Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССАМ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССАМ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ"

-ънъъ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА.

На правах рукописи НГУЕН ТХИ ЛИ АНЬ

1

/

ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К АБИОТИЧЕСКИМ СТРЕССАМ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1995

' / /

/

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной бно технологии ТСХА

Научный руководитель — кандидат биологических наук И. Д. Никифорова.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук 3. Б Шамина, кандидат биологических наук Г. В. Рассадина.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет (биологический факу-""-™^

специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А Тимирязева

Адрес: 127550, г. Москва И 550, ул Тимирязевская, 49, отдел защиты диссертаций

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА ..

Автореферат разослан « » февраля 1995 г

Ученый секретарь специализированного сове-'

Защита состоится 6 марта

на заседании

кандидат биологических

А. С. Лосева

Актуадыгость проблемы. В современных экологических усло-. виях количество тяжелых металлов в почвах и водах техногенных ландшафтов на несколько порядков превышает фоновые природные концентрации. Кроме того, глобальное потепление климата планеты, вызванное влиянием жизнедеятельности человека,. ставит перед селекционерами задачи создания новых . форм культурных растений, устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды (засухе, засолению почв, низким и высоким температурам, ионам тяжелых ' .металлов ). в соответствии с оценками экспертов, по распространенности и опасности для экологических систем тяжелые металлы занимают второе место, уступая только пестицидам и значительно опережая такие широко-известные загрязнители, как двуокись углерода и серы.

Цюблема фитотоксического действия свинца, кадмия и цинка на корневую систему растений в последние десятилетия интенсивно исследуется учеными разных стран мира, поскольку известно, что не менее половины всего количества тяжелых металлов техногенного происхождения в конечном итоге поступает в почву.

Известно, что расширению арсеналов методов для повышения генетического разнообразия растений служит привлечение методов биотехнологии.

Исходя из вышеизложенного, особенную актуальность приобретают работы по изучению влияния ионов кадмия и повышенных температур на рост.культивируемых клеток различных видов пшеницы и созданию на базе *сомаклональной вариабельности форм устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды. Кроме того, чрезвычайно важным является изучение возможности селекции на клеточном уровне форм, обладающих комплексной устойчивостью к стрессам, основываясь на неспецифической реакции на стресс растительными клетками.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было Изучение влияния ' ионов кадмия и температурного стресса на культивируемые клетки двух видов пшеницы(твердой и мягкой). А также, создание новых форм пшеницы, устойчивых к этим стрессам,- методами клеточной селекции. • . , : Для достижения поставленных целей было необходимо: -

' 4 ' - IV- -; РА.Г.Ь ЧАЯ-

НАУЧ , Ь-.-Ы. ОТЕКА ■

,• -'о > с„ *адемии

к • ••..

Ина. Гч^/

- провести сравнительное изучение влияния теплового стресса на формирование каллусной ткани и рост уже сформированного каллуса у твердых и мягких сортов пшеницы;

- отселектировать клеточные линии устойчивые к повышенным температурам и получить из них растения регенеранты;

- провести исследование влияния различных концентрация ионов кадмия на формирование каллусных тканей и рост каллус-ных клеток твердых и мягких сортов пшеницы;

- отселектировать устойчивые к повышенным концентрациям ионов кадмия клеточные линии и получить из них растения реге-неранты;

- провести лабораторную оценку растений-регенерантов на устойчивость к селектирунцэму фактору и проанализировать возможность возникновения перекрестной устойчивости к абиотическим стрессам.

Научная новизна. Впервые проведено изучение влияния ионов кадмия и высоких температур на рост и морфогенез в культуре клеток двух видов пшеницы (Tritioum aestivuro и Tnticum durum). Выявлены генотипические различия в ответе каллус ных клеток на тепловой стресс и стресс, вызываемый ионами кадмия. Установлено, что каллусные клетки сорта Безенчукская 139 обладают большей выносливость!) к повышенной температуре, но наиболее чувствительны к ионам кадмия. Тогда как, клетки сорта Целинная-21 - более устойчивы к ионам кадмия и чувствителны к тепловому стрессу. Впервые проведена селекция двух видов пшеницы на клеточном уровне на устойчивость к ионам кадмия и жароустойчивость и из стабильно устойодвых клеточных линий получены растения регенеранты. штсташ индукции каллуса в стрессовых условиях показано, что "чаб^ь растений регенеран-тов, полученных из устойчивых клеточных линий, сохраняют призак устойчивости и передайся; его следующему поколению. Среди растений-регенерантов выявлены формы, у которых устойчивость в ионам кадмия сочетается с устойчивостью к тепловому стрессу и наоборот.

