __

С i алия 1 змбриог енеза | Цито-гисго югические ¡ особенности зародыша i Значение стадии в эмбриогенезе Д шна зародыша Время посте опы гения

j ЭТАП НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ЗА РО ДЫША

1 3>ii oía 1<!сгка с крупным ячром в , апикальной части 1 , 1 Станов генис потярностн зародыша 1 0 001 мм 0 S сут

i Дв\кти очный заро 1ыш Апикальная и базальная клетки 1 как рез\ тьтат неравного детения зиготы Становтение специализации клеток зародыша 0 05-0.1 мм 1 5-2 0 с\т ■

Чет ырехклегочный зародыш ! К гетки апикального и базального 1 по носов Становтсние дорсовентральности зародыша 0,12-0 14 мм 2 5 сут i

Многоклеточный ' зародыш ¡Интенсивные тс тения клеток I апикального и база ¡ьного поносов Накаптивание массы клеток 0,15-0,2 мм 3 0-4 Осут

j ЭТАП ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЗАРОДЫША

- 1 Подстадия один Формирование | пипка, закла и>тание точки роста Морфологическая дифференциация 0 4-0 6 мм 4 5-8 0с\т

! Органогенез | Подстадия два Формирование 1 зародыша | ко 1СОПТП 1я \ Формирование органов 0 8-13 мм 8 5-12 0 cvi

■ 1 Подсгадпя три Формирование апекса побега и почечки japo tbiuicBoi о корня кслеоризы лшб гаста тип ты 1 5-2 0 мм 12 5-17 0 су г

ЭТАП ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ЗАРОДЫША

Сформированный j зародыш ! Наличие всех органов, i формирование 1-го тиста Подготовка к встутению в период покоя 2 1-2,2 мм 17 5-20 0 сут I

Зретый зародыш ! Незначитетьное растяжение , клеток, формирование 2-3-го | листьев и корневою чехчика Вступление в период покоя 2,3-2 6 мм 210-25 0 i CVT 1 I

Рис. 2.

Игморфо! ениый каллус, полученный из зародыша, и ноку7 нровк ■ > коте не под стадии два стадии органогенеза (20 сут после опыления, длина 2,2 мм) (сpeía I, 7 сут культивирования in vitroy.

á> х20; 6) СМ. *158

Цито-гистологический анализ продемонстрировал, что клетки такого каллуса в целом меристемаТичны. По морфологическим признакам их можно объединить в отдельные группы (рис. 3). В ходе последующих экспериментов, было установлено, что именно в таких каллусах отмечаются процессы морфогенеза, поэтому каллусы обозначены нами как морфо генные. Максимальный показатель пролиферации каллусов (к мг сырой массы), напрямую влияющий на морфогенез, отмечен при концентрации 2.4-Д а 2.0 мг/л при культивировании \п vino зародыша, инокулированкого на 15 сут после опыления (полстадии три стадии органогенеза, длина i ,7 мм) (табл. 2).

а) \30; 6) СМ ч 150 ^^^^^ ^^^^^

Культивирование in vi¡ г о зародышей, инокулированиых на подстадии 3 стадии органогенеза, при концентрации 2,4-Д в 5.0-8,0 мг/л к 5-7 сут вело к формированию неморфогенных каллусов. В контрольном варианте зародыши дегенерировали к 10*12 сут культивирования.

Сформированные зародыши через 10-12 сут культпинрования in vino на среде без 2,4-Д (контроль) давали начало проросткам (рис. 4а), в остальных случаях - неморфогенному каллусу.

Зрелые зародыши через 7-9 сут Культивирования in vitro формировали проростки (рис. 46) при всех использованных концентрациях 2,4-Д и в контроле. Рис. 4.

Проростки, полученные нз сформированного ("(10 сут после опыления, длина 2,1 мм) (я) и ¡релого (25.U сут после опыления, длина 2,6 мм) (б) Ъяродыййй (срсдя 1,9 сут культивирования in vitro)-. a) xlOj fi) xl',5

Пути морфогенеза и каллусной культуре in vitro зародышевого происхождения ил среде I

На 5-10 сут культивирования in vitro на среде 1 в каллусах отмечены следующие пути морфогенеза: органогенез по типу геммогенеза (формирование почки), по типу ризогенеза (формирование корня), по типу гемморичогенеза (формирование почки и корня); соматический эмбриогенез - формирование соматических зародышей. На основе данных цито-гистологнческого анализа установлено, что начало реализации каждого пути морфогенеза связано с формированием в морфогенном каллусе морфогенетического очага, представленного главным образом меристем этическим и клетками. В составе очага можно выделить 3 зоны, клетки которых отчетливо различаются по морфологии (рис. 5а), I'nt. 5.

я) морфогенетнческиЙ очя! в каллусс (среда I, 10 сут культивирования in vitro). CM.xSOO;

0) м орфогенетнчес ки с очаги о каллусе (среда I, IS сут культивировэиия кулы нвнрованни га vitro). СМ.

Выявлено, что по мере культивирования in vitro каллусов количество морфогенетических очагов сначала увеличивается, достигая максимума на 15 сут (рис. 56), затем резко снижается к 20 сут.

Таблица 2

Влияние стадии эмбриогенеза и концентрации 2,4-Д в среде I на отзывчивость зародышей в культуре т vitro

С тадия jvGpiioi eneia 1 Время ! Отзывчивость эксплантов 1 пина заротыша посте i__на концентрацию 2,4-Д в среде кутьтивирования m \iUo

опы (сния 0 0w/t 1 0 мг/л 2 0 мг/т 3 0 мг/т 4 0 чг/ т 5 0 мг/л 6 0 мг л 7 0 мг/т 8 0 Ml'т j

] с\ m (контроть) 1

Четырехкл сточный 2 5 д д д д д д д д Л 1

! зародыш, 0 12-0 14 мм !

! Многоклеточный 3 0 д д д д д д д д д

зародыш, 0 15-0 2 мм 40 д д д д д д д д д

, Потсыдня один 5 0 д д д д д д д д д 1

, органогенеза 0,4-0,6 мм 65 д д д д д д д д д !

11одстадия два 8 5 д нмк- нмк- нмк- нмк - НМК- НМК- нмк- нмк-

органогенеза 100 д нмк - нмк - нмк- нмк- НМК - нмк- нмк- НМК-

,0 8-13 мм

125 д нмк- НМК+ НМК+ НМК+ НМК- НМК+ НМК+ НМК-

14 0 д 1IMK+ НМК+ IIMK+ НМК+ НМК+ нмк- нмк- нмк-

Подсглдия три 15 0 д МК+ МК++ МК+ МК+ НМК4- нмк- нмк- нмк-

органогенеза 160 д МК+ МК+ МК+ МК+ НМК Н нмк^ НМК+ НМК-

1 5-2,0 мм 170 д мк- МК+ МК+ МК+ НМК+ нмк- нмк-^ НМК-

Сформированный 20 0 п нмк- НМК- НМК+ НМК+ нмк- нмк- нмк- HN1K-

зародыш 2,1-2 2 мм

1 Зретый зародыш, 22 0 п П П II п п п п п

2 3-2 6 мм 25 0 п п п п П п 11 п п

\ с юьные обозначения

J - дегенерация junumma ^^интенсивная пролиферация ка п\са (сырая масса 111 0-136 0 мг)

П - формирование проростка +у меренная про тферация ка! i)ca fсырая масса -45 0-110 9 мг)

HUK - формирование не морфо. ешюю кш пса -емг);шя пролиферация ка i пса (сырая масса 15 0-44 У м, )

\1К формирование морфо.чнно, о ка i пса

( I |р\ю \ысс\ ка I |\са и )мсря ш в mi hi 1Чч h\ m i нипрования

Геммагенез in vitro в морфогенном каллусе По мере разрастания морф огенети чеекого очага клетки каллус», окружающие очаг, постепенно дегенерируют, и очаг оказывается на поверхности каллуса; таким образом, почки формируются экзогенпо. Собственно геммогеиез начинается с периклинальных и антиклинальных делений клеток субэпндермаиьных слоев очага, что приводит к образованию примордиев первых листьев (рис. 6), развивающихся в листья.

PitCi ft. Формирование ирииорлиев первых листьев н морфо генетическом очаге (среда I, IS сут культивирования in vitro)'. a) х40;

ft) СМ. iJUfJ. Продольный срез. Условное обозначение: ПрПЛ - npuMopóuü первого ласти

Далее закладываются развития почек наблюдается установление связи между ними и массой каллуса посредством формирования элементов сосудистой системы (рис. 1).

Ннс. 7. Развитие почки и морфогенном каллусе (среда I, 2(1 сут культивирования in vitro)-. at х20;

f>) СМ. 1150. Продольный срез Условные обознйчетш АП апекс побега, К - кал.чус, Л яист, Пч почка

В ходе дальнейшего развития на 28 сут культивирования in vitro на среде ! из почек развиваются побеги При дальнейшем культивировании на среде для регенерации II побеги постепенно дегенерируют.

Ризогенез in vitro в морфогеином каллусе В отличие от почек, корни в морфогеином каллусе закладываются эндогенно (в толще каллуса). Развитие корни происходит путем клеточных делений, происходящих параллельно продольной оси морфогенетическо! о очага, за счет чего формируются периблема и плерома в виде несколько концентрических слоев клеток. Формируются корневой чехлик и колеориза. По мере развития корней наблюдается установление связи между ними и массой каллуса посредством формирования элементов сосудистой системы (рис. 86).

Рис. Я. PiHRHTHC корме» • ^

в морфог сипом каллусе (грела "л \

[, 25 сут кульТИвирОвакня ^^^^^^ '

б) СМ. v 150. Продольный срез. ^HL & ."^-Ч

Условные обозначения ^^KEi^^^^H I'-.i": 4 iAg^if

К -каллус. Кр, т корень, - -^^¡дЩШ^Ш^^ш J __

Kpi колеориш. КЧ корнеаой ^ttK |£рз lip '^fflffif

чехп/к. Пл ч -¡еролю. г ' " ~ "^Д^^И^^И^И К 'I ' )

lip периблема «Зя^Гг

Далее корень вытягивается в длину (рис. 8а) главным образом за счет растяжения клеток На среде II для регенерации корень постепенно дегенерирует.

