Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение кристаллической структуры мутантных форм рибосомного белка L1 и молекулярно-динамические исследования их комплексов с РНК

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Определение кристаллической структуры мутантных форм рибосомного белка L1 и молекулярно-динамические исследования их комплексов с РНК"

9846

На правах рукописи

0789

КЛЯШТОРНЫИ ВЛАДИСЛАВ ГЕОРГИЕВИЧ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ МУТАНТНЫХ ФОРМ РИБОСОМНОГО БЕЛКА Ы И МОЛЕКУЛЯРНО-ДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ КОМПЛЕКСОВ С РНК

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ ?010

Пущино-2010

004610789

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте белка РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Никонов Станислав Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук Куранова Инна Петровна

Доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «21» октября 2010 года в 14°° часов на заседании совета Д 002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке ПНЦ РАН

Автореферат разослан «21» сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук / ¡[/С-^^.Л' Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Молекулярное узнавание на протяжении долгих лет остается одной из основных проблем молекулярной биологии. Как макромолекулы находят и узнают друг друга в клетке? Почему одни белковые комплексы распадаются сразу после образования, а другие стабильны на протяжении нескольких минут и даже часов? Что определяет стабильность тех или иных комплексов? Вот далеко не полный перечень вопросов, на который еще только предстоит ответить современным исследователям. Ответы на эти вопросы очень важны для понимания принципов функционирования биологических систем.

Цель работы

Целью исследования явилось выявление структурных принципов, лежащих в основе РНК-белкового узнавания и стабильности РНК-белковых комплексов.

Научная новизна

Впервые с высоким разрешением определены пространственные структуры различных мутантных форм белка Ы из бактерии ТИегтш ЛегторИПиз (ПЫЛ) и археи МеЛапососсш ]аппа$ски (М]аЬ1). Проведен анализ изменений, вызванных теми или иными мутациями в белке. Показано, что влияние замены на изменение рельефа окружающей области может быть корректно оценено только после определения структуры мутантной формы. Проведено молекулярно-динамическое исследование мутантных форм белка Ы и их комплексов с фрагментами РНК. Показано, что методы молекулярной динамики позволяют получить важную структурную информацию, характеризующую поведение мутантной формы в свободном состоянии и в комплексе с РНК.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы неоднократно докладывались на российских и международных конференциях. Координаты структур мутантных форм белка Ы выложены в банк белковых структур РОВ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, а также обсуждения результатов и выводов и содержит в конце список цитируемой литературы. В работе представлено 30 рисунков и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект исследования

является одним из самых крупных рибосомных белков (молекулярная масса около 25 кДа). Белок состоит из двух доменов, 14- и С-концы находятся в первом домене, второй домен является вставкой по аминокислотной последовательности в первый домен. Гомологи белка Ы были найдены во всех доменах жизни: бактериях, археях и эукариотах. В клетках Ы выполняет две основные функции: рибосомную и регуляторную. В комплексе с 23Э рРНК этот белок образует один из боковых выступов большой субчастицы рибосомы. Это очень лабильное образование и его подвижность важна для высвобождения деацилированной тРНК из Е-сайта рибосомы в процессе трансляции. Помимо функционирования в составе рибосомы, Ы выполняет еще регуляторную функцию. Он способен связываться с полицистронной мРНК в области, находящейся внутри лидирующей последовательности (вблизи последовательности Шайна-Дальгарно) перед участком, кодирующим рибосомные белки Ы и Ы1, и осуществлять, таким образом, регуляцию трансляции по принципу «обратной связи». Кроме того, было показано, что белки Ь1 из различных организмов функционально взаимозаменяемы. Это указывает на то, что взаимодействующие участки на белке и РНК в различных организмах структурно схожи.

Белок Т1ЫЛ в свободном состоянии принимает закрытую конформацию, в которой его домены сближены и закрывают участки, образующие контакты с РНК. В РНК-связанном состоянии домены расходятся, белок находится в открытой конформации. Для белков Ы из архей М. ]аппа$сИИ и М. 1Иегто1ИИо1горЫси5 закрытая конформация не наблюдалась. Анализ определенной ранее структуры комплекса белка Ы с рибосомной РНК, а также сопоставление со структурами изолированных белков 1Л из различных организмов выявили на поверхности белка два структурно инвариантных участка, находящиеся в доменах I и II, соответственно. Однако в структуре комплекса рибосомного белка Ы из бактерии Т. ЖегторИНш с фрагментом мРНК только первый домен белка взаимодействует с РНК. Структуры участков рРНК и мРНК, взаимодействующих с первым доменом, практически инвариантны. Исходя из этих данных, было высказано предположение о достаточности домена I для образования комплекса, что поставило задачу выделения этого домена в изолированном состоянии и определения его структуры. Изолированный первый домен представляет собой идеальный объект для изучения РНК-белковых взаимодействий, поскольку в этом случае влияние второго домена исключено.

Для изучения взаимодействий между РНК и белком обычно используют метод точечных замен в области интерфейса. Однако нельзя заранее предсказать, как каждая замена скажется на структуре молекулы, и поэтому анализ результатов биохимических экспериментов по связыванию во многом носит гипотетический характер. Определение структур мутантных форм белка Ы в

свободном состоянии и исследование их комплексов с РНК методами молекулярной динамики позволяют выявить характер внесенных изменений и оценить их влияние на стабильность комплекса. Кроме того, эти данные просто необходимы для корректного анализа экспериментальных результатов по связыванию белка с РНК.

Область контакта с РНК на поверхности домена I рибосомного белка LI содержит строго консервативные аминокислотные остатки F37, Т40, Е42, Т217, М218, А219 (нумерация TthLl), формирующие инвариантный участок, комплементарный соответствующей области РНК (Рис.1). РНК-белковый комплекс стабилизирован системой межмолекулярных водородных связей, значительная часть которых сосредоточена в области триады Т217-М218-А219.

В рамках данной работы были определены и проанализированы пространственные структуры изолированного первого домена белка TthLl (TthLl_dl) и его комплекса с фрагментом мРНК. Кроме того, были определены пространственные структуры ряда мутантных форм белков MjaLl и TthLl в свободном состоянии с заменами аминокислотных остатков, входящих в состав РНК-узнающего модуля. Для белка MjaLl это структуры с одиночными заменами Ell к, Т204А, T204F и M205D, а также с двойной заменой Е27А/Т204А, для белка TthLl - мутантные формы F37I, S211А, Т217А, M218L и структура изолированного домена I с заменой T217V (dl_T217V).

Определение структуры изолированного первого домена белка TthLl и его комплекса с мРНК

В рибосомном белке TthLl противоположно направленные полипептидные цепи, соединяющие два домена, включают аминокислотные остатки 66-71 и 159-160, соответственно. В открытой конформации белка два глицина (Gly67 и Gly 159) расположены на расстоянии около 4Ä, что позволяет сформировать пептидную связь между двумя этими остатками без существенного изменения хода главной цепи домена. Поэтому положения этих двух глицинов наилучшим образом подходит в качестве конечных точек при удалении второго домена. Полученный таким образом изолированный первый домен белка TthLl содержал остатки 1-67 и 159-228 (рис. 1).

В свободном состоянии изолированный домен I был закристаллизован в двух пространственных группах P2i и РЗ] с разрешением 2.55Ä и 2.30Ä, соответственно (табл. 1). Кристаллы комплекса этого домена с фрагментом мРНК принадлежали к пространственной группе P2i2i2 и отражали до разрешения 2.3Ä. Наборы дифракционных данных собраны на синхротроне DESY в Гамбурге на линиях EMBL Х12 и EMBL BW7B и обработаны в программном комплексе XDS. Статистические характеристики этих наборов приведены в таблице 1.

Рисунок 1. А - аминокислотная последовательность белка ТШ1Л. Домен I показан светло-серым, область гибкого междоменного соединения показана темно-серым. В - ленточная модель структуры изолированного домена I. Нумерация элементов вторичной структуры соответствует номенклатуре для целого ПЫЛ.

Таблиг/а I. Статистические характеристики наборов дифракционных данных и уточнения структуры первого домена белка 1'1Ии в изолированном состоянии и комплексе с мРНК (в скобках представлены значения для зоны высокого разрешения).

параметры НМЛ а 1 (I) НЫЛ (11(11) ПЫЛ с11-мРНК

Пространственная группа Р2| РЗ, Р2,2,2

Параметры ячейки, А, ° а=31.7 а=Ь=79.2 а=76.1

Ь=45.3 с-47.6 Ь=144.4

с=37.9 а-р=90.0 с=56.2

а= 7=90.0 у=120.0 а=р=у=90.0

Р=100.7

Пределы разрешения, А 15.00-2.55 15.00-2.30 20.00-2.30

(2.60-2.55) (2.40-2.30) (2.40-2.30)

Длина волны, А 0.950 0.950 0.842

Общее число отражений 11175(531) 65385(7800) 114748 (13666)

Число уникальных отражений 3392(180) 14608(1754) 26880(3108)

Избыточность 3.3 (3.0) 4.6 (4.4) 4.3 (4.4)

Полнота, % 94.4(89.1) 96.8 (98.4) 95.1 (94.3)

1/0 8.8(3.5) 7.9 (3.2) 12.9 (2.6)

11.9(35.1) 13.9(46.1) 11.7(42.1)

Количество отражений, 3356(241) 14468(1476) 26514 (1905)

используемых в уточнении

IV,, % 17.7(22.7) 19.3 (21.0) 20.9(26.7)

% 27.0 (38.9) 23.3 (23.4) 27.4 (34.6)

Размер тестовой выборки, % 5.0 5.0 5.0

Число атомов в асимметричной

части ячейки: 1025 3228 4513

количество мономеров белка 1 3 2

количество молекул воды 23 152 330

Средний температурный фактор. А" 34.3 60.7 59.3

Среднеквадратичное отклонение от

стандартных значений:

валентные связи, А 0.010 0.006 0.006

валентные углы, 0 1.3 0.8 1.4

твиннинг:

закон - Ь+к, -к, -1 -

фракция - 0.41 -

Начальный набор фаз в пространственной группе Р2| был найден методом молекулярного замещения с использованием программы Phaser. Рассчитанные на основе этих фаз карты электронной плотности позволили построить практически полную модель белка за исключением первых 8 N-концевых аминокислотных остатков. Эта модель была уточнена до значений RcrySt 17.7% и Rfa-c 27.0% (табл. 1) и занесена в банк белковых структур (PDB) под номером 20UM.

Детальный анализ дифракционных данных, собранных от кристаллов первого домена, принадлежащих к пространственной lpynne P3i. выявил наличие мнроэдрального твнннинга с законом (h+k, -k, -1) и долей 0.41. Попытки устранить этот твиншшг с помощью часто используемой в таких случаях программы DETW1N не привели к успеху, поскольку при этом значительно ухудшались статистические характеристики набора данных. Поэтому было принято решение использовать твиннингованные дифракционные данные для нахождения фаз и последующего уточнения структуры. Три четких решения, соответствующие трем молекулам в асимметричной части элементарной ячейки кристалла, были найдены методом молекулярного замещения с использованием программы Phaser. Для уточнения структуры использовались специфические алгоритмы программы CNS. Конечная модель была уточнена до значений Rc,ysl 19.3% и Rfrcc 23.3% (табл. 1) и содержит помимо молекул белка 152 молекулы воды. Структура выложена в банк белковых структур (PDB) под кодом 20V7.

При решении задачи молекулярного замещения для Tthl.!_dl в комплексе с мРНК была использована структура изолированного TthLl_dl, а также структура фрагмента мРШС определенная ранее в комплексе с полноразмерным белком Mjal.l. Две копии комплекса в асимметричной части ячейки были найдены с помощью программы Phaser. Электронная плотность была хорошего качества, что позволило построить полные модели обеих молекул комплекса за исключением двух иуклеотидов в одной из цепей мРНК. После нескольких циклов ручной и автоматической правки конечная модель была уточнена до значений R^, 20.9% и IW. 27.3% (табл. 1). Эта модель, включающая 330 аминокислотных остатков, 94 нуклеотидов. 328 молекул воды и 2 иона К' , помещена в банк белковых структур (PDB) под кодом 2VP1,.

Сравнение первого домена в составе ннтактного белка TthLl и в изолированном состоянии показало, что конформация домена не претерпевает заметных изменений (рис. 2). Небольшие смещения полипептидной цепи наблюдаются только в области подвижных петель, вовлеченных в кристаллические контакты, которые в основном проявляются в кристалле, принадлежащем к пространственной группе РЗ). При наложении структур первого домена в двух состояниях по всем Co-атомам величина среднеквадратичного от клонения (rmsd) составляет около 0.9А, тогда как без учета подвижных петель эта величина уменьшается до 0.5А. Области РНК-белкового контакта инвариантны в обеих структурах.

Рисунок 2. Наложение пространственных структур изолированного домена 1 (светлый) н целого белка "ИМ.! (темный) по методу наименьших квадратов с использованием С„-атомов.

Рисунок 3. Комплекс полноразмерного белка ТШЫ с 36-нуклеотидным фрагментом мРНК (слева) и его первого домена с 48-нуклеотидным фрагментом мРНК (справа). Белки изображены в одинаковой ориентации.

Определение пространственной структуры комплекса изолированного домена I со специфическим фрагментом мРНК подтвердило, что домен 'ПЫЛ способен образовывать комплекс, полностью гомологичный комплексу, формируемому интактным белком (рис. 3).

Домены 1 н обоих комплексах накладываются друг на друга с гпЫ около 0.45А для всех С„-атомов. включая атомы Ы-концевой а-сиирали. Боковые цепи аминокислотных остатков, образующих РНК-белковые интерфейсы, занимают одинаковые положения. Общая площадь РНК-белкового контакта в обоих комплексах также одинакова и составляет приблизительно 1050А2. Все это указывает на то, что взаимодействие ТШЫ и Т1ЫЛ_(Л с мРНК осуществляется сходным

6

образом. Практически идентична оказалась также и сеть РНК-белковых водородных связей, наблюдаемая в структурах комплексов "ПЫЛ с мРНК и НЫЛсП с мРНК. В таблице 2 приведен перечень всех РНК-белковых водородных связей с указанием доступности для растворителя атомов, образующих эти связи.

Таблица 2. РНК-белковые водородные связи в комплексах полноразмерного белка Т/ИИ и его первого домена с мРНКВ скобках указана доступность для растворителя соответствующих атомов (А1).

Комплекс ПЫЛ (11 с мРНК Комплекс ТШ1Л с мРНК

атом белка атом РНК длина, А атом белка атом РНК Длина, А

ШЗ N01 (0.0) 1141 01Р (3.2) 2.4 ИэЗ N01 (0.0) изо 01Р(3.3) 2.7

1^5 N (0.0) 1)1601Р(10.1) 3.1 1^5 N (0.0) 1116 01Р (13.9) 3.1

\гф ИЕ (0.0) С15 01Р (1.4) 2.9 Агкб ЫЕ (0.0) С1501Р(1.4) 2.9

Туг7 ОН (10.9) 1142 01Р (8.8) 2.3 Туг7 ОН (10.9) и31 01Р (8.3) 2.5

ЬузЗб N (0.0) йН 01Р (0.9) 2.8 ЬуБЗб N (0.0) 014 01Р (0.6) 2.6

ТМОСХЛ (0,1) 011 01Р (20.3) 2.6 ТЬг40 001 (0.6) 011 01Р (3.9) 2.6

01и42 ОЕ2 (0,0) вЮ 02' (0.0) 2.7 Ми42 ОЕ2 (0.0) ею 02' (0.0) 2.6

Ьуз46 N2(10.2) А44 02' (0.0) 3.0 1^46 Ж (8.7) АЗЗ 02' (0.0) 3.0

1^70 ыг (21.1) 011 01Р(3.9) 3.1

Азр1бб СЮ2 (0.0) в! N2 (0.0) 3.0 Авр166 0 02 (0.0) 07 N2 (0.0) 3.0

ТЬг168 001 (0.0) А44 02' (0.0) 2.8 ТЬг168 001 (0.0) АЗЗ 02'(0.0) 2.6

5ег211 ОО (0.0) А44 01Р (15,1) 2.7 5ег211 00(1.2) АЗЗ 01Р (14.5) 2.8

ТЬг217 О (0.0) 010 N2 (0.0) 3.3 ТЬт217 0 (0.0) вЮ N2 (0.0) 3.0

ТЬг217 001 (0.0) 010 02' (0.0) 2.7 ТЬг217 001 (0.0) 010 02' (0.0) 2.8

ау219 0(0.0) Ц41 02' (0.0) 2.4 ау219 0(0.0) ШО 02' (0.0) 2.7

8ег221 00 (8.0) С43 01Р (17.8) 2.8 5ег221 00 (8.7) С32 01Р (19.9) 2.6

число водородных связей 15 число водородных связей 16

число недоступных для растворителя водородных связей 9 число недоступных для растворителя водородных связей 10

Расстояние, А

Рисунок 4. Число РНК-белковых взаимодействий в комплексе полноразмерного белка НЫЛ с мРНК (черный) растет с увеличением межатомного расстояния быстрее, чем для комплекса первого домена с мРНК (серый).

Анализ доступности для растворителя отдельных аминокислотных остатков, вовлеченных во взаимодействие с мРНК, не выявил существенных различий между двумя комплексами. Единственным важным исключением является водородная связь, образованная боковой цепыо Thr40. В комплексе полноразмерного белка эта водородная связь закрыта от растворителя боковой цепыо Lys70. В результате удаления второго домена и вместе с ним Lys70 эта водородная связь становится доступной для растворителя. Последнее обстоятельство могло сыграть решающую роль и привести к наблюдаемому изменению плотности РНК-белковых контактов в комплексе (рис. 4)

Определение структур мутаптных форм уибосомного белка L1

Контакт между белком и РНК стабилизирован сеткой водородных связей, которые существуют только при расстояниях между полярными атомами в пределах 2.5-3.5А. Увеличение межмолекулярных расстояний на 0.2-0.3А приводит к разрыву водородных связей и распаду комплекса. Очевидно, что любая точечная замена приводит к изменению рельефа поверхности в точке мутации. Однако влияние замены на близлежащие участки без определения структуры мутантной формы оценить невозможно. В данном разделе исследуются изменения рельефа поверхности и распределения полярных атомов в области контакта между белком L1 и РНК, вызванные точечными заменами аминокислотных остатков в этой области.

Все кристаллы, используемые в работе, были получены сотрудниками института белка РАН. Наборы дифракционных данных для каждого из кристаллов вышеуказанных мутантных форм были собраны на синхротроне DESY в Гамбурге на линиях EMBL Х12 и EMBL BW7B, а также на синхротроне SLS в Швейцарии на линиях РХ и X06SA. Наборы дифракционных данных были обработаны в программном комплексе XDS. Статистические характеристики этих наборов приведены в таблицах 3 и 4.

Структуры изолированных мутантных форм белка были определены методом молекулярного замещения с использованием программы Phaser. В качестве стартовой модели были использованы соответствующие структуры белков дикого типа TthLl и MjaLl, расшифрованные ранее. После получения набора фаз и построения карт электронной плотности модели были подвергнуты нескольким циклам ручной правки в программе молекулярной графики Coot, а также автоматическому уточнению с помощью программы REFMAC. Статистика уточнения также приведена в таблицах 3 и 4. Карты электронной плотности для мутантных форм белка MjaLl были хорошего качества за исключением области, соответствующей С-концевому участку молекулы (остатки 213-219).

мутантных форм белка ЩаИ (■в скобках представлены значения для зоны высокого разрешения).

Параметры Е27А Т204А Е27А/Т204А T204F M205D

Пространственная группа Р1 Р1 Р1 Р1 С2

Параметры ячейки, А, ° а=33.8 а=34.0 а=34.0 а=33.9 а=133.3

Ь=39.0 Ь=38.5 Ь=39.1 Ъ=38.4 Ь=33.7

с=54.8 с=55.2 с=55.3 с=55.1 с=123.3

а=83.0 а=82.3 а=83.1 а=83.0 а=90.0

13=79.5 Р=78.8 р=79.7 р=79.3 0=114.2

7=75.5 7=76.7 7=75.3 7=76.2 7=90.0

Пределы разрешения, А 25.00-2.10 16.00-2.03 25.00-2.14 16.00-1.90 25.00-2.87

(2.20-2.10) (2.10-2.03) (2.20-2.14) (1.95-1.90) (3.00-2.87)

Длина волны,А 0.843 0.843 0.843 0.843 1.072

Общее число отражений 40754(5166) 45184(3997) 56067(3520) 56301(4116) 43089(4950)

Число уникальных отражений 14635(1874) 15709(1407) 14609(913) 19756(1445) 11696(1361)

Избыточность 2.8 (2.8) 2.9 (2.8) 3.8(3.9) 2.8(2.8) 3.7 (3.6)

Полнота, % 94.5 (94.5) 91.5 (85.6) 92.6 (94.8) 94.8(93.5) 97.4 (94.3)

1/о 13.7 (3.2) 19.3 (3.8) 25.4 (5.4) 20.2 (5.6) 12.2(3.5)

И™ 6.6 (32.7) 3.8(27.5) 3.0 (26.8) 3.9(21.9) 8.5(41.1)

Количество отражений, 14265 15722 13727 19158 11125

используемых в уточнении (1000) (1047) (965) (1389) (752)

Яс^, % 15.7(18.1) 9.4 (29.7) 19.9(23.0) 18.3 (25.9) 21.2(30.1)

Штее, % 25.5 (32.3) 25.6 (33.6) 25.2(25.8) 25.3 (37.4) 26.4 (39.7)

Размер тестовой выборки, % 5.0 5.1 5.0 5.1 5.3

Число атомов в

асимметричной части ячейки: 1869 1855 1874 1934 3400

количество мономеров белка 1 1 1 1 2

количество молекул воды 164 165 153 232 -

Средний температурный

фактор, А2 34.4 36.5 47.4 29.1 60.9

Среднеквадратичное

отклонение от стандартных

значений:

валентные связи, А 0.009 0.010 0.009 0.007 0.008

валентные углы,0 1.2 1.2 1.4 1.4 1.1

В модели белка TthLl дикого типа отсутствует 8 N-концевых аминокислотных остатков. В случае же мутантных форм этого белка удалось получить структуры, содержащие с 4 по 228 аминокислотные остатки. Тем не менее, для первых N-концевых аминокислотных остатков качество электронной плотности низкое, что свидетельствует о высокой подвижности этого участка.

Первый домен белка TthLl с заменой T217V был закристаллизован в пространственной группе РЗ ] с параметрами элементарной ячейки близкими к кристаллической форме (И) для TthLl_dl. В этих кристаллах также был выявлен твиннинг со сходными параметрами. При поиске решения задачи молекулярного замещения три мономера TthLl_dl (II) использовались как единое твердое тело. Уточнение структуры осуществлялось в программном комплексе Phénix с использованием целевых функций для уточнения при наличии твиннинга. После нескольких циклов ручной и автоматической правки модель была уточнена до значений R,^ 19.6% и Rfrl;s 25.3%. Модель содержит 40 молекул воды и удовлетворяет всем стереохимическим и рентгеноструктурным критериям.

мутантных форм белка ТЛИ (в скобках представлены значения для зоны высокого разрешения).

Параметры F37I S211A Т217А M218L dl T217V

Пространственная группа Р2,2,2 Р2,2,2 Р2,2,2 Р2,2,2 РЗ,

Параметры ячейки. А,0 а=80.8 а=80.9 а=80.9 а=74.9 а=77.7

Ь=62.2 Ь=62.0 b=62.1 Ь=60.0 Ь=77.7

с=43,8 с=43.7 с=43.6 с=43.9 с=48.1

а=Р=у=90.0 а=Р=у=90.0 а=Р=у=90.0 а=Р=Т=90.0 а=р=90.0 7=120.0

Пределы разрешения, А 20.00-1.31 20.00-1.46 20.00-1.46 15.00-2.00 15.00-2.45

(1.40-1.31) (1.60-1.46) (1.60-1.46) (2.10-2.00) (2.55-2.45)

Длина волны,А 1.072 1.072 1.072 0.950 0.900

Обшее число отражений 363312 (58631) 270941(60747) 268278(59044) 48907(6530) 51588 (7424)

Число уникальных отражений 52215(8922) 38396 (8844) 38090(8632) 13468(1740) 10209(1504)

Избыточность 7.0 (6.6) 7.1 (6.9) 7.0 (6.8) 3.6 (3.8) 5.1 (4.9)

Полнота, % 97.0(93.2) 98.7 (96.5) 97.8(94.1) 97.0(95.1) 96.2 (88.5)

I/o 22.6(9.1) 21.0(7.4) 25.2 (9.4) 9.0 (4.0) 12.4(2.6)

R«m 5.2(19.3) 5.0(18.0) 4.5(19.5) 9.7 (42.4) 9.6 (49.7)

Количество отражений. 49928 36718 36430 12987 11819

используемых в уточнении (3598) (2558) (2488) (884) (1850)

Rcryst, % 18.1 (22.6) 13.8(17.9) 16.4 (25.2) 17.9(18.2) 19.6(28.2)

Rfree, % 20.6(24.1) 19.1 (22.7) 20.2 (24.8) 24.6(17.2) 25.3 (32.0)

Размер тестовой выборки, % 5.1 5.0 5.0 5.1 5.0

Число атомов в

асимметричной части ячейки: 2411 2464 2434 2123 3097

количество мономеров белка 1 1 1 1 3

количество молекул воды 295 365 310 136 40

Средний температурный

фактор, А2 18.8 20.4 22.5 28.4 56.4

Среднеквадратичное

отклонение от стандартных

значений:

валентные связи, А 0.007 0.009 0.011 0.009 0.001

валентные углы,0 1.6 1.3 1.4 1.4 0.4

Мутаптпые форлш белка М]аИ

Структуры четырех мутантных форм с одиночными заменами Е27А, Т204А, Т204Р и М2050, а также мутантная форма с двумя заменами Е27А/Г204А были сопоставлены со структурой белка М]аЫ дикого типа, определенной ранее. Оказалось, что мутации Е27А и Т204А не меняют ни ход главной цепи молекулы, ни положение боковых групп аминокислотных остатков, не подвергавшихся заменам. Положение Ср-атомов в заменяемых аминокислотных остатках совпадает с положением этих атомов в соответствующих остатках белка дикого типа. В месте замены образуется локальная впадина, эффект замены практически не распространяется на соседние остатки.

Влияние этих замен на РНК-связывающие свойства белка может сводиться в основном к утере соответствующих водородных связей и появлению внутри интерфейса несвязанных полярных или заряженных атомов РНК. Известно, что наличие таких атомов в области, недоступной растворителю, дестабилизирует структуру. Этот эффект особенно сильно проявляется при двойной мутации; мутантная форма Е27А/Т204А не образует комплекс ни с мРНК, ни с рРНК.

Замена T204F приводит к заметным изменениям рельефа поверхности в области, прилегающей к точке замены. Боковая группа фенилаланина мутантной формы белка стремится занять положение боковой группы треонина, наблюдаемое для белка дикого типа. В результате, F204 выталкивает боковую цепь М205, что приводит к смещению участка цепи, включающий F22, и изменяет взаимное расположение петель, содержащих эти остатки (рис. 5А). Модифицированный участок поверхности стабилизирован стекинг-взаимодействиями и внутримолекулярными водородными связями. В области, занятой М205 образуется выступ величиной около 1Á, который может препятствовать образованию сетки водородных связей, характерной для белка дикого типа.

Рисунок 5. Структурные изменения в мутантных формах белка М|аЫ (серый) по сравнению с белком дикого типа (черный). А - Изменение участка поверхности, содержащего точку мутации, для мутантной формы Т204Р. В - Изменение хода главной цепи в молекуле М]аЫ, вызванное мутацией М205Э. Наложение осуществлено по Р-тяжам домена I.

Мутантная форма М205Р белка М|аЫ кристаллизуется в пространственной группе С2 в отличие от Р1, характерной для MjaLl дикого типа и всех остальных мутантных форм этого белка. Замена М2050 приводит к образованию димера и находит свое отображение в изменении пространственной группы. При этом изменяется взаимное расположение доменов белка, а также конформация петель домена I, значительно удаленных от места мутации (рис. 5 В), тогда как достаточно хорошо сохраняется структура участка, включающего точку мутации. Положение Су-атомов боковых групп метионина и аспарагиновой кислоты практически совпадают, тогда как среднеквадратичное отклонение (гпиА) положений Са-атомов мутантной формы относительно белка дикого типа составляет 1.8А для всего белка и 1.3А для домена I. Структура же домена II

А

В

М205

сохраняется значительно лучше (rmsd=0.5Á).

Мутантные формы белка TthLl с одиночными заменами аминокислотных остатков

Кристаллические структуры четырех мутантных форм белка TthLl с заменами F37I, S211А, Т217А и M218L были сопоставлены со структурой белка TthLl дикого типа. Оказалось, что для двух мутантных форм F371 и S211A практически не произошло изменений, как в ходе главной цепи, так и в положениях боковых групп аминокислотных остатков, не подвергавшихся заменам. Более того Ср и Сг-атомы боковых групп заменяемых остатков сохранили свое положение. Боковая группа изолейцина расположилась в плоскости кольца фенилаланина белка дикого типа. Среднеквадратичные отклонения положений С„-атомов этих мутантных форм относительно Са-

I

атомов белка TthLl дикого типа не превышают ошибку измерения координат как для белка в целом, так и для участка, включающего места мутаций. Тем не менее, при замене F371 на поверхности белка образуется полость, через которую молекулы воды могут проникать внутрь РНК-белкового интерфейса. Это уменьшает сродство мутантной формы к рРНК практически на порядок, тогда как связывание с мРНК падает более чем на два порядка.

Остаток S211 находится на периферии РНК-белкового интерфейса. Замена S211А не оказала влияния ни на рельеф поверхности области контакта, ни на соседние аминокислотные остатки. Атом РНК, образующий водородную связь с серином в комплексе, содержащем белок дикого типа, доступен воде при замене сернна на аланнн Экспериментальные данные свидетельствуют о практически полном сохранении аффиности такой мутантной формы белка как к рРНК, так и к мРНК.

Иначе обстоит дело с мутантной формой Т217А. Эта мутация приводит к смещению петли Р9-Р10. Такое изменение структуры предвидеть заранее было достаточно трудно, поскольку в белке дикого типа положение петли стабилизировано тремя водородными связями. Замена Т217А исключает возможность образования только одной связи, в которую вовлечен атом OG Thr217. Тем не менее, участок петли 215-219 смещается в направлении нереализованной связи. Отсутствие боковой цепи треонина дает возможность двум молекулам воды проникнуть внутрь белка, стабилизировать структуру РНК-связывающего участка и создать на его поверхности выступ, препятствующий образованию плотного контакта с РНК (рис. 6).

Замена метионина на лейцин, подобно замене метионина на аспартат в MjaLl приводит к изменению параметров элементарной ячейки (табл. 4) и расположения доменов друг относительно друга. В районе мутации происходят изменения в петле Р9-Р10. Аминокислотные остатки в положениях 215-219 оказываются существенно сдвинутыми относительно этого участка в белке дикого типа, что приводит к изменению рельефа поверхности РНК-связывающего участка белка и нарушению его комплементарное™ к соответствующему участку РНК.

TthL1_wt T217-A TthL1_T217A

Рнсунок 6. Включение молекул воды в структуру белка TthLl при замене Т217А. Молекулы воды занимают образовавшиеся пустоты, что приводит к конформационным изменениям в этой области.

Замена T217V ведет к резкому снижению сродства к РНК. Константа ассоциации уменьшается приблизительно на один порядок, в то время как константа диссоциации увеличивается практически на три порядка по сравнению с TthLl_dl. В белке дикого типа боковая цепь Т217 формирует водородную связь с атомом азота главной цепи Т40. Кроме того взаимное положение петли р9-рю, N-концевой спирали и петли cti-Pi сильно стабилизировано сетью водородных связей. Анализ показывает, что замена гидроксильной группы Т217 на метильную смещает петлю Р9-Р10 в направлении М218 на 1Á, формируя выступ на поверхности белка. Это ведет к тому, что петля ar(3i, содержащая строго консервативный F37, приобретает дополнительную подвижность. Повышенная подвижность этой области позволяет молекулам воды проникать во внутреннюю полость интерфейса, что ведет к дестабилизации комплекса.

Молекулярно-динамические исследования белка L1 и его комплексов с РНК

Для некоторых из полученных структур были проведены молекулярно-динамических исследования с использованием программ Gromacs и Charmm. Задача таких исследований заключается в выявлении динамики всех атомов системы под действием внутри и межмолекулярных сил на наносекундной временной шкале. Предварительно моделируемая молекула помещалась в орторомбический ящик, заполненный молекулами воды. Электронейтральность системы достигалась за счет добавления соответствующего числа моновалентных ионов Na+ или СГ в зависимости от суммарного электрического заряда молекулы. Для всех моделируемых систем были применены периодические граничные условия. Перед моделированием проводилась минимизация энергии, целью которой было устранение стерических перекрываний атомов и устранение неблагоприятных контактов. Достижение области локального минимума оценивалось по графику потенциальной энергии.

Следующая стадия моделирования заключалась в уравновешивании системы. Схема

13

уравновешивания системы несколько отличалась в зависимости от используемой программы. В программе Gromacs уравновешивание системы осуществлялось в течение 50 пикосекунд с поддержанием постоянных температуры и давления системы, В программе Charmm этой процедуре предшествовала стадия нагревания от ОК до 300К в течение 30 пикосекунд, в ходе которой в систему постепенно добавлялась кинетическая энергия. Задачей уравновешивания является полная релаксация молекул воды, а также растворенной молекулы, атомы которой находят оптимальные положения. Достижение системой равновесия отслеживалось по графику среднеквадратичного отклонения (rmsd) от стартовой структуры, а также по кривой изменения энергетических характеристик моделируемой системы.

После этого осуществлялся непосредственно расчет молекулярно-динамической траектории, т.е. изменение координат всех атомов системы во времени. Для белков в изолированном виде с помощью программы Gromacs были рассчитаны траектории длиной 1 не. Для комплексов была использована программа Charmm, при этом длина траекторий составила 3 не. В различных программах применяются несколько отличные алгоритмы и параметры моделирования. В Gromacs использовались оптимизированные для водных растворов силовые поля OPLS. При этом для ограничения всех валентных связей был применен алгоритм L1NCS, что позволило использовать шаг интегрирования 2 фемптосекунды. Электростатические взаимодействия были рассчитаны с использованием метода Эвальда для сетей частиц е параметрами среза (cut-off) 10А для электростатических взаимодействий и 14А - для ван-дер-ваальсовых. Моделирование осуществлялось при постоянных температуре (300К) и давлении (1 атм). Координаты сохранялись каждую 1 пс.

Для анализа РНК-белковых комплексов были проведены более точные молекулярно-динамические исследования с использованием программы Charmm и силовых полей CHARMM27, специально оптимизированных для биологических макромолекул. При расчетах не налагались ограничения на валентные связи, поэтому шаг интегрирования составлял 1 фемптосекунду. Электростатические и ван-дер-ваальсовые взаимодействия рассчитывались до расстояния 13А с применением на расстоянии 12-13А сглаживающих функций. Моделирование также осуществлялось при постоянных температуре (300К) и давлении (1атм). Координаты сохранялись каждую 1 пс.

В рамках данной работы были проведены молекулярно-динамические исследования некоторых из мутантных форм белка L1 в свободном и связанном с РНК состояниях. Для верификации полученных траекторий были использованы исходные экспериментальные структуры и проанализированы отклонения структуры от начальной модели по ходу траектории. Кроме того, на различных стадиях моделирования проверялись стереохимические параметры систем: длины и углы валентных связей, планарность пептидных групп и ароматических колец.

Изолированные белки были промоделированы с использованием программы Gromacs. Траектории длиной 1нс были рассчитаны для белков TthLl и MjaLl, а также для их мутаитных форм: MjaLl_E27A, MjaLl_Т204А, MjaL1_T204l?, MjaLl _Н27ЛЛ'204А, TthLl J717A. TthLl_dl, TthL 1 _d 1 T217V. На рисунках 7 и 8 представлены графики атомных флуктуации Св-атомов но ходу траектории для некоторых мутаитных форм белков MjaLl и TthLl. Анализ показывает, что в целом наблюдается схожая картина подвижности различных элементов структуры для мутаитных форм по сравнению с белками дикого тина. В пределах длины траектории флуктуации С0-атомов всех исследованных мутаитных форм не превышают 0.25А. Эта неличина меньше ошибки определения координат атомов, что позволяет считать конформацию области контакта на поверхности белка в растворе соответствующей ею конформащш в кристалле.

Рисунок 7. Атомные флуктуации (.'„-атомов по ходу траектории для белка М|а1Л и его мутаитных форм 1£27А и Т204А.

С помощью программы Огагтт были рассчитаны молекулярно-дннамические траектории длиной 3 не для комплексов первого домена белка 'ПЫЛ и его мутаитных форм с фрагментами ми рРНК. Были промоделированы следующие комплексы: 'Ш^1_с11-т1УМА. 'ПЫЛ _ё1-гКЫА, Т1ЫЛ_а!_Т217У-тГША. ТШГ., 1 _(11_Т217У-гКЫА, ТИ11Л_сП_Р371-т11МА, Т1ЫЛ_(11 _К371-гЯКА,

Т1Ы1-1_с1]_5211А-шКЫА н ТЛЬЬ1 _с118211А-гККА. Стартовые модели комплексов были получены

из соответствующих рибосомного и регуляторного комплексов дикою типа с помощью процедуры докннга. На рисунке представлены атомные флуктуации С„-атомов изолированного домена 1 белка ТШЛ и грех его мутаитных форм в комплексах с мРНК.

Подвижность петель в 1Л. связанных с РНК, коррелирует с подвижностью тех же петель в свободных белках (рис. 8, 9). 1 [рактпчсски все мутации приводят к повышению подвижности Ы-концевого участка молекулы и петель «;-Рь Р1-Р2, «7-Рч- Повышенная подвижность этих областей

I ATftMiiwe$.ivkrvnjniii(nmnC» ¿irftuoinioxtuvrpaevropKH

—MiJi.i: Е:ГД

характерна и для белков дикого типа.

Рисунок 8. Атомные флуктуации С„-атомов по ходу траектории для первого домена белка ЧЧЬЫ и его мутантной формы с заменой '¡ ^ПУ.

Анализ полученных результатов показал, что для комплекса, образованного изолированным первым доменом, флуктуации в области контакта (остатки 37-42 и 217-219) лежат в пределах 0.5-0.75А. Можно утверждать, что такие флуктуации не приводят к деградации комплекса, так его кажущаяся равновесная константа диссоциации, согласно измерениям, выполненным в нашей лаборатории, оценивается в 8.4 х 10"9М Для комплексов, образованных мутантными формами первою домена, флуктуации значительно выше и могут достигать 1.5А, что должно вести к дестабилизации комплексов. Эти данные хорошо подтверждаются результатами биохимических экспериментов. Как и следовало ожидать, наиболее близким по своим характеристикам к комплексу, образованному доменом 1 дикого типа, оказался комплекс, образованный мутантной формой 8211 А.

Ранее мы предполагали, что замена строго консервативного Р37 па любой меньший остаток может вести к проникновению воды в область интерфейса и дестабилизации комплекса. На рисунке 10 показано взаимное положение белка и мРНК после 3 не молекулярной динамики. Видно, что нарушение контактов между белком и РНК начинается с этой области, что подтверждает наше предположение.

Таким образом, исследование РНК-белковых комплексов методами молекулярной динамики приводит к результатам, совпадающим с результатами, полученными другими методами, и позволяет получить структурную информацию, характеризующую поведение комплекса. Эта информация во многих случаях уникальна, поскольку комплексы, образуемые мутантными формами, практически не удается закристаллизовать.

16

Рисунок 9. Атомные флуктуации С„-атомов по ходу траектории для первого домена белка ТЧЫЛ и его мутантных форм в составе комплексов с мРНК.

Рисунок 10. Структурная модель после 3 не молекулярной динамики. Для белка НМЛ с заменой 5211А (слева) большинство нативных контактов сохранилось, в то время как для белка ТШЫ с заменой | Р371 (справа) значительная часть нативных контактов разрушена. Черным показана РНК, серым - белок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Определены пространственные структуры изолированного первого домена белка LI из Т. thermophilus и его комплекса с мРНК. Показано, что конформации области РНК-белкового интерфейса интактного белка TthLl и его первого домена идентичны как в свободном состоянии, так и в комплексах с мРНК.

2. Определены и проанализированы пространственные структуры пяти мутантных форм белка LI из Melhanococcus jannaschii с заменами Е27А, Т204А, T204F, M205D и Е27А/Т204А, четырех мутантных форм белка LI из Thermus thermophilus с одиночными заменами Т217А, F371, SUA, M218L и мутантной формы первого домена TthLl с заменой T217V .

3. Показано, что замены консервативных аминокислотных остатков могут привести к значительным изменениям рельефа поверхности РНК-белкового контакта, способным нарушить сетку межмолекулярных водородных связей и исключить образование или в значительной степени уменьшить время жизни РНК-белкового комплекса.

4. Проведены молекулярно-динамические исследования вышеуказанных мутантных форм белков LI в свободном состоянии. Показано, что в пределах доступных длин траекторий конформация этих форм белка не претерпевает значительных изменений, что позволяет использовать их кристаллические структуры для докинга белка и РНК.

5. Проведены молекулярно-динамические исследования ряда РНК-белковых комплексов, образованных мутантными формами. Показано, что методы молекулярной динамики приводит к результатам, совпадающим с результатами, полученными другими методами, и позволяют получить структурную информацию, характеризующую поведение комплекс а. Эта информация во многих случаях уникальна, поскольку комплексы, образуемые мутантными формами, практически не удается закристаллизовать.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1) New insights into the interaction of ribosomal protein LI with RNA. N. Nevskaya, S. Tishchenko, S. Volchkov, V. Kljashtorny, E. Nikonova, O. Nikonov, A. Nikulin, C. Kohrer, W. Piendl, R. Zimmermann, P. Stockley, M. Garber and S. Nikonov. J. Mol. Biol. (2006) 355, pp. 747-759.

2) Кинетические, энергетические и стереохимические факторы, определяющие молекулярное узнавание белков и нуклеиновых кислот. В.И. Лим, В.Г. Кляшторный. Молекулярная биология (2006), 40, 572-579.

3) Кристаллические структуры мутантных форм рибосомного белка LI. Е. Никонова, С. Волчков, В. Кляшторный, С. Тшценко, О. Костарева, Н. Невская, О. Никонов, А. Габдулхаков, А. Никулин, Н. Давыдова, В. Стрельцов, М. Гарбер и С. Никонов. Молекулярная биология (2007), 40, 688-696.

4) Domain I of ribosomal protein LI is sufficient for specific RNA binding. S. Tishchenko, E. Nikonova, V. Kljashtorny, O. Kostareva, N. Nevskaya, W. Piendl, N. Davydova, V. Streltsov, M. Garber and S. Nikonov. Nucleic Acids Research (2007), V. 35, №21, pp. 7389-7395.

5) Domain II of Thermus thermophilic Ribosomal Protein LI Hinders Recognition of Its mRNA. S. Tishchenko, V. Kljashtorny, O. Kostareva, N. Nevskaya, A. Nikulin, P. Gulak, W. Piendl, M. Garber and S. Nikonov. J. Mol. Biol. (2008) 383, pp. 301-305.

6) Disruption of Shape Complementarity in the Ribosomal Protein LI-RNA Contact Region does not Hinder Specific Recognition of the RNA Target Site. O. Kostareva, S. Tishchenko, E. Nikonova, V. Kljashtorny, N. Nevskaya, A. Nikulin, A. Sycheva, S. Moshkovskii, W. Piendl, M. Garber and S. Nikonov. Journal of Molecular Recognition (2010) 23, pp. 1-9.

Тезисы:

1) Волчков C.A., Кляшторный В.Г., Никонов О.С., Тшценко С.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Гарбер М.Б. Структура комплекса рибосомного белка LI Thermus themophilus с фрагментом мРНК Melhanococcus vannielii. XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 7-10 февраля 2005г.

2) Волчков С.А., Кляшторный В.Г., Тищенко С.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Невская Н.А., Никонов С.В. Выделение функционально-важных участков на поверхности регуляторного комплекса Ll-мРНК. 9-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино 18-22 апреля 2005г.

3) Волчков С.А., Кляшторный В.Г., Никонов О.В, Тищенко С.В., Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Невская Н.А., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Изучение РНК-связывающих свойств рибосомного белка L1. Структурные аспекты регуляции трансляции. XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 7-10 февраля 2006г.

4) Кляшторный В.Г., Никонов С.В. Выделение РНК-узнающего модуля на поверхности рибосомного белка L4. XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 7-10 февраля 2006г.

5) Кляшторный В.Г., Никонов С.В. Выделение РНК-узнающего модуля на поверхности рибосомного белка L14. 10-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино 17-21 апреля 2006г.

6) S.V. Tishchenko, E.Yu. Nikonova, O.S. Kostareva, A.D. Nikulin, V.G. Klyashtorny, S.A. Volchkov, O.S. Nikonov, N.L. Davydova, N.A. Nevskaya, S.V. Nikonov, M.B. Garber, W.Piendl. Crystallization and structural investigation of regulatory complexes between ribosomal protein LI and specific mRNA fragments. International conference on "Protein biosynthesis, structure and fimction", Pushchino 9-13 June 2007. Abstracts, p.20.

7) O.C. Костарева, С.В. Тищенко, Е.Ю. Никонова, В.Г. Кляшторный, М.Б. Гарбер. Домен I рибосомного белка L1 специфически связывается с РНК. 12-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино 10 - 14 ноября 2008 г. Сборник тезисов, стр. 34.

8) О.С. Костарева, В.Г. Кляшторный, Е. Никонова. Влияние рельефа поверхности специфического РНК-узнающего модуля рибосомного белка L1 на его взаимодействие с РНК. XVII международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Биология», Москва 12-15 апреля 2010г. Тезисы докладов, стр. 201.

Структуры, занесенные в банк белковых структур PDB:

1) 1ZHO. The structure of a ribosomal protein LI in complex with mRNA. Nevskaya, N., Tishchenko, S., Volchkov, S., Kljashtorny, V., Nikonova, E., Nikonov, O., Nikulin, A., Piendl, W., Zimmermann, R., Garber, M., Nikonov, S.

2) 20UM. The first domain of LI from Thermus thermophilus. Kljashtorny, V., Tishchenko, S., Nevskaya, N., Nikonov, S., Davydova, N., Garber, M.

3) 20V7. The first domain of LI from Thermus thermophilus. Kljashtorny, V., Tishchenko, S., Nevskaya, N., Nikonov, S., Davydova, N., Garber, M.

4) 2VPL. The structure of the complex between the first domain of LI protein form Thermus thermophilus and mRNA from Methanococcus jannaschii. Kljashtorny, V., Tishchenko, S., Nevskaya, N., Nikonov, S., Garber, M.

Заказ № 97-а/09/10 Подписано в печать 14.09.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maiUinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кляшторный, Владислав Георгиевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы: основные методы исследования структур макромолекул.

1.1. Экспериментальные методы.

1.2. Рентгеноструктурный анализ, как один из наиболее мощных методов определения пространственной структуры биологических макромолекул.

1.2.1. Теоретические основы метода.

1.2.2. От кристаллов до конечной модели: основные этапы определения пространственной структуры.