Практическая значимость» Созданные в результате работы новые формы твердой и мягкой пшеницы могут служить основой для создания новых сортов, обладающих устойчивостью к ионам

-■*,'.' - 3 -

кадмия и жаростойкость!), что позволит сократить потери урожая от воздействия неблагоприятных факторов оцрдгжапцэй среды.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на Межвузовской конференции по физиологии растений и биотехнологии в 1994 году, на конференции молодых ученых Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева 1993 года, на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. По материалам диссертации опубликована одна работа и подготовлено к печати две статьи.

Объём и структура диссертации. Диссертационная - работа состоит из введения; обзора литературы, методической час^и, результатов и обсуждения. Материалы диссертации изложены на_ 12.0страницах!текста, содержат.'/4таблиц,Л3.рисунков Н...Э фотографий.. Библиография содержит ЯРО , источников отечественной и зарубежной литература ,

. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ' • ;

В качестве объектов исследования были использованы сорт яровой гексаплоидной пжницы (Tntioun aestlvum) селекции Севе ро-Казахстанского селекционного центра СКаа. НИИЗХ)г Целинная -21 , и сорта тетраплоиднойпиеницы - Ввзенчукская-139 и Дам-синская-90. ' *;'::Ч ' *' .'**','. !>,:;' Л' - ' "'

Каллусную ткань получали ив незрелых ~ зародьпей (14-16 дней после цветения)на модифицированной среде М/расиге-Скуга '(МИ с д<збавлением 2 мг/л;2,4Д. Следует отметить, что для индукции каллуса использовали зародыш из зерновок расположенных только я средней части колоса Культивирование проводили при температуре 27° Си постоянном ос ведении. Пересадки на свежую питательную среду осуществляли каждые 4 недели и суб-культивировали только морфогенный каллус. Интенсивность роста каллуса обозначали как относительный рост и определяли, как отношение прироста каллуса к весу экспланта. Вес экспланта обычно составлял 20-30мг. Прирост биомассы в стрессовых условиях выражали как X к контролю, т.е.. к росту каллуса данной линии на неселеетивной среде.

. Мэрфогенный потенциал ткани оценивали визуально по вес-

тибалыюй системе, по которой морфогенным считался каллус, состоящий более Чем на ЗОХ из плотных структурированных тканей.

Для изучения влияния ионов кадмия на рост каллусных тканей или проростков пшеницы использовали сернокислый кадмия CdSO+в концентрациях соответствующих содержанию ионов кадмия в литре среды - 10,20,20,40 и 50 иг кадмия.

Клеточную селекции на устойчивость к ионам кадмия проводили по различным схемам. Для отбора клеточных линий, устойчивых к повышенным температурам, каллусные ткани помещали в жидкую питательную среду и прогревали в ультратермостате при температуре 4Б°С различное время при постоянном перемешивании. После прогревания ткани помещали на агаризованную среду VC и культивировали в обычных условиях. В дальнейшая прогревание повторяли несколько раз.

Оценку растений-регенерантов на устойчивость к стрессам проводили методами индукции каллуса в стрессовых условиях. Кроме того, устойчивость на уровне проростков определяли по энергии прорастания семян в присутствии 50 мг/л Cd. жароустойчивость определяли по степени депрессии ростовых процессов поело прогревания семян при 65"С 20 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния ионов кадмия на рост каллусной ткани трех сортов пшеницы

Влияние различных концентраций ионов кадмия на рост каллусних тканей трех сортов пшеницы изучали на тканях, которые находились в условиях in vitro солее четырех месяцев. В этом случае мы имели стабильно растущие каллусные ткани, обладающие высокой морфогенной способностью.

Культивирование зкеплантов различных сортов пшеницы на средах, содержащих достаточно высокие ( для пшеницы) концентрации кадмия в среде (10,20,30 и 40 мг/л) в течение одного месяца дало неожиданный результат (Таблица 1).

- б -

" Таблица 1.

Влияние кадмия на рост и морфогенез кадлусных тканей трех сортов аровой пшеницы _

В А Р И А И т

Ц-21

Д-90

Б-139

Прирост каллу -сов (мг)

X к конт.

I При-| рост МП (каллу |-сов ' 1(мг)

X к конт.

№

Прирост каллу -сов (мг)

X к

конт.