Гемморизогенез in vitro в морфогеином каллусе Циго-гистологи чески установлено, что гемморизогенез состоит из двух ■этапов: сначала в морфогеином каллусе на поверхности морфогенетических очагов экзогенно формируется почка, затем, в толще каллуса, эндогенно формируется корень. Через IS сут культивирования in vitro почки достаточно развиты. Отмечено заложение корневых меристем в каллусе на различном расстоянии от поверхности морфогенетического очага и в различной локализации относительно почки. По мере развития почек и корней между ними постепенно устанавливается связь путем формирования в каллусе элементов сосудистой системы (рис. 9).

Через 25 сут культивирования in vitro наблюдаются хорошо развитые почки, объединенные с корнем в единую систему (рис. ] 0).

Гнс. t(l. Почки с корнями о морфш-сипом каллусе (срсла I, 25 су г культивирования in vitro).

Условные обозначения: Кр корень. Пч почки

Ррс. 9. Установление связи между ночками и корнями посредством формировании сосудистой системы (среда I, 15 cyi культивирования Ш vitro). СМ. *Н10.

Продольный cpoi Условные обозначения Кр ■ корень. 11ч - почка. СЗ элементы сосудистой системы

i la среде II для регенерации почки с корнями формируют растения.

Соматический эмбриогенез in vitro а морфогенном кащусе На 10 суг культивирования '» vitro на питательной среде ! в каллусах т морфогсиетичсских очагов формируются эмбриогенные клеточные комплексы (ЭКК). К 15 суг культивирования ЭКК обособляются от клеток остального каллуса. Согласно пито-гистологическим исследованиям, формирование соматических зародышей со всеми органами, присущими зародышу злаков, происходит путем реорганизации всего ЭКК, начиная с 10 сут культивирования. К 20 сут в зародыше закладываются апекс корня и апекс-побега. Соматические зародыши, заложи в шиеся внутри морфо генного каллуса как единая система, в процессе роста и развития появляются на поверхности каллуса. На 28 сут н них имеются хорошо развитые главный зародышевый корень, адвентивные корни и примордии первого листа (рис. i I). ['не. 11. Соматические зародыши

в морфогенногн каллусе (среда I, 28 сут культивировании in vitro): я) СМ. \52.5. Продольный срез; fi) *3(>. Уеловные обозначения. О -соматический зародыш ¡К зародышевый корень. АК адвентивный корень. ПЛ первый /ист. к' - кстус

Далее на среде II для регенерации соматические зародыши дают начало растениям-регенерантам Важно подчеркнуть, что единицей репродукции в данном случае является зародыш со всеми сформированными органами

Влияние продолжительности культивирования in vitro на среде I на частоту образования морфогенных структур и регенерлцнонную способность каллусов

В течение 28 сут культивирования т \itro каллусов на среде 1 через

каждые 5 сут часть каллусов переносили на среду II (по [Murashige, Skoog, 1962] с добавлением 0 2 мг/л кинетина без 2,4-Д) для изучения регенерационной способности, часть - фиксировали для цито-гистологического анализа, а часть оставляли на среде I На постоянных препаратах подсчитывали копичество корней, почек, корней и почек, соединенных проводящими элементами, а также соматических зародышей, т е морфогенных структур, образовавшихся в результате соответствующих путей морфогенеза т vitio

Анализ данных, полученных к 28 сут, показал зависимость частоты образования морфогенных структур от продолжительности культивирования т vitro каллусов на среде I (рис 12) Так, по мере культивирования частота образования корней увеличивается до 6,3 шт/см2 (на 28 сут), почек - до 6,4 шт/см2 (на 10 с\т) и уменьшается до 0,4 шт/см' (на 28 сут) Максимальная частота образования соматических зародышей (5,4 шт/см~) отмечена на 20 сут, гемморизогенных структур (4,4 шт/см2) - на 25 сут К 28 сут культивирования оба показателя значительно уменьшаются Эти данные согласуются с результатами исследования регенерационной способности каллусов на среде II выявлено, что максимальное количество растений-регенерантов (80% от количества высаженных каллусов при соматическом эмбриогенезе и 70% - при гемморизогенезе) образуется при переносе каллусов на среду II для регенерации соответственно после 20 и 25 сут культивирования на среде I

На рис 12 частота образования морфогенных структур соотнесена с регенерационной способностью каллуса

13 i 3

о 5

Рис. 12, §.

Влияние НрОДОЛЖ HI C,1 ЫГОСТН О JJ

К}.1Ы мьнропяннн in vitro 11 a

ЧЯСИну i'M'ip.1 '.Г.4;;| ¡1H J MI' I; i Л I.' 1111 I.I V

С I p y у P

п pel ciH'pailiKMHUKi способное 11, к я. ] I y< :l:

.V с лщтле Ыю шачеш Щ I—| - соматические ю/юОыиш.

- i'\i\>oin!!0*'ii 1 >гыс $Щрукт\ры.

- ри. 'снсрацношюя tnt/собншшь kiU.i\1■»«

I 2 £

г _

5 10 15 20 25 28 продолжительность культивирования.

сут

Развитие рястенин-регенерантов в условиях in vitro и ex vitro

Через каждые 5 сут культивирования in vitro на среде ! часть Каллусов переносили на среду П для регенерации растений, составленную по [Murashige, Skoog, t%2|, с добавлением 0.2 мгл к и нетина. Формирование in vitro растениЙ-рбгснерантов из почек с корнями и соматических зародышей на среде II протекало сходным образом, различаясь только продолжительностью. Так, в первом случае растения в фазе кущения отмечались на 25 сут культивирования, но втором на 21 су г. В обоих случаях развитие растений-регенерантш шло сходно с развитием донорных растений пшеницы в естественных условиях in vivo. Отмечались типичные фенофазы исколов, третьего листа, кущений, продолжительность которых практически совпадала с а налей ичнымй показателями донорного растения.

Растения-ре гене ранты в фенофазе кущения извлекали из пробирок и переносили в условии ev vitro я Вегетационные сосуды со специально подобранной почвенной смесью, где они развивались до фенофазы полной спелости зерна. Лабораторная и нолевая оценка показала высокую всхожесть полученных семян регенератов. Качество семян подтверждено данными эмбриологическою анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные биотехнологические методы - соматическая гибридизация, клеточная селекция, генно-инженерные эксперименты - кардинально меняют процесс селекционной работы по выведению новых высокопродуктивных сортов культурных растений Перспективный в этом отношении биотехнологический метод культуры т vitro каллусов зародышевого происхождения привлекает внимание исследователей, начиная с 60-х г г прошлого века К настоящему времени накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных по различным аспектам культивирования т vitro таких каллусов, в том числе пшеницы Абсолютное большинство исследований в этой области посвящено оценке физиологических условий культивирования, таких как состав и рН питательной среды, освещенность, температура [Суханов, Папазян, 1983, Гапоненко, 1987, 1994, Oldach et al ,2001, Huang, Wei, 2004, Pellegnneschi et al , 2004, и мн др ]

В то же время успех данной биотехнологии, состоящий в массовом и стабильном получении полноценных фертильных растений-регенерантов, во многом зависит от совершенствования и оптимизации каждого ее этапа на основе комплексных эмбриологических и цитофизиологических данных

Проведенное нами культивирование т vitio разновозрастных зародышей пшеницы выявило, что стадия развития инокулируемого зародыша -важнейший фактор формирования морфогенного каллуса В условиях выполненных экспериментов к формированию морфогенного каллуса (табл 2) вела инокуляция только зародышей в подстадии три стадии органогенеза (табл 1) Для такого зародыша характерен определенный цито-гистологический статус наличие органов на ранней стадии развития, имеющих значительное количество меристематических клеток, способных к морфогенезу (рис I з)

Цито-гистологические исследования показали, что морфогенный каллус пшеницы зародышевого происхождения изначально представлен различными группами клеток (рис 36), что подтверждает мнение Т Б Батыгиной [2000] о гетерогенности структуры каллуса любого происхождения

Патофизиологическими исследованиями установлено, что в условиях культуры in viitо различные группы клеток каллуса пшеницы реализуют морфогенетические программы различными путями (геммогенез, ризогенез, гемморизогенез, сомаз ический эмбриогенез) (рис 6-11)

Важно подчеркнуть универсальность начального этапа всех путей морфогенеза т i Uro в каллусе формируется морфогенетический очаг, представленный главным образом меристематическими клетками, способными к морфогенезу (рис 5) Повышения количества очагов можно добиться оптимальной продолжительностью культивирования каллуса на индукционной среде

Выявленные пути морфогенеза т i то известны по литературным данным (обзоры [Батыгина, 1987, Бутенко, 1999, Лутова, 2003]), в то же время детальный цито-гистологический анализ всех путей морфогенеза в зародышевом каллусе яровой мягкой пшеницы проведен нами впервые Кроме того, впервые продемонстрирована возможность реализации различных путей морфогенеза т vitio клеток каллуса на питательной среде при различных концентрациях 2,4-Д и различной продолжительности культивирования, но без процедуры многократных пересадок, что, несомненно, влияет на ускорение и оптимизацию биотехнологии получения растений-регенерантов пшеницы

Полученные данные позволяют дать рекомендации по управлению морфогенезом каллуса т vino в нужных биотехнологу направлениях, ведущих к формированию и развитию полноценных фертильных растений-регенерантов (гемморизогенез, соматический эмбриогенез) Важно подчеркнуть, что соматический эмбриогенез биотехнологически оптимален, поскольку в данном случае в растение прорастает зародыш со всеми сформированными органами

Анализ полученных комплексных эмбриологических и цитофизиологических данных позволил разработать оптимизированный биотехнологический регламент получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре т Mtio зародышевого происхождения и их развития в условиях ех \ilro (рис 13)

этап

1»||(кД1>1Ш П1МСЖШМ IUI И0ДС1 ДДИИ I |M1

.. _ m;nru oprjttiorcrfei» ЧмЙЕ ^ ^ i'y i после опылсннн, .'Litt I 111 1,7 mm)

TiJíAvM'-i'l

Cpeôa I с jLO.W/'.чU темноте

*'Ч

этап

CUMHI li'lCCK'ltil

ï;ipo;n»ifif

III

МОрфО| СНИМИ

KU. I л ve

¿i

Jm ' ^

2u 1 25

-m -1 1- - ■ fc.

i глкч|»|л1 [<>[ с1шян СТРУКТУР«

( peôa II бе s 2.4-Ji па свету

puciciiii»-|iei ciicpun i ы и фгшгфи je lev ilicitud

d ь

i ц

I 1

лап

Почвенная смесь i V ?

