Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура растительных тканей in vitro как метод повышения стрессоустойчивости яровой мягкой пшеницы сибирской селекции

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Культура растительных тканей in vitro как метод повышения стрессоустойчивости яровой мягкой пшеницы сибирской селекции"

На правах рукописи

Ои^"

Ступко Валентина Юрьевна

КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ IN VITRO КАК МЕТОД ПОВЫШЕНИЯ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СИБИРСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

- 3 ДЕК М09

Красноярск -2009

003486430

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» и ГНУ Красноярский научно-исследовательский институт сельского хозяйства СО Россельхозакадемии.

Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

академик Россельхозакадемии, заслуженный деятель РФ Сурин Николай Александрович

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук

Романов Василий Николаевич кандидат сельскохозяйственных наук Михарева Ольга Григорьевна

Ведущая организация - ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт растениеводства и селекции СО Россельхозакадемии

Защита состоится " 23 " декабря 2009 г. в " 9.00 " часов на заседании диссертационного совета Д 220.037.01 в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 90

Телефон (факс) 8(391)227-86-52

ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» Автореферат разослан "_" ноября 2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Ученый секретарь диссертационного совета

Актуальность темы. Яровая пшеница является ведущей зерновой культурой в Красноярском крае, где среди прочих факторов, лимитирующих ее урожайность, значительный ущерб наносят засуха, засоление и высокая кислотность почв [Ведров, Никитина, 1991; Танделов 1998; 2000; 2003; Шаманин и др., 2005]. Создание новых сортов, устойчивых к данным влияниям, классическими методами селекции характеризуется чрезмерной трудоемкостью и длительным сроком отбора, не менее 12 лет [Dörffling et al., 1993]. Современные технологии: генная инженерия, радиологический и химический мутагенез, культура тканей in vitro, позволяют значительно ускорить этот процесс [Ahloowalia, Maluszynski, 2001; Jain, 2001]. Появляется возможность повысить необходимую для адаптации к эдафическому стрессу клеточную устойчивость [Maas, 1989; Mansour et al., 2003; Kochian et al., 2004; Амосов и др., 2007; Зобова, Конышева, 2007], что в свою очередь обеспечивает высокую полевую выживаемость растений, являющуюся самым значительным элементом продуктивности, характеризующим их хорошую или плохую адаптивность [Иванов, 1975; Дмитриев, 2005].

Вместе с тем генетические методы имеют ряд недостатков, главный из которых недоказанность продовольственной безопасности подобных продуктов. Радиологический мутагенез требует наличия специального оборудования и строгих мер безопасности. Культура изолированных растительных тканей представляется оптимальной экологичной технологией создания адаптивных линий зерновых культур, использующей природные резервы изменчивости растений.

Цель - повышение эффективности селекции стрессоустойчивых форм яровой пшеницы методами каллусной культуры для условий Красноярского края.

Основные задачи:

1. Разработать протоколы селекции in vitro адаптивных форм пшеницы.

2. На селективных средах получить регенеранты пшеницы с физиологической устойчивостью к засухе, засолению и закислению почв.

3. Дать сравнительную характеристику физиологических и морфологических параметров полученных регенератов и их родительских форм.

Защищаемые положения:

• Технология создания соле- , кислото- и засухоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы in vitro.

• Каллусная культура пшеницы на селективных средах -эффективный метод оценки стрессоустойчивости селекционных образцов.

• Усовершенствованная методика лабораторной оценки кислотоустойчивости пшеницы.

Научная новизна: На материале сибирской селекции проведена разработка и оптимизация технологии создания в культуре тканей in vitro форм пшеницы, толерантных к засухе, засолению и низкой кислотности почв.

Выявлены ранее не исследовавшиеся закономерности регенерации каллусных культур пшеницы.

Получены новые формы мягкой яровой пшеницы с устойчивостью к указанным стрессорам, подтвержденной физиологическими лабораторными методами. Усовершенствован метод оценки кислотоустойчивости зерновых культур. Проведены сравнительные полевые испытания линий-регенерантов пшеницы и их родительских форм на нейтральных почвенных фонах в условиях Сибири.

Практическая значимость: Разработана детальная технология селекции in vitro соле-, кислото- и засухоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы для использования на материале сибирской селекции. Повышена объективность метода оценки кислотоустойчивости зерновых культур.

Линии регенерантов, превзошедшие родительские формы в физиологических тестах на устойчивость к засолению - РС(Минуса)3.13, РС(КС-1607)1.21, РС(КС-1607)2.9, и низкой рН - РК(Минуса)1.31, рекомендованы в качестве источников устойчивости и как самостоятельные селекционные образцы в работе по созданию новых адаптивных форм пшеницы для сибирского региона.

Апробация работы: По результатам исследований опубликовано 9 работ, из них 1 - в журнале, рекомендуемом ВАК. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007), Международной конференции молодых ученых "Молодые ученые - аграрной науке" (Омск, 2007), Ш Международной научно-практической конференции молодых ученых "Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых" (Краснообск, 2008), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), научно-практической конференции «Роль науки в развитии сельского хозяйства Приенисейской Сибири» (Красноярск, 2008), научно-практической конференции «Селекция сельскохозяйственных культур на продуктивность и качество» (Красноярск, 2009).

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, практических рекомендаций, выводов, списка использованной литературы, приложений, содержит 23 таблицы и 14 рисунков. Список литературы включает 169 наименований, в том числе зарубежных авторов - 62.

Личный вклад автора. Автором лично заложены все эксперименты по оптимизации технологии получения стрессоустойчивых форм пшеницы in vitro, получено семенное потомство линий регенерантов. Проведена их физиологическая и полевая оценка и статистический анализ данных.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.с.-х.н., академику Россельхозакадемии Н.А. Сурину, а также зав. отделом ООСМ КНИИСХ, к.б.н. Н.В. Зобовой за консультацию и поддержку при подготовке настоящей диссертационной работы.

Глава 1

Проблемы повышения продуктивности растений в экстремальных условиях произрастания

Глава включает обзор научной литературы о влиянии засухи, засоления и высокой кислотности почв на растения и механизмах их адаптации. Дана характеристика стрессовых эдафических и климатических факторов Красноярского края. Уделено внимание традиционным агротехническим, химическим и селекционным методам снижения стрессовых воздействий на сельскохозяйственные культуры. Рассмотрены методы оценки стрессоустойчивости селекционных образцов и роль биотехнологии в создании новых толерантных к стрессам форм культурных растений.

Глава 2

Объекты и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена в 2006-2009 годах в Красноярском НИИСХ. Объектами исследования служили 12 генотипов мягкой яровой пшеницы, отличающихся по степени адаптивности и срокам вегетации, их каллусные культуры, а также 16 линий-регенерантов, полученных в процессе культивирования каллусов на селективных засоленных (РС) и закисленных (РК), а также контрольной (РН) средах. Всего в культуру введено 10090 незрелых зародышей пшеницы.

При разработке технологии создания и получении стрессоустойчивых регенерантов задействованы методы работы с культурами изолированных растительных тканей (Бутенко, 1989), в частности, ячменя (Зобова, Конышева, 2007). Отбор включал три этапа: индукция каллуса, его пролиферация и регенерация растений. Эксплантами служили незрелые зародыши пшеницы. Культивирование проводили на модифицированной среде Мурасиге-Скуга (МС). Индуктором каллусообразования служила 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), концентрацию которой снижали вдвое на следующем этапе культивирования для стимуляции пролиферации каллуса. Увеличившиеся в размерах каллусы пассировали на среду регенерации, содержащую ИУК и кинетин. На двух последних этапах каллусы культивировали на селективных средах: подкисленной, содержащей №С), полиэтиленгликоль (ПЭГ, М 6000) и высокие концентрации сахарозы (рН 5,6). В качестве контрольной среды использовали МС (рН 5,6-5,7). Уровни гормонов и стрессовых агентов приведены в соответствующих разделах работы.

Лабораторную оценку солеустойчивости регенерантов и их родительских форм проводили рулонным методом [Удовенко, 1974]. Учитывали значения массы и длины органов проростков в солевом растворе в сравнении с контрольным. Кислотоустойчивость оценивали модифицированным методом с использованием предложенного коэффициента редукции ростовых функций органов тестируемых растений.

Полевую оценку линий-регенерантов и их родительских форм проводили по пару на оптимальном почвенном фоне в ОПХ «Минино» в 2008 году Образцы высевали на делянки площадью 1 м2. Определение параметров

структуры урожая производили стандартным методом с использованием рекомендаций ВИР по оценке коллекции зерновых культур [Методические указания..., 1981].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакетов "Snedecor" [Сорокин, 2004] и Statistica 6.0 [Боровиков, Боровиков, 1998].

Глава 3

Использование культуры изолированных тканей для повышения устойчивости яровой пшеницы к стрессовым факторам 3.1. Разработка протокола селекции стрессоустойчивых форм пшеницы

В связи с высокой степенью влияния генотипа донорного растения на рост и развитие каллусной культуры существует большое разнообразие различающихся по составу сред и условиям культивирования методик селекции стрессоустойчивых форм пшеницы и ячменя in vitro [Hsissou, Bourmont, 1994; Bajji et al., 2002; 2004; Зобова, Конышева, 2007]. Для материала сибирской селекции разработана технология создания in vitro форм яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засухе, засолению и высокой кислотности почв.

3.1.1. Подбор гормонального состава сред и параметров эксплантов

Для индукции образования каллуса использовался 2,4-Д в различных концентрациях (0,5; 1; 2; 3 мг/л). Стопроцентный уровень каллусогенеза наблюдался только при уровне фиторегулятора 3 мг/л (данные не приводятся). Однако на последующих этапах регенеранты в данных условиях не формировались. Образовавшиеся каллусы пассировали на среды пролиферации, где уровень 2,4-Д был снижен в два раза в сравнении с соответствующей средой индукции. Наиболее активный рост каллусов наблюдался при уровне 2,4-Д в среде пролиферации 0,5 мг/л, что позволяет увеличить число образцов путем разделения крупных каллусов. Поэтому, несмотря на то, что максимальный выход регенерантов наблюдался при уровне 0,25 мг/л (табл. 1), для дальнейшей работы были выбраны концентрации 1 и 0,5 мг/л в среде индукции и пролиферации соответственно.