Ш

юса

госм

зоси

40С<3

373,4 +10.2

328.2 1+ 6.9]

324.3 + 6,8

304,6 ±■'6,9

195,2 ± 7.3

100

87,9

86,8

81,5

52,7

100 |386.6 1+10,2 * I

96.01300.2 1±7,3

" I '

92,3|298,4 1+8,8 I

85,0|265.9 1+6,4

" " ' I

75,0|218,8 |± 7,9

100

77,6

77,2

68,8

56,6

86,6

75,6

68,9

62,8

59,4

321.2 + 8,6

351.3 + 8,2

356,8 ±10,1

289,2 + 7.9

258,8 + 7,4

100

109,4

111,1

90,0

80,6

85,8 71.7 64,7 58,3 44.2

Известно, что кадмий является одним из наиболее токсичных тяжелых металлов для растений. Однако, в нашем эксперименте повышение концентрации кадмия в среде от 10 до 20 иг/л ве приводит к угнетению роста тканей для всех сортов пшеницы. Больше того, данные концентрации стимулировали прирост каллус них клеток сорта Везенчукская 139. Только присутствие 40 мг/л СИ в среде приводит к снижению прироста ткани до 52Х от контроля для сорта Целинная-21 к до 56Х для сорта Дамсинская-

- б -

90. Рост клеток сорта Безенчукская-139 в этих условиях инги-бкровался только на 201.

Анализ морфогенного потенциала тканей, росших в присутствии ионов кадмия показал, что увеличение концентрации кадмия в среде приводит к существенному снижению морфогенной способности тканей сорта Беаенчукская-139 (442) и в меньшей степени влияет на морфогенный потенциал тканей сорта Целинная-21 (75Х).

Таким образом, можно предположить, что рост каллусных тканей сорта Бевенчукская-139 в стрессовых условиях происходит в основном за счет прироста неморфогенных тканей и возможно , ва счет преобладания процессов растяжения над делением клеток. Такое предположение мы можем сделать на основании того, что неморфогенная ткань пшеницы всегда состоит из крупных вакуолизированных клеток. Ызжно предположить также, что мор-Фогенные клетки сорта Целинная-21 проявляют большую устойчивость к ионам кадмия, чем клетки двух сортов твердой пшеницы. На ваш взгляд, оценивать ответ культивируемых клеток пшеницы ва токсическое действие ионов кадмия правильнее не по весовым характеристикам, а по реакции морфогенных тканей, так как именно в этих тканях происходит большинство делений клеток. Больше того, нас интересуют клетки, способные делиться в стрессовых условиях, а не переживать их.

Из литературных данных известно, что ионы тяаешх металлов могут икгиОироватъ деление клеток растений, кроме того, включаясь в клеточную стенку они могут снижать её эластичность, что приводит к угнетению роста растяжением. Известны и различные пути детоксикации йонзв тяжелых металлов растительными клетками. Так как мы не изучали биохимичесих и цитологических основ ответа на стресс, вызванный токсическими концентрациями ионов кадмия, мы вынуждены оценивать влияние кадмия на клетки пшеницы только по интегративным процессам роста и морфогенеза. Можно предположить, что в наших экспериментах ионы кадмия в различной степени угнетаиг процесс деления клеток, но не ингибируют их растяжения.

Повторное культивирование тканей в стрессовых условиях (см. диссертацию) подтвердило наше предположение о сортовых

различия* в ответе на стресс, вызванный присутствием в среде ионов кадмия. 4

Культивирование тканей в течение двух месяцев на кадмий-содержаших средах показало, что ткани сорта Целинная-21 в присутствии 30 мг/л кадмия в среде на 76Z состоят из морфо-геяных тканей, тогда как морфо'генный потенциал тканей двух других сортов в этих условиях равен нулю. Интенсивность роста этих тканей равняется 60Х от контроля. , .

Таким образом, на основании полученных результатов нами выявлены сортовые различия в ответе на.стресс, вызываемый ионами кадмия в среде. Исходя из этого, можно ранжировать испытанные сорта пшеницы по устойчивости к ионам кадмия в порядке возрастания: Беэенчукекая -139,Дамсинская -90,. Целинная-21.

Влияние повышенных температур на рост каллуса трех сортов пшеницы.

Так как в наяу задачу входило сопоставление действия двух стрессов на рост каллусных тканей различных сортов пшеницы (теплового и стресса вызываемого ионами кадмия) для изучения влияния тепловой обработки на каллусные клетки ш помещали каллусные ткани (4пассаж) вжидкую питательную среду и при постоянном перемешивании прогревали в ультратермостате при температуре 4б°0 от 1Бдо60минут. После прогревания эк-сплаиты помещали:. на свежую питательную среду (агаризованную) и культивировали как обычно в течении месяца. В конце пассажа зкспланты взвешивали к определяли интенсивность.прироста ткани. Результаты данного эксперимента приведены на рисунке 1.

Из представленных данных видно, что даже пятнадцатиминутное прогревание : клеток при 45°С приводит к значительному снижению ростовых процессов у тканей сортов Дамсинская-90 и Целинная-21 (на 30Z). В то время как клетки сорта Бевенчукская- 139 снижают. прирост только на 13Х. Увеличение времени тепловой обработки каллусных клеток приводит к дальнейшему снижению ростовых процессов.

Интересно, что наблюдаются сортовые различия по динамике угнетения роста тканей в зависимости от времени прогревания.