(ШСТСМИН-|№ieik'|)»iti Li Ii фенофн 1С НО.I(ICIil спелое i Ii ifpnii

Hue. 13. Oh i ими шронанныи pei ламен i icmio.ioíhm получении

pa с ta i ni t-pet t'licpaif гон кроной «ш м>й кшешщы н ytvi<)ftii»v in vitro и ex vitro

ВЫВОДЫ

1 Разработана периодизация эмбриогенеза пшеницы, удобная в биотехнологической практике тем, что выделенные стадии эмбриогенеза совмещены с морфологическим критерием - длиной зародыша (в миллиметрах) и временным критерием - временем от искусственного опыления (в сутках)

2 Основным условием формирования т vitro морфогеипых каллусов является инокуляция зародышей пшеницы на подстадии три стадии органогенеза, которая характеризуется определенным цито-гистологическим статусом зародыша (наличие органов на ранней стадии развития, характеризующихся большим количеством меристематических клеток)

3 Максимальный показатель пролиферации in vitro морфогенных каллусов (в мг сырой массы) отмечен при концентрации 2,4-Д в индукционной среде в 2 0 мг/л при культивировании зародыша, введенного в культуру in vitro на 15 сут после опыления (на подстадии три стадии органогенеза, длина 1,7 мм)

4 Показано, что обязательным этапом всех путей морфогенеза in vitro является формирование в каллусе морфогенетического очага, состоящего главным образом из меристематических клеток

5 Исследованы пути морфогенеза в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения геммогенез, ризогенез, гемморизогенез, соматический эмбриогенез Выявлено, что к формированию фертильных растений-регенерантов ведут гемморизогенез и соматический эмбриогенез

6 Выявлена зависимость регенерационной способности морфогенных каллусов на среде для регенерации о г продолжительности их культивирования т vitro на индукционной среде, что обусловлено цито-гистологическими особенностями гемморизогенеза и соматического эмбриогенеза При этом на среде для регенерации путем соматического эмбриогенеза формируется большее количество растений (80% от количества морфогенных каллусов) при меньшей продолжительности (20 сут) культивирования каллусов на

индукционной среде, по сравнению с гемморизогенезом (70% и 25 сут, соответственно)

7 Оптимизирован регламент технологии получения фсртильных растений-регенерантов из каллуса зародышевого происхождения в условиях т vitro и ex vitro Для получения максимального количества регенерантов за сравнительно короткие сроки рекомендуется использовать соматический эмбриогенез как биотехнологически оптимальный путь морфогенеза каллуса in vitro *

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Зайнутдинова Э М , Катасонова А А , Сулейманов Ф А , Шаяхметов И Ф Особенности регенерации растений из каллусной ткани пшеницы в присутствии абсцизовой кислоты // Тез докл II науч конф МОГиС «Актуальные проблемы генетики» М , 2003 С 127-128

2 Зайнутдинова Э М, Катасонова А А Особенности формирования морфогенетических очагов в каллусной ткани пшеницы in vitro II Тез докл VIII междун Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино, 2004 С 47

3 Шаяхметов И Ф, Катасонова А А Количественная характеристика морфогенетических очагов в каллусной ткани пшеницы по данным цито-гистологического анализа // Материалы II съезда Общества биотехнологов России М,2005 С 85

4 Зайнутдинова Э М, Катасонова А А Цито-гистологическое изучение особенностей формирования морфогенетических очагов в каллусной ткани пшеницы // Вестник Башкирского государственного университета 2004 № 2 С 64-66

5 Катасонова А А Эмбриоидогенез яровой пшеницы в культуре in vitro // Материалы III съезда Общества биотехнологов России М,2005 С 114-115

6 Круглова Н Н, Сельдимирова О А , Зайцев Д Ю Катасонова А.А Биотехнологическая оценка экспланта для получения растений-регенерантов яровой пшеницы в культуре in vitro // Известия Челябинского НЦ УрО РАН 2006 Вып 2(32) С 94-98

7 Катасонова А А , Круглова Н Н , Шаяхметов И Ф Этапы биотехнологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы путем эмбриоидогенеза в каллусной культуре in vitro // Известия Челябинского НЦ УрО РАН 2006 Вып 2 (32) С 78-82

8 Катасонова А А Органогенез в каллусной культуре пшеницы Triticum aestivam L in vitro // Материалы I (IX) междунар конф молодых ботаников в Санкт-Петербурге СПб , 2006 С 155

9 Катасонова А А Индукция органогенеза в каллусной культуре яровой мягкой пшеницы т vitro // Тез докл XIII междунар копф студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» М , 2006 С 110-111

10 Катасонова А А Биотехнологическая оценка коллекции сортов и гибридных линий яровой пшеницы для использования в генстико-селекционных исследованиях // Материалы междунар конф «Генетика в России и мире» М , 2006 С 85

11 Катасонова А А Пути морфогенеза в каллусной культуре пшеницы т vitro //Тез докл X междунар Путинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино, 2006 С 376

12 Катасонова А А , Шаяхметов И Ф Типы органогенеза в культуре т vitro зародышевого каллуса яровой мягкой пшеницы // Цитология 2006 Т 48 № 9 С 767

13 Сельдимирова OA, Катасонова А А Цито-гистологический статус незрелою зародыша яровой мягкой пшеницы в фазе развития, оптимальной для формирования морфогенного каллуса in vitro // Цитология 2006 Т 48 № 9 С 797

14 Катасонова А А Морфогенетические очаги в каллусной культуре in vitro зародышей пшеницы // Современные микроскопические исследования в биологии и медицине М Лабора, 2006 С 28-29

15 Катасонова А А Оценка коллекции сортов яровой пшеницы для использования в экологической селекции методами биотехнологии // Тез докл междунар научно-практ конф «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» Брянск, 2006 С 32-34

16 Катасонова А А Цитофизиологические особенности регенерации растений в каллусной культуре in vitro // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России Пущино, 2006 С 96-98

17 Катасонова А А Цито-гистологическое изучение особенностей органогенеза в каллусной культуре мягкой пшеницы // Тез докл XIV междунар конф студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» М Макс Пресс, 2007 С 167

Автор выражает искреннюю благодарность д б н , проф И Ф Шаяхметову за руководство при выполнении работы, д б н, проф Н Н Кругловой за неоценимую помощь и поддержку при выполнении работы, сотрудникам лаборатории генетики и цитологии растений Института биологии УНЦ РАН к б н О А Сельдимировой и Д Ю Зайцеву за постоянную помощь и соучастие

Катасонова Анна Александровна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАТОРОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ W VITRO

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 021319 от 05 01 99 г

Подписано в печать 10 04 2007 г Бумага офсетная Формат 60x84/16 Гарнитура Times Отпечатано на ризографе Уел печ л 1,61 Уч-изд л 1,26 Тираж 120 экз Заказ 168

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г Уфа, уп Фрунзе, 32

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г Уфа, ул Фрунзе, 32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Катасонова, Анна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА IN VITRO ЗАРОДЫШЕЙ ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Развитие зародыша хлебных злаков in vivo.

1.1.1. Общая характеристика строения зародышей хлебных злаков.

1.1.2. Периодизации эмбриогенеза in vivo зерновых злаков.

1.2. Зародыши хлебных злаков как экспланты для культивирования in vitro.

1.2.1. Стадия развития зародыша, оптимальная для введения в культуру in vitro.

1.2.2. Культивирование in vitro изолированных зародышей хлебных злаков.

1.2.3. Типы каллусов зародышевого происхождения.

1.3. Получение растений-регенерантов из культивируемых in vitro зародышей злаков.

1.3.1. Эмбриогенез как путь морфогенеза in vitro.

1.3.2. Органогенез in vitro.

1.3.3. Соматический эмбриогенез (эмбриоидогенез) in vitro.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Метод культуры in vitro незрелых зародышей пшеницы.

2.2.2. Метод световой микроскопии.

2.2.3. Метод фенологических наблюдений.

2.2.4. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Развитие зародыша и периодизация эмбриогенеза яровой мягкой пшеницы in vivo.

3.1.1. Развитие зародыша яровой мягкой пшеницы in vivo.

3.1.2. Периодизация эмбриогенеза in vivo яровой мягкой пшеницы.

3.2. Отзывчивость на условия культуры in vitro разновозрастных зародышей яровой мягкой пшеницы.

3.3. Морфологический и цито-гистологический анализ путей морфогенеза в каллусной культуре пшеницы in vitro.

3.3.1. Формирование морфогенетических очагов как начальный этап путей морфогенеза в каллусной культуре in vitro.

3.3.2. Геммогенез как путь морфогенеза in vitro в морфогенном каллусе.

3.3.3. Ризогенез как путь морфогенеза in vitro в морфогенном каллусе.

3.3.4. Гемморизогенез как путь морфогенеза in vitro в морфогенном каллусе.

3.3.5. Соматический эмбриогенез как путь морфогенеза in vitro в морфогенном каллусе.

3.4. Влияние продолжительности культивирования на среде I на частоту образования морфогенных структур и регенерационную способность каллусов.