Возраст зародышей (20-21, 27-28 сутки с начала колошения) не влиял на долю индуцированных каллусов. Однако доля образцов с органогенезом на данном этапе оказалась больше в 2-2,5 раза в культуре более зрелых зародышей. Вследствие этого на среде пролиферации в этой культуре при одинаковой доле каллусов, увеличившихся в размерах, процент образцов с морфогенезом и выход полноценных регенерантов был ниже, чем в культуре зародышей в возрасте 20-21 суток (см. табл. 1). Вероятно, менее зрелые и дифференцированные зародыши более чувствительны к изменению уровня экзогенных гормонов по сравнению с зародышами на стадии восковой спелости. Вследствие этого, они почти не образуют точек роста органов параллельно с каллусогенезом. Кроме того, их каллусы легче формируют органогенные зоны и полноценные регенеранты на фоне снижения уровня 2,4-Д при пассировании их на среду пролиферации.

На индукцию каллуса оказывали влияние не только уровень ауксинов и возраст экспланта, но и генотип донорного растения, в частности, его

вегетационный период. Раннеспелые сорта (Таежная, Новосибирская 15) имели значительно большую долю индуцированных каллусов, чем позднеспелые (Минуса, КС-1607) независимо от уровня 2,4-Д в среде. При одинаковом уровне пролиферации наиболее активный процесс образования регенерантов наблюдался в культуре раннеспелых сортов, которые являются наиболее востребованными в условиях Сибири.

Таблица 1 - Параметры роста и развития каллусной культуры пшеницы (% от общего числа образцов)_

Возраст эксплантов Генотип Среда пролиферации каллуса Доля регенерантов, высаженных на дорацдавание, %

Концентрация 2,4-Д, мг/л Доля пролифери- рующих каллусов, % Доля морфогенных каллусов, %

со стебле-генезом с ризогенезом

Контр №С1, 0,42% Контр ЫаС1, 0,42% Контр №С1, 0,42% Контр ИаС1, 0,42%

21-22 сутки Новосибирская 15 1П м о" 74,0*" 53,4*' 35,1*а 17,2 47,8*а 21,4 35,1* 35,0*"

Таежная 67,8а 61,5* 44,8*а 40,0 40,4* 43,7*а 38,9* 36,3 *а

Минуса 77,5 43,2* - 15,9* 38,4* 15,9* - 15,9*

КС-1607 59.8* 73,7* - 26,7* - 26,7* - 20,0*

Новосибирская 15 VI о" 92,5* 78,0* 24,2* 23,6 20,0* 23,6а 24,2* 25,7*

Таежная 12,Т 70,9*" - 33,за 5,1* 18,4*а 7,7* 18,4*"

Минуса 86,9 68,3* 4,8 - 15,9* - - -

КС-1607 76,9* 54,2* 27,2 8,3* 27,2* 8,3* 27,2* 8,3*

27-28 сутки Новосибирская 15 1Г1 сч о" 85,2а 85,2й 18,5а 21,1 25,9*а 25,4* 14,8 21,1*а

Таежная 86,8а 61,9 28,1*" 34,7* 36,5* 26,4*а 17,3* 26,4*а

Новосибирская 15 о" 93,9 78,4 26,1а 21,1 11,6* 11,7*а 20,3 11,7*

Таежная 83, За 55,2а 13,3* 6,6*' - - - -

* - существенные различия между средами с разной концентрацией 2,4-Д в (Р<0,05); а - существенные различия между разными по степени зрелости зародышами (Р<0,05).

Для повышения регенерационной активности каллусной культуры опробованы среда с высокими концентрациями ИУК (1,75 мг/л) и кинетина (10,75 мг/л) и уменьшенным в два раза содержанием макроэлементов в среде регенерации согласно (ТЫБвои, ВоиЬаппот, 1994], а также безгормональная среда МС [Вият, Ozgen, 2004]. Однако выход регенерантов в этих условиях составил в среднем 27±3%, как и на среде, используемой в работе с ячменем и содержащей 0,5 мг/л ИУК и 1 мг/л кинетина [Зобова, Конышева, 2007]. Эти концентрации и предложены для проведения отбора.

3.1.2. Подбор уровней давления селектирующих факторов

С целью увеличения эффективности отбора стрессоустойчивых форм исследовано влияние различных уровней ИаС1 (табл. 2) и рН (рис. 1) на пролиферацию и регенерацию каллусной культуры пшеницы.

Концентрация ЫаС1 0,42% не обеспечивала достоверного подавления ростовых процессов, которое было достигнуто увеличением уровня стрессора до 0,84%. Содержание соли 1,68% почти полностью прекратило органогенез и привело к нулевому выходу регенерантов у всех генотипов, кроме селекционной линии КС-1607 (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние №С1 в среде пролиферации на ростовые параметры и развитие каллусной культуры пшеницы __

Генотип донорного растения Доля пролиферирующих каллусов, % Доля регенерантных каллусов, % Доля регенерантов, высаженных на доращивание, %

Кон NaCl, % Кон NaCl, % Кон NaCl, %

0,42 0,84 1,68 0,42 0,84 1,68 0,42 0,84 1,68

Таежная 83,8 92,1 64,1*а 56,4*а 43,3 50,0 25,7*а 10,3*а 32,4 42,1 18,0*а 0,0*а

Новосибирская 15 76,0 69,2 56,0* 46,2*а 44,0 57,7 41,7" 26,9*" 36,0 38,5 12,5*а 0,0*а

КС-1607 84,6 69,2 53,9* 45,0 46,2 61,6* 69,2* 8,3*а 38,5 53,9* 15,4*а 8,3*а

Минуса 77,3 80,5 50,0*а 65,1 65,9 63,4 31,0*а 20,9*а 59,1 43,9* 23,8*а 0,0*а

Среднее 80,4 77,8* 56,0а* 60,7* 49,8 58,2 41,9а 16,6*а 41,5 44,6 17,4*а 2,08*а

НСР0,05 для фактора «генотип»/ «концентрация ИаС1» 17,2/11,5 13,5/20,3 13,3/19,9

* - существенные различия с контрольной средой (Р<0,05); а - существенные различия между селективной средой с наименьшим уровнем давления и средами с повышенным давлением селективного фактора (Р<0,05).

Поскольку солеустойчивость пшеницы формируется исключительно за счет клеточных механизмов [Mansour et al., 2003], появляется возможность использовать методику культивирования in vitro каллусов на среде с высоким содержанием NaCl для предварительной сравнительной оценки различных генотипов мягкой яровой пшеницы на солеустойчивость.

Увеличение кислотности среды должно было во все большей степени подавлять ростовые процессы в культуре и тем самым повышать эффективность отбора устойчивых форм. Однако наблюдалось снижение лишь доли пролиферирующих каллусов, в то время как активность регенерационных процессов увеличивалась (см. рис. 1).

—*— Пролиферирующие каллусы

-•-Морфогенные каллусы

—л— Регенератные каллусы

-х-Регенераты, высаженные на доращивание

Рисунок 1 - Влияние уровня кислотности питательной среды на пролиферацию и морфогенез каллусной культуры пшеницы (Р<0,05)

3.1.3. Имитация засухи in vitro

Во многих работах по селекции на засухоустойчивость in vitro в качестве селективного агента используется ПЭГ [Ли и др., 2004; Hsissou, Bouharmont, 1994; Bajji et al., 2002; 2004]. Исследовано влияние двух его концентраций на рост и развитие каллусной культуры пшеницы (табл. 3). В среднем для всех культур при уровне ПЭГ 22% наблюдалось стабильное подавление регенерации, однако сформировавшиеся в этих условиях регенеранты имели стекловидный стебель, подвергавшийся некрозу.

Таблица 3 - Влияние индуцированной засухи на рост и развитие каллусной культуры пшеницы__

Генотип донорного растения Доля пролиферирующих каллусов, % Доля регенерантных каллусов, % Доля регенерантов, высаженных на доращивание, %

Кон ПЭГ 16% ПЭГ 22% Кон ПЭГ 16% ПЭГ 22% Кон ПЭГ 16% ПЭГ 22%

Таежная 83,8 56,4* 50,0* 43,3 43,6 30,6 32,4 33,3 16,7*а

Новосибирская 15 76,0 37,5* 25,0* 44,0 75,0* 39,1" 36,0 58,3* 16,7*а

КС-1607 84,6 50,0* 75,0' 46,2 50,0 25,0*а 38,5 33,3 8,3*а

Минуса 77,3 60,9 66,7 65,9 47,8* 42,9* 59,1 34,8* 16,7*"

Среднее 80,4 51,2* 54,2* 49,8 54,1 34,4*" 41,5 39,9 14,6*а

НСРо,о5 Для фактор «генотип»/ «концентрация ПЭГ» 17,2/11,5 13,5/20,3 13,3/19,9

* - существенные различия с контрольной средой (Р<0,05); а -существенные различия между селективной средой с наименьшим уровнем давления и средами с повышенным давлением селективного фактора (Р<0,05).

Меньшая концентрация ПЭГ (16%) в большинстве случаев не вызывала значимых изменений активности ростовых процессов культуры в сравнении с контрольными условиями (см. табл. 3). В связи с этим, основываясь на литературных данных [Lutts et al., 2002], подходящим признан средний между этими значениями уровень давления ПЭГ 18%.

Альтернативой ПЭГ при имитации засухи in vitro является сахароза, главное преимущество которой невысокая стоимость. С целью выбора подходящего стрессового агента для отбора форм мягкой яровой пшеницы с физиологической засухоустойчивостью исследовано влияние осмотического давления в среде 0,78 МПа, созданного 18% (вес/объем) ПЭГ или сахарозой (6,3%), на пролиферацию и регенерацию каллусной культуры.