- 8 -

Рис. 1 Влияние высокой температуры на рост трех сортов яровой пшеницы

Ц-21 -+-

д-80 —а— 15,...60 время экспозиции

В-139

Так для клеток сорта Дамскнская 90 характерно равномерное снижение интенсивности «роста в зависимости от времени тепловой обработки после «редкого спада, вызванного пятнадцатиминутным прогреванием. Илей® сорта Целинная-21 так® резко реагирует на первнё -15 минут прогревания, но дальнейшее увеличение времени обработки до 45 минут приводит к снижению ростовых процессов только на 8Х. Дополнительные 15 минут прогревания приводят к дальнейшему угнетению роста на 122. Прогревание'каллусных тканей сорта Беэенчукская-139 не приводит к значительному снижению интенсивности ростовых процессов. так 'Прогревание тканей до 45 минут снижает прирост только на 2ЭХ. Увеличение периода прогревания тканей на 15 минут приводив к угнетению роста на 20Х.

Оценивая полученные данные, мы можем предположить, что при прогревании тканей часть клеток, чувствительных к температурному стрессу, погибает и увеличение времени обработки приводит к увеличению числа погибших клеток. Динамика этого процесса зависит от термотолерантности сорта. Так клетки сорита Безенчукская-139 проявили наибольшую устойчивость к тепло-

вому стрессу.

Мэрфогенный потенциал (МП) тканей, образовавшихся после прогревания, равномерно снижается с увеличением времени обработки, причем снижение морфогенных потенциалов тканей твердых сортов пданицы не: различается между, собой. В то время как прогревание тканей сорта Целинная-21 в течение 46 минут приводит к снижению морфогенного потенциала до 40Х, причем Ш. тканей Беэенчукская-139 и Дамсинская-90 составляет 58 и 62Х соответственно.

На основании результатов по ингиСированию ростовых процессов и по изменению морфогенного потенциала тканей после прогревания можно предположить, что морфогенные клетки сорта Целинная-21 более чувствительны к тёпловому стрессу, чем морфогенные клетки сортов Беэенчукская-139 и Дамсинская-90. в

Таким образом нами установлено,- что клетки испытанных нами сортов обладают различной чувствительность» к двум абиотическим стрессам. Так сорт Целинная-21 проявляет большую устойчивость к ионам кадмия, но более чувствителен к тепловому стрессу. Клетки твердых сортов пшеницы более устойчивы к тепловому стрессу. чей клетки сорта Целинная-21, что подтвержда- . ет данныеУапг and Nguen (1989)о корреляции генотипических различий в термотолерантности на клеточном уровне и на уровне целого растения. Ведь известно.что гетраплоидные сорта пшеницы осладаютбольией жароустойчивостью по сравнению с гек-саплоидными. •■'. ["-.IV.is.:-: -V"

Шэтому постановка задачи создания устойчивых к тепловому стрессу •pa^9Hrt.->i9>owi«';Jjbea»iqiiBi!'. устойчивых,' клеток представляется совершенно правомерной. Больше того, существуют исследования, в которых обсуждается возможность приобретения устойчивости к повышенным температурам при клеточной селекции на устойчивость к ионам, кадмия- (Bin Huang and P. a Qoldsbrough 1988).

■ Влияние ионов кадмия на формирование < каллусной ткани из незрелых зародышей различных сортов пшеницы.

Нами было изучено влияние субдетальных концентраций но-

нов одииа на процесс дедифференциации клеток неврелого зародыша различных сортов пшеницы. Как уже отмечалось, зкспланта-ш служили зародыши пшеницы на 14-16 день после опыления. Следует отметить, что в это время размеры зародышей Составляют примерно 1,5 - 2 мм. и весят они около 6 мт. Результаты изучения влияния ионов кадмия на процесс дедифференциации приведены в таблице 2.

Следует отметить, что в отсутствии кадмия в среде индукция' каллуса у всех сортов пшеницы происходит со 100 процентной частотой и вес экспланта в конце пассажа увеличивается в среднем в 13-16 раз в зависимости от сорта. В присутствии "ионов кадмия,также как и в эксперименте с дедифференцированными клетками, не происходит значительного угнетения роста каллусной ткани. Увеличение биомассы в конце пассажа для сортов Целинная-21 и Дамсинская-90 составляет примерно 80Z от контро<-ля. И только для сорта Вэвенчукская-139 прирост ткани составляет 681 от контроля, что свидетельствует о его чувствительности к данному стрессу.

Таблица 2.

Индукция каллуса в стрессовых условиях

; I

| | Контроль | Cd(10мг/л)

Хморф. калл.