3.5. Регенерация растений яровой мягкой пшеницы в условиях in vitro и ex vitro.

3.5.1. Развитие растений-регенерантов в условиях in vitro.

3.5.2. Развитие растений-регенерантов в условиях ex vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro"

Получение морфогенного каллуса и последующая регенерация растений - неотъемлемая часть многих растительных биотехнологий [Бутенко, 1999; Носов, 1999]. Трудности, зачастую возникающие при прохождении этих этапов, особенно характерны для культуры in vitro клеток, тканей и органов злаков. Несмотря на то, что регенерация целого растения из культивируемых каллусных клеток описана для многих представителей этого семейства (пшеницы [Копертех, Бутенко, 1995; Игнатова, 2004; Круглова с соавт., 2005], кукурузы [Сатарова, 2002; Bohorova, 1995], риса [Кучеренко, 1993], ячменя [Ryschka et al,. 1991; Дунаева с соавт., 2000], сорго [Hagio, 2002], овса [Nuutila et al., 2002]), усовершенствование системы культивирования in vitro и повышение выхода растений-регенерантов злаков остаются актуальными.

Отдельная проблема в этой области - выявление цитофизиологических условий формирования морфогенных каллусов зародышевого происхождения, тотипотентные клетки которых в условиях in vitro способны развиваться по различным путям морфогенеза. Имеющиеся в литературе данные сводятся, как правило, к сведениям о составе и рН питательной среды, освещенности, температуре, использование которых способствовало формированию морфогенного каллуса [Суханов, Папазян, 1983; Гапоненко, 1987; Сайб, Карабаев, 1992; Rao et al., 1995; Шаяхметов, 1999; Huang, Wei, 2004; Pellegrineschi et al., 2004; и мн.др.]. Недостаточно полно изучены стадии развития зародыша, давшего начало морфогенному каллусу. Остается открытым вопрос о путях морфогенеза зародышевых каллусов in vitro. Недостаточно выявлены и цитофизиологические особенности путей морфогенеза in vitro, ведущие к формированию фертильных растений-регенерантов в каллусе.

В то же время, именно от полноты комплексных знаний об эмбриологических и цитофизиологических особенностях этих процессов во многом зависит эффективность биотехнологий, связанных с массовым получением фертильных растений-регенерантов из каллусов зародышевого происхождения. Важно и то, что цитофизиологическое изучение развития незрелых зародышей в строго контролируемых условиях in vitro способствует решению важнейшей фундаментальной проблемы биологии -морфогенеза. Более того, именно зародыш, обладающий всеми потенциями особи [Батыгина, 2000], наиболее перспективен в качестве модельной системы при изучении различных аспектов реализации морфогенетических программ растения.

Все эти проблемы особенно необходимо разрабатывать по отношению к яровой мягкой пшенице - основному хлебному злаку.

Для достижения цели были поставлены задачи:

1. Изучить развитие зародыша от зиготы до зрелой структуры на основе данных цито-гистологического анализа.

2. Разработать периодизацию эмбриогенеза, удобную в биотехнологической практике.

3. Разработать критерии оценки стадий эмбриогенеза, сопряженных со способностью зародыша формировать морфогенный каллус.

4. Выявить условия максимальной пролиферации морфогенных каллусов (стадия развития инокулируемого зародыша, состав культуральной среды).

5. Исследовать цитофизиологические особенности путей морфогенеза в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения и выявить оптимальные пути получения фертильных растений-регенерантов.

6. Разработать оптимизированный регламент биотехнологии получения фертильных растений-регенерантов в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Зависимость регенерационной способности каллусов от продолжительности культивирования in vitro на индукционной питательной среде обусловлена особенностями прохождения путей морфогенеза, ведущих к формированию растений-регенерантов.

3. Регенерация фертильных растений из каллусов происходит по таким путям морфогенеза in vitro, как гемморизогенез и соматический эмбриогенез (эмбриоидогенез).

4. Увеличения количества растений-регенерантов можно добиться отбором экспланта с высокой морфофизиологической активностью, а также оптимальной продолжительностью культивирования in vitro морфогенных каллусов.

Научная новизна. На основании комплексных эмбриологических и детальных цитофизиологических исследований установлено, что основным условием формирования морфогенных каллусов является инокуляция незрелых зародышей яровой мягкой пшеницы на подстадии 3 стадии органогенеза (согласно авторской периодизации), которая характеризуется определенным цито-гистологическим статусом зародыша. Выявлены и исследованы пути морфогенеза в каллусной культуре in vitro незрелых зародышей яровой мягкой пшеницы. Продемонстрирована универсальность начального этапа всех путей морфогенеза in vitro, состоящая в формировании в каллусе морфогенетического очага, представленного главным образом меристематическими клетками. Охарактеризованы цитофизиологические особенности развития морфогенетического очага по каждому из выявленных путей морфогенеза in vitro. Показано, что регенерация фертильных растений проходит по таким путям морфогенеза in vitro, как гемморизогенез и соматический эмбриогенез, при этом биотехнологически оптимален соматический эмбриогенез.

Практическая значимость работы. Периодизация эмбриогенеза яровой мягкой пшеницы может быть использована для подбора эксплантов с высоким морфогенетическим потенциалом в биотехнологических работах, связанных с массовым получением регенерантов. Оптимизированный регламент получения фертильных растений-регенерантов пшеницы в каллусной культуре in vitro может быть использован при клеточной селекции, соматической гибридизации, генно-инженерных экспериментах. Результаты исследования могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах высших учебных заведений.

Связь работы с научными программами. Исследования поддержаны РФФИ (грант 05-04-97911, 2005-2007 гг.), а также выполнены в рамках программы «Ведущие научные школы РФ» (грант НШ 4834.2006.4, 20062007 гг.) и ГНТП Академии наук РБ на 2005-2007 гг.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II научной конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003); VIII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004); II (Москва, 2004), III (Москва, 2005) и IV (Пущино, 2006) съездах Общества биотехнологов России; I международной школе молодых ученых «Эмбриология и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005); I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006); XIII международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006); международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006); X международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); международной научно-практической конференции «Молодые ученые - возрождению агропромышленного комплекса России» (Брянск, 2006); XIV международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 203 работы, в том числе 122 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 83 рисунками и 4 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Катасонова, Анна Александровна

выводы

1. Разработана периодизация эмбриогенеза пшеницы, удобная в биотехнологической практике тем, что выделенные стадии эмбриогенеза совмещены с морфологическим критерием - длиной зародыша (в миллиметрах) и временным критерием - временем от искусственного опыления (в сутках).

2. Основным условием формирования in vitro морфогенных каллусов является инокуляция зародышей пшеницы на подстадии 3 стадии органогенеза, которая характеризуется определенным цито-гистологическим статусом зародыша (наличие органов на ранней стадии развития, характеризующихся большим количеством меристематических клеток).

3. Максимальный показатель пролиферации in vitro морфогенных каллусов (в мг сырой массы) отмечен при концентрации 2,4-Д в индукционной среде в 2.0 мг/л при культивировании зародыша, введенного в культуру in vitro на 15 сут после опыления (на подстадии 3 стадии органогенеза, длина 1,7 мм).

4. Показано, что обязательным этапом всех путей морфогенеза in vitro является формирование в каллусе морфогенетического очага, состоящего главным образом из меристематических клеток.

5. Исследованы пути морфогенеза в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения: геммогенез, ризогенез, гемморизогенез, соматический эмбриогенез. Выявлено, что к формированию фертильных растений-регенерантов ведут гемморизогенез и соматический эмбриогенез.

6. Выявлена зависимость регенерационной способности морфогенных каллусов на среде для регенерации от продолжительности их культивирования in vitro на индукционной среде, что обусловлено цито-гистологическими особенностями гемморизогенеза и соматического эмбриогенеза. При этом на среде для регенерации путем соматического эмбриогенеза формируется большее количество растений (80% от количества морфогенных каллусов) при меньшей продолжительности (20 сут) культивирования каллусов на индукционной среде, по сравнению с гемморизогенезом (70% и 25 сут, соответственно).

7. Разработан оптимизированный регламент биотехнологии получения фертильных растений-регенерантов из каллуса зародышевого происхождения в условиях in vitro и ex vitro. Для получения максимального количества регенерантов за сравнительно короткие сроки рекомендуется использовать соматический эмбриогенез как биотехнологически оптимальный путь морфогенеза каллуса in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные биотехнологические методы - соматическая гибридизация, клеточная селекция, генно-инженерные эксперименты -кардинально меняют процесс селекционной работы по выведению новых высокопродуктивных сортов культурных растений. Перспективный в этом отношении биотехнологический метод культуры in vitro каллусов зародышевого происхождения привлекает внимание исследователей, начиная с 60-х г.г. прошлого века. К настоящему времени накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных по различным аспектам культивирования in vitro таких каллусов, в том числе пшеницы. Абсолютное большинство исследований в этой области посвящено оценке физиологических условий культивирования, таких как состав и рН питательной среды, освещенность, температура [Суханов, Папазян, 1983; Гапоненко, 1987; van Ark et al, 1991, Oldach et al., 2001; Huang, Wei, 2004; Pellegrineschi et al., 2004; и мн.др.].

Одним из важнейших факторов, определяющих морфогенную способность каллусов, является выбор экспланта - незрелого зародыша в оптимальной стадии развития. Как правило, исследователи [Суханов, Папазян, 1983; Шаяхметов, 1999; Дунаева с соавт., 2000; Przetakiewicz et al., 2003; Pellegrineschi et al., 2004; Zale et al., 2004] используют незрелые зародыши пшеницы на 10-22 сут после опыления при их определенной длине. Однако оставалось неясным, в какой стадии развития находится при этом зародыш, все ли клетки незрелых зародышей являются тотипотентными, существует ли разница в возникновении морфогенных каллусов у различных сортов пшеницы.