1.2.2.1. Выделение, очистка и кристаллизация препарата.

1.2.2.2. Сбор и обработка дифракционных данных.

1.2.2.3. Проблема фаз и пути ее преодоления.

1.2.2.4. Уточнение модели.

1.2.3. Характеристики метода и критерии достоверности полученных результатов.

1.2.4. Перспективы дальнейшего развития метода.

1.3. Теоретические методы.

1.3.1. Метод молекулярной динамики как один из наиболее мощных подходов изучения конформационных изменений в биологических системах.

1.3.2. Теоретические основы метода.

1.3.3. От статики к динамике: основные этапы расчета молекулярно-динамической траектории.

1.3.3.1. Подготовка системы.

1.3.3.2. Минимизация энергии.

1.3.3.3. Уравновешивание системы.

1.3.3.4. Расчет молекулярно-динамической траектории.

1.3.3.5. Анализ полученных данных.

1.3.4. Характеристики метода молекулярной динамики и критерии достоверности полученных результатов.

1.3.5. Перспективы дальнейшего развития метода.

1.4. Комбинированный подход к исследованию функционирования биологических макромолекул.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Объект исследования: общая характеристика белка L1.

2.1.1. Функциональная активность белка L1.

2.1.2. Структурная характеристика белка L1.

2.1.2.1. L1 из Thermus thermophilic.

2.1.2.2. L1 из Methanococcus jannaschii.

2.1.2.3. Две конформации для белков L1.

2.1.3. Взаимодействие между белком L1 и РНК.

2.1.3.1. Рибосомный комплекс.

2.1.3.2. Регуляторный комплекс.

2.1.3.3. Сравнение структур комплексов Ll-мРНК и Ll-pPHK.

2.2. Определение пространственных структур мутантных форм белка L

2.2.1. Сбор и обработка дифракционных данных.

2.3. Молекулярно-динамические исследования белка L1 и его комплексов с РНК.

2.3.1. Подготовка системы.

2.3.2. Минимизация энергии.

2.3.3. Уравновешивание системы.

2.3.4. Расчет молекулярно-динамических траекторий.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Анализ кристаллических структур.

3.1.1 Анализ структуры изолированного первого домена белка TthLl и его комплекса с мРНК.

3.1.2. Анализ структур мутантных форм рибосомного белка L1.

3.1.2.1. Точечные замены в MjaLl.

3.1.2.1. Точечные замены в TthLl.

3.3. Молекулярно-динамические исследования.

3.3.1. Изолированные мутантные формы белка L1.

3.3.2. Комплексы белка L1 и его мутантных форм с фрагментами РНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение кристаллической структуры мутантных форм рибосомного белка L1 и молекулярно-динамические исследования их комплексов с РНК"

Молекулярное узнавание биологических макромолекул на протяжении долгих лет остается одной из основных проблем молекулярной биологии. Как макромолекулы находят и узнают друг друга в клетке? Почему одни белковые комплексы распадаются сразу после образования, а другие сохраняются на протяжении нескольких минут и даже часов? Что определяет стабильность тех или иных комплексов? Вот далеко не полный перечень вопросов, на который еще только предстоит ответить современным исследователям.

Для изучения взаимодействий между РНК и белком обычно используют метод точечных замен в области интерфейса. Однако нельзя заранее предсказать, как каждая замена скажется на структуре молекулы, и поэтому анализ результатов биохимических экспериментов по связыванию во многом носит гипотетический характер. Определение структур мутантных форм белка L1 в свободном состоянии и исследование их комплексов с РНК методами молекулярной динамики позволяют выявить характер внесенных изменений и оценить их влияние на стабильность комплекса. Кроме того, эти данные просто необходимы для корректного анализа экспериментальных результатов по связыванию белка с РНК.

В рамках данной работы на примере комплексов рибосомного белка L1 с различными фрагментами рРНК и мРНК исследуется влияние точечных мутаций на конформацию РНК-связывающего участка белка в свободном состоянии и, как следствие, на образование и стабильность РНК-белкового комплекса, которая оценивается методами молекулярной динамики. Сравнение полученных данных с результатами биохимических экспериментов позволяет выявить структурные принципы, лежащих в основе специфичности РНК-белкового взаимодействия. Предпосылками к данной работе явилось определение пространственных структур белков L1 из Thermus thermophilus (TthLl) и Methanococcus jannaschii (MjaLl) в изолированном состоянии, а также их комплексов с фрагментами рибосомной и матричной РНК [1-5].

Данная диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, а также обсуждения результатов и выводов и содержит в конце список цитируемой литературы. Раздел «Обзор литературы» посвящен описанию основных современных методов изучения пространственной структуры биологических макромолекул. В первой части обзора подробно освещается метод рентгеноструктурного анализа, который был использован в данной работе для определения пространственных

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кляшторный, Владислав Георгиевич

Основные результаты и выводы

1. Определены пространственные структуры изолированного первого домена белка L1 из Т. thermophilus и его комплекса с мРНК. Показано, что конформации области РНК-белкового интерфейса интактного белка TthLl и его первого домена идентичны как в свободном состоянии, так и в комплексах с мРНК.

2. Определены и проанализированы пространственные структуры пяти мутантных форм белка L1 из Methanococcus jannaschii с заменами Е27А, Т204А, T204F, M205D и Е27А/Т204А, четырех мутантных форм белка L1 из Thermus thermophilus с одиночными заменами Т217А, F37I, S11A, M218L и мутантной формы первого домена TthLl с заменой T217V .

3. Показано, что замены консервативных аминокислотных остатков могут привести к значительным изменениям рельефа поверхности РНК-белкового контакта, способным нарушить сетку межмолекулярных водородных связей и исключить образование или в значительной степени уменьшить время жизни РНК-белкового комплекса.

4. Проведены молекулярно-динамические исследования вышеуказанных мутантных форм белков L1 в свободном состоянии. Показано, что в пределах доступных длин траекторий конформация этих форм белка не претерпевает значительных измененений, что позволяет использовать их кристаллические структуры для докинга белка и РНК.

5. Проведены молекулярно-динамические исследования ряда РНК-белковых комплексов, образованных мутантными формами. Показано, что методы молекулярной динамики приводит к результатам, совпадающим с результатами, полученными другими методами, и позволяют получить структурную информацию, характеризующую поведение комплекса. Эта информация во многих случаях уникальна, поскольку комплексы, образуемые мутантными формами, практически не удается закристаллизовать.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кляшторный, Владислав Георгиевич, Пущино

1. H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000). The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235242

2. K. Wutrich. NMR of Proteins and Nucleic Acids (1986) Wiley, New York.

3. H. S. Mchaourab, K. J. Oh, C. J. Fang, and W. L. Hubbell (1997). Conformation of T4 Lysozyme in Solution. Hinge-Bending Motion and the Substrate-Induced Conformational Transition Studied by Site-Directed Spin Labeling. Biochemistry, 36, pp. 307-316.

4. B. L. de Groot, S. Hayward, D. M. F. van Aalten, A. Amadei and H. J.C. Berendsen (1998). Domain motions in Bacteriophage T4 Lysozyme; a comparison between molecular dynamics and crystallographic data. PROTEINS:Struct., Func. and Gen. 31, pp. 116127.

5. W.L. Bragg (1913). "The Diffraction of Short Electromagnetic Waves by a Crystal", Proceedings of the Cambridge Philosophical Society, 17, 43-57.

6. J.C. Kendrew, G. Bodo, H.M. Dintzis, R.G. Parrish, H. Wyckoff, D.C. Philips (1958). A Three-Dimensional Model of the Myoglobin Molecule Obtained by X-Ray Analysis, Nature 181, pp. 662-666.

7. C.C.F. Blake, D.F. Koenig, G.A. Mair, A.C. T. North, D.C. Phillips, V.R. Sarma (1965). Structure of Hen Egg-White Lysozyme: A Three-dimensional Fourier Synthesis at 2A Resolution. Nature 206, pp. 757-761.

8. F.A. Quiocho, C.H. Mcmurray, W.N. Lipscomb (1972). Similarities Between the Conformation of Arsanilazotyrosine 248 of Carboxypeptidase Aa in the Crystalline State and in Solution. Proc Natl Acad Sci U S A 69, pp. 2850-2854.

9. C.C.F. Blake, D.C. Phillips (1962). Biological Effects of Ionizing Radiation at the Molecular Level. International Atomic Energy Agency Symposium, Brno, Czechoslovakia, pp. 183-191.

10. W.A. Hendrickson (1976). Radiation damage in protein crystallography. J. Mol. Biol. 106, 889-893.

11. A.G.W. Leslie (1992). Recent changes to the MOSFLM package for processing film and image plate data. Joint CCP4 + ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography, 26.

12. Z. Otwinowsk, W. Minor (1997). Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode, Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, part A, p.307-326

13. W. Kabsch (2001). Integration, scaling, space-group assignment, postrefmement. International Tables for Crystallography, F.

14. K. Diederichs, P.A. Karplus (1997). Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Struct. Biol. 4, pp. 269-275.

15. M.S. Weiss, R. Hilgenfeld (1997). On the use of the merging R-factor as a quality indicator for X-ray data. J. Appl. Crystallogr. 30, pp. 203-205.

16. A.L. Patterson (1935). A direct method for the determination of the components of interatomic distances in crystals. Z. Krist. A90, pp. 517-542.

17. J. Navaza (2001). Implementation of molecular replacement in AMoRe. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 57, pp. 1367-72.

18. A.T. Brunger, P.D. Adams, L.M. Rice (1997). New applications of simulated annealing in X-ray crystallography and solution NMR. Structure 5, pp. 325-336.