32,78 12,93 |

20,37 | ±2,35 |

16,51 | +1,40 |

I _____I

Наиболее убедительными данными о генотипических особен-

Сорт

Ц-21

Д-90

Б-139

прирост) Хморф. | прирост (мт) | калл. ( (мг)

-1-1-

69,06 | 63,22 I 66,16 +2,44 | +3,87 | +1,87

I »' 73,88 | 78,60 I 68,93 ±3,00 | ±2,69 | ±2,41

81,33 | 73,33 | 52,36 +3,76 | +3,45 | +2,76

X К

кон.

81,27 79,76 68,40

- и -

ностяхответа на ионы кадмия, на нал взгляд, такажэ как и в случае с культивируемыми клетками пшеницы; являются данные о морфогенетических способностях полученных тканей. Ш видим, что морфогенный потенциал тканей твердых сортов пшеницы в отсутствии стресса (78 и 73Х) превосходит морфогенный потенциал ткани сорта Целинная-21 (53Х). Индукция каллуса в стрессовых условиях (10 мг /л СИ ) существенным образом снижает морфогенный потенциал образующихся тканей, особенно у твердых сортов пшеницы. Так, если морфогенный потенциал тканей сорта Це-* линная -21 в стрессовых условиях снижается на 20Х, то морфогенный потенциал сортов Дамсинская-90 и Безенчукская-139 снижается на Б7-58Х. ■ 4 .

Результаты этого эксперимента подтвердили наше предполо-. жвние о различной чувствительности!к ионам кадмия клеток различных сортов пшеницы и, что устойчивость сортов возрастает в ряду Везенчукская-139, Дамсинская-90,Целинная-21.

Изучение влияния прогревания незрелых зародышей

на формирование каллусных тканей. , .

/ Для изучения влияния теполового стресса на формирование каллусных тканей незрелыми зародышами трех сортов пшеницы, зародыши на 14-16 день после цветения изолировали в стерильных условиях и инкубировали в жидкой питательной среде НС в ультратерютате при . температуре 45 С в течение 30 или 60 минут. После чего зародыши помещали на агаризованную среду МО для индукции каллусной ткани и культивировали в течение месяца в обычных условиях. Взвешивание тканей в конце пассажа показало (Таблица 3), что тепловая обработка незрелых зародышей приводит к снижению эффективности образования каллусных тканей. Тридцатиминутное прогревание зародышей приводит к игиби-рованию процесса.дедифференциации в. большей степени учсорта Безенчукская 139 (67Х), чем у двух других сортов. Прогревание в течение часа приводит к дальнейшему угнетению каллусогене-за, причем индукция каллуса у сортов твердых пшениц угнетается в несколько большей степени, чем у сорта Целинная-21.

Таблица а

Влияние высокой температуры на индукцию каллуса

Контроль!

45®С-ЗОм |

т

45°С-60м

При- |

рост ( Щ

калл. |

(иг) I

I При-l | | рост| X к | МП |каял. |контр | I (кг) I

I ПРИ-1 I

| рост! х к | 1Ш |калл. |контр) i (ИГ) I

11111(11 69,67|29,68|66,33|79,53|10,93|48,11|69,15| О I i2,l6|±2,Э7|+1,471 |±0,34|+2,63| | | I I I I I I I I 61,88|Б5,20|60,16|81,0б|35,34|38,40|62,02|28,29| +1.771+3,34|+3,22| |±2,39|±3,23| |±0,б8| I I I I I I I I 101,80198,41168,48167,27|73,8Ц 62,90|61,78168.181 +3,691+1,291+3,68| |+2,03|+3,43| 1+3.9Ц

I I I I I I I I

Яа представленных в таблице данных видно, однако, что тепловая предобработка зародышей перед индукцией каллуса существенным образом влияет на морфогенные способности образовавшейся каллусной ткани. Так прогревание зародышей в течение 30 минут приводит к снижению морфогенного потенциала у всех сортов примерно на 201. Тогда как предобработка в течение часа приводит к снижению морфогенного потенциала у сортов твердых пшениц на 72, а у сорта Целинная -21 приводит к образованию только неморфогенного каллуса. Пэвидимому при прогревании зародышей погибают те клетки, которые дают начало морфогенному каллусу, и вероятно, эти клетки у сорта Целинная-21 более чувствительны к тепловому стрессу.

Результаты данного эксперимента подтверждают наше предположение о том, что клетки сорта Безенчукская-139 превосходят по устойчивости к тепловому стрессу клетки сортов Дам-

синская-90 и Целинная-21.

Клеточная селекция на устойчивость к ионам кадмия.

Основываясь на полученных данных ш провели клеточную селекцию на устойчивость к ионам кадмия на трех сортах пшеницы. Клеточную селекцию проводили по различным схемам. Основным принципом селекции являлось культивирование в стрессовых условиях в течение трех пассажей (первый этап), ватем второй этап селекции - возврат в неселективные условия (три пассажа) и следующие три пассажа культивирование в селективных услови-

Таблица 4.