Проведенное нами культивирование in vitro разновозрастных зародышей 7 сортов и гибридной линии яровой мягкой пшеницы еще раз выявило, что стадия развития инокулируемого зародыша - важнейший фактор формирования морфогенного каллуса. В условиях выполненных экспериментов к формированию морфогенного каллуса (табл. 4) у всех изученных объектов вела инокуляция только зародышей в подстадии 3 стадии органогенеза (табл. 3). Для такого зародыша характерен определенный цито-гистологический статус: наличие органов на ранней стадии развития, имеющих значительное количество меристематических клеток (рис. 15-17), обладающих наибольшим морфогенным потенциалом.

Вероятно, на процесс формирования морфогенного каллуса оказывают влияние градиенты гормональных и трофических факторов, присутствующие во всех тканях и органах незрелых зародышей, однако этот важный вопрос требует специальных исследований.

Цито-гистологические исследования показали, что морфогенный каллус пшеницы зародышевого происхождения изначально представлен различными группами клеток (рис. 27-29), что подтверждает мнение Т.Б. Батыгиной [2000] о гетерогенности структуры каллуса любого происхождения.

Цитофизиологическими исследованиями установлено, что в условиях культуры in vitro различные группы клеток каллуса пшеницы реализуют морфогенетические программы различными путями (геммогенез, ризогенез, гемморизогенез, соматический эмбриогенез) (рис. 39-68).

Важно подчеркнуть универсальность начального этапа всех путей морфогенеза in vitro: в каллусе формируется морфогенетический очаг, представленный главным образом меристематическими клетками, способными к морфогенезу (рис. 35). Повышения количества очагов можно добиться оптимальной продолжительностью культивирования каллуса на индукционной среде.

Полученные данные еще раз свидетельствуют о том, что морфогенез в культуре in vitro незрелых зародышей зависит от комплекса разнообразных факторов, сочетание которых определяет как пути морфогенеза, так и способы образования растений-регенерантов [Батыгина, 1999,2000].

Выявленные нами пути морфогенеза in vitro в целом известны по литературным данным в каллусах различного происхождения у различных растений [Батыгина, 1987,1999; Эльконин, Тырнов, 1990; Рахимбаев с соавт., 1992; Бутенко, 1999; Дунаева с соавт., 2000; Oldach et al., 2001; Бишимбаева с соавт., 2001; Лутова, 2003; Румянцева с соавт., 2004; Huang, Wei, 2004; Круглова с соавт., 2005; Pellegnneschi et al., 2004; и др.]* В то же время детальный цито-гистологический анализ всех путей морфогенеза в зародышевом каллусе яровой мягкой пшеницы поведен нами впервые.

Кроме того, нами впервые продемонстрирована возможность реализации различных путей морфогенеза in vitro клеток каллуса на питательной среде при различных концентрациях 2,4-Д и различной продолжительности культивирования, но без процедуры многократных пересадок, что, несомненно, влияет на ускорение и оптимизацию биотехнологии получения растений-регенерантов пшеницы.

Полученные данные позволяют дать рекомендации по управлению морфогенезом каллуса in vitro в нужных биотехнологу направлениях, ведущих к формированию и развитию полноценных фертильных растений-регенерантов (гемморизогенез, соматический эмбриогенез). Важно подчеркнуть, что соматический эмбриогенез биотехнологически оптимален, поскольку в данном случае в растение прорастает зародыш со всеми сформированными органами.

Анализ полученных комплексных эмбриологических и цитофизиологических данных позволил разработать оптимизированный биотехнологический регламент получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro зародышевого происхождения и их развития в условиях ex vitro (рис. 83). соматическим зародыш

III этап

20 25 сут сут

Среда П'без 2,4'-Д на свету этап этап

Среда I с 2.0 мг/л 12,4-Д, в темноте морфогениый каллус

IV этап растения-регенеранты в фенофазе полной спелости зерна зародыш пшеницы на подстадии 3 стадии органогенеза (15 сут после опыления, длина 1,7 мм) растения-регенеранты в фенофазе кущения Почвенная смесь гемморизогенная структура

Рис. 83. Оптимизированный регламент технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в условиях in vitro и ex vitro

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Катасонова, Анна Александровна, Уфа

1. Амирова А.К., Бишимбаева Н.К. Идентификация типов каллусных тканей пшеницы и изучение путей их метаморфоза // Вестник КазНУ, серия биол. 2002а. - № 3 (18). - С. 15-19.

2. Амирова А.К., Бишимбаева Н.К. Получение длительно культивируемых рыхлых эмбриогенных каллусов пшеницы под действием 2,4-Д и КН2Р04 // Биотехнология. Теория и практика. 20026. - № 1. - С. 6065.

3. Анапияев Б.Б. Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы: Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Москва. 2001. - 50 с.

4. Банникова В.П., Хведынич О.А. Основы эмбриологии растений. Киев: Наукова думка, 1982. - С. 1-164.

5. Банникова В.П., Хведынич О.А., Кравец. Е.А. и др. Основы эмбриогенеза злаков. Киев: Наукова думка, 1991. - 176 с.

6. Барабанова Е.А., Банникова В.П. Гистологическая характеристика культивируемых in vitro зародышей озимой пшеницы // Цитогенетика зерновых культур. Таллин: 1990. - С. 22.

7. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятое А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.

8. Батыгина Т.Б. О возможности выделения нового типа эмбриогенеза Angiospermae // ДАН СССР. 1968а. Т. 186, № 6. - С. 14991502.

9. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Л.: Наука, 1987. - 103 с.

10. Батыгина Т.Б. Эмбриогенез в роде Triticum (в связи с вопросами однодольности и отдаленной гибридизации у злаков) // Ботанический журнал. 19686. - Т. 53, № 4. - С. 480-490.

11. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения новый тип вегетативного размножения // Эмбриология цветковых растений. Терминология иконцепции. Т. 3: Системы репродукции / Ред. Т.Б.Батыгина. СПб.: Мир и семья, 2000. - С. 334-349.

12. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / Ред. Т.Б.Батыгина. СПб.: Мир и семья, 1997. - С. 624-648.

13. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. JI.: Колос, 1974. - 206 с.

14. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.: Изд-во Санкт-Петербургского университета, 2002. - 232 с.

15. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro (эмбриоидогенез у покрытосеменных) // Ботанический журнал. -1978. Т. 63, № 1. - С. 87-111.

16. Бипгамбаева Н.К., Денебаева М.Г. Влияние 2,4-Д на структуру клеточных популяций рыхлого эмбриогенного каллуса ячменя // Вестник БГУ. 2001. -№ 2 (1). - С. 107-109.

17. Бишимбаева Н.К., Денебаева М.Г., Амирова А.К., Рахимова Е.В. Особенности гистологического строения рыхлых эмбриогенных каллусов ячменя (Hordeum vulgare) // Известия HAH РК, серия биологическая и медицинская. 2001. - № 1-2. - С. 7-14.

18. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

19. Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - 280 с.

20. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений // XXXV Тимирязевские чтения. М.: Наука, 19756.-51 с.

21. Бутенко Р.Г., Джардемалиев Ж.К., Гаврилова Н.Ф. Каллусообразующая способность эксплантатов из разных органов различных сортов озимой пшеницы // Физиология растений. 1986. - Т. 33, № 2. - С. 350-355.

22. Гапоненко А.К., Мунтян М.А., Маликова Н.И., Созинов А.А. Регенерация растений пшеницы Triticum aestivum L. in vitro II Цитология игенетика. 1985. - T.l9, № 5. - С. 335-342.j

23. Гапоненко А.К., Петрова Т.Ф., Искаков А.Р., и др. Цитогенетика культивируемых in vitro соматических клеток и растений-регенерантов злаков. Сообщение I. Hordeum vulgare L. // Генетика. 1987. - Т. 23, № 1. -С. 2036.

24. Гумерова Е.А., Чуенкова С.А., Гатина Е.А., Румянцева Н.И. Соматический эмбриогенез и геммогенез в культуре гипокотилей Fagopirum esculentum Moench. // Физиология растений. 2003. - Т. 50, № 5. - С. 716— 721.

25. Давоян Э.И., Сметанин А.П. Получение каллуса и регенерация растений риса // Физиология растений. 1979. - Т. 26, № 2. - С. 323-328.

26. Данилова М.Ф., Соколовская Т.Б. Анатомия проростка некоторых видов злаков и вопрос о происхождении однодольных // Ботанический журнал. 1973. - Т. 58, № 3. - С. 337-349.

27. Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М.: Мир, 1965. - 378 с.

28. Джое JL, Калашникова Е.А. Влияние генотипа и условий культивирования зародышей яровой пшеницы на процессы каллусогенеза и морфогенеза // Изв. ТСХА. 1998. - №3. - С. 94-99.

29. Диас С., Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Значение физиологических и генетических факторов в индукции эмбриогенного каллуса у разных линий кукурузы // Доклады Росс. акад. с.-х. наук. 1994. - № 2. - С. 6-8.

30. Игнатова С.А. Биотехнологические основы получения гаплоидов, отдаленных гибридов и соматических регенерантов зерновых и бобовых культур в различных системах in vitro: Автореф. дисс. . докт. биол. наук.: Ялта.-2004.-48 с.

31. Исаева Н.А., Годовикова В.А., Бородько А.В. Эмбриогенез в каллусной ткани и суспензионной культуре Hordeum geniculatum II Известия АН СССР, сер. биол. -1991. № 2. - С. 294-299.

32. Камелина О.П., Проскурина О.Б., Жинкина Н.А. К методике окраски эмбриологических препаратов // Ботанический журнал 1992. - Т. 77, №4.-С. 93-96.

33. Ключарева М.В. // Бюлл. Гл. ботан. сада. 1983. - № 127. - С. 81-86.

34. Ковалева О.Н. Цитологический анализ клонов, полученных от незрелых зародышей ячменя сорта Bruce // Науч.-тех. Бюлл. ВНИИ растениеводства. 1992. - №. 218. - С. 66-71.

35. Козырева О.Г., Дунаева С.Е. Генетика регенерации в культуре in vitro злаков // Генетика. 1994. - Т. 30, № 10. - С. 1432-1440.

36. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Каллусогенез и морфогенез у различных генотипов Triticum aestivum II 3 съезд общества физиологов растений: Тез. докл. -1993. № 2. - С. 133.

37. Копертех Л.Г., Бутенко Р.Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro II Физиология растений 1995 - Т. 42, № 1. - С. 115-118.

38. Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б., Егорова О.В., Титова Г.Е., Сельдимирова О.А. Биотехнология получения андроклинных регенерантов на основе данных световой микроскопии. М.: Лабора, 2007. - 139 с.

39. Круглова Н.Н. Морфогенез в культуре пыльников пшеницы: эмбриологический подход. Уфа: Гилем, 2001. - 203 с.

40. Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б., Горбунова В.Ю., Титова Г.Е., Сельдимирова О.А. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы: атлас. -М.: Наука, 2005.-99 с.

41. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков // Успехи современной биологии. 1995. - Т. 115, №. 6. - С. 692-705.

42. Круглова Н.Н., Сельдимирова О.А. Зиготический зародыш и андроклинный эмбриоид пшеницы: сходство и различие // IX Школа по теоретической морфологии растений «Типы сходства и принципы гомолОгизации в морфологии растений»: Труды. СПб., 2001. - С. 271-273.

43. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дифференцировки и каллусообразования // Физиол. раст. 1999. - Т. 46, № 6. -С. 919-929.

44. Куперман Ф.М. Морфофизиология растений. М.: Изд-во Московск. ун-та, 1977. - 256 с.

45. Кучеренко Л.А. Морфологическая разнокачественность каллюсных тканей риса и ее связь с регенерационной способностью // Физиол. раст. 1993. - Т. 40, № 5. - С. 797-801.

46. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. - 1990. - 352 с.

47. Лобакова Е.С., Плетюшкина О.Ю., Бутенко Р.Г. Морфология распределения актина в клетках морфогенного каллуса пшеницы // Докл. РАН. 1997. - Т. 352, № 2. - С. 284-286.

48. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Методы культуры тканей и органов в селекции растений. Методические рекомендации. Одесса: ВСГИ. -1980.-С. 1-21.

49. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. СПб.: Изд-во Санкт-Петербургского ун-та, 2003. - 227 с.

50. Махновская М.Д., Сечняк А.Л., Игнатова С.А. и др. Разработка условий получения регенерантов из незрелых зародышей пшенично-ржаных гибридов // Физиология и биохимия культурных растений. 1994. - Т. 26, № 6.-С. 584-587.

51. Носов А.М. Культура клеток растений уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений. - 1999. - Т. 46, № 6. - С. 837844.

52. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1988.-170 с.

53. Пиралов Г.Р. Каллусогенез в культуре незрелых регенерантов кукурузы // Цитол. и генет. 1995. - Т. 29, № 6. - С. 22-26.

54. Румянцева Н.И., Валиева А.И., Федосеева Н.В., Самохвалова Н.А., Яблонова Е.В. Биохимические и цитоморфологические особенности культивируемых каллусов растений с разной способностью к морфогенезу // Цитология. 1996. - Т. 38, № 2. - С. 244 - 245.

55. Сайб JI.P., Карабаев М.К. Эмбриогенный каллус кукурузы: условия формирования и характеристика пептидного состава // II съезд ВОФР: Тез. докл. Ч. 2. - М., 1992.-С. 185.

56. Сайб JI.P., Карабаев М.К., Айтхожин М.А. Влияние некоторых факторов на формирование морфогенных каллусов кукурузы и табака // Биол. науки. 1990. - № 4. - С. 100-103.

57. Сатарова Т.Н. Андрогенез и эмбриокультура у кукурузы in vitro: Автореф. дисс. докт. биол. наук. Киев, 2002. - С. 1-41.

58. Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. B.C. Шевелухи. М.: Высшая школа, 2003. - 469 с.

59. Соколовская Т.Б. Природа органов зародыша злаков: Дисс. . канд. биол. наук. JI.,1968. - С. 1-103.

60. Суханов В.М., Папазян Н.Д. Условия получения каллуса и регенерантов в культуре незрелых зародышей пшеницы // Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1983. - №.5. - С. 124-128.

61. Характеристика сортов сельскохозяйственных культур, включенных в Госреестр по Республике Башкортостан. Пособие для агрономов / Под ред. Д.Б. Гареева. Уфа, 1997. - 96 с.

62. Чеботарь А.А. Цитоэмбриологическое и электронномикроскопическое исследование кукурузы (Zea mays L.): Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Кишинев: Изд-во ЦК КП Молдавии. -1970.-С. 1-60.

63. Чеботарь А.А. Эмбриология кукурузы. Кишинев, 1972.384 с.

64. Челак В.Р. Система размножения пшеницы Triticum L. -Кишинев: Штиинца, 1991. 320 с.

65. Чернышева В.Г., Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Влияние генетических характеристик исходных растений на морфогенный потенциал каллусных клеток кукурузы // Доклады АН СССР. 1988. - Т. 300, № 1. - С. 227-229.

66. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез: Автореф. дисс. д-ра биол. наук. СПб., 2001. -45 с.

67. Шаяхметов И.Ф. Соматический эмбриогенез и селекция злаковых культур. Уфа: Изд-во Башкирск. ун-та, 1999. - 165 с.

68. Шаяхметов И.Ф., Шакирова Ф.М., Хайруллин P.M. Исследование содержания лектина в связи с формированием морфогенного каллуса пшеницы // Физиол. и биохимия культурных растений 1994. - Т. 26, № 1. -С. 68-71.

69. Эзау К. Анатомия семенных растений. М.: Мир, 1980. - Т. 1.558 с.

70. Эльконин JI.A., Тырнов B.C. Гистологическое исследование каллусных культур Sorghum cajfrorum (Poaceae) со стабильной регенерационной способностью // Ботанический журнал. 1990. - Т. 75, № 1. -С. 44-48.

71. Эльконин JI.A., Тырнов B.C., Папазян Н.Д., Ишин А.Г. Морфогенез и стабильная регенерация растений в каллусных культурах, полученных от зрелых зародышей видов Sorghum (Poaceae) // Ботанический журнал. 1989. - Т. 74, № 12. - С. 1740-1746.

72. Яковлев М.С. Опыт построения системы злаков на основе морфологии зародыша и структуры эндосперма: Дисс. . докт. биол. наук. -Л, 19466.-С. 1-313.

73. Яковлев М.С. Сравнительная эмбриология цветковых растений. Winteraceae Juglandaceae. - Л.: Наука, 1981. - 264 с.

74. Яковлев М.С. Структура эндосперма и зародыша злаков как систематический признак // Тр. БИН АН СССР Сер. VII. 1950. - №1. - С. 121-218.

75. Abdrabou R.T., Moustafa R.A.K. Effect of 2,4-D concentration and two levels of sucrose on callus induction and plantlet formation in two wheat cultivars! Annuals of agricultural science Cairo. Cairo, Egipt., 1993. - №1 (special issue). - P. 41-46.

76. Ahloowalia B.S. Plant regeneration in wheat callus culture // Crop Sci. 1982.- V. 22. - P. 405-410.

77. Ainsley P.J., Aryan A.P. Efficient plant regeneration system for immature embryos of triticale (x Triticosecale Wittmack) // Plant Growth Regulation. 1998. - V. 24, № 1. - P. 23-30.

78. Armstrong C.L., Green C.E. Establishment and maintenance of friable, embryogenic maize callus and involvement of L-proline // Planta. 1985. -V. 164.-P. 207-214.

79. Arzani A., Mirodjagh S.-S. Response of durum wheat cultivars to immature embryo culture, callus induction and in vitro salt stress // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 1999. - V. 58, № 1. - P. 67-72.

80. Ashley T. Zygote shrinkage and subsequent development in some Hibiscus hybrids // Planta. 1972. V. 108, № 4. - P. 303-317.

81. Bahieldin A., Dyer W.E., Qu R. Concentration effects of dicamba on shoot regeneration in wheat // Plant Breed. 2000. - V. 119. - P. 437 - 439.

82. Bai Y., Qu R. Factors influencing tissue culture responses of mature seeds and immature embryos in turf-type tall fescue // Plant Breeding. 2001. - V. 120, №3.-P. 239-242.

83. Bajaj S., Rajam M.V. Efficient plant regeneration from long-term callus cultures of rice by spermidine // Plant Cell Repts. 1995. - V. 14, № 11.-P. 717-720.

84. Bajaj S., Rajam M.V. Polyamine accumulation and loss of morphogenesis in long-term callus cultures of rice. Restoration of plant regeneration by manipulation of cellular polyamine levels // Plant Physiol. 1996. -V. 112,№3.-P. 1343-1348.

85. Bakos F., Darko E., Ponya Zs., Barnabas B. Regeneration of fertile wheat plants from isolated zygotes using wheat microspore culture as nurse cells // Plant Cell Tissue and organ culture. 2003. - V. 74. - P. 243-247.

86. Batygina T.B. On the possibility of separation of a new type of embryogenesis in Angiospermae // Rev. Cytol. Biol. Veg. 1969. - V. 32, № 3-4. -P. 335-341.

87. Batygina T.B., Zakharova A.A. Polymorphism of sexual and somatic embryos as an evidence of their resemblance // Bull. Pol. Acad. Sci. Biol. Sci. -1997. V. 45, № 2-4. - P. 235 - 255.

88. Bebeli P.J. Cytoplasmic effects on tissue culture response in wheat // J. Genet:Breed. 1995. - V. 49, № 3. - P. 201-208.

89. Bohorova N.E., Luna В., Briton R.M., Huerta L.D., Hoistington D.A. Regeneration potential of tropical, and subtropical, midaltitude, and highland maize inbreds // Maydica. 1995. - V. 40. - P. 275 - 281.

90. Bregitzer P., Dahleen L.S, Campbell R.D. Enhancement of plant regeneration from embryogenic callus of commercial barley cultivars II Plant Cell Repts. 1998. -V. 17. - P. 941-945.