19. A. Vagin, A. Teplyakov (1997). MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, pp. 1022-1025.

20. N.S. Pannu, R.J. Read (1996). Improved structure refinement through maximum likelihood. Acta Cryst. A52, pp. 659-668.

21. A.J. McCoy, L.C. Storoni, R.J. Read (2004). Simple algorithm for a maximum-likelihood SAD function. Acta Cryst. D60, pp. 1220-1228.

22. R.J. Read (2001). Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood. Acta Cryst. D57, pp. 1373-1382.

23. L.C. Storoni, A.J. McCoy, R.J. Read (2004). Likelihood-enhanced fast rotation functions. Acta Cryst. D60, pp. 432-438.

24. A.J. McCoy, R.W. Grosse-Kunstleve, L.C. Storoni, R.J. Read (2005). Likelihood-enhanced fast translation functions. Acta Cryst. D61, pp. 458-464.

25. A.J. McCoy (2004). Liking Likelihood. Acta Cryst. D60, pp. 2169-2183.

26. A.T. Brunger (1997). Patterson Correlation Searches and Refinement. Methods in Enzymology, 276, pp. 558-580, Academic Press.

27. D.W. Green, V.M. Ingram, M.F. Perutz (1954). The Structure of Haemoglobin. IV. Sign Determination by the Isomorphous Replacement Method. Proc. R. Soc., A225, pp. 287307.

28. D. Harker (1956). The determination of the phases of the structure factors of non-centrosymmetric crystals by the method of double isomorphous replacement. Acta Cryst. D9, pp. 1-9.

29. W.A. Hendrickson, J.L. Smith, R.P. Phizackerley, E.A. Merritt (1988). Crystallographic structure analysis of lamprey hemoglobin from anomalous dispersion of synchrotron radiation. Proteins 4, pp. 77-88.

30. J.H. Konnert (1976). A restrained-parameter structure-factor least-squares refinement procedure for large asymmetric units. Acta Cryst. A32, pp. 614-617.

31. W.A. Hendrickson, J.H. Konnert (1980). Incorporation of stereochemical information into crystallographic refinement. Intern. Winter School on Cryst.Computing, Bangalore, India.

32. W.A. Hendrickson, J.H. Konnert (1980). Stereochemically restrained erystallographie least-squares refinement of macromolecule structures. Biomolecular structure, function, conformation and evolution 1, pp. 43-57.

33. J.L. Sussman, S.R. Holbrook, G.M. Church, S.-H. Kim (1977). A structure-factor least-square refinement procedure for macromolecular structures using constrained and restrained parameters. Acta Cryst. A33, pp. 800-804.

34. J.L. Sussman (1985). Constrained-resntained least-squares (CORELS) refinement of proteins and nucleic acids. In Methods in Enzymology 115, pp. 271-303, Academic Press.

35. G.A. Jack, M. Levitt (1978). Refinement of large structures by simultaneous minimization of energy and R factor. Acta Cryst. A34, pp. 931-935.

36. R.C. Agarwal (1978). A new least-square refinement technique based on the fast Fourier transforn algorithm. Acta Cryst. A34, pp. 791-809.

37. A.T. Brunger, J. Kuriyn, M. Karplus (1987). Crystallographic R factor refinement by molecular dynamics. Science 235, pp. 458-460.

38. A.T. Brunger, M. Karplus, G.A. Petsko (1989). Crystallographic refinement1 by simulated annealing: application to crambin. Acta Cryst. A45, pp. 51-61.

39. J. Kuriyn, A.T. Brunger, M. Karplus (1989). X-ray refinement of protein structures by simulated annealing: test of method on myohemerythrin. Acta Cryst. A45, pp. 396409.

40. A.T. Brunger, A. Krukovski, J.W. Erickson (1990). Slow-cooling protocol for crystallographic refinement by simulated annealing. Acta Cryst. A46, pp. 585-593.

41. T.A. Jones, J.Y. Zou, S.W. Cowan, M. Kjeldgaard (1991). Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Cryst. A47, pp. 110-119.

42. R. Diamond. (1971). A real-space refinement procedure for proteins. Acta Cryst. A27, pp. 436-452.

43. E. Dodson (1995). Report of workshop on validation of macromolecular structures solved by X-ray analysis. Joint CCP4 and ESF-EACBM newsletter on protein crystallography 31, pp. 51-57.

44. G.N. Ramachandran, C. Ramakrishnan, V. Sasisekharan (1963). Stereochemistry of polypeptide chain configurations. J. Mol. Biol. 7, pp. 95-99.

45. C.I. Briinden, T.A. Jones (1990). Between objectivity and subjectivity. Nature, 343,pp.687-689.

46. G.J. Kleywegt, T.A. Jones (1995). Braille for pugilists, Proceedings of the CCP4 Study Weekend, pp. 11-23.

47. A.T. Brunger (1992). Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 355, pp. 472-475.

48. A.T. Brunger (1993). Assessment of phase accuracy by cross validation: the free R value. Methods and applications. Acta Cryst. D49, pp. 24-36.

49. R.B. Ravelli, H.K. Leiros, B. Pan, M. Caffrey, S. McSweeney (2003). Specific radiation damage can be used to solve macromolecular crystal structures. Structure П, pp. 21724.

50. A. Cohen, P. Ellis, N. Kresge, S.M. Soltis (2001). MAD phasing with krypton. Acta Cryst. D57, pp. 233-238.

51. H.M. Senn, W. Thiel (2009). QM/MM Methods for Biomolecular Systems. Angew. Chem. 48, pp. 1198 1229.

52. P.E.M. Siegbahn, F. Himo (2009). Recent developments of the quantum chemical cluster approach for modeling enzyme reactions. J Biol Inorg Chem 14, pp. 643-651.

53. S.A. Adcock, J.A. McCammon (2006). Molecular Dynamics: Survey of Methods for Simulating the Activity of Proteins. Chem. Rev. 106, pp. 1589-1615.

54. G. Tiana, F. Simona, G.M.S. De Mori, R.A. Broglia, G. Colombo (2004). Understanding the determinants of stability and folding of small globular proteins from their energetic. Protein Sci. 2004 13, pp. 113-124.

55. H.A. Scheraga, M. Khalili, A. Liwo (2007). Protein-Folding Dynamics: Overview of Molecular Simulation Techniques. Annual Review of Physical Chemistry 58, pp. 57-83.

56. W. Thiel (2009). QM/MM methodology: fundamentals, scope, and limitations. Multiscale Simulation Methods in Molecular Sciences 42, pp. 203-214.

57. C. Moller, M.S. Plesset (1934). Note on an Approximation Treatment for Many-Electron Systems. Phys. Rev. 46, pp 618-622.

58. K. Burke, J. Werschnik, E.K.U. Gross (2005). Time-dependent density functional theory: Past, present, and future. J. Chem. Phys. 123, 062206.

59. H.J. Berendsen, S. Hayward S (2000). Collective protein dynamics in relation to function. Curr Opin Struct Biol 10, pp. 165-169.

60. T. Simonson (2001). Macromolecular electrostatics: continuum models and their growing pains. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, pp. 243-252.

61. M. Feig, C.L. Brooks (2004). Recent advances in the development and application of implicit solvent models in biomolecule simulations. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, pp. 217-24.

62. J.W. Ponder, D.A. Case (2003). Force fields for protein simulations. Adv Protein Chem. 66, pp. 27-85.

63. A.D.Jr. Mackerell (2004). Empirical force fields for biological macromolecules: overview and issues. J Comput Chem. 25, pp. 1584-604.

64. M. Born, J.R. Oppenheimer (1927). On the quantum theory of molecules. Ann. Phys. 84, pp. 457-484.

65. J. Verlet (1967). Computer "Experiments" on Classical Fluids. I. Thermodynamical Properties of Lennard-Jones Molecules Phys. ReV. 159, pp. 98-103.

66. D. Beeman (1976). Some multistep methods for use in molecular dynamics calculations. J. Comput. Phys. 20, pp. 130-139.

67. C.W. Gear (1971). Numerical Initial Value Problems in Ordinary Differential Equations. Prentice: New York.

68. W.F. van Gunsteren, H.J.C. Berendsen (1977). Algorithms for macromolecular dynamics and constraint dynamics. Mol. Phys. 34, pp. 1311-1327.

69. J.P. Ryckaert, G. Ciccotti, H.J.C. Berendsen (1977). Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of и-alkanes. J. Comput. Phys. 23, pp. 327-341.

70. H.C. Andersen (1983). Rattle — a velocity version of the shake algorithm for molecular-dynamics calculations. J. Comput. Phys. 52, pp. 24-34.

71. B. Hess, J. Bekker, H.J.C. Berendsen, J.G.E.M. Fraaije (1997). LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations. J. Сотр. Chem. 18, pp. 1463-1472.

72. M.V. Fedoryuk (2001). Method of steepest descent. Encyclopaedia of Mathematics, Springer.

73. M.R. Hestenes, E. Stiefel (1952). Methods of Conjugate Gradients for Solving Linear Systems. Journal of Research of the National Bureau of Standards 49, pp. 409-436.

74. T.J. Ypma (1995). Historical development of the Newton-Raphson method. SIAM Review 37, pp. 531-551.

75. B.R. Brooks, R.E. Bruccoleri, B.D. Olafson, D.J. States, S. Swaminathan, M. Karplus (1983). CHARMM. A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. J. Сотр. Chem. 4, pp. 187-217.

76. H.W. Kim, T.J. Shen, D.P. Sun, N.T. Ho, M. Madrid, M.F. Tam, M. Zou, P.F. Cottam, С. Ho (1994). Restoring allosterism with compensatory mutations in hemoglobin. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, pp. 11547-11551

77. A. Warshel (2003). Computer simulations of enzyme catalysis: methods, progress, and insights. Ann. ReV. Biophys. Biomol. Struct. 32, pp. 425-443.

78. N. Brooijmans, I.D. Kuntz (2003). Molecular recognition and docking algorithms. Ann. ReV. Biophys. Biomol. Struct. 32, pp. 335-373.

79. B. Roux (2002). Computational studies of the gramicidin channel. Acc. Chem. Res. 35, pp. 366-375.

80. P.J. Bond, M.S.P. Sansom (2004). A recent review discussing simulations of outer-membrane proteins. Mol Membr Biol. 21, pp. 151-161.

81. A.H. Elcock (2004). Molecular simulations of diffusion and association in multimacromolecular systems. Numerical Computer Methods D383, pp. 166-198.

82. V. Daggett (2006). Protein Folding-Simulation. Chem. ReV. 106, pp. 1898-1916.

83. R. Day, V. Daggett (2003). All-atom simulations of protein folding and unfolding. Protein Simul. Adv. Protein Chem. 66, pp. 373-403.

84. B.M. Pettitt, V.A. Makarov, B.K. Andrews (1998). Protein hydration density: theory, simulations and crystallography. Curr Opin Struct Biol. 8, pp. 218-221.

85. C.F. Wong, J.A. McCammon (2003). Protein Simulation and Drug Design. Adv. Protein Chem. 66, pp. 87-121.

86. P. Koehl and M. Levitt (1999). De novo protein design. II. Plasticity of protein sequence, J. Mol. Biol., 293, pp. 1183-1193.

87. A.T. Brunger, P.D. Adams (2002). Molecular dynamics applied to X-ray structure refinement. Acc Chem Res. 35, pp. 404-412.

88. J.P. Linge, M.A. Williams, C.A.E.M. Spronk, A.M.J.J. Bonvin, M. Nilges (2003). Refinement of protein structures in explicit solvent. Proteins: Struct, Funct, Genet. 50, pp. 496506.

89. H. Fan, A.E. Mark (2004). Refinement of homology-based protein structures by molecular dynamics simulation techniques. Protein Sci. 13, pp. 211-220.

90. W. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten (1996). VMD-Visual molecular dynamics. J. Mol. Graph. Model. 14, pp. 33-38.

91. W. De Lano (2002). The PyMOL Molecular Graphics System. San Carlos, С A,1. USA.

92. I.T. Jolliffe (1986). Principal Component Analysis. Springer-Verlag, pp. 487.

93. A. Amadei, А.В.М. Linssen, H.J.C. Berendsen (1993). Essential dynamics of proteins. Prot. Struct. Funct. Genet. 17, pp. 412^125.

94. A.E. Garcia (1992). Large-amplitude nonlinear motions in proteins. Phys. ReV. Lett. 68, pp. 2696-2699.

95. J. Mongan (2004). Interactive essential dynamics. J. Comput. Aided Mol. Des. 18, pp. 433-436.

96. I. Andricioaei, M. Karplus (2001). On the calculation of entropy from covariance matrices of the atomic fluctuations. J. Chem Phys. 115, pp. 6289-6292.

97. I. Thorpe, C.L. Brooks (2004). The coupling of structural fluctuations to hydride transfer in dihydrofolate reductase. Proteins: Struct. Funct. Bioinformatics 57, pp. 444-457.108. http://bmrb.wisc.edu/

98. R.A. Laskowski, M.W. MacArthur, D.S. Moss, J.M. Thornton (1993). PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, pp. 283-291.

99. R.W.W. Hooft, G. Vriend, C. Sander, E.E. Abola (1996). Errors in protein structures. Nature 381, pp. 272-272.

100. R.G. Palmer (1982). BrokenErgodicityio Adv. Phys. 31, pp. 669-735.

101. R.A. Zimmermann (1980). Interactions among protein and RNA components of the ribosome. Structure, Function and Genetics of Ribosomes, Baltimore University Park Press, pp. 135-169.

102. G. Baier, O. Hohenwarter, C. Hofbauer, H. Hummel, M. Stoffler-Meilicke, G. Stoffler (1989). Structure and functional equivalence between ribosomal proteins of Escherichia coli and Methanococcus vannielii L6. Syst. Appl. Microbiol. 12, pp. 119-126.

103. R.L. Gourse, D.L. Thurlow, S.A. Gerbi, R.A. Zimmermann (1981). Specific binding of a prokaryotic ribosomal protein to a eukaryotic ribosomal RNA: implications for evolution and autoregulation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 78, pp. 2722-2726.

104. G. Baier, W. Piendl, B. Redl, G. Stoffler (1990). Structure, organization and evolution of LI equivalent ribosomal protein gene of the archaebacterium Methanococcus vannielii. Nucleic Acids Res. 18, pp. 719-724.

105. J. Wower, S.V. Kirillov, I.K. Wower, S. Guven, S.S. Hixson, R.A. Zimmermann (2000). Transit of tRNA through the Escherichia coli ribosome. J. Biol. Chem. 275, pp. 3788737894.

106. S.V. Kirillov, J. Wower, S.S. Hixson, R.A. Zimmermann (2002). Transit of tRNA through the Escherichia coli ribosome: cross-linking of the 3' end of tRNA to ribosomal proteins at the P and E sites. FEBS Lett. 514, pp. 60-66.

107. R.L. Gourse, R.A. Sharrock, M. Nomura (1986). Control of ribosome synthesis in Escherichia coli. Structure, Function and Genetics of Ribosomes, Springer-Verlag, New York, USA, pp. 766-788.

108. M. Hanner, C. Mayer, C. Kohrer, G. Golderer, P. Grobner, W. Piendl (1994). Autogenous translational regulation of the ribosomal MvaLl operon in the archaebacterium Methanococcus vannielii. J. Bacteriol. 176, pp. 409-418.

109. D.E. Draper (1989). How do proteins recognize specific RNA sites? New clues from autogenously regulated ribosomal proteins. Trends Biochem. Sci. 14, pp. 335-338.

110. C. Kohrer, C. Mayer, O. Neumair, P. Grobner, W. Piendl (1998). Interaction of ribosomal LI proteins from mesophilic and thermophilic Archaea and Bacteria with specific Ll-binding sites on 23SrRNA and mRNA. Eur. J. Biochem. 256, pp. 97-105.

111. A.R. Subramanian, E.R. Dabbs (1980). Functional studies on ribosomes lacking protein LI from mutant Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 112, pp. 425-430.

112. C.A. Orengo, J.M. Thornton (1993). Alpha plus beta folds revisited: some favored motifs. Structure 1, pp. 105-120.

113. A.V. Efimov (1994). Common structural motifs in small proteins and domains. FEBS Lett. 355, pp. 213-219.

114. H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000). The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research, 28 pp. 235242.

115. C.S. Hurlbut, C. Klein (1985). Manual of Mineralogy, 20th ed.

116. Collaborative Computational Project, Number 4. (1994). The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst. D50, pp. 760-763.

117. G.N. Murshudov, A.A.Vagin, E.J.Dodson (1997). Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Cryst. D53, pp. 240-255.

118. B. Hess, C. Kutzner, D. van der Spoel, E. Lindahl (2008). GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient, Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation. J. Chem. Theory Comput. 4, pp. 435-447.

119. K. Toukan, A. Rahman (1985). Molecular-dynamics study of atomic motions in water. Physical Review B31, pp. 2643-2648.

120. W.L. Jorgensen, J. Chandrasekhar, J.D. Madura, R.W. Impey, M.L. Klein1983). Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. J, Chem. Phys 79, pp. 926-935.

121. P. Ewald (1921) Die Berechnung optischer und elektrostatischer Gitterpotentiale, Ann. Phys. 369, pp. 253-287.139. http://www.charmm.org/documentation/c35bl/index.html

122. H.J.C. Berendsen, J.P.M. Postma, W.F. Van Gunsteren, A. Dinola, J.R. Haak1984). Molecular-Dynamics with Coupling to an External Bath. Journal of Chemical Physics 81,pp. 3684-3690.

123. W.L. Jorgensen, J. Tirado-Rives J (1988). The OPLS Force Field for Proteins. Energy Minimizations for Crystals of Cyclic Peptides and Crambin. J. Am. Chem. Soc. 110, pp. 1657-1666.

124. G. Bussi, D. Donadio, M. Parrinello (2007). Canonical sampling through velocity rescaling. J. Chem. Phys 126, 014101.

125. Jr.A.D. MacKerell, N. Banavali, N. Foloppe (2001). Development and current status of the CHARMM force field for nucleic acids. Biopolymers 56, pp. 257-265.

126. G.H. Hoover (1985). Canonical dynamics'4 Equilibrium phase-space distributions. Phys. Rev. A31, pp. 1695-1697.

127. S. Tishchenko, E. Nikonova, V. Kljashtorny, O. Kostareva, N. Nevskaya, W. Piendl, N. Davydova, V. Streltsov, M. Garber, S. Nikonov (2007). Domain I of ribosomal protein LI is sufficient for specific RNA binding. Nucl. Acids Res. 35, pp. 7389-7395.

128. В.И. Лим, В.Г. Кляшторный (2006). Кинетические, энергетические и стереохимические факторы, определяющие молекулярное узнавание белков и нуклеиновых кислот. Мол. биол. 40, сс. 572-579.1. Благодарности

129. Отдельную признательность выражаю нашим зарубежным коллегам группе Филиппа Маниве, благодаря которым стало возможным освоение и применение метода молекулярной динамики.

130. Большое спасибо всем сотрудникам группы структурных исследований рибосомных белков и лаборатории структурных исследований аппарата трансляции за поддержку и доброжелательную атмосферу, которая в огромной степени способствовала выполнению данной работы.