Результат селекции клеточных линий, устойчивых к кадмию

1 I Сорт |Селективный | фактор Число линий Число рег. раст. ....... 1 | X ферт иль. 1 |растений(й0)

| Б-139 1 1 юмг/л са 1 3 1 0 |

1 Д-90 1 | 10мг/л Сй ( 3 33 1 36,36 |

1 Ц-21 1 I Юмг/л СИ ■ 5 75 | 48,00 |

1 | 20мг/л СИ 1 3 21 1 28,67 |

и.................... 1 | ЗОмг/Л СИ 1 1 3 1 0 | >

ях (третий этап). Первый вариант - селекция в мягких селективных условиях, когда культивирование тканей проводили при концентрации 10 мг/л СИ в среде на первом и третьем этапах селекции. Второй вариант селекции состоял в отборе клеточных линий на концентрации 20 мг/л кадмия на первом и третьем этапах селекции. Третий вариант селекции начинался с 10 мг/л кадмия в среде, по в дальнейшем концентрация увеличивалась па 10 мг/л в каждим последующем пасслла (т.е. 20 и 30 мг/л).

После культивирования в неселективных условиях ткани культивировали в присутствии 30 мг/л (И.

В результате клеточной селекции нами были отобраны устойчивые клеточные линии и получены ив них растения-регене-ранта Результаты селекции приведены в таблице 4.

Из представленных в таблице данных видно, что для сортов твердой пшеницы только мягкие условия селекции позволили выделить клеточные линии способные расти в присутствии ионов кадмия. Валыю того/растения-ре гене ранты, полученные из устойчивой клеточной ' линии сорта Беаенчукская-139 оказались стерилиными. Кроме того, проведение селекции в более жестких условиях на клетках сорта Целинная-21 приводит к уменьшению числа отобранных линий (но, вероятно, к повышению вероятности отбора истинно устойчивых линий) и к возрастанию стерильности полученных растений.

Клеточная селекция на устойчивость к повышеннш температурам.

Для отбора клеточных линий, устойчивых к тепловому стрессу мы проводили отбор по различным схемам. Первым вариантом была моношаговая селекция, когда зкспланты в четверток пассаже подвергали однократному прогреванию ( 46"С различные периоды времени), после чего культивировали эксплант в обычных условиях в течение месяца и затем переносили на среду для регенерации растений. В этом случае трудно было рассчитывать на отбор устойчивых форы, но этот эксперимент позволил нам оценить влияние тепловой обработки на реализацию морфогенети-ческих способностей тканей. Так нами обнаружено, что для сортов Целинная-21 и Безенчукская-139 прогревание морфогенного каллуса 45.С в течение 30-45 минут прозволяет повысить выход, растений-регенерантов. ; , ' ,

Многошаговая селекция/ включала трехкратное прогревание, чередуюпэеся с культивированием в обычных условиях. В первом варианте многошаговой селекции ткани прогревали при 45 С трижды по 15 минут. Второй вариант состоял из трехкратного прогревания по 45.минут и третий вариант селекции состоял в

постепенном увеличении времени прогревания т. е. первое прогревание - 16 минут, второе-45 минут и третье -60 минут.

Оценка интенсивности роста каллусных тканей после каждого прогревания (см. диссертацию) показала, что уже после третьего прогревания, независимо от длительности, наблюдается тенденция к селекции клеток с повышенной адаптивной способностью. Это выражается в увеличении прироста ткани в сравнении с интенсивностью роста после предыдущей обработки. В этом случае мы не иожвм утверждать, что отобрали термотолерантныэ линии, но можем говорить об их повышенных адаптивных способностях. Результаты данного эксперимента проведенного на клетках сорта Целинная -21 приведены в таблице 5. Из представленных данных видно, что ужесточение условий селекции приводит к снижению числа полученных растений-регенврантов.

Таблица 5.

Многошаговая селекция клеток сорта Целинная-21

| Нэшр | линий 1 1 I Схема селекции | Число |рег раст. - ------------------1 | £ ферт иль. | |растений(Я0}

1 Тб 1 1 | 16МШГ-1 0 -15мин- 0 -15мин -0 1 | 22 ■ 1 1 1 72,7 | ■ 1

| Т4 1 | 45мин-1 0 -45мия- 0 -46мин -0 1 1 го 1 1 1 50.0 | 1 |

I те > 1 | 15мин-1 0 -45мин- 0 -бОмин -0 1 1 14 1 1 1 1 60,0 1 1 1 ______1

Оценка растений регенерантов методом индукции каллуса в стрессовых условиях.