91. Brown W. The epiblast and coleoptile of the grass embryo // Bull. TorreyBot. Club.- 1959.-V. 86,№ i.p. 13-16.

92. Brown W. The grass embryo a rebuttal // Phytomorphology. - 1965. -V. 15, №3.-P. 274-284.

93. Brown W. The morphology of grass embryo // Phytomorphology. -1960.-V. 10, №3.-P. 215-233.

94. Carman J.G. Embryogenic cells in plant tissue cultures: occurrence and behaviour // In Vitro Cell Dev. Biol. 1990. - V. 26. - P. 746-753.

95. Carman J.G. Somatic embryogenesis in wheat // Biotechnology in agriculture and forestry: somatic embryogenesis and synthetic seed II / Eds Y.S.P. Bajaj. -Berlin: Springer-Verlag. 1995. -V. 31. -P. 3-13.

96. Castillo A.M., Egana В., Sanz J.M., Cistue L. Somatic embryogenesis and plant regeneration from barley cultivars grown in Spain // Plant Cell Repts. -1998. -V. 17,№11.-P. 902-906.

97. Chang Y., von Zitzewitz J., Hayes P.M., Chen T.H.H. High frequency plant regeneration from immature e embryos of an elite barley cultivar (Hordeum vulgare L. cv. Morex) // Plant Cell Repts. 2003. - V. 21, № 8. - P. 733-738.

98. Chengalrayan K., Hazra S., Gallo-Meagher M. Histological analysis of somatic embryogenesis and organogenesis induced from mature zygotic embryo-derived leaflets of peanut (Arachis hypogaea L.) // Plant Science. 2001. -V. 161.-P. 415-421.

99. Christiansen M.L., Warnick D.A. Organogenesis in vitro as a developmental process // Horticultural Science. 1988. - V. 23, № 8. - P. 515 -519.

100. Christiansen M.L., Warnick D.A. Phenocritical times in the process of in vitro shoot regeneration // Dev. Biol. -1984. V. 101. - P. 382-390.

101. Datta S.K. Androgenesis in cereals // Current trends in the embryology of Angiosperms / Eds Bhojwani S.S., Soh W.Y. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Acad. Publ. - 2001. - P. 471-488.

102. Eames A.J. Morphology of the Angiosperms. New York Toronto -London: Mc-Grawhill. 1961.-P. 1-518.

103. Elkonin L.A., Lopushanskaya R.F., Pakhomova N.V. Initiation and maintance of friable embryogenic callus of sorghum (<Sorghum bicolour (L.) Moench) by amino acids // Maydica. 1995. - V. 40, № 2. - P. 153-157.

104. Erdelska O. Microcinematographical investigation of the female gametophyte, fertilization and endosperm development // Proc. 7th Int. Symp.

105. Fertilization and Embryogenesis in Ovulated Plants", High Tatra (Radkova dolina), Bratislava. 1983. - P. 49-54.

106. Fernandez S., Michaux-Ferriere N. Coumans M. The embryogenic response of immature embryo cultures of durum wheat (Triticum durum Desf.): histology and improvement by AgN03 // Plant Growth Regulation. 1999. - V. 28, №3.-P. 147-155.

107. Feme A.M.R., Palmer C.E., Keller W.A. In vitro embryogenesis in plants // Plant embryogenesis / Ed. T.A. Thorpe. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. - 1995.-P. 309-344.

108. Fluminhan A., Aguiar-Perecin M.L.R de, Dos Santos J.A. Evidence for heterochromatin involvement in chromosome breakage in maize callus culture // Ann. Bot. (USA). 1996. - V. 78, № 1. - P. 73-81.

109. Fransz P.F., Schel J.H.N. Cytodifferentiation during the development of friable embryogenic callus of maize (Zea mays) I I Canad. J. Bot. 1991. - V. 69, № l.-P. 26-33.

110. Gamborg 0., Evelegh D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of wheat and barleys // Can. J. Biochem. 1968. - V. 46. -P. 417-421.

111. Goldstein C.S., Kronstard W.E. Tissue culture and plant regeneration from immature embryo explants of barley, Hordeum vulgare L. // Theor. Appl. Genet. 1986. - V. 71. - P. 631-636.

112. Gonzales A.I., Pelaez M.I., Ruiz M.L. Cytogenetic variation in somatic tissue cultures and regenerated plants of barley (Hordeum vulgare L.) // Euphytica. -1996.- V. 91, № l.-P. 37-43.

113. Grotkass C., Lieberei R., Preil W. Polyphenoxidase-activity and activation in embryogenic and non-embryogenic suspension cultures of Euphorbia pulcherrima // Plant Cell Repts. 1995. - V. 14, № 7. - P. 428-431.

114. Guignard J.L. Embryogenie des Palmiers. Development de l'embryon chez le Chamaerops humilis L. // Compt. Rend. Hebd. Sea. Acad. Sci. 1961b. -V. 253.-P. 1834-1936.

115. Guignard J.L. Recherches sur l'embryogenie des Graminees; rapports des Graminees avec les autres Monocotyledones // Ann. Sci. Nat. Bot. 1961a. -V. 12,№2,3--P. 491-610.

116. Guignard J.L., Mestre J.C. L'embryon des Graminees // Phitomorphology. 1971. - V. 20, № 2. - P. 190-197.

117. Guignard J.L., Mestre J.C. L'origine du cotyledon et du cone vegetatif chez les Monocotyledones. // Bull. Soc. Bot. France, 1969. V. 116. - P. 207-214.

118. Guttenberg H. von. Griindzuge der Histogenese von hdherer Pflanzen. I. Die Angiospermen. Handb. Pflanzenanat. Berlin: Gebruder Borntrader, 1960. -V.8, № 3- P. 1-315.

119. Hagio T. Adventitious shoot regeneration from immature embryos of sorghum //Plant cell, tissue and organ culture. 2002. - V.68. - P. 65-72.

120. Halperin W., Jensen W.A. Ultrastuctural changes during growth and embryogenesis in carrot cell cultures // J. Ultrastr. Res. 1967. - V. 18, № 1. - P. 428-443.

121. Holm P.B. Knudsen S., Mouritzen P., Negri D., Olsen F.L., Roue C. Regeneration of fertile barley plant from mechanically isolated protoplasts of the fertilized egg cell // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 531-543.

122. Homes J.L.A., Guillaume M. Phenomenes d'organogenese dans les cultures in vitro de tissues de carrotte (Daucus carota L.) // Bull. Soc. Roy. Bot. Belgique. 1967. - V. 100, № 2. - P. 45^9.

123. Huang X.-Q., Wei Z.-M. High-frequency plant regeneration through callus initiation from mature embryos of maize (Zea Mays L.) // Plant Cell Repts. -2004. V. 22, № 11. - P. 793-800.

124. Ilchukov V.V., Naumova T.S., Berezin B.V. Development of embryogenic structures in wheat callus tissue // XI Intern. Sympos. «Embryology and seed reproduction»: Proceed. St. Petersburg: Nauka, 1992. - P. 213-214.

125. Jaligot E., Rival A., Beule Т., Dussert S., Verdeil J.-L. Somaclonal variation in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.): the DNA methylation hypothesis // Plant Cell Reports. 2000. - V. 19. - P. 684-690.

126. Jensen W.A. Cotton embryogenesis. Polysome formation in the zygote // J. Cell Biol. 1968a. - V. 36. - P. 403-406.

127. Jung C.T. Developmental anatomy of the seedling of the rice plant // Bot. Caz. 1937. - V. 99. - P. 786-802.

128. Karp A., Lazzeri P. Regeneration, stability and transformation of barley // Barley: Genetics, Biochemistry, Molecular Biology Mid Biotechnology / Ed. PR. Shewry. Bristol. -1991. -P. 549-571.

129. Karp A., Maddock S.E. Chromosome variation in wheat plants regenerated from culture immature embryos // TAG. 1984. - V. 67, № 2/3. - P. 249-255.

130. Kumlehn J., Lorz H., Kranz E. Differentiation of isolated wheat zygotes into embryos and normal plants // Planta. 1998. - V. 205. - P. 327-333.

131. Levi A., Sink K.C. Somatic embryogenesis in Asparagus officinalis II Hort Science. -1991. V. 26,№ 10.-P. 1322-1327.

132. Li Z.Y., Xia G.M., Chen H.M., Guo G.Q. Plant regeneration from protoplast derived from embryogenic suspension culture of wheat (Triticum aestivum L.) // J. Plant Physiol. 1992b. - V. 139. - P. 714-718.

133. Lu P., Zhou Ch., Yang H-Y. Pollen protoplasts in vitro II Bull. Bot. Res. 1996. - V. 16, № 1. - P. 96-99.

134. Machii К, Mizuno H., Hirabayashi Т., Li H., Hagio Т. Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1998. - V. 53, № 1. - P. 67-74.

135. Madan J.K., Pandey A., Gayen P., Sarkar K.R. Role of embryo orientation in callus induction from mature embryos of maize Zea mays L. // Indian J. Exp. Biol. 1995. - 33, № 9. - P. 694-696.

136. Maeda E. Calluses, freely suspended cells and protoplasts // Sci. Rice Plant. -1993. -№ 1. -P. 465-477.

137. Maeda E., Chen M., Inoue V. Rice: regeneration of plants from callus cultures // Biotechnology in agriculture and forestry. N. Y.; Heidelberg; Berlin: Springer-Verlag. - 1986. - P. 105-122.

138. McCabe P.F., Valentine T.A., Forsberg L.S., Pennel R.I. Soluble signals from cells identified at the cell wall establish a developmental pathway in carrot // the plant Cell. -1997. V. 9. - P. 2225-2241.

139. McCall M.A. Development, anatomy and homologies in wheat // J. Arg. Res. 1934. - V. 48, № 4. - P. 283-321.

140. Milkova V., Ivanov P., Atanassov Z., Todorov I., Panayotov I. Callus culture and gamma-ray treatment used for inducing new breeding material in wheat (Tr. Aestivum L.) // Biotechnol. and biotechnol. equipment. 1995. - № 2. - P. 31-36.