Высокая концентрация сахарозы не обеспечивала необходимого уровня селектирующего давления. Вероятно, в ходе месячного культивирования она усваивалась растительными тканями, ее концентрация снижалась до уровня, не являющегося стрессовым. В свою очередь в присутствии ПЭГ наблюдалось стабильное подавление ростовых процессов (рис. 2).

■ Контроль ШПЭГ □ Сахароза

Рисунок 2 - Влияние высокого осмотического давления на параметры роста и развития каллусной культуры пшеницы на среде пролиферации: 1 -пролиферирующие; 2 - морфогенные; 3 - регенерантные; 4 - регенерантные с аномалиями развития каллусы; 5 - доля полноценных регенерантов (Р<0,05)

Именно на среде с ПЭГ (18% вес/объем) проведена оценка засухоустойчивости генотипов, выделяющихся высокой (Кантегирская 89) и средней (Тулунская 12, КС-1664) засухоустойчивостью, влаголюбивостью (Снаббе, Таежная, КС-1529), широтой и длительностью районирования (Скала). Высокую регенерационная активность (40%) в присутствии ПЭГ продемонстрировал в каллусной культуре сорт Кантегирская 89, обладающий признаком полевой засухоустойчивости. Однако и другие образцы, характеризующиеся как средней (КС-1664), так и повышенной (КС-1529) потребностью во влаге, показали не меньшую, а иногда и большую устойчивость к данному стрессу (табл. 4). Это, вероятно, связано с тем, что

исследованные засухоустойчивые генотипы в основном переносят засуху за счет своих морфологических особенностей, однако данный метод позволяет выявлять формы с клеточной устойчивостью к недостатку влаги.

Таблица 4 - Влияние генотипа и индуцированной засухи на рост и развитие

Генотип донорного растения Доля пролифери- рующих каллусов,% Доля регенератных каллусов,% Доля регенерантов, высаженных на доращивание, %

контр ПЭГ контр ПЭГ контр ПЭГ

Кантегирская 85 100,0 47,8* 65,6 40,0* 18,9 5,6*

Скала 100,0 52,4* 65,6 54,3 61,4 11,4*

Тулунская 12 100,0 21,4* - 42,8* 18,9 5,6*

КС-1664 89,6 35,9* 66,3 54,4* 57,2 9,3*

Таежная 93,9 33,6* 69,3 59,3 52,5 14,2*

Снаббе 100,0 26,9* 47,6 40,9 25,2 3,0*

КС-1529 88,6 37,8* 33,0 30,7 25,0 11,5*

НСР0,05 для факторов «сорт»/ «среда» 18,1/9,7 21,8/11,7 15,7/8,4

* - существенные различия между контрольной и селективной средами (Р<0,05).

3.2. Множественная регенерация растений в условиях светокультуры

Высокая способность к образованию растений-регенерантов при культивировании in vitro тканей и клеток растений является необходимым условием эффективного применения клеточных технологий. Множественная регенерация растений (МРР) позволяет значительно повысить выход регенерантов при работе с каллусной культурой. Для ячменя показана более низкая частота МРР у раннеспелых сортов в сравнении с позднеспелыми [Дунаева и др., 2000]). В отношении пшеницы подобных исследований не проводилось.

В экспериментах с генотипами сибирской селекции частота МРР у скороспелых сортов Таежная и Новосибирская 15 более чем в 2 раза превышала этот показатель у позднеспелых генотипов, Минусы и КС-1607, и составила соответственно 4,1±0,81 и 1,56±0,27%. Вероятно, у раннеспелых сортов генетически закрепленная высокая скорость развития побегов позволяет чаще формироваться отдельным очагам регенерации в несколько атрагирующих центров.

При высадке в керамзит одного пробирочного растения в условиях светокультуры в корневой системе подросших растений отмечалось наличие нескольких самостоятельных точек кущения. Это явление было обозначено нами как остаточные признаки (ОП) МРР. Образцы с ОП МРР и без них формировались на каллусах примерно одного размера. Если количество

продуктивных стеблей на один регенерант (каллус) достоверно не различалось, как при ОП МРР, так и при формировании единственной точки кущения, то их количество, приходящееся на одно растение, в случае ОП МРР снижалось, сопровождаясь увеличением длины колоса и, соответственно, озерненности и количества зрелых зерен на одно растение и регенерант.

ОП МРР отмечены только у регенерантов скороспелых сортов. У позднеспелых сортов доминирование главного стебля, по всей вероятности, не позволило развиться имевшимся дополнительным точкам роста.

В полевых условиях у образцов с ОП МРР в R« у поколения R, отмечена тенденция к увеличению продуктивной кустистости. Поскольку имеется прямая зависимость между МРР и кустистостью донорных растений [Соболева, Логинов, 2004], вполне возможно, что и наличие МРР в каллусной культуре регенеранта впоследствии проявляется в его большей продуктивной кустистости в полевых условиях.

Глава 4

Оценка линий-регенерантов мягкой яровой пшеницы, полученных на селективных средах

В ходе работы получено и доведено до семенного потомства 26 регенерантов на селективных и 20 на контрольных средах. Для оценки эффективности отбора третье поколение регенерантов, семенной материал которых имелся в достаточном для этого количестве, протестировано на устойчивость к высоким концентрациям NaCl (1,68%) и низкой рН среды (3,0) в соответствии с направлением их отбора.

4.1. Сравнительная характеристика солеустойчивости

По результатам лабораторной оценки регенеранты, сформировавшиеся на селективной среде (в присутствии NaCl - 0,42%) в каллусной культуре линии КС-1607 и сорта Минуса, все, кроме одного, продемонстрировали большую толерантность к засолению среды, чем родительские формы (табл. 5).

У регенерантов от сорта Новосибирская 15, полученных на селективной и контрольной средах, показатели проростков в солевом растворе были на уровне родительского сорта, что делает данный донорный генотип неподходящим объектом для введения в культуру in vitro с целью создания новых форм.

Полученные на нейтральной среде регенеранты от линии КС-1607 имели большой разброс значений ростовых параметров в контрольных условиях, однако, продемонстрировали высокую толерантность к засолению - снижение их ростовых показателей в стрессовых условиях в сравнении с контролем было значительно меньше, чем у КС-1607. Проростки регенерантов от сорта Таежная, полученных в контрольных условиях, уступили донорному генотипу по массе стеблей во всех исследованных условиях (табл. 5).

Различия в реакции опытных образцов (регенерантов) можно объяснить как внутрисортовым полиморфизмом, так и сомаклональной изменчивостью, которая является основой отбора in vitro форм, устойчивых к абиотическим факторам [Kendell et al., 1990; Timm et al., 1991; Dorffling et al., 1993].

Таблица 5 — Ростовые параметры исходных форм и их регенерантов

Генотип Число корней, шт. Длина корней 2, мм Длина стеблей, мм Масса корней, мг Масса стеблей, мг

контроль NaCl контроль NaCl контроль NaCl контроль NaCl контроль NaCl

Минуса 4,94 4,04 423 62 151 22 79 29 86 31

РС(Минуса)3.13 4,84 4,74** 317*** 89** 121** 36*** 58*** 30 73* 35

РС(Минуса)9.9 5,00 4,52 469 78 158 41*** 90 25 90 42**

КС-1607 4,08 2,82 296 36 129 8 83 16 105 15

РС(КС-1607)1.21 4,48 4,00*** 292 63** 154 32*** 84 25** 99 34***

РС(КС-1607)2.9 4,42 3,09 387** 46 137 15 95 18 96 25*

РС(КС-1607)3.11 4,40 2,93 345 39 128 10 92 19 100 14

КС-1607 4,27 3,12 410 52 137 17 104 22 99 27

РН(КС-1607)2.1 3,47*** 3,25 215*** 41 82*** 10 63*** 21 75* 19

РН(КС-1607)8.1 3,56** 3,40 298** 57 125 13 77*** 24 86 22

РН(КС-1607)9.1 3,56*** 2,87 296*** 41 89*** 8 77*** 20 78** 15*

РН(КС-1607)3.12 3,64** 3,38 312** 52 1000** 8 86* 22 83 25

Новосибирская 15 4,54 4,65 500 118 170 59 86 26 107 52

РС(Новосибирская 15)8.13 4,40 4,61 477 111 168 59 80 . 24* 113 53

РС(Новосибирская 15)11.8 4,67 4,52 467 106 185 61 78 21*** 113 49

РН(Новосибирская 15)12.6 4,56. 4,81 394*** 107 163 55 80 25 107 51

Р11(Новосибирская 15)8.12 4,66 4,59 465 122 187 57 87 25 117* 48

Таежная 4,63 4,91 407 234 131 95 86 55 89 73

РН(Таежная)1.71 4,75 4,84 406 247 119 100 84 52 91 63***

РН(Таежная) 1.9 4,83 4,87 377 174*** 118 41*** 79 40*** 102** 35***

Различия между регенерантом и родительской формой достоверны при уровне значимости: * — Р<0,1, ** — Р<0,05;

*** — р<0,01.

Поскольку в экспериментах был задействован семенной материал третьего поколения, то можно говорить о наследуемых генетических изменениях, приобретенных в условиях каллусной культуры.

4.2. Характеристика кислотоустойчивости

При использовании в нашей работе для оценки кислотоустойчивости классического метода [Удовенко, 1974], где использовалась фильтровальная бумага, наблюдалась стимуляция органогенеза в сравнении с контрольными условиями. В экспериментах по экспозиции целлюлозной основы, а также зерен и проростков пшеницы на инертной основе (стекло) в дистиллированной воде отмечено подщелачивание среды во всех описанных случаях до уровней, не являющихся стрессовыми.

Предложено: 1) оценку кислотоустойчивости проводить на инертном носителе с ежедневной заменой растворов; 2) для сравнительной оценки толерантности образцов ввести коэффициент редукции ростовых функций органов тестируемых растений относительно контрольных:

тг тг тз тр I

--'

где К*,, (масса корней); Кш (масса побега); Ктр (масса растения); К, (длина побега) - частные коэффициенты редукции, равные отношению среднего значения показателя в стрессовых условиях к среднему его значению в контрольных. Чем выше данный коэффициент, тем более устойчив образец. Из метода исключен параметр длины корней, поскольку зачастую кислотоустойчивые формы укорачивают данные органы в стрессовых условиях, компенсируя это разветвленностью корневой системы.

С использованием усовершенствованного метода проведено исследование кислотоустойчивости регенеранта, полученного от сорта Минуса на среде с низкой рН (4,0), которое еще ярче, чем в случае с солеустойчивыми линиями, продемонстрировало эффективность технологии отбора, подтвердив наследование признака кислотоустойчивости. Снижение интенсивности ростовых процессов в условиях стресса в сравнении с контролем у регенеранта было значительно меньше, чем у сорта Минуса, что выразилось в соответствующих Кред 0,671 и 0,504.

Разработанная и используемая методика оценки кислотоустойчивости позволила проследить, в том числе и динамику роста образцов, что выявило превосходство регенеранта над родительской формой в скорости роста (рис. 3).

Уже на вторые сутки прорастания скорость удлинения корней регенеранта в контрольных условиях в 1,6 раза превышала таковую у проростков родительской формы. При рН 3,0 данное соотношение было достигнуто на 8 сутки. Обращает на себя внимание и большая длительность активного роста регенеранта в присутствии стрессора - вплоть до 8 суток. Рост корней родительского генотипа прекратился при рН 3,0 уже на 4 сутки.

Поскольку скорость роста побегов в исследуемый период была неравномерна, логично рассмотреть относительный прирост органов за сутки.

С этой точки зрения наиболее значительные различия между образцами отмечались только в первые 3-5 суток, где явное преимущество по темпам увеличения длины побегов во всех исследованных условиях и корней - в контрольных, имел регенерант.

Рисунок 3 - Скорость удлинения побегов (а) и корней (б) проростков пшеницы сорта Минуса и ее регенеранта в контрольных (1) и в стрессовых (2) условиях (V, мм/сут.) (Р<0,05)

Все вышесказанное свидетельствует о наличие у регенеранта признаков толерантности к высоким концентрациям IT1". В свою очередь уровень рН 4,0 в культуральной среде достаточен для отбора кислотоустойчивых форм, несмотря на отсутствие подавления роста самих каллусов в этих условиях (раздел 3.1.2) в сравнении с контрольной средой. Вероятно, способность каллусов изменять рН среды в условиях пониженной кислотности и таким образом формировать благоприятные условия можно также считать признаком устойчивости их к закислению среды произрастания. Обращает на себя внимание и значительное превосходство кислотоустойчивого регенеранта над родительской формой в нейтральных условиях. Большую часть пахотных земель все же составляют нейтральные фоны, где данная особенность может стать решающей при выборе селекционного образца.

Регенеранты, полученные на нейтральной среде от сортов Новосибирская 15 и Таежная, демонстрировали значительное превосходство над родительской формой в стрессовых условиях по всем фиксируемым параметрам. В то же время в растворе с нейтральной рН они уступали родительским генотипам, в результате чего Kpeá регенерантов (0,32; 0,33) от сорта Таежная в два раза превышали показатель сорта (0,18). Снижение интенсивности ростовых процессов под действием стресса регенеранта РН (Новосибирская 15)12.6 также

было менее значительным, чем у родительского генотипа 0,63 и 0,43 соответственно).

Несмотря на схожую динамику роста проростков этих сортов и их регенерантов, превосходство линий над родительскими формами на отдельных участках экспозиции, как в контрольных (только сорт Таежная), так и в селективных (оба сорта) условиях, говорит об их повышенной регенерационной способности. Можно говорить об отборе форм с данным признаком в условиях каллусной культуры.

4.3. Полевая оценка линий-регенерантов

В 2008 году проведены сравнительные полевые испытания линий-регенерантов и их родительских форм на оптимальных почвенных фонах в ОПХ «Минино». Растения линий-регенерантов от сорта Новосибирская 15, которые не превзошли родительскую форму в лабораторных тестах в полевых условиях, также уступили ей по элементам продуктивности. Они имели меньшую сохранность к уборке и массу 1000 зерен, чем родительский генотип, а также имели более низкорослые растения, что естественно оказывало положительный эффект на озерненность колоса.

Регенеранты от селекционной линии КС-1607 отличались выравненностью стеблестоя, что характерно для образцов, прошедших отбор in vitro [Guleeva et al., 1984], бблыпими высотой растений и озерненностью главного колоса.

Тенденция к снижению вариации по высоте растений и продуктивной кустистости наблюдалась и у регенерантов от сорта Минуса наряду с повышением озерненности, длины боковых колосьев и урожайности в сравнении с донорным генотипом.

Выводы

1. Для материала сибирской селекции разработана технология создания in vitro форм мягкой яровой пшеницы, устойчивых к засухе, засолению и высокой кислотности почв. Оптимизированы гормональный состав сред, уровни давления селектирующих факторов, подобраны параметры эксплантов и выделены генотипы, наиболее отзывчивые к условиям каллусной культуры.

2. Выявлены закономерности развития каллусной культуры мягкой яровой пшеницы. Впервые исследован феномен множественной регенерации растений in vitro у данного вида. Установлена его связь с кустистостью донорных растений, сформировавшихся регенерантов и их вегетационным периодом.

3. В физиологических лабораторных тестах показана высокая устойчивость к засолению и закислению среды линий-регенерантов, сформировавшихся на селективных средах, что подтверждает эффективность отбора, проведенного в культуре каллусных тканей.

4. Высокий регенерационный потенциал, отмеченный у линий-регенерантов, полученных с нейтральной среды, объясняется наличием своего рода отбора по этому признаку в условиях каллусной культуры.

5. Подтверждена состоятельность методики культивирования каллусных культур на селективных средах in vitro для оценки физиологической устойчивости к засухе и высоким концентрациям NaCl.

6. В однолетних полевых опытах выявлена тенденция к превосходству линий-регенерантов над их родительскими генотипами по отдельным элементам структуры урожая.

Практические рекомендации

Разработанная технология создания стрессоустойчивых форм пшеницы in vitro на основе материала сибирской селекции рекомендуется для использования в селекционных учреждениях Сибири, имеющих в своем составе биотехнологические лаборатории. В отборе предпочтительно использовать в качестве эксплантов незрелые зародыши в возрасте 20-21 суток от начала колошения; в среде введения уровень 2,4-Д - 1 мг/л, в среде пролиферации -

0.5.мг/л. На третьем этапе культивирования для регенерации растений рекомендуется использование прописи среды, используемой в работе с ячменем.

Для отбора стрессоустойчивых форм предлагается использовать следующие уровни селективных агентов: засухоустойчивых форм - 18% вес/объем ПЭГ (6000); солеустойчивых форм in vitro - 0,84% NaCl; кислотоустойчивых форм - рН4,0.

Каллусные культуры яровой мягкой пшеницы на селективных средах предлагается использовать для скрининга генотипов данной зерновой культуры на физиологическую устойчивость к засухе и засолению почв.

В качестве селекционного материала при создании сортов рекомендуется использовать для возделывания на нейтральных и кислых почвах регенерант: РК(Минуса)1.31; на засоленных регенераты: РС(Минуса)3.13, РС(КС-1607)1.21, РС(КС-1607)2.9.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Ступко В.Ю., Зобова Н.В. Оптимизация гормонального состава питательных сред при селекции пшеницы на солеустойчивость in vitro // Актуальные проблемы ботаники, экологии и биотехнологии: мат-лы междунар. конф. молодых ученых-ботаников. Киев: Фитосоциоцентр, 2006. С.167-168.

2. Ступко В.Ю., Зобова Н.В. Разработка технологии создания стрессоустойчивых форм пшеницы в культуре in vitro // Биотехнология: состояние и перспективы развития: мат-лы 4-го Москов. междунар. конгресса (Москва, 12-16 марта 2007 г.). М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. С.238-239.

3. Ступко В.Ю., Зобова Н.В. Влияние генотипа и состава сред на индукцию и регенерацию каллусной культуры пшеницы при отборе in vitro II Научное обеспечение отрасли растениеводства в экстремальных условиях Сибири: мат-лы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию Красноярского НИНСХ. Красноярск: Гротеск, 2007. С.354-358.

4. Ступко В.Ю., Заболоцкий E.B. Множественная регенерация растений мягкой яровой пшеницы в условиях светокультуры // Молодые ученые -аграрной науке: мат-лы междунар. конф. молодых ученых. Омск: СибНИИСХ, 2007. С.117-123.

5. Сгупко В.Ю. Подбор уровней давления селектирующих факторов для отбора стрессоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы in vitro II Молодые ученые - науке Сибири: сб. ст. молодых ученых. Вып. 3. Ч. I. Красноярск: Изд-во Краснояр. гос. аграр. ун-та, 2008. С.80-83.

6. Ступко В.Ю., Киреева A.B. Подбор условий селекции и тестирования кислотоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: тр. III междунар. науч,-практ. конф. молодых ученых. Кемерово: Кузбассвузиздат, 2008. С. 185-188.

7. Ступко В.Ю., Зобова Н.В., Сурин H.A. Подбор условий для создания стрессоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы in vitro II Сиб. вестн. с.-х. науки. 2008. №6 (168). С.20-26.

8. Ступко В.Ю., Киреева A.B., Зобова Н.В. Селекция in vitro и характеристика солеустойчивости регенерантов мягкой яровой пшеницы // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тез. IX междунар. конф. (Звенигород, 812 сентября 2008 г.). М.: ФБК-Пресс, 2008. С.368-369.

9. Ступко В.Ю. Исследование взаимосвязи регенерационной способности каллусной культуры мягкой яровой пшеницы в условиях осмотического стресса с адаптивными свойствами донорных растений // Роль науки в развитии сельского хозяйства Приенисейской Сибири. Красноярск: Гротеск, 2008. С.231-237.

IS

Санитарно-эпидемиологическое заключение №24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09. Подписано в печать 17.11.2009. Формат 60x84/16. Бумага тип. № 1. Печать - ризограф. Уел печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 162 Издательство Красноярского государственного аграрного университета 660017, г. Красноярск, ул. Ленина, 117

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Ступко, Валентина Юрьевна

Введение.

Глава 1. Проблемы повышения продуктивности растений в экстремальных условиях произрастания.

1.1. Влияние стрессовых эдафических и климатических факторов на рост и развитие растений.

1.2. Механизмы устойчивости растений к неблагоприятным условиям произрастания.

1.2.1. Физиологическая устойчивость.

1.2.2. Морфологические особенности стрессоустойчивых растений.

1.3. Характеристика условий возделывания пшеницы в Красноярском крае

1.4. Традиционные методы повышения урожайности культурных растений в экстремальных условиях произрастания.

1.4.1. Агротехника.

1.4.2. Селекция.

1.4.2.1. Методы скрининга адаптивных генотипов.

1.5. Биотехнологические методы в селекции сельскохозяйственных культур

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Биотехнологические методы.

2.3. Модификация метода оценки кислотоустойчивости пшеницы.

2.4. Физиологическая оценка линий-регенерантов.

2.5. Полевая оценка линий-регенерантов.

2.6. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Использование культуры изолированных тканей для повышения устойчивости яровой пшеницы к стрессовым факторам.

3.1. Разработка протокола селекции стрессоустойчивых форм пшеницы

3.1.1. Подбор гормонального состава сред и параметров эксплантов.

3.1.2. Подбор уровней давления селектирующих факторов.

3.1.3. Имитация засухи in vitro.

3.2. Множественная регенерация растений в условиях светокультуры.

Глава 4. Оценка линий-регенерантов мягкой яровой пшеницы, полученных на селективных средах.

4.1 .Сравнительная характеристика солеустойчивости.

4.2. Характеристика кислотоустойчивости.

4.3. Полевая оценка линий-регенерантов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культура растительных тканей in vitro как метод повышения стрессоустойчивости яровой мягкой пшеницы сибирской селекции"

Актуальность темы. Яровая пшеница является ведущей зерновой культурой в Красноярском крае. В связи с повышенным спросом на продовольственное зерно ее возделывают во всех почвенно-климатических зонах, где среди прочих факторов, лимитирующих ее урожайность, значительный ущерб наносят засуха, засоление и высокая кислотность почв [Ведров, Никитина, 1991; Танделов, 1998, 2001, 2003; Шаманин и др., 2005]. В борьбе с данными влияниями сорт является самым дешевым и доступным средством роста урожайности [Семина, Мачнева, 2005; Бёзе, 2005]. Классическая адаптивная селекция до настоящего времени остается основным методом создания новых сортов. Тем не менее, она характеризуется чрезмерной трудоемкостью и длительным сроком отбора [Dorffling et al., 1993]: новый сорт приходит на поля и начинает приносить ощутимую прибыль лишь через 12-20 лет. Современные технологии, включающие в себя генную инженерию, радиологический и химический мутагенез и культуру тканей in vitro, позволяют значительно сократить сроки выведения новых сортов [Ahloowalia, Maluszynski, 2001; Jain, 2001]. С использованием данных методов появляется возможность повысить необходимую для адаптации к эдафическому стрессу клеточную устойчивость [Maas, Poss, 1989; Mansour et al., 2003; Kochian et al., 2004; Амосова и др., 2007; Зобова, Конышева, 2007], что, в свою очередь, обеспечивает высокую полевую выживаемость растений, являющуюся самым значительным элементом продуктивности, характеризующим их хорошую или плохую адаптивность [Иванов, 1975; Дмитриев, 2005].

Вместе с тем методы генетической модификации имеют ряд недостатков: дороговизна материалов, сложность процедур и, в конечном итоге, ограниченность введения полученных таким образом растений в рацион человека из-за возможного, по мнению ряда ученых, вреда здоровью

Фридт, 2005]. Радиологический мутагенез требует наличия специального оборудования и строгих мер безопасности.

Таким образом, культура изолированных растительных тканей представляется наиболее экологически безопасной, малозатратной по времени и ресурсам технологией создания адаптивных форм зерновых, использующей природные резервы изменчивости растений. Многие ее приемы уже успешно применяются селекционерами по всему миру [Farooq & Azam, 2001; Zairl et al., 2003; Almansouri et al., 2001; Bajji et al., 2004].

Цель работы - повышение эффективности процесса селекции стрессоустойчивых форм яровой мягкой пшеницы для условий Красноярского края методами каллусной культуры растений.

Основные задачи:

1. Разработать протоколы селекции in vitro адаптивных форм пшеницы.

2. На селективных средах получить регенеранты пшеницы с физиологической устойчивостью к засухе, засолению и закислению почв.

3. Дать сравнительную характеристику физиологических и морфологических параметров полученных регенератов и их родительских форм.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Технология создания соле- , кислото- и засухоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы in vitro.

• Каллусная культура пшеницы на селективных средах — эффективный метод оценки стрессоустойчивости селекционных образцов.

• Усовершенствованная методика лабораторной оценки кислотоустойчивости пшеницы.

Научная новизна. На материале сибирской селекции проведена разработка и оптимизация технологии создания в культуре тканей in vitro форм пшеницы, толерантных к засухе, засолению и низкой кислотности почв. Выявлены ранее неизвестные закономерности регенерации каллусных культур пшеницы.

Получены новые формы мягкой яровой пшеницы с устойчивостью к указанным стрессорам, подтвержденной физиологическими лабораторными методами. Усовершенствован метод оценки кислотоустойчивости зерновых культур. В сравнительных полевых испытаниях линий-регенерантов пшеницы и их родительских форм на нейтральных почвенных фонах в условиях Сибири выявлена тенденция к превосходству линий-регенерантов по отдельным элементам структуры урожая.

Практическая значимость. Разработана детальная технология селекции in vitro соле-, кислото- и засухоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы для использования на материале сибирской селекции. Повышена объективность метода оценки кислотоустойчивости зерновых культур.

Линии регенерантов, превзошедшие родительские формы в физиологических тестах на устойчивость к засолению — РС(Минуса)3.13, РС(КС-1607) 1.21, РС(КС-1607)2.9, и низкой рН - РК(Минуса)1.31 рекомендованы в качестве источников устойчивости и как самостоятельные селекционные образцы в работе по созданию новых адаптивных форм пшеницы для сибирского региона.

Апробация работы: По результатам исследований опубликовано 9 работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые -аграрной науке» (Омск, 2007), III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2008), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), конференции «Роль науки в развитии сельского хозяйства Приенисейской Сибири» (Красноярск, 2008), научно-практической конференции «Селекция сельскохозяйственных культур на продуктивность и качество» (Красноярск, 2009).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, практических рекомендаций, выводов, списка использованной литературы, приложений, содержит 23 таблицы и 14 рисунков. Список литературы включает 169 наименований, в том числе зарубежных авторов - 62.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Ступко, Валентина Юрьевна

Выводы

1. Для материала сибирской селекции разработана технология создания in vitro форм мягкой яровой пшеницы, устойчивых к засухе, засолению и высокой кислотности почв. Оптимизированы гормональный состав сред, уровни давления селектирующих факторов, подобраны параметры эксплантов и выделены генотипы, наиболее отзывчивые к условиям каллусной культуры.

2. Выявлены закономерности развития каллусной культуры мягкой яровой пшеницы. Впервые исследован феномен множественной регенерации растений in vitro у данного вида. Установлена его связь с кустистостью донорных растений, сформировавшихся регенерантов и их вегетационным периодом.

3. Подтверждена состоятельность методики культивирования каллусных культур на селективных средах in vitro для оценки физиологической устойчивости к засухе и высоким концентрациям NaCl.

4. В физиологических лабораторных тестах показана высокая устойчивость к засолению и закислению среды линий-регенерантов, сформировавшихся на селективных средах, что подтверждает эффективность отбора, проведенного в культуре каллусных тканей.

5. Высокий регенерационный потенциал, отмеченный у линий-регенерантов, полученных с нейтральной среды, объясняется наличием своего рода отбора по этому признаку в условиях каллусной культуры.

6. В однолетних полевых опытах выявлена тенденция к превосходству линий-регенерантов над их родительскими генотипами по отдельным элементам структуры урожая.

Практические рекомендации

Разработанная технология создания стрессоустойчивых форм пшеницы in vitro на основе материала сибирской селекции рекомендуется для использования в селекционных учреждениях Сибири, имеющих в своем составе биотехнологические лаборатории. В отборе предпочтительно использовать в качестве эксплантов незрелые зародыши в возрасте 20-21 сутки от начала колошения; в среде введения уровень 2,4-Д - 1 мг/л, в среде пролиферации — 0,5 мг/л. На третьем этапе культивирования для регенерации растений рекомендуется использование прописи среды, используемой в работе с ячменем.

Для отбора стрессоустойчивых форм предлагается использовать следующие уровни селективных агентов: засухоустойчивых форм - 18% вес/объем ПЭГ (6000); солеустойчивых форм in vitro - 0,84% NaCl; кислотоустойчивых форм — рН 4,0.

Каллусные культуры яровой мягкой пшеницы на селективных средах предлагается использовать для скрининга генотипов данной зерновой культуры на физиологическую устойчивость к засухе и засолению почв.

В качестве селекционного материала при создании сортов рекомендуется использовать для возделывания на нейтральных и кислых почвах регенерант: РК(Минуса) 1-31-06; на засоленных - регенеранты: РС(Минуса)3.13.06, РС.КС-1607.1.21.06, РС.КС-1607.2.9.06.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата сельскохозяйственных наук, Ступко, Валентина Юрьевна, Красноярск

1. Амосова Н.В., Николаева О.Н., Сынзыныс Б.И. Механизмы алюмотолерантности у культурных растений // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология растений. 2007. №1. С. 36-42.

2. Арбузова И.Н. Влияние почвенной засухи на накопление и распределение основных элементов минерального питания в растениях яровой пшеницы // Продуктивность и устойчивость зерновых к засухе: бюллетень ВИУА. М.:ВИУА, 1990. №94. С. 17-22

3. Ахиярова Г.Р., Сабиржанова И.Б., Веселов Д.С., Фрике В. Участие гормонов в возобновлении роста побегов пшеницы при кратковременном засолении NaCl // Физиология растений. 2005. Т.52. №6. С. 891-896.

4. Ацци Дж. Сельскохозяйственная экология. М., 1959. В кн.: Емельянов Л.Г., Анкуд С.А. Водообмен и стресс-устойчивость растений. Минск: Навука i тэхшка, 1992. С.30.

5. Бардак Н.Н., Жук Б.Н., Стручалин М.С. Эффективность препарата силк // Земледелие. 2001. №1. С. 29-31.

6. Безднина С.Я. Рекомендации по оценке качества воды для орошения сельского хозяйства. М.: Наука, 1984. 120 с.

7. Бёзе С. Мало влаги, а пшеницы много! // Новое сельское хозяйство. 2005. № 6. С.46-48.

8. Белецкий Ю.Д., Шевякова Н.И., Карнаухов Т.Б. Пластиды и адаптация растений к засолению. Ростов-н/Д: Изд-во Ростовского унта, 1990. 48 с.

9. Березина В.Ю., Гурова Т.А. Автоматизированный комплекс измерительной аппаратуры для оценки устойчивости растений к стрессовым факторам среды // Достижения науки и техники АПК. 2006. №11. С. 15-17.

10. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Statistical статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М.: Филинъ, 1997. 592 с.

11. Бутенко Р.Г. Биотехнология растений: культура клеток. М.: Агропромиздат, 1989. 290 с.

12. Ведров Н.Г., Никитина В.И. Оценка исходного материала яровой пшеницы по экологической стабильности в условиях Сибири // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 1991. №2. С. 31-37.

13. Веселов Д.С., Шарипова Г.В., Кудоярова Г.Р. Сравнительное изучение реакции растений ячменя (Hordeum vulgaris) и пшеницы (Triticum durum) на кратковременное и длительное действие натрий-хлоридного засоления // Агрохимия. 2007. №7. С. 41-48.

14. Гладков Е.А. Биотехнологические методы получения растений, устойчивых к тяжелым металлам. 2. Получение растений, толерантных к ионам кадмия и свинца // Биотехнология. 2006а. №4. С. 87-92.

15. Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В., Гладкова О.В. Биотехнологические методы получения растений устойчивых к тяжелым металлам. 3. Клеточная селекция газонных трав, толерантных к ионам меди // Биотехнология. 20066. №5. С. 63-66.

16. Гончаров П.JI. Селекция растений в Сибири на адаптивность // Достижения науки и техники АПК. 2006. №1. С. 13-15.

17. Гордеева Т.Н. Селекцентры Сибири и их значение в развитии селекции сельскохозяйственных культур в регионе // Вестник ВОГиС. 2005. Т9. №3. С. 407-414.

18. Горышина Т.К. Фотосинтетический аппарат растений и условия среды. Л.: Изд-во ЛГУ, 1989. 204 с.

19. Гунес А., Инал А., Адак М.С., Багци Е.Г., Цицек Н., Ераслан Ф. Влияние засухи до и после зацветания растений нута на ряд физиологических параметров — возможных критериев засухоустойчивости // Физиология растений. 2008. Т.55. №1. С. 64-72.

20. Давыдов В. А. Количественные характеристики устьичного аппарата растений яровой пшеницы сорта Саратовская 29 при остром дефиците воды // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология растений. 2007. №5. С. 90-93.

21. Дмитриев В.Е. Экология и технология возделывания яровой пшеницы в Красноярском крае. Красноярск: Краснояр. гос. аграр. унт, 2005. 267 с.

22. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). 5-е изд., доп. и перераб. М.: Колос, 1985. 351 с.

23. Емельянов Л.Г., Анкуд С.А. Водообмен и стресс-устойчивость растений. Минск: Навука i тэхшка, 1992. 144 с.

24. Зайцев О.С. Неорганическая химия. 10 (11) класс. М.: АСТ-пресс школа, 2006. 512 с.

25. Зауралов О.А., Барышев В.Н., Жидкин В.И., Чернавина М.В. Физиологические основы устойчивости растений: курс лекций. Саранск: Изд-во Сарат. ун-та. Саран, фил., 1989. 44 с.

26. Зобова Н.В., Конышева Е.Н. Использование биотехнологических методов в повышении соле- и кислотоустойчивости ярового ячменя. Новосибирск: СО Россельхозакадемии, 2007. 124 с.

27. Зоз Н.Н. Химический мутагенез у высших растений и новые высокоактивные мутагены // Экспериментальный мутагенез. Прага: Издательство Чехословацкой Академии Наук, 1966. С. 317-335.

28. Иванов П.К. Высокие урожаи яровой пшеницы. М.: Колос, 1975. 392 с.

29. Иванченко В.М. Адаптивная реакция фотосинтеза на субклеточном уровне организации фотосинтетического аппарата // Регуляция функций мембран растительных клеток. Минск: Изд-во БГУ, 1979. С. 147-199.

30. Каталог сортов сельскохозяйственных культур, созданных учеными Сибири и районированных (включенных в Госреестр РФ) в 1929-1998 гг. 2-е изд., доп. Новосибирск: РАСХН. Сиб. отд-ние, 1999. 208 с.

31. Каталог сортов сельскохозяйственных культур, созданных учеными Сибири и включенных в Госреестр РФ (районированных) в 1929-2008 гг.: выпуск 4. В 2 томах. Т. 1. Новосибирск: Рос. акад. с.-х. наук. Сиб. регион, отд-ние, 2009. 208 с.

32. Князев Б.М., Хамоков Х.А. Фотосинтетическая деятельность и продуктивность сои в условиях недостаточного увлажнения // Зерновое хозяйство. 2005. №2. С. 17-18.

33. Коновалов Ю.Б., Шаймярдянов Н.А. Реакция на пинцеровку колоса как показатель засухоустойчивости сортов яровой пшеницы // Известия ТСХА. 2004. Вып.З. С. 45-53.I

34. Кононенко JI.A. Адаптивные свойства сортов мягкой озимой пшеницы по содержанию хлорофилла // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2004. №4. С. 19-21.

35. Кононенко Л.А., Пак Д.Н. Экологическая устойчивость сортов озимой пшеницы по содержанию белка в зерне // Зерновое хозяйство. 2005. №7. С. 22-23.

36. Кононенко Л.А., Пак Д.Н., Ситоленко С.А. Экологическая устойчивость сортов озимой пшеницы по содержанию каротиноидов в зерне // Зерновое хозяйство. 2005. №8. С. 23-25.

37. Косарева И. А. Методические указания по определению кислотоустойчивости зерновых культур. СПб: ВИР. 1995. 20 с.

38. Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б., Горбунова В.Ю. и др. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы: атлас / отв.ред. И.И. Шамров. М.: Наука, 2005. 99 с.

39. Кузнецов Вл. В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. Полиамины при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция // Физиология растений. 2006. Т.53. №5. С. 658-683.

40. Кузнецова С.А., Климачев Д.А., Якушкина Н.И. Изменение гормонального баланса пшеницы в зависимости от условий засоления NaCl и экзогенной обработки цитокининами // Агрохимия. 2005. №8. С. 29-33.

41. Курсакова B.C. Влияние многолетних трав на солевой режим засоленных почв // Земледелеие. 2005. №4. С. 10-11.

42. Лакин, Г. Биометрия. М.: Высш. шк., 1980. 290 с.

43. Ли М., Ван Г., Лин Ц. Кальций способствует адаптации культивируемых клеток солодки к водному стрессу, индуцированному полиэтиленгликолем // Физиология растений. 2004. Т.51. №4. С. 575581.

44. Лубнин А.Н. Селекция мягкой яровой пшеницы в Сибири. Новосибирск: РАСХН. Сиб. отд-ние. ГНУ СибНИИРС, 2006. 372 с.

45. Методические указания по изучению мировой коллекции ячменя и овса / под ред. В.Д. Кобылянского, А .Я. Трофимовской. 3-е изд., перераб. Л.: Всесоюз. НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, 1981. 32 с.

46. Мохамед A.M., Ралдугина Г.Н., Холодова В.П., Кузнецов Вл. В. Аккумуляция осмолитов растениями различных генотипов рапса при хлоридном засолении // Физиология растений. 2006. Т.53. №5. С. 732738.

47. Мутлу Ф., Бозкук С. Влияние засоления на содержание полиаминов и некоторых других соединений в различающихся по-солеустойчивости растениях подсолнечника // Физиология растений. 2005. Т.52. №1. С. 36-42.

48. Надежкина Е.В. Продуктивность и качество зерна яровой пшеницы в зависимости от кислотности почвы и обеспеченности минеральными и органическими элементами // Сельскохозяйственная биология. 2004. №1. С. 56-61.

49. Най П.Х., Тинкер П.Б. Движение раствора в системе почва-растение. М., 1980. В кн.: Емельянов Л.Г., Анкуд С.А. Водообмен и стресс-устойчивость растений. Минск: Навука i тэхшка, 1992. С.30.

50. Никитишен В.И., Личко В.И. Почвенно-агрохимические условия оптимизации водного режима растений // Доклады РАСХН. 2005. №5. С.20-24.

51. Ниловская Н.Т. Характеристика и влияние засух, свойственных Нечерноземью, на продуктивность и основные процессыжизнедеятельности зерновых культур // Продуктивность и устойчивость зерновых к засухе: бюллетень ВИУА. М.:ВИУА, 1990. №94. С. 3-13.

52. Полонский В.И., Грибовская И.В., Волкова Э.К. О разнокачественности семян пшеницы по способности к набуханию и прорастанию в растворах осмотика // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология растений. 2004. №5. С. 63-67.

53. Поползухина Н.А., Рутц Р.И. Индуцированный мутагенез и гибридизация в решении проблемы качества зерна яровой мягкой пшеницы // Доклады РАСХН. 2006. №3. С.3-4.

54. Практикум по растениеводству: учеб. пособие / Н.Г. Ведров, Е.Т. Загородняя, Е.М. Нестеренко, И.Н. Фролов / под ред. Н.Г. Ведрова; Красноярск: Изд-во Краснояр. ун-та, 1992. 384 с.

55. Пыльнев В.В., Букина С.Н., Аканов Э.Н. Фотосинтетическая реакция сортов ярового ячменя на действие водного стресса // Известия ТСХА. 2006. Вып.З. С.29-35.

56. Рапопорт И. А. Карбонильные соединения и химический механизм мутаций // ДАН СССР. 1947. Т.58. №1. С. 119-124.

57. Рекославская Н.И. Адаптационные изменения в белковом и аминокислотном обмене у растений в условиях водного стресса // Стрессовые белки растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1989. С. 113-142.

58. Рекославская Н.И., Гамбург К.З., Маркова Т.А. Влияние водного дефицита на содержание триптофана и его производных в листьяхрастений II Рост и устойчивость растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1988. С. 183-189.

59. Рутц Р.И. Научные основы и практические результаты селекции яровой пшеницы и озимых мятликовых культур в Западной Сибири. Новосибирск: РАСХН. Сиб. отд-ние. ГНУ СибНИИРС, 2005. 624 с.

60. Садат-Нури С.А., Сохансанж А. Растения пшеницы, содержащие ген осмотина, проявляют повышенную способность к образованию корней при высоких концентрациях NaCl // Физиология растений. 2008. Т.55. №2. С. 279-282.

61. Семеняк Н.С. Засуха и неурожай без знака равенства // Агромир Черноземья. 2007. №8. С. 38-39.

62. Семина С.А., Мачнева В.В. Урожай и качество зерна яровой мягкой пшеницы в зависимости от сорта // Зерновой хозяйство. 2005. №3. С. 23-24.

63. Серегина И.И., Ниловская Н.Т., Обуховская Л.В., Верниченко И.В. Влияние доз азота и обработки семян цинком на продуктивность яровой пшеницы при различной водообеспеченности // Агрохимия. 2005. №6. С. 54-58.

64. Соболева М.И., Логинов И.В. Статистические характеристики, маркирующие морфогенез в каллусных культурах яровой пшеницы // Физиология растений. 2004. Т. 51. №2. С. 287-296.

65. Сорокин О. Д. Прикладная статистика на компьютере. Краснообск: ГУП РПО СО РАСХН, 2004. 162 с.

66. Строгонов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений при разнокачественном засолении. М.: Наука, 1962. 366 с.

67. Строгонов Б.П., Кабанов В.В., Шевякова Н.И. Структура и функция клеток растений при засолении. Новые подходы к изучению солеустойчивости. М.: Наука, 1970. 318 с.

68. Сынзыныс Б.И., Рухляда Н.Н. Роль органических кислот в снижении фитотоксического действия алюминия на некоторые сорта российских пшениц // Вестник РАСХН. 2004. №3. С. 42-45.

69. Таланова В.В., Таланов А.В., Титов А.Ф. Динамика фотосинтеза и транспирации проростков огурца в начальный период хлоридного засоления и при действии фитогормонов // Доклады РАСХН. 2006а. №2. С. 10-13.

70. Таланова В.В., Топчиева JI.B., Титов А.Ф. Влияние абсцизовой кислоты на устойчивость проростков огурца к комбинированному действию высокой температуры и хлоридного засоления // Известия РАН. Серия Биологическая. 20066. №6. С. 757-761.

71. Танделов Ю.П., Ерышова О.В. Состояние плодородия кислых почв Приенисейской Сибири, эффективность минеральных удобрений и химических мелиоратов. М.: Изд-во МГУ, 2001. 115 с.

72. Танделов Ю.П., Ерышова О.В. Особенности кислых почв Красноярского края и эффективность известкования: учеб. пособие. Красноярск: Краснояр. гос. аграр. ун.-т, 2003. 147с.

73. Танделов, Ю.П. Плодородие почв и эффективность удобрений в Средней Сибири. М.: Изд-во МГУ, 1998. 302с.

74. Технология целлюлозно-бумажного производства: справочные материалы/ под ред. П. С. Осипова. СПб: Политехника, 2003. 253 с.

75. Третьяков Н.Н., Аканов Э.Н., Кондратьев Н.В., Клочкова Н.М. С02-газообмен яровой пшеницы при изменении осмотического давления в корневой зоне (имитация почвенной засухи) // Известия ТСХА. 2004. Вып.1. С. 48-54.

76. Троязыков Д.Л., Каменьков А.В. Агроклиматические и агротехнические факторы выращивания яровой пшеницы в Восточной Сибири // Вестник РАСХН. 2004. №4. С. 48-51.

77. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. Л.: Колос, 1977. 215 с.

78. Удовенко Г.В., Олейманова Т.В., Кожушко Н.Н. и др. Методика диагностики устойчивости растений (засухо-, жаро-, соле- и морозоустойчивости). Л.: ВИР, 1974. 74 с.

79. Ушаков Р., Костин Я., Зубец А., Дагаргулия К., Асеев В. Эдафический фактор устойчивости почв к подкислению // Международный сельскохозяйственный журнал. 2005. №2. С. 63-64.

80. Ушаков Р.Н., Косорукова Т.Ю. Повышение устойчивости зерновых культур к почвенной засухе при использовании калийных удобрений // Известия ТСХА. 2004. Вып.З. С. 63-66.

81. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Н.Н. Третьяков, Е.И. Кошкин, Н.М. Макрушин и др. / под ред. Н.Н. Третьякова. 2-е изд. М.: КолосС, 2005. 656 с.

82. Фридт В. Генная инженерия: возможности и ограничения // Новое сельское хозяйство. 2005. № 1. С. 62-65.

83. Хлебникова Т.Д., Хусаинов М.А., Шакирова Ф.М., Хлебникова И.В. Оценка влияния препарата фэтил на рост и гормональный статус проростков пшеницы // Успехи современного естествознания. 2007. №2. С. 76-77.

84. Хлоп M.JI. Проблема экспериментального получения мутаций у растений под влиянием Х-лучей // Тр. по прикл. ботан., генет. и селекции. Сер. А. Соц. раст. 1936. № 18. С. 149-159.

85. Чанышева К.В. Ростстимулирующее и антистрессовое действие препарата Фэтил на растения пшеницы: дис. . канд. биол. наук. М.: ПроСофт-М, 2005. 126 с.

86. Чекалин С.В. Водный баланс и состояние растений. Алма-Ата: Наука, 1987. 168 с.

87. Чертовицкий А.С., Базаров А.К. Вопросы платного водопользования // Аграрная наука. 2005. №11. С. 18-21.

88. Шаманин В.П. Селекция яровой мягкой пшеницы для засушливых условий Западной Сибири и Южного Урала: автореф. дис. д-ра с.-х. наук. Новосибирск, 1994. 34 с.

89. Шевелуха B.C., Гончаров П.Л., Сечняк Л.К., Кривченко В.И., Ишин А.Г. Биологические резервы селекции на засухоустойчивость //

90. Обеспечение устойчивого развития сельскохозяйственного производства и борьба с засухой: по материалам сессии ВАСХНИЛ (Волгоград, 26-28 мая 1987 г.). М.: Агропромиздат, 1988. С. 151-173.

91. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. / под ред. B.C. Шевелухи. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 2003. 469 с.

92. Шевякова Н.И. Полиамины, рост и адаптация растений к стрессам // Рост и устойчивость растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1988. С. 168-175.

93. Широких И.Г., Абубакирова Р.И., Карпова Е.М., Кучин А.В. Оценка Na-солей суммы тритерпеновых кислот Abies sibirica L. в качестве регуляторов роста и стресспротектора яровой пшеницы // Агрохимия. 2007. №1. С. 52-56.

94. Экологическая биофизика: учебное пособие. В 3 т. / под ред. И.И. Гительзона и Н.С. Печуркина. Т. 1. Фотобиофизика экосистем. М.: Логос, 2002. 360 С.

95. Засуха в России погубила 20 млрд рублей Электронный ресурс. // BFM.ru: ежеден. интернет-изд., 2009. 8 сент. URL: http://www.bfm.ru/articles/2009/09/08/zasuha-v-rossii-pogubila-20-mlrd-rublej.html (дата обращения 10.10.2009).

96. Каталог продукции ЗАО «Омскреактив» Электронный ресурс. URL: http://www.omskreaktiv.ru/index.php7menu-4 (дата обращения 15.05.2009).

97. Adkins S.W., Kunanuvatchaidach R., Godwin I.D. Somaclonal variation drought tolerance and other agronomic chaeacters // Australian Journal of Botany. 1995. V.43. P. 201-209.

98. Ahloowalia B.S., Maluszynski M. Induced mutations A new paradigm in plant breeding // Euphytica. 2001. V. 118. P. 167-173.

99. Ahmad A., Zhong H., Wang W., Sticklen M. Shoot apical meristem: in vitro regeneration and morphogenesis in wheat (Triticum Aestivum L.) // In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2002. V.38. P. 163-167.

100. Almansouri M., Kinet J.-M., Lutts S. Effect of salt osmotic stress on germination in durum wheat (Triticum durum Desf.) // Plant and Soil. 2001. V.231.1.2. P.243-254.

101. Bajji M., Kinet J.-M., Lutts S. The use of electrolyte leakage method for assessing cell membrane stability as a water stress tolerance test in durum wheat // Plant Growth Regulation. 2002. V.36. P.61-70.

102. Bajji M., Bertin P., Lutts S., Kinet J.-M. Evaluation of drought-resistance-related traits in durum wheat somaclonal lines selected in vitro // Australian Journal of Experimental Agriculture. 2004. V.44. P.27-35.

103. Bakarat M.N., Abdel-Latif Т.Н. In vitro selection of wheat callus tolerant to high levels of salt and plant regeneration // Euphytica. 1996. V.91.I.2. P.127-140.

104. Benkirane H., Sabounji K., Chlyah A., Chlyah H. Somatic embryogenesis and plant regeneration from fragments of immature inflorescence and coleoptiles of durum wheat // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2000. V.61. P. 107-113.