Как уже отмечалось, анализ растений-регенерантов мы проводили различными косвенными методами. К сожалению ввиду ограниченности во времени нам удалось проанализировать только часть полученных растений-регенерантов. Кроме того, следует

отметить, что мы не могли иметь материал в достаточном количестве для корректной статистической обработки результатов по оценке регенерантов. Мы были вынуждены использовать по 30-50 семян в экспериментах по энергии прорастания и по 20-30 зародышей для индукции каллуса. Кроме того, мы понимаем, что оценка растений двумя косвенными методами не позволяет нам говорить об истинной устойчивости, но позволяют оценить тенденцию."

Индукция каллуса из незрелых зародышей растений-регенерантов в стрессовых условиях позволяет оценить растение-реге-нерант на сохранение признака устойчивости на клеточном уровне и позволяет оценить возможность передачи этого признака потомству.

Ш оценили часть растений регенерантов сортов Целинная -21 и Дамсинская-90 на устойчивость к ионам кадмия при индукции каллуса в присутствии 10 мг/л СИ. Результаты проверки представлены на рисунке 2а. Из регенерантов, сорта Ц-21, полученных из трех клеточных линий (К-1, К-2 и К-3), только ре- ; генерант из линии к-3 способен индуцировать каллус в присутствии 10 мг/л СИ так же, как и в контроле. Эта линия была ч получена в результате селекции на 20 мг/л (И. Кроме того, у регенеранта, полученного из устойчивой линии 0-2 сорта Дам-. синская-90 индукция каллуса в стрессовых условиях превосходит . по эффективности каллусогенез в контроле. Это обстоятельства ,, свидетельствует об устойчивости клеток этого регенеранта, а если учитывать, что ткань зародыша является следующим поколением данного регенеранта, то можно утверждать, что устойчивость к ионам кадмия, проявляющаяся на клеточном уровне, наследуется. Следует-отметить, что морфогенный : потенциал каллусных тканей,образовавшихся в стрессовых условиях, у рас- . ' тений регенерантов превышал контроль. , . ' : , . . "

для анализа растений, полученных из клеток, способных к делению после трехкратных прогреваний, мы проводили индукцию каллуса из зародышей после прогревания 45 С втечение 30 и 60 минут. Из представленных на рисунке 26 данных видно, что у полученного из линии Т-4 регенеранта сорта Целинная-21, прогревание зародышей - в течение 30 минут не влияет на ИМУКЦИ» ..

Рис. 2а Анализ растений-регенерантов методом индукции каллуса в нормальных и стрессовых условиях

ц-21,0-00 исходные сорта К-1,... С-2 селективные линии го

ш без СМ §10мг/л СМ

Ы ш

з

к ш §

^ а

>- — ✓ /

у <

/ —

/ _ , ,

у — у.

у

__ —

✓

У — ■V

У — —

а-а К-1

К-2

К-3

В-в)

(Л

С-2

Рис.26 Анализ растений-регенерантов методом индукции каллуса из зародышей,обработанных высокой температурой

Ц-21 исходный сорт Т-4.Т-6 селективные линии

ш

^45

! зп

в -

/ <• у

/'

р

1

V/ ■ /у

^ контроль

В 45"С,30ы экспозиции ЕШ 45"С,60м экспозиции

■у

X

на

т-ч

- 18 - ■

каллуса, а прогревание в течение 60 минут только немного они- -хает эффективность каллусогенеза. Эта линия была воделена после трёхкратного прогревания каллусных тканей 46° С по 45 минут. Таким образом можно утверждать, что такой способ позволяет отобрать клеточные линии с повышенной термотолерантностью и толерантность на клеточном уровне наследуется. ■

Оценка растений-регенерантов по энергии прорастания . семян в стрессовых условиях.

, Для нас было необходимо убедиться в том, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, экопрессируется на уровне целого растения. Шэтому устойчивость растений-ре-генерантов к тепловому стрессу определяли по степени депрессии ростовых процессов после прогревания семян при 56 С 20 мин. ( Волкова и Мэткалпк, 1976). На рисунке За представлены результаты такой оценки. Ш обнаружили, что семена регенеран-.та сорта Целинная-21, полученного из устойчивой клеточной линии Т-4 и сохранившего признак устойсивости на клеточном уровне, прогревание . не ингибирует, а стимулирует ростовые процессы. Так длина корня и длина.побега после прогревания превосходит не только контроль, но й исходный сорт. На основании этого можно заключить, что прямая селекция на устойчивость к тепловому .стрессу на клеточном уровне позволяет сода-вать новые формы. превосходящие по устойчивости исходный ■ сорт. ' ■

Устойчивость к ионам кадмия оценивали по энергии прорастания семян растений регенерантов в присутствии ЛО мг/л СМ и сравнивали сухой вес корней и побегов в контроле и в опыте. Результаты экспериментов показали (Рис. 36), что все испытанные растения- регенеранты сорта Целинцая-21 обнаруживают . признаки устойчивости. У всех регенерантов накопление биомассы в стрессовых условиях превосходят контроль.. У регенерантов сорта Дамсинская-90 ионы кадмия не угнетает рост корней, но немного снижают рост проростка, даже у регенеранта,проявившего признаки устойчивости на клеточном уровне (С-2). Конечно, для окончательной оценки, растений регенерантов необходимы ис-

Рис. За Анализ растений-регенерантов методом прорастания семян

Щ корни: контроль Ц-21 исходный сорт @ корни: 66° С. 20м экспозиции

Т-4.Т-Б.Т-6 селективные линии ^ побеги: контроль

I побеги: 66" С, 20м экспозиции

ц-а1

Рис.30 Анализ растений-регенерантов методом прорастания семян в нормальных и стрессовых условиях

У/7Х КОРНИ воде

Ц-21,13-90 исходные сорта § корни в БОмг/л Сс1

К-1....С-2 селективные линии И побеги в воде

побеги в БОмг/л СИ

13

. ' , . - 20 -Рис. 4а Оценка перекрёстное устойчивости Сй-селективных линий

корни: контроль . Ц-21,0-90 исходные сорта • |=3 корни: Бб® С, 20м экспоэиции К-1,,.,0-2 оелективные линии побеги: контроль

Ц2 побеги: 56° С, 20м экспоэиции

в

Ц-2. М К-2 К-3

>90

С-2

Рис. 46 Оценка перекрёстной устойчивости жаро-селективных линий

'. ^ корни в воде

Ц-21 исходный сорт § корни В 50МГ/Л са

Т-4.Т-6 селективные ЛИНИИ • Ё-Э побеги в воде

Цпобеги в БОмг/л Ое»

Е5

12

2 6 «

о

Г »

о

1

1

¿х>

кХ>

Ц-21

Ш

&

питания, поаволяпцие оценить не только устойчивость, но и продуктивность. Однако уже сейчас можно сказать, что селекция на клеточном уровне на устойчивость к ионам кадмия позволяет отОирать генотипы, способные противостоять токсическому действии ионов кадмия.

Оценка растений-регенерантов на наличие перекрестной устойчивости. 1

Как мы отмечали ранее, в литературе было сообщение о возможности получения температуроустойчивых клеточных линий при отборе на устойчивость к ионам кадмия (Bin Huang and Goldsbrough,1988). Пэзтому для нас было важно оценить растения регенеранты на наличие перекрестной устойчивости, то есть, оценить растения, полученные из температуровыносливых линий на устойчивость к ионам кадмия и наоборот. Результаты такой оценки представлены на рисунке 4 (а)и (0). Как видно из рисунка 4 (а) ни один из регенерантов сорта Целинная-21, полученных иа устойчивых к кадмию клеток, не показал устойчивости к повышенным температурам. Однако регенеранты сорта Дамсинская-90 и С-1 и особенно С-2 показали, что повышенные температуры не угнетают ростовых процессов, из чего можно заключить, что у этих форм устойчивость к ионам кадмия сочетается с устойчивостью к повышенным температурам.

Из регенерантов сорта Целинная-21, полученных из температуровыносливых клеток, только у растения из линии Т-б накопление биомассы в присутствии ионов кадмия почти не угнетается, что может свидетельствовать в пользу его толерантности к ионам кадмия. Для детального анализа механизмов устойчивости растений-регенерантов необходимы дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения влияния ионов кадмия на рост и морфогенез каллусных тканей пшеницы испытанные в данной рабо-

, . . ... 22-- . те сорта можно расположить в ряд в порядка возрастания устойчивости: Безенчукская-139, Дамсинская-90, Целинная-21.

2. Оценка устойчивости к тепловому стрессу на клеточном уровне позволила ранжировать испытанные сорта а порядке возрастания устойчивости: Целинная-21, Дамсинская-90, Вевенчукс-кая-139.

аклеточная селекция на устойчивость к ионам кадмия позволяет создавать формы, у погорше прианак устойчивости эк-спрессируется на клеточном уровне и на уровне целого растения И передвтся следуюцему поколении -I

4. Трехкратное прогревание каллусных тканей пшеницы при температуре 45 С в течение 4б минут, чередующееся с субкультивированием в обычных условиях, позволяет соадать стабильные, наследуемые температуротолеравтные Формы.

6. На базе сомакюналыюй вариабельности возможно соэда-ние генотипов с комплексной устойчивостью к абиотическим стрессам. ■

.■ • Публикации.

Нгуен Тхи Ли Ань, Никифорова К. Д., "Влияние ионов тяжелых металлов(кадмия) на рост и морфогевев каллусных тканей йровой пшеницы", тезисы> Межвузовской конференции по физиологии растений и биотехнологии, Москва, 1004. ■

Объем 1',. п л

Тираж 100

Заказ 14Ь

Типография Московской с х академии им К А Тимирязева 127550 г Москва И 5"0 Тимирязевская ул, 44