141. Mordhorst A.P., Toonen M.A.J., de Vries S.C. Plant embryogenesis // Crit. Rev. Plant Sci. 1997. - V. 16. - P. 535-576.

142. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. - V.15, № 3. - P. 473497.

143. Nakamura C., Keller W.A. Callus proliferation and plant regeneration from immature embryos of hexaploid triticale // Z. Pflanzenzuchtg. 1982. - V. 88, № 2. - P. 137-160.

144. Narayanaswamy S. The structure and development of the caryopsis in some Indian millets. 4. Panicum miliare Lamk. And /. miliaceum L. // Phytomorphology. 1955a. - V. 12, № 2. - P. 61-73.

145. Narayanaswamy S. The structure and development of the caryopsis in some Indian millets. 5. Echinochloa frumentaceae Link // Phytomorphology. -1955b.-186, №5.-P. 161-181.

146. Norstog K. Early development of the barley embryo: fine structure // Amer. J. Bot. -1972. V. 59, № 2. - P. 123-132.

147. Nuutila A.M., Villiger C., Oksman-Caldentey K.-M. E Embryogenesis and regeneration of green plantlets from oat (Avena sativa L.) leaf-base segments: influence of nitrogen balance, sugar and auxin // Plant Cell Rep. -2002.- V. 20. P. 1156-1161.

148. O'Brien T.P., Thimann K.V. Observation on the fine structure of oat coleoptile. 3. Correlated light and electron microscopy of the vascular tissues // Protoplasma. 1967. - V. 63, № 4. - P. 443-478.

149. Ozgen M., Taret M., Altinok S., Sancak C. Efficient callus induction and plant regeneration from mature embryo culture of winter wheat (Triticum aestivum L.) genotypes // Plant Cell Repts. 1998. - V. 18.-P. 331-335.

150. Padmanabhan D. Tracing the shoot apex in angiosperm embryos. // Advances in Botany. / Ed. Mukeiji K.G. New Delhi: aph Publ. Coiporation. -1996.-P. 39-51.

151. Palmer C.E., Keller W.A. Pollen embryos // Pollen biothechnology for crop production and improvement / Eds K.R.Shivanna, V.K.Sawhney. -Cambridge: Cambridge Univ. press, 1997. P. 392-422.

152. Pechan P.M., Smykal P. Androgenesis: affecting the fate of the male gametophyte // Physiol. Plant. 2001. - V. 111, № 1. - P. 1-8.

153. Pellegrineschi A., Brito R.M., McLean S., Hoisington D. Effect of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and NaCl on the establishment of callus and plant regeneration in durum and bread wheat // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 2004. -V. 77, №3.-P. 245-250.

154. Przetakiewicz A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A. The effect of auxin on' plant regeneration of wheat, barley and triticale // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 2003. - V. 73, № 3 - P. 245-256.

155. Raghavan V. Experimental eembryogenesis in vascular plants. London etc.: Acad. Press, 1976. 603 p.

156. Raghavan V. Molecular embryology of flowering plants. -Cambridge: Cambridge Univer. press, 1997. 565 p.

157. Rakoczy-Trojanowska M., Malepszy S. Genetic factors influencing the regeneration ability of rye (Secale cereale L.). II. Immature embryos // Euphytica. 1995. - V. 83, № 3. p. 233-239.

158. Rao A.M., Sree K.P., Kishor Р.В.К. Enhanced plant regeneration in grain and sweet sorghum by asparagine, proline and cefotaxime // Plant Cell Repts. 1995.-V. 15.-P. 72-75.

159. Redway F.A., Vasil V., Lu D., Vasil I.K. Characterisation and regeneration of wheat (Triticum aestivum L.) embryogenic cell suspension cultures // Plant Cell Repts. 1990. - V. 8, № 12. - P. 714-717.

160. Reinert J. Untersuchungen uber die Morphogenese an Gewebekulturen // Berl. Deutsch. Bot. Ges. -1958. V. 71, № 1. - P. 218-226.

161. Reynolds Th. Plant embryogenesis // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 33, № l.-P. 1-10.

162. Roth I. Histigenese und Entwicklungsgeschichte des Triticum-Embryos // Flora. 1957. - V. 144, № 2. - P. 163-212.

163. Roth I. Histogenesis and morphological interpretation of the grass embryo // Recent advances in botany, I. Montreal. 1961. P. 96-99.

164. Ryschka S., Ryschka U., Schulze J. Anatomical studies on the development of somatic embryoids in wheat and barley explants // Biochem. und Physiol. Pflanz. 1991. - Bd. 187. - № 1. - P. 31-41.

165. Sears R.J., Deckard E.L. Tissue cultural variability in wheat: callus induction and plant regeneration // Crop Science. 1982. - V. 22, № 3. - P. 546550.

166. Sharma H.C., Gill B.S. Effect of embryo age and culture media on plant growth and vernalization response in winter wheat // Euphytica. 1982. - V. 31, № 3. - P. 629-634.

167. Sharma V.K., Rao A., Varshney A. et al., Comparison of developmental stages of inflorescence for high frequency plant regeneration in Triticum aestivum L. and T. durum Desf. // Plant Cell Rep. 1995. - V. 15. - P. 227-231.

168. Sirkka A., Immonen T. Comparison of callus culture with embryo culture at different times of embryo rescue for primary triticale production // Euphytica. 1993. - V. 70. - P. 185-190.

169. Somleva Factors affecting somatic embryogenesis in cereals // Bulg. J. Plant Physiol. 1994. - V. 20. - P. 110-123.

170. Songstad D.D., Petersen W.L., Armstrong C.L. Establishment of friable embryogenic (type II) callus from immature tassels of Zea mays (Poaceae) // Am. J. Bot. 1992. - V. 79. - P. 761-764.

171. Soueges R. Embryogenie des Graminees, Developpent de l'embryon chez le Poa annua L. // Compt. Rend. Held. Sea. Acad. Sci. 1924b. - V. 178. -P. 1307-1310.

172. Steward F.G. Growth and organized development of cultured cells. III. Interpretation of the growth from free cells to carrot plants // Amer. J. Bot. -1958. V. 45, № io. - P. 467-473.

173. Stoddart Ch.R. Thomas H. Robertson A. Protein synthesis patterns in barley embryos during germination // Planta. 1973. - V. 112, № 3. - P. 309-321.

174. Subhadra J., Chowdhury В., Singh R. Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of wheat Triticum aestivum L. // Indian J. Exp. Biol. 1995. - V. 33, № 2. - P. 147-149.

175. Suprasanna P., Ganapathi T.R., Rao P.S. Embryogenic ability in long term callus cultures of rice (Oryza sativa L.) // Cereal Res. Commun. 1997. -V. 25, № l.-P. 27-33.

176. Swedlung В., Locy R.D. Embryogenic and nonembryogenic corn callus from immature embryo // J. Plant Physiol. -1993. V. 103, № 4. - P. 13391343.

177. Tchorbadjieva M, Somleva M., Odjakova M. Characterization of embiyogenic and nonembryogenic callus of Dactylis glomerata L. // Докл. Болг. АН. 1992. - Т. 45, № 7. - P. 103-111.

178. Torrey J.G. Morphogenesis in relation to chromosomal constitution in long-term plant tissue cultures // Physiol. Plant. 1967. - V. 20, № 2. - P. 134140.

179. Vasil V., Redway F., Vasil I.K. Regeneration of plants from embryogenic suspension culture protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.) // Bio/Technology. 1990. - V. 8. - P. 429-434.

180. Vikrant , Rashid A. Comparative study of somatic embryogenesis from immature and mature embryos and organogenesis from leaf-base of Triticale // Plant Cell Tissue and Organ culture. 2001. - V. 64. - P. 33-38.

181. Wan Y., Lemaux P.G. Generation of large number of independently transformed fertile barley plants // Plant Physiol. 1994. - V. 104. - P. 37-48.

182. Wang W.-Ch., Nguyen H.T. A simple approach to isolate shoot competent cells from sorghum {Sorghum bicolor (L.) Moench.) callus culture // Cereal Res. Commun. -1995. V. 23. - № 1-2. - P. 87-93.

183. Wardlaw C.W. Embryogenesis in Plants. London: Methuen, 1955. -P. 1-391.

184. Welter M.E., Clayton D.S., Miller M.A., Petolino J.F. Morphotypes of friable embryogenic maize callus // Plant Cell Repts. 1995. - V. 14, № 11. -P. 725-729.

185. Whelan E.D.P. Meiosis abnormalities in primary regenerants from callus culture of immature embryos of "Norstar" winter wheat // Genome. 1990. -V. 33, №2.-P. 260-266.

186. Yancheva S.D., Golubowicz S., Fisher E., Lev-Yadun S., M.A. Flaishman Auxin type and timing of application determine the activation of the developmental program during in vitro organogenesis in apple // Plant Science. -2003.-V. 165.-P. 299-309.

187. Yoshida T. Relationship between callus size and plant regeneration in rice (Oryza sativa L.) anther culture // Jap. Agr. Res. Quart. 1995. - V. 29, № 3. -P. 143-147.

188. Zale J.M., Borchardt-Wier H„ Kidwell K.K., Steber C.M. Callus induction and plant regeneration from mature embryos of a diverse set of wheat genotypes // Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 2004. - V. 76, №3.-P. 277-281.

189. Zhao J., Zhou C., Yang H.Y. Isolation and in vitro culture of zygotes and central cells of Oryza sativa L. // Plant Cell Repts. 2000. - V. 19. - P. 321326.

190. Zimmerman J.L. Somatic embryogenesis: a model for early development in higher plants // Plant Cell. -1993. V. 5, № 10. - P. 1411-1423.

Информация о работе

Катасонова, Анна Александровна
кандидата биологических наук
Уфа, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Оптимизация технологии получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы в каллусной культуре in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы