Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация методов получения антигенного материала и поликлональных антител для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации эндомикоризных грибов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация методов получения антигенного материала и поликлональных антител для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации эндомикоризных грибов"

с ,

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ.

На правах рукописи

РГБ ОД

КОЗЛОВА Наталия Валерьевна

1 8 Д-К т

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО МАТЕРИАЛА И ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНДОМИКОРИЗНЫХ ГРИБОВ

УДК 579.64:631.46

Специальность 03. 00.07. - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик

РАСХН Муромцев Георгин Сергеевич

Научный консультант: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Струпникова Ольга Ковдратьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Громов Борис Васильевич, кандидат биологических наук Козлов Леонид Петрович

Ведущее учреждение: Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН

Защита состоится » декабря 2000 г. в час. (^С? мин, на заседании Специализированного совета К 020.26.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском инсттуте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 196608, Санкт-Петербург, Пушкин 8, шоссе Подбельского, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСХМ.

Автореферат разослан « » ноября 2000 года

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Зарецкая

В ОМ, О Е Ш в 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Симбиоз с эндомикоризными грибами (арбускулярно-микоризными грибами, АМГ) приводит к улучшению минерального питания растений, увеличивает их устойчивость к фитопатогенам и другим стрессовым воздействиям, а также способствует выводу из почвы солей тяжелых металлов и радионуклидов. Отсутствие методов надежной идентификации АМГ и сложность их культивирования без растения-хозяина являются серьезными препятствиями для изучения этих микроорганизмов, в том числе, оценки их биоразнообразия. Систематика АМГ основана на морфологических критериях (Trappe, 1982; Walker, 1992), весьма неоднозначных вследствие моднфикационной изменчивости морфологических признаков и внутривидовых вариаций (Morton, 1988).

Иммунохимические методы привлекательны для решения задач идентификации и систематики благодаря специфичности реакции антиген - антитело. Для изучения АМГ с помощью иммунохимических методов важными задачами являются получение специфичных антител и выбор метода, адекватного для решения поставленных задач. Получение антител к водорастворимым белкам АМГ целесообразно ввиду их видоспецифичности и способности индуцировать строгай иммунный ответ. Использование иммуноэлектрофореза и поликлональных антител перспективно для оценки биоразнообразия АМГ и степени их родства, так как позволяет оценить полиморфизм сразу нескольких белковых антигенов.

Для получения поликлональных антител и проведения иммуноэлектрофоретического анализа необходимо значительное количество белкового антигена АМГ, свободного от растительных примесей. Однако, низкое процентное содержание белка в структурах этих грибов и невозможность нарастить существенное количество их биомассы

без растения-хозяина затрудняют получение достаточного количества антигена.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - получить поликлональные антитела к водорастворимым белкам эндомикоризного гриба и использовать их для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации АМГ. Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизировать метод очистки везикул АМГ от растительных тканей.

2. Оптимизировать процесс подготовки белкового антигена к иммунизации.

3. Предложить схему иммунизации для получения активных поликлональных сывороток к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба

4. Проанализировать полиморфизм водорастворимых белковых антигенов нескольких видов АМГ.

Научпая новизна работы. Предложен способ получения поликлональных антител к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба Glomus intraradices. Оптимизирован метод получения белковых антигенов АМГ, свободных от растительных примесей. Предложена совокупность приемов подготовки антигена к иммунизации, позволяющая существенно увеличить концентрацию и иммуногенность белков эндомикоризного гриба Впервые методом двумерного иммуноэлектрофореза проанализирован полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов. Показано наличие семи перекрестно реагирующих антигенов для G.intraradices и G.species и пяти таких антигенов для G.intraradices и G.constrictum. Три антигена были обнаруженных только у G.intraradices. Рассмотренные подходы позволяют

изучать биоразнообразие и проводить идентификацию АМГ на качественно новом уровне.

Практическая пеппость работы. Получены поликлональные антитела, позволяющие изучать поведение и развитие С?. Шгагас11се^ в условиях модельных опытов,- приближенных к естественным. Идентификация специфичных антигенов методом иммуноэлектрофореза может быть использована для контроля чистоты биопрепарата на основе С. ШгсггаЖсея штамма 7 и мониторинга при его использовании. Предложенные методы очистки структур эндомикоризных грибов от растительных примесей, подготовки антигенного материала к иммунизации и получения поликлональных антител к С. \n\raradices штамму 7 открывают перспективы для получения антител к другим видам АМГ.

Публикации я апробация работы. Материалы диссертации были изложены на второй международной конференции по микоризе (Упсала, Швеция, 1998), конференции «Проблемы микологии на рубеже веков» (Москва, 2000), Докучаевских молодежных чтениях 2000 «Почвы и биоразнообразие» (Санкт-Петербург), международной конференции «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность» (Санкт-Петербург, 2000). По материалам диссертации опубликовано три работы и две работы принято к публикации.

Структура и объем диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материатов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит восемь таблиц, 11 рисунков. Список использованной литературы включает 149 наименований, в том числе 138 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы грибов н условия культивирования. Glomus inrraradices штамм 7 Schenck and Smith (S7) был выделен из почв Ленинградской области, идентифицирован и охарактеризован как высокоэффективный симбионт, способствующий увеличению урожая сельскохозяйственных растений, в лаборатории почвенной микологии ВНИИСХМ (Муромцев и др., 1985). В работе также использованы следующие изоляты эндомикоризных грибов: G.constrictum Trappe (S44, институт полуаридного земледелия, Индия), G.fasciculatum (Thaxter sensu Gerdemann) Gerdemann and Trappe (S38, Dr. Lee, Новая Зеландия), G.mosseae Gerdemann and Trappe (S2, Ротамстедская опытная станция, Великобритания), Gigaspora margarita Becker and Hall (SI62) и G.albidum Walker and Rhodes (SI05) (Dr. Cudlin, институт микробиологии Академии Наук Чехии). Культуры эндомикоризных грибов поддерживали в корнях растения Plectranthus australis R. Вг. в сосудах емкостью 1 кг. В качестве субстрата использовали стерильную смесь дерново-подзолистой почвы и промытого кварцевого песка в объемном соотношении 3:1 (рН 6,2; содержание N; Р205 и К20: 1,82; 20 и 10 мг на 1 кг субстрата соответственно). В качестве инокулюма использовали почвенно-корневую смесь из сосудов с коллекционными культурами, которые являлись моноспоровыми производными указанных изолягов. Инокулюм вносили в количестве 50 г на 1,5 кг субстрата.

Штаммы немикоризных почвообигающих грибов: Sclerotinia sp., Trichoderma sp., Gliocladium sp., Paecilomyces sp.. Penicilliwn sp., Pythium sp., Mucor sp., Wardomwes sp.. были получены из коллекции ВНИИСХМ и поддерживались на агаризованой среде Чапека - Докса (Singleton et al. 1992).

Получение п поддержание культур Ш-трапсформнрованпых корней и установление эндомикоркчпого симбиоза in vitro. В качестве

растительного партнера для установления эндомикоризного симбиоза in vitro использовали корни, полученные в результате трансформации Ri-плазмидами Agrobacterium rhizogenes (штамм 8196) стерильно выращенных растений гороха (Pisum sativum L, cv. Sparkle), табака (Nicotiana tabacum L., сорт «Трапезунд-285») и картофеля (Solanum tuberosum L., сорт «Весна белая»). Трансформированные корни поддерживали на среде MS (Murashige and Skoog, 1962). Для элиминации A.rhizogenes первые три пассажа трансформированных корней проводили на среде MS с клафораном (500 мкг/мл). Для установления симбиоза G.intraradices и культур трансформированных корней использовали минимальную среду M (Becard and Fortin, 1988). Выделенные из микоризованных корней везикулы поверхностно стерилизовали 1 % раствором диоцида и помещали на среду M для прорастания. Через одни -трое суток к везикулам помещали трансформированные корни длиной 3-5 см с несколькими боковыми корнями или их зачатками, располагая последние в непосредственной близости от везикул. Формирование симбиоза происходило в темноте при 20 °С. Отбор проб производили на 60 сутки.

Определение степени мпкоризпой колопюаиип корией. Для

окрашивания микоризованных корней и определения степени колонизации использовали метод Крюгер с соавторами (1968). Степень колонизации определяли как отношение суммарной длины микоризованных участков к общей длине корней образца, выраженное в процентах. Сравнительную оценку этого параметра проводили с использованием стандартных статистических методов (Глотов и др., 1982).

Получение иммунной сыворотки н оценка активности антител. Иммунную сыворотку получали в процессе иммунизации кролика породы шиншилла. Схема иммунизации включала девять подкожных инъекций водорастворимыми белкам G.intraradices, Иммуноглобулины выделяли из

полученной сыворотки высаливанием сульфатом аммония с последующей очисткой ионообменной хроматографией на колонке с сефадексом DEAE А-50 (Harboe and Ingild, 1983). Очищенную фракцию иммуноглобулинов концентрировали диатезом (+4 "С. 8 ч) в растворе 0,1 М NaCl, 15m М NaN3, 20 % (вес/объем) полиэтиленгликоль 20000 и лиофильно высушивали. Для оценки активности сыворотки и антител использовали метод им.\гунодиффузии в 1 % агарозном геле на предметных стеклах (Гусев, Цветков, 1961).

Определение специфичности антител к поверхностным антигенам. Специфичность антител к поверхностным антигенным детерминантам эндомикоризных и других почвообитающих грибов определяли с помощью метода непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания, используя в качестве флуоресцентной метки флуоресцеин изотиоцнанат натрия (FITC), ковачентно связанный с антикроличьими иммуноглобулинами (Weiler and Coons, 1954). Дтя проверки специфичности полученных антител к поверхностным антигенам мицелия эндомикоризных грибов выделенные из корней везикулы проращивали в почве на стерильных нитроцеллюлозных мембранных фильтрах, помещенных в мешочек из нейлонового сита (диаметр пор 200 мкм). Фильтры размещали в непосредственной близости от корней P.australis, инкубирование проводили в течение 10 суток.

Анализ аптигениых структур. Анализ антигенных структур, распознаваемых полученными антителами, а также анализ полиморфизма белковых антигенов нескольких видов эндомикоризных грибов проводили методом двумерного иммуноэлектрофореза (Вееке, 19776) в веронат-ацетагном буфере (pH 8.6: ц 0,02). Градиенты потенциалов первого и второго иммуноэлектрофоретического разделения составляли 4 В/см2 и 1 В/см2 соответственно. Образующиеся преципитаты окрашивали раствором кумасси ярко-синего R-250 (Вееке 1977а). Каждый иммуноэлектрофорез

повторяли три-четыре раза, полученные результаты сравнивали, накладывая пластины друг на друга. Пики преципитации идентифицировали, сравнивая их по относительному' расположению в геле, интенсивности и высоте.

Идентификация изолята АМГ по морфологическим признакам. Идентификацию АМГ проводили, сравнивая морфологические и ультраструктурные характеристики изолята с описаниями определителя (Schenck and Pérez, 1988). Для получения спор использовали метод мокрого просеивания (Зольникова и Воробьев, 1992). Ультраструктурные особенности спор анализировали по электронным микрофотографиям срезов, выполненным в лаборатории электронной микроскопии ВНИИСХМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО МАТЕРИАЛА.

Для достижения поставленной цели, прежде всего, необходимо было решить проблему получения значительного количества биомассы эндомикоризного гриба свободной от растительных примесей. Для этого были использованы два подхода: оптимизация метода очистки относительно богатых белком везикул от корней P.australis и совместное выращивание выбранного штамма с культурами Ri- трансформированных корней на питательной среде.

Оптимизация метода очистки везикул эпдомякорнзных грибов от корней P.australis. Предложенные ранее методы не позволяли получить удовлетворительные результаты очистки везикул используемых штаммов АМГ от корней P.australis. Поэтому', для очистки везикул бьи предложен метод, основанный на центрифугировании суспензии микоризованных корней в ступенчатом градиенте сахарозы. В ходе исследования было

экспериментально установлено время дезинтеграции корней, определена оптимальная для очистки густота суспензии, параметры градиентного центрифугирования и концентрации слоев градиента. В результате был предложен следующий метод очистки везикул.

Микоризованные корни одного - двух растений P.australis подвергали легкой мацерации в растворе 0,25 М NaHC03, 3 % глюкозы в течение 4 часов и измельчат в механическом дезинтеграторе до состояния суспензии. Полученную суспензию фильтрован! через нейлоновое сито с диаметром пор 200 мкм и осаждали фильтрат на сито с диаметром пор 40 мкм. Осадок разбавляли водой до достижения значения оптической плотности суспензии равного 0,3 при длине волны проходящего пучка света 620 нм. Суспензию наносили поверх ступенчатого градиента сахарозы и центрифугировали (300-g, 12 мин). Концентрации слоев градиента составляли 60, 50, 40 и 10 массовых %. После центрифугирования фракцию 10 % сахарозы осторожно отбирали и дополнительно очищачи фильтрацией через сита с диаметром пор 200 и 90 мкм. Очищенные везикулы осаждали на сито с диаметром пор 40 мкм при помощи водоструйного насоса подсушивали на воздухе, взвешивали и хранили при температуре минус 20 °С.

Данный подход был применен для очистки везикул нескольких видов эндомикоризных грибов. Содержание примесей в материале очищенных везикул не превышало 5-10 %. Биомасса очищенных подсушенных на воздухе везикул, получаемая за один рабочий день, составляла 40-200 мг в зависимости от степени микоризации растений. Очищенные везикулы сохраняли жизнеспособность и нативность структуры, что позволяло использовать их и для выделения белка, и для инокуляции трансформированных корней.

Совместное культивирование Glomm intraradices штамма 7 a Ri-трапсформировапных корчей. Для решения проблемы получения

биомассы G.intraradices штамма 7, необходимой для иммунизации, была также проанализирована возможность использования культур Ri-трансформированных корней. Так как этот штамм не способен к образованию спор, то для инокуляции культур корней использовались везику лы, выделенные по описанной выше методике.

Поскольку известные методы поверхностной стерилизации спор и участков микоризованных корней оказались неэффективными для везикул G.intraradices, были экспериментально подобраны параметры обработки везикул диоцидом. Везикулы помещали в 0,05 % раствор Твин-20 и встряхивали на шейкере (Micro-shaker type 326 М, «Premed», Польша) в течение минуты. Затем добавляли 1 % раствор диоцида и в течение 15 минут продолжали встряхивание. После этого везикулы пятикратно промывали стерильной водой и высевали на среду М в виде капель, каждая из которых содержала по 10-20 везикул. Предложенный метод стерилизации позволит устранить посторонние микроорганизмы, сохраняя при этом способность везикул к прорастанию и установлению симбиоза

Чтобы выбрать оптимального растительного партнера для наращивания биомассы АМГ, культуры Rj-трансформированных корней гороха, табака и картофеля сравнивали по интенсивности роста на среде М и частоте колонизации корней G.intraradices штамм 7. Для оценки частоты микоризной колонизации использовали понятие «экспериментальная единица», под которым понимали Ri-трансформированный корень, помещенный вблизи капли поверхностно-стерильных везикул, и его соматическое потомство. Наибольшей частотой колонизации и наиболее интенсивным ростом на среде М обладали корни картофеля (табл. 1).

Внедрение гиф в Ri-трансформированные корни картофеля и формирование эндомикоризных структур было обнаружено в 100 % случаев, как при горизонтальном, так и при вертикальном инкубировании чашек Петри.

Таблица 1

Колонизация G.intraradices Ri-трансформированных корней гороха, табака н картофеля

Растение Количество экспериментальных единиц

всего с микоризой

Табак Горох Картофель 7 3 15 3 19 19

Это говорит о возможном таксисе у прорастающих гиф по отношению к корню.

После прорастания везикул G.intraradices и проникновения гиф в Ri-трансформированные корни гороха, табака и картофеля на небольших отрезках корней наблюдалось образование характерных эндомикоризных структур: мицелия, арбускул и везикул; для корней картофеля в ряде случаев наблюдалось также образование спор. Распространения эндомикоризного гриба в корне в условиях in vitro не наблюдалось.

В целях поиска путей увеличения количества структур гриба, формирующихся внутри корня in vitro, мы сравнили степень колонизации корней картофеля, адаптированных и неадаптированных к росту на среде для установления симбиоза Адаптированными считались корни картофеля, прошедшие пассаж (15 суток) на среде М и способные интенсивно расти на этой среде. Степень колонизации адаптированных и неадаптированных корней картофеля была низкой (табл.2). Сравнительная статистическая оценка степени колонизации методом Хи-квадрат показала отсутствие различий для адаптированных и неадаптированных культур (Х2эксп-=2,096; х2теор-= 7,815). Тем не менее, образование спор было обнаружено лишь в неадаптированных культурах, в то время как формирование мицелия, везикул и арбускул наблюдалось как в

адаптированных, так и в неадаптированных корнях. Отсутствие спорообразования в корнях, адаптированных к росту в условиях дефицита фосфатов, углеводов и ионов натрия, достаточно любопытно, учитывая, что исходно & ШгагасИсез штамм 7 обладал способностью к споруляции, но постепенно утратил ее. Возможно, образование спор гриба регулируется в зависимости от физиологического состояния хозяина.

Таблица 2

Колонизация С.тиагшИсея Ш-трансформнрованпьп корней картофеля, адаптированных и неадаптнроваппых к росту на среде М

Корин картофеля Количество экспериментальных единиц Общая длина корней, см Средняя степень колонизации,% Дисперсия, %

Адаптированные к росту па среде М Бе)адаптации 9 10 4851,9 6791,3 0,211+0,035 0,244±0,042 0,0001 0,0002

Поскольку степень колонизации была крайне низкой для всех исследованных культур, то в дальнейшем для получения необходимых количеств биомассы эндомикоризных грибов использовались везикулы, выделенные из корней Р.аияП-аШ методом градиентного центрифугирования.

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ.

Подготовка антигена к иммунизации. Ввиду низкого содержания белка даже в везикулах эндомикоризных грибов и низкой иммуногенности материала эндомикоризных грибов для млекопитающих была предложена совокупность приемов, направленных на максимально возможное увеличение концентрации белка и иммуногенности вводимого материала. Чтобы обеспечить максимально возможную экстракцию водорастворимых белков и, вместе с тем, избежать их денатурации, для каждого изолята

было установлено минимальное время, необходимое для полной дезинтеграции 100 мг везикул. Для того чтобы выделить максимально возможное количество водорастворимых белков и при этом избежать применения веществ, потенциально токсичных для кролика, гомогенаг везикул экстрагировали в небольшом количестве дистиллированной воды (суммарное разбавление не превышает 10 раз). Для увеличения концентрации балка были использованы процедуры диализа и лиофилизации экстракта

В результате был предложен следующий метод выделения водорастворимых белков. Везикулы (600-700 мг), очищенные от корней Р.аизп-аШ методом градиентного центрифугирования, смешивали с 3 мл холодной дистиллированной воды и гомогенизировали при помощи пальцевого дезинтегратора Степень гомогенизации контролировали микроскопированием. Время гомогенизации составляло 5-7 мин для разных видов эндомикоризных грибов. Объем полученного гомогената доводили до 5-6 мл смывами дистиллированной водой с дезинтегратора, белки экстрагировали 16 часов при + 4 "С. Для предотвращения бактериального загрязнения к гомогенату добавляли мертиолат в концентрации 1: 10000. Гомогенат центрифугировали (12000^, +4 "С, 60 мин.), супернатант переносили в диализные трубки, диализовали 20 часов против дистиллированной воды и лиофильно высушивали.

Масса сухого белкового экстракта составляла 4-6 мг, т.е. 0,7-1 % массы исходного материала.

Схема иммунизации. Для получения сыворотки к белкам эндомикоризных грибов была предложена схема иммунизации, основанная на введении малых доз антигена Она включала четыре подкожных инъекции 2-5 мг белкового экстракта везикул, эмульгированного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и пять реиммунизашш таким лее антигенным материалом по одной подкожной инъекции каждая (табл.3).

Таблица 3

Схема иммунизации

Количество Активность Партия

антигена, мг сыворотки антител

§ 1 0 2,16 н.т.

8Г в е-» 2 14 2,00 н.т.

3 28 2,97 н.т.

и 4 42 4,82 -

2 1 77 3,28 -

аг а и 112 3,60 +

а III 248 4.00 + $2

г IV 285 1,68 +

г!

м о. V 346 3,02 +

+ Наличие преципитатов в реакции иммунодиффузии

- Отсутствие преципитатов

н. т. Активность сыворотки не тестировалась

Введение малых доз антигена было направлено не только на преодоление дефицита белка эндомикоризного гриба, но и на снижение количества антигенных детерминант, активирующих пролиферацию антител-продуцирующих клеток, то есть на увеличение специфичности антител иммунной сыворотки.

Преципитация гомологичного антигена антителами сыворотки в реакции иммунодиффузии наблюдалась, начиная со второй реиммунизации. Титр сыворотки определялся минимальной концентрацией антигена, образующей полосу преципитации при иммунодиффузии и составлял 0,55 мг/мл. Образование достаточно активных антител только после шестой инъекции и невысокий титр сыворотки объясняется низкой иммуногенностью структур АМГ для кролика Тем не менее, активность полученных антител была достаточна

для поставленной цели, то есть для выявления нескольких антигенных детерминант и образования четких пиков преципитации при проведении иммуноэлекгрофореза

Всего в результате последовательных реиммунизаций было получено четыре партии активных антител (Si - S4). Интервал между-реиммунизациями составлял от 35 до 136 дней, причем, длительный перерыв не снижал активности сыворотки. Это позволило использовать одного кролика-донора для получения достаточно большого количества активных антител. Таким образом, данная схема иммунизации может бьггь рекомендована для получения значительных количеств активных сывороток в случаях требующих экономного использования антигена.

Специфичность антител к поверхностным антигенам. Специфичность полученных антител к поверхностным антигенам эндомикоризных и немикоризных почвообитающих грибов была протестирована методом иммунофлуоресцентного анализа (табл.4). Антитела реагировали с поверхностными антигенами мицелия и везикул шести видов АМГ, но не давати перекрестных реакции с мицелием восьми видов немикоризных почвообитающих грибов. Таким образом, показана специфичность полученных антител к поверхностным антигенам АМГ. Кросс-реактивность антител с поверхностными структурами шести видов АМГ позволяет предположить наличие у этих видов перекрестно реагирующих антигенных детерминант.

Взаимодействие антител, полученных к фракции водорастворимых белков, с поверхностными антигенами позволяет предположить наличие перекрестно реагирующих антигенных детерминант для фракции водорастворимых белков и поверхностных структур АМГ.

Таблица 4

Кросс-реактнвность антител с поверхностными антигенами эндомнкорнзных и немпкоризных ночвоебнтающпх грпбов по дапным иммупофлуоресцептпого анализа

Тестированные виды Структуры Реакция антител

Эпдомнкорнзные грибы

Glomus intraradices везикулы, гифы +

Glomus constrictum везикулы, гифы +

Glomus mosseae везикулы, гифы -

Glomus fasciculatum везикулы, гифы -ь

Glomus albidum везикулы, гифы +

Gigaspora margarita везикулы, гифы +

Грпбы, не образующие

мпкорнзу гифы -

Sclerotinia sp. гифы -

Trichoderma sp. гифы -

Gliocladium sp. гифы -

Paecilomyces sp. гифы -

Pénicillium sp гифы -

Pythium sp. гифы -

Mucor sp. гифы -

Wardomyces sp.

+ наличие иммупофлуоресцептпого сигнала - отсутствие сигнала

АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР. Общая характеристика выявленных антигепов. Дниамнка активности аптнтел. Иммуиоэлектрофоретический анализ белковых экстрактов АМГ показал наличие по крайней мере 10 водорастворимых антигенов, выявляемых полученными антителами (рис.1).

Каждый пик преципитации, отмеченный на рисунке, соответствует по крайней мере одному антигену. Выявленные антигены, в основном, относились к мажорной фракции, лишь антиген В был охарактеризован как минорный.

Сравнительный анализ спектра антигенов, выявляемых антитатами,

Рисунок 1. Общая схема расположения водорастворимых белковых антигенов АМГ, распознаваемых полученными антителами.

полученными в результате четырех последовательных реиммунизаций (Б] - 84), показал увеличение количества антигенов: антиген В, не распознаваемый Бх и 82, распознавался Бз и 84; антиген А2, слабо преципитируемый 81 и 82, интенсивно преципитировался Бз и (табл.5).

Тшсим образом, последовательные реиммунизации привели к увеличению количества распознаваемых антигенов, то есть к увеличению активности антител.

Таблица 5

Динамика активности антител, полученных в результате четырех последовательных реиммунизаций (Б, - 84)

Антиген (пик преципитации) Активность антител

Б! Бз Б,

А 1 + + + +

А 2 (+) (+) + +

В - - + +

С 1 + + + +

С 2 + + + +

и 1 + + + +

Б2 + + + +

Е 1 + + (+) (+)

Е2 + + + +

Р + + + +

+ Наличие пика преципитации при иммуноэлектрофоретическом разделении водорастворимых белков О. ¡ШгагасИсех. (+) Слабо выраженная реакция - Отсутствие пика преципитации

Полиморфизм белковых антпгенов зпдомикоризных грибов.

Анализ полиморфизма белковых антигенов трех видов AMT: G.intraradices, G.constrictum и Gig.margarita был проведен методом двумерного иммуноэлектрофореза Для получения препаративного количества везикул и выделения белков всех трех видов были использованы описанные выше методы. Анализ спектра распознаваемых антигенов выявил четкие отличия гомологичной и гегерологачных проб. Из 10 антигенов, распознаваемых полученными антителами, три были обнаружены только у G.intraradices, семь оказались перекрестно реагирующими для G.intraradices и Gig.margarita, а пять из них -перекрестно реагирующими для G.intraradices и G.constrictum (табл.6). Наличие у G.intraradices трех антигенов, не обнаруженных у G.constrictum и Gig.margarita, говорит об их возможной видоспецифичности. Тем не менее, степень специфичности этих антигенов можно оценить лишь на основании сравнительного анализа спектра белковых антигенов нескольких видов AMT и нескольких изолятов каждого вида.

Таблица 6

Анализ полиморфизма водорастворимых белковых антпгенов эндомикоризных грибов

Вид АМГ Спектр выявляемых антигенов Антигены, выявленные только v G.intraradices

G.intraradices G.constrictum Gig.margarita AI, А2, В, С1, С2, Dl, D2, El, Е2, F AI, Dl, El, E2. F AI, Cl, Dl, D2, E1.E2.F A2, В, C2

Идентификация нзолята СИрачуога тагцагиа с помощью морфологических критериев. По выявленному спектру перекрестно реагирующих антигенных детерминант изолят, полученный как Ощ.таг^агиа (8162), оказался ближе к С.тГгагасИсе5, чем 0.сож1патп. Анализ морфологических и ультраструктурных характеристик 5162

показал, что он обладает признаками, характерными для Glomus и не имеет отличительных признаков Gigaspora. Это позволило переопределить изолят S162 как Glomus species и констатировать, что по данным иммуноэдектрофоретического анализа он достаточно близок к Glomus intraradices (семь перекрестно реагирующих антигенных детерминант из 10).

Приведенные результаты показывают, что сравнительный иммуно-электрофоретический анализ является ценным инструментом для идентификации видов АМГ и может быть использован для установления идентичности коллекционных штаммов. Специфичность полученных антител вполне достаточна для этих задач.

ВЫВОДЫ:

1. Оптимизирован метод очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis. Содержание примесей в материале очищенных везикул не превышает 5 - 10 %. Очищенные везикулы сохраняют жизнеспособность и нативность структуры, что позволяет использовать их как для выделения белка, так и для инокуляции корней.

2. Показана возможность установления симбиоза Glomus intraradices штамма 7 с культурами Ri-трансформированных корней гороха, табака и картофеля с образованием характерных эндомикоризных структур внутри коротких участков корней.

3. Оптимизирован метод экстракции белков из везикул АМГ. Предложена совокупность приемов подготовки антигена к иммунизации, направленная на увеличение концентрации белка и иммуногенности материала эндомикоризных грибов.

4. Получены поликлональные антитела к водорастворимым белкам Glomus intraradices. Предложена схема иммунизации, основанная на введении малых доз антигенного материала и позволяющая получить

значительное количество активных антител необходимой специфичности, используя одного кролика-донора.

5. Проведен анализ полиморфизма белковых антигенов трех видов эндомикоризных грибов. Установлено наличие пяти перекрестно реагирующих антигенных детерминант для Glomus intraradices и Glomus constrictum и семи таких детерминант для Glomus intraradices и Glomus species. Показано наличие трех антигенных детерминант Glomus intraradices, не выявляемых полученными антителами у двух других видов Glomus.

6. На основании анализа иммунохимических и морфологических признаков изолят Gigaspora margarita переопределен как Glomus species.

По материалам диссертации опубликованы следующие

работы:

1. Козлова Н.В. Получение специфичных антител для иммунохимической идентификации эндомикоризных грибов // Труды победителей конкурса грантов 1998 года для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга. Направление «Биология». - Санкт-Петербург, 1998. - с. 114-115.

2. Labutova N.M., Kozlova N.V., Muromtsev G.S. Development of endophyte Glomus intraradices near the barley roots // Second International Conference on Mvcorrhiza Uppsala, Sweden. 5-10 July 1998.

3. Козлова H.B., Лугова JT.A. Взаимодействие штамма 7 Glomus intraradices и культур Ri-трансформированных корней // Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность. Сборник статей по материалам междунар. науч. конф. 24-28 апреля 2000. -Санкт-Петербург, 2000. - с. 157-159.

Приняты к публикации следующие работы:

1. Kozlova N.V., Strunmkova O.K., Labutova N.M.. Muromtsev G.S. Production and analysis of specificity of polyclonal antibodies against soluble proteins from arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices. // Mycorrhiza, (accepted for publication with corrections).

2. Козлова H.B., Струнникова O.K. Применение иммуноэлектрофоретического анализа для изучения биоразнообразия эндомикоризных грибов // Материалы по изучению русских почв. -2001. - № 2 (29) (в печати).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козлова, Наталия Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль эвдомикоризных грибов в жизни растений.

1.2. Биоразнообразие и идентификация эндомикоризных грибов. Современные методы исследования

1.2.1. Биологическое разнообразие эндомикоризных грибов.

1.2.2. Изучение биоразнообразия и идентификация эндомикоризных грибов с помощью молекулярно-генетических методов.

1.2.3. Использование иммунохимических методов для изучения биоразнообразия и идентификации эндомикоризных грибов

1.2.3.1. Молекулярные основы иммунохимических методов. Поликлональные и моноклональные антитела.

1.2.3.2. Особенности получения антител к антигенам эндомикоризных грибов.

1.2.3.3. Использование антител для серогруппирования AMГ и их идентификации в почве и корнях.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы грибов и условия культивирования.

2.2. Получение и поддержание культур Ri-трансформированных корней и установление эндомикоризного симбиоза in vitro.

2.3. Определение степени микоризной колонизации корней.

2.4.Получение иммунных сывороток и оценка активности антител.

2.5. Выделение иммуноглобулинов.

2.6. Определение специфичности антител к поверхностным антигенам почвообитающих грибов.

2.7. Анализ антигенных структур AMT

2.7.1. Двумерный иммуноэлектрофорез и прибор для его проведения.

2.7.2. Приготовление буфера, агарозных гелей и белковых растворов. Проведение иммуноэлектрофореза.

2.7.3. Визуализация иммунопреципитатов.

2.7.4. Характеристика антигенных детерминант.

2.7.5. Идентификация изолята AMT по морфологическим признакам. 60 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ:

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО МАТЕРИАЛА

3.1. Оптимизация метода очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis.

3.2. Совместное культивирование Glomus intraradices штамма 7 и Ri-трансформированных корней.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

4.1. Подготовка антигена к иммунизации.

4.2. Схема иммунизации.

4.3. Специфичность антител к поверхностным антигенам.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР

5.1. Общая характеристика выявленных антигенов. Динамика активности антител.

5.2. Полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов.

5.3. Идентификация изолята Gigaspora margarita с помощью морфологических критериев.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация методов получения антигенного материала и поликлональных антител для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации эндомикоризных грибов"

Актуальность проблемы. Симбиоз с эндомикоризными грибами (арбускулярно-микоризными грибами, AMT) приводит к улучшению минерального питания растений, увеличивает их устойчивость к фитопатогенам и другим стрессовым воздействиям, а также способствует выводу из почвы солей тяжелых металлов и радионуклидов /Marschner and Dell, 1994/. Отсутствие методов надежной идентификации AMГ и сложность их культивирования без растения-хозяина являются серьезными препятствиями для изучения этих микроорганизмов, в том числе, оценки их биоразнообразия. Систематика AMT базируется на морфологических критериях /Trappe, 1982; Walker, 1992/, весьма неоднозначных вследствие модификационной изменчивости морфологических признаков и внутривидовых вариаций /Morton, 1988/.

Иммунохимические методы привлекательны для решения задач идентификации и систематики благодаря специфичности реакции антиген -антитело. Для изучения AMT с помощью иммунохимических методов важными задачами являются получение специфичных антител и выбор метода, адекватного для решения поставленных задач. Получение антител к водорастворимым белкам AMT целесообразно ввиду их видоспецифичности и способности индуцировать строгий иммунный ответ. Использование иммуноэлектрофореза и поликлональных антител перспективно для оценки биоразнообразия AMT и степени их родства, так как позволяет оценить полиморфизм сразу нескольких белковых антигенов. Для получения поликлональных антител и проведения иммуноэлектрофоретического анализа необходимо значительное количество белкового антигена AMT, свободного от растительных примесей. Однако, низкое процентное содержание белка в структурах этих грибов (не более 20 %) и невозможность нарастить существенное количество их биомассы без растения-хозяина /Неррег, 1984; Williams, 1991/ затрудняют получение достаточного количества антигена.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - получить поликлональные антитела к водорастворимым белкам эндомикоризного гриба и использовать их для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации AMГ. Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оптимизировать метод очистки везикул AMT от растительных тканей.

2. Оптимизировать процесс подготовки белкового антигена везикул к иммунизации.

3. Предложить схему иммунизации для получения активных поликлональных сывороток к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба.

4. Проанализировать полиморфизм водорастворимых белковых антигенов нескольких видов AMT.

Научная новизна работы. Предложен способ получения политональных антител к водорастворимым белкам везикул эндомикоризного гриба Glomus intraradices. Оптимизирован метод получения белковых антигенов AMГ, свободных от растительных примесей. Предложена совокупность приемов подготовки антигена к иммунизации, позволяющая существенно увеличить концентрацию и иммуногенность белков эндомикоризного гриба. Впервые методом двумерного иммуноэлектрофореза проанализирован полиморфизм белковых антигенов эндомикоризных грибов. Показано наличие семи перекрестно реагирующих антигенов для G. intraradices и G. species и пяти таких антигенов для G. intraradices и G. constrictum. Три антигена были обнаруженных только у G. intraradices. Рассмотренные подходы позволяют изучать биоразнообразие и проводить идентификацию AMT на качественно новом уровне.

Практическая ценность работы. Получены поликлональные антитела, позволяющие изучать поведение и развитие G. intraradices в условиях модельных опытов, приближенных к естественным. Идентификация специфичных антигенов методом иммуноэлектрофореза может быть использована для контроля чистоты биопрепарата на основе G. intraradices штамма 7 и мониторинга при его использовании. Предложенные методы очистки структур эндомикоризных грибов от растительных примесей, подготовки антигенного материала к иммунизации и получения поликлональных антител к G. intraradices штамму 7 открывают перспективы для получения антител к другим видам AMT.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации были изложены на второй международной конференции по микоризе (Упсала, Швеция, 1998), конференции «Проблемы микологии на рубеже веков» (Москва, 2000), Докучаевских молодежных чтениях 2000 «Почвы и биоразнообразие» (Санкт-Петербург), международной конференции «Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность» (Санкт-Петербург, 2000). По материалам диссертации опубликовано три работы и две работы принято к публикации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит восемь таблиц, 11 рисунков. Список использованной литературы включает 149 наименований, в том числе 138 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Козлова, Наталия Валерьевна

выводы

1. Оптимизирован метод очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis. Содержание примесей в материале очищенных везикул не превышает 5 - 10 %. Очищенные везикулы сохраняют жизнеспособность и нативность структуры, что позволяет использовать их как для выделения белка, так и для инокуляции корней.

2. Показана возможность установления симбиоза G. intraradices штамма 7 с культурами Ri-трансформированных корней гороха, табака и картофеля с образованием характерных эндомикоризных структур внутри коротких участков корней. Оптимизирован метод поверхностной стерилизации везикул, позволяющий использовать их в качестве инокулюма для установления AM симбиоза in vitro.

3. Оптимизирован метод экстракции белков из везикул AMT. Предложен процесс подготовки антигена к иммунизации, направленный на увеличение концентрации белка и иммуногенности материала эндомикоризных грибов.

4. Получены поликлональные антитела к водорастворимым белкам G. intraradices. Предложена схема иммунизации, основанная на введении малых доз антигенного материала и позволяющая получить значительное количество активных антител необходимой специфичности, используя одного кролика-донора.

5. Проведен анализ полиморфизма белковых антигенов трех видов эндомикоризных грибов. Показано наличие пяти перекрестно реагирующих антигенных детерминант для Glomus intraradices и Glomus constrictum и семи таких детерминант для Glomus intraradices и Glomus species. Кроме того, показано наличие трех антигенных детерминант Glomus intraradices, не выявляемых полученными антителами у двух других видов Glomus.

6. На основании анализа иммунохимических и морфологических признаков изолят Gigaspora margarita переопределен как Glomus species.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа осуществлена при поддержке двух грантов для студентов, аспирантов, молодых ученых и специалистов (кандидатский проект) администрации Санкт-Петербурга, Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации и Российской Академии наук, а также при поддержке совместной программы ВНИИСХМ - Soil and Water Research Institute (Иран).

Автор выражает благодарность Струнниковой О. К, Лабутовой Н. М., Востряковой В. И., Лутовой Л. А. Ходжаевой Л. Т., Зеленникову О. В., Богомяко С. А. и Гинзбургу М. М. за неоценимую помощь в выполнении и оформлении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы были получены поликлональные антитела к водорастворимым белкам Glomus intraradices штамм 7, пригодные как для изучения полиморфизма белковых антигенов, так и для идентификации эндомикоризных грибов.

Проведенное исследование предлагает ряд методик, позволяющих преодолеть трудности работы с эндомикоризными грибами, которые, несомненно, будут полезны для изучения этих облигатных симбионтов. В частности, предложен эффективный метод очистки везикул эндомикоризных грибов от корней P. australis, оптимизирован метод экстракции белков из везикул AMT и процесс подготовки антигена к иммунизации, направленный на увеличение концентрации бежа и иммуногенности материала AMГ.

Предложенная схема иммунизации позволила получить активные антитела, специфичность которых была достаточна для изучения полиморфизма белковых антигенов и идентификации AMT. Несомненным достоинством данной схемы является возможность экономного использования антигена эндомикоризных грибов. Кроме того, данная схема иммунизации может служить основой для разработки модифицированных схем. Например, для получения антител с высоким сродством к поверхностным структурам, необходимым для изучения AMT в почве, в схему иммунизации могут быть включены дополнительные инъекции поверхностными структурами AMT.

Специфичность полученных антител к поверхностным антигенам АМГ открывает возможность использования антител для изучения эндомикоризных грибов в естественных условиях в случаях, когда необходимо отличить мицелий АМГ от мицелия немикоризных почвообитающих грибов. Поскольку мицелий АМГ не обладает четкими морфологическими отличиями, изучение ранних стадий формирования эндомикоризного симбиоза, в том числе, механизмов контакта АМГ при взаимодействии с растением затруднено. Проблемы идентификации мицелия АМГ часто возникают при изучении процессов, происходящих при совместной инокуляции растений микоризными и другими почвообитающими (например, фитопатогенными) грибами. Кроме того, стадия развития эндомикоризных грибов в почве исследована крайне мало ввиду тех же объективных трудностей. При правильной организации модельного опыта, исключающей одновременное наличие нескольких видов АМГ, использование полученных антител позволит решить проблему идентификации эндомикоризных грибов и изучать эти микроорганизмы в условиях, приближенных к естественным.

Взаимодействие антител, полученных к фракции водорастворимых белков, с поверхностными антигенами мицелия и спор шести видов АМГ является серьезным аргументом в пользу наличия антигенных детерминант, общих для водорастворимой фракции и поверхностных структур АМГ.

Полученные в работе данные говорят о применимости использования сравнительного иммуноэлектрофоретического анализа белковых антигенных детерминант для оценки биоразнообразия и идентификации эндомикоризных грибов. Однако, проделанная работа является лишь первым шагом в этом направлении. Анализ полиморфизма белковых антигенов с использованием широкого спектра антител к различным таксономическим группам AMT в совокупности с морфологическими и молекулярно-генетическими данными позволит оценить степень родства этих грибов, что весьма важно для развития их систематики. Кроме того, анализ полиморфизма белковых антигенов нескольких изолятов, выделенных из разных мест обитания, может внести существенный вклад в оценку биологического разнообразия AMT, в том числе, и на подвидовом уровне.

Проделанная работа открывает путь для идентификации специфичных антигенов коммерческих штаммов и создания систем контроля чистоты и мониторинга соответствующих биопрепаратов. Одной из систем контроля может быть идентификация коммерческих штаммов на основании наличия специфичных антигенов, выявляемых методом иммуноэлектрофореза. Кроме того, возможно получение антител, специфичных к коммерческим штаммам, за счет выявления штаммоспецифичных антигенов методом сравнительного иммуноэлектрофоретического анализа и использования их в качестве иммуногена. В частности, возможно создание систем идентификации G.intraradices штамм 7, если штаммоспецифичность антигенов А2, В и С2 будет доказана по результатам более обширного анализа изолятов.

Полученные результаты показывают, что сравнительный анализ перекрестно реагирующих антигенных детерминант может быть крайне ценным для определения идентичности коллекционных штаммов эндомикоризных грибов.

Таким образом, результаты проведенного исследования, в частности предложенные подходы, расширяют возможности изучения эндомикоризных грибов с помощью иммунохимических методов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козлова, Наталия Валерьевна, Санкт-Петербург

1. Вееке Б. Принципы, оборудование, реактивы и процессы. Общие сведения. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. М.: Мир. 1977а.-с. 11-42.

2. Вееке Б. Перекрестный иммуноэлектрофорез. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. М.: Мир. 19776. с. 58-74.

3. Глотов Н. В., Животовский Л. А., Хованов Н. В., Хромов-Борисов Н. Н. Биометрия. Л.: Издательство ЛГУ, 1982. - 263с.

4. Гусев А. И., Цветков В. С. К технике постановки реакции микропреципитации в агаре // Лабораторное дело. 1961. - т. 2. - с. 43.

5. Зольникова Н. В., Воробьев Н. И. Методы исследования грибов, образующих с растениями микоризу арбускулярно-везикулярного типа / Под ред. Г. С. Муромцева. Санкт-Петербург, 1992. - 44с.

6. Карандашов В. Е. Особенности формирования и развития арбускулярной микоризы в условиях in vitro: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1999. -21с.

7. Муромцев Г. С., Маршунова Г. Н., Павлова В. Ф., Зольникова Н. В. Роль почвенных микроорганизмов в фосфорном питании растений // Успехи микробиологии. 1985. - т. 20. - с. 174-195.

8. Струнникова О. К., Муромцев Г. С. Изучение штаммов Verticillium dahliae и V. albo-atrum методом иммуноэлектрофореза // Микология и фитопатология. 1987. - т. 21. - № 2. - с. 155-160.

9. Хрущева Е. П., Согина И. И. Об участии эндомикоризы в фосфорном питании сельскохозяйственных растений // Микориза и другие формы консортивных связей в природе. Пермь, 1983. - с. 29 - 33.

10. Abbott L. К., Robson A. D., Hall I. R. Introduction of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi into agricultural soils // Australian Journal of Agricultural Research. 1983. - v. 34. - p. 741-749.

11. Abdalla M. E., Abdel-Fattah G. M. Influence of the endomycorrhizal fungus Glomus mosseae on the development of peanut pod rot disease in Egypt // Mycorrhiza. 2000. - v. 10. - p. 29-35.

12. Ahiabor B. D., Hirata H. Characteristic responses of three tropical legumesto the inoculation of two species of VAM fungi in Andosol soils with different fertilities //Mycorrhiza. 1994. - v. 5. - p. 63-70.

13. Aldwell F. E. B., Hall I. R. Monitoring spread of Glomus mosseae through soil infested with Acaulospora laevis using serological and morphological techniques // Trans. Br. Mycol. Soc. 1986. - v. 87. - p. 131-134.

14. Aldwell F. E. B., Hall I. R., Smith J. M. B. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to identify endomycorrhizal fungi // Soil. Biol. Biochem. 1983. - v. 15.-p. 377-378.

15. Aldwell F. E. B., Hall I. R., Smith J. M. B. Enzyme-linked immunosorbent assay as an aid to taxonomy of the Endogonaceae // Trans. Br. Mycol. Soc. 1985. - v. 84.-p. 399-402.

16. Al-Karaki G. N. Growth of mycorrhizal tomato and mineral acquisition under salt stress // Mycorrhiza. 2000. - v. 10. - p. 51-54.

17. Ames R. N., Reid C. P. P., Porter L. K., Cambardella C. Hyphal uptake and transport of nitrogen from two I5N labeled sources by Glomus mosseae, a vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus // New Phytol. 1983. - v. 95. - p. 381396.

18. Azcon R., Gomez M., Tobar R. Physiological and nutritional responses by Lactuca sativa L. to nitrogen sources and mycorrhizal fungi under drought conditions // Biology and Fertility of Soils. 1996. - v. 22. - p. 156-161.

19. Bécard G., Fortín J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots // New Phytol. 1988. - v. 108. - p. 211-218.

20. Bécard G., Pfeffer P. E. Status of nuclear division in arbuscular mycorrhizal fungi during in vitro development // Protoplasma. 1993. - v. 194. - p. 62-68,

21. Bethlenfalvay G. J., Reyes-Solis M. G., Camel S. B., Ferrera-Cerrato R. Nutrient transfer between the root zones of soybean and maize plants connected by a common mycorrhizal mycelium // Physiol. Plant. 1991. - v. 82. - p. 423-432.

22. Bolan N. S., Robson A. D., Barrow N. J. Effects of vesicular-arbuscular mycorrhiza on the availability of iron phosphates to plants // Plant Soil. 1987. -v. 22.-p. 401-410.

23. Bonfante-Fasolo P., Faccio A., Perotto S., Schubert A. Correlation between chitin distribution and cell wall morphology in the mycorrhizal fungus Glomus versiforme II Mycol. Res. 1990. - v. 94. - p. 157-165.

24. Casana M., Bonfante-Fasolo P. Ife intercellulari ed arbuscoli di Glomus fasciculatum (Thaxter) Gerd. et Trappe isolate con digestione enzimatica // Allionia. 1982. - v. 25. - p. 17-25.

25. Chabot S., Bécard G., Piché Y. Life cycle of Glomus intraradices in root organ culture//Mycologia. 1992. - v. 84. - p. 315-321

26. Chelius M. K., Triplett E. W. Rapid detection of arbuscular mycorrhizae in roots and soil of an intensively managed turfgrass system by PCR amplification of small subunit rDNA // Mycorrhiza. 1999. - v. 9. - p. 61-64.

27. Clapp J. P., Young J. P. W., Merryweather J. W., Fitter A. H. Diversity of fungal symbionts in arbuscular mycorrhizas from a natural community // New Phytol. 1995. v. 130.-p. 259-265.

28. Cooke J. C., Gemma J. N., Koske R. E. Observations of nuclei in vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // Mycologia. 1987. - v. 79. - p. 331-333.

29. Cordier C., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Immunodetection de champignons endomycorhiziens a arbuscules in planta // Acta Bot Gallica. -1994.-v. 141,-p.465-468.

30. Dewey M., Evans D., Coleman J., Priestley R., Hull R., Horsley D., Hawes C. Antibodies in plant science // Acta Bot Neerl. 1991. - v.40. - p. 1-27.

31. Diop T. A., Plenchette C., Strullu D. G. Dual axenic culture of sheared-root inocula of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with tomato roots // Mycorrhiza. 1994. - v. 5. - p. 17-22.

32. Franken P., Gianinazzi-Pearson V. Construction of genomic phage libraries of the arbuscular mycorrhizal fungi Glomus mosseae and Scutellospora castanea and isolation of ribosomal RNA genes // Mycorrhiza. 1996. - v. 6. - p. 167-173.

33. Friese C. F., Allen M. F. Tracking the fates of exotic and local VA mycorrhizal fungi: methods and patterns // Agric. Ecosys. Environ. 1991. - v. 34. - p. 8796.

34. Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Enzymatic studies on the metabolism of vesicular-arbuscular mycorrhiza. II soluble alkaline phosphatase specific to the mycorrhizal infection in onion roots // Physiol. Plant Pathol. 1978. - v. 12. - p. 45-53.

35. Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. Protein and protein activities in endomycorrhizal symbioses. In: Mycorrhiza: function, molecular biology and biotechnology. / ed. B. Hock, A. K. Varma. Springer-Verlag. - Heidelberg, 1994.

36. Gibbons A. Systematics goes molecular // Science. -1991. v. 251. - p. 872-874.

37. Giersch T., Hock B. Production of monoclonal antibodies for the determination of s-triazines with enzyme immunoassays // Food Agrie. Immunol. 1990. - v. 2. -p. 85-97.

38. Giovanetti M., Gianinazzi-Pearson V. Biodiversity in arbuscular mycorrhizal fungi // Mycol. Res. 1994. - v. 98. - p. 705-715.

39. GÓbel C., Hahn A., Hock B. Production of polyclonal and monoclonal antibodies against hyphae from arbuscular mycorrhizal fungi // Critical Reviews in Biotechnology. 1995. - v. 15. - p. 293-304.

40. Gupta R., Krishnamurthy K. V. Response of mycorrhizal and nonmycorrhizal Arachis hypogaea to NaCl and acid stress // Mycorrhiza. 1996. - v. 6. - p. 145149.

41. Haas J. H., Krikun J. Efficacy of endomycorrhizal fungus isolates and inoculum quantities required for growth response // New Phytologist. 1985. - v. 100. - p. 613-621.

42. Hahn A., Bonfante P., Horn K., Pausch F., Hock B. Production of monoclonal antibodies against surface antigens of spores from arbuscular mycorrhizal fungi by an improved immunization and screening procedure // Mycorrhiza. 1993. -v.4. - p. 69-78.

43. Hahn A., Horn K., Hock B. Serological properties of mycorrhizae. In: Mycorrhiza: function, molecular biology and biotechnology. / ed. B. Hock, A. K. Varma. Springer-Verlag. - Heidelberg, 1994b

44. Hall I. R., Field trials assessing the effect in inoculating agricultural soils with endomycorrhizal fungi // Journal of Agricultural Science. 1984. - v. 102. - p. 725-731.

45. Harboe N. M. G., Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins and antibody titre determination // Scand. J. Immunol. 1983. - v. 17. - p. 345-351.

46. Hardham A. R., Suzaki E., Perkin J. L. Monoclonal antibodies to isolate-, species-, and genus-specific components on the surface of zoospores and cysts of the fungus Phytophthora cimmamomi I I Can. J. Bot. 1986. - v. 64. - p. 311321.

47. Harley J. L., Smith S. E. Mycorrhizal symbiosis. London: Academic Press, 1983.-483 pp.

48. Harley J. L. The significance of Mycorrhiza // Mycological research. 1989. - v. 92, part 2.-p. 129-139.

49. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

50. Haselwandter K., Berreck M. Accumulation of radionuclides in fungi. In: Metal ions in fungi. / ed. G. Winkelmann, D. R. Winge. Marcel Dekker. - New York, 1994.-p. 259-277.

51. Hassouna N., Michot B., Bachellerie J. P. The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implication for the process of size increase of the large rRNA in higher eucaryotes // Nucleic Acid Res. 1984. - v. 12. - p. 3563-3583.

52. Hayashi K., Yandell D. W. How sensitive is PCR-SSCP? // Hum. Mutat. 1993. - v.2. - p. 338-346.

53. Hepper C. M. Isolation and culture of VA mycorrhizal (VAM) fungi. In: VA Mycorrhiza. / ed. C. L. I. Powell, D. J. Bagyaraj. CRC Press. - Boca Raton, Fla, 1984.-p. 95-112.

54. Hepper C. M., Mosse B. Techniques used to study the interaction between Endogone and plant roots. In: Endomycorrhizas. / ed. F. E. Sanders, B. Mosse, P. B. Tinker. Academic Press. - London, 1975. - p. 65-75.

55. Hepper C. M., Sen R., Azcon-Aguilar C., Grace C. Variation in certain isozymes amongst different geographical isolates of the vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi Glomus monosporum and Glomus mosseae // Soil Biol. Bioch. 1988a. - v. 20.-p. 51-59.

56. Hepper C. M., Azcon-Aguilar C., Rosendahl S., Sen R. Competition between three species of Glomus used as spatially separated introduced and indigenousmycorrhizal inocula for leek {Allium porrum L.) // New Phytol. 1988b. - v. 110. -p. 207-215.

57. Horn K., Hahn A., Pausch F., Hock B. Isolation of pure spore and hyphal fractions from vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // J. Plant Physiol. 1992. -v. 141.-p. 28-32.

58. Jabaji-Hare S., Sridhara S. J., Kendrick B. A technique for the isolation of intramatrical vesicles from vesicular-arbuscular mycorrhizae // Can. J. Bot. -1984.-v. 62.-p. 1466-1468.

59. Jackson N. E., Miller R. H., Franklin R. E. The influence of vesicular-arbuscular mycorrhizae on uptake of 90 Sr from soil by soybeans // Soil Biol. Biochem. -1973.-v. 5.-p. 205.

60. Jakobsen I., Rosendahl L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants // New Phytol. 1990. - v. 115. - p. 77-83.

61. Jakobsen I., Abbot L. K., Robson A. D. External hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum L. Spread of hyphae and phosphorus inflow into roots // New Phytol. 1992. - v. 120. - p. 371-380.

62. Karandashov V., Kuzovkina I., Hawkins H-J., George E. Growth and sporulation of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus caledonium in dual culture with transformed carrot roots // Mycorrhiza. 2000. - v. 10. - p. 23-28.

63. Kawai Y., Yamamoto Y. Increase in the formation and nitrogen fixation of soybean nodules by vesicular-arbuscular mycorrhiza // Plant Cell Physiol. -1986.-v. 27.-p. 399-405.

64. Khaliq A., Sanders F. E. Effects of phosphorus application and vesicular arbuscular mycorrhizal inoculation on the growth and phosphorus nutrition of maize // Journal of Plant Nutrition. 1997. - v. 20. - p. 1607-1616.

65. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity //Nature. 1975. - v. 256. - p. 495-497.

66. Kohn I. Developing new characters for fungal systematics: an experimental approach for determining the rank of resolution // Mycologia. 1992. - v. 84. -p. 139-153.

67. Kothari S. K. Marschner H., Römheld V. Contribution of VA mycorrhizal hyphae in acquisition of phosphorus and zinc by maize grown in a calcareous soil //Plant soil.-1991.-v. 131.-p. 177-185.

68. Kough J., Malajczuk N., Linderman R.G. Use of the indirect immunofluorescent technique to study the vesicular-arbuscular fungus Glomus epigaeum and other Glomus species // New Phytol. 1983. - v. 94. - p. 57-62.

69. Li X-L., George E., Marschner H. Extension of the phosphorus depletion zone in VA-mycorrhizal white clover in a calcareous soil // Plant Soil. 1991a. - v. 136. -p. 41-48.

70. Li X-L., Marschner H., George E. Acquisition of phosphorus and cooper by VA-mycorrhizal hyphae and root-to-shoot transport in white clover // Plant Soil. -1991b.-v. 136.-p. 49-57.

71. Liu A., Hamel C., Hamilton R.I., Ma B.L., Smith D.L. Acquisition of Cu, Zn, Mn, and Fe by mycoirhizal maize (Zea mays L.) grown in soil at different P and micronutrient levels // Mycorrhiza. 2000. - v.9. - p. 331-336.

72. Marschner H., Dell B. Nutrient uptake in mycorrhizal symbiosis // Plant and Soil. -1994.-v. 159.-p. 89-102.

73. McGraw A. C., Gamble J. F., Schenck N. C., Vesicular-arbuscular mycorrhizal uptake of cesium-134 in two tropical pasture grass species // Phytopathology. -1979.-v. 69.-p. 1038.

74. Micales J. A., Bonde M. R., Peterson G. L. The use of isozyme analysis in fungal taxonomy and genetics // Mycotaxon. 1986. - v. 27.- p. 405-449.

75. Michot B., Bachellerie J. P. Secondary structure of mouse 28S rRNA and general models for the folding of the large RNA in eucaryotes // Nucleic Acid Res. -1984.-v. 12.-p. 4259-4279.

76. Miller R. M., Jastrow J. D. The role of mycorrhizal fungi in soil conservation. In: Mycorrhiza in sustainable agriculture / ed. G. J. Bethlenfalvay, R. G. Linderman. ASA Spec. Publ. - Madison, 1992. - p. 29-44.

77. Miller-Wideman M. A., Watrud L. S. Sporulation of Gigaspora margarita on root cultures of tomato // Canad. J. Microbiol. 1984. - v. 30. - p. 642-646.

78. Morton J. B. Variation in mycorrhizal and spore morphology of Glomus occultum and Glomus diaphanum as influenced by plant and soil environment // Mycologia. 1985a. - v. 77. - p. 192-204.

79. Morton J. B. Underestimation of most probable numbers of vesicular-arbuscular endophytes because of nonstaining mycorrhizae // Soil Biol. Biochem. 1985b. -v. 17.-p. 383-384.

80. Morton J. B. Taxonomy of VA mycorrhizal fungi: classification, nomenclature, and identification // Mycotaxon. 1988. - v. 32. - p. 267-324.

81. Morton J. B. Evolutionary relationships among arbuscular mycorrhizal fungi in the Endogonaceae // Mycologia. 1990. - v. 82. - p. 192-207.

82. Mosse B., Hepper C. Vesicular-arbuscular mycorrhizal infections in root organ cultures // Physiol. Plant Pathol. 1975. - v. 5. - p. 215-223.

83. Mugnier J., Mosse B. Vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in transformed root-inducing t-DNA roots grown axenically // Phytopathology. 1987. - v. 77. -p. 1045-1050.

84. Mullis K., Faloona F., Schaarf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. // Quant. Biol. 1986. - v. 51. - 263-273.

85. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. - v. 15. - p. 473-497.

86. Pacovsky R. S., Fuller G., Stafford A. E., Paul E. A. Nutrient and growth interactions in soybeans colonized with Glomus fasciculatum and Rhizobium japonicum II Plant Soil. 1986. - v. 92. - p. 37-45.

87. Perrin R. Interactions between mycorrhizae and diseases caused by soil-borne fungi II Soil Use Manag. 1990. - v. 6. -p. 189-195.

88. Raju P. S., Clark R. B., Ellis J. R., Maranville J. W. Mineral uptake and growth of sorghum colonized with VA mycorrhiza at varied soil phosphorus levels // J. Plant Nutr. 1990. - v. 13. - p. 843-859.

89. Remy W., Tailor T. N., Hass H., Kerp H. Four hundred-million-years-old vesicular arbuscular mycorrhizae // Proceedings of the National Academy of Sciences USA.- 1994,-v. 91.-p. 11841-11843.

90. Rosendahl S., Sen R. Isosyme analysis of mycorrhizal fungi and their mycorrhiza. In: Methods in microbiology. Techniques for mycorrhizal research /ed. J. R. Norris, D. J. Read, A. K. Varma. Academic Press. - London, 1994. - p. 629-654.

91. Ruiz-Lozano J. M., Azcon R., Gomez M. Effects of arbuscular-mycorrhizal Glomus species on drought tolerance: Physiological and nutritional plant responses //Appl. Environ. Microbiol. 1995. - v. 61. - p. 456-460.

92. Ruiz-Lozano J. M., Azcon R., Gomez M. Alleviation of salt stress by arbuscular-mycorrhizal Glomus species in Lactuca sativa plants // Physiol. Plant. 1996. -v. 98. - p. 767-772.

93. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S„ Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B., Erich H. A. Primer-directed enzyme amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - v. 239. - p. 487-491.

94. Schenck N. C., Pérez Y. Manual for the identification of VA mycorrhizal fungi. -Gainesville: INVAM, University of Florida, 1988.-241 pp.

95. Sen R., Hepper C. M. Characterization of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi {Glomus spp) by selective enzyme staining following polyacrylamide gel electrophoresis // Soil Biol. Biochem. 1986. - v. 18. - p. 29-34.

96. Sharma M. P., Gaur A., Bhatia N. P., Adholeya A. Growth responses and dependence of Acacia nilotica var. cupriciformis on the indigenous arbuscular mycorrhizal consortium of a marginal wasteland soil // Mycorrhiza. 1996. - v. 6.-p. 441-446.

97. Simon L., Lalonde M., Bruns T.D. Specific amplification of 18S fungal ribosomal genes from vesicular-arbuscular endomycorrhizal fungi colonizing roots // Appl Environ Microbiol. 1992a. - v. 58. - p. 291-295.

98. Simon L., Levesque R. C., Lalonde M. Rapid quantification by PCR of endomycorrhizal fungi colonizing roots // PCR Methods and Application. -1992b.-v. 2.-p. 76-80.

99. Simon L., Bousquet J., Levesque R. C., Lalonde M. Origin and diversification of endomycorrhizal fungi and coincidence with vascular land plants // Nature. -1993a.-v. 363.-p. 67-69.

100. Simon L., Levesque R. C., Lalonde M. Identification of endomycorrhizal fungi colonizing roots by fluorescent single-strand conformation polymorphism -polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. — 1993b. v. 59. - p. 4211-4215.

101. Singleton L. L., Mihail J. D., Rush C. M. (eds) Methods for research on soilborne phytopathogenic fungi. St. Paul: APS Press, 1992. -p 243.

102. Smith S. E., Gianinazzi-Pearson V. Physiological interactions between symbionts in vesicular-arbuscular mycorrhizal plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bioi. 1988. - v. 39. - p. 221-244.

103. Smith S. E., Gianinazzi-Pearson V., Koide R., Cairney J. W. G. Nutrient transport in mycorrhizas: structure, physiology and consequences for efficiency of the symbiosis // Plant and Soil. 1994. - v. 159. - p. 103-113.

104. Straker C. J., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S., Cleyet-Marel J. C., Bousquet N. Electrophoretic and immunological studies on acid phosphatase from a mycorrhizal fungus of Erica hispidula // New Phytol. 1989. - v. 111. — p. 215221.

105. Subramanian K. S., Charest C. Nutritional, growth and reproductive responses of maize (Zea mays L.) to arbuscular mycorrhizal inoculation during and after drought stress at tasselling // Mycorrhiza. 1997. - v.7 - p. 25-32.

106. Sward R. J. The structure of the spores of Gigaspora margarita. II. Changes accompanying germination//New Phytol. -1981. v. 88. - p. 661-666.

107. Sylvia D. Activity of external hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi // Soil Biol. Biochem. 1988. - v. 20. - p. 39-43.

108. Tommerup I. C. The vesicular-arbuscular mycorrhizas // Adv. Plant Pathol. -1988.-v. 6.-p. 81-91.

109. Walker C Systematics and taxonomy of the Glomales: a possible way forward // Agronomie. 1992. - v. 12. - p. 887-897

110. Walker C., Trappe J. M. Names and epithets in the Glomales and Endogonales // Mycol. Res. 1993. - v. 97. - p. 339-344.

111. Wang G., Whittam T. S., Berg M., Berg D. E. RAPD (arbitrary primer) PCR is more sensitive than multilocus enzyme electrophoresis for distinguishing related bacterial strains //Nucleic Acid Res. 1993. - v. 21. - p. 5930-5935.

112. Weinbaum B. S., Allen M. F., Friese C. F. Tracking the fate of Acaulospora and Scutellospora using fluorescent antibodies // Newsletter of the MSA. 1992. - v. 43.-p. 54

113. Weller T. H., Coons A. H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagates in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954. - v. 86, n. 4.-p. 789-794.

114. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tinguey S. V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acid Res. 1990. - v. 18. - p. 6531-6535.

115. Williams P.G. Axenic culture of arbuscular mycorrhizal fungi // Methods Microbiol. 1991. - v. 24. - p. 203-220.

116. Wilson I. M., Trinick M. J., Parker C. A. The identification of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi using immunofluorescence // Soil Biol. Biochem. -1983.-v. 15.-p. 439-445.

117. Wright S. F., Franke-Snyder M., Morton J. B., Upadhyaya A. Time-course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots // Plant Soil. 1996. - v. 181. - p. 193203.

118. Wright S. F., Morton J. B. Detection of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus colonization of roots by using a dot-immunoblot assay // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - v. 55. -p. 761-763.

119. Wright S. F., Morton J. B., Sworobuk J. E. Identification of a. vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus by using monoclonal antibodies in an enzyme-linked immunosorbent assay // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - v. 53. - p. 2222-2225.

120. Wright S. F., Starr J. L., Paltineanu I. C. Changes in aggregate stability and concentration of glomalin during tillage management transition // soil Sci. -1999.-v. 63.-p. 1825-1829.

121. Wright S. F., Upadhyaya A. Extraction of an abundant and unusual protein from soil and comparison with hyphal protein of arbuscular mycorrhizal fungi // Soil Sci. 1996. - v. 161. - p. 575-586.

122. Wright S. F., Upadhyaya A. A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi // Plant Soil. 1998. - v. 198. - p. 97-107.

123. Wright S. F., Upadhyaya A. Buyer J. S. Comparison of N-linked oligosaccharides of glomalin from arbuscular mycorrhizal fungi and soils by capillary electrophoresis // Soil Biol. Biochem. 1998. - v. 30. - p. 1853-1857.

124. Wyss P., Bonfante P. Amplification of genomic DNA of arbuscular-mycorrhizal (AM) fungi by PCR using short arbitrary primers // My col Res. 1993. - v. 97. -p. 1351-1357.

125. Zézé A., Dulieu H., Gianinazzi-Pearson V. DNA cloning and screening of a partial genomic library from an arbuscular mycorrhizal fungus, Scutellospora castanea I I My corrhiza. 1994. - v. 4. - p. 251-254.