105. Bertin P., Bouharmont J., Kinet J.-M. Somaclonal variation and improvement in chilling tolerance in rice: changes in chilling-induced electrolyte leakage // Plant Breeding. 1996. V.l 15. P.268-272.

106. Birsin M. A., Ozgen M. A. Comparison of callus induction and plant regeneration from different embryo explants of triticale (x Triticosecale Wittmack) // Cellular & Molecular Biology Letters. 2004. V.9. P.353-361.

107. Blum A., Ebercon A. Cell membranes stability as measure of drought and heat tolerance in wheat // Crop Science. 1981. V.21. P.43-47.

108. Das A., Gosal S.S., Sidhu J.S., Dhaliwal H.S. Induction of mutations for heat tolerance in potato by using in vitro culture and radiation // Euphytica. 2000. V.l 14. P.205-209.

109. Del Zoppo M., Galleschi L., Onnis A., Pardossi A., Saviozzi F. Effect of salinity on water relations, sodium accumulation, chlorophyll content and proteolic enzymez in wild wheat // Biologia plantarum. 1999. V.42.1.1. P.97-104.

110. Dencic S., Kastori K., Kobiljski В., Duggan B. Evaluation of grain yield and its components in wheat cultivates and landraces under near optimal and drought conditions // Euthytica. 2000. V.l 13. P. 43-52.

111. Djilianov D., Dragiiska R., Yordanova R., Doltchinkova V., Yordanov Y., Atanassov A. Physiological changes in osmotically stresseddetached leaves of alfalfa genotypes selected in vitro // Plant Science. 1997. V.129. P.147-156.

112. Dokuyucu Т., Akkececi S., Akkaya A., Kara R. Investigation of the response of bread wheat cultivars to salinity by using callus culture // J. Environ. Biol. 2005. V.26.1.2. P.251-255.

113. Dorffling K., Dorfling H., Lesselich G. In vitro selection and regeneration of hydroxyproline-resistant lines of winter wheat with increased proline content and increased frost tolerance // Journal of Plant Physiology. 1993. V.142. P.222-225.

114. El-Hannawy M.A. Salt tolerance in wheat using tissue culture techniques //Ann. Agr. Sci. 1996. V.41. P.785-803.

115. El-Shintinawy F. Photosynthesis in two wheat cultivars differing in salt susceptibility// Photosynthetica. 2000. V.38.1.4. P.615-620.

116. Farooq S., Azam F. Co-existence of salt and drought tolerance in Triticeae // Hereditas. 2001. V. 135.1.2-3. P.205-210.

117. Flowers T.J. Improving crop salt tolerance // J. Exp. Bot. 2004. V.55. P.307-319.

118. Foy C.D., Bums G.R., Brown J.C., Fleming A.L. Differential aluminum tolerance of two wheat varieties associated with plant-induced pH changers around their roots // Soil Science Society of America Proceedings. 1965. V.29. P.64-67.

119. Fukutoku G., Yamada Y. Sources of proline-nitrogen in water-stressed soybean (Glycine max.). II. Fate of /15 N/-labelled protein // Ibid. 1984. V.61.1.4. P.622-628.

120. Gulnaz A., Iqbal J., Farooq S., Azam F. Seed treatment with growth regulators and crop productivity. I. 2,4-D as an inducer of salinity tolerance in wheat (Triticum aestivum L.) // Plant and Soil. 1999. V.210. 1.2. P.209-218.

121. Gulyaeva E.M., Mashkina O.S., Sivolapov A.I. Variability in poplar induced by chemical mutagens // Soviet genetics. 1984. V.20. 1.4. P.495-503

122. Hsissou D., Bouharmont J. In vitro selection and characterization of drought-tolerant plants of durum wheat (Triticum durum Desf.) // Agronomie. 1994. V.2. P.65-70.

123. Ни Y., Fromm J., Schmidhalter U. Effect of salinity on tissue architecture in expanding wheat leaves // Planta. 2005. V.220. P.838-848.

124. Iqbal M., Ashraf M., Jamil A. Seed enhancement with cytokinins: changers in growth and grain yield in salt stressed wheat plants // Plant Growth Regulation. 2006. V.50.1.1. P.29-39.

125. Iser M., Fettig S., Scheyhing F., Viertel K., Hess D. Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential // J. Plant Physiol. 1999. V.154. P.509-516.

126. Jain S.M. Tissue culture-derived variation in crop improvement // Euthytica. 2001. V. 118. P. 153-166.

127. Kafi M., Stewart S., Borland A.M. Carbohydrate and praline contents in leaves, roots and apices of salt-tolerant and salt-sensitive wheat cultivars // Russian journal of plant physiology. 2003. V.50.1.2. P.155-162.

128. Kendell E.J., Qureshi J.A., Kartha K.K., Leung N., Chevrier N., Caswell K., Chen T.H.H. Regeneration of freezing-tolerant spring wheat (Triticum aestivum L.) plants from cryoselected callus // Plant Physiol. 1990. V.94. P. 1756-1762.

129. Kidd P.S., Proctor J. Why plants grow poorly on very acid soils: are ecologists missing the obvious? // Journal of experimental botany. 2001. V.52.1.357. P.791-799.

130. Kochian L.V., Hoekenga O.A., Pineros M.A. How do crop plants tolerate acid soils? Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency // Annual Review of Plant Biology. 2004. V.55. P.459-493.

131. Larkin P.J., Scowcroft W.R. Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for plant improvement // Theoretical and Applied Genetics. 1981. V.60. P. 197-127.

132. Lerner H.R. Adaptation to salinity at the plant cell level // Plant and Soil. 1985. V.89.1.1-3. P.3-14.

133. Lu D.B., Sears R.G., Paulsen G.M. Increasing stress resistance by in vitro selection for abscisic acid insensitivity in wheat // Crop Science. 1989. V.29. P.939-943.

134. Lutts S., Almansouri M., Kinet J.-M. Salinity and water stress have contrasting effects on the relationship between growth and cell viability during and after stress exposure in durum wheat callus // Plant science. 2004. V.167. P.9-18.

135. Maas E.V., Poss J.A. Salt sensitivity of wheat at various growth stages // Irrigation Science. 1989. V.10.1.1. P.29-40.

136. Mansour M.M.F., Salamaa K.H.A., Mutawah M.M.A1. Transport proteins and salt tolerance in plants // Plant Science. 2003. V.164. 1.6. P. 891-900.

137. Menke-Milczarek I., Zimny J. NH4+ and N03~ requirement for wheat somatic embryogenesis // Acta Physiol. Plant. 2001. V.23. P.37-42.

138. Murray F.R., Hill A., Appels R., Brettell R.I.S. Transformation of australian wheat cultivars // Proceedings of 9th International Wheat Genetics Symposium (Saskatoon, Saskatchewan, Canada, 2-7 Augast). 1998. P.159-162.

139. Mwanamwenge J., Loss S.P., Siddique K.H.M., Cocks P.S. Effect of water stress during floral initiation, flowering and podding on the growth and yield of faba bean (Vicia faba L.) // Eur. J. Agron. 1999. V. 11. P. 1 -11.

140. Premachandra G.S., Shimada T. Evaluation of polyethylene glycol test of measuring cell membrane stability as a drought tolerance test in wheat// Journal of Agricultural Sciences, Cambridge. 1988. V.110. P.429-433.

141. Rus A.M., Rios S., Olmos E., Santa-Cruz A., Bolarin M.C. Long-term culture modifies the salt response of callus lines of salt-tolerant and salt-sensetive tomato species // J. Plant. Physiol. 2000. V.157. P.413-420.

142. Sairam R.K., Srivastava G.C., Agarwal S., Meena R.C. Differences in antioxidant activity in response to salinity stress in tolerant and susceptible wheat genotypes // Biologia Plantarum. 2005. V.49. 1.1. P.85-91.

143. Sparks C., Rasco-Gaunt S., Riley A., Barcelo P., Lazzeri P.A. Development of tranformation systems for current wheat varieties // Proceedings of 9th International Wheat Genetics Symposium (Saskatoon, Saskatchewan, Canada, 2-7 Augast). 1998. P.212-214.

144. Tang С., Asseng S., Diatloff E., Rengel Z. Modelling yield losses of aluminium-resistant and aluminium-sensitive wheat due to subsurface soil acidity: effects of rain fall, liming and nitrogen application // Plant and Soil. 2004. V.254. P.349-360.

145. Taylor G.J., Foy Ch. D. Mechanisms of aluminum tolerance in Triticum aestivum L. (wheat). I. Differential pH induced by winter cultivars in nutrient solutions // Amer. J. Bot. 1985. V.72.1.5. P.695-701.

146. Taylor H.M. Postponement of severe water stress in soybeans by rooting modifications: a progress report // World soybean res. Conf. 2. 1979. Proc. London, 1980. P.161-178.

147. Timm D.A., Waskom R.M., Miller D.R., Nabos M.W. Greenhouse evaluation of regenerated spring wheat for enhanced salt tolerance // Cereal Research Communication. 1991. V. 19. P.451-457.

148. Urbanski T. Chemistry and Technology of Explosives. Vol. 2. New York: Pergamon Press . Oxford, 1965. 480 p.

149. Varshney A., Altpeter F. Satble transformation and tissue culture response in current European winter wheats (Triticum aestivum L.) // Molecular Breeding. 2001. V.8. P.295-309.

150. Zairl I., Chlyah A., Sabounji K., Tittahsen M., Chlyah H. Salt tolerance improvement in some wheat cultivars after application of in vitro selection pressure // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. V.73. 1.3. P.237-244.

151. Zale J.M., Bochardt-Wier H., Kidwell K.K., Steber C.M. Callus induction and plant regeneration from mature embryos of a diverse set of wheat genotypes // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2004. V.76. P.277-281.

152. Zair I., Chlyah В., Chlyah H. Effect de deux etraits biologique sur Tembryogenese somayique et sur la retention de capacites de regeneration chez les cals de ble (Triticum aestivum) // Can. J. Bot. 1995. V.73. P.498-504.